Würzburg, Statusseminar, 03.03.2005

SPP Biosystem 322 1100 NE 560/3-3:

„Titantopographie - Einfluss auf Adhäsionskomponenten von Osteoblasten und deren Funktion“

Barbara Nebe, Ulrich Beck, Joachim Rychly, Frank Lüthen, Regina LangeUniversität Rostock

Osteoblast (Aktin, grün) mit Fibronektin-„footprints“ (rot)

Kooperationen innerhalb des Schwerpunktprogramms SPP 1100

Dr. Barbara Nebe / Prof. Dr. Joachim Rychly

Universität Rostock

Klinik für Innere Medizin

Klinische Forschung

Ernst-Heydemann-Str. 6

18057 Rostock

zellbiologische Untersuchungen:

Osteoblast-Zellkultur auf modifiziertem Titan

Adhäsions-spezifische Parameter

PD Dr. Ulrich Beck

Universität Rostock

Fakultät für Informatik und Elektrotechnik

Institut für Gerätesysteme und Schaltungstechnik

Richard-Wagner-Str. 31

18119 Rostock

physikalisch-chemische Untersuchungen:

Physikalisch-chemische Charakterisierung von Titan-

Oberflächen; Strukturierung von Ti-Oberflächen

Projekt: NE 560/3-3

Ansprechpartner:

Dr. Bettina Hoffmann, Dr. RainerDetsch

Friedrich-Baur-Forschungsinstitut

für Biomaterialien

und Lehrstuhl für Biochemie

Universität Bayreuth

95440 Bayreuth

Material-Bereitstellung:

Funktionalisierung von

Titanoberflächen

durch Peptid-Immobilisierung

Projekt: ZI 215/25-3

Ansprechpartner:

Dr. Andrea Ewald

Lehrstuhl für Funktionswerkstoffe der

Medizin und Zahnheilkunde,

ZMK Klinik

Universität Würzburg

97070 Würzburg

Analysen:

Western Blot für Matrixproteine

Elektrochemische Vergleichsmessungen

Projekt: TH 438/16-5

Ansprechpartner:

Dr. Frank Müller

Institut für Werkstoffwissenschaften,

Lehrstuhl für Glas und Keramik

der Universität Erlangen-Nürnberg

91058 Erlangen

Material-Bereitstellung:

Biomimetische Apatitschicht auf

chemisch vorbehandeltem Titan

Projekt: MU 1803/1-1

Ansprechpartner:

Dr. Scharnweber

Inst. für Werkstoffwissenschaften

TU-Dresden

Analysen:

elektrochemische Messung

an Titan, Ti-Legierungen

Projekt: WO 495/11-3

Ansprechpartner:

Dr. Eva Eisenbarth

Universität des Saarlandes

Lehrstuhl für metallische Werkstoffe

66041 Saarbrücken

Material-Bereitstellung:

Nanostrukturierung von Titanoberflächen

thermische Oxidation, Ra 10-100 nm

Projekt: EI 467/1-3

Publikationen ab Mai 2003

Publikationen

Datum Anlass Autoren Thema

2003 Mater Sci Engin: C23 (2003) 413-418

Kirbs, Lange, Nebe,Rychly, Müller, Beck

On the description of the fractal nature ofmicrostructured surfaces of titanium-implants.

2003 Mater Sci Engin: C23 (2003) 425-429

Kirbs, Lange, NebeRychly, Baumann,Neumann, Beck

Methods for the physical and chemicalcharacterisation of surfaces of titaniumimplants.

2003 Mater Sci ForumVols. 426-432(2003) 3023-3030

Nebe,Lüthen, Baumann,Beck, Diener,Neumann, Rychly

Effects of titanium surface topography onthe cell-extracellular matrix interaction inosteoblasts.

2004 J Mater Sci: MaterMed 15 (2004) 437-440

Becker, Nebe,Lüthen, Rychly,Neumann

Cellular investigations on electrochemicallydeposited calcium phosphate composites

2004 BIOmaterialien5 (2004) 74-75

Lange, Lüthen, Kirbs,Baumann, Müller,Rychly, Nebe, Beck

Correlation between physico-chemicalproperties of micro-structured implants andcell biological parameters

2004 BIOmaterialien5 (2004) 32-33

Nebe, Lüthen, Diener,Becker, Lange, Beck,Neumann, Rychly

Mechanisms of cell adhesion on surfaces ofpure titanium

2004 Mater Sci Engin: C24 (2004) 619-624

Nebe, Lüthen, Lange,Becker, Beck, Rychly

Topography-induced alterations in adhesionstructures affect mineralization in humanosteoblasts on titanium

2005 Biomaterials26 (2005) 383-392

Diener, Nebe, Lüthen,Becker, Beck,Neumann, Rychly

Control of focal adhesion dynamics bymaterial surface characteristics.

2005 Biomaterials26;15 (2005) 2423-2440

Lüthen, Rychly, Becker,Lange, Beck,Neumann, Nebe

The influence of surface roughness of

titanium on β1- and β3-integrin adhesionand the organization of fibronectin in humanosteoblastic cells.

Zellmorphologie: Osteoblasten MG-63

Titantopographie

P

Ra 0.19 µm

NT

Ra 0.54 µm

GB

Ra 1.22 µm

CB

Ra 6.07 µm

VPS

Ra 48.59 µm

Titan pur (Grad 2) DOT GmbH GB Glas gestrahlt Glaspartikel, 180-300 µm, 3.5 bar

P poliert 4000er Feinschliffpapier CB Korund gestrahlt Aluminiumoxid-Partikel, 500-600 µm, 6.0 bar

NT abgedreht VPS Vakuum Plasma Schichtdicke 250 µm + Aluminiumoxid-

gespritzt Partikel, 500-600 µm, 3.5 bar

Grenzflächeninteraktion Zelle - Implantatoberfläche

physikalisch-chemische Komponenten Oberflächentopography

Aktin-Zytoskelett

extrazelluläre Matrix

Biomaterial

IntegrinrezeptorenAdhäsions-Kontakte

Zellsignaling

Vinkulin

Tensin

Fibronektin

maschiniert Korund gestrahltpoliert

ββββ1-Integrine

Tensin

Aktin / FN

TitanTopographie

Localization of ββββ1 integrins and tensin in primary osteoblasts

Method: 24 h culture, DMEM +10% FCS, anti-β1 mAb + goat anti-mouse secondary Ab 488Alexa,

anti-tensin mAb +secondary Ab Cy3, confocal LSM 410

ββββ1

ββββ1

tensin

tensin

merge

merge

COL

CB

Kolokalisation von ββββ1-Integrinen (grün) mit dem Aktin-Zytoskelett (rot)

- beeinflusst durch die Struktur des Titans

Methode:Zellen: humane primäre Osteoblasten

Integrine: primärer Ak: Maus anti-human beta1

sekundärer Ak: Alexa488-Ziege anti-Maus IgG

Aktin: Phalloidin-TRITC

Analyse: LSM Leica TCS SP2 AOBS

COL-Kontrolle

NT

COL

CB

Mineralisierung humaner Osteoblasten auf strukturiertem Titan

T-Test, gepaart, *p<0.005 CB+NT

0

50

100

150

200

250

300

1 2 3 4 5

fluore

scence r

ela

ted to P

in %

Ti P Ti NT Ti GB Ti CB

*

n=8

Ti P=100%

mRNA Expression von Differenzierungsmarkern von MG-63 Osteoblasten

Methode: real time RT-PCR

DNA Diagnostik Nord

Fr. Dr. U. Bulnheim

Osteopontin - mRNA-Expression in Abhängigkeit von der

Oberflächenbeschaffenheit

0

1

2

3

4

TCPS+Coll 1 TiP TiNT TiGB TiCB TiVPS ES

Material

rel.

mR

NA

-Ex

pre

ss

ion

3d 7d

OsteopontinBone Sialoprotein - mRNA-Expression in Abhängigkeit von der

Oberflä#chenbeschaffenheit

0

1

2

3

TCPS+Coll 1 TiP TiNT TiGB TiCB TiVPS ES

Material

rel. m

RN

A-E

xp

res

sio

n

24h 3d 7d

Bone Sialoprotein

Alkalische Phosphatase - mRNA-Expression in Abhängigkeit von der

Oberflächenbeschaffenheit

0

1

2

3

TCPS+Coll 1 TiP TiNT TiGB TiCB TiVPS ES

Material

rel. m

RN

A-E

xp

res

sio

n

24h 3d

Alkalische Phosphatase

Physikalisch-chemische Materialeigenschaften

•Mittenrauhwert ra (Tastschnittmessungen)•Korrosionspotential Ecorr (LSV)•Korrosionswiderstand Rcorr (LSV)•Korrosionsstrom Icorr (LSV)•Oberflächenladung Q (CA)•Elektrochemische Doppelschichtkapazität C (EIS)•Fraktale Dimension DF (LSV, EIS, DIP)

Methodik:

•LSV � Linear Sweep Voltammetry•CA � Chronoamperometrie•EIS � Elektrochemische Impedanzspektroskopie•DIP � Digitale Bildverarbeitung

20 µm20 µm

20 µm20 µm 20 µm

Poliert(P)

Maschiniert(M)

Glasgestrahlt(G)

Korundgestrahlt6 bar (C6)

Vakuumplasmagespritzt rauh (VR)

ra= 0.07µm

ra= 0.53µm

ra= 1.22µm

ra= 6.07µm

ra= 48.59µm

Oberflächenmodifikationen von Titan

α3

α2

α5

5 m

in

10

min

15

min

MG

63

PO

B

3h

16

h

40

h

3h

16

h

24

h

40

h

24

h

3d

7d

ra [µm]

Ecorr [mV]

Rcorr [kOhm]

Icorr [nA]

Q [µC]

C [µF] (1 kHz)

DF (LSV)

DF (EIS)

DF (DIP)

Struktur-

modifikationen5 5 5 5 5 5 3 3 4 4 4 4 4 4 4 5 4 4 4 5 5 5 5 5

Alk

al.

Pho

sphata

se 2

4h

Ost

eo

po

ntin 3

d

Bone

Sialoprotein

Zellausbreitung

FormFläche

Vinculin

Pro

lifera

tio

n 2

4h

Länge

Dyn

am

ik

Anza

hl

GenexpressionIntegrin-

expression

Zell-

adhäsion

ββββ1 -

Integrin-

Länge

Korrelationskoeffizient nach Pearson

xx

K2 = 0.9884

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

0 500 1000 1500 2000 2500

Rcorr [kOhm]

Bo

ne

Sialo

pr.

3d (

P=

1) VR

C6

G

M

PK2 = 0.9293

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 500 1000 1500 2000 2500

Rcorr [kOhm]

ad 1

0 m

in [

%]

M

P

G

C6

VR

0,9 <= |K| < 0.950,95 <= |K| < 1.0

Zelladhäsion nach 10 min = f(Rcorr)Bone Sialoprotein nach 3 d = f(Rcorr)

20 µm 20 µm 20 µm 20 µm

50 µm 50 µm50 µm 50 µm

Zusätzliche Oberflächenmodifikationen

feinpoliert korundgestrahlt 2,5 bar plasmagespritzt sehr fein plasmagespritzt fein

Mittenrauhwert ra [µm]

FP C2,5 VFF VF

0.050.07

0.531.22

48.5928.98

11.516.074.89

0.01

0.1

1

10

100

FP P M G C2,5 C6 VFF VF VR

β1

Integrin-

länge

Proliferation

β1 α3 α2 α5 β3 10 min 15 min MG63 24h

ra [µm]

Rcorr [kOhm]

Icorr [nA]

Q [µC]

C [µF] (1 kHz)

DF (EIS)

DF (LSV)

DF (DIP)Struktur-

modifikationen9 9 9 9 9 9 9 6 9

Integrinexpression Zelladhäsion

Korrelationskoeffizient nach Pearson

0.7 <= |K| < 0.8

0.8 <= |K| < 0.9

0.9 <= |K| < 1.0

x

x

K2 = 0.6937

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0Df (LSV)

β3 Integrinexpression = f (DF (LSV)) Zelladhäsion nach 10 min = f (Rcorr)

K2 = 0.7548

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 500 1000 1500 2000 2500R corr [kOhm]

COL=1 COL=1

Ausblick

•Zusätzliche biologische und physikalisch-chemische Parameter

•Erweiterung der Strukturpalette mit definierten geometrischen Strukturen

•Funktionale Abhängigkeiten des Zellverhaltens von der OF-Struktur

Geplante Poster ab Mai 2003

Poster

Datum Anlass Autoren Thema

2003 BIOmaterialien

2 (2003) 128

Lüthen, Becker, Lange,Rychly, Beck, Nebe

Effects of titanium topography on theformation of integrin adhesions in humanosteoblasts.

2003 BIOmaterialien

2 (2003) 98

Diener, Nebe, Lüthen,Becker, Neumann,Rychly

Formation of focal adhesions are controlledby surface characteristics of a biomaterial.

2003 BIOmaterialien

2 (2003) 122

Lange, Lüthen, Kirbs,Becker, Müller, Rychly,Beck, Nebe

Correlation between morphologicalcharacteristics of microstructured surfacesof titanium implants and cell biologicalparameters.

10/2003 ESB Stuttgart Lüthen, Diener,Bulnheim, Teller, Nebe,Beck, Krause,Neumann, Rychly

Adhesion and gene expression inosteoblasts on sol-gel-derived calciumphosphate coatings.

10/2003 ESB Stuttgart Lange, Lüthen, Kirbs,Becker, Müller, Rychly,Nebe, Beck

Correlation between biological parametersof cells on micro structured titaniumsurfaces and its topographicalcharacteristics.

2004 DGZ, BerlinEur J Cell Biol 83(2004) S 2/37

Diener, Nebe, Lüthen,Becker, Neumann,Rychly

Dynamics of focal adhesions in osteoblasticcells are controlled by characteristics ofbiomaterial surfaces.

06/2004 ECMDavos, Schweiz

Lange, Lüthen, Kirbs,Müller, Rychly, Nebe,Beck

An attempt to correlate the characteristicsof micro structured surfaces of titaniumimplants and biological parameters ofadhesive cells

09/2004 SymposiumBiomaterialien inder Zahnmedizin,Rostock-Warnemünde

Lange, Lüthen, Kirbs,Baumann, Müller,Rychly, Nebe, Beck

A contribution to the correlation betweenphysico-chemical properties of microstructured implants and cell biologicalparameters