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Inhaltsverzeichnis I

INHALTSVERZEICHNIS

Abkürzungsverzeichnis IIIGenbank-Zugangsnummern V

1. Einleitung 11.1. Picornaviren als Pathogene 11.1.1. Viren als Krankheitserreger 11.1.2. Picornaviren im Überblick 21.1.3. Das Genom der Picornaviren 31.1.4. Replikation des Virusgenoms 41.1.5. Struktur der Picornaviren 51.1.6. Pathogenität von Coxsackievirus B3 61.2. Programmierter Zelltod (Apoptose) 81.2.1. Einführung 81.2.2. Zelluläre Ereignisse während des programmierten Zelltodes 81.2.3. Viren als Pathogene 111.3. Das pro-apoptotische Protein Siva 131.4. Zielsetzung der Arbeit 14

2. Material und Methoden 152.1. Material 152.1.1. Verwendete Stämme und Zellinien 152.1.2. Vektoren und Plasmide 162.1.3. Synthetische Oligonukleotide 192.1.4. Kulturmedien für Escherichia coli 202.1.5. Kulturmedien und Lösungen für Saccharomyces cerevisiae 212.1.6. Kulturmedien und Lösungen für die Kultur von Säugerzellen 212.1.7. Puffer und Lösungen 222.1.8. Chemikalien, Enzyme, Reagenzien und Kits 232.1.9. Antikörper 252.1.10. Geräte 252.2. Methoden 262.2.1. Transformation von E. coli nach Hanahan (HANAHAN1983) 262.2.2. Transformation des E.coli-Stammes HB101 durch Elektroporation 272.2.3. Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli (Mini- und Midipräparation) 272.2.4 Arbeiten mit Plasmid-DNA 282.2.5. Zweihybrid-Untersuchungen in S. cerevisiae 322.2.6. Proteinexpression in E. coli 362.2.7. Zellkultur 37

Inhaltsverzeichnis II

2.2.8. Transiente Transfektion von Säugerzellen 382.2.9. Herstellung von Zelllysaten 382.2.10. MTT-Überlebenstest (MOSMANN 1983) 382.2.11 Untersuchung der Genexpression mit reverser Transkription und PCR 392.2.12. Bestimmung der Proteinkonzentration (BRADFORD 1979) 402.2.13. Bestimmung des Zink-Gehaltes in Proteinen (STENMARK ET AL 1996) 412.2.14. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 412.2.15. Western Blot im Semi dry-Verfahren 422.2.16. In vitro-Bindungstest mit immobilisierten Proteinen (Pulldown) 42

3. Ergebnisse 443.1. Interaktion von Siva mit dem Rezeptor CD27 443.2. Interaktion zwischen Siva und dem Strukturprotein VP2 von Coxsackievirus

B3 in vitro 473.2.1. Expression von Siva-1 und -2 und einzelner Fragmente von

Siva in E. coli 473.2.2. In vitro-Interaktionsassay zwischen dem Coxsackievirus B3-

Capsidprotein VP2 und Siva 513.3. Suche nach Siva-bindenden Proteinen in einer humanen Herz-cDNA-Bank

(Zweihybrid-Screening) 533.4. In vitro-Interaktionstest zwischen MBP-Siva und HA-PMP22 553.5. Expression von Siva als MBP-Fusionsprotein und Bestimmung des Zn2+ -

Gehaltes 573.6. Zelltod nach Expression von Siva und funktionellen Mutanten in Zellkultur 583.7. Siva-Expression nach Infektion mit CVB3 oder Zugabe exogener

Apoptose-Stimuli 60

4. Diskussion 644.1. Die Suche nach neuen Interaktionspartnern von Siva 644.2. Analyse der Primärstruktur und Konsequenzen für die Funktion von Siva 714.3. Ereignisse in den Wirtszellen bei einer Coxsackievirus B3-Infektion 754.4. Pathologische Prozesse mit Beteiligung von Siva 774.5. Modell für die Einbettung von Siva in zelluläre Prozesse während einer

CVB3- Infektion 794.6. Ausblick 82

5. Zusammenfassung 84

6. Literatur 86

Anhang

Abkürzungsverzeichnis III

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

3-AT 3-Amino-1,2,4-Triazol

a. bidest. aqua bidestillata (bidestilliertes Wasser)

AK Antikörper

APS Ammoniumpersulfat

AS Aminosäure

ATCC American Type Culture Collection (kommerzielle Zellen- und

Gewebebank)

BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)

bp Base pairs (Basenpaare)

CAR Coxsackie- und Adenovirus-Rezeptor

CMV Cytomegalievirus

CVB3 Coxsackievirus B3

DAF Decoy Accelerating Factor

DMEM Dulbecco´s Modifiziertes Eagle-Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

dNTP Desoxynucleosidtriphosphat

DTT Dithiothreitol

Gal4-DNA-BD DNA-Bindedomäne des Transkriptionsfaktors GAL4p in S.

cerevisiae

GAL4-AD Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors GAL4p in S.

cerevisiae

GFP green fluorescent protein (Grün Fluoreszierendes Protein)

GST Glutathion S-Transferase

EDTA Ethyldiamin-tetra-Essigsäure

FCS Fetal calf serum (fötales Kälberserum)

HA Hämagglutinin

i.p. intraperitoneal

IRES Interne Ribosomen-Eintrittsstelle

MBP Maltose-bindendes Protein

LB Luria Bertani-Medium

LBAmp LB-Medium mit Ampicillin

Abkürzungsverzeichnis IV

LBKana LB-Medium mit Kanamycin

MOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure

MTT 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

NAC N-Acetyl-L-Cystein

NTR Nicht translatierte Region

OD optische Dichte

ORF open reading frame (offener Leserahmen)

PAA Polyacrylamid

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PAR 4-(2-Pyridylazo)-resorcinol

PBS Phosphate buffered saline (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)

PCR Polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion)

PEG 3350 Polyethylenglykol (Molekulargewicht 3350)

PMPS p-Hydroxymercuriphenylsulfonat

PTS Peroxisomal targeting sequence (Peroxisomen-

Lokalisierungssequenz)

RNA Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)

rpm rotations per minute (Umdrehungen pro Minute)

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion

SDS sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat)

SL Stammlösung

TEMED N,N-Tetramethyl-ethylendiamin

TNF Tumornekrose-Faktor

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

TUNEL Terminal deoxynucleotide transferase dUTP nick end labeling

(enzymatische Markierung apoptotischer DNA-Strangbrüche)

U Unit (Einheit)

UAS upstream activation sequence (stromaufwärts gelegene

Regulator-sequenz)

v/v Volume per volume (Volumen/Volumen; Volumenanteil)

w/v Weight per volume (Gewicht/Volumen; Gewichtsanteil)

YNB yeast nitrogen base (aminosäurefreie Stickstoffbasis)

Genbank-Zugangsnummern V

GENBANK -ZUGANGSNUMMERN

Name des Proteins Organismus Zugangsnummer

BARD-1 Mensch AF038042

CD27 Mensch NM001242

CD27 Maus XM132890

CVB3 (vollständiges Genom) Coxsackievirus B3 (Woodruff) CXU57056

c-src Mensch NM005417

Cytochrom C-Oxidase Untereinheit III Mensch XM059201

PMP22 Mensch AY044439

PMP22 Maus AF3096443

MLL-T6 Mensch NM005937

Not4 Mensch XM045804

Paxillin Mensch XM045802

Siva-1 Mensch HSU82938

Siva-2 Mensch AF033111

Siva-1 Maus AF033114

Telethonin Mensch AJ000491

VP2 CVB3 (Woodruff) AAB02228

Einleitung 1

1. Einleitung

1.1. Picornaviren als Pathogene

1.1.1. Viren als Krankheitserreger

Es ist schon seit längerem bekannt, dass Viren schwere Krankheiten bei Mensch und Tieren

verursachen können. Das Maul- und Klauenseuchevirus wurde zum Beispiel bereits 1898

von Löffler und Frosch entdeckt. Die Poliomyelitis (Kinderlähmung) wurde im Jahr 1909 von

den Wiener Pathologen Karl Landsteiner und Emil Popper als Viruserkrankung erkannt. Der

potentielle Erreger musste sehr klein sein, denn er war durch ein Ultrafilter nicht abtrennbar.

Das Poliovirus selbst wurde ungefähr dreissig Jahre später identifiziert. Im Jahr 1949

beschrieben ENDERS ET AL. erstmals morphologische Veränderungen von Nierengewebe im

Verlauf einer Polio-Infektionen und wiesen damit den zytopathischen Effekt (die direkte

Schädigung der Wirtszellen) durch eine Virusinfektion nach.

Die Erforschung der molekularen Eigenschaften der Viren erbrachte viele grundlegende

Erkenntnisse der Molekularbiologie. Durch ihr vergleichsweise kleines, aus wenigen

Elementen bestehendes Genom sind sie als Forschungsobjekte gut geeignet. Aus der

Virusforschung resultierten wichtige Erkenntnisse über die Kontrolle der Genexpression in

eukaryontischen Organismen, zum Beispiel über die Wirkung von Enhancer-Elementen zur

Steigerung der Genexpression oder das alternative Splicen der mRNA-Transkripte. Die

moderne Molekularbiologie ermöglichte einen deutlichen Fortschritt bei der Erforschung der

Genetik der Viren. Zum Beispiel können mit automatischen Sequenziergeräten in relativ

kurzer Zeit ganze Virusgenome entziffert werden und ermöglichen so die Klassifizierung neu

entdeckter Viren. Auch der Nachweis von Virus-Erbgut in Abwesenheit kompletter Virionen

mit Hilfe von PCR-Methoden ist so möglich.

Viren sind einfach aufgebaute Lebensformen. Sie sind sehr klein (circa 20-300nm) und

weisen fast immer eine symmetrische Struktur auf. Viren bestehen im allgemeinen aus zwei

Grundbestandteilen: der Nukleinsäure, die die Erbinformation enthält, und einer Proteinhülle

(Capsid), welche die Nukleinsäuren vor äusseren Einflüssen schützt. Eine Reihe von Viren

sind ausserdem von einer zweischichtigen Lipidhülle umgeben, die ähnlich aufgebaut ist wie

die Zellmembran der eukaryontischen Organismen. Viren besitzen selbst nicht alle

Voraussetzungen zu ihrer Vermehrung. Sie stellen den Stoffwechsel der von ihnen

befallenen Zellen auf ihre eigenen Bedürfnisse um und agieren deshalb immer als Parasiten.

Einleitung 2

1.1.2. Picornaviren im Überblick

In dieser Promotionsarbeit wurden Aspekte der Pathogenese des Coxsackievirus B3 näher

untersucht. Dieses Virus ist ein Vertreter der Klasse der Picornaviren, die derzeit insgesamt

etwa 230 Serotypen umfasst. Coxsackieviren wurden 1948 bei Arbeiten mit neugeborenen

Mäusen entdeckt (DALLDORF AND SICKLES 1948), die mit einem Ultrafiltrat von Kinderstuhl

infiziert wurden. Der Name „Picorna“ setzt sich zusammen aus dem griechischen Wort für

klein („pikos“) und „RNA“. Picornaviren besitzen ein RNA-Genom von 7-8,5 Kilobasen Länge.

In Tabelle 1 ist die seit zwei Jahren geltende, vorwiegend auf molekularbiologischen Daten

(Sequenzdaten und Genomorganisation) beruhende Klassifizierung der Picornavirus-Familie

mit ausgewählten Mitgliedern dargestellt (KING ET AL. 2000).

Tabelle 1: Molekularbiologisch begründete Klassifizierung der Picornaviren.

Dargestellt sind ausgewählte wichtige Spezies und Serotypen (nach KING ET AL. 2000).

Genus Spezies Serotypen

Anzahl Name Anzahl Beispiele

Aphtovirus 2 Maul-und Klauenseuche-Virus

Equines Rhinitis A-Virus

7

1

MKS-Virus A, O, C

Cardiovirus 2 Enzephalomyokarditis-Virus

Theilovirus

1

3

Theiler´s Murine

Encephalomyocarditis Virus

Enterovirus 7 Poliovirus 3 Poliovirus 1-3

Humanes Enterovirus A 16 Coxsackievirus A2-8, 10, 12, 14, 16

Humanes Enterovirus B 43 Coxsackievirus B1-6, A9

Humanes Enterovirus C 11 Coxsackievirus A1, 11, 13, 15, 17-

22, 24

Humanes Enterovirus D 3 Humanes Enterovirus 68, 70

Erbovirus 1 Equines Rhinitis B-Virus

Hepatovirus 2 Hepatitis-A-Virus 1

Kobuvirus 1 Aichivirus 1

Parechovirus 2 Humanes Parechovirus 1

Rhinovirus 3 Humanes Rhinovirus A 76 Humanes Rhinovirus 1a, 1b, 2, 7-13

Humanes Rhinovirus B 25 Humanes Rhinovirus 3-6, 14, 17, 26

Teschovirus 1 Bovines Teschovirus 1

In der Vergangenheit wurden Coxsackieviren anhand der unterschiedlichen von einer

Infektion hervorgerufenen Krankheitssymptome in die Subklasssen A (vorwiegend Myositis -

Infektionen der quer- und glattgestreiften Muskulatur) mit 23 Serotypen und B (hauptsächlich

Endomyokartitiden und Läsionen in Hirn und Pankreas) mit 6 Serotypen unterschieden

(GAUNTT ET AL. 1979). Erst vor zwei Jahren wurde eine Neuklassifizierung der Picornaviren

vorgenommen, die hautsächlich auf der Grundlage von molekularbiologischen Daten beruht

Einleitung 3

(siehe Tabelle 1). Nach dieser Systematik werden Coxsackie A-Viren den Spezies Humane

Enteroviren Typ A und C zugeordnet, die Coxsackie B-Viren gehören zur den Humanen

Enteroviren Typ B.

1.1.3. Das Genom der Picornaviren

Das Genom aller Mitglieder der Picornavirus-Familie weist charakteristische

Gemeinsamkeiten auf (MODROW AND FALKE 1997). Die genomische RNA ist infektiös (um

den Faktor 106 geringer als intakte Viruspartikel, die Rate der Infektion lässt sich jedoch

durch Transfektion der RNA in die Zielzellen erhöhen). Da das Genom der Picornaviren eine

Plusstrang-Orientierung besitzt, können die Virusproteine ohne Zwischenschritt direkt von

der RNA translatiert werden. Abbildung 1 zeigt zusammengefasst die Vorgänge der

Translation der Virus-RNA und des Reifungsprozesses des dadurch entstandenen

Polyproteins.

Abb. 1: Organisation des Picornavirus-Genoms und post-translationale Prozessierung des Virus-Polyproteins, dargestellt am Beispiel des Poliovirus 1. Am 5´-Ende der viralen RNA bindet kovalent das Protein VPg. Vor dem Start-Codon befindet sich die interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES), die die cap-unabhängige Translation des Virus-Polyproteins ermöglicht. Nach der Translation wird das Polyprotein durch die Proteasen 2A und 3CD beziehungsweise 3C in die verschiedenen Komponenten (Struktur- und Nichtstrukturproteine) gespalten. (nach MODROW AND FALKE 1997)

Am 5´-Ende enthält die genomische RNA eine nicht-translatierte Region (600-1200 Basen),

die für die Translation der Virus-RNA und die Virulenz wichtig ist. Ein Teil dieser Region

bildet eine sogenannte „Cloverleaf“-Struktur aus, die als interne Ribosomen-Eintrittstelle

(IRES) fungiert. Am 3´-Ende befindet sich ebenfalls ein nicht-translatierter Bereich von 50-

RNA

TranslationPolyprotein

AUG UAG

VPg IRES Leserahmen Polyprotein Poly(A)AAA5´ 3´

1A 1B 1C 1D 2A 2B 2C 3A 3B 3C 3D

P1 (Protomer) P2 P3

Abspaltung des Protomersdurch die Protease 2A

1A 1B 1C 1D 2A 2B 2C 3A 3B 3C 3D

Capsidproteine Nichtstrukturproteine

Spaltungen durch die Proteasen3C und 3CD

VP0 VP3 VP1 2A 2B 2C 3B 3C 3D3A

Virusreifung

VP4 VP2

Protease VPg Protease RNA-abhängigeRNA-Polymerase

RNA

TranslationPolyprotein

AUG UAG

VPg IRES Leserahmen Polyprotein Poly(A)AAA5´ 3´

1A 1B 1C 1D 2A 2B 2C 3A 3B 3C 3D

P1 (Protomer) P2 P3

Abspaltung des Protomersdurch die Protease 2A

1A 1B 1C 1D 2A 2B 2C 3A 3B 3C 3D

Capsidproteine NichtstrukturproteineCapsidproteine Nichtstrukturproteine

Spaltungen durch die Proteasen3C und 3CD

VP0 VP3 VP1 2A 2B 2C 3B 3C 3D3A

Virusreifung

VP4 VP2

Protease VPg Protease RNA-abhängigeRNA-Polymerase

Einleitung 4

100 Basen, der die Synthese des Minus-Strangs der Virus-RNA koordiniert. Darüber hinaus

ist das 3´-Ende polyadenyliert. Das Virusgenom kodiert für ein einzelnes Polyprotein von

etwa 2100-2400 Aminosäuren Länge. Darin sind alle Proteine und Funktionen enthalten, die

das Virus für seine Replikation benötigt. Das Polyprotein wird noch während der Translation

proteolytisch in die einzelnen Komponenten gespalten. Das Genom der Picornaviren enthält

die vier Capsidproteinen VP1 bis VP4 und einige Nichtstrukturproteine, zum Beispiel

Proteasen sowie die RNA-abhängige Polymerase.

1.1.4. Replikation des Virusgenoms

Die Infektion mit einem Virus beginnt mit seiner spezifischen Adsorption an ein

Oberflächenprotein der Wirtszellen. In der Vergangenheit wurden verschiedene von

Coxsackieviren zur Adhäsion an die Zellmembran genutzte Proteine gefunden. Die

Coxsackieviren B1, B3 und B5 binden an das Zelloberflächen-Protein „Decoy Accelerating

Factor“ (DAF, auch als CD55 bezeichnet; BERGELSON ET AL. 1995, SHAFREN ET AL. 1995).

Der wichtigere Bindungspartner für Coxsackievirus B3 scheint jedoch „Coxsackie and

Adenovirus Receptor“ (CAR) zu sein, ein Protein von 46kDa (LONBERG-HOLM ET AL. 1976,

BERGELSON ET AL. 1997; TOMKO ET AL. 1997). CAR wird von den Coxsackie B-Viren und

Adenoviren der Subklassen A, C, D, E und F als Rezeptor benutzt (ROELVINK ET AL. 1998).

Über seine Funktion in den Säugerzellen ist bisher nichts genaues bekannt.

Nach der Bindung an den Rezeptor werden die Viruspartikel durch Endozytose in das Innere

der Zellen aufgenommen. Durch Poren in der Membran der Vesikel wird die Virus-RNA in

das Zytoplasma entlassen. Mit Hilfe der IRES (siehe Kapitel 1.1.3.) ist die direkte, cap-

unabhängige Translation der Virus-RNA möglich (JANG ET AL. 1990; BELSHAM AND

SONENBERG, 2000). Noch während der Translation beginnen die Faltung in die einzelnen

Proteindomänen und die ersten proteolytischen Spaltungen.

Die Protease 2A ist zu einem frühen Zeitpunkt der Virusreplikation aktiv und spaltet vor allem

das Protomer (die Region P1 mit den Strukturproteinen VP1-VP4) ab. Die Capsidproteine

VP0, VP3 und VP1 gehen aus der Spaltung des Protomers durch die virale Protease 3C

hervor. Für alle weiteren proteolytischen Spaltungen des Virus-Polyproteins ist ebenfalls die

Protease 3C verantwortlich.

Im Genom der Picornaviren gibt es weitere Komponenten, die durch Spaltung durch die

Protease 3C aus dem Virus-Polyprotein entstehen. Das Segment 3B bildet das

genomassoziierte Virusprotein VPg, das im Verlauf der Virusreifung an das 5´-Ende der

Virus-RNA gekoppelt wird. Ein weiterer wichtiger Bestandteil des Picornavirus-Polyproteins

ist die RNA-abhängige Polymerase. Sie befindet sich im Abschnitt 3D des Vorläuferproteins

und wird deshalb auch als 3Dpol bezeichnet. Die RNA-abhängige Polymerase katalysiert die

Einleitung 5

Synthese des Minus-Stranges der Virus-RNA, der wiederum als Matrize zur Replikation des

Virusgenons dient (LINDBERG ET AL. 1987).

Die Synthese des Polyproteins dauert etwa 15 Minuten (CHATTERJEE ET AL. 1981a, 1981b).

Sobald das VPg-Protein und die RNA-abhhängige Polymerase 3Dpol als einzelne Proteine

vorliegen, kann die Replikation der Virus-RNA erfolgen. Als Primer dient dabei das

uridinylierte VPg-Protein (KLUMP ET AL. 1990). Wenn in einer infizierten Zelle ausreichend

Bausteine für neue Viren vorhanden sind, werden diese durch „Self-assembly“ zu infektiösen

Viruspartikeln zusammengebaut. Als letzter Schritt erfolgt eine Reifungsspaltung, bei der

autokatalytisch das VP0-Segment zu VP4 und VP2 gespalten wird. Der gesamte

Replikationsprozess bis zur Freisetzung neu synthetisierter Viruspartikel dauert etwa 6-7

Stunden.

Mikroskopisch sichtbar wird eine Picornavirusinfektion durch eine Veränderung der

Zellstruktur, die als zytopathischer Effekt bezeichnet wird (MCMANUS ET AL. 1993, WESSELY

ET AL. 1998). Die Chromatinstruktur löst sich auf, und die Nukleinsäure-Protein-Komplexe

akkumulieren an der Innenseite der Kernmembran. Das Zytoskelett lagert sich um, und die

infizierten Zellen runden sich ab. Im weiteren bilden sich im gesamten Zytoplasma Vesikel

aus, die Zellmembran verliert ihre Permeabilität und wird schliesslich durchlässig (CARTHY ET

AL. 1998).

1.1.5. Struktur der Picornaviren

Alle Picornaviren sind ähnlich aufgebaut. Sie bestehen aus einem ikosaedrischen

Nucleocapsid, das nicht von einer Membranhülle umgeben ist. Dieses Capsid wird aus einer

regelmässigen Anordnung von 60 Protomeren gebildet. Als Protomer wird eine feste

Struktureinheit bezeichnet, die aus den Polyproteinen VP1 bis VP4 besteht. Die Oberfläche

des Virions wird von den Proteinen VP1, VP2 und VP3 gebildet, VP4 befindet sich komplett

im Innern und ist mit dem RNA-Genom assoziiert. Die Viruspartikel sind 27-30nm groß

(HOGLE ET AL. 1985, ROSSMANN ET AL. 1985, MUCKELBAUER AND ROSSMANN 1997). An den

Ecken des Ikosaeders, wo die jeweiligen VP1-Proteine aufeinandertreffen, befindet sich eine

Canyon genannte kreisförmige Vertiefung (siehe Abbildung 2).

Die Aminosäuren, die den Canyon auskleiden, bestimmen die Spezifität des Virus für einen

zellulären Rezeptor, mit dessen Hilfe das Virus an die Membran bindet und dann in das

Innere der Zelle gelangt (MUCKELBAUER AND ROSSMANN 1997). Diese Oberflächenregionen

sind deshalb einem Selektionsdruck ausgesetzt und weisen eine gewisse Variabilität auf, die

im Entstehen verschiedener Serotypen sichtbar wird.

Einleitung 6

Abb. 2: Struktur der Picornaviren. A: Aufbau eines Picornavirus-Partikels. Die Lage der Capsidproteine VP1, VP2 und VP3 ist schematisch dargestellt. Das von ihnen gebildete Protomer ist durch dicke schwarze Linien eingefasst. Der schattierte Kreis markiert die Lage des Canyon. VP4 befindet sich an der Innenseite des Capsids und ist in dieser Darstellung nicht zu sehen. (aus MUCKELBAUER ET AL. 1997) B: Röntgenstruktur von Poliovirus Typ 1 Mahoney (Falschfarbendarstellung). (aus HOGLE ET AL. 1995) C: Struktur eines Protomers und Lage der Aminosäure N165 auf der Aussenseite des Virus-Capsids. (aus HENKE ET AL. 2001)

1.1.6. Pathogenität von Coxsackievirus B3

Herz- und Kreislauferkrankungen gehören zu den hauptsächlichen Todesursachen in der

westlichen Welt. In den USA sind diese Krankheiten für mehr als ein Viertel aller Fälle von

akutem Herzversagen (ungefähr 750.000 pro Jahr) und 250.000 Todesfälle verantwortlich

(SOLE ET AL. 1993, O´CONELL ET AL. 1994).

Seit der Einführung molekularbiologischer Techniken in der medizinischen Diagnostik wurde

deutlich, dass bei vielen Patienten mit Kardiomyopathien persistente Enterovirusinfektionen

auftraten (KANDOLF ET AL. 1987). Coxsackie B3-Viren und andere Enteroviren verursachen

bis zu 50% aller Fälle von akuter und etwa ein Viertel aller Fälle von Dilatativer

Kardiomyopathie (FRISK ET AL. 1984, BOWLES ET AL. 1986, KANDOLF AND HOFSCHNEIDER

AA B

C VP1

VP2VP3

VP4

VP1

VP2VP3

VP4

VP1

VP2VP3

VP4

VP1

VP2VP3

VP4

Einleitung 7

1989, KANDOLF 1998). Allein in den USA werden jährlich etwa 100.000 Fälle diagnostiziert

(FIGULLA ET AL. 1995). In Deutschland tritt sie mit einer Prävalenz von 36 Fällen je 100.000

Einwohner auf.

Eine Infektion mit Coxsackievirus B3 verursacht in dem infizierten Herzgewebe eine starke

Immunreaktion gegen die Viren (Myokarditis). Immunkompetente mononukleäre Zellen

(Monozyten) wandern in die betroffenen Areale ein, und es kommt zu einer weit

ausgedehnten Entzündungsreaktion (KANDOLF ET AL. 1993; HENKE ET AL. 1995; KLINGEL ET

AL. 1996). Da die Viren auch T- und B-Zellen infizieren und so durch den Organismus weiter

verbreitet werden, resultiert daraus eine weitere Konzentration von Viruspartikeln in den

entzündeten Arealen (KLINGEL ET AL. 1992). Bei einem chronischen Verlauf der Infektion mit

Coxsackievirus B3 entsteht meist eine Dilatative Kardiomyopathie (KAWAI 1999). In ihrem

Verlauf vergrössert sich hauptsächlich der linke Ventrikel des Herzens, ohne dass die

Muskelmasse zunimmt. Es kommt zu einer Verringerung der Kontraktilität und der

Pumpleistung des Herzens. Das Absterben der Myozyten führt zu einer Einlagerung von

Bindegewebe (Fibrose). Die Dilatative Kardiomyopathie ist mit einer hohen Lethalität durch

progrediente Herzinsuffizienz oder einem plötzlichen Herztod assoziiert (GILLUM 1986;

SUGRUE ET AL. 1992). Während der Virusreplikation spaltet die Protease 2A in den infizierten

Zellen das Actin-bindende Zytoskelettprotein Dystrophin. Die Verringerung der

Kraftübertragung entlang des Zytoskeletts der Muskelzellen ist am Entstehen einer

Dilatativen Kardiomyopathie beteiligt (BADORFF ET AL. 1999).

Neben der Infektion des Herzmuskelgewebes mit Coxsackievirus B3 ist auch der Pankreas

betroffen (MENA ET AL. 2000). Es kommt zu einer massiven Zerstörung des exokrinen

Pankreas, die Langerhans-Inselzellen des endokrinen Pankreas bleiben hingegen erhalten

(HENKE ET AL. 2001).

Eine virusspezifische Therapie oder Prophylaxe (zum Beispiel durch eine Schutzimpfung) ist

im Moment nicht möglich. Immunsuppressive Therapie zur Unterdrückung der mit der

Immunreaktion gegen das Virus einhergehenden Herzgewebsschädigungen brachte keinen

Überlebensvorteil für die behandelten Patienten („Myocarditis Treatment Trial“ in den USA,

MASON ET AL. 1995). Bei der amerikanischen Firma Viropharma befindet sich das

Medikament Pleconaril in der klinischen Erprobung, das die Bindung von Entero- und

Rhinoviren an den Rezeptor der Wirtszelle und ihre Replikation verhindern soll (KYTÖ ET AL.

2002, BAUER ET AL. 2002).

Einleitung 8

1.2. Programmierter Zelltod (Apoptose)

1.2.1. Einführung

Seit der ersten Beschreibung (KERR ET AL. 1972) hat der programmierte Zelltod ein ständig

wachsendes Interesse hervorgerufen, und ist bis heute eines der faszinierendsten

Phänomene der modernen Zellbiologie geblieben. Der Begriff Apoptose (griechisch für

„Fallende Blätter im Herbst“) wurde anhand von mikroskopischen Beobachtungen gewählt,

weil die sterbenden Zellen aus sich heraus viele kleine Ableger bildeten, die unter dem

Mikroskop wie vertrocknete Blätter erschienen.

Apoptose beschreibt einen Prozess, der in einer Zelle ein irreversibles Selbstzerstörungs-

Programm auslöst. Dieses Programm wird von der Zelle selbst initiiert, ist also ein aktiver

Prozess, der komplexen Regulationsmechanismen unterliegt. Für die Ausführung eines

programmierten Zelltodes sind RNA- und Proteinsynthese erforderlich (WYLLIE ET AL. 1984).

Physiologisch bedeutsame apoptotische Prozesse treten unter anderem in

Embryonalentwicklung und Morphogenese auf, wo durch ein genetisch gesteuertes

Programm aus der Mitte des lebenden Gewebes heraus einzelne Zellen entfernt werden.

(JACOBSON ET AL. 1997, VAUX ET AL. 1999). Bei der Reifung der T-Lymphozyten im Thymus

tritt ebenfalls Apoptose auf, in deren Ergebnis nur immunkompetente T-Zellen übrig bleiben.

Auch bei der Homöostase von Geweben oder Organen ist die Apoptose wichtig, weil so die

Balance zwischen Proliferation und Zelltod bewahrt wird und die Integrität des Organs

erhalten bleibt (THOMPSON 1995). Ausgelöst werden kann Apoptose ausserdem durch

Entzug von Wachstumsfaktoren, Ausschüttung bestimmter Zytokine, Schädigungen der DNA

oder virale Infektionen.

1.2.2. Zelluläre Ereignisse während des programmierten Zel ltodes

In den vergangenen zwei Jahrzehnten wurden verstärkte Anstrengungen bei der

Erforschung der Apoptose unternommen. Es bestand die Hoffnung, durch gezielte Angriffe

auf Krebszellen Wege und Mittel zur gezielten Behandlung von Krebserkrankungen zu

finden. Nach heutigem Wissen wird der programmierte Zelltod durch ein komplexes

Netzwerk von Signalen, Regulatorproteinen und Zellorganellen reguliert. Anhand von

Abbildung 3 soll im folgenden ein kurzer Überblick gegeben werden.

Das zentrale Ereignis bei der Induktion des programmierten Zelltodes ist die Aktivierung

spezifischer Aspartat-Proteasen, der Caspasen („Cystein-Asp artat-Proteasen“; ALNEMRI ET

AL. 1996), durch Spaltung an einer spezifischen Erkennungssequenz, die einen Aspartat-

Rest enthält (EARNSHAW ET AL. 1999). Caspasen können sich auch autokatalytisch

aktivieren, wenn sie zum Beispiel durch Bindung an einen sogenannten „Death Receptor“

(ein Protein, das zur Klasse der Tumornekrosefaktor-Rezeptoren gehört) in räumliche Nähe

Einleitung 9

zueinander gebracht werden. Im zeitlichen Verlauf einer Apoptose werden nacheinander

verschiedene Caspasen aktiviert, man spricht je nach Reihenfolge von Aktivator- und

Effektor-Caspasen. Die Caspase-Induktion führt zwangsläufig und irreversibel zum Tod der

betroffenen Zelle.

Abb. 3. Signalwege in der Apoptose. Der Death Receptor-vermittelte Teil ist links dargestellt, die zentrale Rolle der Mitochondrien wird im rechten Teil verdeutlicht. Wichtige Einzelheiten werden im Text erläutert. (aus KAUFMANN AND HENGARTNER 2001)

Es gibt zwei verschiedene Wege zur Aktivierung der Caspasen, den extrinsischen (durch die

Aktivierung eines Death Receptor) und den intrinsischen Weg (Freisetzung von Cytochrom C

aus den Mitochondrien, verursacht zum Beispiel durch Chemotherapeutika, Entzug von

Wachstumsfaktoren oder Schädigung der DNA durch UV-Bestrahlung; REED AND

THOMASELLI, 2000).

Zellmembranproteine aus der Familie der Tumornekrose-Faktor (TNF)- Rezeptoren werden

auch als Death Receptor bezeichnet, denn die Interaktion mit dem jeweiligen Liganden führt

über die Bindung von Adaptorproteinen direkt zur Aktivierung der Aktivator-Caspase 8.

(LOCKSLEY ET AL. 2001, BODMER ET AL. 2002). Die TNF-α-Rezeptor-Familie wird in zwei

Gruppen unterteilt. Die Rezeptoren, die Ähnlichkeiten zu TNF-Rezeptor-1 (CD120a, p55

TNF-Rezeptor-1) aufweisen, umfasst unter anderem den FAS/Apo-Rezeptor (CD95), den

Nerve Growth Factor-Receptor (p75 NGFR) und die Death-Rezeptoren 3, 4 und 5 (DR 3, -4

und -5). Alle Rezeptoren besitzen am N-Terminus (ausserhalb der Zellmembran) eine oder

mehrere cysteinreiche Immunglobulin-ähnliche Domänen, die für die Bindung an den

jeweiligen Liganden verantwortlich sind (ASHKENAZI AND DIXIT, 1998). Da der physiologische

Ligand dieser Rezeptoren als Trimer auftritt, entsteht auch ein Dreifach-Komplex der

Einleitung 10

entsprechenden Rezeptoren. Der zytoplasmatische C-Terminus enthält eine konservierte

Domäne, die „Death Domain“, die die Adaptorproteine TRADD („Tumor necrosis factor

Receptor Associated Death Domain protein“), FADD („Fas Associated Death Domain“) und

RIP („Receptor Interacting Protein“ oder „Requiesce In Pace“) bindet. Mit Hilfe dieser

Adaptorproteine wird die Caspase-8 gebunden, die sich durch die Rezeptor-Trimerisierung

autokatalytisch aktiviert. Der Komplex aus Rezeptor, Adaptor und Caspase-8 wird als DISC

(„death inducing signaling complex“) bezeichnet (WALCZAK ET AL. 2001). Neben dem für den

Zelltod verantwortlichen FADD/RIP-Komplex kann ein weiteres Adaptorprotein, TRAF

(„Tumor necrosis factor Receptor Associated Factor“) an TRADD binden, das die Induktion

der Stress-Proteinkinasen p38 und JNK-Kinase („Jun N-terminale Kinase“) und des

Transkriptionsfaktors NF-κB vermitteln kann, wodurch Signale für das Überleben ins Innere

der Zellen gesandt werden. Die Balance zwischen den Ereignissen, die entweder zum Tod

oder Überleben der Zelle führen, ist noch nicht komplett verstanden (BAUD AND KARIN 2001,

DENECKER ET AL. 2001).

Zu den TNF-Rezeptoren der Gruppe 2 zählen neben dem p75 TNF-Rezeptor-2 (CD120b)

auch die Proteine CD27, CD28, CD30, OX40, 4-1BB, GITR und Lymphotoxin B-Rezeptor.

Sie werden vorzugsweise auf Lymphozyten und anderen Zellen des Immunsystems

exprimiert und sind eher für einen kostimulatorischen Effekt bei der durch T-Zellen

vermittelten Immunantwort verantwortlich als für die Induktion des Zelltodes (IDRISS AND

NAISMITH 2000). Die Ursache ist vermutlich, dass ihr zytoplasmatischer C-Terminus keine

Death Domain besitzt, sondern spezifische Bindungsstellen für TRAF-Adaptorproteine. Da

es sechs verschiedene TRAF-Proteine gibt, werden die unterschiedlichen zellulären Effekte

der TNF 2-Rezeptoren vermutlich durch ihre unterschiedliche Affinität zu bestimmten TRAFs

reguliert (LOCKSLEY ET AL. 2001).

Das wichtigste Substrat der Caspase-8 ist die Effektor-Caspase-3. Durch deren Aktivierung

werden Substrat-Proteine gespalten, die direkt zur Ausprägung der apoptotischen

Morphologie beitragen (EARNSHAW ET AL. 1999). Unter anderem wird die Caspase-aktivierte

DNAse (CAD) aktiviert, die für die nukleosomale Fragmentierung der DNA verantwortlich ist.

Die Proteine PARP („Poly ADP Ribose Polymerase“) und DNA-PK (DNA-abhängige

Proteinkinase), die wichtig für die Reparatur von DNA-Strangbrüchen sind, werden

inaktiviert. Zytoskelett-Proteine wie Actin, Lamine und β-Catenin werden ebenfalls gespalten.

Ausserdem kann Caspase-8 das Protein Bid spalten, das im zweiten wichtigen

Signalweg der Apoptose die Mitochondrien beeinflusst. Bid ist Vertreter einer Familie von

Proteinen, die Homologie zu Bcl-2 aufweisen. Die Bcl-2-Proteine werden unterteilt in anti-

apoptotische (Bcl-2, Bcl-XL etc.) und pro-apoptotische (Bax, Bak, Bid, Bim etc.) Vertreter.

(ANTONSSON AND MARTINEAU 2000, ADAMS AND CORY 2001). Die Proteine der Bcl-2-Familie

integrieren sich mit Hilfe ihres C-Terminus in die äussere Mitochodrien-Membran und bilden

Einleitung 11

porenartige multimere Komplexe. Antiapoptotische Bcl-2-Proteine halten diese Poren

verschlossen, und das Membranpotential der Mitochondrien bleibt intakt. Durch

Heteromultimerisierung mit proapoptotischen Bcl-2-Proteinen werden diese Poren geöffnet.

Dadurch können Diablo/SMAC, Cytochrom C, AIF („Apoptosis inducing factor“) und andere

für die Ausführung der Apoptose wichtige Proteine in das Zytoplasma gelangen. Durch die

ATP-abhängige Bindung von Cytochrom C, Apaf-1 und Caspase-9 entsteht ein großer

Multiprotein-Komplex, das Apoptosom. Die Caspase-9 wird so aktiviert und spaltet ihrerseits

die Effektor-Caspase-3. Das Protein AIF gelangt in den Zellkern und verursacht Chromatin-

Kondensation und DNA-Fragmentierung (SHI 2001, WANG 2001).

1.2.3. Viren als Pathogene

Viren sind auf die Infektion von Wirtszellen und Replikation in deren Innerem zwingend

angewiesen. Vom Wirtsorganismus wird in vielen Fällen Apoptose als

Verteidigungsmassnahme gegen eine Virusinfektion eingesetzt. Deshalb haben viele Viren

Strategien entwickelt, um den Tod der Wirtszellen zu verhindern und ihre Replikation oder

Persistenz ungestört fortzuführen. Dagegen ist es zu einem späteren Zeitpunkt aus Sicht des

Virus durchaus sinnvoll, sich der Apoptose zu bedienen, um die Vielzahl der replizierten

Viren im Inneren der apoptotischen Zellfragmente freizusetzen und sie damit der

Aufmerksamkeit des Immunsystems zu entziehen (TEODORO AND BRENTON 1997). Eine

virusinduzierte Apoptose von Zellen des Immunsystems kann ebenfalls dazu beitragen, die

Replikation der Viren zu begünstigen.

Viren haben ausserdem eine Vielzahl von Strategien entwickelt, die Immunantwort im

Wirtsorganismus zu beeinflussen (ALCAMI AND KOSZINOWSKI 2000). Unter anderem kann

durch eine Virusinfektion die humorale Immunantwort gestört werden. Viren können

ausserdem die Wirkung von Zytokinen und Chemokinen inhibieren. Zum Beispiel bilden

Myxomaviren und Kuhpockenviren Proteine analog dem TNF-Rezeptor, die im Blut

zirkulieren, dort TNF-α binden und so die Aktivierung des Death Receptor auf den Zielzellen

verhindern.

Möglich ist jedoch auch eine direkte Unterdrückung des programmierten Zelltodes in den

virusinfizierten Zellen. Das bekannteste Beispiel hier ist das Protein IAP („Inhibitor of

APoptosis“) der Baculoviren, das direkt und mit hoher Affinität die aktiven Caspasen -9 und -3

inhibiert (siehe Abbildung 3; SALVESEN AND DUCKETT 2002). Auch in Drosophila und Säugern

wurden zu IAP homologe Proteine gefunden. Das Protein Smac/DIABLO wiederum, das sich

normalerweise im Intermembranraum der Mitochondrien befindet, wird bei einer Apoptose-

bedingten Schädigung der Mitochondrien freigesetzt. Es bindet dann an IAP und hebt die

Blockierung der Caspasen wieder auf.

Einleitung 12

Viele Viren besitzen zu den antiapoptotischen Bcl-2-Proteinen homologe Sequenzen, zum

Beispiel das Epstein-Barr-Virus und einige Herpesviren. Bei der Replikation der Viren wird

das homologe Protein freigesetzt und unterbindet den intrinsischen Apoptose-Weg (BARRY

AND MCFADDEN 1998; EVERETT AND MCFADDEN, 1999).

Auch verschiedene Picornaviren können in den infizierten Zellen Apoptose auslösen. Zum

Beispiel aktiviert das Poliovirus die Caspase-3, verursacht die Spaltung von PARP und DNA-

Fragmentierung (LÓPEZ-GUERRERO et al. 2000). Durch einen Caspase-3-Inhibitor wird der

zytopathische Effekt verhindert, nicht jedoch die Virusreplikation beeinflusst (AGOL ET AL.

1998). In Coxsackievirus-infizierten Zellen wurden ebenfalls Merkmale der Apoptose

festgestellt, zum Beispiel die Aktivierung von Caspase-3 in virusinfizierten HeLa-Zellen

(CARTHY ET AL. 1998). Eine Hemmung der Caspase-3 durch einen spezifischen Inhibitor

unterdrückt jedoch nicht den zytopathischen Effekt auf die Wirtszellen. In den Myozyten

Coxsackievirus B3-infizierter Mäuse wurden erhöhte Expressionsraten von Bcl-2, Fas und

Fas-Ligand gefunden, ausserdem war die Expression der induzierbaren NO-Synthase

erhöht. Dies deutet auf den Ablauf einer Immunreaktion in den betroffenen Zellen hin

(COLSTON ET AL. 1998).

Wie bereits erwähnt, spaltet die Protease 2A aus Coxsackie- und anderen Picornaviren den

eukaryontischen Transkriptionsinitiationsfaktor eIF-4G. Dadurch wird die Proteinsynthese der

Wirtszellen inhibiert (der „Virus-host-shutoff“; YALAMANCHILLI ET AL. 1996, KEREKATTE ET AL.

1999). Die Zellzyklus-Checkpoints, in denen die Integrität der betreffenden Zelle geprüft wird,

können nicht mehr durchschritten werden. Dadurch wird der programmierter Tod der Zelle

bewirkt (HARDWICK 1998). Wenn die herkömmliche Transkription nicht mehr möglich ist,

kommt es zu einer verstärkten Transkription Cap-unabhängiger Gene (mit IRES), wie zum

Beispiel des proapoptotischen Proteins Apaf-1. Dies wiederum bewirkt die Aktivierung der

Effektor-Caspase-3 (HOLCIK ET AL. 2000).

In Mäusen mit experimentell durch eine CVB3-Infektion hervorgerufenen Myokarditis wurde

in von einem zytopathischen Effekt betroffenen Arealen im Herzgewebe auch Apoptose

nachgewiesen (HENKE ET AL. 1995, HUBER 2000, KYTÖ ET AL. 2001).

1.3. Das pro -apoptotische Protein Siva

Die Ligation des CD27-Rezeptors (der zur Klasse 2 der TNF-Rezeptoren gehört, siehe

Abschnitt 1.2.2.) mit seinem physiologischen Liganden CD70 kann über das Adaptormolekül

TRAF2 zur Aktivierung der JNK-Kinase oder zum apoptotischen Tod der Zielzelle führen.

Der zytoplasmatische Teil von CD27 enthält keine Death Domain und kann also nicht die für

die rezeptor-vermittelte Apoptose wichtigen Adaptorproteine FADD und TRADD binden. In

dem knapp 50 Aminosäuren umfassenden zytoplasmatischen Teil von CD27 befindet sich

jedoch eine Bindungsstelle für TRAF2 (AKIBA ET AL. 1998). Vor einigen Jahren wurde mit

Einleitung 13

Hilfe des Zweihybrid-Systems nach Proteinen gesucht, die mit CD27 interagieren und

Apoptose auslösen können. Es wurde ein bislang unbekanntes, 21 kDa großes Protein

gefunden, das die Entdecker Siva (nach dem Hindu-Gott des Todes und der Zerstörung)

nannten, denn seine Überexpression in adhärenten Säugerzellen führte zu DNA-Degradation

und zum apoptotischen Tod der Zellen (PRASAD ET AL. 1997). Das Protein Siva wird in

verschiedenen menschlichen Geweben (Thymus, Prostata, Testis und Ovar) und einigen

Zellinien exprimiert. Durch Vergleiche mit den Aminosäure-Sequenzen bekannter Proteine

wurde deutlich, dass das Siva-Molekül im mittleren Abschnitt eine gewisse Homologie mit

den Death Domain-Proteinen FADD und RIP aufweist. Der C-Terminus von Siva enthält

mehrere Cystein-Reste und hat Ähnlichkeit zu B-Box- und Zinkfinger-Proteinen. Dem N-

Terminus von Siva wurde keine Funktion zugeordnet (siehe Abbildung 4).

Abb. 4: Das proapoptotische Protein Siva. A: Domänen-Struktur von Siva. Nach Vergleichen der Aminosäure-Sequenz von Siva mit bekannten Proteinen wurde eine Death Domain postuliert (AS 61-136). Der Cystein-reiche C-Terminus enthält Vermutlich eine B-Box und einen Zink-Finger, beides Domänen, die Zink-Ionen komplexieren können. Im unteren Teil ist die Lage der Aminosäure-Deletion in der verkürzten Variante Siva-2 dargestellt. (nach PRASAD ET AL. 1997; YOON ET AL. 1999).

Zwei Jahre später wurden die Ergebnisse weiterer Untersuchungen zu Siva veröffentlicht

(YOON ET AL. 1999). Es wurde ein zu Siva homologes Protein aus der Maus isoliert, das zu

70% identische Aminosäuren aufweist. Das Maus-Siva wird vor allem in Herz, Lunge, Leber,

Testis und Skelettmuskel exprimiert. Durch alternatives Splicing wird das Exon 2 von Maus-

Siva deletiert, und es entsteht ein um 65 Aminosäuren verkürztes Protein, genannt Siva-2

(im Gegensatz zu Siva-1, dem Gesamtprotein). Exon 2 umfasst ein Stück des N-Terminus

und die Aminosäuren 61-118 der Death Domain-homologen Region (siehe Abbildung 4).

Siva wurde auch von anderen Arbeitsgruppen untersucht. Es wurde zum Beispiel

festgestellt, dass bei Nierenversagen aufgrund von Ischämie (mangelnde Durchblutung)

CD27 in den Nieren exprimiert wird, und der Tod der Nierenzellen möglicherweise durch die

Interaktion mit Siva verursacht wird (PADANILAM ET AL. 1998).

Die Grundlage für die vorliegende Doktorarbeit bildete die Beobachtung, dass während einer

Infektion mit Coxsackievirus B3 die Expression von Siva in den infizierten Zellen deutlich

N-Terminus Death Domain B-Box Zn-Finger

1 61 136 164 189

Gesamtprotein(Siva -1)

Splice -Variante(Siva -2)

1 53 119 136 164 189

AS

AS

N-Terminus Death Domain B-Box Zn-Finger

1 61 136 164 189

Gesamtprotein(Siva -1)

Splice -Variante(Siva -2)

1 53 119 136 164 189

AS

AS

Einleitung 14

zunimmt. Es wurde nachgewiesen, dass Siva mit dem Capsidprotein VP2 von

Coxsackievirus B3 interagiert (HENKE ET AL. 2000).

1.4. Zielsetzung der Arbeit

Wie bereits beschrieben wurde, sind die molekularen Mechanismen der Pathogenese von

Coxsackievirus B3 weitgehend ungeklärt. In der vorliegenden Promotionsarbeit sollte durch

eine funktionelle Analyse des proapoptotischen Proteins Siva versucht werden, die Ursache

der durch das Coxsackievirus B3 verursachten Zellschädigungen näher zu charakterisieren.

Die Expression von Siva wird durch die Infektion mit Coxsackievirus B3 aktiviert (HENKE ET

AL. 2000). Ausserdem wurde nachgewiesen, dass das Virus-Capsidprotein VP2 mit Siva

interagiert.

Siva besitzt eine ungewöhnliche Aminosäure-Zusammensetzung, insbesondere enthält es

sehr viele Cystein- und Histidin-Reste. Es sollte versucht werden, aufgrund einer Analyse der

Proteinsequenz von Siva Mutanten dieses Proteins herzustellen, deren Funktion im

Vergleich zum vollständigen Protein eingeschränkt ist. Dabei sollten bisher bekannte Daten

über das Vorhandensein funktioneller Domänen im Siva-Molekül berücksichtigt werden.

Die Interaktion des Hüllproteins VP2 mit Siva ist für die Pathogenese einer Coxsackievirus-

Infektion von Bedeutung. Mit Hilfe eines in vitro-Interaktionsassays sollte diese durch einen

unabhängigen Versuch mit rekombinant in E. coli exprimiertem Siva bestätigt werden. Durch

Verwendung von Fragmenten des Siva-Proteins sollte versucht werden, den Ort der

Interaktion mit VP2 auf dem Siva-Molekül einzugrenzen.

Weiterhin sollte die Bindung von Siva an den zellulären Rezeptor CD27 näher untersucht

werden. Dieses Protein gehört zu den Tumornekrosefaktor-Rezeptoren, die wichtige

regulatorische Funktionen bei der Kommunikation von Zellen mit ihrer Umgebung und

anderen Zellen ausüben. Möglicherweise spielt die Interaktion von CD27 mit Siva bei der

Induktion der Apoptose durch die Infektion mit Coxsackievirus eine Rolle.

Durch Screenen einer cDNA-Bank aus humanem Herzmuskel sollte darüber hinaus versucht

werden, bislang unbekannte Bindungspartner von Siva zu finden. Eventuell lassen sich

durch solche Siva-bindenden Proteine Aussagen zu Ursache und Regulation des von

Coxsackievirus B3 verursachten zytopathischen Effekts treffen.

Material und Methoden 15

2. Material und Methoden

2.1. Material

2.1.1. Verwendete Stämme und Zellinien

Tabelle 2: Verwendete Escherichia coli-Stämme.

Stamm Genotyp Herkunft

MC1061 F-, araD139, ∆(ara-leu)7696, galE15, galK, galU, ∆(lac)X74,

rpsL, (Strr), hsdR2, (rK-mK+), mcrA, mcrB1

New England Biolabs

(WERTMANN ET AL. 1986)

HB101 F-, ∆(gpt-proA)62, leuB6, supE44, ara14, galK2, lacY, ∆(mcrC-

mrr), rspL20, (Strr), xyl-5, mtl-1, recA13

New England Biolabs

(BOYER ET AL. 1969)

BL21 F-, ompT, hsdS (rB-mB-), gal (38,39), dcm

Pharmacia

(STUDIER ET AL. 1986)

RV308 F-, lac74-galISII::OP308strA

ATCC-Nummer 31608

ATCC

(MAURER ET AL. 1980)

Tabelle 3: Der eingesetzte Saccharomyces cerevisiae-Stamm.

Stamm Genotyp Herkunft

KFY3 MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, -112,

gal4∆, gal80∆, cyhr2, LYS2::GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3, URA3::GAL1UAS-

GAL1TATA-lacZ,ADE2::ADE2, leu2::PGAL1-yEGFP3-loxP-kanMX-loxP

K. Fahr,

HKI Jena (1999)

Tabelle 4: Verwendete Zellinien.

Zellinie Beschreibung Herkunft

HeLa Humane Zervix-Adenokarzinom-Zellinie, adhärent

ATCC-Nummer CCL2

Dr. A. Henke, Institut für

Virologie, FSU Jena

293 Humane Nieren-Zellinie, transformiert mit Adenovirus 5,

adhärent

ATCC-Nummer CRL-1573

Dr. A. Henke, Institut für

Virologie, FSU Jena


2.1.2. Vektoren und Plasmide

Tabelle 5: In dieser Arbeit verwendete kommerzielle oder von anderen zur Verfügung

gestellte Plasmide.

Plasmid/Vektor Beschreibung Herkunft

pAS2-1 GAL4-BD, TRP1, ampR, 2µ

Zweihybridvektor mit GAL4-DNA-Bindedomäne

Clontech

pGAD GH GAL4-AD, LEU2, ampR, 2µ

Zweihybridvektor mit GAL4-Aktivierungsdomäne

Clontech

pGEX4T-1 GST, ampR

E. coli-Expressionsvektor für GST-Fusionsproteine

Pharmacia

pGEX4T-3 GST, ampR

E. coli-Expressionsvektor für GST-Fusionsproteine

Pharmacia

p413GPD PGPD, HIS3, ampR, CEN/ARSH4

S. cerevisiae-Expressionsvektor

T. Munder, HKI Jena

p423GPD PGPD, HIS3, ampR, 2µ

S. cerevisiae-Expressionsvektor

T. Munder, HKI Jena

pMAL-c2x malE-lacZ, ampR

E. coli-Expressionsvektor für MBP-Fusionsproteine,

Faktor Xa-Spaltstelle

New England Biolabs

pCDNA3 PCMV, ampR

Expressionsvektor für Säugerzellen

Invitrogen

pCMV-Tag5A PCMV, neo/kanR

Expressionsvektor für Säugerzellen (C-terminaler myc-tag)

Stratagene

pKK6 pGAD GH

GAL4-AD-Siva

T. Munder, HKI Jena

pKK7 pAS2-1

GAL4-BD-Siva

T. Munder, HKI Jena

pKK8 pGAD GH

GAL4-AD-Siva (AS 1-61)

T. Munder, HKI Jena

pKK12 pGAD GH

GAL4-AD-Siva (AS 1-127)

T. Munder, HKI Jena

pAS2-1-VP2 GAL4-BD-VP2 (CVB3H3 Woodruff) T. Munder, HKI Jena

pAS2-1-VP2 N165D GAL4-BD-VP2 (CVB3H310A1) T. Munder, HKI Jena

pTM145 GAL4-BD-BCY1, TRP1, ampR, 2µ T. Munder, HKI Jena


pTM146 GAL4-AD-BCY1, TRP1, ampR, 2µ T. Munder, HKI Jena

piH3M-CD27 Expressionsplasmid für CD27 (human) Brian Seed, Boston

pEGFPC1-PMP22 Expressionsplasmid für GFP-PMP22 U. Brosius, Universität

Düsseldorf

pEGFPC1-Siva Expressionsplasmid für GFP-Siva U. Martin, Universität

Jena

Tabelle 6: Für diese Arbeit konstruierte Plasmide.

Plasmid Vektor Beschreibung

pMN01 pGEX4T-1 PCR-Fragment (HT253/MN003) aus pKK6 in pGEX4T-1 (EcoRI / XhoI)

Expression von GST-Siva (AS 1-61) in E. coli

pMN02 pGEX4T-3 PCR-Fragment (HT280/HT254) aus pKK6 in pGEX4T-3 (EcoRI / XhoI)




pMN04 pGEX4T-3 PCR-Fragment (MN001/HT281) aus pKK6 in pGEX4T-3 (EcoRI / XhoI)








pMN09 pAS2-1 PCR-Fragment (MN011/MN012) aus piH3M-CD27 in pAS2-1 (EcoRI / BamHI)

GAL4 BD-CD27 (zytoplasmatischer Teil, AS 193-240)

pMN10 pAS2-1 PCR-Fragment (MN011/MN006) aus piH3M-CD27 in pAS2-1 (EcoRI / BamHI)

GAL4 BD-CD27 (zytoplasmatischer Teil, AS 193-220)

pMN12 p413GPD PCR-Fragment (ST13/ST12) aus pAS2-1-VP2 in p413GPD (BamHI / EcoRI)

Expression von VP2 (CVB3 Woodruff) in S. cerevisiae

pMN14 p413GPD PCR-Fragment (ST13/ST12) aus pAS2-1-VP2 N165D in p413GPD

(BamHI / EcoRI)

Expression von VP2 N165D (CVB310A1) in S. cerevisiae














pMN25 pMAL-c2x PCR-Fragment (MN027/MN016) aus pKK6 in pMAL-c2x (XmnI / HinDIII)

Expression von MBP-Siva in E. coli

pMN27 pGEX4T-1 Ligation der PCR-Fragmente (HT253/MN030 und MN031/HT254) aus

pKK6 und Klonierung in pGEX4T-3 (EcoRI / XhoI)

Expression von GST-Siva Spl. (AS 62-189) in E. coli

pMN28 pGAD GH PCR-Fragment (HT253/HT254) aus pMN27 in pGAD GH (EcoRI / XhoI)

GAL4 AD-Siva Spl.

pMN29 pAS2-1 PCR-Fragment (HT253/HT254) aus pMN27 in pAS2-1 (EcoRI / SalI)

GAL4 AD-Siva Spl.

pMN40 pcDNA3 PCR-Fragment (HT253/HT254) aus pKK6 in pcDNA3 (EcoRI / XhoI)

Expression von HA-Siva in Säugerzellen

pMN41 pcDNA3 PCR-Fragment (HT253/HT254) aus pMN27 in pcDNA3 (EcoRI / XhoI)

Expression von HA-Siva-2 in Säugerzellen

pMN42 pcDNA3 PCR-Fragment (HT253/HT282) aus pKK6 in pcDNA3 (EcoRI / XhoI)

Expression von HA-Siva ∆ C-Terminus in Säugerzellen

pMN43 pcDNA3 PCR-Fragment (MN054/MN055) aus pKK6 in pcDNA3 (EcoRI / XhoI)

Expression von myrSiva-HA in Säugerzellen

pMN44 pMAL-c2x PCR-Fragment (MN027/MN016) aus pMN27 in pMAL-c2x (XmnI / HinDIII)

Expression von MBP-Siva-2 in E. coli

pMN45A pCMV-

Tag5A

PCR-Fragment (MN056/MN057) aus pEGFPC1-PMP22 in pCMV-Tag5A

(EcoRI / SalI)

Expression von PMP22-HA-myc in Säugerzellen

pMN47 pMAL-c2x PCR-Fragment (MN027/MN059) aus pMN27 in pMAL-c2x (XmnI / HinDIII)

Expression von MBP-Siva ∆ C-Terminus in E. coli

pKK11 pGAD GH PCR-Fragment (HT279/HT281) aus pKK6 in pGAD GH (EcoRI / XhoI)

GAL4 AD-Siva (AS 1-164)

pKK13 pAS2-1 PCR-Fragment (HT253/HT281) aus pKK6 in pAS2-1 (EcoRI / SalI)

GAL4 BD-Siva (AS 1-164)

pKK14 pGAD GH PCR-Fragment (MN040/HT254) aus pKK6 in pGAD GH (EcoRI / XhoI)

GAL4 AD-Siva (AS 128-189)


2.1.3. Synthetische Oligonukleotide

Tabelle 7: Verwendete PCR-Primer mit Restriktionsenzym-Erkennungsstellen und anderen

Merkmalen.

Primer Sequenz (Restriktionsenzym)

HT253 5´-TCGGAATTCATGAGGCGGCCGGGGAGCTGC (EcoRI)

HT254 5´-GTCGCTCGAGTCAGGTCTCGAACATGGCACAG (XhoI)

HT279 5´-ATCGAATTCGATGAGGCGGCCGGGGAGCT (EcoRI)

HT281 5´-AGCTCTCGAGACAGGCCACGGAGCCGCAGC (XhoI)

HT282 5´-AGCTCTCGAGACAGGCAATGGACGCTACCC (XhoI)

ST12 GCGAATTCCTACTGGTGCCCGGCCAAACGTAG (EcoRI)

ST13 GACGGATCCATGTCCCCCACAGTAGAGGAGTGC (BamHI)

MN001 GCGAATTCATGTTCCTCATGCGTGCGAG (EcoRI)

MN002 GCGAATTCATGTACCCTGTGTGGCCTC (EcoRI)

MN003 TCGCTCGAGGAACAGGAGTCGCTTGGTCTTC (XhoI)

MN004 TCGCTCGAGATCCACGGCTCGCACGCATG (XhoI)

MN006 CGGGATCCTCCTCCTTGGGGCACCTG (BamHI)

MN011 GCGAATTCCAACGAAGGAAATATAGATC (EcoRI)

MN012 CGGGATCCGGGGGAGCAGGCAGGCTCCGG (BamHI)

MN013 TCGCTCGAGGTCAGCTTCGGAGGCCTGCCC (XhoI)

MN014 GCGAATTCACCATCTGGGGTAGCGTCCATTG (EcoRI)

MN016 GTCCCCAAGCTTTCAGGTCTCGAACATGGCACAG (HinDIII)

MN027 GCATTCGAAGGATTTCAAGGCGGCCGGGGAGCTGC (XmnI)

MN030 GAAGACCTCCTGCGAGTAGCG

MN031 GACCCATCTGGGGTAGCGTTC

MN040 GTCGAATTCGATGTGTTCCTCATGCGTGCGAGCCG (EcoRI)

MN053 TCGGAATTCCTAGACACC ATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTAGGCG

GCCGGGGAGCTGCGTAGC (EcoRI, Kozak-Sequenz, HA-tag)

MN054 TCGGAATTCCTAGACACC ATGGGTAGCAACAAGAGCAAGCCCAGGCGGCCGGGGAGCTG

CGTAGC (EcoRI, Kozak-Sequenz, c-src Myristoylierungssequenz)

MN055 TCGCTCGAGTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGGTCTCGAACATGGCACAGCT

GG (XhoI, reverser HA-tag)

MN056 TCGGAATTCCTAGACACC ATGGCGCCGGCCGCGTCCAGGCTG (EcoRI, Kozak-Sequenz)

MN057 TCGCTCGAGAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA CTTCCCCAAGGAGGCCAGGTAG

GC (XhoI, reverser HA-tag)

MN059 GTCCCCAAGCTTTCAGGCAATGGACGCTACCCCAGATGG (HinDIII)


Tabelle 8: Zur Sequenzierung eingesetzte Primer.

Primer Sequenz Modifikation

malE forward GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC 5´-IRD 800

malE reverse CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 5´-IRD 800

T7 TAATACGACTCACTATAGGG 5´-IRD 800

T3 ATTAACCCTCACTAAAGGGA 5´-IRD 800

CMV forward CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 5´-IRD 800

VP2 GCGCAACGCTAAACAACACC 5´-IRD 800

GAL4 AD TACCACTACAATGGATG 5´-IRD 800

GAL4 BD TCATCGGAAGAGAGTAG 5´-IRD 800

pGAD GH reverse AGTTGAAGTGAACTTGCGGGG 5´-IRD 800

2.1.4. Kulturmedien für Escherichia coli

LB-Medium 10g Bacto-Trypton, 5g Hefeextrakt, 5g NaCl ad 1l a. bidest.

LBAmp-Medium LB-Medium unter Zusatz von 100µg/ml Ampicillin (SL 100mg/ml)

LBKana-Medium LB-Medium unter Zusatz von 100µg/ml Kanamycin (SL 100mg/ml)

SOC-Medium 2g Bacto-Trypton, 0,5g Hefeextrakt, 0,06g NaCl, 0,02g KCl, 0,2g

MgCl2 x 6 H2O, 0,25g MgSO4 x 7 H2O, 0,36g Glucose ad 100ml a.

bidest.

M9-Platten 15g/l Agar

nach dem Autoklavieren Zugabe von: 1x M9-Salzen (SL 5x M9-

Salze), 4% (w/v) Glucose, 1x Aminosäuren (SL 10x Aminosäuren),

1mM Thiamin (SL 1M), 40µg/ml Prolin (SL 4mg/ml), 100µg/ml

Ampicillin (SL 100mg/ml)

LB- und SOC-Medium wurden durch Autoklavieren (120°C, 20min) sterilisiert. Ampicillin und

Kanamycin wurden nach dem Abkühlen zugegeben. LB-, LBAmp- und LBKana-Medium wurden

durch Zugabe von 15g/l Agar auch als Festmedien verwendet.


2.1.5. Kulturmedien und Lösungen für Saccharomyces cerevisiae

YPD-Medium 20g Bacto-Pepton, 10g Hefeextrakt, 20g Glucose ad 1l a. bidest.

10x YNB-Glukose (SL) 6,7g YNB, 20g Glukose

ad 100ml a. bidest

Minimalmedium 450ml a. bidest.

nach dem Autoklavieren Zugabe von 50ml 10x YNB-Glucose und

essentiellen Aminosäuren je nach Auxotrophie

Essentielle Aminosäuren 20mg/l Adenin-Hemisulfat (SL 200mg/100ml); 20mg/l L-Histidin (SL

1g/100ml); 30mg/l L-Leucin (SL 1g/100ml); 30mg/l L-Lysin (SL

1g/100ml); 20mg/l L-Methionin (SL 1g/100ml); 20mg/l L-Tryptophan

(SL 1g/100ml)

3-AT-Platten Minimalmedium mit 15g/l Agar

nach dem Autoklavieren Zugabe von 5mM 3-AT

5xM9-Salze 64g Na2HPO4 x 7 H2O, 15g KH2PO4, 2,5g NaCl, 5g NH4Cl ad 1l a.

bidest.

10x Aminosäuren für M9-

Platten

300mg L-Isoleucin, 1,5g L-Valin, 200mg L-Adenin Hemisulfat, 200mg

L-Arginin-HCl, 200mg L-Histidin-HCl, 300mg L-Lysin, 200mg L-

Methionin, 500mg L-Phenylalanin, 2g L-Threonin, 200mg L-

Tryptophan, 300mg L-Tyrosin, 200mg L-Uracil

ad 1l a. bidest

YPD-Medium und Minimalmedium wurden durch Autoklavieren sterilisiert, essentielle

Aminosäuren und 5xM9-Medium durch Sterilfiltration. YPD- und Minimalmedium wurden durch

Zugabe von 15g/l Agar auch als Festmedien eingesetzt.

2.1.6. Kulturm edien und Lösungen für die Kultur von Säugerzellen

DMEM komplett DMEM-Medium

10% (v/v) FCS, 1%(v/v) Penicillin/Streptomycin

PBS 8g NaCl, 0,2g KCl, 1,44g Na2HPO4 x 2H2O, 0,2g KH2PO4

ad 1l a. bidest., pH 7,4. autoklaviert


2.1.7. Puffer und Lösungen

Anoden-Puffer 200mM Tris, pH 8,9

Bindungspuffer für

Interaktions-Assay

50mM Tris pH 7,5, 150mM NaCl, 0,1% (v/v) NP40, 1mM EDTA

1% (w/v) BSA, sterilfiltrieren, aufbewahren bei 4°C

Blockierlösung WB TBS-T mit 5% (w/v) Magermilchpulver

Chloroform/Isoamylalkohol 96ml Chloroform, 4ml Isoamylalkohol

dNTP-SL 2mM 20µl dATP, 20µl dCTP, 20µl dGTP, 20µl dTTP (SL jeweils 100mM)

ad 1ml a. bidest

dNTP-SL 10mM 100µl dATP, 100µl dCTP, 100µl dGTP, 100µl dTTP (SL jeweils

100mM) ad 1ml a. bidest

DEPC-a. bidest. 1ml DEPC ad 1l a. bidest., rühren über Nacht, dann autoklavieren

Gel-Puffer 3M Tris pH 8,45, 0,3% (w/v) SDS

Kathoden-Puffer 100mM Tris, 100mM Tricin, 0,1% (w/v) SDS

Ladepuffer für Agarose-

Gelelektrophorese

50% Glycerol, 0,05% (w/v) Bromphenolblau

Lysepuffer für Plasmid-

Rescue

10mM Tris, 1mM EDTA pH 8,0, 100mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2%

(w/v) Triton X-100

Lösung 1 25mM Tris, 10mM EDTA pH 8,0, 50mM Glucose

4mg/ml Lysozym frisch zugeben

Lösung 2 0,2M NaOH, 1% (w/v) SDS

Lösung 3 3M Kaliumacetat pH 5,5

NTE 10 mM Tris, pH 7,4, 100mM NaCl, 1mM EDTA

4% PAA-Gel 21g Harnstoff, 6ml 10x TBE, 6ml Long Ranger-Solution, 300µl APS

(SL 10% w/v), 10µl TEMED

PBS 8g NaCl, 0,2g KCl, 1,44g Na2HPO4 x 2H2O, 0,2g KH2PO4 pH7,4

ad 1l a. bidest.

PBS mit Proteaseinhibitoren PBS mit 10µg/ml Aprotinin, 10µg/ml Leupeptin, 100µg/ml PMSF (SL

10mg/ml in 2-Propanol), 1mM DTT

PBS zum Aufschluss von

E. coli

PBS mit Proteaseinhibitoren und 4mg/ml Lysozym, 1% (v/v) Triton X-

100

Probenpuffer für SDS-

Elektrophorese (4x konz.)

0,125M Tris pH 6,8, 4% (w/v) SDS, 5% (v/v) 2-Mercaptoethanol, 20%

(v/v) Glycerol, 0,05% (w/v) Bromphenolblau

Sammelgel-Acrylamid 48g Acrylamid, 1,5g Bis-Acrylamid

ad 100ml a. bidest.


Sammelgel 4% für SDS-

PAGE

1ml Sammelgel-Acrylamid, 3ml Gel-Puffer, 8ml a. bidest., 30µl APS

(SL 10% w/v), 12µl TEMED

50x TAE 242g Tris Base, 57,1ml Essigsäure, 100ml 0,5M EDTA (pH 8,0)

ad 1l a. bidest

10x TBE 162g Tris Base, 55g Borsäure, 9,3g EDTA

ad 1l a. bidest

TBS-T 20mM Tris pH 7,5, 150mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20

TE 10mM Tris, 1mM EDTA pH 8,0

TFBI 30mM Kaliumacetat (SL 3M, pH 6,0), 50mM MnCl2 (SL 1M), 100mM

KCl (SL 3M), 10mM CaCl2 (SL 1M), 15% (w/v) Glycerol

TFBII 10mM MOPS (SL 1M, pH 7,0), 75mM CaCl2 (SL 1M), 10mM KCl (SL

4M), 15% (w/v) Glycerol

TNG-Puffer 10mM Tris pH8,0, 200mM NaCl, 5% (v/v) Glycerol

Towbin-Blotpuffer 3g Tris, 14,4g Glycin, 0,05% (w/v) SDS

ad 1l a. bidest.

Trenngel-Acrylamid 46,5 g Acrylamid, 1,5% Bis-Acrylamid

ad 100ml a. bidest

Trenngel 10% für SDS-PAGE 3ml Trenngel-Acrylamid, 5ml Gel-Puffer, 4,5ml a. bidest., 2,5ml

Gylzerol, 50µl APS (SL 10% w/v), 18µl TEMED

Z-Puffer 16,1g Na2HPO4 x 7H2O, 5,5g NaH2PO4 x H2O, 0,75g KCl, 0,25g

MgSO4 x 7H2O

ad 1l a. bidest

Z-Puffer/X-Gal-Lösung 10ml Z-Puffer, 27µl β-Mercaptoethanol, 167µl X-Gal-SL (20mg

X-Gal/1ml DMF)

2.1.8. Chemikalien, Enzyme, Reagenzien und Kits

Amersham Pharmacia, Little Chalfont, U.K.

Glutathion-Sepharose 4B, ECL western blotting detection kit, Thermo Sequenase fluorescent

labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza dGTP

BD Biosciences, Heidelberg

Calibrite™-beads, Yeast nitrogen base (YNB) ohne Aminosäuren

BD Biosciences Clontech, Heidelberg

Human heart Matchmaker cDNA library


Biochrom, Berlin

Trypanblau, DMEM, Trypsin/EDTA 10x, Penicillin/Streptomycin, Fötales Kälberserum

Bio-Rad, München

GenePulser Elektroporationsküvetten (0,2cm gap), Protein assay (Bradford)

Biozym, Oldendorf

Long Ranger Solution (50%)

BTS biotech trading service, St. Leon Roth

X-Gal

Calbiochem, Schwalbach/Ts.

Camptothecin

Fluka, Berlin

N-Acetylcystein

ICN Biomedicals, Hilden

NP-40

Invitrogen/Gibco Life sciences, Karlsruhe

Agarose electrophoresis grade, alle Restriktionsenzyme (ausser XmnI), dNTP Set, Kanamycin,

Lipofectamin 2000, MultiMark prestained protein standard, NuPAGE Bis-Tris-Gel 4-12%,

NuPAGE MOPS SDS running buffer, NuPAGE LDS Sample Buffer, NuPAGE Sample Reducing

Agent, NuPAGE Transfer Buffer, NuPAGE Antioxidant , Ready-Load 1kB DNA ladder, OptiMEM

I - Medium, Platinum Pfx DNA Polymerase, SeeBlue Plus2 Protein marker, Superscript Reverse

Transcriptase

Merck, Darmstadt

Bromphenolblau, Dimethylsulfoxid, Glycerol, Isoamylalohol, KCl, KH2PO4, MgCl2 x 6H2O,

MgSO4 x 7H2O, Na2HPO4 x 7H2O, NaH2PO4 x H2O, Ponceau S, Tricin, Tris-HCl

Millipore, Darmstadt

Ultrafree-DA DNA purification columns

New England Biolabs, Frankfurt

Amylose Resin, XmnI

Promega, Mannheim

Taq DNA Polymerase

Qiagen, Hilden

Effectene Transfektionsreagenz

Roche Diagnostics, Mannheim

Alkalische Phosphatase aus Tiefseegarnelen, Ampicillin, Pwo DNA-Polymerase


Roth, Karlsruhe

Agar, Borsäure, Chloroform, Dialyseschlauch, Ethanol, Glasperlen, (0,45-0,5mm), Glycin,

Impfösen/Impfnadeln, Kaliumacetat, LiCl, Lithiumacetat, Magermilchpulver, 2-Mercaptoethanol,

MOPS, NaCl, PEG 3350, Phenol/Chloroform-Lösung, 2-Propanol, SDS, Tris Base, Tris/HCl

Schleicher&Schüll, Dassel

Optitran BA-S 83 Nitrocellulose

Serva, Heidelberg

Acrylamid, Ammoniumpersulfat, Bis-Acrylamid, Bromphenolblau, Coomassie Brilliantblau R250,

L-Lysin Hydrochlorid, PMSF, TEMED, L-Tryptophan,

Sigma, Deisenhofen

3-AT, Actinomycin D, Adenin Hemisulfat, Albumin (Bovin), L-Arginin Hydrochlorid, Aprotinin,

Benzamidin, Etoposid, L-Histidin Hydrochlorid, L-Isoleucin, L-Leucin, Leupeptin, Lysozym, L-

Methionin, MTT, Nitroprussid-Natrium, PAR, L-Phenylalanin, Polyethylenglykol 3350, PMPS, L-

Prolin, Röntgenfilm Kodak X-Omat AR 13x18 cm, Rundfilter 7cm und 12,5 cm, Salmon testes

DNA, Thiamin Hydrochlorid, L-Threonin, L-Tyrosin, L-Valin, Wasserstoffperoxid

Whatman/Biometra, Göttingen

Filterpapier für Western Blot

2.1.9. Antikörper

Anti-VP2-Antiserum (rabbit) Dr. A. Henke, Institut für Virologie

Anti-Rabbit-Peroxidase (goat) Dianova

Anti-myc tag (rabbit) Dianova

2.1.10. Geräte

FACStar+ mit Turbosort-Option BD Biosciences Immunocytometry Systems,

Heidelberg

Sequenzierer "LiCOR" MWG; Ebersberg

Horizontale Gelelektrophorese-Apparatur Bio-Rad, München

Vertikale Elektrophorese-Apparatur "Mini-Protean II" Bio-Rad, München

Semi-dry Transferapparatur "TransBlot SD" Bio-Rad, München

UV/VIS Spektrometer LB50 Beckman Coulter, Krefeld

Elektroporationsgerät "Gene Pulser" Bio-Rad, München

PCR-Gerät "MiniCycler" MJ Research, Watertown/Mass, USA


Wipptisch WT12 Whatman-Biometra, Göttingen

Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg

Tischzentrifuge "Biofuge fresco" Heraeus, Hanau

Sicherheitswerkbank "Laminair HB 2448" Heraeus, Hanau

Zellkultur-Brutschrank IG150 Jouan, Unterhaching

Zellkulturmikroskop "Telaval 31" Carl Zeiss, Jena

Ultraschall-Aufschlussgerät "Labsonic U" Schütt Labortechnik, Göttingen

Geldokumentationsanlage "Gene Genius" und

GeneSnap-Software

Merck Eurolab, Darmstadt

Zentrifuge 4K10 Sigma Laborzentrifugen, Osterode

Kühlzentrifuge Sorvall RC 50 plus Kendro Laborprodukte, Hanau

Hochdichtefermenter „Sixfors“ Infors, Schweiz

Rotationsschüttler für Flüssigkulturen Infors, Schweiz

2.2. Methoden

2.2.1. Transformatio n von E. coli nach Hanahan ( HANAHAN 1983)

Herstellung kompetenter E. coli-Zellen

Aus einer Einzelkolonie von E. coli wurde eine 5ml-Vorkultur in LB-Medium beimpft und über

Nacht geschüttelt (180rpm, 37°C). Für die Hauptkultur wurde zu 100ml LB-Medium 10mM KCl

(SL 1M) und 20mM MgSO4 (SL 1M) pipettiert und das Medium auf 37°C erwärmt. Anschliessend

wurde 1ml der Vorkultur zugegeben und bis zum Erreichen einer OD600 von 0,6 geschüttelt

(ungefähr 2h). Die Bakterien wurden durch Zentrifugation (2500x g, 10min, 4°C) geerntet und

vorsichtig in 15ml eiskaltem TFB I resuspendiert. Nach 10minütiger Inkubation auf Eis wurden

die Bakterien erneut zentrifugiert (2500x g, 10min, 4°C), der Überstand vorsichtig dekantiert und

das Pellet kurz getrocknet. Die Bakterien wurden dann in 2ml TFB II vorsichtig resuspendiert

und in vorgekühlte Eppendorf-Gefässe in Portionen zu 200µl aliquotiert. Durch Aufbewahrung

bei -70°C waren die kompetenten E. coli-Zellen bis zu einem halben Jahr für die Transformation

einsetzbar.

Transformat ion in kompetente E. coli-Zellen

Für eine Transformation wurde ein Aliquot der kompetenten Zellen auf Eis aufgetaut und

vorsichtig mit der zu transformierenden Plasmid-DNA vermischt. Der Ansatz wurde unter


gelegentlichem Schütteln für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschliessend folgte ein Hitzeschock

bei 42°C für 1min 45s. Nach einer kurzen Inkubation auf Eis wurde 1ml LB-Medium zugegeben

und der Ansatz für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Anschliessend wurden die Bakterien

zentrifugiert (2500x g, 5min, 4°C) und in 100µl LB-Medium aufgenommen. Die Suspension

wurde auf Agarplatten mit Selektionsmedium ausplattiert (LBAmp- oderLBKana-Platten) und

über Nacht bei 37°C im Brutschrank angezogen.

2.2.2. Transformation des E. coli-Stammes HB101 durch Elektroporation

Herstellung elektrokompetenter Zellen

Für die Elektroporation wurde eine 10ml-Übernachtkultur von HB101 verwendet. Mit 2ml dieser

Vorkultur wurde die Hauptkultur (200ml) beimpft und circa 3 Stunden geschüttelt, bis eine OD600

von 0,8 erreicht war. Anschliessend wurde die Hauptkultur 20min auf Eis inkubiert und danach

zentrifugiert (2500x g, 15min, 4°C). Das Pellet wurde vorsichtig in 200ml eiskaltem a. bidest.

resuspendiert und erneut 5min bei 4°C zentrifugiert. Die Bakterien wurden in 100ml kaltem a.

bidest. vorsichtig resuspendiert, mit 5ml 10% Glycerol gemischt und nochmals zentrifugiert. Das

Pellet wurde dann in 2ml 10% Glycerol aufgenommen und in Portionen zu 40µl auf vorgekühlte

Eppendorf-Gefässe verteilt. Die elektrokompetenten Zellen wurden bei -70°C eingefroren und

waren so ein halbes Jahr verwendbar.

Elektroporation

Die kompetenten Zellen wurden vorsichtig auf Eis aufgetaut und mit der zu transformierenden

DNA gemischt. Anschliessend wurde der Ansatz in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette

pipettiert. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes (2,5V, Kapazität 250µF, Widerstand 200Ω)

wurden die Bakterien transformiert. Danach wurde 1ml SOC-Medium zugegeben und der Ansatz

in ein Eppendorf-Gefäss transferiert. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C wurden die

Bakterien abzentrifugiert (2500x g, 5min) und in 100µl LB-Medium aufgenommen. Die

Suspension wurde auf Agarplatten mit Selektionsmedium ausplattiert (LBAmp-Platten) und über

Nacht bei 37°C im Brutschrank angezogen.

2.2.3. Isolierung von Pl asmid -DNA aus E. coli (Mini - und Midipräparation)

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli durch alkalische Lyse wurde in Anlehnung an die

Methode von BIRNBOIM UND DOLY (1979) durchgeführt. Da sich die Arbeitsschritte für Mini- und

Midipräparation ähneln, werden beide Methoden im folgenden gemeinsam beschrieben (in

Klammern die Angaben für die Midipräparation).


Für die Plasmidgewinnung wurden 5 ml (50ml) Übernachtkultur angeimpft. 1,5ml (50ml) wurden

für 1min (15min) bei Höchstgeschwindigkeit abzentrifugiert, in 100µl (2ml) Lösung 1

resuspendiert und 5min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschliessend wurden 200µl (4ml)

Lösung 2 zugegeben, kräftig resuspendiert und 5min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 150µl

(3ml) Lösung 3 wurde 15min auf Eis inkubiert und danach 20min. bei 4°C und

Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Gefäss pipettiert und die

Plasmid-DNA durch Zugabe von 250µl (5ml) 2-Propanol gefällt. Nach Inkubation bei -20°C für

10 (20) min wurde die DNA durch 20minütige Zentrifugation pelletiert und anschliessend mit

500µl (5ml) eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde getrocknet und in 50µl

(300µl) TE aufgenommen.

Die Konzentration der DNA aus einer Midi-Präparation wurde spektrometrisch bestimmt. Dazu

wurden 2,5µl Plasmid-DNA mit a. bidest auf 500µl verdünnt und die Absorption bei 260nm

gegen a. bidest. als Leerwert gemessen. Mit Hilfe der Näherung, dass 1OD ungefähr einer

Konzentration von 50µg/ml entspricht, wurde die DNA-Konzentration bestimmt. Anhand des

Quotienten OD260/OD280 wurde die Reinheit der Plasmid-DNA kontrolliert. Bei einer hinreichend

reinen Präparation liegt dieser Wert zwischen 1,8 und 2.

Zur Sequenzierung wurde die Plasmid-DNA aus einer Midipräparation weiter gereinigt. Dazu

wurde zu der gelösten DNA 300µl 9M LiCl-Lösung pipettiert, die Lösung resuspendiert und

30min bei -20°C inkubiert. Durch diesen Schritt werden an der DNA anhaftende Proteine und

andere Verunreinigungen weitgehend ausgefällt. Anschliessend wurde der Ansatz 15min. bei

4°C und Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, in ein neues

Gefäss pipettiert und mit 600µl 2-Propanol versetzt. Nach 10minütiger Inkubation bei -20°C

wurde für 20min bei 4°C und Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 500µl

eiskaltem Ethanol gewaschen und danach getrocknet. Die DNA wurde zum Schluss in 200µl TE

aufgenommen.

2.2.4. Arbeiten mit Plasmid -DNA

PCR-Amplifikation

Zur Amplifizierung definierter DNA-Fragmente wurde die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

verwendet. Sofern nicht anders beschrieben, wurden die PCR-Reaktionen in einem Volumen

von 100µl durchgeführt und als Matrize Plasmid-DNA verwendet. Der fertige Ansatz wurde mit

50µl Mineralöl überschichtet. Die Pwo-Polymerase wurde erst am Ende des ersten

Denaturierungsschrittes zugegeben.


Reaktionsansatz:

2µl DNA-Matrize (ca. 10-20ng)

2µl forward Primer

2µl reverse Primer

16µl dNTP-Gemisch (SL 2mM)

10µl 10x Pwo-Reaktionspuffer mit MgCl2

2U Pwo-Polymerase

68µl a. bidest.

Falls nicht anders erwähnt, wurde das folgende PCR-Programm eingesetzt:

Erst-Denaturierung 95°C 5min 1 Zyklus

Denaturierung

Primer-Anlagerung

Verlängerung

95°C

60°C

72°C

30s

50s

1min 45s - 3min.

5 Zyklen

Denaturierung

Primer-Anlagerung

Verlängerung

95°C

55°C

72°C

40s

40s

1min 45s

25 Zyklen

Komplettierung

Ende

72°C 10min

Die Dauer des Verlängerungsschrittes wurde je nach Länge des zu vervielfältigenden

Fragmentes angepasst, wobei von einer Syntheserate von ca. 1000 Basen je Minute

ausgegangen wurde.

Verdau mit Restriktionsenzymen

Zur Klonierung von DNA-Fragmenten (zumeist PCR-Produkten) in Vektoren mussten diese

zuerst mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut werden, um kompatible Enden zu erzeugen.

Dazu wurden circa 5µg Plasmid-DNA beziehungsweise das gefällte und gereinigte PCR-Produkt

in 20µl Gesamtvolumen unter Zugabe von 5U Restriktionsenzym und dem entsprechenden

Volumen Enzym-Puffer (im allgemeinen 2µl eines 10fach konzentrierten Puffers) bei der für das

Enzym optimalen Temperatur für eine Stunde inkubiert. Zum Verdau grösserer Mengen DNA

wurde das Ansatzvolumen vergrössert und die Reaktionszeit entsprechend verlängert.

Zur Analyse einer Plasmid-Minipräparation wurden 10µl DNA in einem Gesamtvolumen von 20µl

eingesetzt, zusammen mit 3U Restriktionsenzym.


DNA-Agarosegel -Elekt rophorese

Zur Kontrolle der Restriktionsverdaue wurde ein Teil des Ansatzes in einem Agarosegel

elektrophoretisch aufgetrennt. Dazu wurde ein 1%iges Agarosegel unter Zusatz von 1x TAE-

Puffer und 1µg/ml Ethidiumbromid (SL 10mg/ml) verwendet. Die Proben wurden mit 1/6 des

Volumens Ladepuffer gemischt und in einer Vertikalelektrophoresekammer aufgetrennt. Als

Grössenstandard wurde "1kB DNA ladder"-Marker von Invitrogen (250-10.000 bp) auf das Gel

aufgetragen.

Isolierung von DNA -Fragmenten aus Agarosegelen

Nach einem Restriktionsverdau wurden die entstandenen DNA-Fragmente über ein Agarosegel

gereinigt. Auf dem UV-Tisch wurden die entsprechenden Banden mit einem Skalpell aus dem

Gel ausgeschnitten und anschliessend die in den Agarosestücken enthaltene DNA mittels eines

"Ultrafree DA"-Säulchens eluiert. Dazu wurden die Säulchen 20min bei Höchstgeschwindigkeit

zentrifugiert.

Fällung der DNA mit Ethanol und Glycogen

Die aus den Agarosegel-Fragmenten isolierte DNA wurde durch eine Fällung konzentriert. Es

wurde folgendes Gemisch verwendet:

100µl DNA

5µl Glycogen (SL 20mg/ml)

35µl Ammoniumacetat (SL 8M)

300µl Ethanol absolut

Bei anderen DNA-Volumina wurde der Ansatz entsprechend angepasst. Das Gemisch wurde

20min bei -20°C inkubiert und anschliessend ebenfalls 20min bei 4°C und

Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet

und zum Schluss in einem kleinen Volumen TE gelöst.

Dephosphorylierung linearisierter DNA

Um zu verhindern, dass ein mit einem Restriktionsenzym verdautes Plasmid ohne Aufnahme

eines Inserts religieren kann, wurde dieses mit alkalischer Phosphatase am 5´-Ende

dephosphoryliert. Dabei wurde nach den Angaben des Herstellers Roche gearbeitet. Die für die

Ligation bestimmte Menge Vektor-DNA wurde mit 2U Phosphatase und dem 10x-

Reaktionspuffer in 10µl Gesamtvolumen für 20min bei 37°C inkubiert. Anschliessend wurde die

Phosphatase durch 15minütige Inkubation bei 65°C inaktiviert. Die auf diese Weise behandelte

Plasmid-DNA wurde dann mit dem entsprechenden Insert ligiert.


Ligation von DNA -Fragmenten

Für die Ligation kompatibler oder glatter DNA-Enden wurde das Insert im Verhältnis zum Vektor

in 3-5fachem molaren Überschuss eingesetzt. In einem Gesamtvolumen von 20µl wurden beide

Fragmente mit 5U T4 DNA-Ligase und dem entsprechenden Enzympuffer über Nacht bei 16°C

inkubiert. Der Ligationsansatz wurde dann in ein Aliquot kompetenter E. coli-Zellen (200µl)

transformiert und auf LBAmp- bzw. LBKana-Platten ausplattiert. Der Erfolg der Ligation wurde

durch eine Plasmid-Minipräparation aus einer Einzelkolonie und einen anschliessenden

Restriktionsverdau kontrolliert.

Sequenzierung

Die Sequenzierreaktionen wurden mit dem "Thermo Sequenase fluorescent labelled primer

cycle sequencing kit with 7-deaza dGTP" durchgeführt. Für die Sequenzierung eines Plasmids

wurden 0,5-2µg DNA eingesetzt. Die Plasmid-DNA wurde mit 2pmol des entsprechenden, am

5´-Ende mit dem Farbstoff IRD800 gekoppelten Sequenzierprimers in einem Gesamtvolumen

von 17µl gemischt. Jeweils 4µl davon wurden zu 2µl des mitgelieferten Reaktionsgemisches

gegeben, das auch das jeweilige terminierende Didesoxynukleotid enthielt. Für die

Sequenzierreaktion wurden die Ansätze mit 50µl Mineralöl überschichtet. Je Probe waren

demnach 4 Ansätze zu jeweils 6µl erforderlich.

Für die Sequenzierreaktion wurde folgendes PCR-Programm verwendet:


Denaturierung 94°C 30s

Primeranlagerung 54-65°C 30s 25 Zyklen

Verlängerung 72°C 1-4,5min

End-Verlängerung 72°C 10min 1 Zyklus

Kühlen 4°C

Nach Beendigung der PCR wurde zu jedem Raktionsansatz 3µl des zum Kit gehörenden

Gelladepuffers zugegeben und jeweils 1,3µl auf ein 4%iges PAA-Gel aufgetragen. Die

Sequenzen wurden mit dem LiCOR-Sequenziergerät gelesen und mit der zugehörigen Software

analysiert.


2.2.5. Zweihybrid -Untersuchungen in S. cerevisiae

Einführung in das Zweihybrid -System

Das Zweihybrid-System (FIELDS UND SONG 1989) basiert darauf, dass eukaryontische

Transkriptionsfaktoren vom so genannten "acid blop type" aus voneinander unabhängig

funktionierenden Domänen aufgebaut sind (MA AND PTASHNE 1987; KAKIDANI AND PTASHNE

1988; Ma et al. 1988). Sie bestehen im wesentlichen aus zwei voneinander unabhängigen, für

die Initiation der Transkription notwendigen funktionellen Domänen: der DNA-Bindedomäne

(BD) und der Aktivierungsdomäne (AD) (PTASHNE 1988). Diese Domänen erhalten ihre

Eigenschaften auch dann, wenn sie voneinender getrennt und nicht mehr im selben Protein

verbunden sind. Im traditionellen Zwei-Hybrid-System in Saccharomyces cerevisiae wird der

hefeeigene Transkriptionsfaktor GAL4 und die von ihm erkannte Zielsequenz im Promoter,

genannt Upstream Activating Sequence (UAS), verwendet. Die DNA-Bindedomäne von GAL4

kann auch isoliert an die UAS binden (KEEGAN ET AL. 1986), ebenso wie die Aktivierungsdomäne

unabhängig von der BD die Transkription initiieren kann. Die Funktion des Transkriptionsfaktors

GAL4 kann auch wieder hergestellt werden, indem die beiden Domänen durch die Interaktion

zweier mit ihnen fusionierten Proteine wieder miteinander verbunden werden. Abbildung 7 zeigt

das Prinzip des GAL4-Zweihybrid-Systems.

Abb. 5: Schematische Darstellung des Zweihybrid-Systems in Hefe. A: Der intakte Transkriptionsfaktor Gal4p ist in der Lage, das Reportergen zu aktivieren. B: Bei räumlicher Trennung von AD und DNA-BD ist keine Reporteraktivierung möglich, da die AD nicht an die DNA gelangen kann. C: X und Y stellen miteinander interagierende Proteine dar, deren Wechselwirkung die an Y fusionierte AD in ausreichende Nähe zur DNA bringt und dadurch eine Expression des Reportergens erlaubt. D: Gehen X und Z keine Wechselwirkung miteinander ein, ist (im Unterschied zu C) Gal4p inaktiv. (AD: Gal4p-Aktivierungsdomäne; BD: Gal4p-DNA-Bindedomäne)

BD

AD

UAS Promotor Reportergen

BD

AD


BD

AD


X

Y ADZ

A B

C D

BD


X

BD

AD


BD

AD


BD

AD


X

Y ADZ

A B

C D

BD


X


Amplifizierung der Herz -cDNA-Bank

Ein Aliquot der die cDNA-Bank enthaltenden E. coli wurde aufgetaut und eine Mehrfach-

Verdünnungsreihe mit dem Faktor 1:100 hergestellt. Gleiche Volumina dieser Verdünnungen

wurden auf LBAmp-Platten ausplattiert. Am nächsten Tag wurden die Kolonien auf den Platten

ausgezählt und unter Berücksichtigung der Verdünnung der Titer der cDNA-Bank berechnet. Er

betrug 2,25x108 Klone je ml (Angabe des Herstellers: > 1x108/ml).

Zur Gewinnung grösserer Mengen Bank-DNA wurden 50µl der cDNA-Bank aufgetaut, mit

LBAmp auf 30ml verdünnt, je 200µl davon auf 135 15cm-Petrischalen mit LBAmp-Agar

ausplattiert und über Nacht im 37°C-Brutschrank inkubiert. Am nächsten Tag wurden die

Schalen in je 10ml LBAmp eingeweicht und die Klone abgeschwemmt. Die Bakterien wurden in

6 500ml-Erlenmeyerkolben gesammelt und mit LBAmp-Flüssigmedium auf ein Gesamtvolumen

von 2l aufgefüllt. Anschliessend wurden die Bakterien für 4h bei 37°C geschüttelt. Die

Suspension wurde 20Min. bei 2500x g zentrifugiert. Zu jedem der 4 Pellets wurden 25ml Lösung

1 zugegeben und die Bakterien gründlich resuspendiert. Nach einer 10minütigen Inkubation bei

Raumtemperatur wurden je 30ml Lösung 2 zugegeben, die Suspension geschüttelt und 10min

auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 30ml Lösung 3 kam die Präparation erneut für 30Min auf

Eis. Anschliessend wurden die Ansätze für eine Stunde mit 2500x g bei 4°C zentrifugiert. Der

Überstand wurde durch ein Faltenfilter filtriert, die Ausbeute betrug circa 400ml Lysat. Dieses

wurde auf 4 Zentrifugenbecher verteilt und 75ml 2-Propanol zugegeben. Anschliessend wurde

die DNA über Nacht bei -20°C gefällt. Nach einer Zentrifugation bei 2500x g und 4°C für eine

Stunde wurde der Überstand abgegossen und die Pellets getrocknet. Die Pellets wurden in

zweimal 30ml TE gelöst und zweimal mit je 20ml Phenol/Chloroform extrahiert. Dazu wurden die

Ansätze gevortext, für 20min bei 4°C mit 2500x g zentrifugiert und der Überstand vorsichtig

abgenommen. Je 15ml des Überstandes wurden mit 3ml Lösung 3 und 15ml 2-Propanol

versetzt und die DNA erneut über Nacht bei -20°C gefällt. Am nächsten Tag wurde 30min bei

4°C zentrifugiert, das Pellet getrocknet, in 2x 3ml TE gelöst und aliquotiert.

Zur Kontrolle wurden verschiedene Verdünnungen der Präparation auf einem Agarosegel

analysiert.

Transformation von S. cerevisiae nach der Lithiumacetat -Methode ( AGATEP ET AL . 1998)

Eine 10ml-Übernachtkultur in YPD-Medium wurde mit einer Imfpöse S. cerevisiae-Zellen des

Stammes KFY3 (K. Fahr und T. Munder, HKI Jena) beimpft und bei 30°C und 180rpm

geschüttelt. 2ml dieser Vorkultur wurden in eine 100ml-Hauptkultur von YPD übertragen und für

3h geschüttelt. Die Kultur wurde in zwei 50ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und 5min bei 2500x

g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Pellets in 25ml sterilem a. bidest.

resuspendiert. Die Hefezellen wurden erneut zentrifugiert und der Waschschritt wiederholt.


Anschliessend wurden die Zellen in je 1ml 0,1M Lithiumacetat (SL 1M) resuspendiert und die

Zellsuspensionen in einem 2ml-Eppendorfgefäss vereinigt. Die Zellen wurden durch

Zentrifugation für 15s bei Höchstgeschwindigkeit pelletiert, nochmals mit 2ml 0,1M Lithiumacetat

gewaschen und dann in einem Volumen von 1,5ml 0,1M Lithiumacetat aufgenommen. Diese

kompetenten Zellen wurden sofort für eine Transformation weiterverwendet.

Für die Transformation wurde ein Aliquot Lachssperma-DNA aufgetaut, für 5min bei 95°C

denaturiert und sofort auf Eis gegeben. Die zuvor hergestellte Suspension kompetenter S.

cerevisiae-Zellen wurde vorsichtig resuspendiert, je 100µl in sterile Eppendorf-Gefässe pipettiert

und nochmals pelletiert. Nach Absaugen des Überstandes wurde der Transformationsmix

zugegeben. Je Ansatz bestand dieser aus:

240 µl PEG 3350 (SL 50%)

36µl Lithiumacetat (SL 1M)

50µl denaturierte Lachssperma-DNA

24µl a. bidest steril

Anschliessend wurden 10µl Plasmid-DNA zupipettiert und die Eppendorf-Gefässe für eine

Minute gevortext, bis das Zellpellet vollständig resuspendiert war. Die Transformationsansätze

wurden für 30min bei 30°C unter Schütteln in einem Thermomixer inkubiert und dann ebenfalls

für 30min einem Hitzeschock bei 42°C unterzogen. Danach wurden die Ansätze für 15s bei

1000x g zentrifugiert und die Überstände vorsichtig abgesaugt. Die Pellets wurden vorsichtig in

je 100µl sterilem a. bidest. resuspendiert und auf Minimalmedium-Platten mit den der

Auxotrophie entsprechenden Aminosäuren (mit dem entsprechenden Selektionsmedium)

ausplattiert. Die Platten wurden 4-5 Tage bei 30°C bis zum Auftreten sichtbarer Einzelkolonien

inkubiert.

Zweihybrid -Filterassay zur Analys e der β-Galactosidase -Reporteraktivität ( BREEDEN AND

NASMYTH 1985)

Zum Nachweis der β-Galactosidase-Reporteraktivität wurden je drei Einzelkolonien einer S.

cerevisiae-Transformation auf einer neuen Platte mit Minimal-Selektionsmedium ausgestrichen

und nochmals für 4-5 Tage angezogen.

Für jede dieser Platten wurde in eine saubere Petrischale ein steriles Whatman-Filterpapier

gelegt und mit 2ml (für 150mm-Petrischalen 4,5ml) Z-Puffer/X-Gal-Lösung befeuchtet. Ein

weiterer steriler Papierfilter wurde auf die Agarplatte mit den Hefe-Kolonien gelegt und mit einem

Drygalski-Spatel leicht angedrückt. Mit einer Kanüle wurde durch den Filter in den Agar

gestochen und so die Lage des Filters auf dem Agar markiert. Anschliessend wurde der Filter


mit den anhaftenden Kolonien vorsichtig mit einer Pinzette abgezogen und für circa 10s in

flüssigen Stickstoff getaucht. Der gefrorene Filter wurde dann herausgenommen und in die

vorbereitete andere Petrischale gelegt, wobei die Kolonien nach oben zeigten. Zur Entwicklung

der Filter wurden diese bei 30°C bis zum Auftreten einer deutlichen Blaufärbung (maximal 24h)

inkubiert.

Durchflusszytometrische Analyse der GFP -Reporteraktivität

Der S. cerevisiae-Stamm KFY3 enthält neben dem lacZ-Reporter auch einen HIS3- und einen

yEGFP3-Reporter. In einigen Fällen wurde die Expression des GFP-Reportergens

durchflusszytometrisch untersucht.

Dazu wurden aus einer Transformation je drei Einzelkolonien mit einer Impföse abgenommen

und in 5ml Minimal-Flüssigmedium mit den entprechenden Selektionsmarkern resuspendiert.

Die Kulturen wurden über Nacht bei 30°C und 180rpm angezogen. Am nächsten Tag wurden

1,5ml der Kultur in ein Eppendorf-Gefäss gegeben und 5min bei 500x g zentrifugiert. Das Pellet

wurde mit einmal PBS gewaschen und anschliessend in 1ml PBS resuspendiert.

Die Zellen wurden mit dem Durchflusszytometer FACStar+, ausgestattet mit einem 488nm-

Argonlaser und einer Turbosort-Option, gemessen. Als Trägerflüssigkeit wurde autoklaviertes

und filtriertes 1x PBS verwendet. Vor jeder Messung wurde das Gerät mittels Calibrite™-beads

justiert. Der Durchmesser der Probendüse (nozzle) betrug 70µm, die Laserleistung 150mW. Im

Listmode-Modus wurden die Parameter Vorwärts-Streulicht, 90°-Streulicht und Fluoreszenz1

(Bandpassfilter 535/30nm) gespeichert. Nach der Messung wurden die Daten mit Hilfe der

Computerprogramme CellQuest™ oder WinMDI ausgewertet.

Isolierung von Plasmid -DNA aus S. cerevisiae (Plasmid -Rescue)

Zur Charakterisierung eines Hefeklons mit einem positiven Test auf Reportergen-Aktivität

musste die Plasmid-DNA aus diesen Zellen extrahiert werden. Da Plasmide in S. cerevisiae nur

in geringer Kopienzahl vorliegen, können sie nicht wie bei einer Plasmid-Minipräparation in E.

coli direkt isoliert werden. Statt dessen muss die Plasmid-DNA aus den Hefezellen isoliert und in

einen E. coli-Stamm transformiert werden, um ausreichende Mengen Plasmid zu erhalten. Für

einen sogenannten Plasmid-Rescue wurde mit einer Impföse des zu testenden Klons eine 10ml -

Schüttelkultur Minimalmedium mit Zusatz der entsprechenden Selektionsmarker beimpft und 3

Tage bei 30°C unter Schütteln angezogen. 5ml dieser Kultur wurden in mehreren Durchgängen

in ein Eppendorf-Gefäss zentrifugiert und für 1min bei Höchstgeschwindigkeit pelletiert. Zu dem

Pellet wurden 500µl Lysis-Puffer, 500µl Phenol/Chloroform und eine Spatelspitze Glasperlen

gegeben. Zum Aufschluss der Hefezellen wurde das Gemisch für 2min kräftig gevortext und

anschliessend 5min bei Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Die obere Phase wurde abpipettiert

und nochmals mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Nachfolgend wurde die DNA durch


Zugabe von 100µl Lösung 3 und 500µl 2-Propanol gefällt, 15min bei Höchstgeschwindigkeit und

4°C zentrifugiert und das Pellet fünfmal mit 500µl 70%igem Ethanol gewaschen. Das

getrocknete Pellet wurde in 20µl TE aufgenommen.

Im Anschluss daran wurde der gesamte Ansatz mittels Elektroporation in E. coli HB101

transformiert, auf LBAmp-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten

Tag wurden die entstandenen Kolonien auf Agarplatten mit leucinfreiem M9-Festmedium

überstochen. Da der Stamm HB101 Leucin-auxotroph ist, konnten auf diese Weise Plasmide

isoliert werden, die Leucin als Selektionsmarker enthielten.

Am nächsten Tag wurde von den entstandenen Kolonien eine 5ml-Übernachtkultur in LBAmp-

Medium angeimpft, aus der dann mit einer Plasmid-Minipräparation die DNA isoliert wurde.

Abschliessend wurde die Plasmid-DNA mit einer Lithiumchlorid-Fällung gereinigt und

sequenziert.

2.2.6. Proteinexpression in E. coli

Expression und Reinigung von GST -Fusionsproteinen

Zur Expressionen von Proteinen wurden diese im selben Leserahmen wie das GST-Protein in

die Vektoren pGEX4T-1 bzw. pGEX4T-3 kloniert und in den E. coli-Stamm BL21 transformiert.

1ml der 5ml-Übernachtkultur in LBAmp-Medium wurden in eine 50ml-Hauptkultur überimpft und

bei 37°C geschüttelt. Nach zwei Stunden wurde die Proteinexpression durch Zugabe von 50µl

IPTG-Lösung (SL 100mM) induziert und weitere zwei Stunden geschüttelt. Anschliessend

wurden die Bakterien für 15min bei 4°C und 2500x g abzentrifugiert und 7ml PBS zum

Aufschluss von E. coli zugegeben. Nachdem das Pellet resuspendiert war, wurden die Bakterien

auf Eis mit Ultraschall aufgeschlossen (3 Zyklen zu je 45s mit 15s Pause, maximum power). Der

Aufschluss wurde zur Vervollständigung der Lyse für 30min bei Raumtemperatur geschüttelt,

anschliessend bei 4°C und 2500x g für 15min zentrifugiert und der Überstand in ein neues

Zentrifugenröhrchen pipettiert. Pro Aufschluss wurden 250µl Glutathion-Sepharose eingesetzt,

die vor der Proteinbindung einmal mit PBS mit Proteaseinhibitoren gewaschen wurde. Zur

Bindung der Proteine wurde die vorbereite Sepharose in den Aufschluss pipettiert und dieser für

30min. bei 4°C auf einem Kippschüttler inkubiert. Danach wurde die Sepharose für 5min bei

500x g und 4°C abzentrifugiert und fünfmal mit je 10ml PBS mit Proteaseinhibitoren gewaschen.

Am Schluss wurde soviel PBS mit Proteaseinhibitoren zugegeben, dass eine 50%ige

Sepharose-Suspension entstand. Die Sepharose wurde in ein mit Dichlordimethylsilan

beschichtetes Eppendorfgefäss pipettiert und bei 4°C aufbewahrt.


Expression und Reinigung von MBP -Fusionsproteinen

Um Proteine als Fusion mit dem Maltose-bindenden Protein (MBP) aus E. coli exprimieren zu

können, wurden diese im selben Leserahmen in den Vektor pMAL-c2x kloniert und in den E.

coli-Stamm RV308 transformiert. Die Hochdichte-Kultur der transformierten RV308-Zellen, die

Proteinexpression sowie Aufschluss und Reinigung der MBP-Fusionsproteine wurden von Dr. P.

Hortschansky, HKI Jena, durchgeführt. Im folgenden werden die einzelnen Arbeitsschritte kurz

beschrieben.

Aus einer 100ml-Vorkultur wurden 10ml in 0,5l Fermentationsmedium mit Zusatz von 1mM

Zinkacetat überimpft und in einem Sixfors-Hochdichtefermenter angezogen. Die

Proteinexpression wurde mit 1mM IPTG für 4h induziert und die Bakterien anschliessend

portionsweise zentrifugiert. Das Pellet (circa 10g Feuchtmasse) wurde in 100ml Aufschlusspuffer

mit je 1mM DTT, Benzamidin und PMSF aufgenommen und in einem Hochdruckhomogenisator

aufgeschlossen. Anschliessend wurde das Lysat mit 10.000x g bei 4°C zentrifugiert und über ein

Membranfilter filtriert. Das Filtrat wurde mittels FPLC auf eine Amylose-Säule mit 15ml

Säulenvolumen aufgetragen. Nach dem Auswaschen des nicht gebundenen Materials wurde

das MBP-Fusionsprotein mit 10mM Maltose eluiert.

2.2.7. Zellkultur

HeLa- oder 293-Zellen wurden in DMEM-Komplettmedium im Begasungsbrutschrank bei 37°C

und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre mit 5% CO2 kultiviert. Alle Arbeiten mit den Kulturen

wurden unter einer Sicherheits-Werkbank ausgeführt. Zur Passagierung wurde eine konfluente

Kultur mit sterilem PBS gespült und die Zellen durch Inkubation mit 1x Trypsin/EDTA-Lösung für

5min im Brutschrank abgelöst. Die Zellen wurden in Komplettmedium aufgenommen und den

Erfordernissen der Versuche entsprechend in neue Kulturgefässe ausgesät. Zur Stammhaltung

wurden die Zellen im Verhältnis von 1:20 passagiert, wodurch sie in der Regel nach fünf Tagen

wieder Konfluenz erreichten.

Die genaue Konzentration der Zellsuspension wurde durch Auszählung der lebenden Zellen mit

einer Trypanblau-Färbung in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.


2.2.8. Transiente Transfektion von Säugerzellen

Für eine transiente Transfektion mit Plasmid-DNA wurden die 293-Zellen mit einer Konfluenz

von 50% ausgesät. Am nächsten Tag wurde das Medium in den Kulturen erneuert. Die Zellen

wurden mit Lipofectamin 2000 nach den Angaben des Herstellers Invitrogen transfiziert. Zur

Transfektion wurde immer durch Lithiumchlorid-Fällung gereinigte Plasmid-DNA verwendet, die

auf eine Konzentration von 1µg/µl verdünnt war. Entsprechend der Vorschrift wurden für jede

Kavität einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen 0,3µg, für eine 12 Kavitäten enthaltende Platte 2µg

und für eine 10cm-Petrischale 20µg DNA eingesetzt.

2.2.9. Herstellung von Zelllysaten

Um die nach einer transienten Transfektion in 293-Zellen exprimierten Proteine zu gewinnen,

wurden diese zwei Tage nach der Transfektion geerntet und lysiert. Dazu wurde zuerst das

Kulturmedium abgesaugt und die Zellen einmal mit sterilem PBS gespült. Anschliessend wurden

die Zellen mit einem Zellschaber geerntet, in eine Eppendorfgefäss pipettiert und für 5min bei

500x g und 4°C abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 500µl NTE-Puffer aufgenommen, 25µl 10%

(v/v) NP40 zugegeben und der Ansatz für 30s kräftig gevortext. Die Zellbruchstücke wurden

dann durch Zentrifugation für 20min bei Höchstgeschwindigkeit und 4°C abgetrennt. Der

Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäss pipettiert, 50µl Glycerol zugegeben und das

Lysat bei -20°C eingefroren.

2.2.10. MTT-Überlebenstest ( MOSMANN 1983)

Um den Einfluss eines in 293-Zellen transient exprimierten Proteins auf das Überleben der

Zellen zu untersuchen, wurde ein Vitalitätstest mit dem Farbstoff MTT eingesetzt. In vitalen

Zellen wird dabei der gelbe Farbstoff zu einem violetten Präzipitat metabolisiert.

Je 2x104 293-Zellen wurden pro Kavität einer Zellkulturplatte mit 96 Vertiefungen eingesetzt. Am

nächsten Tag wurde das Medium abgesaugt und 150µl frisches Medium zugegeben.

Anschliessend wurde die Transfektion mit den entsprechenden Expressions-Plasmiden (0,5µg

DNA je Kavität) mit Lipofectamin 2000 durchgeführt. Nach zwei Tagen wurden 10µl MTT-

Lösung (SL 2mg/ml in PBS) direkt in das Medium pipettiert und die Zellen anschliessend für

circa drei Stunden zurück in den Brutschrank gestellt, bis eine deutliche violette Färbung

entstanden war. Das Medium wurde vorsichtig abgesaugt und die Kulturplatte für 10min bei

70°C im Umluft-Wärmeschrank getrocknet. Um das Präzipitat zu lösen, wurden 200µl DMSO

zugegeben und die Platte für 10min auf einen Schütteltisch platziert. Die entstandene Färbung

wurde an einem Mikrotiterplatten-Lesegerät gemessen (Messfilter 570nm, Referenzfilter


630nm). Um eine möglichst genaue Bestimmung zu erreichen, wurden alle Ansätze vierfach

ausgeführt.

2.2.11. Untersuchung der Genexpression mit reverser Transkription und PCR

Isolierung von Gesamt -RNA aus Säugerzellen

Die RNA wurde mit Hilfe des "RNeasy Mini Kit" nach der Vorschrift des Herstellers Qiagen

isoliert. Hierfür wurden HeLa-Zellen aus einer 3cm-Kulturschale eingesetzt (circa 1-2x106

Zellen). Die Zellen wurden mit Trypsin abgelöst und einmal mit PBS gewaschen. Anschliessend

wurden die Zellen zentrifugiert und das Pellet in 350µl Lysepuffer (im Kit enthalten)

aufgenommen. Das Lysat wurde unter Verwendung von "QIAshredder spin columns"

homogenisiert und die RNA über eine RNeasy-Säule isoliert. Die gereinigte RNA wurde von der

Säule zweimal mit je 30µl DEPC-behandeltem a. bidest. eluiert. Danach wurde 1µl DNAse I

zugegeben und der Ansatz für 30min bei 37°C inkubiert. Die Konzentration der gewonnenen

RNA wurde spektrometrisch durch die Messung der Absorption bei 260nm bestimmt und die

Konzentration mit Hilfe der Näherung 1OD260=40µg/ml RNA bestimmt.

Reverse Transkription

Für eine Reverse Transkriptions-Reaktion (Umschreibung der isolierten RNA in cDNA) wurden

5µg der isolierten RNA mit DEPC-behandeltem a. bidest. auf 10µl aufgefüllt. Dann wurde 1µl

Oligo-dT-Primer zugegeben, der Ansatz für 10min bei 70°C inkubiert und dann für zwei Minuten

auf Eis gestellt. Pro Reaktion wurden folgende Bestandteile eingesetzt:

10µl RNA

4µl Erststrangsynthese-Puffer

2µl DTT 100mM

2µM dNTPs 10mM

100U SuperScript Reverse Transkriptase

Die Reverse Transkription wurde dann in einem Thermocycler nach folgendem Protokoll

durchgeführt:

25°C 10min

42°C 50min

95°C 5min

4°C Ende


PCR zur spezifischen Amplifizierung exprimierter Gene

Im letzten Schritt wurde aus dem zuvor hergestellten Gemisch von cDNAs mit einer PCR

spezifisch bestimmte Gene amplifiziert. Zur Kontrolle, dass in jedem Versuchsansatz identische

Bedingungen herrschten (insbesondere gleiche Mengen RNA zur reversen Transkription

verwendet wurden), wurde als Kontrolle das β-Actin-Gen amplifiziert. Für die PCR wurden

folgende Bedingungen gewählt:

PCR-Ansatz:

β-Actin -PCR Siva-PCR

RT-Reaktion 2µl 5µl

10x MgCl2 5µl 5µl

dNTP 10mM 1,5µl 1,5µl

Primer 1 1µl 1µl

Primer 2 1µl 1µl

a. bidest 34µl 32µl

Taq DNA-Polymerase 2U 2Ul

PCR-Programm:


Denaturierung 95°C 50s 30 Zyklen für β-Actin

Primeranlagerung 53°C 50s 33 Zyklen für Siva

Verlängerung 72°C 50s

End-Verlängerung 72°C 5min 1 Zyklus

Zur Analyse der PCR-Reaktion wurde der gesamte Ansatz auf ein 1%iges Agarosegel

aufgetragen.

2.2.12. Bestimmung der Proteinkonzentration ( BRADFORD 1979)

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration in Lösung wurde der Protein-Assay der Firma Bio-

Rad angewendet, der auf der Standard-Bradfordmethode basiert. Die Proteinbestimmung wurde

in Mikrotiterplatten mit flachem Boden durchgeführt. Zu Beginn wurde die gebrauchsfertige

Farbstofflösung durch Verdünnen der Stammlösung im Verhältnis 1:5 mit a. bidest. hergestellt.


In jede Vertiefung der Mikrotiterplatte wurden 200µl der verdünnten Farbstofflösung gegeben.

Anschliessend wurde eine Eichkurve mit je 2µl einer Verdünnungsreihe von BSA in a. bidest.

(100-1000µg/ml) pipettiert. Von jeder Probe wurden ebenfalls 2µl eingesetzt. Falls nötig, wurde

die Proteinlösung vorher verdünnt. Als Leerwert wurde der jeweilige Puffer (ohne Protein)

verwendet. Alle Standards und Proben wurden im Duplikat aufgetragen. Die Mikrotiterplatte

wurde für eine Minute geschüttelt und anschliessend 15min bei Raumtemperatur inkubiert. Die

Absorption wurde in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 600nm gemessen und die

tatsächliche Proteinkonzentration anhand einer mit dem Programm MS Excel errechneten

Standardkurve (unter Berücksichtigung der Leerwert-Absorption und der Verdünnung) ermittelt.

2.2.13. Bestimmung des Zink -Gehaltes in Proteinen ( STENMARK ET AL . 1996)

Zur Bestimmung der je Molekül Siva gebundenen Zn2+-Ionen wurden die wie unter 2.2.5.

beschriebenen MBP-Fusionsproteine für zwei Tage bei häufigem Pufferwechsel bei 4°C gegen

TNG-Puffer dialysiert. Anschliessend wurde die Proteinkonzentration mit der Bradford-Methode

bestimmt (siehe Abschnitt 2.2.7.1.). Sie lag bei allen Proben zwischen 0,7 und 3,3µg/ml. Als

externe Kontrolle wurde BSA verwendet, das keine Zink-Ionen bindet. Je 200, 400 und 800µl

der dialysierten Proteine wurden in ein Eppendorf-Gefäss pipettiert und mit TNG-Puffer auf ein

Volumen von 1ml aufgefüllt. Dann wurden 20µl PMPS (SL 50mM) zugegeben und die Ansätze

gut gemischt. Durch dieses Reagenz wurden die Zink-Ionen aus ihren Koordinationsstellen

verdrängt, da PMPS kovalent mit Sulfhydryl-Gruppen reagiert. Nach Zugabe von 10µl PAR (SL

50mM, verdünnt auf 10mM), das als Komplex-Indikator für die durch die Reaktion mit PMPS

freigesetzten Zink-Ionen dient, wurden die Gefässe nochmals gut gemischt. Nach einer

30minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden je dreimal 200µl des Ansatzes

abgenommen, in eine Mikrotiterplatte pipettiert und die A500 mit einem Mikrotiterplatten-

Lesegerät gemessen. Mit Hilfe des im Internet verfügbaren Programms Protparam wurde das

Molekulargewicht der Proteine aus der AS-Sequenz genau bestimmt und anschliessend mit

Hilfe des Extinktionskoeffizienten für den Zn[PAR]2-Komplex (6,6x104 mol-1 * cm-1, GIEDROC ET

AL. 1986) das molare Verhältnis der Zink-Ionen je Molekül Protein als Mittelwert über alle

eingesetzten Proteinmengen berechnet.

2.2.14. SDS-Polyacrylamid -Gelelektrophorese

Zur Analyse von Zellysaten und Proteinen wurden diese auf einem diskontinuierlichen PAA-Gel

nach Grösse aufgetrennt (SCHAGGER AND VON JAGOW 1987). Die Acrylamid-Konzentration

betrug in allen Gelen 10%. Die Proben wurden mit reduzierendem Probenpuffer (4fach

konzentriert) und a. bidest gemischt, dass die End-Verdünnung des Probenpuffers 1fach war.


Anschliessend wurden die Proben für 5min bei 75°C inkubiert und auf das PAA-Gel

aufgetragen. Die Proteine wurden mit konstant 100V aufgetrennt. Zur Größenbestimmung wurde

der "MultiMark prestained" Standard mit auf das Gel aufgetragen.

Zur unmittelbaren Färbung der Proteinbanden wurde das Gel danach in Coomassie-

Färbelösung für 30min auf einem Kipptisch inkubiert und hinterher mit Entfärbelösung der

überschüssige Farbstoff wieder entfernt.

2.2.15. Western Blot im Semi dry -Verfahren

Für den spezifischen Nachweis eines Proteins wurden die Proteine aus dem PAA-Gel auf eine

Nitrocellulose-Membran transferiert. Die Membran, das PAA-Gel und die Filterpapiere wurden in

Towbin-Blotpuffer (TOWBIN ET AL. 1979) eingeweicht und dann in der Blot-Apparatur zu einem

Sandwich geschichtet, so dass das Proteingel zur Anode und die Nitrocellulose zur Kathode

zeigte. Durch Anlegen eines Stromes von 1mA je cm2 Gelfäche wurden die Proteine für eine

Stunde auf die Membran transferiert. Um die Proteine direkt nach dem Transfer auf der

Membran sichtbar zu machen, wurde die Membran für 5min mit Ponceau S-Lösung inkubiert

und anschliessend mit a. bidest. der überschüssige Farbstoff abgewaschen. Durch Zugabe der

Blockierlösung und Inkubation für eine Stunde auf dem Kipptisch wurde die unspezifische

Proteinbindung auf der Membran blockiert und die Ponceau S-Färbung wieder entfernt.

Der primäre Antikörper, mit dem ein betreffendes Protein nachgewiesen werden soll, wurde in

Blockierlösung verdünnt und für eine Stunde auf die Membran gegeben. Anschliessend wurde

die Membran fünfmal für je 5min mit TBS-T gewaschen und danach der mit Merrettich-

Peroxidase gekoppelte spezies-spezifische Zweitantikörper zugefügt. Nach einer erneuten

Inkubation für eine Stunde auf dem Kipptisch wurde wieder fünfmal mit TBS-T gewaschen und

der Blot mit dem ECL-System entwickelt.

2.2.16. In vitro-Bindungstest mit immobilisierten Proteinen (Pulldown)

Diese Methode wurde eingesetzt, um in vitro die Bindung eines Proteins an Siva oder eines der

in E. coli exprimierten Siva-Fragmente nachzuweisen.

Für diesen Versuch wurden an eine feste Matrix (Glutathion-Sepharose für die GST-

Fusionsproteine oder Amylose im Fall der MBP-Fusionen) gebundene Proteine eingesetzt. Da

die MBP-Fusionsproteine durch die Elution in Lösung vorlagen, wurden sie zuerst wieder an

Amylose gekoppelt. Dazu wurde eine grössere Menge der Fusionsproteine gegen PBS mit

Proteaseinhibitoren dialysiert. Anschliessend wurde 1ml dialysiertes Protein mit 100µl Amylose

gemischt und über Nacht bei 4°C auf dem Rotationsmixer inkubiert. Es schloss sich eine


Bradford-Proteinbestimmung mit allen gebundenen Proteinen an. Als Leerwert wurde Amylose-

oder Glutathion-Sepharosematrix in PBS mit Inhibitoren ohne Proteine verwendet.

Für jeden Pulldown-Ansatz wurden 10µg Protein in silanisierten Eppendorf-Gefässen eingesetzt,

das Volumen wurde mit Sepharose bzw. Amylose in PBS mit Inhibitoren auf 50µl aufgefüllt.

Anschliessend wurden zur Blockierung unspezifischer Bindungen 500µl PBS mit Inhibitoren und

5mg/ml BSA zugegeben und über Nacht bei 4°C auf dem Rotationsschüttler inkubiert. Der

Ansatz wurde dann bei 500x g für eine Minute bei 4°C zentrifugiert und einmal mit 1ml

Bindungspuffer unter Zusatz der Proteaseinhibitoren gewaschen. Im Anschluss daran wurden

150µg Zellysat zugeben und 2h unter Rotieren bei 4°C inkubiert. Die Ansätze wurden

zentrifugiert und fünfmal mit je 1ml Bindungspuffer und Inhibitoren gewaschen. Der Überstand

wurde abgesaugt, die Proteine mit 20µl 2xSample Buffer denaturiert und auf ein PAA-Gel

aufgetragen. Nach dem Western Blot wurden die gebundenen Proteine mit einem Antikörper

und ECL-Detektion nachgewiesen.

Ergebnisse 44

3. Ergebnisse

3.1. Interaktion von Siva mit dem Rezeptor CD27

Die Untersuchungen zur Pathogenese von Coxsackievirus B3 im Rahmen dieses Projektes

wurden mit einem Zweihybrid-Screening einer cDNA-Bank aus HeLa-Zellen begonnen.

Dabei wurde nach Interaktionspartnern der Capsidproteine VP1 und VP2 sowie der Protease

2A gesucht. Als mit VP2 interagierendes Protein wurde ein Klon gefunden, der die cDNA von

Siva enthielt (HENKE ET AL. 2000). Dieses bislang wenig untersuchte Protein ist für die

Induktion des programmierten Zelltods nach Stimulierung des CD27-Rezeptors

verantwortlich (PRASAD ET AL. 1997). Um diese ersten Ergebnisse zu vertiefen, sollte im

Rahmen dieser Promotionsarbeit mit Hilfe gerichteter Zwei-Hybrid-Experimente die Bindung

von Siva an CD27 weiter charakterisiert und die Bindungsregionen auf beiden

Bindungspartnern eingegrenzt werden.

In dem in dieser Arbeit eingesetzten Zweihybrid-System wurden die zu testenden Proteine

als C-terminale Fusionen im gleichen Leserahmen an die GAL4-DNA-Bindedomäne (AS 1-

147, in den Vektor pAS2-1) beziehungsweise Aktivierungsdomäne (AS 768-881, Vektor

pGAD GH) kloniert. Die Plasmide wurden als Kotransformation in den S. cerevisiae-Stamm

KFY3 eingebracht. Dieser Stamm wurde von K. Fahr (HKI Jena) aus dem kommerziell

erhältlichen Stamm Y190 von Clontech weiterentwickelt. Er enthält im Gegensatz zu Y190

keinen Adenin-Auxotrophiemarker, dafür aber als zusätzliches Reportergen yEGFP3 unter

der Kontrolle des GAL1-Promotors. Mit dem Stamm KFY3 können also sowohl die

konventionelle lacZ-Färbung als auch mit Hilfe eines Durchflusszytometers (Filter 526/30

nm) die Expression und Fluoreszenz einer für Hefezellen optimierten Variante des Grün-

fluoreszierenden Proteins (GFP) gemessen werden (CORMACK ET AL. 1996).

Mit Hilfe des Zweihybrid-Systems wurde getestet, ob der intrazelluläre Teil von CD27,

fusioniert an die GAL4-BD, mit verschiedenen verkürzten Varianten von Siva interagierte. In

Abbildung 6 ist das Ergebnis dieses Versuchs dargestellt.

Alle getesteten Fragmente von Siva, mit Ausnahme der Mutante, die nur den C-Terminus

enthielt, interagierten mit dem zytoplasmatischen Teil von CD27. Eine unterschiedlich

intensive Blaufärbung deutete auf verschieden starke Interaktionen der beiden Proteine hin.

So wurde die stärkste Färbung bei dem vollständigen Siva und bei der Mutante Delta C-

Terminus sichtbar. Die Interaktion von CD27 mit der Splicevariante Siva-2 und der N-

Terminus von Siva ergab keine so intensive Blaufärbung. Zusammengefasst lässt sich

sagen, dass der N-Terminus von Siva zur Bindung an CD27 dient. Das Vorhandensein der

AS 64-127 verstärkt die Wechselwirkung noch. In diesem Bereich befindet sich auch die

potentielle amphipatische Helix, die aufgrund von Sequenzvergleichen mit einer

Ergebnisse 45

Proteindatenbank als mögliche helikale Region definiert wurde (XUE ET AL. 2002). Sie soll

hauptsächlich für die proapoptotische Wirkung von Siva verantwortlich sein, indem sie mit

Bcl-2 interagiert und dessen protektive Eigenschaften aufhebt.

Abb. 6: Zweihybrid-Filterassay zum Nachweis der Bindung von CD27 und Siva.Verschiedene Fragmente von Siva wurden auf ihre Interaktion mit dem zytoplasmatischen Teil von CD27 getestet. Falls die beiden Proteine interagieren, wird das LacZ-Reportergen exprimiert. Dessen Aktivität wurde mit einem Filterassay nachgewiesen. Als Positivkontrolle diente die Homodimerisierung der regulatorischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase aus Hefe (BCY1; Plasmide pTM145/146).

Es wurde ausserdem untersucht, ob das Virusprotein VP2 die Interaktion zwischen CD27

und Siva beeinflussen kann. Dazu wurde VP2 in den Vektor p413GPD eingesetzt, um dieses

gemeinsam mit CD27 und Siva in dem zuvor beschriebene System zu exprimieren. In

diesem Versuch wurde durchflusszytometrisch die Expression des yEGFP-Reporters

gemessen.

Abb. 7: Bestimmung des Einflusses von VP2 auf die Interaktion von CD27 mit Siva.CD27, Siva und VP2 (Wildtyp-Protein aus dem Stamm CVB3H3 oder N165D-Mutante des Stammes CVB3H310A1) wurden gemeinsam exprimiert. Die Stärke der yEGFP3-Reportergen-Aktivität wurde mit Hilfe des Durchflusszytometers FACStar+ bestimmt (Kanal FL1, 530nm). Beide VP2-Varianten können die Interaktion von CD27 mit Siva kompetitieren und auf das Niveau der Kontrolle zurückbringen.

GAL4-BD

CD27(pMN09)

CD27(pMN09)

CD27(pMN09)

BCY1(pTM145)

GAL4-AD

Vektor(pGADGH)

Siva(pKK6)

Siva-2(pMN28)

BCY1(pTM146)

GAL4-BD

CD27(pMN09)

CD27(pMN09)

CD27(pMN09)

BCY1(pTM145)

GAL4-AD

Siva N-Term.(AS1-64)(pKK8)

Siva ∆ C-Term. (AS 1-127)(pKK12)

Siva C-Term.(AS 128-189)(pKK14)

BCY1(pTM146)

Filter 1 Filter 2GAL4-BD

CD27(pMN09)

CD27(pMN09)

CD27(pMN09)

BCY1(pTM145)

GAL4-AD

Vektor(pGADGH)

Siva(pKK6)

Siva-2(pMN28)

BCY1(pTM146)

GAL4-BD

CD27(pMN09)

CD27(pMN09)

CD27(pMN09)

BCY1(pTM145)

GAL4-AD

Siva N-Term.(AS1-64)(pKK8)

Siva ∆ C-Term. (AS 1-127)(pKK12)

Siva C-Term.(AS 128-189)(pKK14)

BCY1(pTM146)

Filter 1 Filter 2

CD27 + pGADGH + p413GPDCD27 + Siva + p413GPDCD27 + Siva + VP2 (Wildtyp)CD27 + Siva + VP2 (N165D)

100 101 102 103 104

012

8

GFP-Fluoreszenz

Zellz

ahl

Ergebnisse 46

Wie Abbildung 7 zeigt, verursacht die Koexpression von CD27 und Siva eine deutlich

verstärkte Reportergen-Aktivität, was eine Interaktion der beiden Proteine zeigt. Damit wurde

die bereits beschrieben Interaktion (PRASAD ET AL. 1997) bestätigt. Wird VP2 zusätzlich in die

Hefezellen gebracht, geht die Reportergen-Expression auf Kontrollniveau zurück, VP2

unterbindet also die Interaktion von CD27 und Siva. Ausserdem wurde in diesem Versuch

ein mutierte VP2-Protein aus dem Stamm CVB3H310A1 eingesetzt. Das VP2 aus diesem

Coxsackievirus-Stamm weist eine einzige Mutation gegenüber dem Ausgangsstamm

CVB3H3 auf (N165D). Diese Punktmutation führt bei gleicher Replikationsrate zu einer sehr

abgeschwächten Myokarditis in den infizierten Mäusen (Knowlton et al. 1996). VP2 (N165D)

zeigte den gleichen Einfluss auf diese Interaktion. Wie bereits früher gezeigt werden konnte,

interagiert das mutierte VP2 viel schwächer mit Siva (HENKE ET AL. 2001).

Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass VP2 die Bindung von Siva an CD27

kompetitieren kann, unabhängig davon, ob es selbst an Siva gebunden ist oder nicht.

Der C-Terminus des Zelloberflächen-Rezeptors CD27 ist nur 40 Aminosäuren lang. CD27

gehört zu der Gruppe der TNF-Rezeptoren, die keine Death Domain besitzen, und deshalb

mit keinem der pro-apoptotischen Adaptorproteine interagieren können. Jedoch befindet

findet sich in dem kurzen zytoplasmatischen Teil eine Sequenz, an die die Proteine TRAF2,

TRAF3 und TRAF5 binden können (Abbildung 8; AKIBA ET AL. 1998, YAMAMOTO ET AL.

1998).

Abb. 8: Der Oberflächenrezeptor CD27. Vollständige Aminosäure-Sequenz von CD27 einschliesslich des Signalpeptids zur Membranlokalisation, das im Verlauf der posttranslationalen Reifung abgespalten wird. Am C-Terminus befinden sich das hydrophobe Transmembran-Segment und der kurze intrazelluläre (zytoplasmatische) Teil. Die TRAF2-Bindungsstelle ist grau unterlegt. Die Sequenz EEEG kann die Bindung von TRAF2 verstärken. Mit einer Klammer eingefasst ist der verkürzte Teil der zytoplasmatischen Domäne, der ebenfalls in dem Zweihybrid-Versuch eingesetzt wurde. (nach GRAVESTEIN ET AL. 1993; AKIBA ET AL. 1998)

1 MARPHPWWLC VLGTLVGLSA TPAPKSCPER HYWAQGKLCC QMCEPGTFLV KDCDQHRKAA

61 QCDPCIPGVS FSPDHHTRPH CESCRHCNSG LLVRNCTITA NAECACRNGW QCRDKECTEC

121 DPLPNPSLTA RSSQALSPHP QPTHLPYVSE MLEARTAGHM QTLADFRQLP ARTLSTHWPP

181 QRSLCSSDFI RILVIFSGMF LVFTLAGALF LHQRRKYRSN KGESPVEPAE PCRYSCPREE

241 EGSTIPIQED YRKPEPACSP

Hydrophobes Signalpeptid Extrazellulär Cystein-reiche Domäne

Transmembran-Domäne Intrazellulär

C-Terminus verkürztTRAF2-Bindung

1 MARPHPWWLC VLGTLVGLSA TPAPKSCPER HYWAQGKLCC QMCEPGTFLV KDCDQHRKAA

61 QCDPCIPGVS FSPDHHTRPH CESCRHCNSG LLVRNCTITA NAECACRNGW QCRDKECTEC

121 DPLPNPSLTA RSSQALSPHP QPTHLPYVSE MLEARTAGHM QTLADFRQLP ARTLSTHWPP

181 QRSLCSSDFI RILVIFSGMF LVFTLAGALF LHQRRKYRSN KGESPVEPAE PCRYSCPREE

241 EGSTIPIQED YRKPEPACSP

Hydrophobes Signalpeptid Extrazellulär Cystein-reiche Domäne

Transmembran-Domäne Intrazellulär

C-Terminus verkürztTRAF2-Bindung

Ergebnisse 47

Abb. 9: Interaktion von Siva mit CD27. Zweihybrid-Interaktionsversuch mit Siva und dem C-Terminus von CD27. Es wurden der gesamte zytoplasmatischen Teil sowie der um die TRAF2-Bindungsstelle verkürzte C-Terminus eingesetzt (siehe Markierung in A) Die Stärke der yEGFP3-Reportergen-Aktivität wurde wie in Abb. 7 durchflusszytometrisch gemessen.

Um die Lage der Interaktionsstelle von Siva auf dem C-Terminus von CD27 zu lokalisieren,

wurden gerichtete Zweihybrid-Versuche unternommen, wobei der gesamte zytoplasmatische

Teil von CD27 und eine um die TRAF2-Bindungsstelle verkürzte Variante eingesetzt wurden.

Wie Abbildung 9 zeigt, führt die Koexpression von Siva und dem kompletten

zytoplasmatischen Teil von CD27 zu einer deutlichen Erhöhung der Reportergen-Aktivität.

Der verkürzte C-Terminus von CD27 kann nicht mit Siva interagieren, das Niveau der

Expression des Reportergens erreicht nur den Wert der Kontrolle. Der Bindungsort für Siva

auf dem zytoplasmatischen Teil von CD27 liegt folglich in dem Bereich, in dem auch TRAF2

bindet. Eine direkte Konkurrenz von Siva und TRAF2 um die Bindung an CD27 ist damit

jedoch nicht gezeigt.

3.2. Interaktion zwischen Siva und dem Strukturprotein VP2 von Coxsackievirus B3

in vitro

3.2.1. Expression von Siva-1 und -2 und einzelner Fragmente von Siva in E. coli

Um die in einem cDNA-Genbankscreening gefundene und durch einen gerichteten

Zweihybridversuch bestätigte Interaktion des Viruscapsidproteins VP2 mit Siva in einem in

vitro-Versuch zu bestätigen, musste Siva in grösseren Mengen rekombinant hergestellt

werden. Die Fragmente wurden anhand der Lage der Exon 2-Deletion in der Splicevariante

Siva-2 und der von Prasad et al. vorgenommenen Klassifizierung der funktionellen Domänen

ausgewählt. Eine Analyse der Aminosäure-Sequenz von Siva ergab zudem, dass dieses

CD27 C-Terminus kom pl. + pGADGH

CD27 C-Terminus kom pl. + Siva

CD27 C-Terminus verkürzt + Siva

Zellz

ahl

GFP-Fluoreszenz

Ergebnisse 48

Protein im Verhältnis zur Gesamtzahl einen sehr grossen Anteil der Aminosäuren Cystein

(17 von 189 Aminosäuren) und Histidin aufweist. Im C-Terminus sind insgesamt sechs nach

dem Schema CxxC gepaarte Cysteine zu finden (x steht hier für eine beliebige Aminosäure).

Diese Cystein-Paarung ist charakteristisch für Proteine, die Zink-Ionen koordinieren können

(SCHWABE AND KLUG 1994). Ausserdem befinden sich über das ganze Siva-Molekül verteilt

weitere einzelne Cystein- und Histidinreste (siehe Abbildung 10). Der gesamte Anteil von

Cystein und Histidin an den Aminosäuren von Siva beträgt mehr als 10%.

Abb. 10: In E. coli exprimierte Fragmente von Siva.A: Die Proteine Siva-1, Siva-2 und die Deletionsmutante ∆ C-Terminus wurden als Fusionsproteine mit MBP hergestellt. Dargestellt sind die von Prasad et al. (1997) vorgeschlagene Domänen-Gliederung, die Position der Cysteinpaare (CxxC-Muster,* ) und einzelner Cystein- und Histidinreste. In dem vergrösserten Ausschnitt ist die Aminosäure-Sequenz des C-Terminus wiedergegeben, Unterstreichungen markieren die Position der Cystein-Paare. B: Die Position der als GST-Fusionsprotein hergestellten Fragmente von Siva. Ihre Lage orientiert sich ebenfalls an der Domänen-Gliederung. Die Nummerierung bezieht sich auf die zugehörigen Plasmid-Konstruktionen. Im rechten Teil ist markiert, ob das betreffende Fragment im in vitro-Interaktionsassay mit VP2 reagiert.

N-Terminus Death Domain B-Box Zn-Finger1 61 136 164 189 AS

128 - CSSCVRAVDGKAVCGQCERALCGQCVRTCWGCGVACTLCGLVDCSDMYEKVLCTSC - 184

Siva-1

(MN25)

1 53 118 136 164 189 AS

Siva-2(MN44)

1 61 127

∆∆ C-Terminus(MN47)

MN01

MN18

MN17

MN19

MN21

MN03

MN05

MN02

MN20

MN22

MN04

MN07

MN06

Fragmente von Siva

--++-+++++++-

Interaktionmit VP2

B

A

N-Terminus Death Domain B-Box Zn-Finger1 61 136 164 189 AS

128 - CSSCVRAVDGKAVCGQCERALCGQCVRTCWGCGVACTLCGLVDCSDMYEKVLCTSC - 184

Siva-1

(MN25)

1 53 118 136 164 189 AS

Siva-2(MN44)

1 61 127

∆∆ C-Terminus(MN47)

MN01

MN18

MN17

MN19

MN21

MN03

MN05

MN02

MN20

MN22

MN04

MN07

MN06

Fragmente von Siva

--++-+++++++-

Interaktionmit VP2

--++-+++++++-

Interaktionmit VP2

B

A

Ergebnisse 49

Zuerst wurden mittels PCR aus der cDNA von Siva die entsprechenden Bereiche amplifiziert

und in die Vektoren pGEX4T-1 und pGEX4T-3 einkloniert, die die Expression eines

Fusionsproteins mit Glutathion S-Transferase in E. coli ermöglichen. Anschliessend wurden

die Expression der Fusionsproteine in einer Schüttelkultur induziert und die GST-

Fusionsproteine mit Glutathion-Sepharose nach den Angaben des Herstellers isoliert. Die

Analyse der Präparationen durch eine SDS-Gelelektrophorese ergab, dass nicht alle

Fragmente mit hoher Ausbeute gewonnen werden konnten. Die Fragmente MN17-19 liessen

sich schlecht exprimieren, ebenso das als GST-Fusion präparierte Protein Siva-1. (Abbildung

11).

Abb. 11: Analyse der GST-Siva-Fusionsproteine mit SDS-Gelelektrophorese.Pro Spur wurden je 10µl der gereinigten, an Glutathion-Sepharose gebundenen Proteine aufgetragen, die direkt in Probenpuffer aufgenommen wurden. Die Proteine wurden über ein 12%iges SDS-Gel aufgetrennt und mit Coomassie-Blau gefärbt.

Eine Analyse der Eigenschaften der betreffenden Proteine mit dem Proteinanalyseprogramm

„Protparam“ ergab, dass Siva einen deutlich basischen Isoelektrischen Punkt besitzt

(pI=8,3). Fragmente, die den N-Terminus enthielten, wiesen einen zum Teil noch höheren pI-

Wert auf (Tabelle 9).

Um die mit den beschriebenen Eigenschaften der Proteine einhergehende schlechte

Ausbeute zu verbessern, wurde ein anderes Expressionssystem für E. coli gewählt: die

Fusion mit dem Maltose-Bindenden Protein (MBP). Es enthält kein Cystein und hat eine

einfache Struktur, die bereits vor längerer Zeit bestimmt wurde (SPURLINO ET AL. 1991).

Durch die Fusion an MBP kann die Löslichkeit von Proteinen und die Protein-Ausbeute

deutlich erhöht werden (KAPUST AND WAUGH 1999). Die Fusionsproteine können wegen der

Affinität von MBP reversibel an eine Amylose-Matrix gebunden und mit Maltose wieder

eluiert werden (RIGGS 1994).

M – Marker1 – GST2 – MN013 – MN024 –MN035 – MN046 – MN057 – MN068 – MN07

M 1 2 3 4 5 6 7 8 199 -131

23 -

34 -

17 -

7 -

85 -

M – Marker1 – GST2 – MN013 – MN024 –MN035 – MN046 – MN057 – MN068 – MN07

M 1 2 3 4 5 6 7 8 199 -131

23 -

34 -

17 -

7 -

85 -

1 – MN172 – MN183 – MN194 – MN205 – MN216 – MN227 – Siva

(human)M – Marker

- 199131

- 85

- 7

- 13- 23

- 34

1 2 3 4 5 6 7 M 1 – MN172 – MN183 – MN194 – MN205 – MN216 – MN227 – Siva

(human)M – Marker

- 199131

- 85

- 7

- 13- 23

- 34

1 2 3 4 5 6 7 M

Ergebnisse 50

Tabelle 9: Eigenschaften der Siva-Fusionsproteine. (Das Molekulargewicht und der pI-Wert wurden berechnet mit dem Programm „Protparam“: http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)

Fragment Aminosäure-Position Molekulargewicht (kDa) pI

Siva-1 1-189 20.0 8.3

Siva-2 1-53 + 118-189 13.1 8.1

MN01 1-61 6.8 10.2

MN02 62-189 13.2 5.2

MN03 62-136 7.6 5.5

MN04 118-164 3.8 8.2

MN05 63-164 10.4 6.9

MN06 164-189 2.9 3.9

MN07 118-189 6.5 5.0

MN17 1-136 14.5 9.1

MN18 1-119 13.0 9.3

MN19 1-164 17.3 8.9

MN20 120-164 4.5 8.3

MN21 53-119 5.9 5.5

MN22 120-189 7.2 5.0

GST-Siva-1 1-189 47.9 7.4

MBP-Siva-1 (MN25) 1-189 62.9 5.6

MBP-Siva-2 (MN44) 1-53 + 118-189 56.1 5.3

MBP-Siva ∆C (MN47) 1-127 56.5 5.7

Die Siva-Varianten Siva-1 und -2 sowie ein um den gesamten C-Terminus verkürztes Protein

(MN47, siehe Abbildung 10a) wurden in den Vektor pMAL-c2x einkloniert. Dieser

Deletionsmutante ohne C-Terminus fehlen alle nach dem Muster CxxC gepaarten Cysteine.

Die drei Proteine wurden in den speziell für die Expression von MBP-Fusionsproteinen

geeigneten E. coli-Stamm RV308 transformiert. Die Hochdichtekultur und die anschliessende

Reinigung mittels FPLC über eine Amylose-Säule wurden von Dr. Peter Hortschansky aus

der Abteilung Angewandte Mikrobiologie des HKI durchgeführt. Von ihm wurde auch das

SDS-Gel zur Analyse der gereinigten MBP-Fusionsproteine angefertigt (Abbildung 12).

Ergebnisse 51

Abb 12: Expression von Siva und zwei Siva-Mutanten als MBP-Fusionsproteine in E.coli RV308. Die Bakterien wurden in einem Sixfors-Hochdichtefermenter unter Zusatz von Zinkacetat angezogen und die Expression mit IPTG induziert. Die Fusionsproteine wurden durch Bindung an eine Amylose-Säule und Elution mit Maltose gereinigt. Aliquots der einzelnen Proben wurden auf ein NuPAGE-Gel mit MOPS-Laufpuffer (Fa. Invitrogen) aufgetragen. Die Proteinreinigung und das Gel wurden von Dr. Peter Hortschansky (Abteilung Angewandte Mikrobiologie des HKI) angefertigt. (M – Molekulargewichtsstandard, 1 – Komplettes Zelllysat, 2 – Durchfluss aus der Amylose- Säule, 3 – Eluat) Bei den Arbeiten mit den MBP-Siva-Fusionsproteinen wurden weitere Schwierigkeiten

deutlich: zwar liessen sich die Proteine mit guter Ausbeute in E. coli RV308 exprimieren,

wurden sie jedoch längere Zeit bei 4°C aufbewahrt, bildeten sich ungerichtet Multimere, die

auf einem nicht denaturierenden Gel sichtbar wurden. Durch Zugabe von 1mM DTT liess

sich die Multimerisierung rückgängig machen (P. Hortschansky, persönliche Mitteilung).

Daraufhin wurde versucht, durch die Wahl bestimmter Puffer und Denaturierungs-

/Renaturierungs-Schritte gezielt Dimere zu erzeugen, um eine eventuelle Dimerisierung von

Siva nachzuweisen. Dies gelang jedoch nicht, immer wieder waren auch höhermolekulare

Komplexe zu beobachten. Da die Aminosäure-Sequenz von Siva eine Bindung von Zink-

Ionen vermuten liess (siehe oben), wurden daraufhin die Bakterien zur Expression von Siva

unter Zusatz von 1mM Zinkacetat angezogen. Dies führte zu einer Erhöhung der Stabilität

der Siva-Präparationen und deutlichen Reduzierung der ungerichteten Aggregation.

3.2.2. In vitro-Interaktionsassay zwischen dem Coxsackievirus B3-Capsidprotein VP2

und Siva

In dieser Arbeit sollte versucht werden, in vitro mit isolierten Proteinen die Interaktion von

Siva mit dem Hüllprotein VP2 von Coxsackievirus B3 nachzuvollziehen. Der Bereich von

Siva, der für die Bindung an VP2 verantwortlich ist, sollte dabei eingegrenzt werden.

200

116.397.4

66.3

55.4

36.531

21.514.4

6

MBP-Siva-1(MN25)

MBP-Siva-2(MN44)

MBP-Siva∆ C-Terminus

(MN47)

1 2 3 1 2 3 1 2 3M M [kDa]M

200

116.397.4

66.3

55.4

36.531

21.514.4

6

MBP-Siva-1(MN25)

MBP-Siva-2(MN44)

MBP-Siva∆ C-Terminus

(MN47)

1 2 3 1 2 3 1 2 3M M [kDa]M

Ergebnisse 52

Dazu wurden die in Abschnitt 3.2.1. beschriebenen Siva-Fusionsproteine, gebunden an die

jeweilige feste Matrix (Glutathion-Sepharose für GST-Fusionsproteine, Amylose für MBP-

Fusionen) verwendet. In jedem Ansatz wurden 10µg Fusionsprotein eingesetzt, entstandene

Volumenunterschiede wurden durch Zugabe entsprechender Mengen der festen Matrix

(ohne gebundenes Protein) ausgeglichen. Zur Unterdrückung unspezifischer Bindungen

wurden die Versuchsansätze erst mit einer Lösung von BSA in PBS mit Protease-Inhibitoren

blockiert. Die Siva-Fusionsproteine wurden mit einem Lysat von Coxsackievirus B3-

infizierten GMK-Zellen (von Dr. Andreas Henke, Institut für Virologie) inkubiert. Nach

mehrmaligem Waschen wurde das an das jeweilige immobilisierte Protein gebundene VP2

durch einen Western Blot mit VP2-Antiserum und ECL-Detektion nachgewiesen.

Abb. 13: In vitro-Interaktionsassay von Siva und Siva-Mutanten mit dem Virusprotein VP2.A: Siva und die Deletionsmutanten wurden als GST- bzw. MBP-Fusionsproteine in E. coli exprimiert und gereinigt. Gleiche Mengen der gereinigten Fusionsproteine wurden an die korrespondierende Matrix (Glutathion-Sepharose bzw. Amylose) gekoppelt und mit Lysat von Coxsackievirus B3-infizierten GMK-Zellen (von Dr. A. Henke, Institut für Virologie) inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen wurden die gebundenen Proteine über ein SDS-Gel aufgetrennt und das gebundene VP2 mittels Western Blot (Erstantikörper: VP2-Antiserum, Zweitantikörper: Anti-Kaninchen-Peroxidase,Detektion: ECL) nachgewiesen. B: In vitro-Interaktion von MBP-Siva-Fusionsproteinen mit VP2. Der Bindungstest wurde wie in A durchgeführt.

kDa

14-19-28-

39-

51-

64-

97-

GMK-CVB307060504030201GST

GST-Siva-Fragmente

kDa

14-19-28-

39-

51-

64-

97-

kDa

14-19-28-

39-

51-

64-

97-

GMK-CVB307060504030201 07060504030201GST

GST-Siva-Fragmente

kDa

14-19-28-

39-

51-

64-

97-

GMK-CVB3MBP

MBP-Siva-1

GMK-CVB3MBP

MBP-Siva-1222120191817 222120191817

GST-Siva-Fragmente

208 -

105 -

53 -

34 -

23 -17 -13-

7 -

[kDa] MBP GMK-CVB3

208 -

105 -

53 -

34 -

23 -17 -13-

7 -

208 -

105 -

53 -

34 -

23 -17 -13-

7 -

[kDa] MBP GMK-CVB3

A

B MBP-Siva-Proteine

Siva-1

Siva-2

Siva∆∆ C-Term.

Ergebnisse 53

Abbildung 13 zeigt das Ergebnis dieses Versuches: die GST-Siva-Fragmente MN02-05, 07,

17, 19, 20 und 22 interagierten in vitro mit VP2, ebenso wie die MBP-Fusionsproteine Siva-1

und Siva-2. Die Siva-Mutante ∆ C-Terminus (MN47) band nicht an VP2, auch die übrigen

GST-Siva-Fusionsproteine zeigten keine Bindung. Als Negativkontrolle wurden die reinen

Protein-„Tags“ ohne Fusionsprotein verwendet. Zum Nachweis der Spezifität des VP2-

Antiserums wurde GMK-CVB3-Lysat aufgetragen.

Vergleicht man die Positionen der an VP2 bindenden Fusionsproteine innerhalb des Siva-

Moleküls (Abbildung 10b, rechte Seite), so wird deutlich, dass allen mit VP2 interagierenden

Siva-Varianten ein kleiner Teil gemeinsam ist: das Ende der so genannten „Death Domain“,

genauer die Aminosäuren 128-136 von Siva. Dies ist nur ein sehr kleiner Teil des gesamten

Moleküls, man kann jedoch annehmen, dass diese 9 Aminosäuren eher den Kern eines

grösseren Interaktionsbereiches bilden. Interessant ist in diesem Zusammenhang, dass die

physiologisch relevante Variante Siva-2 mit VP2 interagieren kann. Die Überexpression

dieser Splice-Variante kann im Gegensatz zum Gesamtprotein Siva-1 keinen

programmierten Zelltod auslösen (YOON ET AL. 1999).

3.3. Suche nach Siva-bindenden Proteinen in einer humanen Herz-cDNA-Bank

(Zweihybrid-Screening)

Mit Hilfe der Lithiumacetat-Transformationsmethode wurde Siva als Fusion mit der GAL4-

DNA-Bindedomäne in den S. cerevisiae-Stamm KFY3 transformiert, zusammen mit einer in

den Aktivierungsdomänen-Vektor pACT2 eingesetzten cDNA-Bank aus menschlichem

Herzgewebe (Vektor und cDNA-Bank von Clontech). Die Suche nach cDNA-Klonen für mit

Siva interagierenden Proteinen erfolgte auf dem herkömmlichen Weg durch einen

Filterassay mit β-Galactosidase-Färbung (siehe Abschnitt 2.2.5.). Bei einem Klon mit

Interaktion zu Siva wurde die Plasmid-DNA durch einen Plasmid-Rescue mit

anschliessender Mini-Präparation isoliert. Die Spezifität der Interaktion wurde durch einen

weiteren, gerichteten Zweihybrid-Versuch mit Siva und dem jeweiligen Klon überprüft. Nur

wenn ein Klon auch in diesem zweiten Test eine Blaufärbung zeigte, wurde anschliessend

das aus der cDNA-Bank stammende Insert sequenziert und diese Interaktion als bestätigt

angenommen.

Insgesamt wurden etwa 210.000 unabhängige Klone getestet. Diese Zahl wurde durch

Ausplattieren eines Aliquots jedes Transformationsansatzes auf Agarplatten mit

Minimalmedium und Auxotrophie-Selektion und Auszählen der entstandenen Kolonien

bestimmt. 83 dieser 210.000 Kolonien färbten sich im ersten β-Galactosidase-Test blau.

Durch Retransformation und gerichteten Zweihybrid-Assay wurden schliesslich sechs

Interaktionen bestätigt (siehe Tabelle 10).

Ergebnisse 54

Tabelle 10: Ergebnis des Zweihybrid-Screenings der humanen Herz-cDNA-Bank nach Proteinen, die mit Siva interagieren. Nach einer Bestätigung der Interaktion in einem gerichteten Zweihybrid-Versuch wurden die jeweiligen Klone sequenziert. Durch Suche in der Gen-Datenbank BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) wurden die korrespondierenden Gene ermittelt.

Klon Zugehöriges Protein Länge der cDNA

(AS-Position)

Sequenzierung

(Identität in %)

A19, A 33 Nicht natürliches Protein (3´-

untranslatiertes Ende eines Gens)

- -

B1-1 Peroxisomen-Protein PMP22 5-56 (von 194) 100

E51A, E51C Telethonin Gesamtprotein

(167 AS)

100

E178 Cytochrom C-Oxidase, Untereinheit

III

Gesamtprotein

(138 AS)

93,3

In Abbildung 14 sind die Filterassays zur Bestätigung der einzelnen Interaktionen abgebildet.

Um eine Aktivierung durch einen Bindungspartner allein auszuschliessen, wurden die

jeweiligen Klone auch zusammen mit dem korrespondierenden leeren Vektor transformiert.

Abb. 14: Ergebnisse des Screenings einer Herz-cDNA-Bank nach mit Siva interagierenden Proteinen.Dargestellt sind die Kontroll-Filterassays mit den aus der Genbank isolierten Klonen B1-1 (Peroxisomen-Membranprotein PMP22, Links), E51A und -C (Telethonin, Mitte) und E178 (Cytochrom-Oxidase Untereinheit III, Rechts). Um eine Transaktivierung auszuschliessen, wurden die jeweiligen Klone auch gemeinsam mit dem leeren Bindedomänen-Vektor transformiert. Als Positivkontrolle diente die Homodimerisierung von BCY1 (Plasmide pTM145/146).Das Protein PMP22 ist ein wichtiger Bestandteil der einschichtigen

Peroxisomen-Protein PMP22 (Klon B1-1)

Telethonin (Klon E51A/C)

Cytochrom-Oxidase Untereinheit III (Klon E178)

Siva/Vektor(pKK7/pACT2)

Siva/Telethonin(pKK7/E51A)

Vektor/Telethonin(pAS2-1/E51A)

Siva/Telethonin(pKK7/E51C)

pTM145/pTM146

Vektor/Telethonin(pAS2-1/E51C)

Siva/Cytochrom-Oxidase III(pKK7/E178)

Vektor/Cytochrom-Oxidase III(pAS2-1/E178)

pTM145/pTM146

Siva/Vektor(pKK7/pACT2)

Siva/PMP22(pKK7/b1-1)

Vektor/PMP22(pAS2-1/B1-1)

pTM145/pTM146

Ergebnisse 55

Membran von Peroxisomen, einer für den Fettsäure- und Purinmetabolismus sowie den

Hydroperoxid-Stoffwechsel wichtigen Zellorganelle (LÜERS ET AL. 2001). Es enthält mehrere

Bereiche mit hydrophoben Aminosäuren, die den Einbau von PMP22 in die Peroxisomen-

Membran ermöglichen.

Telethonin gehört zu denjenigen Zytoskelett-Protein, das fast ausschliesslich in Herz- und

Skelettmuskelgewebe exprimiert werden. In Organen mit glatten Muskelzellen (Magen,

Harnblase, Darm, Prostata) ist es dagegen kaum zu finden. Es ist ein Bestandteil der

kontraktilen Einheiten der Muskelzellen, der Sarcomere (VALLE ET AL. 1997).

Das Enzym Cytochrom C-Oxidase ist ein Multiprotein-Komplex, der Teil der mitochondrialen

Atmungskette ist. Cytochrom C-Oxidase ist als Dimer in der inneren Membran der

Mitochondrien lokalisiert. Jedes dieser Dimere enthält dreizehn Untereinheiten (TSUKIHARA

1996). Der Cytochrom C-Oxidase-Komplex akzeptiert Elektronen von Cytochrom C und

überträgt sie auf molekularen Sauerstoff. Die Untereinheit III enthält sieben Transmembran-

Einheiten ohne nennenswerten Extramembran-Anteil. Die Funktion dieses Proteins ist

unbekannt, es wird jedoch vermutet, dass die Untereinheit III als Strukturprotein die

Ausrichtung der anderen Bestandteile des Enzyms vermittelt (IWATA ET AL. 1995).

3.4. In vitro-Interaktionstest zwischen MBP-Siva und HA-PMP22

Um die Interaktion zwischen Siva und dem Peroxisomen-Protein PMP22 durch einen

unabhängigen Versuch zu bestätigen, wurde ein in vitro-Bindungsassay durchgeführt. Es

wurden ähnliche Versuchsbedingungen wie bei dem Interaktionstest VP2-Siva (Abschnitt

3.2.2.) gewählt, auch hier wurden immobilisierte MBP- und GST-Siva-Fusionsproteine

verwendet. Das zu testende Protein PMP22 wurde jedoch in Säugerzellen exprimiert. Dazu

wurde die cDNA des humanen PMP22-Gens aus dem Plasmid pEGFPC1-PMP22 (von Dr.

Ute Brosius, Kinderklinik der Universität Düsseldorf) mittels PCR amplifiziert und in den

Vektor pCMV-Tag5A einkloniert. Dieses Plasmid wurde mit Lipofectamin 2000 nach den

Angaben des Herstellers in 293-Zellen transfiziert. Auf diese Weise wurde unter der Kontrolle

des starken CMV-Promoters ein Fusionsprotein von PMP22 mit einem C-terminalen HA- und

einem myc-Tag exprimiert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet

und wie in Abschnitt 2.2.9. beschrieben mit NTE-Puffer lysiert. Der Proteingehalt des

Zelllysats wurde mit der Bradford-Methode bestimmt. Für den Bindungstest wurden je Ansatz

250µg Lysat eingesetzt. Das an die immobilisierten Siva-Fragmente gebundene PMP22

wurde durch einen Western Blot mit einem myc-tag-Antikörper und ECL-Detektion

nachgewiesen.

Das Ergebnis des in vitro-Bindungsversuchs zeigte, dass von den drei eingesetzten MBP-

Siva-Fusionsproteinen Siva-1 (das gesamte Protein) und die C-Terminus-Deletionsmutante

an PMP22 binden konnten, jedoch nicht die Splicevariante Siva-2. Das GST-Fusionsprotein

Ergebnisse 56

MN01, das den N-Terminus von Siva enthält, interagierte mit PMP22, die anderen

Fusionsproteine MN03, 07 und 20 zeigten keine Reaktion (Abbildung 15). In allen Spuren ist

auf dem Western Blot eine Bande von ca. 90 kDa Grösse zu sehen, bei der es sich

vermutlich um ein durch die Art des Versuches bedingtes Artefakt handelt. Die Ursache

könnte der myc tag-Antikörper sein, der möglicherweise ein unspezifisch an die feste Matrix

gebundenes Protein (entweder aus E. coli oder den 293-Zellen) erkennt.

Abb. 15: In vitro-Interaktionsassay von Siva und Siva-Mutanten mit PMP22.Siva und die Deletionsmutanten wurden als GST- bzw. MBP-Fusionsproteine in E. coli exprimiert. Gleiche Mengen der gereinigten Fusionsproteine wurden an die korrespondierende Matrix (Glutathion-Sepharose bzw. Amylose) gekoppelt und mit Lysat von mit pCMV-Tag5A-PMP22 transfizierten 293-Zellen inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen wurden die gebundenen Proteine über ein SDS-Gel aufgetrennt und gebundenes PMP22 mittels Western Blot (Erstantikörper: myc-tag-Antiserum, Zweitantikörper: Anti-Kaninchen-Peroxidase, Detektion: ECL) nachgewiesen. Bei der in allen Spuren auftretenden Bande von ca. 90 kDa Grösse handelt es sich um ein vermutlich durch den myc tag-Antikörper verursachtes Artefakt.

Beim Überblick über die Lage der Fragmente von Siva, die eine Interaktion mit PMP22

zeigten (siehe Abbildung 10) wird deutlich, dass allen eine Region gemeinsam ist: das Ende

des N-Terminus (AS 53-61 von Siva). Diese Aminosäuren sind für die Bindung an PMP22

verantwortlich. In der Splice-Variante Siva-2, die bei Überexpression in Säugerzellen keine

Apoptose induzieren kann (Yoon et al. 1999), ist diese Region nicht vorhanden.

208 -

105 -

53 -34 -23 -17 -13 -7 -

[kDa] MBPSiva

-1Siva-2

∆C-Term.

MBP-Fusionen

GSTMN01

MN03

MN07

MN20

GST-Fusionen

PMP22

208 -

105 -

53 -34 -23 -17 -13 -7 -

[kDa] MBPSiva

-1Siva-2

∆C-Term.

MBP-Fusionen

GSTMN01

MN03

MN07

MN20

GST-Fusionen

208 -

105 -

53 -34 -23 -17 -13 -7 -

[kDa] MBPSiva

-1Siva-2

∆C-Term.

MBP-Fusionen

GSTMN01

MN03

MN07

MN20

GST-Fusionen

PMP22PMP22

Ergebnisse 57

3.5. Expression von Siva als MBP-Fusionsprotein und Bestimmung des Zn2+ -

Gehaltes

Die Analyse der Aminosäure-Sequenz von Siva ergab, dass das Protein überdurchschnittlich

viele Cystein- und Histidin-Reste enthält. Am C-Terminus finden sich insgesamt sechs

Cystein-Paare vom Typ CxxC. Dies lässt auf eine möglich Bindung von Zink-Ionen

schliessen (Schwabe and Klug 1994). Jedes Zink-Ion benötigt zur Koordination vier

Liganden, also möglicherweise zwei dieser Cystein-Paare oder zusätzlich noch einzelne

Cystein- oder Histidinreste (siehe Abschnitt 3.2.1.).

Um zu prüfen, ob und wie viele Zink-Ionen von Siva gebunden werden können, wurden ein

kolorimetrischer Test eingesetzt (siehe Abschnitt 2.2.13.). Die zu testenden MBP-

Fusionsproteine Siva-1 (MN25), Siva-2 (MN44) und Siva ∆ C-Terminus (MN47) wurden unter

Zusatz von 1mM Zink in E. coli RV308 exprimiert und wie beschrieben gereinigt.

Anschliessend wurden sie für zwei Tage gegen den TNG-Puffer dialysiert. Nach Zugabe der

Reagenzien PMPS und PAR wurde die Absorption verschiedener Mengen Protein

gemessen. Aus den Messwerten wurde ein Mittelwert für die Zahl der gebundenen Zink-

Atome berechnet, indem die mit dem Test bestimmte Zink-Konzentration mit der

eingesetzten Proteinmenge ins Verhältnis gesetzt wurde. Als externe Kontrolle wurde BSA

verwendet, das kein Zink bindet (STENMARK ET AL. 1996). Als weitere Kontrolle wurde MBP

ohne ein angefügtes Protein eingesetzt. Das Ergebnis des Versuches zeigt, dass das

komplette Siva-Protein drei Zink-Ionen enthält, wovon zwei am Cystein-reichen C-Terminus

gebunden sind, denn durch die Deletion des C-Terminus gehen zwei Zink-Ionen verloren

(Abbildung 16).

Abb. 16: Bindung von Zink-Ionen im Siva-Protein.Die MBP-Fusionsproteine wurden unter Zusatz von 1mM Zink in E. coli RV308 exprimiert. Mit den gereinigten und gegen TNG-Puffer dialysierten Proteine wurde ein colorimetrischer Test mit dem Zink-Komplexindikator PAR durchgeführt und mit Hilfe der Proteinkonzentration und des Extinktionskoeffizienten für den Zink-Indikatorkomplex die Anzahl gebundener Zink-Ionen je Molekül Protein bestimmt. Es wurden drei verschieden Konzentrationen jedes Proteins eingesetzt.

0

1

2

3

0

1

2

3

MBP-Fusionsproteine

Siva∆∆ C-Term.

Siva-2Siva-1MBPBSA

Äq

uiva

len

te Z

n 2+

/ M

olek

ül P

rote

in

Ergebnisse 58

Die Splice-Variante Siva-2 enthält immer noch zwei Zn2+. Durch die Deletion von Exon 2 in

der Splice-Variante wird also die Koordinationsstelle für das dritte Zink-Ion entfernt. Die

ungepaarten Histidin- und Cysteinreste im vorderen Teil des Siva-Moleküls (siehe Abbildung

10a) nehmen also an der Bindung eines Zink-Ions teil.

3.6. Zelltod nach Expression von Siva und funktionellen Mutanten in Zellkultur

Durch Expression von Siva und einigen der bisher vorgestellten Deletionsmutanten in

Säugerzellen sollte geprüft werden, ob diese den Tod der Zellen verursachen können. Dazu

wurden mit PCR verschiedene Bereiche von Siva amplifiziert und in den Expressionsvektor

pcDNA3 eingesetzt, der die transiente Transkription von Proteinen unter der Kontrolle des

CMV-Promotors ermöglicht. Neben Siva-1 wurde wiederum die Splicevariante Siva-2 und die

um den C-Terminus (der die Cysteinpaare enthält) verkürzte Variante verwendet. Ausserdem

wurde ein Plasmid konstruiert, in dem vor Siva am N-Terminus im selben Leserahmen die

Myristoylierungssequenz der Proteinkinase c-src (N-terminale Aminosäure-Sequenz

MGSNKSKP, TANAKA ET AL. 1987) eingesetzt wurde. Dies entspricht der minimalen

Konsensussequenz MGxxxSxx für eine cotranslationale Myristoylierung des N-Terminus,

wodurch der Einbau des myristoylierten Proteins in die Innenseite der Zellmembran

ermöglicht wird (UTSUMI ET AL. 2001).

In 96well-Zellkulturplatten wurden je 2x104 293-Zellen ausgesät. Nach einem

Mediumwechsel am nächsten Tag wurden die Zellen mit Lipofectamin 2000 (0,5µg Plasmid-

DNA) transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die lebenden Zellen mit dem Farbstoff MTT

gefärbt und nach 3 Stunden der Versuch kolorimetrisch ausgewertet. Je Plasmid wurden 4

Kavitäten transfiziert. Insgesamt wurde der Versuch viermal durchgeführt. Für jeden Versuch

wurden die Mittelwerte für die einzelnen Transfektionen auf die Kontrolle normiert (Vektor-

Transfektion entspricht 100% Überleben). Abschliessend wurde der Mittelwert aus den

Ergebnissen der vier Einzelversuche berechnet.

In Abbildung 17a ist gezeigt, wie die Expression von Siva oder der funktionellen Mutanten

die Vitalität der transfizierten Zellen beeinflusste. Mit Siva-1 transfizierte Zellen zeigen eine

gegenüber der Kontrolle um ungefähr 30% reduzierte Überlebensrate. Zum Vergleich: die

Transfektionseffizienz für die transiente Transfektion wurde mit einem Expressionsplasmid

für das Grün-fluoresziere Protein (pEGFP-N1 von Clontech) und Quantifizierung der

leuchtenden Zellen am Durchflusszytometer FACStar+ mit 25-30% bestimmt (diese Messung

ist nicht dargestellt). Das bedeutet, dass vermutlich alle oder die meisten mit Siva

transfizierten Zellen im Verlauf der 48 Stunden dauernden Expression starben. Bei

Transfektion der veränderten Siva-Proteine stieg die Überlebensrate deutlich an, sie

erreichte jedoch nicht ganz wieder das Kontrollniveau.

Ergebnisse 59

Abb. 17: Überleben von 293-Zellen nach Transfektion mit Siva oder Siva-Mutanten. A. Transfektion von 293-Zellen mit Expressionsplasmiden für Siva-1 und -2, der Deletions-Mutante ∆ C-Terminus oder einer mit dem N-terminalen Myristoylierungssignal versehenen Variante. Das Überleben wurde durch eine MTT-Färbung 48h nach der Transfektion mit Lipofectamin gemessen und als Mittelwert aus vier Experimenten relativ zur jeweiligen Kontrolle berechnet. B. Einfluss von N-Acetylcystein oder Vitamin C auf das Überleben mit Siva-1 oder -2 transfizierter Zellen. Die Zellen wurden wie in A transfiziert, jedoch wurde gleichzeitig mit der Plasmid-DNA 2mM N-Acetylcystein oder 500µM Vitamin C zugesetzt.

Dass die Splice-Variante Siva-2 einen geringeren Einfluss auf die Vitalität der transfizierten

Zellen hat als das Wildtyp-Protein Siva-1 (YOON ET AL. 1999), konnte also in diesem Versuch

bestätigt werden. Die N-Myristoylierung von Siva bewirkte ebenfalls eine Verbesserung der

Überlebensrate. Vermutlich wird durch den Einbau von Siva in die innere Zellmembran der

Kontakt zu im Zytoplasma befindlichen Bindungspartnern verhindert, wodurch die

proapoptotische Eigenschaft von Siva gehemmt wird.

Die in dieser Arbeit gefundene Interaktion mit dem Peroxisomen-Membranprotein PMP22

legte die Vermutung nahe, dass der zytopathische Effekt von Siva durch die Freisetzung von

Peroxid oder reaktiven Sauerstoff-Spezies aus den Peroxisomen verursacht werden könnte.

Zur Prüfung dieser Hypothese wurde der Transfektionsversuch modifiziert. Gemeinsam mit

der Plasmid-DNA von Siva-1 oder -2 wurde 2mM N-Acetylcystein (NAC) oder 500µM

Ascorbinsäure (Vitamin C) in die Kulturgefässe gegeben. NAC erhöht die intrazelluläre

Konzentration von reduziertem Glutathion und gibt der Zelle damit Reduktionsäquivalente

zurück, wodurch der apoptotische Zelltod zumindest teiweise verhindert werden kann

A

B

40

60

80

100

Siva-2Siva-1KontrolleSiva-2Siva-1Kontrolle

Übe

rleb

en [

% d

er K

ontr

olle

] ohne NAC mit NAC

40

60

80

100

Vitamin C (Ascorbinsäure)N-Acetylcystein

ohne Vit.C mit Vit.C

40

60

80

100

40

60

80

100

myristoyl. Siva

Siva∆ C-Term.

Siva-2Siva-1 Vektor-Kontrolle

Übe

rleb

en [%

der

Kon

trolle

]

Ergebnisse 60

(MEYER AND NOBLE 1994, ESTEVE ET AL. 1999). Ascorbinsäure hingegen wirkt als

Radikalfänger den direkten Zellschädigungen zum Beispiel durch oxidativen Stress und

Stickstoffmonoxid-Radikale entgegen (GUAIQUIL ET AL. 2001, RÖSSIG ET AL. 2001). Wie

Abbildung 17b zeigt, verbessert die Zugabe von NAC die Überlebensrate der mit Siva-1

transfizierten Zellen. Siva-2 exprimierende Zellen, die ohne NAC besser überlebten, erhielten

einen zusätzlichen Schutz, der (im Rahmen dieses Versuches) jedoch nicht deutlich

verbessert war. Vitamin C konnte ebenfalls den Anteil der überlebenden Siva-1-transfizierten

Zellen erhöhen, war aber in seiner protektiven Wirkung nicht so gut wie NAC. Die Siva-2

exprimierenden Zellen profitierten ebenfalls von der Zugabe von Vitamin C, aber nicht in so

starkem Masse wie bei Siva-1.

Zusammengefasst ergaben diese Versuche, dass die zellschädigende Wirkung der

Expression von Siva in kultivierten Säugerzellen ein funktionell intaktes Protein erfordert. Es

wurden Hinweise gefunden, dass diese Wirkung durch reaktive Sauerstoff-Spezies

verursacht worden sein könnte. Eine direkte Beteiligung der Peroxisomen liess sich nicht

nachweisen.

An dieser Stelle muss darauf hingewiesen werden, dass mit dem MTT-Test, der im Grunde

die Aktivität eines bestimmten metabolischen Enzyms misst, nur Aussagen über den

Zustand einer Zelle (im weitesten Sinne also lebend/tot) gemacht werden können. Der

Nachweis des Zelltodes durch Apoptose ist mit dieser Methode nicht möglich.

3.7. Siva-Expression nach Infektion mit CVB3 oder Zugabe exogener Apoptose-

Stimuli

Bei der Infektion mit Coxsackievirus B3 wird Siva verstärkt exprimiert, im Gegensatz zu den

meisten Proteinen der Wirtszellen, deren Transkription durch Inaktivierung des Faktors

eIF4G eingeschränkt wird (YALAMANCHILLI ET AL. 1996, HENKE ET AL. 2000). Mit Hilfe einer

RT-PCR sollte untersucht werden, ob die Stimulierung des programmierten Zelltods durch

Zugabe anderer bekannter Apoptose-Induktoren auch die verstärkte Expression von Siva

bewirkt, oder ob dieses Ereignis spezifisch für die CVB3-Infektion ist.

Zunächst wurde geprüft, ob in normal proliferierenden humanen Zellinien Siva exprimiert

wird. Dazu wurden aus je 2x106 Zellen mit Hilfe des RNEasy-Mini-Kits die RNA isoliert. Aus

der gereinigten RNA wurde durch eine Reverse Transkriptions-Reaktion die zu der RNA

komplementäre cDNA synthetisiert. Zum Abschluss wurde mit einer PCR und Siva-

spezifischen Primern das Vorhandensein von Siva in den Zellinien nachgewiesen. Zur

Kontrolle dafür, dass in allen Reaktionen vergleichbare Mengen verwendet wurden, wurde

aus der RT-Reaktion zusätzlich das β-Actin-Gen amplifiziert. Wie Abbildung 18a zeigt, wurde

unter normalen Kulturbedingungen in keiner der getesteten Zellinien das Siva-Gen

Ergebnisse 61

exprimiert. Lediglich in der Positivkontrolle (mit Coxsackievirus B3 infizierte 293-Zellen)

konnte die mRNA von Siva nachgewiesen werden.

Abb. 18: Expression von Siva in humanen Zelllinien; Überleben von HeLa-Zellen nach Zugabe Zelltod-induzierender Substanzen. A: Nachweis von Siva in normal proliferierenden Kulturen verschiedener humaner Zellinien. Nach Versuchsende wurden die Zellen geerntet und die RNA mit dem RNEasy Mini Kit (Qiagen) isoliert. Nach einer reversen Transkriptions-Reaktion wurde die Expression von Siva mit einer PCR überprüft. Als Positivkontrolle dienten mit Coxsackievirus B3 infizierte HeLa-Zellen. Die Grösse des Siva-Transkripts beträgt 567 bp. Zur Kontrolle der je PCR eingesetzten Menge an RNA bzw. RT-Reaktionsansatz wurde aus den gleichen RT-Reaktionen auch das b-Actin-Gen amplifiziert (851 bp). B: Um die Überlebensrate nach Zugabe zellschädigender Substanzen zu testen, wurden HeLa-Zellen für 24 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen von Staurosporin, Camptothecin, Actinomycin, Etoposid, Wasserstoffperoxid oder Nitroprussid-Natrium inkubiert. Der Anteil überlebender Zellen wurde durch eine mikrosopische Zählung trypanblau-negativer Zellen relativ zu einer unbehandelten Kontrolle bestimmt.

HeLa29

3Raji

U937

H 2O-K

ontr.

293 +

CV B

3

M 293

RajiHeLa

U937

H 2O-K

ontr.

RT-PCR Siva RT-PCR β-Actin

800

1000 bp

600

HeLa29

3Raji

U937

H 2O-K

ontr.

293 +

CV B

3

M 293

RajiHeLa

U937

H 2O-K

ontr.

RT-PCR Siva RT-PCR β-Actin

800

1000 bp

600

A

B

0

20

40

60

80

100

Übe

rlebe

n [%

de

r Ko

ntro

lle]

101 1015000500505

Actinomycin D [µM]Camptothecin [µM]

0

20

40

60

80

100

1000,1 1000,1Staurosporin [nM]

Serum-entzug

0

20

40

60

80

100

1000100101 10001001011001010,1

surv

iva

l (%

of c

ont

rol)

0

20

40

60

80

100

Nitroprussid [µM]H2O

2 [µM]Etoposid [µM]

Ergebnisse 62

Die auch in anderen Versuchen eingesetzten HeLa-Zellen wurden für die folgenden

Versuche ausgewählt. Zur Stimulierung des programmierten Zelltods wurden die Substanzen

Staurosporin (ein unspezifischer, breit wirksamer Proteinkinase-Inhibitor), Camptothecin und

Etoposid (Mitose-Hemmstoffe) und Actinomycin D (Proteinsynthese-Inhibitor) verwendet

(DARZYNKIEWICZ ET AL. 1997). Um den Einfluss von oxidativem Stress zu testen, wurden

ausserdem Wasserstoffperoxid und Nitroprussid-Natrium (ein NO-Donor) eingesetzt.

Vorher musste noch die wirksame Konzentration der einzusetzenden Apoptose-Stimuli

bestimmt werden. Mit Hilfe einer Trypanblau-Ausschlussfärbung wurde nach 24stündiger

Inkubation mit den Substanzen der Anteil überlebender Zellen bestimmt (Abbildung 18b) und

auf der Grundlage dieses Versuches eine Konzentration der jeweiligen Substanz gewählt,

bei der die Zellen eine deutlich reduzierte Vitalität aufwiesen.

Abb. 19: RT-PCR zum Nachweis der Expression von Siva nach Zugabe apoptose-induzierender Substanzen. A: HeLa-Zellen wurden für die angegebenen Zeiten unter Serumentzug kultiviert oder mit den angegebenen Substanzen für jeweils 3, 8 oder 24 Stunden inkubiert. Nach Versuchsende wurden die Zellen geerntet und die RNA mit dem RNEasy Mini Kit (Qiagen) isoliert. Nach der reversen Transkriptions-Reaktion wurde die Expression von Siva mit einer PCR überprüft. Als Positivkontrolle dienten mit Coxsackievirus B3 infizierte HeLa-Zellen. Die Grösse des Siva-Transkripts beträgt 567 bp. B: Zur Kontrolle der je PCR eingesetzten Menge an RNA bzw. RT-Reaktionsansatz wurde aus den gleichen RT-Reaktionen wie in A auch das β-Actin-Gen amplifiziert (851 bp).

M Ko. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 P M

500 bp

800 bp

M Ko. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 P M

1000 bp

A

B

500 bp500 bp

M Ko. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 P M

1000 bp1000 bp

M MarkerKo. Wasser-Kontrolle1 Unstimulierte Zellen2 DMSO 24 Std.3 MeOH 24 Std.

4 Serum-Entzug 3 Std.5 8 Std.6 24 Std.

7 Staurosporin 5 µM 3 Std.8 8 Std.9 24 Std.

10 Camptothecin 10µM 3 Std.11 8 Std.12 24 Std.

13 Actinomycin D 100nM 3 Std.14 8 Std.15 24 Std.

16 Etoposid 10 µM 3 Std.17 8 Std.18 24 Std

19 Wasserstoff- 3 Std.20 peroxid 100µM 8 Std.21 24 Std.

22 Nitroprussid- 3 Std.23 Natrium 1mM 8 Std.24 24 Std.

P Positivkontrolle(CVB3-infizierte HeLaZellen)

Ergebnisse 63

Ausgehend von diesen Vorversuchen wurden dann 2x106 Zellen in 3cm-Kulturschalen

ausgesät. Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium gewechselt und die Zellen für 3, 8 und

24 Stunden mit den Substanzen behandelt. Anschliessend wurden die Zellen geerntet, die

RNA isoliert und danach die RT-Reaktion durchgeführt. Mit einer PCR wurden unter

Verwendung Siva- und β-Actin-spezifischer Primer die Expression dieser Proteine in den

behandelten Zellen nachgewiesen (Abbildung 19).

Keine der zugegeben Sustanzen war in der Lage, die Expression von Siva zu induzieren. Die

Positivkontrolle (mit CVB3 infizierte Zellen) zeigt jedoch, dass mit diesem Versuch der

Nachweis von Siva-mRNA grundsätzlich möglich ist. Daraus lässt sich ableiten, dass die

Siva-Expression nicht durch Zugabe exogener Substanzen induziert wird. Sie stellt vielmehr

einen spezifischen, mit der CVB3-Infektion verbundenen Effekt dar.

Diskussion 64

4. Diskussion

4.1. Die Suche nach neuen Interaktionspartnern von Siva

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle des Wirtsproteins Siva bei der Infektion mit

Coxsackievirus B3 und den dadurch induzierten zellulären Prozessen näher untersucht. Der

zelluläre Transkriptionsapparat wird im Verlauf der Replikation von CVB3 ausser Funktion

gesetzt, um die verstärkte Synthese der Virusproteine zu ermöglichen (ETCHISON ET AL.

1982; CLARK ET AL. 1991, 1993). Die Expression von Siva hingegen nimmt zu (HENKE ET AL.

2000), was darauf hindeutet, dass Siva an der Regulation zellulärer Prozesse während der

Virusreplikation beteiligt ist.

Eine zentrale Rolle nahm in dieser Promotionsarbeit die Suche nach Proteinen ein, die mit

Siva interagieren und den Verlauf der CVB3-Infektion in den infizierten Zellen beeinflussen

können.

Bei der Aufklärung komplexer Ereignisse in einer Zelle, zum Beispiel auf dem Gebiet der

Signaltransduktion (PELECH 1996) oder des Programmierten Zelltods (WALLACH ET AL. 1998),

hat die Suche nach Interaktionspartnern vielfach wichtige neue Erkenntnisse zum Verstehen

komplexer Zusammenhänge oder Signal-Netzwerke ergeben. Wichtig zur Charakterisierung

neu entdeckter Proteine ist vor allem die Analyse von Protein-Protein-Interaktionen (FIELDS

1999). Das Zweihybrid-System in der Hefe Saccharomyces cerevisiae hat sich bei der

gezielten Suche nach Interaktionspartnern für ein Protein in der Vergangenheit vielfach

bewährt (PHIZICKI AND FIELDS 1995). Mittlerweile gibt es bereits einige mit Hilfe dieser

Methode erstellte Interaktionskarten, die auf genomischer Ebene in verschiedenen

Organismen die Interaktionen aller Proteine darzustellen versuchen (SCHWIKOWSKI ET AL.

2000, RAIN ET AL. 2001). Dadurch sind Rückschlüsse auf die Rolle der Proteine in zellulären

Netzwerken möglich. Wegen der Grösse und Kompexität solcher Experimente wurden bisher

vor allem kleinere Genome untersucht (LEGRAIN ET AL. 2001).

Das Zweihybrid-System hat im Vergleich mit anderen Methoden zur Analyse von Protein-

Interaktionen einige bedeutende Vorteile. Es ist eine sensitive, in vivo durchgeführte

Methode. S. cerevisiae als Modellsystem ist ein schnell wachsender und gut

transformierbarer Organismus. Weil nur wenige Arbeitsschritte notwendig sind, erlaubt das

Zweihybrid-System eine Analyse vieler Proteine zur gleichen Zeit (MUNDER AND HINNEN

1999). Da diese Methode auf der physikalischen Interaktion zweier Proteine beruht, ist es

auch möglich, einzelne Protein-Domänen zu untersuchen.

Arbeiten mit dem Zweihybrid-System haben jedoch einige Einschränkungen. Da die

Aktivierung des Reprotergens auf der Interaktion zweier Domänen eines

Diskussion 65

Transkriptionsfaktors beruht, können nur im Zellkern stattfindende Kontakte der zu testenden

Proteine nachgewiesen werden. Auch Interaktionen von zytoplasmatischen Proteinen

können das Reportergen aktivieren, wenn der Komplex in den Zellkern importiert wird. Durch

posttranslationale Modifikationen, bei denen Proteine in der Hefe anders modifiziert werden

als in Säugerzellen, können tatsächlich stattfindende Interaktionen mit dem Zweihybrid-

System unter Umständen nicht erkannt werden.

Ausserdem ist im Zweihybrid-System das Auftreten falsch positiver Interaktionen möglich,

zum Beispiel dann, wenn ein an die DNA-Bindedomäne von Gal4 fusioniertes Protein allein

an die Gal4-Erkennungssequenz im Promoter bindet und die Transkription des Reportergens

verursacht. Falsch positive Interaktionen können auch dann auftreten, wenn Domänen eines

Proteins interagieren, die im nativen Protein nicht auf der Aussenseite des Proteins lokalisiert

sind (FIELDS AND STERNGLANZ 1994). Befinden sich die interagierenden Proteine in der Zelle

in unterschiedlichen Kompartimenten, kann dies auch zu einer Fehlinterpretation der

Ergebnisse des Zweihybrid-Systems führen.

Um die Relevanz einer in einem Zweihybrid-Screening gefundenen Wechselwirkung zweier

Proteine zu prüfen, muss also in jedem Fall ein weiterer unabhängiger Bindungs-Test

durchgeführt werden. Anhand von bereits bekannten Daten über die Interaktionspartner

muss zudem die biologische Bedeutung geprüft werden.

Ein wichtiger Bestandteil dieser Doktorarbeit war die Suche nach neuen, bislang

unbekannten Interaktionspartnern von Siva. Dazu wurde mit Hilfe des Zweihybrid-Systems

eine kommerziell erhältliche cDNA-Bank aus humanem Herzgewebe gescreent. Das

Coxsackie B3-Virus ist kardiotrop, das heisst, es infiziert bevorzugt Zellen aus dem

Herzgewebe und repliziert sich in ihnen. Durch das Screenen einer Herz-cDNA-Bank sollten

Interaktionspartner von Siva gefunden werden, die sich an einem massgeblichen Ort der

Coxsackievirus-Infektion befinden. Durch diese neuen Interaktionspartner könnte sich unter

Umständen eine neue Erklärung für die Pathogenese der CV B3-Infektion, vor allem für den

zytopathischen Effekt, finden lassen. In dem Interaktionsscreening der Herz-cDNA-Bank mit

Siva als Köder wurden drei neue Proteine gefunden: PMP22, ein Membranprotein der

Peroxisomen, das herzmuskel-spezifische Protein Telethonin, das ein Bestandteil der

kontraktilen Einheiten in Cardiomyozyten ist, und die Untereinheit III der Cytochrom C-

Oxidase.

Peroxisomen sind Zellorganellen mit verschiedenen metabolischen Funktionen (VAN DEN

BOSCH ET AL. 1992, TERLECKY AND FRANSEN 2000). Sie enthalten Enzyme zur Synthese von

Wasserstoffperoxid (verschiedene Oxidasen) und Katalase, die in der Lage ist, das gebildete

Peroxid wieder abzubauen. Wasserstoffperoxid wird bei der β-Oxidation der Fettsäuren

Diskussion 66

benötigt, die ebenfalls in Peroxisomen stattfindet. In der Peroxisomen-Matrix werden

ausserdem Phospholipide und Sterole synthetisiert.

Das mit Siva interagierende Protein PMP22 enthält vier Transmembran-Domänen. Sie sind

über das gesamte Protein verteilt und befinden sich zwischen den Aminosäuren 36-55, 72-

93, 112-131 und 173-193. Lediglich der N-Terminus ragt aus der Peroxisomen-Membran

heraus. Die Aminosäuren 19-29 sind hydrophob und könnten ebenfalls an die Peroxisomen-

Membran assoziiert sein (KALDI ET AL. 1993; siehe Abbildung 20).

Abb. 20: Membran-Topologie des Peroxisomen-Proteins PMP22. Das Peroxisomen-Membranprotein PMP22 enthält vier Transmembrandomänen, die über das gesamte Protein verteilt sind. Eine kurze Region am N-Terminus (AS 19-29) ist wahrscheinlich auch an die Membran assoziiert. Die Zylinder verdeutlichen in die Peroxisomenmembran integrierte Bereiche von PMP22 mit hydrophoben Aminosäuren. (nach KALDI ET AL. 1993)

In diesem Bereich liegt auch das Fragment, das aus der Herz-cDNA-Bank isoliert wurde (AS

5-56). Das gesamte Protein wäre vermutlich nicht in einem Zweihybrid-Ansatz als

Interaktionspartner von Siva identifiziert worden, denn es enthält zwei Membran-

Lokalisierungssignale, mit deren Hilfe es posttranslational in die Peroxisomen-Membran

integriert wird. Sie entsprechen jedoch nicht den bisher bekannten Peroxisomen-

Lokalisierungssequenzen PTS1 und -2 (SUBRAMANI ET AL. 2001; Dr. Georg Lüers,

persönliche Mitteilung). PMP22 wird vor allem in den Organen Herz, Leber und Niere

exprimiert, im Unterschied zu den meisten anderen Peroxisomenmembranproteinen, deren

Expression keine Präferenz auf das Herzgewebe zeigt (Dr. G. Lüers, persönliche Mitteilung).

Eine Funktion dieses Proteins im Myokard als Bindungspartner von Siva während einer

CVB3-Infektion ist damit zumindest wahrscheinlich. Obwohl PMP22 eines der wichtigsten

Peroxisomen-Membranproteine darstellt, ist seine genaue Funktion nicht bekannt. Es wird

vermutet, dass es durch Porenbildung die Permeabilität der Peroxisomen-Membran reguliert

(VAN VELDHOVEN ET AL. 1987). Es wäre denkbar, dass die Bindung von Siva an PMP22 eine

NH2

COOH

! #"%$'& ( ) * +-,.0/21354

6-798!:<; =

Diskussion 67

Zellschädigung verursacht, möglicherweise weil durch die Interaktion die von PMP22

gebildeten Poren in der Peroxisomen-Membran geöffnet werden. Dadurch könnten

Bestandteile des Innenraumes der Peroxisomen (zum Beispiel Hydroperoxid) in das

Zytoplasma gelangen und dort als Initiatoren des programmierten Zelltodes wirken.

Oxidativer Stress ist vielfach als Auslöser der Apoptose beschrieben worden (HAMPTON AND

ORRENIUS 1997, SIMIZU ET AL. 1998). Sowohl exogene Zugabe von Wasserstoffperoxid als

auch von apoptose-stimulierenden Substanzen wie Camptothecin führte zum Anstieg der

zytoplasmatischen Konzentration an reaktiven Sauerstoff-Spezies und zur Aktivierung der

Caspase-3.

Da der Interaktion von Siva mit PMP22 eine Rolle in dem durch die Coxsackievirus B3-

Infektion verursachten zytopathischen Effekt zukommen könnte, wurde in einem

unabhängigen in vitro-Versuch diese Interaktion verifiziert (siehe Kapitel 3.4., Abbildung 15).

Durch den Einsatz verschiedener verkürzter Varianten von Siva konnte gezeigt werden, dass

für eine Bindung an PMP22 die Aminosäuren 53-61 von Siva unbedingt notwendig sind. Die

Bindungsregion ist damit auf dem N-Terminus von Siva lokalisiert, dem bisher keine explizite

Funktion zugewiesen ist. Diese Region fehlt der Splicevariante Siva-2, die nicht mit Bcl-2

interagieren und dessen antiapoptotische Wirkung aufheben kann (XUE ET AL. 2002).

Überexpression von Siva-2 verursacht anders als bei Siva-1 nicht den apoptotischen Tod der

transfizierten Zellen. Die Ursache hierfür könnte auch sein, dass PMP22 nicht mit Siva-2

interagieren kann, auf diese Weise die Integrität der Peroxisomen erhalten bleibt und es

nicht zu einer Induktion der Apoptose durch austretende Bestandteile der geschädigten

Peroxisomen kommt.

Die Überprüfung der Hypothese, ob eine Schädigung der Peroxisomen in vivo den mit einer

CVB3-Infektion verbundenen zytopathischen Effekt oder den apoptotischen Zelltod nach

Überexpression von Siva verursacht, ist schwierig. Es gibt kein experimentelles Modell für

eine Beeinträchtigung der Peroxisomen-Funktion und der damit verbundenen negativen

Folgen für die betroffene Zelle. Nur eine Hemmung einzelner peroxisomaler Enzyme durch

spezifische Inhibitoren ist möglich. Bei Überexpression eines GFP-gekoppelten PMP22 wird

die Bildung neuer Peroxisomen beeinträchtigt. Dies hat jedoch keinen Einfluss auf die

Vitalität der Zellen (Dr. G. Lüers, persönliche Mitteilung). Um indirekt den Einfluss reaktiver

Sauerstoff-Spezies oder des zellulären Redox-Potentials auf den durch eine transiente

Expression von Siva induzierten Zelltod zu prüfen, wurden die Siva-transfizierten Zellen mit

N-Acetylcystein oder Ascorbinsäure kultiviert. Die Gabe dieser Substanzen verbessert deren

Überlebensrate (siehe Kapitel 3.6.). Eine Beteiligung reaktiver Sauerstoff-Spezies an dem

durch die Siva-Expression verursachten Zelltod ist also wahrscheinlich.

Diskussion 68

Einen interessanten Rückschluss auf die Ursachen des CVB3-induzierten zytopathischen

Effektes erlaubt auch die Identifizierung des zweiten Siva-bindenden Proteins, Telethonin.

Telethonin, auch Titin-cap oder T-cap genannt (wegen seiner Eigenschaft, den N-Terminus

des Proteins Titin abzuschirmen; GREGORIO ET AL. 1998). Titin ist ein sehr grosses

elastisches Protein, das den Hauptbestandteil der kontraktilen Einheiten der

Herzmuskelzellen (Sarcomere) darstellt. Können Titin und Telethonin nicht interagieren, ist

die Kraftübertragung entlang der Sarcomere in den Myozyten nicht mehr möglich.

Abb. 21: Molekularer Aufbau eines Sarcomers.A: Dargestellt ist eine einzelne kontraktile Einheit mit A-Bande (dickes Myosin-Filament) und I-Bande (dünnes Actin-Filament). In der M-Line, die auch die Myosin-Stränge verankert, überlappen sich die C-Termini aneinanderhängender Titin-Moleküle. Die N-Termini von Titin sind in der Z-Disc verbunden. Dort befindet sich auch Telethonin oder T-cap, hier als blauer Punkt dargestellt. B: Position der kontraktilen Einheit in Relation zum gesamten Sarcomer und den anderen Zytoskelett-Proteinen in einer Herzmuskelzelle. (verändert aus GREGORIO ET AL. 1999, TOWBIN AND BOWLES 2002)

Die Sarcomere sind eine Organisationsform des Zytoskeletts, die nur in Skelett- und

Herzmuskelgewebe vorkommt (FAULKER ET AL. 2001). Sie sind aufgebaut aus geordneten

I-BandeA-Bande

I-Bande

A

B

Diskussion 69

dicken (Myosin) und dünnen Filamenten (Actin, Tropomyosin, Troponin), die bei den

Kontraktionen des Muskels aneinander vorbeigleiten. Das Ende der einzelnen Sarcomere

wird von der sogenannten Z-Disc gebildet, in welcher neben α-Actin, α-Actinin und Titin auch

Telethonin angeordnet ist. In der Z-Disc bindet Telethonin an den N-Terminus von Titin und

vermittelt die Multimerisierung von Titin in das folgende Sarcomer hinein (Abbildung 21).

Es ist durchaus möglich, dass das während einer CVB3-Infektion verstärkt exprimierte Siva

mit Telethonin interagiert, denn dessen Expression ist strikt auf das Herzmuskelgewebe

beschränkt. Eine Bindung von Siva an Telethonin könnte also wegen der Beeinträchtigung

der Funktion des Herzmuskels an der Ausprägung der Coxsackievirus-induzierten

Myocarditis beteiligt sein.

An verschiedenen Cardiomyopathien, sowohl durch eine Virusinfektion als auch durch

andere Faktoren verursacht, sind Zytoskelett- oder kontraktile Proteine der Herzmuskelzellen

beteiligt. Die Dilatative Cardiomyopathie wird fast immer durch eine verminderte

Transmission der Zugkräfte innerhalb einer einzelnen oder zwischen benachbarten

Muskelzellen verursacht. Ein Beispiel wurde bereits erwähnt: die Spaltung von Dystrophin

durch die virale Protease 2A der Enteroviren (BADORFF ET AL. 1999). Auch die Proteine Actin,

Desmin, Lamin, β-Myosin und Troponin T wurden mit der Pathogenese von

Cardiomyopathien in Verbindung gebracht (KAMISAGO ET AL. 2000, TOWBIN AND BOWLES,

2002).

Wie bereits ausgeführt wurde, ist es unwahrscheinlich, dass die in dem Zweihybrid-

Screening beobachtete Interaktion von Siva mit der Untereinheit III des Enzyms Cytochrom

C-Oxidase eine physiologische Bedeutung hat. Dieses Protein ist in intakten Zellen im

Inneren der Mitochondrien eingeschlossen und daher für eine Bindung mit Siva nicht

zugänglich. Dieses Protein wird (wie auch die Untereinheiten I und II der Cytochrom C-

Oxidase) von mitochondrialer DNA kodiert (CALHOUN ET AL. 1994).

Zwei weitere mit Siva interagierende Proteine wurden von der Arbeitsgruppe beschrieben,

die Siva entdeckt hat. Die Proteinkinase ARG (CAO ET AL. 2001) gehört zur Gruppe der c-

Abl-Tyrosinkinasen (KHARBANDA ET AL. 1995). ARG wie auch c-Abl spielen eine wichtige

Rolle bei der Induktion des Zelltods nach Einwirkung reaktiver Sauerstoff-Spezies (ITO ET AL.

2001, CAO ET AL. 2001). Die aktivierte ARG-Kinase phosphoryliert Siva-1, was zum

apoptotischen Tod der Zellen führt.

Siva interagiert auch mit dem antiapoptotischen Protein Bcl-2 (XUE ET AL. 2002). Dadurch

wird die protektive Wirkung von Bcl-2 aufgehoben, und es kommt zu einer für Apoptose

typischen Kondensation der nukleären DNA.

Diskussion 70

Ausserdem gibt es Hinweise darauf, dass Siva ein Substrat der Proteinkinase ROCK1 sein

könnte (Dr. M. F. Olson, persönliche Mitteilung). Diese Kinase wird durch die Caspase 3 im

Verlauf des apoptotischen Zelltods gespalten und dadurch aktiviert. Diese Aktivierung von

ROCK1 verursacht die Ausbildung von Actin-Stressfasern und dadurch eine Zellkontraktion,

was zum Auftreten der für die Apoptose typischen Membran-Ausstülpungen („blebs“) führt

(COLEMAN ET AL. 2001).

Nach wie vor ist die physiologische Funktion der Interaktion von Siva mit dem Rezeptor

CD27 ungeklärt. CD27 ist eigentlich ein kostimulatorisches Molekül der T- und B-Zellen, das

über Bindung der Adaptorproteine TRAF2 und -5 unter Einbeziehung des JNK-Kinaseweges

diese Zelle zusätzlich aktivieren kann (AKIBA ET AL. 1998, LENS ET AL. 1998, YAMAMOTO ET AL.

1998). Andere Rezeptoren aus der TNFR 2-Klasse wie 4-1BB vermitteln ebenso ein Signal

zum Überleben, ja sogar zu verstärkter Proliferation der Zielzellen (CANNONS ET AL. 2001).

Wichtig dabei ist die Interaktion des Rezeptors mit dem Adaptorprotein TRAF2, was die

Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB bewirkt (ARCH AND THOMPSON 1998). Das

ebenfalls zur TNF R2-Klasse gehörende Protein GITR kann spezifisch die T-Zell-Rezeptor-

induzierte Apoptose in Thymozyten und peripheren T-Zellen unterdrücken (NOCENTINI ET AL.

1997). TNF R2 selbst jedoch übermittelt hauptsächlich zytotoxische Signale (HELLER ET AL.

1992).

Die Bedingungen, unter denen das durch die Ligandbindung ausgelöste Signal entweder in

Richtung Apoptose oder in Richtung Überleben/Proliferation gelenkt wird, sind bisher kaum

untersucht worden. Im Falle des p75-TNF-Rezeptors (Typ 2) spielt dabei möglicherweise die

Koligation von TNF-Rezptor 1 durch den trimeren Liganden TNF eine Rolle, von dem sowohl

Typ 1- als auch Typ 2-Rezeptoren gebunden und so auch TNF-Rezeptor 1 komplexiert und

aktiviert werden können (GRELL ET AL. 1999). Die Sequenzen der intrazellulären Domänen

von CD27, 4-1BB und GITR weisen eine hohe Homologie auf. Sie bilden möglicherweise

eine Subgruppe innerhalb der TNF R2-Familie, die eher für das Übermitteln von Überlebens-

Signalen verantwortlich ist (NOCENTINI ET AL. 1997).

Auch unterschiedliche Affinitäten für die jeweiligen TRAF-Proteine TRAF1-3 und 5 könnten

diese Unterschiede in den Rezeptor-induzierten Effekten bedingen (LENS ET AL. 1998).

Möglicherweise fungiert Siva als Adaptorprotein, das bei der Bindung an CD27 den

hauptsächlich von TRAF2 initiierten und zur Stimulation der Zelle führenden Signalweg

unterbricht und statt dessen ein proapoptotisches Signal auslöst. Unter Umständen

verdrängt es TRAF2 vom intrazellulären Teil von CD27. Vielleicht funktioniert Siva auf diese

Weise auch in Cardiomyozyten, die vermutlich selbst kein CD27 exprimieren, aber eventuell

andere Mitglieder der TNF R2-Klasse und verschiedene TRAF-Proteine. Zur Überprüfung

dieser Hypothese müssten weitere Versuche unternommen werden, um die Rolle von

Diskussion 71

TRAF2 (oder der anderen in diesem Zusammenhang wichtigen TRAFs 1, 3, 5 und 6)

aufzuklären.

4.2. Analyse der Primärstruktur und Konsequenzen für die Funktion von Siva

Siva ist ein relativ kleines Protein (189 AS, 20 kDa). Es weist keine deutliche Homologie zu

anderen, bereits bekannten Proteinen auf. Dadurch ist ein Rückschluss auf die zellulären

Funktionen von Siva zunächst nicht möglich. Bereits die Veröffentlichung der Aminosäure-

Sequenz von Siva (PRASAD ET AL. 1997) zeigte, dass dieses Protein im Verhältnis zur

Gesamtzahl einen sehr grossen Anteil der Aminosäuren Cystein (17 von 189 Aminosäuren)

und Histidin aufweist. Der gesamte Anteil an Cystein und Histidin beträgt mehr als 10%. In

diesem Artikel wurde eine Homologie des C-Terminus von Siva zu B-Box- und Zinkfinger-

Domänen vorgeschlagen, die jeweils mehrere Cystein- bzw. Histidinreste enthalten. Es

wurde festgestellt, dass in der B-Box-Region von Siva im Gegensatz zu der Konsensus-

Sequenz für die B-Box (REDDY AND ETKIN 1991) kein Histidin vorkommt. Durch

Aminosäuresequenz-Vergleiche mit bekannten Proteinen wurde deutlich, dass das Siva-

Molekül im mittleren Abschnitt eine gewisse Homologie mit den Death Domain-Proteinen

FADD und RIP aufweist. Dem N-Terminus von Siva wurde keine Funktion zugeordnet.

Zwei Jahre später wurde ein zu Siva homologes Protein aus der Maus isoliert, das zu 70%

identische Aminosäuren aufweist (YOON ET AL. 1999). Durch alternatives Splicing kann das

Exon 2 von Maus-Siva deletiert werden, und es entsteht ein um 65 Aminosäuren verkürztes

Protein, genannt Siva-2 (im Gegensatz zu Siva-1, dem Gesamtprotein). Exon 2 umfasst ein

Stück des N-Terminus und die Aminosäuren 61-118 der Death Domain-homologen Region.

Im Gegensatz zu Siva-1 kann die Splicevariante Siva-2 bei Überexpression in Säugerzellen

keine Apoptose induzieren. Dies wurde auf das Fehlen der von Exon 2 kodierten

Aminosäuren zurückgeführt. Vor kurzem wurde gezeigt, dass Siva-1 in vitro und in vivo mit

dem antiapoptotischen Protein Bcl-2 interagiert, Siva-2 hingegen nicht (XUE ET AL. 2002).

Durch diese Interaktion wird der Schutz von Bcl-2 vor einem durch UV-Bestrahlung

induzierten Zelltod aufgehoben. Mit Hilfe eines Programms zur Berechnung der räumlichen

Struktur wurde aus der Aminosäuresequenz vorhergesagt, dass die Region 50-69 eine

amphipatische Helix bilden könnte. Diese helikale Struktur interagiert mit dem in der

äusseren Mitochondrien-Membran lokalisierten Bcl-2 und macht diese möglicherweise

permeabel für Cytochrom C oder andere Initiatoren des mitochondrialen Zelltods. Die

Strukturvorhersage für die helikale Region wurde jedoch nicht durch weitere Untersuchungen

(Röntgen- oder NMR-Strukturbestimmungen) bestätigt. Durch diese Publikation wird auch

gezeigt, dass Siva keine sogenannte Death Domain enthält, wie bei der Entdeckung des

Proteins (PRASAD ET AL. 1997) ursprünglich vorgeschlagen wurde. Die Death Domain ist ein

Strukturelement, das bei vielen in der Apoptose wichtigen Adaptorproteinen vorkommt.

Diskussion 72

Bisher wurden die Strukturen einiger Proteine mit Death Domain bestimmt, unter anderem

von FADD (JEONG ET AL. 1999) und TNF-Rezeptor 1 (TELLIEZ ET AL. 2000). Alle diese

Strukturen zeigen eine dichte Folge von insgesamt sechs kurzen Helices. In der

Veröffentlichung von XUE ET AL. wird jedoch nur ein längerer helikaler Abschnitt benannt. Von

uns wurde ebenfalls versucht, aus der Aminosäure-Sequenz von Siva mit Hilfe mehrerer

Programme Struktur-Vorhersagen zu treffen. Dabei wurde von allen Programmen eine

längere Helix in der N-terminalen Hälfte von Siva vorhergesagt. Dies stimmt mit den

Ergebnissen von XUE ET AL. überein.

Oftmals lassen sich über Verwandtschaftsbeziehungen mit einem bekannten Protein

Rückschlüsse auf die Funktion eines nicht charakterisierten Proteins ziehen. Deshalb wurde

versucht, in der Internet-Sequenzdatenbank BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)

Proteine mit einer zu Siva homologen Aminosäuresequenz zu finden. Die Suche mit der

Sequenz von Siva-1 ergab kein sinnvolles Resultat, es wurden viele sehr kurze, nur in

wenigen Aminosäuren annähernd übereinstimmende Bereiche anderer Proteine

ausgegeben. Die Suche mit dem cysteinreichen C-Terminus (AS 128-189) ergab ein

einziges Resultat: das Protein BARD-1 (siehe Abbildung 22a).

Der N-Terminus von BARD-1 (Aminosäuren 46-90) enthält einen RING-Finger (WU ET AL.

1996), ein Zink-bindendes Strukturelement (Borden 2000). Mittels ihrer RING-Finger

interagieren BARD-1 und das Tumorsuppressorprotein BRCA1. Dieses Heterodimer fungiert

als Ubiquitin E3-Ligase, das heisst, es vermittelt als Coenzym den letzten Schritt der

enzymatischen Ubiquitinierungsreaktion. Mit dieser Ubiquitinierung erhalten Proteine eine

Zielsequenz für das 26S-Proteasom, in dem sie vollständig degradiert werden (JOAZEIRO AND

WEISSMAN 2000).

Eine weitergehende, von uns durchgeführte Analyse der Aminosäure-Sequenz von Siva

ergab zudem, dass die meisten der im C-Terminus konzentrierten Cysteine nach dem

Schema CxxC angeordnet sind (x steht hier für eine beliebige Aminosäure). Diese Cystein-

Paarung ist charakteristisch für Proteine, die Zink-Ionen koordinieren können (SCHWABE AND

KLUG 1994). Ausserdem befinden sich über das ganze Siva-Molekül verteilt weitere einzelne

Cystein- und Histidinreste (siehe Abbildung 10). Histidin ist auch in anderen Zink-bindenden

Proteindomänen enthalten (BORDEN 2000). Weiterhin wurde durch eine Literatursuche nach

cysteinreichen Domänen bzw. Zink-bindenden Proteinen drei weitere Proteine identifiziert,

deren Aminosäure-Sequenzen eine Homologie mit dem C-Terminus von Siva aufweisen:

Paxillin, MLLT6 und Not4 (siehe Abbildung 22b).

Diskussion 73

Abb. 22: Suche nach Proteinen mit Homologie zum C-Terminus von Siva.A: Resultat der Homologiesuche in der BLAST-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Es wurde nur ein Protein gefunden, BARD-1, dessen N-Terminus eine RING-Finger-Domäne enthält. B: Beim Vergleich der Sequenz von Siva mit Not4 und MLLT6 ergaben sich sehr gute Übereinstimmungen. Über die Funktion der beiden Proteine ist nicht viel bekannt. Die Sequenzvergleiche wurden mit dem Internet-Programm Multalin erstellt (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html).

Paxillin enthält als Zink-bindende Formationen mehrere LIM-Domänen, die hauptsächlich als

Adaptormodule zur Bindung an andere Proteine fungieren (DAWID ET AL. 1998). Die

Aminosäuren 7-53 von MLLT6 bilden eine LAP-Domäne, eine Variation der Zinkfinger-

Struktur. Die LAP-Domäne ist zur Bindung an doppelsträngige DNA befähigt (SAHA ET AL.

1995). Das Protein Not4, ein Regulator der Transkription der RNA-Polymerase II, ist das

einzige RING-Finger-Protein, das ausschliesslich über Cysteinreste zur Komplexierung der

zwei Zink-Ionen verfügt (HANZAWA ET AL. 2001).

Diese zum C-Terminus von Siva homologen Proteine haben sehr unterschiedliche

Funktionen. Ein Rückschluss auf die Eigenschaften von Siva ist daher nur sehr begrenzt

möglich. Immerhin wurde mit Not4 ein Protein identifiziert, das zwei Zink-Ionen

ausschliesslich über Cystein-Reste koordiniert, ebenso wie dies im C-Terminus von Siva der

Fall ist (siehe hierzu Kapitel 3.5.).

Aufgrund dieser Überlegungen wurden in die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche

zusätzlich zwei Varianten des Proteins Siva-1 einbezogen. Mit Hilfe einer PCR-Ligations-

Amplifikationsstrategie wurde das verkürzte Protein Siva-2 kloniert. In der zweiten Siva-

Mutante wurde der gesamte C-terminale Bereich entfernt, der die gepaarten Cysteine enthält

(AS 128-189). Für den in vitro-Bindungstest wurden neben einigen kurzen an GST

A

B

Diskussion 74

fusionierten Stücken von Siva die Fusionsproteine MBP-Siva-1(Plasmid MN25) und -Siva-2

(MN44) sowie die ∆ C-Terminus-Variante (MN47) eingesetzt. Sowohl Siva-1 als auch Siva-2

interagierten mit dem Capsidprotein VP2 von Coxsackievirus B3, das um den C-Terminus

verkürzte Fragment jedoch nicht.

Um die Bedeutung der Häufung von Cystein- und Histidinresten in Siva, insbesondere der

am C-Terminus lokalisierten Cystein-Paare, näher zu untersuchen, wurde mit Hilfe eines

kolorimetrischen Tests die Anzahl der je Molekül gebundenen Zink-Ionen bestimmt. Die

Auswertung des Zink-Bindungsversuches ergab, dass der Cystein-reiche C-Terminus von

Siva zwei Zink-Ionen kordiniert. Durch die Deletion der Aminosäuren 54-117 in Siva-2 wird

der Bindungsort für ein weiteres Zink-Ion entfernt. Das Ergebnis dieses Versuches deutet auf

eine relativ komplizierte räumliche Struktur von Siva hin. Die ersten Versuche zur Reinigung

von Siva aus E. coli schlugen fehl, weil die Ausbeute an löslichem Protein sehr gering war.

Statt dessen wurde das exprimierte, aber nicht korrekt gefaltete Siva in „inclusion bodies“

deponiert (Dr. P. Hortschansky, persönliche Mitteilung). Auch traten bei der Reinigung von

Siva nach kurzer Zeit ungerichtete Multimere auf, die durch ein SDS-Gel nachgewiesen

wurden. Bei Zugabe reduzierender Substanzen lösten sich diese Komplexe wieder auf. Für

die posttranslationale Faltung eines nativen Polyproteins mit Zink-Koordinierungsstellen ist

das Vorhandensein von Zink notwendig, um die natürliche Konformation auszubilden (BERG

AND GODWIN 1997, COX AND MCLENDON 2000). Es scheint daher unwahrscheinlich, dass

allein aus der Aminosäure-Sequenz für Zink-bindende Proteine eine gute Strukturvorhersage

abgeleitet werden kann. Aus diesem Grund müssen die Ergebnisse von Xue et al. (2002) mit

Vorbehalt betrachtet werden.

Der beste Weg, diesen Widerspruch aufzulösen, ist die Aufklärung der Struktur von Siva mit

Hilfe von Röntgenbeugungs- oder NMR-Methoden. Die zweite Methode ist jedoch nur für

kleine Moleküle bis ca. 20 kDa anwendbar (Dr. M. Görlach, persönliche Mitteilung). Um die

Struktur von Siva mit Hilfe von Röntgenmethoden zu untersuchen, wurde bereits von Dr. P.

Hortschansky eine grössere Menge MBP-Siva in E.coli RV308 exprimiert und mit

Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt. In der Abteilung Strukturbiologie und

Kristallographie des Instituts für Molekulare Biotechnologie wurden erste Versuche zur

Kristallisation von MBP-Siva begonnen. Die Struktur des Maltose-bindenden Proteins wurde

aufgeklärt (SPURLINO ET AL. 1991), ebenso wie die Struktur eines MBP-Fusionsproteins

(KOBE ET AL. 1999). Es sollte also möglich sein, die Struktur-Anteile von MBP und Siva zu

unterscheiden und eine gute Strukturbestimmung für Siva zu erhalten.

Auch bei der Untersuchung der Eigenschaften von Siva und der Mutanten Siva-2 und ∆ C-

Terminus wurden Unterschiede festgestellt. Das letztgenannte Protein bindet als einziges

nicht an das Capsidprotein VP2 des CVB3. Ausserdem ist Siva-1 als einzige Variante dieses

Diskussion 75

Moleküls in der Lage, bei Überexpression in Zellkultur den Tod der transfizierten Zellen zu

induzieren. In diesem Versuch (siehe Kapitel 3.6.) wurde zusätzlich eine Variante von Siva-1

getestet, die mit Hilfe einer an den N-Terminus fusionierten Membranlokalisierungssequenz

(das N-Mystoylierungsmotiv der Proteinkinase c-src) in die Zellmembran eingebaut wurde.

Siva mit dieser Lokalisierungssequenz verursachte im Gegensatz zu Siva-1 in geringerem

Umfang den Tod der Zellen. Das bedeutet, dass Siva in Verbindung mit anderen, vermutlich

zytoplasmatischen, Faktoren den Tod der Zellen bewirkt.

Zur physiologischen Rolle des alternativen Splicens der mRNA von Siva, in dessen Ergebnis

das komplette Protein Siva-1 und die um das Exon 2 verkürzte Variante entstehen können,

ist bisher nichts bekannt. Nachgewiesen wurde das Auftreten einer kürzeren für Siva

kodierenden mRNA durch eine RT-PCR mit Proben aus einer B-Zell-Linie und vier

embryonalen Stammzell-Linien der Maus (YOON ET AL. 1999). Sowohl Siva-1 als auch Siva-2

können an den zytoplasmatischen Teil von CD27 binden. Die gewebespezifische Expression

von Siva-2 oder das Vorhandensein von Siva-2-Protein unter normalen Bedingungen in vivo

wurde nicht untersucht. Lediglich in drei transformierten Zelllinien wurde mittels Western Blot

das Auftreten der verkürzten Isoform nachgewiesen.

Durch die Infektion mit CVB3 wird die Expression von Siva in infiziertem Herzgewebe und

auch in Zellinien induziert. Bei dem Nachweis von Siva mit RT-PCR in Coxsackievirus-

infiziertem Herzgewebe aus der Maus wurde bisher ausschliesslich das 570bp grosse

Transkript von Siva-1 gefunden, ein kürzeres Transkript konnte nicht nachgewiesen werden

(Dr. A. Henke, persönliche Mitteilung).

4.3. Ereignisse in den Wirtszellen bei einer Coxsackievirus B3-Infektion

Die bei einer Infektion mit Coxsackievirus B3 auftretenden pathophysiologischen

Veränderungen im Organismus sind ausgiebig untersucht worden. Während der

Virusreplikation kommt es zu massiven Zellschädigungen in Myokard und Pankreas. Eine

grosse Zahl immunkompetenter T-Zellen infiltriert das betroffene Herzmuskelgewebe. Die

terminal differenzierten Myozyten sterben im Verlauf dieses Prozesses ab und können nicht

ersetzt werden. Es kommt zur Ablagerung von Bindegewebe in den betroffenen

Gewebearealen (Fibrose). Klinisch entsteht das Bild einer Myokarditis. In ca. 70% aller Fälle

verheilt das Myokardgewebe ohne Restsymptome, bei 10% der Patienten entsteht eine

progressive Herzinsuffizienz, die zumeist in eine Herztransplantation mündet. In seltenen

Fällen kommt es zu einem fulminanten Verlauf der Virusinfektion, die besonders bei

Säuglingen und schwangeren Frauen zum Tod führen kann.

Diskussion 76

Mit verschiedenen biochemischen und molekulargenetischen Methoden wurde versucht, die

durch eine CVB3-Infektion ausgelösten zellulären Vorgänge aufzuklären und so die

molekularen Grundlagen der durch die Virusinfektion hervorgerufenen Zell- und

Organschädigungen zu finden. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf Prozesse gelegt,

die den Verlauf der Infektion günstig für die Wirtszelle gestalten, wenn zum Beispiel die

Virus-Replikationsrate herabgesetzt oder die entstehenden Zellschädigungen reduziert

werden konnten. Im Folgenden werden einige dieser Untersuchungen zur Rolle von

Wirtsproteinen kurz geschildert.

Die Untersuchung der genetischen Anwort im Wirtsorganismus während einer CVB3-

Infektion mit Hilfe von DNA-Mikroarrays brachte wichtige Erkenntnisse über die in dem

infizierten Gewebe ablaufenden Prozesse. Die komplexe Natur dieser Vorgänge wurde

durch Analyse der unterschiedlichen Genexpressionsmuster im Herzgewebe virusinfizierter

Mäuse im Vergleich zu normalen Tieren untersucht (TAYLOR ET AL. 2000). Für die

Hybridisierung der Arrays wurden Proben von verschiedenen Zeitpunkten (Tag 3, 9 und 30)

nach der Infektion mit Coxsackievirus B3 eingesetzt. Am Tag 3 und Tag 9 ist virale RNA im

Myokard infizierter Tiere mittels RT-PCR nachweisbar, an Tag 30 jedoch nicht mehr.

Insgesamt wurden 169 Gene gefunden, deren Expression im Verlauf des untersuchten

Zeitraums signifikant mindestens 2,5fache Veränderung gegenüber der zeigten. Für die

Auswertung wurden jedoch nur 69 Gene ausgewählt, die zu allen drei Zeitpunkten

Veränderungen zeigten. Diese wurden nach ihrer zellulären Funktion innerhalb der Wirtszelle

zusammengefasst. In diesem Versuch wurden unter anderem differentiell exprimierte

mitochondriale, fibroblastische, Zytoskelett- und Immunzell-Proteine gefunden. Die Infektion

mit CVB3 verursacht also vielfältige Veränderungen im Genexpressionsmuster. Die

unterschiedlich starke Expression von Siva wurde nicht nachgewiesen. Dies könnte auf die

Bedingungen zurückzuführen sein, unter denen die zum Spotten auf die Arrays verwendeten

Klone der Genbank aus dem Herzgewebe der Ratten gewonnen wurden. Siva war

möglicherweise nicht unter den ca. 7000 Klonen mit etwa 4200 verschiedenen für das

Experiment eingesetzten Genen. Ausserdem wurden in diesem Versuch zur Hybridisierung

der Ratten-cDNA enthaltenden Arrays Proben aus CVB3-infizierten Mäusen eingesetzt.

In weiteren Versuchen wurde gezielt die Rolle einzelner differentiell exprimierter Proteine

untersucht.

Das Apoptose-Regulatorprotein Nip21 wird bei einer Coxsackievirus-induzierten Myokarditis

verstärkt exprimiert. Werden Zellen mit einem Nip21-Expressionsplasmid transfiziert und

dann mit CVB3 infiziert, erhöht sich die Caspase-3-Aktivität deutlich, und es kommt zu einem

verstärkten Tod infizierter Zellen (ZHANG ET AL. 2002). Ausserdem wird die Replikation von

Diskussion 77

CVB3 durch die Nip21-Expression behindert. Durch Nip21 erfolgt also eine Sensibilisierung

der Wirtszellen, die durch ihr Absterben eine schnelle Ausbreitung des Virus verhindern.

Das Protein Bag-1 besitzt anti-apoptotische Eigenschaften. Es bindet an Bcl-2 und

unterstützt dessen stabilisierende Wirkung auf die Mitochondrien (TAKAYAMA ET AL. 1995).

Mit einem mRNA-Differential Display wurde festgestellt, dass die Expressionsrate von Bag-1

im Verlauf einer Coxsackievirus-Infektion in Mäuseherzen deutlich sinkt (PENG ET AL. 2001).

Zudem wird das zurückbleibende Bag-1-Protein proteolytisch gespalten und inaktiviert.

Im Zusammenhang mit der Untersuchung von Faktoren im Wirtsorganismus, die eine

Coxsackievirus-Infektion negativ beeinflussen und für den Wirt eine bessere Prognose

bieten, wurden auch einige Proteinkinasen einbezogen. Die Tyrosin-Kinase p56lck gehört zu

der Gruppe der src-homologen Proteinkinasen. Mitglieder dieser Proteinklasse spielen eine

wichtige Rolle bei der Aktivierung von peripheren T-Lymphozyten. Bei einer CVB3-Infektion

von p56lck Knockout-Mäusen tritt in vivo überhaupt keine Myokarditis auf, und die

Überlebensrate der p56lck -/--Mäuse ist signifikant besser als die der Wildtyp-Mäuse (LIU ET AL.

2000). Durch das Ausschalten der lck-Kinase wird die Rate der Virusreplikation, vor allem im

Herzen, deutlich herabgesetzt. Für den protektiven Effekt des p56lck-Knockouts ist neben der

Unterdrückung der Virusreplikation vermutlich auch die Verhinderung einer

Autoimmunantwort gegen kardiale Antigene verantwortlich, die normalerweise eine

Coxsackievirus-Infektion begleiten.

Auch die Rolle der Tyrosinkinase ERK-1/2 bei der Induktion der CVB3-induzierten

Myokarditis wurde in diesem Zusammenhang untersucht. Kontakt mit dem Virus induziert

innerhalb von 5 Minuten die Aktivität der ERK-Kinasen in Jurkat-Zellen (LUO ET AL.

2002; OPAVSKY ET AL. 2002). Hierfür ist die Aktivität von p56lck nötig (siehe oben), die ERK-

Kinasen werden also über p56lck aktiviert. Bei Inhibierung des ERK-Signalweges mit dem

Inhibitor PD98059 sinkt die Replikationsrate in den infizierten Jurkat-Zellen. Auch in den

Herzen Coxsackievirus-infizierter Mäuse wurde eine Aktivierung von ERK-1/2 beobachtet.

4.4. Pathologische Prozesse mit Beteiligung von Siva

Siva ist ein pro-apoptotisches Protein. Seine Überexpression in kultivierten Säugerzellen

führt zum programmierten Zelltod (PRASAD ET AL. 1997; CAO ET AL. 2001). Während einer

CVB3-Infektion wird die Transkription des Siva-Gens induziert. In den Herzen virusinfizierter

Mäuse wurde Siva immunhistologisch nachgewiesen (HENKE ET AL. 2000). Andererseits wird

im Verlauf der Virusreplikation in den infizierten Zellen die Translation zellulärer Proteine

unterbunden, wahrscheinlich um die Synthese viraler Proteine zu begünstigen. Durch die

Replikation des Virus werden die infizierten Zellen schliesslich in die Apoptose gezwungen

(HENKE ET AL. 2000, 2001). Auch im Myokardgewebe von Patienten mit Dilatativer

Cardiomyopathie wurden apoptotische Prozesse nachgewiesen (OLIVETTI ET AL. 1997). Wie

Diskussion 78

im Rahmen dieser Arbeit gezeigt wurde, konnte bei der Stimulierung von HeLa-Zellen mit

unspezifischen Apoptose-auslösenden Substanzen keine Induktion der Siva-Expression

nachgewiesen werden. Die Induktion der Siva-Proteins gehört wahrscheinlich zur Strategie

des Virus, seine Replikation in den infizierten Zellen zu maskieren und sich so dem Angriff

des Immunsystems zu entziehen.

Die Bedeutung der Expression des Wirtsproteins Siva in der Pathogenese der CVB3-

Infektion wurde von unserer Arbeitsgruppe schon in einigen Veröffentlichungen dargestellt

(HENKE ET AL. 2000, 2001). Hierzu wurde ein Mausmodell eingesetzt, um die Vorgänge

während der Virusinfektion im gesamten Organismus sowie in ausgewählten Organen

darstellen zu können. Mit einer RT-PCR wurden Coxsackievirus B3 und die mRNA von Siva

im Blut sowie den hauptsächlich durch das Virus geschädigten Organen Herz und Pankreas

nachgewiesen. Immunhistologische Untersuchungen haben zudem die Anwesenheit von

Siva, CD27 und dessen Ligand CD70 in diesen Organen gezeigt (HENKE ET AL. 2000; SEKO

ET AL. 2001). Das Auftreten apoptotischer Zellen wurde durch eine DNA-

Strangbruchmarkierung mit Hilfe des TUNEL-Assay und einen histologischen Nachweis der

aktiven Caspase-3 sichtbar gemacht. Somit wurde das Vorhandensein wichtiger in dieser

Promotionsarbeit untersuchter Proteine in den betroffenen Gewebearealen nachweisen.

Auch andere Arbeitsgruppen haben die mit einer Coxsackievirus B3-Infektion verbundenen

zellulären Effekte untersucht. Bei der Infektion von HeLa-Zellen in Zellkultur wurde ebenfalls

eine Aktivierung von Caspase 3 beobachtet (CARTHY ET AL. 1998), ausserdem die Spaltung

des Transkriptions-Initiationsfaktors eIF4G. Zudem wurden in virusinfizierten Zellen die

Caspase 3-Substrate Poly ADP Ribose-Poymerase (PARP) und DNA Fragmentation Factor

(DFF) nachgewiesen.

Auch während einiger anderer pathologischer zellulärer Prozesse wird die Expression von

Siva induziert. Mit Hilfe eines differentiellen cDNA-Bankscreenings wurde gezeigt, dass eine

operativ herbeigeführte Ischämie in den Nieren von Ratten zu einer verstärkten Expression

von Siva führt. Diese erreicht 12 Stunden nach Beginn der Ischämie ihren Höhepunkt

(PADANILAM ET AL. 1998). Siva-positive Zellen in den ischämischen Nieren wiesen ausserdem

apoptotische DNA-Strangbrüche auf.

In anderen experimentell induzierten apoptotischen Prozessen wurde ebenfalls eine

verstärkte Expression von Siva nachgewiesen, so zum Beispiel in einer mit TGF-β

stimulierten Prostatakarzinomzelllinie (LIN AND YING 1999), in einer humanen Darmkrebs-

Zelllinie (OKUNO ET AL. 2001) oder in einer Cisplatin-behandelten Hepatom-Zelllinie (QIN ET

AL. 2002). Ausserdem wurde die Abhängigkeit der Siva-Expression von der Aktivität des

transkriptionellen Kofaktors TIP30 gezeigt, der an das Tat-Protein des HIV-Virus binden kann

Diskussion 79

(XIAO ET AL. 2000). In den beiden letztgenannten Veröffentlichungen wurde die differentielle

Expression von Siva unter Verwendung der Atlas-Filter der Firma Clontech nachgewiesen.

(zwei dieser Filter enthalten die cDNA von Siva, die Filter mit Bezug zu Apoptose und

Krebs). In diesen Versuchen mit cDNA-Arrays wurde lediglich die unterschiedlich starke

Expression bei verschiedenen Versuchsbedingungen registriert. Rückschlüsse auf die

zelluläre Funktion oder die Rolle von Siva an den untersuchten Prozessen sind auf diesem

Weg nicht möglich.

4.5. Modell für die Einbettung von Siva in zelluläre Prozesse während einer CVB3-

Infektion

Zum Abschluss der Diskussion der Ergebnisse dieser Arbeit soll versucht werden, die

gewonnenen Erkenntnisse in einem Modell zusammenzufassen. Dabei wird sowohl auf die

Erkenntnisse über neue Bindungspartner als auch auf die Konsequenzen dieser

Interaktionen im zellulären Kontext eingegangen.

In Abbildung 23 sind die Ergebnisse der Aminosäure-Analyse und die identifizierten

Bindungspartner gezeigt. Da über die räumliche Struktur von Siva bisher keine genauen

Daten existieren, wurde eine offene Darstellung gewählt. Siva interagiert mit dem

Capsidprotein VP2 von Coxsackievirus B3, wozu zumindest die Aminosäuren 128-136 nötig

sind. Ausserdem bindet Siva im Bereich der Aminosäuren 53-61 an das Protein PMP22. Die

Primärstruktur von Siva enthält verhältnismässig viele Cystein- und Histidinreste, die meisten

der Cysteine sind paarweise im C-Terminus des Proteins angeordnet. Mit Hilfe dieser

Aminosäuren bindet Siva insgesamt drei Zink-Ionen. Eines ist im N-Terminus des Proteins

lokalisiert, die zwei anderen werden vom cysteinreichen C-Terminus gebunden.

Abb. 23: Interaktionen von Siva.Dargestellt sind Bindungspartner, die im Rahmen dieser Dissertation untersucht wurden, sowie deren Lokalisation innerhalb des Proteins. Siva enthält eine Vielzahl von zum Teil gepaarten Cystein- und Histidinresten, an die insgesamt drei Zink-Ionen binden können. Zwei der Ionen binden am C-Terminus, ein weiteres im vorderen Teil des Moleküls. Siva interagiert mit den Proteinen CD27, PMP22 und VP2, deren Bindungsorte innerhalb des Moleküls gezeigt sind. Eingetragen sind ausserdem die Interaktion von Siva mit Bcl-2 im Bereich der helikalen Region (Xue et al. 2002) und die Phosphorylierung des Tyrosinrestes an Position 48 durch die Proteinkinase ARG (CAO ET AL. 2001).

CD27

Zn2+ Zn2+

VP2

Zn2+

N-Terminus Helikale Region

B-Box Zn-Finger

> > > > > > > > > > > >? ? ? ? ? ?? ? ? ?@ @ @ @PMP22

Siva

Bcl-2

A AP

A AP

ARG

Diskussion 80

In Abbildung 24 wird auf die Funktion des Rezeptors CD27 eingegangen. Durch die Bindung

seines Liganden CD70 werden die Adaptorproteine TRAF2 und -5 an den intrazellulären Teil

von CD27 gebracht, was wiederum die Aktivierung des JNK-Kinaseweges und die Induktion

des Transkriptionsfaktors NF-κB zur Folge hat. Beide Signalwege sind für eine Kostimulation

der Zielzellen von Bedeutung. CD27 kann aber auch mit Siva assoziieren, wodurch ein

entgegengesetzter Effekt erreicht wird: durch die Aktivierung der Caspase-3 kommt es zur

Induktion des programmierten Zelltodes.

Abb. 24: Durch den Rezeptor CD27 übermittelte zelluläre Signalereignisse.Durch Bindung des Liganden CD70 kann eine kostimulatorische Signalkaskade initiiert werden, die über das Adaptorprotein TRAF2 und die Kinase NIK den JNK- und NF-κB-Signalweg stimuliert (linke Seite). Die Assoziation von Siva mit CD27 hingegen führt zu Aktivierung der Caspase-3 und Apoptose (rechte Seite).

Die Infektion einer Zelle mit Coxsackievirus B3 führt in der Regel zu deren apoptotischem

Zelltod (Abbildung 25). Im Verlauf der Virusreplikation wird die Expression von Siva deutlich

verstärkt. Siva kann an CD27 binden; ob jedoch diese Interaktion den Verlauf der

Virusinfektion beeinflusst, ist nicht geklärt. Der Ausgangspunkt für die Untersuchungen im

Rahmen dieser Arbeit war die Bindung von Siva an das Hüllprotein VP2 von Coxsackievirus

B3, das während der Replikation des Virus im Zytoplasma gebildet wird. Im Herzgewebe

CVB3-infizierter Mäuse wurden gleichzeitig das Auftreten von CD27, CD70, apoptotischen

DNA-Strangbrüchen und aktivierter Caspase-3 nachgewiesen.

CD27 CD70

Transkription

TRAF2/5

NIKKinase

NIKKinaseKinase

JNK

Kinase

JNK

KinaseKinase

IKKKinase

IKKKinaseKinase

I-κκB

PP PP

. . .

κκBNF κκBκκBNF

Kostimulation

Siva

Aktivierung derCaspase-3

Apoptose

Diskussion 81

Abb. 25: Modell der zellulären Ereignisse bei einer Infektion mit Coxsackievirus B3. Zelluläre Ereignisse während der Infektion mit Coxsackievirus B3, die in dieser Arbeit untersucht wurden. Der durch das Virus verursachten zytopathische Effekt kann möglicherweise durch die Interaktion von Siva mit Telethonin (im Sarcomer) oder mit dem Peroxisomen-Protein PMP22 erklärt werden. Weitere Einzelheiten im Text.

Die Frage, auf welchem Wege die Aktivierung der Effektor-Caspase-3 stattfindet, ist zur Zeit

noch nicht geklärt. Denkbar wären sowohl eine Aktivierung über den „Death Receptor“-

Signalweg, wenn Siva als Adaptorprotein an CD27 bindet und die Aktivierung der Caspase-8

bewirkt. Möglich wäre hingegen auch, dass Siva über die Interaktion mit dem Peroxisomen-

Protein PMP22 den mitochondrialen Apoptose-Weg induziert, zum Beispiel durch eine

Permeabilisierung der Peroxisomenmembran, in deren Folge Wasserstoffperoxid in das

Zytoplasma gelangt. Wasserstoffperoxid und das Superoxid-Radikal (O2.-) können die

Mitochondrienmembran durchlässig machen und die Freisetzung von Cytochrom C

verursachen (MADESH AND HAJNOCZKY 2001). Dadurch kommt es zu einer Aktivierung von

Caspase-3 und zur Induktion des apoptotischen Zelltods.

Ausserdem erbrachte die Suche nach Bindungspartnern für Siva in einer Herz-cDNA-Bank

einen Hinweis auf die Entstehung der Schädigungen des Myokards im Verlauf einer

Coxsackievirus-Infektion. Siva interagiert mit dem in den Sarcomeren lokalisierten Protein

Telethonin. Telethonin seinerseits bindet am N-Terminus des kontraktilen Proteins Titin, das

hauptsächlich für die Kraftübertragung entlang der Sarcomeren in einer kontrahierenden

Apoptose

Replikation

Infektion mit CVB3

Induktionvon Siva

Siva

CD27

?

Procaspase-3

Procaspase-8Caspase-8

Caspase-3

CD70

?

Freisetzung von VP2

Interaktion von VP2 mit Siva

Interaktion von VP2 mit Siva

Sarcomer

PeroxisomPeroxisom H2O2

Apoptosom(Caspase-9)

VP2

Myocarditis

?

Diskussion 82

Herzmuskelzelle verantwortlich ist. Die Interaktion von Telethonin und Titin ist dafür

erforderlich (GREGORIO ET AL. 1998). Es wurde bereits früher gezeigt, dass Beeinträchtigung

der Funktion der Sarcomere das Entstehen einer Dilatativen Kardiomyopathie begünstigt

(CHEN AND CHIEN 1999; TOWBIN AND BOWLES 2002).

4.6. Ausblick

Die vorliegende Arbeit bietet mehrer Ansatzpunkte für weiterführende Untersuchungen. Auf

einige ungelöste Fragen wurde bereits in der Diskussion kurz eingegangen. An dieser Stelle

werden diese Fragen und ihre mögliche Beantwortung kurz zusammengefasst.

Die räumliche Struktur von Siva sollte unbedingt untersucht werden. Hierzu liegen bisher

keine gesicherten Erkenntnisse vor. Es wurde lediglich versucht, aus der Aminosäure-

Sequenz von Siva über Computerberechnungen das Vorhandensein eines helikalen

Strukturelements vorherzusagen (XUE ET AL. 2002), das haupsächlich für die

proapoptotischen Eigenschaften von Siva verantwortlich sein soll. Wie in Kapitel 4.2.

ausgeführt wurde, müssen diese Ergebnisse jedoch mit Vorbehalt betrachtet werden. Die

Aufklärung der Struktur von Siva könnte auch die Frage beantworten, wie die gebundenen

Zink-Ionen in das Protein eingebaut sind und welche Strukturelemente sie tatsächlich bilden.

Die Anwesenheit eines hohen Anteils von Cystein im Siva-Protein und die Schwierigkeiten

bei der rekombinanten Expression in E. coli deuten jedenfalls auf eine komplexe

Raumstruktur hin.

Die Arbeiten zur Strukturbestimmung wurden bereits begonnen. Von Dr. P. Hortschansky

(HKI jena, Abt. Angewandte Mikrobiologie) wurde eine grössere Menge gereinigtes MBP-

Siva-Fusionsprotein hergestellt. Im Moment werden damit in der Abteilung Strukturbiologie

und Kristallographie des Instituts für Molekulare Biotechnologie Vorversuche zu geeigneten

Kristallisationsbedingungen unternommen. Da die Struktur des an Siva anfusionierten MBP

bereits bekannt ist, sollten sich bei der Strukturaufklärung beide Proteine unterscheiden

lassen.

Eine wichtige Frage ist , wie die starke Expressionsrate von Siva während einer Infektion mit

Coxsackievirus B3 zustande kommt. Während einer CVB3-Infektion wird der zelleigene

Transkriptionsapparat ausser Funktion gesetzt, um die Expression der Virus-Proteine zu

begünstigen. Es müsste geklärt werden, warum trotzdem die Expression von Siva zunimmt,

da das Vorhandensein dieses proapoptotischen Proteins sicherlich das Schicksal der

infizierten Zelle beeinflusst. Denkbar wäre, dass der Promotor des Siva-Gens Elemente

enthält, die ähnlich wie eine interne Ribosomen-Einstrittstelle (IRES) die cap-unabhängige

Translation von Siva ermöglichen.

Diskussion 83

Ungeklärt ist bisher ebenso, ob der Oberflächenrezeptor CD27 bei den durch das

Coxsackievirus verursachten zellulären Prozessen eine Rolle spielt. Siva war ursprünglich

als ein an CD27 bindendes Protein entdeckt worden. Die Überexpression von Siva in

kultivierten Säugerzellen verursacht Apoptose (PRASAD ET AL. 1997), ebenso wie die

Replikation des CVB3 in den infizierten Zellen, die auch eine erhöhte Expression von Siva

zeigen. Der Rezeptor CD27 ist jedoch ein lymphozyten-spezifisches Mitglied der TNF

Rezeptor-Familie. Seine Expression in infizierten Myozyten und damit die Beteiligung an der

Induktion des programmierten Zelltods durch eine CVB3-Infektion erscheint eher

unwahrscheinlich. In diesem Zusammenhang müsste also geklärt werden, ob Siva auch an

andere Rezeptoren des TNF Rezeptor 2-Typs binden kann. Darüber hinaus müssten bislang

unbekannte Adaptorproteine identifiziert werden, mit deren Hilfe das Signal vom Rezeptor in

das Innere der Zelle gelangen kann. Coxsackievirus B3 infiziert auch B-Lymphozyten (MENA

ET AL. 1999). Die Frage nach der Rolle von CD27 könnte durch Untersuchungen in diesen

Zellen sicherlich beantwortet werden.

Im Moment erscheint die Annahme wahrscheinlicher, dass Siva seine apoptose-

induzierende Wirkung über den mitochondrialen Weg ausübt. Von XUE ET AL. wird eine

Lokalisation von Siva zusammen mit Bcl-2 auf dem Mitochondrien gezeigt. In dieser

Veröffentlichung wird davon gesprochen, dass der eigentliche Mechanismus des Siva-

induzierten Zelltodes noch nicht bekannt ist. Weiter zelluläre Ereignisse des Mitochondrien-

Signalweges, wie die Freisetzung von Caspase-9, Cytochrom C oder anderer Effektor-

Proteine aus den geschädigten Mitochondrien, wurden nicht berichtet.

Ebenso wurde bisher nicht untersucht, welche Rolle die Splicevariante Siva-2 in

physiologischen Prozessen spielt. Nachgewiesen wurde das Auftreten einer kürzeren für

Siva kodierenden mRNA durch eine RT-PCR mit Proben aus einer B-Zell-Linie und vier

embryonalen Stammzellen der Maus (YOON ET AL. 1999). Diese Zelllinien sind

wahrscheinlich transformiert und besitzen deshalb ein verändertes Expressionsmuster. Siva-

2 hat im Vergleich zum Gesamtprotein keine proapoptotischen Eigenschaften. Durch

Beeinflussung des Splicevorgangs könnte möglicherweise eine Regulation des

programmierten Zelltodes hin zu einer grösseren Überlebensrate erreicht werden. Dadurch

liessen sich möglicherweise die im Verlauf einer CVB3-Infektion auftretenden massiven

Gewebeschädigungen verringern.

Zusammenfassung 84

5. Zusammenfassung

Gegenstand dieser Promotionsarbeit waren die zellulären Ereignisse im Verlauf einer

Infektion mit Coxsackievirus B3, einem Mitglied der Familie der Picornaviren. Zu Beginn der

Untersuchung der molekularen Vorgänge während einer CVB3-Infektion wurde mit Hilfe

eines Zweihybrid-Genbankscreenings festgestellt, dass das Capsidprotein VP2 von

Coxsackievirus B3 mit einem bis dahin wenig erforschten Protein interagiert. Dieses Protein,

genannt Siva, verursachte bei Überexpression in Zellkultur den apoptotischen Tod der

transfizierten Zellen, weswegen es als proapoptotisch eingestuft wurde. Ausserdem wurde

festgestellt, dass die Expression durch eine Infektion mit Coxsackievirus B3 stark zunahm.

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Charakterisierung der Interaktion zwischen dem

Virusprotein VP2 und dem zellulären Protein Siva. Dazu wurden zunächst Fragmente von

Siva kloniert und als Fusionsproteine mit GST oder MBP in E. coli exprimiert und gereinigt.

Mit Hilfe eines in vitro-Bindungsversuches wurde gezeigt, dass die Interaktion mit VP2 einen

kleinen Bereich des Siva-Proteins benötigt, im wesentlichen die Aminosäuren 128-136.

Bereits zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass Siva mit dem kostimulatorischen

Zellmembranprotein CD27 interagieren kann, ein zur Gruppe der Tumornekrosefaktor-

Rezeptoren des Typs 2 gehörendes Protein. Der kurze intrazelluläre C-Terminus von CD27

besitzt eine Bindungsstelle für die Adaptorproteine TRAF2 und -5, mit deren Hilfe die

stimulatorischen Signale in das Innere der Zellen weitergegeben werden. Durch einen

gerichteten Zweihybrid-Versuch wurde nachgewiesen, dass Siva ebenfalls mit der TRAF-

bindenden Region des CD27-Proteins interagieren kann.

Weiterhin wurde gezeigt, dass die gleichzeitige Expression von VP2 die Interaktion von Siva

und CD27 verhindern kann. Die Expression einer VP2-Mutante, in der eine einzige

Aminosäure ausgetauscht ist und die selbst nicht mit Siva interagieren kann, kann ebenfalls

die Bindung von Siva an CD27 kompetitieren. Das Virusprotein VP2 kann also die Interaktion

von CD27 mit Siva unterdrücken, unabhängig davon, ob es selbst an Siva gebunden ist oder

nicht.

Weitere Erkenntnisse über die Ursachen des durch die Infektion mit CVB3 hervorgerufenen

zytopathischen Effektes erbrachte die Suche nach bislang unbekannten Bindungspartnern

von Siva in einer human Herz-cDNA-Bank. Es wurden insgesamt drei Proteine gefunden, die

mit Siva interagierten: das Peroxisomen-Membranprotein PMP22, das in den Sarcomeren

Zusammenfassung 85

(den kontraktilen Einheiten von Herzmuskelzellen) lokalisierte Protein Telethonin und die

Untereinheit III der Cytochrom C-Oxidase. Da sich das zuletzt genannte Protein unter

normalen Bedingungen im Inneren der Mitochondrien befindet, ist nur bei den beiden ersten

Proteinen eine Interaktion mit Siva möglich.

Telethonin schirmt innerhalb eines Sarcomers den N-Terminus des kontraktilen Proteins Titin

ab. Eine Beeinträchtigung der Funktion von Telethonin oder die Verkürzung des N-Terminus

von Titin zieht ein deutliches Nachlassen der Kraftübertragung und der kontraktilen Funktion

der Kardiomyozyten nach sich. Es ist also möglich, dass die Interaktion von Siva mit

Telethonin ebenfalls einen solchen Effekt hat, und somit das Auftreten einer Dilatativen

Kardiomyopathie verursachen könnte.

Die Bindung von Siva an das Peroxisomen-Membranprotein PMP22 wude in dieser

Doktorarbeit näher untersucht. In einem weiteren in vitro-Bindungstest mit den in E. coli

exprimierten Fragmenten von Siva und rekombinant in Säugerzellen hergestelltem PMP22

wurde gezeigt, dass PMP22 an den N-Terminus von Siva bindet, wozu zumindest die

Aminosäuren 53-61 von Siva benötigt werden. Es wurde vermutet, dass durch die Bindung

von Siva an PMP22 die Funktion der Peroxisomen beeinträchtigt werden kann. Durch die

Permeabilisierung der Peroxisomen-Membran können Moleküle wie etwa Hydroperoxid aus

dem Inneren der Peroxisomen in das Zytoplasma gelangen und auf diesem Wege den

mitochondrialen Weg zum programmierten Zelltod (Apoptose) initiieren. Der Nachweis dieser

Vermutung konnte nur indirekt erfolgen: die Überlebensrate von Siva-transfizierten Zellkultur-

Zellen nahm deutlich zu, wenn gleichzeitig mit der zu transfizierenden Plasmid-DNA Vitamin

C (ein Radikal-Fänger) oder N-Acetylcystein, das die intrazelluläre Konzentration an

reduziertem Glutathion erhöht, zugegeben wurde.

Die Aminosäure-Sequenz von Siva weist einen sehr hohen Anteil der Aminosäuren Cystein

und Histidin auf (insgesamt mehr als 10%). Dies legt die Vermutung nahe, dass das native

Siva-Protein Zink-Ionen binden könnte. Mit einem kolorimetrischen Test wurde untersucht,

ob aus unter Zusatz von Zinkacetat kultivierten E. coli gewonnene MBP-Siva-

Fusionsproteine Zink enthalten. Siva bindet insgesamt drei Zink-Ionen. Es wurde gefunden,

dass der besonders cysteinreiche C-Terminus von Siva zwei Zink-Ionen bindet, und durch

die Deletion des von Exon 2 des Siva-Gens kodierten Bereiches (Aminosäuren 54-117) die

Bindungsstelle für ein weiteres Zink verloren geht.

Ausserdem wurde nachgewiesen, dass durch exogene Apoptose-Stimuli wie Staurosporin

oder Camptothecin die Expression von Siva nicht induziert werden kann. Die deutlich

erhöhte Expression von Siva ist also ein spezifisch durch die Infektion mit CVB3

verursachtes Ereignis.

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SELBSTÄNDIGKEITS ERKLÄRUNG

Hiermit erkläre ich, dass mir die geltende Promotionsordnung der Biologisch-

Pharmazeutischen Fakultät der Friedrich-Schiller-Universität Jena bekannt ist.

Ich versichere, die vorliegende Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfasst und keine

anderen als die angegebenen Quellen, persönlichen Mitteilungen und Hilfsmittel verwendet

zu haben.

Die Hilfe eines Promotionsberaters wurde von mir nicht in Anspruch genommen. Dritte

haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten,

die im Zusammenhang mit der vorgelegten Dissertation stehen.

Weiterhin versichere ich, dass ich diese Dissertation noch an keiner anderen Hochschule

eingereicht habe, um ein Promotionsverfahren eröffnen zu lassen.

Saalfeld, den 11. November 2002 Matthias Nestler

PUBLIKATIONEN IM ZUS AMMENHANG MIT DER DISSERTATION Publikationen in wissenschaftlichen Zeitschriften: Martin, U., Nestler, M., Munder, T., Zell, R., Henke, A. (2002): Characterization of coxsackievirus B3- caused apoptosis under in vitro conditions. Med. Microbiol. Immunol., accepted for publication. Henke A., Nestler M., Strunze S., Saluz H.P., Hortschansky P., Menzel B., Martin U., Zell R., Stelzner A., Munder T. (2001): The apoptotic capability of coxsackievirus B3 is influenced by the efficient interaction between the capsid protein VP2 and the proapoptotic host protein Siva. Virology, 289:15-22. Posterpräsentationen: Martin, U., Nestler, M., Menzel, B., Munder, T., Stelzner A. und Henke, A. (2002): Investigation of coxsackievirus B3-caused apoptosis in vitro. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, Marburg. Martin U., Nestler M., Menzel B., Munder T., Stelzner A. und Henke A. (2002): Characterization of apoptotic events during coxsackievirus B3 infection. Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, Erlangen. Martin U., Nestler M., Menzel B., Munder T., Stelzner A. und Henke A. (2002): Characterization of apoptotic events during coxsackievirus B3 infection. XIIth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses, Falmouth, USA. Nestler M., Strunze S., Martin U., Henke A., Saluz H.P., Munder M. (2001): Apoptosis caused by Coxsackievirus B3 is mediated through interaction between VP2 and human Siva. Programmed Cell Death Meeting, Cold Spring Harbor, USA.

DANKSAGUNG Diese Arbeit wurde in der Zeit von November 1999 bis Oktober 2002 am Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e. V. in der Abteilung Zell- und Molekularbiologie angefertigt. Zuallererst möchte ich mich herzlich bei Herrn Prof. Dr. Hans-Peter Saluz für die Möglichkeit bedanken, in seiner Abteilung diese interessante und vielseitige Dissertation anzufertigen. Seine Unterstützung und seine stete Diskussionsbereitschaft waren mir sehr wertvoll. Mein ganz besonderer Dank gilt meinem Doktorvater PD Dr. Thomas Munder für seine uneingeschränkte Unterstützung und Ermutigung. Ich verdanke ihm wertvolle methodische Anregungen und viele hilfreiche Diskussionen. Er hat, nicht zuletzt durch die kritische Revision des Manuskripts, maßgeblich zum Gelingen der Arbeit beigetragen. Die Zusammenarbeit mit dem Institut für Virologie der Friedrich-Schiller-Universität war eine wichtige Grundlage für die Arbeit an dem vorgestellten Thema. Ganz besonders danke ich Herrn PD Dr. Andreas Henke für seine Unterstützung bei virologischen Fragestellungen. Seine Ausführungen zum Thema Picornaviren waren mir sehr hilfreich. Ausserdem bedanke ich mich bei Ulrike Martin und Beate Menzel für ihre kooperative Zusammenarbeit. Alle Mitglieder der Abteilung Zell- und Molekularbiologie des Hans-Knöll-Instituts haben mich in allen Phasen der Arbeit unterstützt, besonders durch eine freundliche und angenehme Arbeitsatmosphäre. Dafür danke ich Claudia Franke, Birgit Lemser, Kristina Fahr, Gino Limmon, Javeed Iqbal, Katja Lehmann, Grit Mrotzek und Sweta Bauer. Dank auch an Herrn Dr. Frank Hänel und Herrn Dr. Hans Krügel für ihre hilfreichen Hinweise, und Frau Grit Mrotzek für die Durchführung der vielen Sequenzanalysen. Herr Dr. Peter Hortschansky aus der Abteilung Angewandte Mikrobiologie hat die Verwendung des pMal-Expressionssystems vorgeschlagen und alle Arbeiten zur präparativen Proteinreinigung durchgeführt. Dies hat entscheidend zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen. Herzlichen Dank für diese Unterstützung. Frau Dr. Ute Brosius (Universität Düsseldorf) und Herr Dr. Georg Lüers (Universität Marburg) haben mir Plasmide zur Verfügung gestellt. Dafür danke ich herzlich, ebenso für die hilfreiche Einführung zum Thema Peroxisomen. Dank auch an Dr. Brian Seed (Boston, USA) für ein weiteres Plasmid.

LEBENSLAUF Angaben zur Person Name: Matthias Reinhart Nestler Geburtsdatum: 20. Januar 1970 Geburtsort: Leipzig Wohnort: Melanchthonstr. 30A

07318 Saalfeld Familienstand: Lebensgemeinschaft Kinder: Eine Tochter, geboren im Oktober 2001 Schulau sbildung 1976-1984: 157. Polytechnische Oberschule, Leipzig 1984-1988: Erweiterte Thomas-Oberschule Leipzig Wehrdienst 10.1989-09.1990: Nationale Volksarmee der DDR Hochschulstudium 10.1990-9.1992: Grundstudium

Fachrichtung: Chemie/Diplom Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

10.1992-12.1995: Hauptstudium

Julius-Maximilians-Universität Würzburg Spezialisierungsfach: Biochemie Diplomarbeit am Institut für Physiologische Chemie II Thema: „Signaltransduktion bei Cardiofibroblasten aus den Herzen adulter Ratten“

Beruflicher Werdegang • 09.1988-09.1989 und 02.1990-09.1990 (während des Wehrdienstes): ungelernter Laborant, Karl-Marx-Universität Leipzig, Sektion Biowissenschaften, Fachbereich Tierphysiologie und Immunbiologie (Prof. Dr. H. Ambrosius) • 01.1996-06.1997: Wissenschaftlicher Mitarbeiter, Technische Universität München, Klinische Forschergruppe der Frauenklinik des Klinikums rechts der Isar (Prof. Dr. M. Schmitt) • 07.1997-06.1999: Wissenschaftlicher Mitarbeiter, Max-Delbrück-Centrum Berlin und Martin-Luther-Universität Halle, Institut für Pharmazeutische Biologie (Prof. Dr. M. Gaestel) • 11.1999-10.2002: Promotion am Hans-Knöll-Institut für Naturstoffforschung Jena, Abteilung Zell- und Molekularbiologie (Prof. Dr. H.-P. Saluz) Thema: „Apoptoseprozesse in der Pathogenese viraler Infektionen: Interaktion des Kapsidproteins VP2 von Coxsackievirus B3 mit dem proapoptotischen Protein SIVA“ Saalfeld, am 11. November 2002 Matthias Nestler

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