Sulfoquinovosyldiacylglyceride – antiviral aktive Substanzen · MALDI matrix assisted laser...

Sulfoquinovosyldiacylglyceride – antiviral aktive Substanzen

Der Technischen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg

zur Erlangung des Grades

D O K T O R - I N G E N I E U R

vorgelegt von

Ivonne Naumann

Erlangen - 2009

Als Dissertation genehmigt von

der Technischen Fakultät

der Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der Einreichung: 27.10.2008

Tag der Promotion: 06.03.2009

Dekan:

Prof. Dr.-Ing. Johannes Huber

Berichterstatter:

Prof. Dr. Rainer Buchholz

Prof. Dr. Monika Pischetsrieder

Für meine Eltern

Heinz und Ingrid Naumann

„Es ist ein verdammt langer Weg

vom Grund des Meeres bis in die Apotheke!“ (Prof. Dr. Brümmer & Prof. Dr. Schill, 2006)

Inhaltsverzeichnis

- Seite I -

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................... VI

Zusammenfassung.................................................................................................IX

Abstract ................................................................................................................. XII

1 Einleitung .....................................................................................................1

2 Stand des Wissens ......................................................................................3

2.1 Humane Herpesviren...............................................................................3

2.1.1 Humanes Cytomegalievirus..............................................................4

2.1.1.1 Pathologie.......................................................................................4

2.1.1.2 Infektionszyklus............................................................................5

2.1.2 Virustatika............................................................................................6

2.1.2.1 Synthetische Virustatika ..............................................................6

2.1.2.2 Natürliche antivirale Wirkstoffkandidaten...............................8

2.1.3 Drug Discovery .................................................................................10

2.1.3.1 Target Zytotoxizität ....................................................................10

2.1.3.2 Target HIV-Reverse Transkriptase ..............................................11

2.1.3.3 Target Humanes Cytomegalievirus .........................................12

2.2 Sulfoglycolipide als pharmazeutische Wirkstoffkandidaten ...........13

2.2.1 Sulfoquinovosyldiacylglyceride – Struktur und Vorkommen...13

2.2.2 SQDG – Biosynthese und Funktion ...............................................14

2.2.3 Pharmazeutisches Potential der SQDG .........................................16

2.2.4 Pharmazeutisches Potential weiterer Sulfoglycolipide...............19

2.2.5 Strukturcharakterisierung - MALDI trap ToF Hybrid MSn ........20

2.2.5.1 MALDI ToF in der Lipidanalytik .............................................21

2.3 Neue Therapeutika aus phototrophen Mikroorganismen................23

2.3.1 Phototrophe Mikroorganismen – Mikroalgen

und Cyanobakterien .........................................................................23

2.3.2 Kultivierung phototropher Mikroorganismen.............................25

2.3.2.1 Photosynthese..............................................................................25

2.3.2.2 Kultivierungsbedingungen .......................................................26

2.3.2.3 Photobioreaktoren ......................................................................28

3 Problemstellung ........................................................................................33

4 Material und Methoden.......................................................................... 35

Inhaltsverzeichnis

- Seite II -

4.1 Kultivierung phototropher Mikroorganismen...................................35

4.1.1 Verwendete Mikroorganismen .......................................................35

4.1.2 Photobioreaktor-Screening-Modul.................................................35

4.1.3 Verwendete Medien und Kultivierungsbedingungen ................36

4.1.4 Vorkulturführung/Inokulieren .......................................................38

4.1.5 Untersuchungen zur Optimierung der SQDG-Produktion........38

4.1.6 Prozessbegleitende Analytik...........................................................39

4.1.6.1 Messung der Optischen Dichte.................................................39

4.1.6.2 Bestimmung der Biotrockenmassekonzentration ..................40

4.1.6.3 Ermittlung der Zellzahl..............................................................40

4.1.6.4 Messung des pH-Wertes............................................................41

4.1.6.5 Bestimmung der maximalen spezifischen Wachstumsrate..41

4.1.6.6 Bestimmung der Raum-Zeit-Ausbeute....................................41

4.1.7 Ernte der Biomasse ...........................................................................41

4.2 Aufarbeitung der SQDG ........................................................................42

4.2.1 Verwendete Lösungsmittel und Salze ...........................................42

4.2.2 Extraktion...........................................................................................42

4.2.3 Dünnschichtchromatographie ........................................................43

4.2.3.1 Analytische Dünnschichtchromatographie ............................43

4.2.3.2 Präparative Dünnschichtchromatographie.............................44

4.2.4 Adsorption/Desorptions-Trennverfahren .....................................44

4.2.5 Zweiphasensystem (Folch wash)....................................................46

4.2.6 Isolierung der Ac-SQDG..................................................................46

4.3 Strukturcharakterisierung und Quantifizierung................................47

4.3.1 MALDI trap ToF Hybrid MSn ........................................................47

4.3.1.1 Matrix und Technikoptimierung ..............................................47

4.3.2 Enzymatischer Verdau.....................................................................48

4.3.3 Quantifizierung der SQDG mittels LC-MS ...................................49

4.4 Biologische Assays..................................................................................50

4.4.1 Kultivierung der Wirtszellen ..........................................................50

4.4.2 Herstellung des Virusstocks............................................................50

4.4.3 Bestimmung der antiviralen Aktivität ...........................................51

4.4.4 Weiterführende Untersuchungen...................................................52

Inhaltsverzeichnis

- Seite III -

4.4.5 Assay der Inhibierung der HIV-Reversen Transkriptase

(HIV-RT).............................................................................................54

5 Ergebnisse ................................................................................................. 56

5.1 Stammauswahl von potentiellen SQDG-Produzenten......................56

5.2 Kultivierungen ........................................................................................57

5.2.1 Rhodophyta .......................................................................................57

5.2.2 Heterokonotphyta.............................................................................58

5.2.3 Chlorophyta.......................................................................................59

5.2.4 Cyanophyta........................................................................................60

5.3 Down Stream Processing der SQDG....................................................61

5.3.1 Etablierung.........................................................................................61

5.3.1.1 Dünnschichtchromatographie ..................................................61

5.3.1.2 Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren .............................61

5.3.1.3 Zweiphasensystem (Folch wash)..............................................62

5.3.2 SQDG in phototrophen Mikroorganismen ...................................63

5.3.2.1 Rhodophyta .................................................................................63

5.3.2.2 Heterokontophyta.......................................................................64

5.3.2.3 Chlorophyta.................................................................................65

5.3.2.4 Cyanophyta..................................................................................65

5.3.3 Ac-SQDG in phototrophen Mikroorganismen .............................66


5.3.4 Etablierung einer Trennmethode für Ac-SQDG...........................67

5.4. Strukturcharakterisierung mittels MALDI trap ToF Hybrid MSn ...68

5.4.1 Matrixoptimierung ...........................................................................68

5.4.2 MALDI ToF des SQDG-Standards .................................................70

5.4.2.1 Untersuchungen des SQDG-Standards im MS1 .....................70

5.4.2.2 Untersuchungen des Standards im MS2 und MS3 ..................71

5.4.3. MALDI ToF der SQDG aus phototrophen Mikroorganismen ...72

5.4.3.1 Rhodophyta .................................................................................72


5.4.3.3 Chlorophyta.................................................................................79

5.4.3.4 Cyanophyta..................................................................................79

5.4.3.5 Zusammenfassung der identifizierten SQDG ........................83

Inhaltsverzeichnis

- Seite IV -

5.4.4 MALDI ToF von Ac-SQDG aus phototrophen Mikroorganismen.....84


5.4.5 MS-Analyse separierter Ac-SQDG/SQDG-Fraktionen................85

5.4.6 Enzymatischer Verdau der Ac-SQDG ...........................................88

5.5 HPLC-ESI-Massenspektrometrie zur Quantifizierung von SQDG .89

5.5.1 Etablierung der chromatographischen Trennung........................89

5.6 Untersuchung zur Optimierung der SQDG-Bildung ........................92

5.6.1 Variation der Bestrahlungsstärke ...................................................92

5.6.2 Variation der Phosphatquelle/-konzentration..............................95

5.7 Biologische Aktivitäten der SQDG/Ac-SQDG....................................98

5.7.1 Antiviraler Bioassay mit HCMV.....................................................98

5.7.1.1 Herstellung von hochtitrigen Virusstöcken............................98

5.7.1.2 Vergleich der Assays IE-POX und DE-POX .........................100

5.7.1.3 Etablierung des HCMV-Assays mit Standardsubstanzen ..101

5.7.2 Anti-HCMV-Aktivität der SQDG.................................................102

5.7.2.1 Rhodophyta ...............................................................................102

5.7.2.2 Heterokontophyta.....................................................................103

5.7.2.3 Cyanophyta................................................................................104

5.7.3 Anti-HCMV-Aktivität und Zytotoxizität der SQDG.................105

5.7.4 Anti-HCMV-Aktivität und Zytotoxizität der Ac-SQDG...........107

5.7.5 Enzymatischer Bioassay mit der Reversen Transkriptase von HIV108

5.7.5.1 Etablierung des HIV-Reverse Transkriptase-Assays ..............108

5.7.6 Anti-HIV-RT-Aktivität der SQDG................................................109

5.7.6.1 Rhodophyta ...............................................................................109

5.7.6.2 Heterokonotphyta.....................................................................110

5.7.6.3 Cyanophyta................................................................................111

5.7.6.4 Zusammenfassung der Anti-HIV-RT-Aktivitäten ...............112

6 Fehlerbetrachung ................................................................................... 113

6.1 Prozessbegleitende Analytik...............................................................113

6.2 Aufarbeitungen der SQDG..................................................................113

6.3 MALDI trap ToF Hybrid MSn .............................................................114

6.4 HPLC-ESI-MS........................................................................................114

6.5 Biologische Assays................................................................................114

Inhaltsverzeichnis

- Seite V -

7 Diskussion............................................................................................... 116

7.1 Selektion phototropher Mikroorganismen........................................116

7.2 Kultivierungen ......................................................................................119

7.3 Down Stream Processing für SQDG ..................................................121

7.3.1 Etablierung der Trennmethoden für SQDG ...............................121

7.3.2 SQDG in phototrophen Mikroorganismen .................................124

7.3.3 Ac-SQDG in phototrophen Mikroorganismen ...........................125

7.3.4 Etablierung chromatographischer Trennmethoden für Ac-SQDG...125

7.4 MALDI trap ToF Hybrid MSn Massenspektrometrie ......................126

7.4.1 Matrixoptimierung .........................................................................126

7.4.2 MALDI ToF des SQDG-Standards ...............................................126

7.4.3 MALDI ToF von SQDG aus phototrophen Mikroorganismen 127

7.4.4 MALDI ToF von Ac-SQDG aus phototrophen Mikroorganismen 134

7.5 HPLC-ESI-MS........................................................................................136

7.6 Untersuchungen zur Optimierung der SQDG-Bildung..................136

7.7 Antivirale Bioaktivität ..........................................................................139

7.7.1 Antiviraler Bioassay mit HCMV...................................................139

7.7.2 Anti-HCMV Aktivität und Zytotoxizität der SQDG .................141

7.7.3 Anti-HCMV Aktivität und Zytotoxizität der Ac-SQDG...........145

7.7.4 Inhibierung der HIV-RT durch SQDG.........................................146

7.8 Gesamtfazit ............................................................................................147

8 Ausblick und Perspektiven ................................................................. 149

9 Literaturverzeichnis............................................................................... 151

10 Anhang..................................................................................................... 168

Abkürzungen

- Seite VI -

Abkürzungsverzeichnis

AC Essigsäure

Ac-SQDG acylierte SQDG

Ac2-SQDG zweifach acylierte SQDG

ACN Acetonitril

AIDS Aquired Immuno Deficiency Virus

APS Sulfat-Adenosin-5´-Phosphosulfat

APU Antigen producing units

ATP Adenosin Triphosphate

A/V Oberfläche/Volumen-Verhältnis

BTM Biotrockenmassekonzentration

CID collision induced decay

CHCA α-Cyanohydroxyzimtsäure

Cyt b6/f Cytochrom b6/f-Komplex

DAG Diacylglycerol

DC Dünnschichtchromatographie

DCM Dichlormethan

DE virale delayed early Proteine

DHB 2,5-Dihydroxybenzoesäure

DNA Desoxyribonucleinsäure

DS Dextransulfat

EBV Epstein Barr Virus

EGFR epidermal growth factor receptor

ECACC European Collection of cell cultures

EPS Exopolysaccharide

ESI Electro Spray Ionization

EtAc Ethylacetat

FACS Fluorescence Activated Cell Sorting

FKS Fötales Kälberserum

GFP Green Fluorescent Protein

gp Glycoprotein

GV Ganciclovir

IE virale immedeate early Proteine

HCMV Humaner Cytomegalovirus

HHV Humaner Herpesvirus

HIV Human Immunodeficiency Virus

Abkürzungen

- Seite VII -

HIV-RT HIV-Reverse Transkriptase

HMF 4-Hydroxymethylfurfural

HSV Herpes Simplex Virus

HPLC High Performance Liquid Chromatography

I0 Bestrahlungsstärke an der PSM-Oberfläche

ILM ionic liquid matrice

ILM 1 1-Butylamin-α-4-hydroxyzimtsäure

ILM 2 N,N-Diethyl-N-phenylammonium-α-cyano-4-hydroxyzimt-

säure

L virale late Proteine

LC Liquid Chromatography

LDH Lactat-Dehydrogenase

LP lipophile Phase

MALDI matrix assisted laser desorption ionization

MeOH Methanol

MOI Multiplicity of Infection

MS Massenspektrometrie

µmax maximale Wachstumsrate

NaAc Natriumacetat

NAD+ Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid

NH4Ac Ammoniumacetat

NIES National Institute for Enviromental Studies Collection

NEPCC North East Pacific Culture Collection

NNRTIS Nicht-Nucleosid Reverse Transkriptase Inhibitoren

NRTIs Nucleosid Reverse Transkriptase Inhibitoren

OD Optische Dichte

o. g. oben genannte(n)

p. A. Reagenzien für die Analyse

p. I. post infectum

PAPS Adenosin-3´-phosphate-5´-phosphosulfat

PE Phosphatidylethanolamine

PBS phosphate buffer saline

PC Plastocyanin

PC Phosphatidylcholin

PCR Polymerase Chain Reaction

PE Phosphatidylethanolamin

Abkürzungen

- Seite VIII -

PG Phosphatidylglycerol

POX Immunoperoxidasefärbung

PPFD photosynthetische Photonenflussdichte

PQ Plastochinon

PS Phosphatidylserin

PS Photosystem

PSD post source decay

PSM Photobioreaktor-Screening-Modul(e)

PUFA Polyunsaturated fatty acids, vielfach ungesättigte Fettsäuren

RE Rohextrakt

Rf Retentionsfaktor

Rubisco Ribulosebisphosphat-Carboxylase/-Oxygenase

RT Reverse Transkriptase

RZA Raum-Zeit-Ausbeute

SAG Stammsammlung für Algenkulturen in Göttingen

S/N Signal/Rausch-Verhältnis

STD Standard

STY space-time yield

SV Säulenvolumen

SGL Sulfoglykolipide

SQDG Sulfoquinovosyldiacylglycerid(e)

SQG Sulfoquinovosylglyceride

SQMG Sulfoquinovosylmonoacylglyceride

SV Säulenvolumen

Temp. Temperatur

TIC total ion collection mode

TFA Trifluoressigsäure

TOI time of infection

UDP Uridin 5´-Disulfat

UTEX Culture Collection of Algae at the University of Texas, Austin

VZV Varicella-Zoster-Virus

vvm Volume per Volume per Minute

v/v Volume per Volume

WP wässrige Phase

ZZ Zellzahl, Zelldichte

z. B. zum Beispiel

Zusammenfassung

- Seite IX -

Zusammenfassung

Die Substanzklasse der Sulfoquinovosyldiacylglyceride (SQDG) stellt eine

Gruppe potentiell antiviraler Wirkstoffe aus phototrophen Mikroorganismen

dar, an dessen Beispiel in der vorliegenden Arbeit eine erfolgreiche Strategie

der Entwicklung von entsprechenden Wirkstoffkandidaten aufgezeigt wird.

Ausgehend von Literaturdaten sind potentielle SQDG-bildende Stämme aus

den Algenabteilungen Rhodophyta (Porphyridium purpureum), Heterokonto-

phyta (Heterosigma carterae, verschiedene Spezies Phaeodactylum tricorntum),

Chlorophyta (Chlorella kessleri, Chlorella salina, Chlorella vulgaris) und Cyano-

phyta (verschiedene Spezies Arthrospira platensis, Scytonema hofmanni, Nostoc

punctiforme) selektiert und zur Biomassegewinnung in 1 l Photobioreaktor-

Screening-Modulen kultiviert worden.

P. purpureum kann in den Untersuchungen bereits frühzeitig als SQDG-

Produzent identifiziert werden. Die Biomasse der Alge bzw. der daraus

gewonnene Extrakt wird daher zur Etablierung der Trennverfahren für die

Gewinnung von SQDG und deren Strukturcharakterisierung mit matrix assisted

laser desorption ionization (MALDI) trap time of flight (ToF) Hybrid MSn

Massenspektrometrie eingesetzt. Als Aufreinigungsmethoden der SQDG

eignen sich die Dünnschichtchromatographie (DC) als auch ein Adsorptions/

Desorptions-Trennverfahren mit aminopropylmodifiziertem Kieselgel. Im

Rahmen von MALDI-MSn-Experimenten können die vorkommenden SQDG

von P. purpureum in ihrer Struktur identifiziert werden. Die SQDG-Molekül-

ionen werden im MS1 und die am Glycerol veresterten Acylreste C16:0, C18:2,

C20:4 und C20:5 im MS2 bestimmt. Ein zusätzlicher enzymatischer Verdau der

SQDG mit der regioselektiven Lipase aus Rhizopus arrhizus resultiert in der

Hydrolyse der sn-1-veresterten ungesättigten Fettsäuren. Ableitend daraus

kann die massenspektrometrische Eliminierung der ungesättigten Fettsäuren an

dieser Position (MS2) geklärt werden. Die Sulfoquinovose als charakteristisches

Strukturelement wird im MS3-Experiment bestätigt.

Die MALDI-Untersuchungen identifizieren zudem SQDG in den Mikroalgen

H. carterae und den Spezies von P. tricorntum sowie den Cyanobakterien S. hof-

manii, N. punctiforme und einem Spezies von A. platensis. Die SQDG aus den

Mikroalgen variieren in der sn-1-veresterten ungesättigten Fettsäure. An sn-2-

Zusammenfassung

- Seite X -

Position der SQDG ist in den Mikroalgen ein Palmitoylrest lokalisiert, der einen

prokaryotischen Biosyntheseweg der SQDG in eukaryotischen Mikro-

organismen kennzeichnet. Die SQDG-produzierenden Cyanobakterien A. pla-

tensis und N. punctiforme können SQDG sowohl prokaryotisch als auch

eukaryotisch (C18-Fettsäure an sn-2-Position) synthetisieren.

Zusätzlich zu den SQDG kann in den selektierten P. tricornutum-Stämmen die

Bildung von acylierten Sulfoquinovosyldiacylglyceriden (Ac-SQDG) mit der

MALDI ToF Analytik nachgewiesen werden. Die Ac-SQDG besitzen im Gegen-

satz zu den SQDG an der 2´-Position der Sulfoquinovose eine zusätzlich

veresterte Fettsäure.

Zur Untersuchung der antiviralen Aktivität der SQDG ist aufgrund der sehr

hohen klinischen Relevanz das humane Cytomegalievirus (HCMV) als Target-

virus ausgewählt und eine Immunoperoxidasefärbung (POX) im zellkultur-

basierten Assay mit MRC-5-Fibroblasten etabliert worden. Dabei wird die

Viruslast über die Detektion der viralen Immediate Early (IE) Proteine ermittelt.

IE-Proteine werden direkt nach dem Eindringen des Virus in die Wirtszelle

gebildet. Eine Reduktion der detektierten viralen IE-Proteine in den MRC-5-

Zellen lässt damit auf eine Inhibierung der Virusreplikation zu einem frühen

Zeitpunkt (Adsorption, Fusion) schließen. Für die Reduktion der HCMV-

Replikation um 50 % (IC50) kann nach Inkubationen von isolierten SQDG aus

verschiedenen phototrophen Mikroorganismen mittels IE-POX-Assay ein Kon-

zentrationsbereich von 33 bis 93 µg ml-1 bestimmt werden. Die SQDG-Fraktion

von S. hofmanii (SQDG C18:2/C16:0) zeigt mit einer ermittelten IC50 von

19 µg ml-1eine höhere antivirale Aktivität. Dieser Wert unterscheidet sich damit

im Vergleich zur Referenzsubstanz Dextransulfat (IC50 1,6 µg ml-1) um eine

Größenordnung. Die Inhibierung der HCMV-Viruslast kann zudem für die

isolierten Ac-SQDG-Fraktionen nachgewiesen werden.

Untersuchungen zur Optimierung der SQDG-Produktion sind am Beispiel von

A. platensis unter Variation der Prozessparameter Bestrahlungsstärke (30, 60, 80,

110, 140 µE m-2 s-1) und Phosphatquelle im Medium durchgeführt worden. Die

maximale Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) von 0,16 mgSQDG l-1 d-1 resultiert bei einer

Kultivierung mit 110 µE m-2 s-1. Durch Sublimation von K2HPO4 durch K2P2O7

im Medium bei entsprechenden Kultivierungsbedingungen kann die RZA um

20 % gesteigert werden.

Zusammenfassung

- Seite XI -

Ein Teil der antiviralen Testungen (DE-HCMV-POX-Assay) ist in Kooperation

mit der Arbeitsgruppe von Prof. Siegert an der Charité Berlin, Medizinische

Klinik II, Onkologie und Hämatologie im Rahmen der AiF-Forschungs-

vorhaben 13883 BG und 14895 BG durchgeführt worden.

Die AiF-Foschungsvorhaben 13883 BG und 14985 BG sind aus Haushaltsmitteln

des Bundesministeriums für Wirtschaft und Arbeit (BMWA) über die Arbeits-

gemeinschaft industrieller Forschung „Otto von Guericke“ e. V. (AiF) gefördert

worden.

Abstract

- Seite XII -

Abstract

Sulfoquinovosyldiacylglycerides (SQDG) represent a class of potential antiviral

agents from phototrophic microorganisms which are used in order to

demonstrate a successful strategy for the development of drug candidates.

Based on literature studies, potential SQDG-producing strains have been

selected from different alga phyla like Rhodophyta (Porphyridium purpureum),

Heterokontophyta (Heterosigma carterae, different species of Phaeodactylum

tricorntum), Chlorophyta (Chlorella kessleri, Chlorella salina, Chlorella vulgaris) and

Cyanophyta (several species of Arthrospira platensis, Scytonema hofmanni, Nostoc

punctiforme). The algae have been cultivated for biomass production in 1 l

Photobioreactor-Screening-Modules.

P. purpureum has been identified as a SQDG-producer during an early stage of

the analyses. Therefore the biomass of the alga or rather the obtained extract

were used to establish a separation processes in order to purify SQDG and to

perform structural characterization using matrix assisted laser desorption

ionization (MALDI) trap time of flight (ToF) hybrid MSn mass spectrometry.

Appropriate purification methods for SQDG are thin-layer chromatography

(TLC) as well as an Adsorption/Desorption separation method with amino-

propyl modified silica gel. SQDG-constitutions from P. purpureum has been

characterized by MALDI MSn-experiments, whereas MS1 experiments point out

the molecular weight. Esterified acyl groups C16:0, C18:2, C20:4 und C20:5 are

identified by MS2. Additional enzymatic digestion of SQDG with regio-selective

Lipase from Rhizopus arrhizus results in hydrolysis of sn-1-esterified unsaturated

fatty acids. Based on this fact, mass spectrometric elimination of unsaturated

fatty acids at this position (MS2) can be elucidated. Sulfoquinovose as a

characteristic structure element of SQDG is confirmed by MS3-experiments.

Using MALDI MSn analyses SQDG could also be identify in extracts of the

microalgae H. carterae and in the species of P. tricorntum as well as in the

cyanobacteria S. hofmanii, N. punctiforme and one species of A. platensis. SQDG

from microalgae vary in their sn-1-esterified unsaturated fatty acid. At sn-2-

position of SQDG a palmitoyl residue is localized which marks a prokaryotic

biosynthesis path of SQDG in eukaryotic microorganisms. SQDG-producing

Abstract

- Seite XIII -

cyanobacteria A. platensis and N. punctiforme synthesize SQDG via prokaryotic

as well as eukaryotic pathway (C18 fatty acid at sn-2-position).

In addition to SQDG, the production of acylated sulfoquinovosyldiacyl-

glycerides (Ac-SQDG) can be identified in selected strains of P. tricornutum by

MALDI ToF analysis. Contrary to SQDG, Ac-SQDG have an additional esteri-

fied fatty acid at 2´-position of sulfoquinovose.

The human herpes virus Cytomegalovirus (HCMV) was focussed as target virus

concerning antiviral investigations. In order to analyze anti-HCMV activities of

SQDGs, a virus-specific in vitro assay based on the inhibition of early steps of

infection was established. Thereby, the viral load is determined by detection of

viral Immediate Early (IE) proteins. IE proteins are produced in the MRC-5 host

cells directly after HCM-virus penetration. The reduction of viral IE-proteins in

host cells records an inhibition of an early step of viral replication (viral

adsorption/fusion). By using the IE-POX-Assay the incubations of isolated

SQDG from various phototrophic microorganisms results in a reduction of

HCMV replication of 50 % (IC50) within the used SQDG-concentration range of

33 bis 93 µg ml-1. SQDG fraction of S. hofmanii (SQDG C18:2/C16:0) shows a

higher antiviral activity, as a IC50 of 19 µg ml-1 is determined. This value varies

just in one order of magnitude compared to reference agent dextransulfate (IC50

1,6 µg ml-1). Beside antiviral activity of SQDG, the inhibition of virus load can

also be determined for isolated Ac-SQDG fractions.

Optimization studies of SQDG-production have been performed by variation of

irradiance (30, 60, 80, 110, 140 µE m-2s-1) and phosphate source in medium,

taking A. platensis as an model organism. The maximum space-time yield (STY)

of 0.16 mgSQDG l-1 d-1 can be achieved by a cultivation with an irradiance of

110 µE m-2s-1. Furthermore STY can be increased by 20 % at appropriate culti-

vation conditions by sublimation of K2HPO4 in the medium by K2P2O7.

Einleitung

- Seite 1 -

1 Einleitung

Neue und bereits bekannte Infektionskrankheiten treten aufgrund von Verän-

derungen in der Technik, der Gesellschaft und der Umwelt auch in den

Industrieländern wieder vermehrt auf. Dabei stellen virale Infektionskrank-

heiten gegenüber bakteriellen ein höheres Risiko dar, da Viren aufgrund ihrer

hohen Mutationsrate Selektionsvorteile schnell und besonders effektiv reali-

sieren können. Die kommerziell verfügbaren Virustatika zur Behandlung sind

oft unzureichend wirksam und bei längeren Behandlungszeiten werden auch

gehäuft Resistenzen und Nebenwirkungen gegenüber diesen beobachtet. Daher

ist für die Therapie viraler Infektionen ein stetig steigende Bedarf an innova-

tiven Arzneimitteln zu verzeichnen und die Pharmaindustrie ist veranlasst, ein

Screening nach potentiellen antiviral wirkenden Substanzen durchzuführen.

Von 5.000 bis 10.000 getesteten Wirkstoffen erreichen nur fünf die klinische

Prüfung und nur ein Wirkstoff davon wird als Medikament zugelassen

[Verband-Forschender-Arzneimittelhersteller, 2007]. Die kombinatorische Che-

mie, bei der eine Vielzahl verschiedener chemischer Strukturen kreiert und

anschließend Bioaktivitätstest unterzogen werden, zeigte jedoch bisher keine

zufriedenstellenden Erfolge im Bereich des drug discovery.

Seit Jahrhunderten werden Naturstoffe zur Behandlung und Heilung von

Krankheiten verwendet. Derartige Biowirkstoffe finden in der jüngeren

Vergangenheit immer mehr Beachtung seitens der Pharmaindustrie, so dass

industrielle Naturstoffscreenings vermehrt durchgeführt werden. Die in Mikro-

organismen des marinen Lebensraum vorkommende Vielzahl an Wirkstoffen

stellt dabei eine unerschöpfliche Quelle von strukturellen Verbindungen zur

Generierung neuartiger Pharmazeutika für das 21. Jahrhundert dar. Die

Eigenschaft von Naturstoffen sich aufgrund chiraler Zentren als Bild und

Spiegelbild mit einem charakteristischen Verhältnis zu manifestieren, ist der

Schlüssel zum Verständnis ihrer biologischen Wirksamkeit und erklärt das

Spektrum ihres Einsatzes. Pharmakonzerne reagieren auf die Erfordernisse,

neue innovative Arzneimittel zu entwickeln, in dem Naturstoffe in umfang-

reicher Naturstoffbibliotheken nach ihren Strukturen und vielfältigen biolo-

gischen Aktivitäten klassifiziert werden.

„Es ist ein verdammt langer Weg vom Grund des Meeres bis in die Apotheke“

(Zitat Prof. Dr. Brümmer und Prof. Dr. Schill, Universität Stuttgart, 2006).

Dieser vielversprechende Weg beginnt mit der Bereitstellung der potentiellen

Wirkstoffproduzenten beispielsweise durch Isolierung und monoseptische

Einleitung

- Seite 2 -

Kulturführung der bisher unzureichend genutzten marinen, phototrophen

Mikroorganismen. Thermisch sterilisierbare Photobioreaktoren, in denen eine

Kultivierung unter reproduzierbaren optimalen Prozessbedingungen durch-

führbar ist, ermöglichen eine ausreichende Biomasse- und damit Wirkstoff-

gewinnung für Strukturanalysen und biologische Aktivitätstests.

Die aquatischen Mikroorganismen phototropher Lebensweise verfügen über

ein umfangreiches Spektrum an bioaktiven Primär- und Sekundärmetaboliten

wie polar geladene Lipide (z. B. anionischen Sulfoquinovosyldiacylglyceride),

Proteine (z. B. Lektine, Depsipeptide), Alkylsulfate, Polyether, Alkaloide und

anionisch geladene Polysaccharide. Aufgrund verschiedener biologischer

Aktivitäten dieser Metaboliten wird diesen Naturstoffen ein großes pharma-

kologisches Potential zugewiesen. So ist beispielsweise das antivirale Lektin

Cyanovirin-N aus Nostoc ellipsosporum [Boyd et al., 1997], das antineoplastisch

wirkende Depsipeptid Lyngbyastatin aus Lyngbya majuscula (tumorwachstums-

hemmend) [Luesch et al., 1999] und die natriumkanalblockierenden Brevetoxine

(zyklische Makromoleküle) aus verschiedenen Dinoflagellaten isoliert worden

[Shimizu, 1993]. Die in phototrophen Mikroorganismen vorkommenden Sulfo-

quinovosyldiacylglyceride (SQDG) stellen aufgrund ihrer antiviralen Aktivität

potentielle Wirkstoffkandidaten für die Therapie von viralen Infektions-

krankheiten dar.

Das humane β-Herpesvirus Cytomegalievirus (HCMV) als Ursache schwer-

wiegenden Krankheiten bei immunsupprimierter Patienten (z. B. HCMV-

Pneumonie, Enzephalitis) kann zum Tode des Patienten führen. Im Rahmen der

vorliegenden Arbeit wird anhand der methodischen Versuchsplanung der

erfolgreiche Ablauf im drug discovery zur Behandlung des HCMV exemplarisch

an der fokussierten Wirkstoffgruppe SQDG dargestellt.

Die Arbeiten umfassen die Selektion und Kultivierung der phototrophen

Mikroorganismen, das Down Stream Processing zur Gewinnung der SQDG, die

Strukturcharakterisierung mittels MALDI trap ToF MSn Hybrid Massenspektro-

metrie und die antiviralen Untersuchungen gegenüber HCMV in einem zell-

kulturbasierten Assay.

Stand des Wissens

- Seite 3 -

2 Stand des Wissens

2.1 Humane Herpesviren

Herpesviren sind bei Wirbeltieren und Menschen weit verbreitet. Nach der

Primärinfektion, die zumeist im Kleinkindalter erfolgt, können die Viren

lebenslang latent im Körper persistieren, ohne dass infektiöse Partikel frei-

gesetzt oder die Wirtszellen geschädigt werden [Huang and Kowalik, 1993;

Modrow et al., 2003]. Bei immunsupprimierten Patienten können die Herpes-

viren aus dem Latenzstadium in den lytischen Infektionsweg reaktiviert

werden und sind häufig die Ursache schwerwiegender Erkrankungen (z. B.

Lungenentzündung bei einer HCMV-Infektion, Hirnhautentzündung und

Hepatitis bei einer HHV-6-Infektion) [Villareal, 2001].

Herpesviren sind doppelsträngige, behüllte DNA-Viren. Im Inneren des Virus-

partikels befindet sich das ikosaedrische Nucleocapsid. Diese Struktureinheit

beinhaltet die um Fibrillen gewickelte lineare DNA, die Enzyme für den viralen

Genomreplikationszyklus und den Nukleinsäurestoffwechsel sowie Struktur-

proteine codiert. Zwischen dem Nucleocapsid und der Virushülle befindet sich

das Tegument, eine Proteinmatrix mit regulatorischen Proteinen. In der lipid-

haltigen Virushülle sind Glycoproteine eingelagert, die eine Funktion bei der

Virusadsorption/-fusion ausüben [Mocarski and Chariman, 1996; Modrow et al.,

2003].

In Abhängigkeit ihrer Wirtsspezifität, ihrer Pathogenität und ihrer Replika-

tionszyklen werden die Humanen Herpesviren (HHV) in die drei Untergrup-

pen α-, β- und γ- Herpesviren untergliedert.

Die α-Herpesviren mit den Vertretern Herpes-Simplex-Virus-1 (HSV-1),

Herpes-Simplex-Virus-2 (HSV-2) und Varicella-Zoster-Virus (VZV, HHV-3)

weisen in vitro kurze Replikationszyklen von weniger als 24 Stunden auf. Sie

infizieren in vivo ein weites Wirtsspektrum und persistieren latent in den

Ganglien der Nervenzellen. Der Replikationszyklus der β-Herpesviren (Cyto-

megalievirus (HCMV/HHV-5), HHV-6A/B, HHV-7) dauert im Vergleich zu den

α-Herpesviren länger (z. B. für HCMV erste Viruspartikelfreisetzung 4 Tage

post infectum (p. I.)) [Smith and de Harven, 1973; Horzinek, 1985; Modrow et al.,

2003]. Zusammen mit den γ-Herpesviren (Epstein Barr Virus (EBV/HHV-4),

HHV-8) sind sie durch eine engere Wirtsspezifität als α-Herpesviren

charakterisiert. Die γ-Herpesviren infizieren zumeist B-Lymphozyten sowie T-

Stand des Wissens

- Seite 4 -

Zellen und sind durch eine unterschiedliche Replikationsdauer gekennzeichnet

[Modrow et al., 2003].

2.1.1 Humanes Cytomegalievirus

2.1.1.1 Pathologie

Die Durchseuchungsrate von HCMV in der erwachsenen Bevölkerung liegt

zwischen 60 bis 90 % [Huang and Kowalik, 1993]. Die Übertragung des Virus

erfolgt durch virushaltigen Speichel, Muttermilch, Blut, Urin oder Spermien.

Föten können über die Plazenta der Mutter infiziert werden.

Die Primärinfektion verläuft zumeist asymptomatisch, jedoch kann auch ein

Krankheitsverlauf mit wenig Fieber, Lymphknotenschwellungen, Gastritis

(Magenschleimhautentzündung) oder grippeähnlichen Symptomen beobachtet

werden [Modrow et al., 2003]. Danach persistieren die Viren latent im Körper,

so dass keine weiteren Krankheitssymptome auftreten.

Immunsuppression, Krankheiten, Stress und Hormonschwankungen begün-

stigen die Reaktivierung des Virus aus dem Latenzstadium und können akute

Krankheitsverläufe hervorrufen: In Transplantatempfängern, bei denen die

Immunantwort aktiv unterdrückt wird, können Reaktionen der Blutgefäße im

Transplantat hervorgerufen werden, die einer histologischen Abstoßungs-

reaktion gleichen. Die interstitielle HCMV-Pneumonie (Lungenentzündung im

Gewebe zwischen den Lungenbläschen) stellt für AIDS- und Knochenmark-

transplantationspatienten die häufigste Todesursache dar. Ebenso können

akute HCMV-Infektionen bei AIDS- und anderen immungeschwächten

Patienten Ursache von Entzündungen der Retina und des Gastrointestinaltrakts

sowie einer Enzephalitis (Hirnhautentzündung) sein [Nguyen et al., 2001;

Modrow et al., 2003; Perssons et al., 2003].

Eine pränatale Infektion zwischen der zweiten und der sechsten Schwanger-

schaftswoche ist als besonders kritisch zu bewerten, da es infolge einer

Infektion des Zentralen Nervensystems zu Augen-, Gehirn-, Hörschäden und

Entwicklungsdefekten kommen kann. Weitere Schäden stellen Hepatospleno-

megalie (Vergrößerung der Leber und der Milz) oder Thrombocytopenie

(reduzierte Thrombozytenzahl) dar [Modrow et al., 2003].

Stand des Wissens

- Seite 5 -

2.1.1.2 Infektionszyklus

Das HCMV repliziert nach der Primärinfektion in einer Vielzahl von Organen

und den Stammzellen des Knochenmarks. Durch die einsetzende humorale

Immunantwort wird die weitere Virusreplikation kontrolliert und das Virus

geht in das Latenzstadium über. Während der Latenz persistiert das HCMV

zumeist in den Zellen der Milz und der Lunge [Modrow et al., 2003].

Die Infektion der Wirtzelle mit HCMV wird durch eine unspezifische Inter-

aktion des viralen Glycoproteins gB und des Glycoproteinkomplexes gM/gN

mit den auf der Wirtsoberfläche lokalisierten Heparansulfatproteoglycanen

initiiert [Kari and Gehrz, 1992; Compton et al., 1993]. Die postulierte spezifische

Bindung des HCMV mit dem Wirtszellrezeptor EGFR (epidermal growth factor

receptor) im Verlauf der Virusadsorption und die damit eingeleitete Aktivierung

einer HCMV-rezeptorspezifischen Zellsignalkaskade [Wang et al., 2003] sind in

weiterführenden Untersuchungen widerlegt worden [Isaacson et al., 2007].

Andere Forschungsarbeiten belegen, dass das virale Glycoprotein gB spezifisch

an die in der Zellmembran eingelagerten Integrine α2β1, α6β1 und αVβ3

(Transmembranproteine) bindet und diese damit essentiell für das Eindringen

des HCMV in die Wirtszelle sind [Feire et al., 2004; Wang et al., 2005]. Es wird

davon ausgegangen, dass die zellulären Integrine als Rezeptoren allein oder in

einer synchronen Reaktion mit weiteren bisher nicht beschriebenen

Zellrezeptoren den Viruseintritt in die Wirtszelle vermitteln [Isaacson et al.,

2007].

Nach endocytotischer Fusion (Penetration) des HCMV mit der Wirtszelle lagert

sich das unumhüllte Viruscapsid an die Mikrotubuli (Proteinfilamente des

Cytoskeletts) an und wird zur Kernpore transportiert [Compton, 2004; Evers et

al., 2004]. Dort wird das Virusgenom in den Kern entlassen und zirkularisiert

extrachromosomal (episomale DNA). Das Virusepisom wird während der

Latenz zeitgleich zum Wirtszellgenom von viralen DNA-Polymerasen repliziert

[Modrow et al., 2003].

Bei Reaktivierung latenter Viren oder nach Fusion des Virus mit der Wirtszelle

infolge einer Primärinfektion werden virale immediate early (IE)-Proteine

exprimiert (s. Abb. 2.1). Diese Proteine stellen virale Transaktivatoren (z. B.

Phosphokinasen) dar, die mit transkriptionellen Aktivatoren an Promotoren der

viralen Gene gebunden werden und anschließend die virale Transkription

Stand des Wissens

- Seite 6 -

einleiten. Die virale m-RNA wird im Zytoplasma translatiert und die expri-

mierten IE-Proteine aktivieren im Kern die Promotoren der delayed early (DE)-

Gene. Bei den exprimierten DE-Proteine handelt es sich um Enzyme und

nucleinsäurebindende Proteine, die für die Replikation des Virusgenoms

erforderlich sind. Die virale Replikation erfolgt nach dem rolling circle

Mechanismus zeitgleich mit der Expression später Virusproteine (late (L)-

Proteine). Die zusammengesetzten infektiösen Viruspartikel werden zur

Zelloberfläche transportiert und freigesetzt. Die Virusausbreitung kann auch

über Zell-Zell-Kontakt von tegumenthaltigen viralen Nucleocapsiden oder

durch Zellfusion infizierter Wirtszellen erfolgen [Modrow et al., 2003; Evers et

al., 2004].

Abb. 2.1 Replikationszyklus des β-Herpesvirus HCMV mit der Expression verschiedener viraler Proteine (immediate early-(IE), delayed early-(DE), late-(L) Proteine in zeitlicher Abfolge

2.1.2 Virustatika

2.1.2.1 Synthetische Virustatika

Zur Behandlung von HCMV-Infektionen können synthetische Virustatika

hinsichtlich ihrer Wirksamkeit (Inhibierung der viralen DNA-Replikation, der

viralen Proteinkinase und viraler Proteasen) eingeteilt werden (Tab. 2.1).

Das Nucleosidanalogon Ganciclovir stellt das am häufigsten eingesetzte

Virustatikum bei akuten HCMV-Infektionen dar. Es wird durch die virale

Stand des Wissens

- Seite 7 -

Proteinkinase pUL97 phosphoryliert und anschließend von den viralen DNA-

Polymerasen in Konkurrenz zu natürlichen Nucleosiden in den viralen DNA-

Strang eingebaut, wodurch ein Kettenabbruch der viralen DNA-Synthese

resultiert [Snoeck et al., 1988; Littler et al., 1992; He et al., 1997].

Bei längeren Behandlungszeiten mit Ganciclovir sind jedoch zunehmende

Resistenzen des Virus gegenüber diesem Präparat beobachtet worden [Erice et

al., 1989; Drew et al., 1991]. Die Ganciclovirresistenz beruht zumeist auf einer

Mutation im Gen der viralen Proteinkinase pUL97, wodurch keine

Phosphorylierung des Ganciclovir erfolgen kann [Baldanti et al., 1996]. Solche

Virustatikaresistenzen, basierend auf einer Mutationen im Virusgenom, sind

nicht nur bei Behandlungen mit Ganciclovir sondern auch bei weiteren

Therapeutika (z. B. Maribavir) beobachtet worden [Chou et al., 2007].

Tab.2.1 Verschiedene synthetische Virustatika gegen HCMV und dazugehörige Wirktargets

Virale Wirktargets Virustatika Literatur

DNA-Replikation Nucleosidanaloga

� Ganciclovir [Snoeck et al., 1988; Littler et al., 1992;

Sullivan et al., 1992; He et al., 1997;

Modrow et al., 2003]

Pyrophosphatanaloga

� Foscarnet [Snoeck et al., 1988; Modrow et al., 2003]

� Cidofovir [Snoeck et al., 1988; Modrow et al., 2003].

Proteinkinase pUL97 Indolcarbazol-Derivate [Horton et al., 1994; Slater et al., 1999;

Marschall et al., 2001, 2002]

Maribavir

(Benzimidazol-L-Riboside)

[Chulay et al., 1999; Biron et al., 2002]

Proteasen β-Lactamderivate [Yoakim et al., 1998; Gerona-Navarro et

al., 2004]

andere Artesunate

(Aminoquinolin)

[Efferth et al., 2002; Kaptein et al., 2006]

Aufgrund auftretender Resistenzen von HCMV gegenüber herkömmlichen,

antiviralen Medikamenten und der geringen kommerziellen Verfügbarkeit

selektiv wirksamer Virustatika ist die Entwicklung neuer antiherpaler bzw.

antiviraler Medikamente mit einem möglichst veränderten Wirkmechanismus

von Bedeutung [Groene, 1998]. Naturstoffe besitzen aufgrund ihrer Struk-

turvielfalt einen hohen Stellenwert im Drug Discovery. Potentielle antivirale

Stand des Wissens

- Seite 8 -

Wirkstoffkandidaten sind im Rahmen von zahlreichen Screeningprogrammen

aus marinen und phototrophen Mikroorganismen isoliert worden und werden

im Folgenden genauer beschrieben.

2.1.2.2 Natürliche antivirale Wirkstoffkandidaten

SULFATIERTE POLYSACCHARIDE

Aus dem Kultivierungsüberstand der Rotalge Porphyridium purpureum sind

sulfatierte Exopolysaccharide (EPS) mit der mittlere Molmasse 1,9 bis

3,3*106 g mol-1, einer Monomerzusammensetzung aus D-Galactose, L-Galactose,

D-Glucose, D-Xylose, D-Glucoronsäure und einem Sulfatanteil von 8,6 %

isoliert worden, die eine Aktivität gegen HCMV (Inhibition Concentration of 50 %

(IC50) ≤ 100 µg ml-1 nach 3 d post infectum (p. I.) DE-POX, Cytotoxic Concentration

of 50 % (CC50,MRC-5-Zellen) > 5000 µg ml-1 nach 1 d p. I. WST-1-Test), HHV-6A (IC50 ≤

25 µg ml-1 1 d p. I. real-time PCR, CC50,HSB-2-Zellen > 5000 µg ml-1 nach 1 d p. I.

WST-1-Test) und Vaccinia Virus aufweisen [König, 2006]. Weiterhin sind aus

der Zellwand von Porphyridium sp. sulfatierte Polysaccharide mit einer

mittleren Molmasse 2,3*106 g mol-1 extrahiert worden, welche die Herpesviren

HSV-1 und HSV-2 inhibieren [Huheihel et al., 2002; Geresh et al., 2002 a].

Calcium-Spirulan, ein sulfatiertes Polysaccharid aus dem Cyanobakterium

Arthrospira platensis bestehend aus den Monomeren Rhamnose, Methyl-

rhamnose, Dimethylrhamnose, Methylxylose, Uronsäure, mit einem Schwefel-

gehalt von 5,7 % und einer mittleren Molmasse von 7,46*104 g mol-1 zeigt

antivirale Aktivitäten gegen HSV-1, HCMV, Masern, Mumps, Influenza und

Human Immunodeficiency Virus (HIV)-1 [Hayashi et al., 1996; Hayashi and

Hayashit, 1996; Lee et al., 1998]. Neuartige extrazelluläre Polysaccharide

(Monomerzusammensetzung des EPS mit Glucose, Rhamnose, Methyl-

rhamnose, Xylose, Mannose, Galactose, Glucuronsäure) aus diesem Cyano-

bakterium inhibieren die Viren HCMV (IC50 4 µg ml-1 nach 3 d p. I. DE-POX,

CC50,MRC-5 > 5000 µg ml-1 nach 1 d p. I. WST-1-Test), HSV-1 (IC50 2,4 µg ml-1

4 d p. I. Plaqueassay), HHV-6 und HIV-1 (IC50 3,2 µg ml-1 5 d p. I. GFP-HIV-

Assay) [König, 2006; Rechter et al., 2006].

Die Wirkung sulfatierter Polysaccharide basiert bei einer Vielzahl behüllter

Viren auf der Inhibierung der viralen Adsorption/Fusion. Auch für die sulfa-

tierten Exopolysaccharide aus P. purpureum und die intra- und extrazellulären

Stand des Wissens

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Polysaccharide aus A. platensis ist die Inhibierung dieser initialen Schritte der

Virusreplikation am Beispiel von HCMV gezeigt worden [Rechter et al., 2006;

Thulke, 2007]. Untersuchungen von Neyts et al.[Neyts et al., 1992] zeigen, dass

die Inhibierung von HCMV durch sulfatierte Polysaccharide auf deren

Interaktion mit den Viren beruht und damit die Adsorption des Virus an die

Heparansulfatproteoglycane der Wirtszellen verhindert wird.

In Versuchen mit HIV und deren Wirtszellen (T-Zellen) ist ebenso die

Adsorptions-/Fusionsinhibierung durch sulfatierte Polysaccharide nachgewie-

sen worden. Dabei interagieren die sulfatierten Polysaccharide z. B. mit den

positiv geladenen Aminosäuren der V3 Loop Domain des HIV-1-Glycoproteins

gp 120. Das virale Glycoprotein gp 120 kann damit nicht mehr an den Ober-

flächenrezeptor CD4 der T-Zellen binden, wodurch der Adsorptionsprozess des

Virus an die Wirtszellen blockiert wird [Callahan et al., 1991; Batinić and Robey,

1992].

OLIGOSACCHARIDSPEZIFISCH BINDENDE PROTEINE

Als weitere potentielle Wirkstoffgruppe sind oligosaccharidspezifisch bindende

Proteine (Lektine) aus Cyanobakterien und Pflanzen identifiziert worden.

Dabei inhibieren die mannosespezifischen Pflanzenlektine das HCMV (IC50-

Konzentrationsbereich 0,9 bis 1,6 µg ml-1) sowie die HI-Virusadsorption an die

Wirtzelle (IC50 0,2 bis 0,6 µg ml-1) [Balzarini et al., 1991].

Cyanovirin-N ist ein Lektin mit 101 Aminosäuren, das aus Nostoc ellipsosporum

isoliert worden ist. Es bindet spezifisch an Oligomannosestrukturen des gp120

von HIV und inhibiert die Adsorption des Virus an die Wirtszelle [Boyd et al.,

1997; Bewley et al., 2004]. Die rekombinate Proteinexpression von Cyanovirin-N

in Lactobacillus jensenii (Ausbeute 4-5 µg ml-1) bietet ein potentiell anwendbares,

präventiv wirksames Drug-Delivery-System für den in vivo Einsatz in der

vaginalen Schleimhaut [Lagenaur et al., 2005].

Weitere Lektine, wie Scytovirin aus dem Cyanobakterium Scytonema varium,

Griffithsin aus der Rotalge Griffithsia sp. und das Lektin mit der Bezeichnung

MVL aus Microcystis viridis, weisen einen ähnlichen Wirkmechanismus wie

Cyanovirin-N auf und inhibieren die Virusadsorption [Bokesch et al., 2003;

Bewley et al., 2004; Mori et al., 2005].

Stand des Wissens

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SULFOQUINOVOSYLDIACYLGLYCERIDE

Die Wirkstoffgruppe der Sulfoquinovosyldiacylglyceride (SQDG) ist 1989 vom

National Cancer Institute als potentiell antiviral eingestuft worden [Gustafson

et al., 1989]. Als Zielstrukturen der vorliegenden Arbeit wird die Stoffklasse der

SQDG nachfolgend im Kap. 2.2 genauer erläutert.

2.1.3 Drug Discovery

2.1.3.1 Target Zytotoxizität

Potentielle antivirale Komponenten müssen zunächst hinsichtlich ihrer zyto-

toxischen Wirkung untersucht werden. Dazu sind verschiedene Zyto-

toxizitätstests entwickelt worden, die im folgenden kurz vorgestellt werden.

Der Resazurintest basiert auf der Umsetzung des blauen, nicht fluores-

zierenden Resazurin zum fluoreszierenden Farbstoff Resofurin durch zelluläre

Reduktasen [Carter et al., 1956]. Das Resofurin wird weiter zum farblosen

Hydroresofurin metabolisiert. Aufgrund der Membrangängigkeit von Edukten

und Produkten wird der Resazurintest zur Bestimmung der Proliferation von

Säugerzellen eingesetzt [Ahmed et al., 1994; Meier, 2006].

Der WST-1 Test sowie der MTT-Test beruhen auf der metabolischen Verstoff-

wechselung der Tetrazoliumsalze MTT bzw. WST-1 zu colorimetrisch mess-

baren Formazanfarbstoffen durch die mitochondrialen Dehydrogenasen. Die

messbare Extinktion des gebildeten Formazanfarbstoff ist dabei proportional

zur eingesetzten Zellzahl. Im Gegensatz zum Resazurintest handelt es sich bei

dem WST-1 bzw. dem MTT-Test um Endpunktbestimmungen, da die Zellen

durch die gebildeten Metabolite irreversibel geschädigt werden [Mosmann,

1983; Berridge et al., 1996].

Der Neutralrot-Assay basiert auf der Akkumulation des Neutralrotes in den

Lysosomen lebender Zellen. Nach Extraktion des Farbstoffes aus den Zellen

korreliert die spektroskopisch ermittelte Farbstoffquantität mit der Anzahl

lebender Zellen [Parish and Müllbacher, 1983].

Im Gegensatz zu den vorher genannten Assays wird durch die Trypanblau-

färbung die Anzahl toter Zellen erfasst. Durch die veränderte Membrandurch-

lässigkeit abgestorbener Zellen dringt der Azofarbstoff in tote Zellen ein und

färbt diese blau. Vitale Zellen werden nicht gefärbt. Die mikroskopische

Stand des Wissens

- Seite 11 -

Bestimmung der Zellzahlen (Lebend- und Gesamtzellzahlen) und die daraus

ermittelbare Vitalität ist dabei auf Zellen in Suspension beschränkt.

Der Lactat-Dehydrogenase (LDH)-Assay (LDH, EC 1.1.1.27) erfasst die Akti-

vität der aus toten oder verletzten eukaryotischen Zellen freigesetzten LDH.

Das Enzym LDH ist eine Dehydrogenase und katalysiert die photometrisch

messbare Reaktion der Übertragung eines Hydrids von Lactat auf Nicotinamid-

Adenin-Dinucleotid (NAD+) [Decker and Lohmann-Matthes, 1988; Legrand et

al., 1992].

2.1.3.2 Target HIV-Reverse Transkriptase

Retroviren sind Ursache vieler Krankheiten bei Tieren und Menschen. Als

erstes Retrovirus ist das T-Zell-Leukämie-Virus, welches bei erwachsenen

Menschen Krebserkrankungen (T-Zell-Leukämien) hervorruft, beschrieben

worden [Poiesz et al., 1980; Gallo, 1986]. Der bekannteste Vertreter in dieser

Gruppe ist das HIV, welches als Erreger der erworbenen Immunschwäche-

krankheit AIDS (aquired immunodeficiency syndrom) identifiziert worden ist

[Chermann et al., 1983]. Alle Retroviren sind durch das Enzym Reverse

Transkriptase (RT, EC 2.7.7.49) charakterisiert, welches die virale RNA in

doppelsträngige DNA transkribiert [Baltimore, 1970; Temin and Mizutani,

1970]. Die meisten der verschiedenen AIDS-Therapien nutzen unter anderem

die HIV-RT als Target für die Behandlung [Goff, 1990]. Von den kommerziell

erhältlichen Präparaten sind 11 der zugelassenen 20 Präparate (keine Kombi-

nationspräparate) Inhibitoren der Reverse Transkriptase [Arastéh et al., 2004].

Das Enzym HIV-RT stellt einen Heterodimer dar, welcher virusspezifisch ist

und zwei enzymatische Aktivitäten vereint. Die RNA-abhängige DNA-Poly-

merase-Funktion der RT synthetisiert nach Vorlage der RNA zunächst einen

RNA-DNA-Hybridstrang. Die RNA-Strang wird anschließend durch die

RNAseH-Aktivität der RT hydrolysiert und der zweite DNA-Strang durch die

DNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität der RT zum DNA-Doppelstrang

vervollständigt [Hizi et al., 1991].

Die Inhibitoren der enzymatischen RT-Aktivität können nach ihrem Wirk-

mechanismus in verschiedene Gruppen unterteilt werden:

i) Die Nucleosid Reverse Transkriptase Inhibitoren (NRTIs), die auch als

Basenanaloga bekannt sind, binden an das aktive Zentrum des Enzyms in

Stand des Wissens

- Seite 12 -

Konkurrenz zu den natürlichen Nucleotiden (kompetitive Hemmung)

[Mitsuya and Broder, 1987].

ii) Die Polynucleotidanaloga hemmen die Aktivität des Enzyms kompetitiv,

in dem sie an den Primer, das Template oder an beiden binden.

iii) Nicht-Nucleosid Reverse Transkriptase Inhibitoren (NNRTIs) interagieren

mit dem allosterischen Zentrum des Proteins und inhibieren das Enzym

nicht-kompetitiv [Goff, 1990; De Clercq, 2005]. Das allosterische Zentrum

ist dabei nahe der Substratbindungsstelle des Enzyms lokalisiert [Tantillo

et al., 1994].

Die NRTIs (Basenanaloga) stellen auch bei der Behandlung von HIV die Wirk-

stoffe mit der höchsten klinischen Relevanz dar [Chandra et al., 1985; Mitsuya

and Broder, 1987]. Sie weisen eine hohe Affinität zu viralen Polymerasen, aber

nicht zu den DNA-Polymerasen der Wirtszellen auf [Furmann et al., 1986; Fischl

et al., 1987]. Längere Behandlungszeiten können jedoch in einer gesteigerte

Produktion von resistenten HIV-Stämmen resultieren [Larder et al., 1989].

2.1.3.3 Target Humanes Cytomegalievirus

Das Screening nach neuen antiviralen Komponenten und die Testung von

Medikamentenresistenzen klinischer HCMV-Stämme erfordert Assays, die eine

zeitnahe kostengünstige Auswertung ermöglichen. Der allgemein bekannte

Plaqueassay ist durch neue Technologien, die eine parallele Probenbearbeitung

ermöglichen, ersetzt worden.

Bei der peroxidasegekoppelten Antikörperfärbung werden exprimierte

HCMV-Proteine (IE, DE oder andere) in infizierten Zellen detektiert. Zunächst

bindet ein monoklonaler Antikörper an das virale Protein. Anschließend bindet

ein zweiter polyklonaler, Peroxidase (POX)-gekoppelt Antikörper an den

primären. Durch eine POX-vermittelte Reaktion mit Farbstoffen (z. B. 3, 3´, 5, 5´-

Tetramethylbenzidin) und dem Katalysator Wasserstoffperoxid können

entsprechend der Quantität der Antikörper bzw. der infizierten Zellen

spektroskopisch messbare Farbumsetzungen erzielt werden. In Assays mit

wasserunlöslichen, visuell sichtbaren POX-Produkten präzipitiert das Farb-

stoffprodukt in den infizierter Zellen, so dass die Viruslast mikroskopisch

bestimmt werden kann [Thulke, 2007].

Stand des Wissens

- Seite 13 -

Bei der Auswertung einer Antikörperfärbung mit Fluorescence Activated Cell

Sorting (FACS) müssen die Zellen in Suspension vorliegen. Die Antikörper-

färbung erfolgt analog der POX-Färbung jedoch mit einem fluoreszenz-

gekoppelten zweiten Antikörper. Die Auswertung gibt das Verhältnis

infizierter Zellen (Fluoreszenzsignal) zu nicht infizierten Zellen (kein Fluores-

zenzsignal) an. Die Durchführung der FACS-Analytik mit Antikörpern gegen

zeitlich verschieden exprimierte virale Proteine (unterschiedliche Fluoreszenz-

marker) ermöglicht die Bestimmung des Status im Replikationszyklus. Nach

der Virusadsorption/–fusion und vor Beginn der viralen Replikation können

ausschließlich IE-Proteine detektiert werden [Schols et al., 1989].

Die real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) ermöglicht die Quanti-

fizierung der viralen DNA bezogen auf die zelluläre DNA. Diese Methodik zur

Bestimmung der Viruslast erfordert die Extraktion der DNA infizierter Zellen

[Nitsche et al., 1999; Thulke, 2007].

Marschall et al. etablierten einen Green Fluorescent Protein (GFP)-Assay mit

gentechnisch verändertem HCMV, das während der Replikation rekombinantes

GFP exprimiert. Die Zellen werden nach einer bestimmten Inkubationszeit zur

Freisetzung des intrazellulär gebildeten GFP lysiert. Die detektierte Menge an

GFP korreliert dabei mit der Anzahl infizierter Zellen [Marschall et al., 2000].

2.2 Sulfoglycolipide als pharmazeutische Wirkstoffkandidaten

2.2.1 Sulfoquinovosyldiacylglyceride – Struktur und Vorkommen

Sulfoquinovosyldiacylglyceride (1,2-di-O-acyl-3-O-(6´-deoxy-6´-sulfo-D-glyco-

pyranosyl)-sn-glycerol) [Benson et al., 1959; Daniel et al., 1961; Miyano and

Benson, 1962] sind anionische Lipide, die der Strukturgruppe der Sulfoglyco-

lipide zugeordnet werden. Die Moleküle bestehen aus (1) einem Glycerolgerüst,

(2) den sn-1 und sn-2 veresterten Fettsäuren und (3) dem an sn-3 Position

glycosidisch gebundenem Sulfonozucker (Sulfoquinovose, Abb. 2.2). Der Dipol-

charakter ist durch die lipophilen Fettsäuren und die hydrophile, anionische

Sulfoquinovose gegeben [Benson, 1963]. Natürliche SQDG-Moleküle weisen

ausschließlich die α-anomere Glycosidkonformation auf [Matsumoto et al.,

2002].

Stand des Wissens

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In dem Cyanobakterium Scytonema sp. sind zudem zweifach acylierte SQDG

(Ac2-SQDG) mit zusätzlichen Palmitoylresten an der 2´ und 3´ Position der

Sulfoquinovose nachgewiesen worden (Abb. 2.2) [Reshef et al., 1997].

Abb. 2.2 Strukturen von SQDG (links) und Ac2-SQDG (rechts)

SQDG sind auf der Erde neben Glutathion, Cystein und Methionin die häufig-

sten vorkommenden schwefelhaltigen organischen Verbindungen [Harwood

and Nicholls, 1979; Heinz, 1993]. Das Vorkommen der SQDG ist in

verschiedenen Cyanobakterien (Lyngbya lagerheimii [Gustafson et al., 1989],

Oscillatoria raoi [Reshef et al., 1997], dem Nichtschwefelbakterium Rhodobacter

sphaeroides [Gage et al., 1992], Mikroalgen (Heterosigma caterae [Keusgen et al.,

1997], Pavlova lutheri [Eichenberger and Gribi, 1997]), Makroalgen (Gigartina

tenella [Ohta et al., 1998]) und der Pflanze Spinacia oleeracea (Spinat) [Gage et al.,

1992] bestätigt worden.

Die SQDG stellen dabei zusammen mit den Phosphatidylglycerolen wichtige

Bestandteile der Thylakoidmembran photosynthetisch aktiver Organismen dar

und stabilisieren dabei die laminare Lipidphase dieser Membran [Webb and

Green, 1991]. Obwohl ein Zusammenhang zwischen photosynthetischer Akti-

vität von Organismen und der SQDG-Bildung in der Thylakoidmembran

abgeleitet werden kann, produzieren einige phototroph wachsende Organis-

men, wie z. B. Gloeobacter violaceus PCC7421, keine SQDG [Selstam and

Campbell, 1996].

2.2.2 SQDG – Biosynthese und Funktion

Die Biosynthese der SQDG erfordert die Verfügbarkeit von UDP-Sulfo-

quinovose und 1,2-Diacylglycerol (DAG). Beide Precursoren werden durch

Sulfoquinovosyltransferase (EC 2.4.1) miteinander zu SQDG verknüpft [Heinz et

al., 1989; Seifert and Heinz, 1992].

UDP-Sulfoquinovose resultiert aus der Reaktion von Sulfit und UDP-4-oxo-

Glucose-5-en [Pugh et al., 1995]. Ausgehend von Sulfit wird Sulfat-Adenosin-5´-

Stand des Wissens

- Seite 15 -

Phosphosulfat (APS) durch das Enzym ATP-Sulfurylase (EC 2.7.7.4) gebildet

und von der APS-Kinase (EC 2.7.1.25) zu Adenosin-3´-phosphate-5´-phospho-

sulfat (PAPS) umgesetzt (Abb. 2.3) [Bandurski et al., 1956; Robbins and

Lipmann, 1956; Mercer and Thomas, 1969]. Das so vorliegende Sulfat wird

durch eine ferredoxinabhängige PAPS-Reduktase (EC 1.8.4) zu Sulfit reduziert

und das Sulfit abschließend auf das Molekül UDP-4-oxo-Glucose-5-en

übertragen.

Abb. 2.3 Verlauf der SQDG-Biosynthese

Für die Biosynthese von SQDG in photosynthetisch aktiven Organismen wird

eine Koregulation mit dem Anabolismus der Phospholipide der Thylakoid-

membran postuliert [Essigmann et al., 1998]. Eine Phosphatlimitation im

Kulturmedium des phototrophen Mikroorganismus R. sphaeroides resultiert

dabei in der Reduktion der Ausbeute an acidischen Phospholipiden wie z. B.

Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylglycerol (PG) und Phosphatidyl-

cholin (PC) sowie einer Steigerung der Ausbeute von SQDG [Benning et al.,

1993]. In der Pflanze A. thaliana kann auch bei Variation der Phosphatkonzen-

tration ein konstantes Verhältnis der anionischen Thylakoidmembranlipide PG

und SQDG zur Gesamtlipidmenge von etwa 0,2 bestimmt werden. In weiter-

führenden genetischen Untersuchungen der Pflanze ist eine erhöhte Expression

der SQDG-Gene beim Wachstum unter phosphatlimitierenden Bedingungen

nachgewiesen worden [Essigmann et al., 1998].

Stand des Wissens

- Seite 16 -

Experimente mit einer SQDG-defizienten Nullmutante von R. sphaeroides und

Synechococcus sp. (PCC7924) bestätigen die Funktion der SQDG als Substituent

des Phospholipids in der Thylakoidmembran. SQDG-defiziente Nullmutanten

zeigen unter phosphatlimitierenden Bedingungen im Vergleich zum Wildtyp

eine Wachstumslimitierung, die unter optimalen Bedingungen nicht beobachtet

werden kann [Benning et al., 1993; Güler et al., 1996].

In verschiedenen photosynthetisch aktiven Spezies, wie z. B. Chlamydomonas

reinhardtii, sind die SQDG für die uneingeschränkte Funktion des Photosys-

tems II (PS II) notwendig. In defizienten SQDG-Mutanten ist über die Messung

der Sauerstoffbildung im Vergleich zum Wildtyp eine Reduktion der PS II-

Aktivität von 40 % nachgewiesen worden [Sato et al., 1995 a]. Untersuchungen

belegen eine stabilisierende Wirkung der SQDG für die aktive Konformation

des PS II, besonders für das D1-Polypeptid, das für eine maximale Aktivität des

PS II im Zusammenhang mit dem Elektronentransport notwendig ist [Minoda

et al., 2003]. Weiterhin sind SQDG endogene Bindungspartner für die

Untereinheiten des im PS II-verankerten Cytochrom b6/f (Cyt b6/f)–Komplexes

(Wasserstoffbrückenbindung mit Arg12 und Asn17 des Riesky-Protein, Lys272 des

Cyt f). Es wird vermutet, dass die Komplexbildung der Cyt b6/f-Untereinheiten

für die Aktivierung der Translation von Cyt f notwendig ist [de Vitry et al.,

2004].

Eine weitere Bedeutung zeigen SQDG bei der funktionellen Stabilität des PS II

zur Hitzeresistenz. SQDG-defiziente Chlamydomonas rheinhardtii haben nach

Temperierung von 28 °C auf 41°C (120 min, dunkel) eine Reduktion der PS II-

Aktivität um 50% (Vergleich Wildtyp 30%) gezeigt. Nach Reaktivierung durch

Beleuchtung ist in den Mutanten sowohl bei Temperaturreduktion als auch bei

Fortführung der Kultivierungen bei 41 °C eine Aktivität von 70 % des Aus-

gangswertes (Wildtyp 90%) gemessen worden [Sato et al., 2003].

2.2.3 Pharmazeutisches Potential der SQDG

Nach Durchführung einer bioassay-guided-fractionation am National Cancer

Institute sind die aufgereinigten SQDG aus den Cyanobakterien Lyngbya

lagerheimii, Phormidium cebennse, Oscillatoria raciborskii, Scytonema burmanica,

Calothrix elenkinii und Anabaena variabilis als antiviral aktive Substanzen gegen

das HIV identifiziert worden. Die antivirale Wirkung der SQDG ist in

Stand des Wissens

- Seite 17 -

verschiedenen zellkulturbasierten biologischen Testassays nachgewiesen

worden. SQDG führen konzentrationsabhängig zur Reduktion des zyto-

pathischen (zellpathogenen) Effektes in verschiedenen HIV-infizierten

humanen Lymphoblastenzelllinien. Weiterhin ist mit steigender SQDG-

Konzentration eine reduzierte Bildung von Synzitien (virale Zell-Zell-Infektion)

und eine verringerte Expression des viralen Proteins p24 (Antigen der HI-

Virushülle) beobachtet worden. Die Varianz der Fettsäurespektren der

getesteten SQDG (C18:3/C16:0, C18:2/C16:0, C18:1/C16:0, C16:1/C16:0) hat

keinen Einfluss auf die antivirale Aktivität gezeigt [Gustafson et al., 1989].

Weiterführende Untersuchungen hinsichtlich der anti-HIV-Wirkung von SQDG

sind mit dem Enzym HIV-1-Reverse Transkriptase (HIV-RT) durchgeführt

worden. Im enzymatischen Assay mit HIV-RT inhibieren SQDG-haltige

Extrakte aus den Cyanobakterien Scytonema sp., Phormidium tenue, Oscillatoria

limnetica, O. raoi, O. trichoides (Konzentration > 10 µgSQDG ml-1) die Enzym-

aktivität bis zu 90 %. Die enzymatische HIV-RT-Aktivität wird durch

SQDG C18:1/C16:0 isolierte aus diesen Cyanobakterien mit einer Konzentration

von 24 nM um 50 % reduziert [Reshef et al., 1997; Loya et al., 1998]. Im Wider-

spruch zu den Ergebnissen des zellkulturbasierten antiviralen Assays

[Gustafson et al., 1989] ist dabei ein Einfluss des Fettsäurespektrums der SQDG

auf die inhibierende Wirkung beobachtet worden. Eine zunehmende Ketten-

länge der im SQDG-Molekül inkorperierten Fettsäuren resultiert in einer

geringeren Inhibierung der Enzymaktivität. Die Ac2-SQDG weisen im Vergleich

zu den SQDG eine verringerte inhibierende Aktivität gegen HIV-RT auf. In

enzymatischen Untersuchungen mit Sulfoquinovosylglyceriden (SQG) kann

keine Inhibierung der HIV-RT nachgewiesen werden. Daher wird postuliert,

dass bei der Inhibierung des Enzymes die Acylreste von SQDG mit dem

hydrophoben Teil der HIV-RT und die Sulfonogruppen mit den positiv

geladenen Seitenketten des Enzyms interagieren [Loya et al., 1998].

Weitere biologische Untersuchungen mit SQDG belegen eine antineoplastische

(tumorwachstumshemmende) Wirkung dieser Verbindungsklasse. SQDG inhi-

bieren die enzymatischen Aktivitäten der DNA-Polymerasen pol α und pol β

[Ohta et al., 1998; Hanashami et al., 2000]. Die DNA-Polymerase pol α repliziert

sowohl die nucleare als auch die mitochondriale DNA, pol β ist hingegen für die

DNA-Reparatur und Rekombination zuständig. Der Zusammenhang zwischen

Stand des Wissens

- Seite 18 -

antineoplastischer Aktivität und Molekülstruktur der SQDG ist bei der

Inhibierung der DNA-Polymerase erkennbar, da bei den untersuchten synthe-

tisch gewonnenen SQDG (C14:0/C14:0, C16:0/C16:0, C18:0/C18:0) die zuneh-

mende Kettenlänge der veresterten Fettsäuren mit der Inhibierung der

enzymatischen DNA-Polymerase-Aktivität korreliert [Hanashami et al., 2000].

Die Sulfonogruppe der SQDG ist für die Inhibierung der DNA-Polymerasen

essentiell, da Molekülstrukturen mit abgespaltener Sulfonogruppe keine

Wirksamkeit zeigen [Hanashami et al., 2000; Murakami et al., 2002]. Die

synthetisch hergestellten anomeren Konformationen α-SQDG und β-SQDG mit

gleichem Fettsäurespektrum variieren nicht in ihrer Wirksamkeit [Hanashami et

al., 2000].

Die Inkubation der synthetischen α-SQDG C18:0/C18:0 und β-SQDG

C18:0/C18:0 mit der humanen Magenkrebszelllinie NUGC-3 zeigt entgegen den

postulierten Erwartungen nach der Inhibierung der DNA-Polymerasen keine

verminderte Proliferation der Zellen in vitro. Das α-Sulfoquinovosylmono-

acylglyceride (SQMG) C18:0 und das β-SQMG C18:0 hingegen inhibieren das

Wachstum dieser Zelllinie. Für die SQMG-behandelten Zellen ist dabei nach-

gewiesen worden, dass sie in die G1-Phase des Zellzyklus übergehen und das

apoptoseassoziierte Enzym Caspase-3 vermehrt bilden [Murakami et al., 2002;

Murakami et al., 2003]. Als mögliche Ursache der unterschiedlichen Wirk-

samkeit von SQDG und SQMG wird angenommen, dass SQDG die DNA-Poly-

merasen nicht inhibieren [Hanashami et al., 2000; Murakami et al., 2003].

Die Inkubation von Zellen weiterer humaner Krebszelllinien (HELA, W14) mit

α-SQDG (C16:0/C16:0, C18:0/C18:0) und β-SQDG (C16:0/C16:0, C18:0/ C18:0)

zeigt bis zu einer Konzentration von 100 µg ml-1 keine zytotoxische Wirkung.

Bei Behandlung dieser Zellen mit SQDG-Konzentration bis 1000 µg ml-1 kann

im Vergleich zu unbehandelten Zellen eine Senkung der Zellvitalität unter 50 %

ermittelt werden [Matsumoto et al., 2002].

Eine immunosuppressive Wirkung synthetischer β-SQDG C18:0/C18:0 wird

durch die verzögerte Abstoßungsreaktion von transplantierter Haut in vivo in

Ratten bestätigt. Diese Verzögerung kann nicht in der Suppression der Immun-

antwort begründet sein, da die an eine Abstoßungsreaktion gekoppelte

Ausbildung spezifischer T-Zellrezeptoren (z. B. CD4 und CD28) in SQDG-

behandelten und unbehandelten Ratten nicht variiert [Matsumoto et al., 2002].

Stand des Wissens

- Seite 19 -

Es ist jedoch die Bindung eines modifizierten ß-SQDG-Moleküls (wasserstabiles

Liposom) an das L-Selektin beobachtet worden. Das kohlenhydratbindende

Membranprotein L-Selektin wird nach einer Entzündung auf dem CD62L-

Zellrezeptors der T-Lymphozyten exprimiert. Die einsetzende Immunreaktion,

die zum Abstoßen der Haut führen würde, wird dabei durch das oberflächen-

aktive SQDG-Liposom supprimiert [Yamamoto et al., 2004].

Die Inhibierung weiterer Selektine ist am Beispiel des P-Selektins durch SQDG

C16:0/C16:0 nachgewiesen worden [Golik et al., 1997]. Das P-Selektin ist ein Ad-

häsionsmolekül zur unterstützenden Bindung von Leukozyten an Endothel-

zellen bei Entzündungsprozessen. Viele Krankheiten, wie z. B. die nach einer

Leberoperation oder –transplantantation häufig auftretende Ischemia Reperfusion

sowie die rheumatische Arthritis, sind mit einer Überfunktion der P-Selektin-

abhängigen Bindung mit den entsprechenden Liganden assoziiert. Ischemia

Reperfusion ist im Versuch mit Ratten durch Applikation von SQDG C18:0/C18:0

reduziert worden. Das eingeschränkte Krankheitsausmaß ist dabei vermutlich

in einer P-Selektininhibierung durch die verabreichten SQDG begründet

[Tsuruma et al., 2004].

2.2.4 Pharmazeutisches Potential weiterer Sulfoglycolipide

Die Sulfoglycolipide 2-Palmitoyl- und 2-Stearoyl-3-hydroxyphthioceranoyl-2´-

sulfate-α-α´-D-trehalose (Ac2SGL, Abb. 2.4) stellen potentielle Impfstoffkan-

didaten zur Vorbeugung einer Mycobacterium tuberculosum-Infektion dar. Die

aus den Mycobakterien isolierten Ac2SGL werden von den T-Zellen als Antigen

erkannt und stimulieren das Wachstum Ac2SGL-spezifischer T-Zellen (aktive

Impfung). Für das Auslösen der zellulären Immunantwort durch Ac2SGL sind

die Sulfatgruppe und die zwei veresterten Fettsäuren in der Molekülstruktur

essentiell [Gilleron et al., 2004].

Seminolipide sind weitere Vertreter der Sulfoglycolipide. Sie weisen in der

Molekülstruktur ein Glycerolgerüst mit sn-1-verknüpftem Alkylrest, sn-2veres-

tertem Acylrest und einem sulfatierten Zucker (3´-Position des Sulfats) auf

(Abb. 2.4). Seminolipide beeinflussen als wichtige Oberflächenglycolipide der

Spermatocyten die Spermatogenese in Säugetieren. Knock-out Mäuse, denen

das Enzym zur Bildung dieser Moleküle fehlt, sind nicht fähig die Sperma-

tocyten meiotisch in haploide Zellen (Spermatiden) zu differenzieren. Der

Stand des Wissens

- Seite 20 -

Zellteilungsprozess stoppt in der Metaphase der ersten Meiose, so dass weder

Spermatiden noch durch Morphogenese funktionsfähige Spermien gebildet

werden können [Fujimoto et al., 2000; Honke et al., 2002].

Abb. 2.4 Chemische Struktur der Sulfoglycolipide Ac2SGL (links) und Seminolipide (rechts)

2.2.5 Strukturcharakterisierung - MALDI trap ToF Hybrid MSn

Die matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) ist eine schonende

Methode zur Ionisation von Biomolekülen. Der Analyt wird dabei mit einer

chromophortragenden Matrix kokristallisiert. Durch einen Laserbeschuss

absorbiert die Matrix Energie, in dessen Folge Matrix und Analyt-Moleküle

desorbieren. Dieser Vorgang ist mit einem Transfer von Protonen, Natrium-

bzw. Kaliumionen von der Matrix auf den Analyten begleitet [Karas and

Hillenkamp, 1988; Hillenkamp et al., 1991]. Die dabei entstehenden Ionen

werden fokussiert und entsprechend ihres Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) in

einem Flugrohr beschleunigt. Die Zeit (Time of Flight, ToF), die ein Ion bis zu

seinem Auftreffen in einen Detektor benötigt, wird als charakteristische Größe

in Korrelation zu seinem m/z-Wert erfasst [Cotter, 1992].

Die infolge der Ionisation auftretende Dispersion von Geschwindigkeit und

Richtung von Ionen mit gleichem m/z-Werten wird durch eine Umpolung und

Erhöhung der Beschleunigungsspannung in einem Reflektron reduziert. Diese

Doppelfokussierung ermöglicht die Aufnahme von hochaufgelösten Massen-

spektren.

Das MALDI trap ToF Hybrid MSn Spektrometer verfügt über eine Quadrupole

Ionenfalle (ion trap) zwischen der Ionisationseinheit und des Flugrohres. Die

neuartige Hybridtechnik ermöglicht die Selektion von Ionen nach ihren m/z-

Werten in dieser Ionenfalle. Durch Einleiten eines Kollisionsgases in die

Ionenfalle wird die Fragmentierung der Ionen durch Stoßreaktionen induziert.

Fragmentionen von Interesse können erneut selektiert und weitere Zerfälle

durch einen collision induced decay (CID) eingeleitet werden [Doroshenko and

Cotter, 1997]. Diese Technik erlaubt die Aufnahme von n-dimensionalen

Stand des Wissens

- Seite 21 -

Massenspektren, wodurch eine de novo Strukturaufklärung von Biomolekülen

ermöglicht wird.

2.2.5.1 MALDI ToF in der Lipidanalytik

Neben der klassischen Lipidanalytik durch Kopplung von Kapillargaschro-

matographie und Massenspektrometrie wird bei polar geladenen Lipiden

zunehmend die MALDI ToF Massenspektrometerie bzw. HPLC-ESI-MS ein-

gesetzt [Schiller et al., 2004].

Nachteil der herkömmlich verwendeten, gaschromatographischen Trenn-

methode ist die Notwendigkeit polare Gruppen zu derivatisieren (Methy-

lierung, Silylierung, Oximierung). Die Derivatisierung unterdrückt die intra-

molekulare Ausbildung von Wasserstoffbrücken, so dass die zu unter-

suchenden Lipide in die Gasphase überführt werden können. Da aufgrund der

hohen Siedetemperaturen der polar geladenen Lipide eine Verdampfung der

Moleküle nicht erfolgen kann, ist eine separate Detektion des Glycerolgrund-

gerüstes und der daran veresterten Fettsäuren erforderlich.

Die MALDI ToF Analytik kann insbesondere hinsichtlich der Bestimmung des

Molekulargewichts polar geladener Lipide eingesetzt werden, da durch den

Einsatz einer Matrix die Moleküle vor einer Fragmentierung infolge des Laser-

energieeintrages geschützt werden. Diese Methode ist besonders geeignet, das

Molekulargewicht der Phospholipide zu bestimmen (Tab. 2.2) [Schiller et al.,

2004].

Für die Aufnahme der MALDI trap ToF MSn Hybrid Massenspektren von

Phospholipiden hat sich im positive und negative ion mode die klassische MALDI-

Matrix 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) bewährt [Schiller et al., 1999]. Des

Weiteren findet p-Nitroanilin als Matrix für Phosphatidylethanolamin (PE) und

Phosphatidylcholin (PC) im positive ion mode Anwendung [Rujoi et al., 2004].

Neuartige chromophortragende ionische Liquide ermöglichen als MALDI-

Matrix einen homogenen Liquid-Layer mit dem gelösten Analyten. Im

Vergleich zu klassischen Matrices resultieren daraus infolge der homogeneren

Kokristallisation der Matrix-Analyt-Lösung Massenspektren mit höheren

Signalintensitäten auch bei geringerem Laserenergieeintrag [Mank et al., 2004;

Li et al., 2005]. Die Verwendung von α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure und

Sinapinsäure als Matrices wird aufgrund der schlechteren Ionisierbarkeit der

Stand des Wissens

- Seite 22 -

Phospholipide und der Überlagerung von Matrix- und Analytpeaks nicht

empfohlen [Schiller et al., 2004]. Die MALDI-Analytik von Phospholipiden

(außer PC) kann sowohl im positive als auch im negative ion mode durchgeführt

werden. Phosphatidylcholine können jedoch nur im positive ion mode detektiert

werden [Al-Saad et al., 2003; Li et al., 2005]. Die Aufnahme von Massenspektren

der acidischen Phospholipide Phosphatidylglycerol, Phosphatidylserin und

Phosphatidylinositol ist aufgrund der negativen Molekülladung im negative ion

mode gegenüber der Messung im positive ion mode vorteilhafter [Schiller et al.,

1999; Petkovic et al., 2001].

Tab. 2.2 Übersicht über die chemischen Strukturen der Phospholipide

Grundstruktur Seitengruppen (R3)

Phosphatidsäure (PA)

-H

Phosphatidylcholin (PC)

Phosphatidylethanolamin (PE)

Phosphatidylglycerol (PG)

Phosphatidylserin (PS)

Phosphatidylinositol (PI)

Die Molekülionen im positive ion mode werden aufgrund der Bindungstendenz

von H+ und Na+ an das Glycerolrückrat oder die polare Kopfgruppe häufig als

H+-Addukte und Na+-Addukte detektiert [Asbury et al., 1999]. Das Vorkommen

der Addukte ist abhängig von der Ionenzusammensetzung, den verwendeten

Lösemittel und der eingetragenen Laserenergie. Die Zugabe der Alkalikationen

Na+ oder K+ sowie von 0,1 % Trifluoressigsäure zum Matrixgemisch resultiert in

höheren Intensitäten der Na- ((M+Na)+) bzw. K-Addukte ((M+K)+) und des

Stand des Wissens

- Seite 23 -

Molekülions (M+H)+ [Schiller et al., 1999; Schiller et al., 2001]. Des Weiteren

werden Laser-induzierte Fragmentierungen bei Phospholipiden (außer PC)

beobachtet. Infolge von post source decay (PSD) können am Glycerolgerüst

veresterte Fettsäuren favorisiert an sn-1 Position eliminieren. Die Fragmente

werden dabei nicht als Na-Addukte detektiert [Al-Saad et al., 2001; Al-Saad et

al., 2003].

2.3 Neue Therapeutika aus phototrophen Mikroorganismen

Das Wasser der Ozeane bedeckt 70 % der Erdoberfläche und enthält 90 % der

gesamten Biosphäre. Im marinen Lebensraum sind phototrophe Mikroorganis-

men (Mikroalgen, Cyanobakterien) die wichtigsten Primärproduzenten und

stellen dabei eine einzigartige Quelle von Naturstoffen mit vielfältigen

chemischen Strukturen und verschiedenen biologische Aktivitäten dar. Seit

Beginn der Erforschung des marinen Lebensraum als Quelle potentieller

pharmakologischer Wirkstoffe in den sechziger Jahren sind in verschiedenen

Screeningprogrammen 424 bioaktive Komponenten aus Cyanobakterien bis

zum Jahr 2001 isoliert worden, die eine antivirale, antifungale, herbizide,

immunosuppressive oder anderer biologischer Wirkung aufweisen [Burja et al.,

2001]. Einige dieser Wirkstoffe, wie beispielsweise der ursprünglich aus dem

Cyanobakterium N. ellipsosporum isolierte antivirale Wirkstoff Cyanovirin-N,

befinden sich derzeit in klinischen Studien [Boyd et al., 1997; Bewley, 2001].

2.3.1 Phototrophe Mikroorganismen – Mikroalgen und Cyanobakterien

Die meisten phototrophen Mikroorganismen (Mikroalgen und Cyanobakterien)

verfügen über autotrophen Stoffwechsel und können durch Photosynthese aus

anorganischen Salzen und Kohlendioxid unter Lichteinfluss Biomasse und

Sauerstoff generieren.

MIKROALGEN

Mikroalgen sind eukaryotische Organismen, deren Zellen durch Organellen

(z. B. Chloroplasten, Mitochondrien, Peroxisomen) kompartimentiert sind. Alle

in der Photosynthese beteiligten Zellbestandteile (Thylakoide, lichtabsorbieren-

de Pigmente) sind in Chloroplasten lokalisiert.

Stand des Wissens

- Seite 24 -

Die Einteilung der verschiedenen Mikroalgenspezies in Abteilungen erfolgt

vielfältig nach den vorhandenen Photosynthesepigmenten (z. B. Chlorophyta =

Grünalgen), die das Aussehen der Algen bestimmen. Biochemische Charak-

teristika, wie beispielsweise die Zusammensetzung der Reservestoffe und der

Zellwandbestandteile, werden bei der Taxonomie der Algen ebenso berück-

sichtigt wie deren Morphologie und Zytologie [van den Hoek et al., 1993]. Die

Mikroalgen werden dabei nach van den Hoek in acht Abteilungen untergliedert:

� Chlorophyta

� Cryptophyta,

� Dinophyta,

� Euglenophyta,

� Glaucophyta,

� Haptophyta,

� Heterokontophyta

� Rhodophyta

CYANOBAKTERIEN

Cyanobakterien (Blaualgen, Abteilung Cyanophyta) stellen Eubakterien dar und

können aufgrund ihrer oxygenen Photosynthese als prokaryotische Mikroalgen

bezeichnet werden. Die Cyanobakterien besitzen im Gegensatz zu den eukaryo-

tischen Mikroalgen keine Zellkompartimentierung. Ihr Photosynthesepigment

Chlorophyll a ist an Thylakoide gebunden, die frei im Protoplasma liegen. Ihre

Zellwand besteht aus einer Mureinschicht (Peptidoglucane), die von einer

Lipopolysaccharidschicht überzogen ist.

Die Anzahl der verschiedenen Arten phototropher Mikroorganismen ist

unbekannt, jedoch gehen Schätzungen von circa 50000 existierenden Spezies

aus [Kyle, 1989]. Bisher wurden nur etwa 10 Prozent in vitro kultiviert und zehn

Spezies für kommerzielle Zwecke genutzt. Die Biomasse von phototrophen

Mikroorganismen wird überwiegend für die Anwendung in der Nahrungs-

und Kosmetikindustrie produziert. Im Jahr 1998 sind schätzungsweise bereits

2500 Jahrestonnen Biotrockenmasse von Spirulina als Nahrungsergänzungs-

mittel produziert worden [Osinga et al., 1999].

Stand des Wissens

- Seite 25 -

Den maximalen Anteil am Marktumsatz erzielen die Metabolite aus den

phototrophen Mikroorganismen: β-Carotin, ein antioxidatives Carotinoid aus

der halotoleranten Grünalge Dunaliella salina, findet Anwendung als Lebens-

mittelfarbe [Ben-Amotz, 2003]. Das Carotinoide Astaxanthin, deren Bildung

von der Alge Haematococcus pluvialis unter Stress induziert wird, fördert das

menschliche Immunsystem und beugt Krankheiten des oxidativen Stresses vor

[Guerin et al., 2003; Olaizola and Huntley, 2003]. Ebenso stellen die gebildeten

vielfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) Docosahexaensäure (C22:6, n-3),

Eicosapentaensäure (C20:4, n-3) und Arachidonsäure (C20:4, n6) wichtige

Nahrungsergänzungsmittel auf Basis von phototrophen Mikroorganismen dar,

da sie das Risiko von Herzinfarkt und Entzündungserkrankungen erniedrigen

[von Schacky and Dyerberg, 2001]

2.3.2 Kultivierung phototropher Mikroorganismen

2.3.2.1 Photosynthese

Die Grundlage zur Kultivierung phototropher Mikroorganismen bildet die

Photosynthese. Sie kann in eine lichtabhängige und eine lichtunabhängige

Reaktion (Calvinzyklus) eingeteilt werden. In der Lichtreaktion wird zunächst

das Photosystem II (PS II) durch die Absorption von Licht angeregt. Dabei

werden zwei Elektronen pro aufgenommen Photonen freigesetzt. Zur

Schließung der Elektronenlücke im Reaktionszentrum fungiert Wasser als

Elektronendonator, so dass molekularer Sauerstoff und vier Protonen frei-

gesetzt werden. Die Elektronen werden vom angeregten Zustand über mehrere

Überträgermoleküle (Plastochinon (PQ), Cytochrom b6/f-Komplex (Cyt b6/f)

und Plastocyanin (PC)) zunächst von PS II auf das Photosystem I (PS I) und

nach einer lichtinduzierten Anregung des PS I auf NADPH durch NADP+-

Reduktase übertragen (Abb. 2.5). Die bei der Wasserspaltung und während der

Elektronentransportkette freigesetzten Protonen erzeugen einen Protonen-

gradient zwischen der inneren und der äußerer Thylakoidmembran, der die

ATP-Synthese antreibt.

In der lichtunabhängigen Reaktion wird durch das Enzym Ribulosebisphosphat-

Carboxylase/-Oxygenase (Rubisco) Kohlendioxid fixiert und in weiteren Schritten

Glucose unter Verbrauch von NADPH und ATP gebildet (Abb. 2.5) [Lawlor,

1992].

Stand des Wissens

- Seite 26 -

Abb. 2.5 Vereinfachtes Schema der Photosynthese mit Lichtreaktion und Calvinzyklus

2.3.2.2 Kultivierungsbedingungen

Die verschiedenen Arten der phototrophen Mikroorganismen zeigen hetero-

gene Anforderungen bezüglich der Kultivierungsparameter Lichtintensität,

Temperatur, pH-Wert, Nährmedium mit entsprechender Kohlenstoffquelle und

Salinität. Einige phototrophe Mikroorganismen können zum Kohlendioxid

auch organische Kohlenstoffquellen verwerten und verfügen somit zusätzlich

zum autotrophen Stoffwechsel über einen chemoorganoheterotrophen Stoff-

wechsel (Mixotrophie).

LICHT

Das eingesetzte Licht zur Kultivierung phototropher Mikroorganismen muss

im absorbierbaren Spektralbereich (~400 bis 700 nm) für die im Organismus

vorkommenden Photosynthesepigmente liegen [Heath, 1972; Lawlor, 1992]. Die

benötigte optimale Bestrahlungsstärke (Anzahl der Photonen pro Fläche und

Zeit [µE m-2 s-1], Photosynthetische Photonenflussdichte (PPFD)) ist spezies-

spezifisch und kann aus der Lichtsättigungskurve abgeleitet werden. Diese

spiegelt den Zusammenhang von zugeführter PPFD und messbarer Photo-

syntheserate (Differenz des in der Photosynthese freigesetzten und des in der

Atmung verbrauchten Sauerstoffes) wider (Abb. 2.6.). Unterhalb einer mini-

malen Bestrahlungsstärke verbraucht ein photosynthesebetreibender Mikro-

organismus für seinen Erhaltungsstoffwechsel mehr Energie, als er vom

eingestrahlten Licht nutzen kann (messbare Photosyntheserate bzw.

Stand des Wissens

- Seite 27 -

Sauerstoffgesamtbilanz negativ). Die minimal nötige Bestrahlungsstärke für

eine positiv messbare Photosyntheserate wird in der Lichtsättigungskurve als

Lichtkompensationspunkt gekennzeichnet [Goldmann, 1979; Kohl and

Nicklisch, 1988].

Abb. 2.6 Lichtsättigungskurve der Photosynthese

Mit steigender PPFD nimmt die Bildung von Sauerstoff während der

Photosynthese zunächst linear zu und nähert sich bei weiterer Zunahme an

einen konstanten maximalen Wert für die Sauerstoffbildung an (Sättigungs-

bereich). Im linearen Bereich der Lichtsättigungskurve wird jedes von Photo-

synthesepigmenten absorbierte Photon photochemisch für den Photosyn-

theseprozess genutzt. Die Photonenausnutzung ist in diesem Bereich maximal

(maximale Quantenausbeute), jedoch die Wachstumsrate der photosynthese-

aktiven Organismen durch die geringe Lichtintensität begrenzt (Licht-

limitierung).

Im Übergangsbereich der Lichtsättigungskurve wird die Photosyntheserate

maximal und der für die Photosynthese genutzte Photonenanteil der einge-

strahlten Photonen minimal. Die Lichtsättigung basiert auf der begrenzten

Reaktionsgeschwindigkeit bei der Regeneration von Plastochinon oder der

Oxidation der NADPH-Moleküle im Calvin-Zyklus [Matthijs et al., 1996]. Ein

Teil der im PS II angeregten Elektronen kann nicht für die Photosynthese

genutzt werden, sondern ihre Energie wird in Wärme oder Fluoreszenz

umgewandelt.

Stand des Wissens

- Seite 28 -

Eine weitere Erhöhung der Lichtintensität kann zur Photoinhibierung (Reduk-

tion der Photosyntheserate) durch Zerstörung der Photosyntheserezeptoren,

der lichtabsorbierenden Pigmente und der Thylakoidmembran führen [Hopkin

and Hüner, 2004].

Die während der Kultivierung steigenden Zelldichten führen zu einer zuneh-

menden Zellabschattung, die durch Anpassung des Lichteintrages kompensiert

werden muss. Andernfalls kommt es zur Lichtlimitierung während des Wachs-

tums, da die verfügbaren Photonen nicht mehr für eine optimale Versorgung

ausreichen. Im gegensätzlichen Fall würde ein zu hoher Lichteintrag zu Beginn

der Kultivierung die Zellen schädigen (Photoinhibierung).

Ein weiterer Parameter, der den Lichteintrag beeinflusst, stellt das Oberflächen/

Volumen (A/V)-Verhältnis des Photobioreaktors dar. Eine homogene Bestrah-

lung der Zellen aufgrund eine optimalen A/V-Verhältnis im Zusammenhang

mit einer idealen Durchmischung würde einen ständigen Wechsel der Licht-

verhältnisse von unbeleuchtetem Reaktorkern und beleuchteter Oberfläche für

die kultivierten, phototrophen Mikroorganismen vorbeugen [Ogbonna et al.,

1995].

2.3.2.3 Photobioreaktoren

a) Thermisch sterilisierbare Photobioreaktoren

Die Nutzung von Cyanobakterien und Mikroalgen als Produzenten pharma-

kologischer Naturstoffe bedarf thermisch sterilisierbarer und kontrollierbarer

Kultivierungssysteme, die eine monoseptische Produktion unter reproduzier-

baren Bedingungen ermöglichen. Es sind nur wenige Kultivierungssysteme

bekannt, die den genannten Anforderungen genügen und im Folgenden

anhand einiger Beispiele vorgestellt werden:

PHOTOBIOREAKTOR-SCREENING-MODUL

Die am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik entwickelten Photobioreaktor-

Screening-Module (PSM) sind ex situ autoklavierbare Blasensäulen mit einem

Reaktorvolumen von 1 l (maximales Arbeitsvolumen 0,9 l). Sie bestehen aus

einem Glasdruckbehälter, Reaktorboden mit integriertem Wärmetauscher und

Belüftungsöffnung, Reaktordeckel mit integriertem Probenahmerohr und

weiteren Stutzen für das Inokulum, die Antischaumzufuhr oder sonstigen

Stand des Wissens

- Seite 29 -

Zugaben (Abb. 2.7). Die in der Lichtintensität regelbare Bestrahlung erfolgt

extern, vierseitig (vollseitig bestrahlte PSM-Modelle) mit Leuchtstoffröhren

[König, 2006]. Aufgrund der bestrahlen Reaktoroberfläche und des Reaktor-

volumens resultiert ein A/V-Verhältnis von 80 m-1.

In den PSM kann im Parallelbetrieb durch Variation der relevanten Kulti-

vierungsparameter (Bestrahlungsstärke, Begasungsrate, Kohlendioxidzufuhr,

Temperatur, Nährstoffe) deren Einfluss auf die Biomasse- und die Produkt-

konzentration untersucht werden. Die Kultivierung phototropher Mikroorga-

nismen in den PSM ermöglicht zudem in vielen Fällen die Produktion von

Wirkstoffen in ausreichender Menge für biologische Tests und Struktur-

untersuchungen.

Abb. 2.7 PSM mit schematischen Aufbau (links) und photographisch während einer Kultivierung (rechts)

Stand des Wissens

- Seite 30 -

AIRLIFTSCHLAUFENREAKTOREN

Die an der Technischen Universität Berlin am Fachgebiet Bioverfahrenstechnik

entwickelten Airliftschlaufenreaktoren vom Typ Medusa mit Reaktorvolumen

von 10 l, 25 l und 100 l erfüllen alle relevanten steriltechnischen Anforderungen.

Die Medusa besteht in Abhängigkeit ihrer Größe aus einer unterschiedlichen

Anzahl an zwei paarig angeordneten Glasröhren (d=51 mm), die im unteren

Bereich über U-Rohr-Schlaufen sowie über den Kopfraum miteinander

verbunden sind (Abb. 2.8). Die Begasung eines Schlaufenarms über eine Düse

der paarig angeordneten Glasröhren induziert eine Strömung auf Basis von

Dichteunterschieden, welche gleichzeitig eine Durchmischung im Reaktor

realisiert. Die Sterilisation der Medusa erfolgt in-situ oder über Streichdampf.

Die Beleuchtung der Medusa erfolgt extern über Leuchtstoffröhren [Walter,

1999; Walter et al., 2003].

Abb. 2.8 Airliftschlaufenreaktor Medusa (25 l) mit Steuerungseinheiten (links) und Aus-schnitten vom Kopfraum (rechts oben) und den unteren U-Rohren (rechts unten)

Prozessbegleitend können der pH-Wert, der Sauerstoffpartialdruck und die

Temperatur über Sonden im Kopfraum bestimmt werden. Ein an den Schlaufen

angebrachter Light Controller ermöglicht über eine Transmissionsmessung die

Stand des Wissens

- Seite 31 -

Regelung der Bestrahlungsstärke während der Kultivierung zur Vermeidung

von Lichtlimitierung oder zur Prozessführung im kontinuierlichen Betrieb

(Turbidostat) [Walter, 1999; Walter et al., 2003].

PHOTOBIOREAKTOREN MIT LICHTWELLENLEITERN

Herkömmliche Bioreaktorsysteme können durch den Einbau von seitabstrah-

lenden Lichtwellenleitern auf Quarzbasis, ummantelt mit Fluorpolymer, in

Photobioreaktorsysteme umgerüstet werden. Die fixierten Lichtwellenleiter

ermöglichen einen homogenen Lichteintrag in das gesamte System. Obwohl die

zusätzlichen Einbauten nur einen geringen Raumbedarf haben, der Reaktor mit

den Einbauten eine gute Durchmischung und Gasversorgung gewährleistet

und die Reinigung einfach durchführbar ist, hat sich aufgrund des licht-

limitierten Wachstums der phototrophen Zellen dieses System in der Praxis

nicht durchsetzen [Gerbsch, 1997].

b)Nicht-thermisch sterilisierbare Photobioreaktoren

Zusätzlich zu den thermisch sterilisierbaren Photobioreaktoren finden weitere

geschlossene Reaktormodelle in der Produktion von Nahrungsergänzungs-

mitteln Anwendung, von denen einige Beispiele im Folgenden aufgezeigt

werden:

PHOTOBIOREAKTOREN ALS PLATTENSYSTEME

Die Funktionsweise der Plattenphotobioreaktoren wird exemplarisch an einem

Reaktor beschrieben, da vielfältige Bauweisen vorkommen. Der ausgewählte

Plattenreaktor ist aus zwei planparallelen Platten aufgebaut, die seitlich

abgedichtet sind. Zwischen den Platten befinden sich horizontale Stege, die an

den Enden verkürzt sind und somit innerhalb des Systems Kanäle für die

Zellsuspension bilden. Die Bestrahlung des Reaktors erfolgt beidseitig auf die

Platten. Der Abstand der Platten zueinander definiert die Schichtdicke und

daraus ableitend die Lichteindringtiefe. Das Plattenmaterial ist nicht sterilisier-

bar, so dass dieser Photobioreaktor nicht für pharmakologische Prozesse

genutzt werden kann [Pulz et al., 1995; Pulz, 2001].

Stand des Wissens

- Seite 32 -

PHOTOBIOREAKTOREN ALS ROHRREAKTOREN

Die Rohrreaktoren sind die am weitest verbreiteten Photobioreaktoren [Pulz,

2001]. Sie bestehen aus lichtdurchlässigen Rohren mit nachgeschaltetem Misch-

behälter. Die Zellsuspension wird über Pumpen befördert. Ein Scale up des

Rohrreaktors ist durch Verlängerung oder Parallelschaltung der Rohre realisier-

bar. Das größte Photobiorohrreaktorsystem mit 500 km Gesamtrohrlänge und

700 l Volumen ist im Jahr 2000 in Klötze (Deutschland) in Betrieb genommen

worden. In diesem Reakorsystem werden 130 bis 150 Jahrestonnen von Chlorella

vulgaris-Biomasse als Nahrungsergänzungsmittel produziert [Pulz, 2001].

Problemstellung

- Seite 33 -

3 Problemstellung

Die häufigsten Viruserkrankungen bei Patienten mit geschwächten Immun-

system sind auf Herpesviren zurückzuführen [Villareal, 2001]. Die derzeit

verwendeten Therapieansätze zur Behandlung der herpalen Infektion beruhen

zumeist auf Hemmung der viralen Transkription und zeigen den Nachteil einer

unzureichenden Effektivität sowie das Auftreten von Nebenwirkungen. Bei

einer längeren Behandlungsdauer sind zunehmend Resistenzen gegen das

verwendete Virustatikum beobachtet worden.

Naturstoffe aus phototrophen Mikroorganismen bilden vielfältige intra- und

extrazelluläre Wirkstrukturen, die in der Entwicklung neuer antiviraler Medi-

kamente ein bisher unzureichend genutztes Potential darstellen. Die in der vor-

liegenden Arbeit fokussierte Substanzklasse der Sulfoquinovosyldiacylgly-

ceride (SQDG) ist in antiviralen Untersuchungen mit HIV als potentieller

antiviraler Wirkstoff eingestuft worden [Gustafson et al., 1989]. Die SQDG als

integrale Bestandteile der Thylakoidmembran von phototrophen Mikroorga-

nismen besitzen aufgrund ihrer Varianz im Fettsäurespektrum eine große

Strukturvielfalt.

In den Untersuchungen soll eine Strategie einer gezielten Wirkstoffentwicklung

im Hinblick auf die Gewinnung von SQDG als antivirale Therapeutika

erarbeitet werden.

Zur Identifikation von SQDG-Bildnern sind phototrophe Mikroorganismen

(Cyanobakterien, Mikroalgen) nach Literaturrecherche zu selektieren und in

den PSM zur Biomassegewinnung zu kultivieren. Aus einem identifizierten

SQDG-produzierenden Modellorganismus soll ein Extrakt gewonnen werden,

anhand dessen ein Trennverfahren zur Gewinnung von SQDG und eine

Strukturcharakterisierung mittels MALDI ToF etabliert werden kann.

Nach Identifikation der SQDG-Produzenten und der präparative Gewinnung

von SQDG aus der Biomasse der Produzenten sollen die SQDG auf ihre

antivirale Wirksamkeit untersucht werden. Als Targetvirus für diese Unter-

suchungen wird das humane Herpesvirus Cytomegalievirus (HCMV) ausge-

wählt, da dieser Virus als Ursache schwerer Erkrankungen (z. B. Lungen-

entzündung) bei immunsupprimierten Patienten von höchster klinischer

Relevanz ist. Therapeutika mit Inhibierung der Virusadsorption bzw. -fusion

Problemstellung

- Seite 34 -

gelten als vielversprechend, so dass dieses Target bei der Etablierung des

antiviralen Assays Berücksichtigung finden soll. Der zu entwickelnde,

zellkulturbasierter Assay muss daher die frühzeitig exprimierten viralen

Immediate Early-Proteine von HCMV quantitativ erfassen können.

Zusätzlich zu den biologischen Untersuchungen ist ein SQDG-bildender

Modellorganismus zu selektieren anhand dessen die Steigerung der Wirkstoff-

ausbeute unter Variation verschiedener Prozessparametern genauer untersucht

wird. Dazu ist es notwendig, ein geeignetes Analyseverfahren zur Quanti-

fizierung der in der Biomasse gebildeten SQDG zu etablieren.

Material und Methoden

- Seite 35 -

4 Material und Methoden

4.1 Kultivierung phototropher Mikroorganismen

4.1.1 Verwendete Mikroorganismen

Im Rahmen der vorliegenden Forschungsarbeiten werden verschiedene photo-

trophe Mikroorganismen (Tab. 4.1) unter den in Kap. 4.1.3 beschriebenen

Parametern kultiviert und hinsichtlich der Bildung von SQDG untersucht.

Tab. 4.1 Übersicht über die phototrophen Mikroorganismen (*nicht axenische Stämme) mit den Stammnummern der Bezugsquellen (Stammsammlung für Algenkulturen in Göttingen (SAG), North East Pacific Culture Collection (NEPCC), National Institute for Enviromental Studies Collection (NIES), Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik der Universität Erlangen-Nürnberg (C))

Algenabteilung Mikroalgen Stammhaltung/Stammnummer

Chlorophyta Chlorella kessleri SAG 211-11g

Chlorella salina *) C 29

Chlorella vulgaris SAG 211-1

Heterokontophyta Heterosigma carterae *) NEPCC 102 R

Phaeodactylum tricornutum 6 SAG 1090-6

Phaeodactylum tricornutum 1a SAG 1090-1a

Phaeodactylum tricornutum 1b SAG 1090-1b

Rhodophyta Porphyridium purpureum SAG 1380-1f

Cyanophyta Arthrospira platensis N-39 NIES 39

Arthrospira platensis N-46 NIES 46

Scytonema hofmanni UTEX 2349

Nostoc punctiforme SAG69.79

4.1.2 Photobioreaktor-Screening-Modul

Die Kultivierung phototropher Mikroorganismen erfolgt in den PSM

(s. Kap. 2.4.3). Die Bestrahlungsstärke an der Oberfläche der PSM wird durch

Messung als wellenlängenintegrierte Photonenflussdichte mit dem Photometer

LI-189 (Li-Cor, Biosciences GmbH, Bad Homburg) bestimmt und nach den

experimentellen Vorgaben eingestellt. Die Begasung der Kulturen erfolgt über

einen Sterilfilter (Midisart 2000, Sartorius, Göttingen) mit Druckluft, die

entsprechend der Versuchsprotokolle mit CO2 angereichert worden ist. Der

Reaktor wird über den integrierten Wärmetauscher der PSM mit Kühlwasser

aus einem Kryostaten (KK 8H, Meding lab, Freital) temperiert. Die Sterilisation


- Seite 36 -

der PSM wird ex situ im Autoklaven Typ ELV 5075 (Systec-Laborsystem-

Technik, Wettenberg) durchgeführt. Das Inokulieren des Kultivierungsansatzes

mit Vorkultur kann sowohl unter einer sterilen Werkbank (HeraSafe Heraeus/

Thermo Electron Corporation, Langensendelbach) als auch keimfrei unter einer

Flamme direkt durch eine Animpfnadel über einen Animpfstutzen (DN 12) mit

integriertem Silikon-Septum (Bioengineering, CH-Wald) erfolgen.

4.1.3 Verwendete Medien und Kultivierungsbedingungen

Für die Kultivierung phototropher Mikroorganismen werden die folgenden

Kultivierungsmedien (siehe Kap. 10) verwendet:

� Medium für einzellige Grünalgen

� Modifiziertes Seewassermedium

� Artifizielles Seewassermedium mit Vitaminen

� Brackwassermedium

� Modifiziertes Trebonmedium

� Artifizielles Seewassermedium

� Spirulina Medium

� Medium BG 11

� Basalmedium

Die Medien werden mit Reinwasser (ELIX3, Progard 1 Silver, Millipore) bzw.

Reinstwasser (Synergy 185, Simpak 2; Millipore) sowie deren Mikronähr-

lösungen ausschließlich mit Reinstwasser angesetzt. Die Sterilisation der

Lösungen erfolgt mit dem Autoklav ELV 5075 (Systec-Labor-System Technik,

Wettenberg) bei 121°C für 30 Minuten. Nach dem Autoklavieren werden den

Nährmedien die sterilfiltrierten hitzeempfindlichen Vitaminlösungen (0,2 µm

Sterilfilter, Roth, P664.1) und die separat sterilisierte Erdextraktlösung zuge-

geben.

Bei Verwendung der Medien in Kultivierungen mit zusätzlichem CO2-Anteil im

Prozessgas muss das Medium vor dem Autoklavieren mindestens 2 Stunden

entsprechend der Kultivierungsbedingungen begast und der pH-Wert durch

Zugabe von 1 M NaOH auf den Ausgangswert korrigiert werden.


- Seite 37 -

Die Kulturführung phototropher Mikroorganismen erfolgt in den PSM unter

zum Teil optimierten Prozessparametern für eine maximale Biomasse-

produktion (Tab. 4.2).

Tab. 4.2 Übersicht über die Kultivierung phototropher Mikroorganismen in den PSM für Untersuchungen zur SQDG-Bildung (I0: Oberflächenbestrahlungsstärke evtl. angepasst , z. B. 80 � 130 µE m-2 s-1, vvm: Luftvolumenstrom pro Reaktorvolumen und Minute, *) nicht axenisch Stämme)

Mikroalge Kultivierungsbedingungen

Chlorophyta

Chlorella kessleri I0: 80 � 130 µE m-2 s-1, Temp. 30°C, Begasung 1 vvm mit 2,5 % CO2, Medium für einzellige Grünalgen

Chlorella salina *) I0: 80 � 120 � 180 µE m-2 s-1, Temp. 24°C, Begasung 1 vvm mit 2,5 % CO2, Modifiziertes Seewassermedium

Chlorella vulgaris I0: 80 � 150 µE m-2 s-1, Temp. 24°C, Begasung 1 vvm mit 2,5 % CO2, Medium für einzellige Grünalgen

Heterokontophyta

Heterosigma carterae *)

I0: 80 � 120 µE m-2 s-1, Temp. 24 °C, Begasung 1 vvm mit 2,5% CO2, Artificial Seewassermedium mit Vitaminen

Phaeodactylum tricornutum 6

I0: 80 µE m-2 s-1, Temp. 24°C, Begasung 1 vvm mit 2,5 % CO2, Brackwassermedium

Phaeodactylum tricornutum 1a

I0: 80 µE m-2 s-1, Temp. 24°C, Begasung 1 vvm mit 2,5 % CO2, mod. Trebon Medium

Phaeodactylum tricornutum 1b

I0: 80 µE m-2 s-1, Temp. 24°C, Begasung 0,5 vvm mit 2,5 % CO2, Brackwassermedium

Rhodophyta

Porphyridium purpureum I0: 120 � 180 µE m-2 s-1, Temp. 25°C, Begasung 1 vvm mit 2,5 % CO2, Medium Artificial Seewassermedium

Cyanophyta

Arthrospira platensis N-39 I0: 80 � 180 µE m-2 s-1, Temp. 24°C, Begasung 1 vvm mit 2,5 % CO2, Spirulina Medium

Arthrospira platensis N-46 I0: 80 � 180 µE m-2 s-1, Temp. 24°C, Begasung 1 vvm mit 2,5 % CO2, Spirulina Medium

Scytonema hofmanni

I0: 90 µE m-2 s-1, Temp. 24°C, Begasung 1 vvm mit 2,5 % CO2, modifiziertes Medium BG 11

Nostoc punctiforme I0: 80 µE m-2 s-1, Temp. 24°C, Begasung 1 vvm mit 2,5 % CO2, Basalmedium


- Seite 38 -

4.1.4 Vorkulturführung/Inokulieren

Die Vorkultur der Mikroalgen und Cyanobakterien wird auf dem jeweiligen

Kultivierungsmedium in 1000 ml Erlenmeyerkolben mit einem Arbeitsvolumen

von 300 ml angezogen. C. kessleri, C. salina, C. vulgaris, P. purpureum werden auf

dem Rundschüttler HAT, Typ AK82 (INFORS AG, CH-Bottmingen) bei einer

Schüttelfrequenz von 100 rpm und einer Beleuchtungsstärke von 30 bis

50 µE m-2 s-1 (OSRAM L18W/840, Lumilux, Coolwhite) kultiviert. Die Vorkul-

turen von H. carterae, A. platensis N-39 und A. platensis N-46 werden unge-

schüttelt vor der Lichtbank mit einseitiger Bestrahlung (OSRAM L58W/840,

Lumilux Plus) bei 30 bis 50 µE m–2 s-1 angezogen. Die Kultivierung der Vorkul-

turen von P. tricornutum 6, P. tricornutum 1a, P. tricornutum 1b erfolgt unter

Bestrahlung mit 30 bis 50 µE m-2 s-1 im CO2-begasten Schüttelbrutschrank

Multitron HT (3% CO2, INFORS AG, CH-Bottmingen) mit einer Schüttel-

frequenz von 100 rpm. Die Cyanobakterien N. punctiforme und S. hofmanni

werden zur Vermeidung der Zellagglomeration ungeschüttelt unter sonst

gleichen Bedingungen im CO2-begasten Schüttelbrutschrank kultiviert.

Für die Hauptkultivierungen werden Vorkulturen verwendet, die bis zum

Ende der exponentiellen Wachstumsphase unter den o. g. Bedingungen

kultiviert worden sind. Die Hauptkulturen werden so angeimpft, dass diese zu

Beginn der Kultivierung eine Optische Dichte (OD) von ca. 0,05 (P. tricornu-

tum 1a, 1b und 6, A. platensis N-39 und N-46, N. punctiforme) bzw. ca. 0,1

(C. kessleri, C. salina, C. vulgaris, H. carterae, P. purpureum, S. hofmanii) aufweisen.

4.1.5 Untersuchungen zur Optimierung der SQDG-Produktion

Die Optimierung der SQDG-Produktion wird am Modellorganismus A. pla-

tensis unter Variation bestimmter Kultivierungsparameter in den PSM durch-

geführt.

Variation I) Variation der Bestrahlungsstärke an der PSM-Oberfläche

mit: Spirulina Medium

Temperatur: 24°C

Begasung: 1 vvm mit 2,5 % CO2 im Zuluftstrom

und den Ansätzen: 1) 30 µE m-2 s-1, 2) 60 µE m-2 s-1, 3) 80 µE m-2 s-1,

4) 110 µE m-2 s-1 und 5) 140 µE m-2 s-1


- Seite 39 -

Variation II) Variation der Phosphatquelle und Phosphatkonzentration

mit: Spirulina Medium

Temperatur: 24°C

Begasung: 1 vvm mit 2,5 % CO2 im Zuluftstrom

Bestrahlung: 60 µE m-2 s-1

und den Ansätzen:

1) Standard: 0,5 g l-1 K2HPO4 (2,9*10-3 mol l-1)

2) siehe Ansatz 1, äquimolare Phosphatkonzentration mit K4P2O7a)

(0,47 g l-1; 1,4*10-3 mol l-1)

3) siehe Ansatz 1, 1:10 Phosphatkonzentration mit K4P2O7 (0,047 g l-1;

1,4*10-4 mol l-1)

4) siehe Ansatz 3, Licht 2 d vor Ernteb) von 60 auf 0 µE m-2 s-1 eingestellt a)Alfa Aesar, Ref.-No. 044269,

b) Ende exponentielle Wachstumsphase

4.1.6 Prozessbegleitende Analytik

4.1.6.1 Messung der Optischen Dichte

Für eine zeitnahe Beurteilung des Wachstums wird die OD bei einer Wellen-

länge von 750 nm ermittelt. Bei dieser Wellenlänge ist die Beeinflussung der

Extinktion durch Absorption von Zellpigmenten reduziert und damit die

Korrelation von gemessener OD750 und der Zellzahl optimal. Die Vermessung

der Zellsuspension zur Bestimmung der OD750 erfolgt mit dem Spektral-

photometer Specord 210 (Analytik Jena, Jena) in Präzisionsküvetten aus

optischem Glas Typ 6040 (Schichtdicke 10 mm, Messvolumen 1 ml, Hellma,

Müllheim). Die Zellsuspensionsproben werden mit 0,9 %iger Natrium-

chloridlösung so verdünnt, dass diese im linearen Messbereich der zuvor ermit-

telten Kalibriergerade von OD750/Biotrockenmassekonzentration (Kap. 4.1.6.2)

liegen. Die 0,9 %iger Natriumchloridlösung wird als Referenzwert verwendet.

Die OD-Messung erfolgt jeweils als Dreifachbestimmung.

Die Bestimmung der OD von den Zellsuspensionen der Cyanobakterien wird

aufgrund der schnellen Sedimentation ihrer Zellfilamente und den damit

verbundenen großen Abweichungen der einzelnen Messwerte als Fünffachbe-


- Seite 40 -

stimmung durchgeführt. Bei der Berechnung des Mittelwerts werden dabei

Minimal- und Maximalwert vernachlässigt.

4.1.6.2 Bestimmung der Biotrockenmassekonzentration

Für jeden verwendeten Organismus wird eine Korrelationsgerade von OD750

zur Biotrockenmasse erstellt. In den Hauptkultivierungen kann dement-

sprechend aus der ermittelten OD750 direkt die Biotrockenmassekonzentration

der Zellsuspension berechnet werden.

Für die Erstellung der Kalibriergerade werden Cellulose-Nitrat-Filter (Poren-

größe 0,2 µm) für 24 Stunden bei 100°C getrocknet, im Exsikkator auf

Raumtemperatur abgekühlt und vor Verwendung ausgewogen. Die verwen-

deten phototrophen Mikroorganismen werden im entsprechenden Kulti-

vierungsmedium in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet. 5 oder 10 ml

der Zellsuspension werden mit einer Vakuumpumpe filtriert und das gewon-

nene biomasseenthaltende Retentat zweimal mit einer der Zellsuspension

äquivalenten Menge an 0,9 %iger Natriumchloridlösung nachgespült. Von der

Zellsuspension werden die OD750 mit verschiedenen Verdünnungsstufen als

Dreifach- oder Fünffachbestimmung aufgenommen.

Die Filter werden erneut 24 Stunden bei 100°C getrocknet, auf Raumtemperatur

abgekühlt und das Gewicht der Biotrockenmasse über Differenzwägung

bestimmt. Aus der ermittelten Biomasse (Fünffachbestimmung) und der

Verdünnungsreihe kann nun eine Kalibriergerade von OD750 zur Biotrocken-

massekonzentration für den Organismus erstellt werden.

4.1.6.3 Ermittlung der Zellzahl

Die Bestimmung der Zellzahl von Mikroalgenkulturen erfolgt durch Aus-

zählung der Zellen unter dem Durchlichtmikroskop Axiovert (Carl Zeiss Jena).

Die Zellzahl der Cyanobakterien kann aufgrund der als Filamente angeord-

neten Zellen nicht bestimmt werden. Für die Zellzahlbestimmung von H. car-

terae wird die Neubauer Zählkammer und für alle weiteren Mikroalgenkulturen

die Thoma Zählkammer verwendet.

Da sich die begeißelten Zellen von H. carterae während der exponentiellen

Wachstumsphase bewegen, wird für eine bessere Zählbarkeit gegebenenfalls


- Seite 41 -

Lugol´sche Lösung (Merck, 1.09261) bis zu einer Konzentration von max. 5 %

zur Zellsuspension dazugegeben. Die Verdünnung mit Lugol´scher Lösung

wird bei der Berechnung der Zellzahl berücksichtigt.

4.1.6.4 Messung des pH-Wertes

Der pH-Wert der Zellsuspension wird mit der pH-Elektrode des Types 411 in

Verbindung mit dem Messverstärker MP 200 (Mettler Toledo, Steinbach)

gemessen.

4.1.6.5 Bestimmung der maximalen spezifischen Wachstumsrate

Die maximale spezifische Wachstumsrate µmax wird graphisch aus dem Quo-

tienten der Differenz der Biotrockenmassekonzentration zu Beginn (X0) und

zum Ende der exponentiellen Wachstumsphase (Xt) sowie der Differenz der

dazugehörigen Prozesszeiten (t-t0) aus einem halblogarithmisch aufgetra-

genem Wachstumsdiagramm bestimmt:

µmax = (ln Xt-ln X0)/(t-t0). (Formel 4.1)

4.1.6.6 Bestimmung der Raum-Zeit-Ausbeute

Die Raum-Zeit-Ausbeute der SQDG-Produktion wird nach Aufarbeitung und

Quantifizierung der SQDG in der Biomasse bzw. in der Zellsuspension (cSQDG-

Konzentration) zum Prozesszeitpunkt (t) der Ernte bestimmt:

RZASQDG = cSQDG/t (Formel 4.2)

4.1.7 Ernte der Biomasse

Mit Einlauf der Kulturansätze in die stationären Wachstumsphase wird die

Biomasse durch Zentrifugation (Megafuge 1.0, Heraeus Kendro/ Thermo

Electron Corporation, Langenselbold) vom Überstand separiert und geerntet.

Der Überstand wird verworfen und die Biomasse zweimal mit 0,9 %iger

Natriumchloridlösung gewaschen, um andere an den Zellen anhaftende Salze

zu entfernen. Die gewonnene Biomasse wird bei –20°C eingefroren, in der

Gefriertrocknungsanlage Alpha 1-4 (Christ, Osterode) lyophilisiert und bis zur

weiteren Verwendung im Exsikkator gelagert.


- Seite 42 -

4.2 Aufarbeitung der SQDG

4.2.1 Verwendete Lösungsmittel und Salze

Während der Aufarbeitung werden die folgenden Lösungsmittel und Salze

verwendet:

Dichlormethan (DCM) ROTISOLV HPLC unstab. Roth, 7334.1

Methanol (MeOH) ROTISOLV HPLC Roth, P717.1

Isopropanol ROTISOLV HPLC Roth, 7343.1

Essigsäureethylester (EtAc) ROTISOLV HPLC Roth, 7336.1

Acetonitril (ACN) ROTISOLV HPLC Roth, 7330.2

Essigsäure (AC) Ph. Eur., reinst Roth, 6755.1

0, 1% Trifluoressigsäure (TFA) Sigma-Aldrich, T3443

Ammoniumacetat (NH4Ac) p. A. Fluka, 09690

Natriumacetat (NaAc) p. A. Merck, 1.06268

TRIS p. A. PROLABO, 28812265

Dihydroxybenzoesäure (DHB) p.A. Fluka, 85707

α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) p.A. Fluka, 70990

4.2.2 Extraktion

Die lyophilisierte Biotrockenmasse wird mit 40 ml DCM/MeOH (1:1, v/v) pro

Gramm Biotrockenmasse bei 4°C über Nacht extrahiert. Der gewonnen Extrakt

wird anschließend filtriert (Filter MN 1640 d, Macherey und Nagel, Düren) und

mit dem Rotationsverdampfer Laborator 4002-Control (Heidolph Instruments

Labortechnik, Schwabach) bei max. 25°C und 120 mbar Unterdruck aufkon-

zentriert. Das restliche Lösungsmittel wird durch Aufblasen mit Stickstoff

vollständig entfernt. Das Extraktgewicht kann anschließend durch Differenz-

wägung der extraktenthaltenden Rundkolben bestimmt werden. Bis zur

Durchführung weiterer Aufarbeitungsschritte wird der Extrakt in DCM/MeOH

(1:1, v/v, max. Konzentration 0,1 gExtrakt ml-1) bei 4°C gelagert.

Die Extrakte für die Quantifizierung der SQDG aus den Optimierungsunter-

suchungen werden aus 0,1 g Biotrockenmasse gewonnen. Das Lösemittel von

diesen Extrakten wird nach der Extraktion und Filtration nicht entfernt.


- Seite 43 -

4.2.3 Dünnschichtchromatographie

4.2.3.1 Analytische Dünnschichtchromatographie

Bei Durchführung der analytischen Dünnschichtchromatographie (DC) wird

ein Aliquot der Probe (4 bis 8 µl) mit einer Mikroliterspritze (Hamilton

Bonaduz AG, CH-Bonaduz) als Spot auf die Startlinie einer DC-Platte Kiesel-

gel 60 (SIL G-25, Ref. 809021, Macherey und Nagel, Düren) aufgetragen. Zur

Identifizierung der aus den phototrophen Mikroorganismen isolierten SQDG

werden die Platten in einer lösungsmittelgesättigten DC-Kammer mit dem

Laufmittel EtAc/MeOH/1M AC 24:6:1 (v/v/v) entwickelt.

Die qualitative DC-Analytik der SQMG erfolgt zusätzlich durch Verwendung

des Laufmittels DCM/MeOH 2:1 (v/v). Die visuelle Detektion der SQDG- bzw.

SQMG-Spots wird durch die glycospezifische Reaktion mit Orcinol (Farb-

reaktion mit Orcinol) ermöglicht. Die entwickelten DC-Platten werden für die

Datendokumentation eingescannt und in der Bildbearbeitung auf die Lauf-

mittelfront zugeschnitten. Die Identifizierung der SQDG-Spots in der analy-

tischen DC erfolgt nach Vergleich der Retentionsfaktoren (Rf, Quotient der

Strecke des Spots zur Startlinie und der Strecke der Laufmittelfront zur

Startlinie) mit dem kommerziell erhältlichen SQDG-Standard (isoliert aus

Spinat, Rf 0,21, Ref. 59-1230, Larodan Fine Chemicals, Malmoe, Schweden).

FARBREAKTION MIT ORCINOL

Für die glycospezifische Farbreaktion wird die Orcinollösung auf die DC-Platte

aufgesprüht und anschließend 10 min bei 100°C entwickelt. Dabei reagieren die

in den Molekülen verankerten Glycostrukturen mit der in der Orcinollösung

vorhandenen Schwefelsäure zu 4-Hydroxymethyfurfural (HMF). Die folgende

Reaktion der HMF mit Orcinol resultiert in Farbkomplexen, die als violette

Spots auf der DC-Platte sichtbar werden.

ORCINOL LÖSUNG

Für die Herstellung der Orcinol-Reaktionslösung wird die Lösung A (1,66 g

Fe3Cl*6H2O (Merck, 1.03943) in 100 ml 10 % iger Schwefelsäure (Roth, 96 %ige

Schwefelsäure 4623.5)) mit der Lösung B (0,6 g Orcinol*H2O (Sigma Aldrich,

O1875) in 10 ml absolutem Ethanol (Roth, 5054.3)) im Verhältnis 10:1 (A:B)


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gemischt. Die Orcinol-Reaktionslösung wird unter Lichtausschluss bei 4°C

gelagert.

4.2.3.2 Präparative Dünnschichtchromatographie

Die präparative Dünnschichtchromatographie wird entsprechend den Parame-

tern der analytischen DC durchgeführt. Es werden DC-Platten Kieselgel 60 mit

einer Schichtdicke von 0,2 mm (SIL G-200, Ref. 809083, Macherey und Nagel,

Düren) verwendet. Dazu werden maximal 40 mg Extrakt für die chromato-

graphische Trennung an der Startlinie aufgetragen. Zur Aufarbeitung der

SQDG-Fraktion wird ein Vergleich des Retentionsverhaltens mit der parallel

gelaufenen und mit Orcinol gefärbten, analytischen DC-Platte durchgeführt.

Diese Laufdaten (Rf 0,15 bis 0,25) werden übertragen und die Fraktion von

Interesse wird ohne Anfärben mit Orcinol aus dem Kieselgel ausgeschnitten.

Die SQDG/SQMG werden durch Extraktion mit DCM/MeOH (1:1, v/v, Roth)

aus dem Kieselgel extrahiert, filtriert (MN1640 d, Macherey und Nagel, Düren)

und abschließend mit dem Speed Vac Concentrator 5301 (eppendorf, Hamburg)

oder über einen Stickstoffstrom eingeengt.

4.2.4 Adsorption/Desorptions-Trennverfahren

Die Aufarbeitung der SQDG erfolgt im Adsorptions-/Desorptionsverfahren

nach einer variierten Methode von Rizoh und Doulis [Rizov and Doulis, 2001].

Entsprechend der aufzuarbeitenden Extraktmenge werden verschiedene

Säulenvolumina der aminopropylmodifizierten Kieselgelsäulen (Kieselgel,

Säulenvolumen (SV) 3 ml, 500 mg, Ref. 730033; SV 6 ml, 1000 mg, Ref. 730626;

SV 30 ml, 5000 mg, Ref. 730030, Macherey und Nagel, Düren) verwendet. Die

Aufarbeitung wird exemplarisch an einer Kieselgelsäule mit 3 ml SV aufge-

zeigt. Bei Verwendung größerer Säulen werden die Volumina der verwendeten

Lösungsmittel verdoppelt (SV 6 ml) oder verzehnfacht (SV 30 ml).

Zum Konditionieren der Säule (SV 3 ml) werden nacheinander 2 ml MeOH,

2 ml Wasser, 4 ml 0,1 M HCl eluiert und das Säulenmaterial anschließend für

1 Stunde in der Säure gelagert. Das Konditionieren wird durch die Elution mit

2 ml Wasser, 2 ml MeOH und 2 ml DCM/Isopropanol/MeOH (15:30:50, v/v/v)

beendet. Danach wird maximal 20 mg Extrakt gelöst in DCM/MeOH (1:1, v/v)


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auf die Säule aufgetragen. Die Elution ungeladener Substanzen (Fraktion 1)

erfolgt mit 9 ml DCM/Isopropanol/MeOH 15:30:50 (v/v/v). Die SQDG werden

in der Fraktion 2 mit 5 ml DCM/ACN/Isopropanol/MeOH/0,1 M NH4Ac

10:10:10:50:15 (v/v/v/v/v) eluiert. Die Fraktion wird durch Abdampfen des Löse-

mittels im Speed Vac Concentrator 5301 (eppendorf, Hamburg) aufkonzentriert.

Für die Lagerung wird das Lösemittelgemisch DCM/MeOH 1:1 (v/v, max.

200 µl bei aufgereinigten Fraktionen von SV 3 ml) auf die Fraktion gegeben. Die

Proben werden bis zur Strukturcharakterisierung oder weiteren Aufarbeitung

bei 4°C gelagert.

Die Aufarbeitung von Extrakten für die Quantifizierung der SQDG erfolgt im

zweifachen Ansatz. Es werden zwei konditionierte 6 ml Säulen in Reihe

geschaltet (Abb. 4.1). Die Fraktion 1 wird aus der Elution beider gekoppelter

Säulen und die Fraktion 2a (obere Säule) und 2b (untere Säule) aus der

getrennten Elution beider Säulen gewonnen. Die Fraktionen werden an-

schließend über einen Stickstoffstrom eingeengt. Werden bei der Auswertung

des analytischen DC-Laufes von Fraktion 2b SQDG-Spots detektiert, können

sich aufgrund einer unzureichenden Säulenkapazität noch weitere Produkte in

Fraktion 1 befinden. In diesem Fall wird die aufgefangene Fraktion 1 erneut mit

dem Adsorption/Desorptions-Trennverfahren aufgereinigt. Alle aus einem

Extrakt gewonnenen Fraktionen 2 werden vereinigt und zusammen über einen

Stickstoffstrom aufkonzentriert.

Abb. 4.1 Darstellung der Aufarbeitung von Extrakten zur Quantifizierung der SQDG nach dem Adsorption/Desorptions-Trennverfahren im Bild (links) und schematisch (rechts)


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Es folgt das Rücklösen in 100 µl Methanol und die Lagerung bei 4°C.

Anschließend wird ein Aliquot der Probe in der analytischen DC qualitativ

beurteilt. Nach Zudosieren von weiteren 900 µl Methanol werden die Proben

mit HPLC-ESI-MS auf den Gehalt an SQDG untersucht.

4.2.5 Zweiphasensystem (Folch wash)

Die mit dem Adsorptions-/Desorptionstrennverfahren gewonnenen SQDG-

Fraktionen müssen vor der Verwendung in den biologischen Assays entsalzt

werden. Dazu wird die eingeengte Fraktion im Zweiphasensystem mit DCM/

MeOH/0,1 NaAc-Puffer pH 4.0 (8:4:3, v/v/v) verteilt und zur Separation der

Phasen über Nacht bei 4°C gelagert. Die untere lipophile Phase, welche die

ungeladenen SQDG enthält, kann mit dem Speed Vac Concentrator 5301

(eppendorf, Hamburg) eingeengt und deren Gewicht über Differenzwägung

bestimmt werden. Die Lagerung der Fraktion erfolgt in Methanol bis zu einer

maximalen Konzentration von 50 mgFraktion ml-1 bei 4 °C.

4.2.6 Isolierung der Ac-SQDG

Die Isolierung der Ac-SQDG aus der aufgereinigten Fraktion (Adsorp-

tion/Desorption) erfolgt über eine weitere Trennung mit einer unmodifizierten

Kieselgelsäule (Kieselgel 60, SV 15 ml, Ref. 730217; Macherey und Nagel,

Düren). Dazu wird die Säule nacheinander mit jeweils 25 ml MeOH, 25 ml

MeOH/DCM (1:1, v/v) und 25 ml DCM konditioniert. Anschließend wird die

Fraktion aus der Aufreinigung mit aminopropylmodifiziertem Kieselgel gelöst

und in maximal 1 ml des Elutionsmittel DCM/MeOH 9:1 (v/v) auf die Säule

aufgetragen. Die Elution der einzelnen, strukturell verschiedenen SQDG erfolgt

nacheinander mit jeweils 25 ml DCM/MeOH 9:1 (v/v, Fraktion 1), DCM/MeOH

8:1 (v/v, Fraktion 2), DCM/MeOH 7:1 (v/v, Fraktion 3) und DCM/MeOH 5:1

(v/v, Fraktion 4). Das Elutionslösungsmittel wird durch Abdampfen über einen

Stickstoffstrom entfernt und durch Differenzwägung kann das Gewicht der

Fraktionen bestimmt werden. Die Lagerung der Proben erfolgt in einer maxi-

malen Konzentration von 50 mg ml-1 Methanol bei 4 °C.


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4.3 Strukturcharakterisierung und Quantifizierung

4.3.1 MALDI trap ToF Hybrid MSn

Die Aufnahme der Massenspektren erfolgt mit dem MALDI trap ToF Hybrid

MSn (AXIMA QIT, Kratos Analytical, Manchester, UK). Das Massenspektro-

meter ist ausgestattet mit einem Stickstofflaser (337 nm, 3ns pulse, max.

Pulsrate 10 Hz). Zur Aufnahme der Massenspektren wird mit einem Laser-

energieeintrag von 7 µJ (MS1) bzw. 22 µJ (MS2/MS3) gearbeitet. Die Messungen

werden sowohl im positive als auch negative ion reflectron mode durchgeführt. Für

SQDG mit einem Molekulargewicht kleiner 850 Da wird das Massenfenster im

hochaufgelösten Ionenselektionsbereich auf Low 300+ gesetzt, hingegen für Ac-

SQDG mit MW>850 Da wird das Massenfenster auf 750+ eingestellt. Die in der

Ionenquelle generierten Ionen werden in der hochvakuumbetriebenen Ionen-

falle (4*10-3 Torr) mit Helium gekühlt. Der Ionenzerfall durch collusion induced

decay (CID) wird durch Argon induziert. Vor Durchführung der MSn-Experi-

mente wird das Mutterion mit Hilfe eines Isotopenselektionsfensters mit einer

Auflösung von 70 M/dM isoliert.

Die aufgenommenen Massenspektren bestehen aus durchschnittlich 200 Einzel-

profilen von zwei laser shots. Die Kalibrierung erfolgt als externe Zwei-Punkt-

Kalibrierung mit dem deprotonierten Phospholipidstandards 1,2–Dilauroyl-sn-

glycerol-3-phosphat (m/z 535.3, Ref. 840635, Avanti Polar Lipids, Alabaster,

USA) und 1,2-Dioleyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (m/z 861,5, Ref. 850149,

Avanti Polar Lipids) mit einem errechneten Massenfehler von maximal 0,6 Da.

4.3.1.1 Matrix und Technikoptimierung

Zur Optimierung der Messung von SQDG mit dem MALDI trap ToF MSn

Hybrid Massenspektrometer werden verschiedene Techniken der Auftragung

von Matrix und Probe auf das Target sowie verschiedene Matrices getestet.

MATRICES

Für die Testmessungen werden 10 mg ml-1 2,5 Dihydroxybenzoesäure (DHB) in

DCM/MeOH 1:1 (v/v), 10 mg ml-1 α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) in

ACN/0,1 % TFA 1:1 (v/v), 0,01-0,1 M 1-Butylamin-α-4-hydroxyzimtsäure

(ILM 1) und 0,01-0,1 M N,N-Diethyl-N-phenylammonium-α-cyano-4-hydroxy-


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zimtsäure (ILM 2) in ACN/0,1 % TFA 1:1 (v/v) gelöst und als Matrices

verwendet (Tab. 4.3).

Tab. 4.3 Übersicht über die Strukturen der verwendeten MALDI-Matrices ILM 1 und ILM 2

Matrix Struktur

1-Butylamin-α-4-hydroxyzimtsäure

(ILM 1*))

N,N-Diethyl-N-phenylammonium-α-cyano-4-hydroxyzimtsäure

(ILM 2*))

*) Die ionischen Liquide ILM 1 und ILM 2 sind vom Lehrstuhl für chemische Reaktionstechnik der Universität Erlangen-Nürnberg (Leitung: Prof. Peter Wasserscheid) zur Verfügung gestellt worden.

MODIFIZIERTE SANDWICH-METHODE

Bei Durchführung der modifizierten Sandwichmethode werden zunächst 0,7 µl

der Matrix auf das Target aufgetragen, der Überschuss an Matrix nach zwei

Sekunden vom Target entfernt und das Target luftgetrocknet. Anschließend

werden 0,7 µl der in DCM/MeOH (1:1, v/v) gelösten Probe auf das Target

gegeben, mit weiteren 0,7 µl Matrixlösung überschichtet und anschließend

erneut getrocknet [Methode empfohlen von Shimadzu Biotech].

DRIED DROPLET METHODE

Bei der dried droplet Methode wird die in DCM/ MeOH (1:1, v/v) gelöste Probe

sowie die Matrixlösung in einem PCR-Reaktionsgefäß 1:1 (v/v) gemischt und

anschließend 1 µl des Gemisches auf das MALDI-Target aufgetragen.

4.3.2 Enzymatischer Verdau

Die aus P. purpureum isolierten SQDG werden zum Zweck der Struktur-

charakterisierung mit der Lipase aus Rhizopus arrhizus (Ref. 62305, Fluka, Neu-

Ulm) hydrolisiert. Dazu wird die lösungsmittelfreie SQDG-Fraktion in 1 ml

0,04 M TRIS/HCl-Puffer pH 7,2 mit 1,15 units (125 µg ml-1 Enzym) suspendiert

und bei Raumtemperatur unter Schütteln (80 rpm, Thermomixer comfort,


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eppendorf) für 15 min inkubiert. Der enzymatische Verdau wird durch Zugabe

von 15 ml Isopropanol gestoppt. Das gesamte Reaktionsgemisch wird

anschließend filtriert (Filter MN 1640 d, Macherey und Nagel, Düren),

aufkonzentriert und das verdaute Produkt Sulfoquinovosylmonoacylglycerid

(SQMG) mit präparativer Dünnschichtchromatographie (Laufmittel DCM/

MeOH 2:1, v/v) aufgereinigt. Nach Übertragung der analytischen DC-Daten

eines Aliquots der Probe wird das SQMG in einer Fraktion zwischen den Rf-

Werten 0,40 bis 0,55 aus dem Kieselgel mit DCM/MeOH 1:1 (v/v) extrahiert. Die

gewonnene Fraktion wird unter einem Stickstoffstrom aufkonzentriert und bis

zur Durchführung der Strukturanalytik in DCM/MeOH 1:1 (v/v) bei 4°C

gelagert.

4.3.3 Quantifizierung der SQDG mittels LC-MS

Die SQDG können mit der HPLC-ESI-MS quantifiziert werden. Das verwendete

HPLC-System umfasst zwei LC-20 AT Pumpen, einen Prominence Degaser

DGU-20 A3, einen Prominence SIL-20AV Autosampler zur Probenahme, einen

CBM-20 A Controller sowie einen Säulenofen CTO-10ASVP mit integriertem

Säulenanschlüssen und einen SPD-10AVP UV VIS Detektor (Shimadzu

Deutschland GmbH, Duisburg). Das nachgeschaltete ESI-Massenspektrometer

der HPLC ist ein Q TRAP LC/MS/MS System (Applied Biosystems / MDS

SCIEX, Foster City, USA).

Die Trennmethode ist durch Variation der Säulen (C8-, C18-, Phenyl-Phase), der

Lösungsmittel, der Fahrweise (isokratisch, Gradienten) und der Fließrate für

die Quantifizierung der SQDG optimiert worden. Die optimale Trennung kann

mit einer C18-Säule (LiChrosorb 100 RP18, 250*4,0mm, 7 µm, Ref-No.

N2540L007 E18, VDS optilab Chromatographie Technik GmbH, Berlin) und den

in Kap. 5.5.1 beschriebenen Parametern (Flussrate, Gradient) erzielt werden.

Die Quantifizierung der SQDG einzelner Kultivierungsansätze erfolgt über eine

Dreifachbestimmung jeder Probe und die Berechnung über die Kalibriergerade.

Zur Erstellung der Kalibriergerade sind die SQDG aus der Alge P. purpureum

nach der etablierten Methode (Extraktion, Adsorptions/Desorptions-Trenn-

verfahren, Folch wash) aufgearbeitet, die Menge der SQDG durch Differenz-


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wägung bestimmt und entsprechende Verdünnungskonzentrationen hergestellt

worden.

4.4 Biologische Assays

4.4.1 Kultivierung der Wirtszellen

Alle sterilen Arbeiten mit der Wirtszelllinie und dem Virus werden unter der

Werkbank HeraSafe (Heraeus/Thermo Electron Corporation, Langensendel-

bach) durchgeführt. Als Wirtszelllinie für die antiviralen Untersuchungen wird

die adhärente humane Fibroblastenzelllinie MRC-5 (Ref. 97112601, ECACC)

verwendet. Die Zellen werden in sterilfiltriertem D-MEM-Medium (Ref.

128000-116, GIBCO, 13,48 g l-1 Medium mit 4,5 g l-1 Glucose add 1,5 g l-1

NaHCO3 (Merck, 1.04873)) mit 10 % Fötalem Kälberserum (FKS, Ref. A15-043,

PAA Laboratories GmbH, Inaktivierung 56 °C, 30 min) und 1 % Penicillin/

Streptomycin (100x, Ref. P11-010, PAA Laboratories GmbH) bei 37°C im CO2-

Brutschrank Hera Cell® 150 (Thermo Electron Corporation, Langenselbold)

kultiviert. Eine regelmäßige Kontrolle auf Konfluenz (Zusammenwachsen

einzelner Zellen auf der Wachstumsoberfläche) und mögliche Kontamination

der Zellen wird unter dem Inversen Mikroskop Axiolab (Carl Zeiss Jena GmbH,

Jena) durchgeführt. Ein Medienwechsel erfolgt alle 3 Tage und bei Erreichen

von höheren Zelldichten (95 bis 100 % Konfluenz) werden die Zellen trypsiniert

und in einer Zellkulturflasche mit mindestens 4,5*103 Zellen cm-2 eingesät. Die

Zellzahl und Vitalität der Zellen wird durch Trypanblaufärbung und an-

schließendem Auszählen der gefärbten Zellen unter dem Mikroskop bestimmt.

BESTIMMUNG DER ZELLZAHL UND DER ZELLVITALITÄT

Die Zellzahl und die Zellvitalität kann nach Färbung der Zellen mit Trypan-

blaulösung (Verdünnung 1:10, Ref. T8154, Sigma Aldrich, 0,4 %) und

anschließender Zellzählung mit der Neubauerzählkammer unter dem Mikros-

kop bestimmt werden. Nach der Färbung mit Trypanblau erscheinen tote

Zellen blau, da durch die nicht-intakte Zellmembran der Farbstoff passieren

kann. Die Vitalität der Zellen ergibt sich aus dem Verhältnis der Lebendzellzahl

zur Gesamtzellzahl.


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4.4.2 Herstellung des Virusstocks

Für die Gewinnung eines hohen Titers werden zwei verschiedene Methoden

der Herstellung des Virusstocks getestet. Zunächst werden die Zellen mit einer

Zellzahl von 4,5*103 Zellen cm-2 in die Zellkulturflaschen mit D-MEM Gluta-

maxTM (Ref. 31966-021) und verschiedenen Konzentration inaktiviertem FKS (5

und 10 %) eingesät und im CO2-Brutschrank bei 37°C inkubiert. Die Infektion

der Zellen nach Methode 1 erfolgt bei Erreichen von einer 10 bis 20 %igen

Konfluenz des Zellrasens. Die Zellen einer parallel kultivierten Kontrollflasche

werden trypsiniert und die Zellzahl bestimmt. Anschließend werden die Zellen

der Virusanzucht mit einer Multiplicity of Infection (MOI, Viruspartikel pro

Zelle) von 0,01 infiziert und weiter kultiviert. Die Ernte des Virusstockes (Über-

stand der Zellkultur) erfolgt 3 Tage nach Erreichen einer 100 %igen Konfluenz

der Zellen (~ 10 Tage post infectum (p. I.)). Die Vitalität der infizierten Zellen hat

zum Zeitpunkt der Ernte des Virusstockes 85 % nicht unterschritten.

Die Infektion der Zellen nach Methode 2 erfolgt bei Erreichen einer 80 %igen

Konfluenz des Zellrasens. Die Zellen werden anschließend für 7 Tage weiter-

kultiviert bevor der Überstand als Virusstock geerntet wird.

Der Virusstock wird in Kryovials aliquotiert und bei –80 °C gelagert. Der Virus-

titer wird analog der Bestimmung der antiviralen Aktivität mit verschiedenen

Verdünnungen des Virusstockes ermittelt.

4.4.3 Bestimmung der antiviralen Aktivität

Die Bestimmung der antiviralen Aktivität von aufgereinigten SQDG- bzw. Ac-

SQDG-Fraktionen erfolgt in dem zellkulturbasierten Assay auf Basis der

Immunoperoxidasefärbung der immediate early-Proteine von HCMV (IE-

HCMV-POX-Assay) in 96-well-Platten. Dazu werden 1,8*104 Zellen in 100 µl

D-MEM-Medium mit 10 % FKS pro Well in die inneren 60 Wells einer Mikro-

titerplatten eingesät (äußere Wells mit 100 µl PBS befüllt) und für einen Tag bis

zum Erreichen von einer Konfluenz über 95 % im CO2-Brutschrank Hera Cell®

150 bei 37 °C kultiviert. Zur Infektion der Zellen wird das Medium entfernt.

Anschließend werden je Well 50 µl der Inhibitorlösung (definierte Inhibitor-

konzentration in Medium ohne FKS, max. 5 % Methanol) und 50 µl Viruslösung

(1600 APU ml-1 in Medium mit 10 % FKS) dosiert. Der Virusassay wird durch


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Positivkontrolle (infizierte Zellen ohne Inhibitorzugabe) und Negativkontrolle

(nicht-infizierte Zellen) verifiziert. Die antivirale Aktivität wird aus der

sechsfachen Bestimmung jeder Inhibitorkonzentration bestimmt.

Die Virusreplikation wird 24 h bzw. 30 h p. I. durch Abnehmen des Mediums

von den Zellen und durch Zudosieren von 350 µl Methanol/well (Merck,

1.06009, p. A.) gestoppt. Zum Fixieren werden die Zellen mit dem Methanol bei

-20°C für mindestens 2 h inkubiert. Das Methanol wird anschließend von den

Zellen entfernt und Reste des Lösemittels durch Abdampfen evaporiert.

Für die Antikörperfärbung werden die infizierten Zellen mit 50 µl Primäranti-

körper anti-HCMV Immediate Early (IE, Ref. 11-003, Argene, 1:250 verdünnt in

PBS mit 1 % Magermilchpulver) je Well für 30 min im CO2-Brutschrank Hera

Cell® 150 inkubiert und dreimal mit 200 µl PBS je Well gewaschen. Die Inku-

bation mit 100 µl monoklonalem Sekundärantikörper antiMouse (Ref. M 0757,

Dako Cytomation, 1:100 verdünnt in PBS mit 1 % Magermilchpulver) je Well

wird für 30 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach erneutem drei-

maligen Waschen mit 200 µl PBS erfolgt das Färben infizierter Zellen über eine

peroxidasespezifische Reaktion. Dazu wird eine Tablette 3-Amino-9-Ethyl-

carbazol (AEC, Ref. A-6926, Sigma-Aldrich) zunächst in 4 ml Dimethylform-

amid (Merck, 1.03053) und weiteren 16 ml 0,1 M Natriumacetatlösung (Fluka,

71180, pH 5,0) gelöst. Vor Gebrauch der AEC-Lösung wird 120 µl 30 %iges

Wasserstoffperoxid (Merck, 8.22287) als Katalysator der Reaktion zudosiert. Je

Well werden 50 µl gebrauchsfertige AEC-Lösung auf die infizierten Zellen

gegeben und unter Lichtausschuss bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach mikroskopischer Kontrolle der Färbung (Axiovert 40, Carl Zeiss Jena)

werden die gefärbten Zellen mit 200 µl PBS dreimal gewaschen. Die Aus-

wertung erfolgt durch Auszählen der gefärbten Zellen je Well unter dem

Mikroskop Axiovert 40 (s. Abb. 4.2) und wird prozentual zur Positivkontrolle

als Viruslast [%] angegeben. Die Konzentration, bei der die Viruslast um 50 %

reduziert wird, ist die Inhibition Concentration of 50 % (IC50). Zur Bestimmung

der IC50 wird die Viruslast in einem Graphen über die Inhibitorkonzentration

aufgetragen und über die ermittelte Trendlinie des Polynom zweiten Grades

mathematisch ermittelt.


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Für die Etablierung des IE-HCMV-POX-Assays werden die bekannten anti-

viralen Substanzen Dextransulfat (Roth, 5956.1) und Ganciclovir (Cymeven®,

Roche) verwendet.

4.4.4 Weiterführende Untersuchungen

BESTIMMUNG DER ANTIVIRALEN AKTIVITÄT

Die antiviralen Aktivität der aufgereinigten SQDG-Fraktionen ist im Rahmen

des Kooperationsprojektes mit der Charité Berlin zusätzlich in einem weiteren

Assay mit HCMV von Dr. Ing. Stefanie Thulke bestimmt worden. Dieser

HCMV-Assay basiert im Gegensatz zum IE-HCMV-POX-Assay auf der Detek-

tion der delayed early Antigene von HCMV durch Peroxidase-gekoppelte

Antikörper (DE-HCMV-POX-Assay) und wird analog durchgeführt.

Abb.4.2 Antikörperfärbung viral IE- (links) und DE-Proteine (rechts) von HCMV

Die Inkubation dauert hierbei drei Tage, bevor die Virusreplikation durch

Fixieren der MRC-5-Zellen gestoppt wird. Die infizierten Zellen werden über

die Antikörperfärbung des viralen delayed early (DE)-Proteins mikroskopisch

sichtbar gemacht. Die antivirale Aktivität der einzelnen SQDG-Fraktionen wird

durch Auszählen der gefärbten und damit infizierten Zellen bestimmt

(Abb. 4.2) [Thulke, 2007].

BESTIMMUNG DER ZYTOTOXIZITÄT

Die zytotoxischen Untersuchungen sind im Rahmen des Kooperationsprojektes

an der Charité Berlin (Medizinische Klinik II, m. S. Onkologie und Häma-

tologie) von Dr.-Ing. Stefanie Thulke durchgeführt worden. Die Zytotoxizität

der SQDG-Fraktion selektierter phototropher Mikroorganismen wird mit dem

colorimetrischen WST-1 Test (Ref. 1644807, Roche) bestimmt. Dazu werden die


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MRC-5 Zellen in 96-well-Platten eingesät. Das zudosierte Medium enthält

SQDG in verschiedenen Konzentrationen. Nach einer Inkubationszeit der

Zellen mit SQDG von 1 d bzw. 3 d erfolgt die Färbung mit dem WST-1

Reagenz. Die mitochondrialen Dehydrogenasen stoffwechselaktiver Zellen

spalten dabei das Reagenz in einen wasserlöslichen photometrisch messbaren

Formazanfarbstoff. Die Stoffwechselaktivität ist proportional der Anzahl einge-

säter bzw. vitaler Zellen. Daher kann durch Vergleich der gemessenen Stoff-

wechselaktivität der Zellen in den Inhibierungsuntersuchungen mit SQDG ein

Rückschluss auf die Vitalität der Zellen gezogen und der CC50-Wert (Cytotoxic

Concentration of 50 %, Konzentration bei der 50 % der Zellen noch aktiv sind)

bestimmt werden [Thulke, 2007].

4.4.5 Assay der Inhibierung der HIV-Reversen Transkriptase (HIV-RT)

Für die Bestimmung der anti-HIV-RT-Aktivität wird der Assay Enz Check

Reverse Transcriptase (Ref. E22064, invitrogen) mit dem Enzym HIV-Reverse-

Transkriptase (Ref. 382129 rekombinat gewonnen aus E. coli, Calbiochem)

etabliert. Dazu sind verschiedene Konzentrationen der HIV-RT, die Inku-

bationsdauer und die Inkubationstemperatur im Thermocycler für die Erstel-

lung einer auswertbaren Kalibriergerade getestet worden, um anschließend die

Proben auf ihr Potential der Inhibierung untersuchen zu können.

Die SQDG werden für den HIV-RT-Assay zu je 1 µg, 5 µg und 10 µg pro

Reaktion in nucleasefreie PCR-Reaktionsgefäße aliquotiert und das Lösungs-

mittel mit dem Speed Vac Concentrator 5301 (eppendorf, Hamburg) entfernt. Zu

den einzelnen Proben werden je 5 µl HIV-RT-Enzymlösung mit 0,4 units gelöst

in Reverse Transkriptase-Puffer (Ref. A3561, Promega, 10x 1:10 verdünnt mit

DEPC Wasser) dosiert. Die Proben und die verschiedenen Enzymkonzen-

trationen zur Kalibrierung werden im Thermocycler PCR Primus 96 advanced®

Gradient (peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Programm: Lid Heat On

80°C, Temp. 8,0°C + 0,5° 1 min, Lid up, Proben einstellen, Lid close on, Pause

8,0°C 2 min, Temp. 30°C + 0,1 °C 10 min, Store 8°C) inkubiert.

Für 100 Reaktionen werden 5 µl Poly-A-Template und 5 µl Oligo-T-Primer in

nucleasefreien Tubes gemixt und für eine Stunde bei Raumtemperatur zum

Annealing (Hybridisierung des Primers und des RNA-Stranges) inkubiert.


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Dieser Mix wird anschließend mit 2 ml 200fachem Polymerisationspuffer

verdünnt und davon 20 µl zu jeder Probe und jedem Kalibrierstandard dosiert.

Das Probengemisch wird erneut im Thermocycler Primus 96 advanced®

Gradient (Programm: Lid Heat On 80°C, Temp. 8,0°C + 0,5° 1 min, Lid up,

Proben einstellen, Lid close on, Pause 8,0°C 2 min, Temp. 37°C + 0,1 °C 10 min,

Store 8°C) inkubiert. Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von 2 µl 200 mM

EDTA gestoppt und bis zum Messen bei 4°C gelagert.

Für die Fluoreszenzfärbung wird 52 µl Pico Green Lösung mit 17490 µl TE-

Puffer vermixt. Jede Probe wird mit 170 µl der gebrauchsfertigen Pico-Green-

Lösung für 5 min im Dunkeln inkubiert und anschließend im Mikroplattenleser

Flash Scan 530 (Analytik Jena AG, Jena, Excitation 480 nm, Emission 520 nm)

vermessen. Als Positivkontrolle für die Reaktion der Färbung mit Pico Green

dient doppelsträngige DNA.

Die Auswertung der Reversen-Transkriptase-Aktivität erfolgt durch Integration

der Fluoreszenz im Bereich 515 bis 525 nm. Zur Berechnung der enzymatischen

Restaktivität in den Proben mit SQDG werden die Integrationsflächen der

Probenkonzentrationen über eine mit HIV-RT-Konzentrationen 0,01 units,

0,05 units, 0,1 units, 0,2 units, 0,3 units und 0,4 units erstellte Kalibriergerade in

eine fiktive Enzymkonzentration umgerechnet. Das Verhältnis der errechneten

Enzymkonzentration zur eingesetzten Enzymkonzentration von 0,4 units ergibt

die verbleibende enzymatische Aktivität nach der Inhibierung des Enzyms.

Ergebnisse

- Seite 56 -

5 Ergebnisse

5.1 Stammauswahl von potentiellen SQDG-Produzenten

Die Auswahl verschiedener phototropher Mikroorganismen (Mikroalgen,

Cyanobakterien) für die Untersuchungen der SQDG-Produktion ist auf Basis

einer Literaturrecherche erfolgt. Die selektierten Vertreter sind dabei taxo-

nomisch mit phototrophen Mikroorganismen verwandt, die entsprechend den

Literaturdaten über das Potential einer SQDG-Biosynthese verfügen (Tab. 5.1).

Tab. 5.1 Selektierte phototrophe Mikroorganismen als potentielle SQDG-Produzenten

Phototrophe Mikroorganismen Ref.-Nr. Literaturquelle/taxonomische

Verwandtschaft

Rhodophyta

Porphyridium purpureum SAG 1380-1f Verwandtschaft zu P. cruentum

[Berge et al., 2002]

Heterokontophyta

Heterosigma carterae NEPCC 102 R [Keusgen et al., 1996; Keusgen et al., 1997]

Phaeodactylum tricornutum 6 SAG 1090-6 Verwandtschaft zu N. alba

[Anderson et al., 1975]

Phaeodactylum tricornutum 1a SAG 1090-1a Verwandtschaft zu N. alba


Phaeodactylum tricornutum 1b SAG 1090-1b Verwandtschaft zu N. alba


Chlorophyta

Chlorella kessleri SAG 211-11g Verwandtschaft zu C. kessleri SAG211-11h

[El-Sheek and Rady, 1995]

Chlorella salina C29 Verwandtschaft zu C. kessleri

[El-Sheek and Rady, 1995]

Chlorella vulgaris SAG 211-1 Verwandtschaft zu C. kessleri

[Morimoto et al., 1993]

Cyanophyta

Arthrospira (Spirulina) platensis NIES-39 Verwandtschaft zu S. platensis PC8005

[Quoc et al., 1993; Quoc and Dubacq,

1997]

Arthrospira (Spirulina) platensis NIES-46 Verwandtschaft zu S. platensis PC8005

[Quoc et al., 1993; Quoc and Dubacq,

1997]

Scytonema hofmanni UTEX 2349 Verwandtschaft zu Scytonema sp.

[Reshef et al., 1997]

Nostoc punctiforme SAG 69.79 Verwandtschaft zu N. commune

[Taranto et al., 1993 ]

Ergebnisse

- Seite 57 -

Die in der Literatur beschriebenen Analyseverfahren für SQDG basieren

vielfältig auf chromatographischen Trennmethoden (DC; Gaschromatographie

(GC)), aus denen aufgrund fehlender spektroskopischer Daten die chemische

Gesamtstruktur dieser Verbindungsklasse nicht abgeleitet werden kann. Im

Gegensatz dazu sind die isolierten SQDG aus H. carterae mit Hilfe der direkten

Kopplung von high performance liquid chromatographie (HPLC) und einem

Tandem-Massenspektrometer (MS/MS) strukturell charakterisiert worden. Die

Ionisation der Verbindungen erfolgt dabei durch eine Electron Spray Ionization

(ESI) [Keusgen et al., 1997]. Daher sind in der vorliegenden Arbeit neben einem

kommerziell verfügbaren SQDG-Standard auch die SQDG aus H. carterae als

positive Kontrolle für die Etablierung einer MALDI trap ToF Hybrid Massen-

spektrometrie verwendet worden.

5.2 Kultivierungen

Am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik der Friedrich-Alexander Universität

Erlangen-Nürnberg ist ein umfassendes Know-How hinsichtlich der Kulti-

vierung von phototrophen Mikroorganismen vorhanden. Die selektierten,

potentiell SQDG-produzierenden Organismen werden für die Gewinnung von

Biomasse und die anschließenden Untersuchungen bezüglich der SQDG-Pro-

duktion in Photobioreaktor-Screening Modulen (PSM) kultiviert. Die Kulti-

vierung der Mikroalgen erfolgt dabei bis zum Beginn der stationären

Wachstumsphase unter teilweise optimierten Prozessparametern für eine maxi-

male Biomassenkonzentration (BTM, gemäß Tab. 4.1). Im Folgenden soll auf die

Kultivierung dieser phototrophen Mikroorganismen eingegangen werden.

5.2.1 Rhodophyta

Die Kultur der Rotalge P. purpureum (Rhodophyta) weist einen typischen

Wachstumskurvenverlauf mit einer ausgeprägten exponentiellen Phase auf und

erreicht zum Zeitpunkt der Ernte eine maximale Biomassekonzentration von

4,5 gBTM l-1 und eine Zelldichte von 6,2*107 ZZ ml-1 (Abb. 5.1).

Ergebnisse

- Seite 58 -

Abb. 5.1 Zeitliche Verläufe (a) der Biomassekonzentration BTM und (b) der Zelldichte während

der Kultivierung von P. purpureum in den 1 l Photobioreaktoren (PSM)

5.2.2 Heterokontophyta

Die Wachstumskurven der Kultivierung von H. carterae unterscheiden sich

bezüglich Biomassekonzentration und Zelldichte im Verlauf. Die Auftragung

der BTM zeigt ein ausgeprägtes exponentielles Wachstum, welches zum

Prozessende in eine beginnende Retardationsphase übergeht. Im Gegensatz

dazu zeigt der zeitliche Verlauf der Zelldichte eine charakteristische Wachs-

tumskurve mit lag-, exponentieller und stationärer Phase. Bis zum Zeitpunkt

der Ernte erreicht H. carterae eine maximale Biomasseausbeute von 1,0 gBTM l-1;

die Zellzahl vervierfacht sich ausgehend von 2,0*105 ml-1 auf 8,4*105 ml-1

(Abb. 5.2).


der Kultivierung von H. carterae in den 1 l Photobioreaktoren (PSM)

Ergebnisse

- Seite 59 -

Die Kultivierungen der Phaeodactylum tricornutum-Stämme zeigen weitgehend

einen charakteristischen Wachstumsverlauf. Die Kulturen erzielen bis zum

Zeitpunkt der Ernte folgende Biomassekonzentrationen: 1,6 gBTM l-1 für P. tricor-

nutum 1a, 0,5 gBTM l-1 für P. tricornutum 6 und 0,3 gBTM l-1 für P. tricornutum 1b. Die

Zelldichte der Kultur P. tricornutum 1a nimmt über den Prozessverlauf von

2,0*106 auf 4,4*107 Zellen ml-1 (Faktor 22) zu. Im Gegensatz dazu wird für die

Kulturen von P. tricornutum 6 und P. tricornutum 1b eine geringere Steigerung

der Zelldichte über den Prozessverlauf beobachtet. Die Zelldichte erhöhte sich

dabei von 3,7*106 auf 2,8*107 Zellen ml-1 (Faktor 7, P. tricornutum 6) bzw. von

2,35*106 auf 7,8*106 Zellen ml-1 (Faktor 3, P. tricornutum 1b) (Abb. 5.3).


der Kultivierung von P. tricornutum 1a, P. tricornutum 1b und P. tricornutum 6 in den 1 l Photo-

bioreaktoren (PSM)

5.2.3 Chlorophyta

Die untersuchten Chlorella-Kulturen weisen über die Prozesszeit einen

typischen Wachstumsverlauf auf. Bei der Kultivierung von C. kessleri wird eine

Biomassekonzentration (BTM) von 11,0 gBTM l-1 erzielt. Im Gegensatz dazu wird

in den Kulturen von C. salina und C. vulgaris bis zur Ernte eine geringere BTM

von 4,8 gBTM l-1 bzw. von 4,0 gBTM l-1 erreicht (Abb. 5.4). Durch Zellzählung

werden zum Zeitpunkt der Ernte die Zelldichten 5,8*108 ml-1 für C. kessleri;

3,9*108 ml-1 für C. salina und 3,6*108 ml-1 für C. vulgaris ermittelt.

Ergebnisse

- Seite 60 -


der Kultivierung von C. kessleri, C. salina und C. vulgaris in den 1 l Photobioreaktoren (PSM)

5.2.4 Cyanophyta

Die Cyanobakterien erzielen während der Kultivierung maximale Biomasse-

konzentration von 1,2 gBTM l-1 (S. hofmanii), 4,7 gBTM l-1 (N. punctiforme), 1,9 gBTM l-1

(A. platensis N-39) und 1,3 gBTM l-1 (A. platensis N-46). Im Gegensatz zu den an-

deren Cyanobakterien, bei denen während der Kultivierung keine lag-Phase

(Adaption) beobachtbar ist, befinden sich die Zellen von N. punctiforme über

einen Zeitraum von 48 Stunden in dieser Wachstumsphase (Abb. 5.5).

Aufgrund des filamentösen Charakters der Kulturen kann eine Zellzählung

nicht vorgenommen werden.

Abb. 5.5 Zeitliche Verläufe der Biomassekonzentration BTM während der Kultivierung von

S. hofmanni, N. punctiforme, A. platensis N-39 und A. platensis N-46 in den 1 l Photobioreaktoren

(PSM)

Ergebnisse

- Seite 61 -

5.3 Down Stream Processing der SQDG

5.3.1 Etablierung

Ein Screening nach Wirksubstanzen aus natürlichen Quellen erfordert eine

Trennmethode zur Isolierung und Anreicherung des Wirkstoffes. Somit wird

sichergestellt, dass diese Verbindungen in analytischen Verfahren identifiziert

und dessen biologische Aktivität genauer untersucht werden kann. Zur

Aufreinigung der fokussierten Wirkstoffgruppe SQDG sind die Dünnschicht-

chromatographie (DC, Kap. 5.3.1.1) und ein Adsorptions/Desorptions-Trenn-

verfahren mit modifiziertem Kieselgel (Kap. 5.3.1.2) untersucht worden.

5.3.1.1 Dünnschichtchromatographie

Zur Trennung polarer Wirkstoffkomponenten eines lipophilen Extraktes der

Biomasse phototropher Mikroorganismen sind sowohl eine analytische als auch

eine präparative DC mit Kieselgel 60 Dünnschichtplatten durchgeführt worden.

Die DC-Entwicklung von Proben unter gleichen Bedingungen der stationären

und mobilen Phase führt auf den präparativen DC-Platten zu Fraktionen mit

Retentionsverhalten und Konzentrationsprofilen entsprechend denen des

Standards bzw. des Aliquots auf den analytischen DC-Platten. Diese Fraktionen

mit vergleichbarem Retentionsfaktor werden aus den präparativen DC-Platten

ausgeschnitten, im Extraktionsmittel resolvatisiert und anschließend aufkon-

zentriert. Ein Aliquot dieser präparativen DC-Fraktion wird erneut einer

analytischen DC unterzogen. Das dabei erkennbare Tailing des DC-Spots

verdeutlicht das Vorhandensein einer geladenen Gruppe in der chemischen

Struktur (Abb. 5.6). Ein weiteres Aliquot der präparativ aufgereinigten Fraktion

wird für massenspektrometrische Untersuchungen bereitgestellt.

5.3.1.2 Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren

Für die Bereitstellung von SQDG für antivirale Wirkstoffuntersuchungen ist ein

Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren auf Basis von aminopropylmodifi-

ziertem Kieselgel 60 als stationäre Phase etabliert worden. Die Trennung

negativ geladener Komponenten von neutralen Verbindungen erfolgt durch

ionische Wechselwirkungen der Anionen mit der stationären Phase. Die

eluierte Fraktion 1 enthält ungeladene Komponenten sowohl polaren als auch

Ergebnisse

- Seite 62 -

unpolaren Charakters des lipophilen Rohextraktes (Abb. 5.6). In Fraktion 2

können SQDG anhand des Retentionsverhaltens in der analytische DC und

durch Bestimmung des Molekulargewichts sowie durch MSn-Fragmentierungen

mit Massenspektrometrie nachgewiesen werden (Kap. 5.4.3.1).

Abb. 5.6 Analytische DC des Standards (STD) sowie der aufgereinigten SQDG-Fraktion aus

P. purpureum, (Kieselgel 60, EtAc/MeOH/1M Ac, 24:6:1 (v/v/v)); a) STD, Rohextrakt (RE) und

SQDG-Fraktion aus präparativer DC, b) Rohextrakt (RE), Fraktionen 1 und 2 (SQDG-Fraktion)

des Adsorptions/Desorptions-Verfahrens, c) lipophile (LP) und wässrige Phase (WP) der

Fraktion 2 aus dem Adsorptions/Desorptions-Verfahren nach Entsalzung im Zweiphasen-

system (Folch wash).

5.3.1.3 Zweiphasensystem (Folch Wash)

Das Elutionsmittel der Fraktion 2 enthält das Salz Ammoniumacetat, welches

für das biologische Screening entfernt werden muss. Zur Entsalzung ist daher

ein Zweiphasen-Verfahren nach Folch angewendet worden [Folch et al., 1956].

Aufgrund der Zusammensetzung des ternären Lösemittelgemisches DCM/

MeOH/Wasser (8:4:3 (v/v/v)) mit einer molaren Zusammensetzung von

32 mol % DCM, 25 mol % MeOH und 43 mol % Wasser entstehen entsprechend

der Löslichkeit zwei Phasen (Abb. 5.7).

Ergebnisse

- Seite 63 -

Abb. 5.7 Gibb´sches Phasendreieck des ternären Lösemittelgemisches DCM/MeOH/Wasser bei

20 °C mit kalkulierten Binodalkurven [Sørensen and Arlt, 1979]

Das Ansäuern der wässrigen Phase (NaAc-Puffer/Methanol) auf den pH-Wert

4,0 verbessert die Verteilung der SQDG im Zweiphasensysten nach Nernst

zugunsten der lipophilen Phase (DCM/ Methanol) (Abb. 5.6).

5.3.2 SQDG in phototrophen Mikroorganismen

Die genannten Aufreinigungsmethoden (präparative DC, Adsorptions/Desorp-

tions-Trennverfahren, Folch wash) der SQDG sind mit dem lipophilen Extrakt

der Rotalge Porphyridium purpureum etabliert worden. Auf Basis des ent-

sprechenden Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren sind anschließend alle

weiteren lipophilen Extrakte der kultivierten phototrophen Mikroorganismen

aufgereinigt und hinsichtlich der SQDG-Bildung mit analytischer DC überprüft

worden.

5.3.2.1 Rhodophyta

Nach Aufarbeitung der präparativen DC-Fraktion sind in der analytischen

Entwicklung der DC-Platten zwei Spots mit dem Rf,1-Wert 0,26 und dem

Rf,2-Wert 0,30 visualisiert worden (Abb. 5.6). Der Spot mit dem kleineren Rf-

Wert entspricht sowohl im Retentionsverhalten als auch hinsichtlich des

Konzentrationsprofils (Tailing) dem Spot des SQDG-Standards.

Die analytische DC der Fraktion 2 aus dem Adsorptions/Desorptions-Trenn-

verfahren verdeutlicht die qualitative Aufreinigung einer potentiellen SQDG-

Fraktion aus dem lipophilen Rohextrakt. Sie zeigt einen Spot (Rf 0,24), der im

Rf-Wert dem SQDG-Standard entspricht. In der Fraktion 1 werden ungeladene

Ergebnisse

- Seite 64 -

Verbindungen des lipophilen Rohextraktes eluiert. Der Vergleich der Chroma-

togramme beider Fraktionen und des Rohextraktes zeigt, dass sowohl in

Fraktion 2 als auch in Fraktion 1 und dem Rohextrakt ein Spot mit dem Rf-Wert

0,24 detektiert wird.

5.3.2.2 Heterokontophyta

Das Adsorptions/Desorptions-Verfahren des lipophilen Extraktes von H. car-

terae resultiert in zwei Fraktionen, deren dünnschichtchromatographische

Auswertungen in der zweiten Fraktion einen Spot mit dem Rf-Wert von 0,25

(vergleichbar mit dem SQDG-Standard) ergibt (Abb. 5.8).

Abb. 5.8 Analytische DC des Standards (STD) sowie der mit Adsorptions/Desorptions-

Trennverfahrens aufgereinigten Rohextrakte (RE) mit den Fraktionen 1 und 2; isoliert aus

H. carterae, P. tricornutum 1a, P. tricornutum 1b und P. tricornutum 6 (Kieselgel 60, EtAc/MeOH/

1M Ac, 24:6:1 (v/v/v))

Die aufgereinigten Extrakte der Phaeodactylum-Stämme weisen in der DC der

Fraktionen 2 jeweils Spots mit einem Rf-Wert von 0,3 auf. Die Spots sind durch

Konzentrationsprofile unterschiedlicher Intensitäten charakterisiert. Für P. tri-

cornutum 1a kann der entsprechende Spot nur schwach visuell erfasst werden,

so dass ein geringer Gehalt an potentiellen SQDG postuliert werden kann. Die

relevanten Spotintensitäten der aus P. tricornutum 1b separierten Fraktion 2 sind

im Vergleich zu den DC-Auswertungen des Adsorptions/Desorptions-Trenn-

Ergebnisse

- Seite 65 -

verfahrens anderer Phaeodactylum-Stämme intensiver. Das gleichzeitig beo-

bachtbare Tailing des Spots reflektiert wiederum das Vorhandensein von polar

geladenen Gruppen in der strukturellen Beschaffenheit der in diesem Spot

verankerten Verbindungen (Abb. 5.8).

5.3.2.3 Chlorophyta

In den Stämmen C. kessleri, C. vulgaris und C. salina der Algenabteilung Chloro-

phyta können in der analytischen DC nach Aufreinigung des lipophilen

Rohextraktes im Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren keine Spots in der

Fraktion 2 nachgewiesen werden. Die DC-Chromatogramme von Fraktion 1

sind mit denen des Rohextraktes vergleichbar (Abb. 5.9).

Abb. 5.9 Analytische DC des Standards (STD) sowie der mit Adsorptions/Desorptions-

Trennverfahren aufgereinigten Rohextrakte (RE) mit den Fraktionen 1 und 2; isoliert aus

C. kessleri, C. salina und C. vulgaris (Kieselgel 60, LM EtAc/ MeOH/1M Ac, 24:6:1 (v/v/v))

5.3.2.4 Cyanophyta

Die analytische DC zeigt in den potentiellen SQDG-Fraktionen 2 der

selektierten Cyanobakterien Spots mit den Rf-Werten 0,28 (S. hofmanni), 0,31

(N. punctiforme) und 0,35 (A. platensis N-46). Die Farbintensität des fokussierten

Spots von N. punctiforme ist im Vergleich zu den anderen Fraktionen weniger

intensiv, so dass eine geringere Konzentration an potentiellen SQDG in der

Ergebnisse

- Seite 66 -

aufgereinigten Fraktion 2 angenommen werden kann. Die aufgereinigte Frak-

tion des Rohextraktes von A. platensis N-39 zeigt keinen Spot im analytischen

DC-Chromatogramm, der im Retentionsverhalten mit dem Spot des SQDG-

Standards vergleichbar ist (Abb. 5.10).

Abb.5.10 Analytische DC des Standards (STD) sowie der mit Adsorptions/Desorptions-

Trennverfahren aufgereinigten Rohextrakte (RE) mit Fraktionen 1 und 2; isoliert aus A. platensis

N-39, A. platensis N-46, S. hofmanii und N. punctiforme (Kieselgel 60, EtAc/MeOH/1M Ac, 24:6:1

(v/v/v))

5.3.3 Ac-SQDG in phototrophen Mikroorganismen


In den Adsorptions/Desorptions-Trennfraktionen der Phaeodactylum-Stämme

können potentielle SQDG identifiziert werden, die in ihrem DC-Retentions-

verhalten dem des kommerziell verfügbaren SQDG-Standards gleichen. Die

Fraktionen zeigen weitere Spots mit höheren Rf-Werten (Bsp. P. tricornutum 1b

Rf,1 0,56, Rf,2 0,63), die durch die Reaktion mit Orcinol visualisiert worden sind,

jedoch nicht dem Retentionsverhalten des Standards (Rf 0,24) entsprechen

(Abb. 5.11). In der Literatur sind weitere SQDG-Strukturen bekannt, die im

Vergleich zu den bereits in der Arbeit beschriebenen SQDG weitere Acylreste

an der 2´und der 3´-Position der Sulfoquinovose beinhalten [Reshef et al., 1997].

Diese acylierten Verbindungen weisen eine geringere Polarität als die nichtacy-

lierten SQDG auf und retardieren daher geringer an der stationären Phase der

Ergebnisse

- Seite 67 -

DC (Kieselgel 60). Sie resultieren dadurch in Spots mit höheren Rf-Werten. Die

vorliegenden DC-Daten der Adsorptions/Desorptions-Trennfraktionen aus den

Phaeodactylum-Stämmen erlauben das Postulat, dass die in der DC detektierten

Verbindungen mit größeren Rf-Werten acylierte SQDG darstellen.

Abb. 5.11 Analytische DC (DC-Platte Kieselgel 60, LM EtAc/ MeOH/ 1M Ac, 24:6:1, v/v/v), a)

der aufgereinigten Rohextrakte von P. tricornutum 1b im Vergleich zum SQDG-Standard (STD),

b) der chromatographischen Trennung der postulierten SQDG und Ac-SQDG

5.3.4 Etablierung einer Trennmethoden für Ac-SQDG

Zur Bestimmung der biologischen Aktivität der verschiedenen, postulierten

SQDG-Strukturklassen in der Adsorptions/Desorptions-Trennfraktion aus den

Phaeodactylum tricornutum-Stämmen muss ein Verfahren zur Separation von

SQDG und Ac-SQDG etabliert werden. Dies ist exemplarisch an der Ac/SQDG-

Fraktion isoliert aus P. triconutum 1b (Fraktion 2 Adsorptions/Desorptions-

Trennverfahren) durchgeführt worden. Die Aufreinigung beider Struktur-

klassen erfolgt in einem weiteren Schritt im Adsorptions/Desorptions-Trenn-

verfahren mit unmodifiziertem Kieselgel als stationäre Phase und trennt die

Verbindungen nach ihren Polaritäten.

Die aufgefangenen vier Fraktionen werden qualitativ in der analytischen DC

erfasst (Abb. 5.11). Die Fraktionen 1 und 2 zeigen Spots im Vergleich zum

Standard mit höheren Rf-Werten. Die in diesen Spots verankerten Verbin-

dungen sind unpolarer als der SQDG-Standard, so dass vorhandene Ac-SQDG

Ergebnisse

- Seite 68 -

postuliert werden können. Der Spot der Fraktion 4 entspricht dem Retentions-

verhalten des Standards und zeigt ein Konzentrationsprofil mit ausgeprägtem

Tailing. Diese chromatographischen Eigenschaften sprechen für detektierte

SQDG. Die im Vergleich zu den Spots der Fraktionen 1 und 2 stärkere, farbliche

Intensität des Spots von Fraktion 4 reflektiert einen größeren Konzentrations-

gehalt der in Fraktion 4 vorkommenden Verbindungen.

In Fraktion 3 können geringe Intensitäten von Spots mit höherem Rf-Wert

(unpolare Verbindungen) als auch kleinerem Rf-Wert (polarer Verbindungen)

detektiert werden, die geringe Konzentrationen der in den Spots detektierten

Verbindungen vermuten lassen.

Eine Strukturidentifizierung der in den Spots postulierten Verbindungen als

Ac-SQDG und SQDG erfolgt mit MALDI trap ToF Hybrid MSn (Kap. 5.4.5).

5.4 Strukturcharakterisierung mittels MALDI trap ToF Hybrid MSn

Die Bestätigung vorkommender SQDG in den aufgereinigten Fraktionen und

die Charakterisierung in ihrer Struktur erfolgt mittels MALDI trap ToF Hybrid

MSn.

5.4.1 Matrixoptimierung

Der Ionisationsprozess infolge einer laser desorption von cokristallisierter Matrix

mit dem Analyten erfordert eine Optimierung der Matrix hinsichtlich der

Laserresponse für die zu untersuchende Verbindung. In den vorliegenden

massenspektrometrischen Untersuchungen werden neben den konventionellen

MALDI-Matrices 2,5-Dihydroxybenzoesäure und α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure

auch folgende ionische Liquide hinsichtlich der Laserresponse für die Substanz-

klasse der SQDG getestet:

• 1-Butylamine-α-4-hydroxyzimtsäure (ILM 1),

• N,N-Diethyl-N-phenylammonium-α-cyano-4-hydroxyzimtsäure (ILM 2).

Für die Präparation der Proben auf dem MALDI-Target sind dabei die dried-

droplet- und die sandwich-Methode anhand des SQDG-Standards auf ihre

Anwendbarkeit geprüft worden. Vorzugsweise ist die dried-droplet-Methode mit

ILM 1 bzw. DHB als MALDI-Matrix angewendet worden, da diese Präparation

Ergebnisse

- Seite 69 -

in höheren Signalintensitäten im Vergleich zu α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure

und ILM 2 resultiert.

Bei Verwendung von ILM 1 sind insbesondere neutrale Eliminierungen von

Fettsäuren aus der molekularen Struktur der SQDG (Interpretation Kap. 5.4.2.2)

mit höherer Intensität beobachtet worden. Da jedoch ILM 1 nicht kommerziell

verfügbar ist und sich gleichzeitig auch das Signal/Rausch-Verhältnis (S/N 44)

der Messungen im Vergleich zur DHB-Matrix (S/N 60) verschlechtert, ist in

allen nachfolgenden Untersuchungen DHB als Matrix verwendet worden (Abb.

5.12).

Abb. 5.12 Massenspektren des SQDG-Standards im negative ion mode mit den Matrices (a) DHB

und (b) ILM1 bei einem Eintrag von 7µJ Laserenergie und den gleichen Settings

Ergebnisse

- Seite 70 -

5.4.2 MALDI-ToF des SQDG-Standards

5.4.2.1 Untersuchung des SQDG-Standards im MS1

Das aufgenommene Massenspektrum des SQDG-Standards im negative ion mode

ist durch das signifikante Molekülion m/z 815,6 [M-H]- sowie die Masse/

Ladungs-Verhältnisse m/z 537,3 und 559,3 gekennzeichnet (Abb. 5.12). Diese als

post source decay bzw. in source decay postulierten m/z-Werte können als

neutraler Verlust der Fettsäuren Linolensäure (C18:3) und Palmitinsäure

(C16:0) aus der Molekülstruktur interpretiert werden, so dass durch die

Ergebnisse die strukturelle Beschaffenheit des SQDG-Standard gemäß den

Angaben des Herstellers verfiziert worden ist.

Die massenspektrometrische Vermessung des SQDG-Standards im positive ion

mode führt zur Detektion des Molekül-Ions als Natriumaddukt mit m/z 861,5

([M+2Na-H]+). Auch nach neutralem Verlust der im Molekül inkorporierten

Fettsäuren sind die verbleibenden Fragmente als Na-Addukte detektiert

worden (Abb. 5.13).

Abb. 5.13 Massenspektrum des SQDG-Standards im positive ion mode

Die im positive ion mode aufgenommenen Massenspektren der SQDG sind

aufgrund der Na-Addukte nicht so klar interpretierbar, so dass im weiteren

Verlauf der massenspektrometrischen Untersuchungen ausschließlich im

negative ion mode aufgenommene Massenspektren ausgewertet worden sind.

Ergebnisse

- Seite 71 -

5.4.2.2 Untersuchung des Standards im MS2 und MS3

Nach Selektion des Molekülions (m/z 815,6) in der Qtrap und dessen Frag-

mentierung durch collusion induced dissociation (CID) sind im aufgenommenen

MS2-Massenspektrum die post source decay-Fragmente m/z 537,3 und m/z 559,3

des MS1-Massenspektrums bestätigt worden. Sie resultieren aus den neutralen

Verlusten der Linolensäure (C18:3, Fragment m/z 537,3) und der Palmitinsäure

(C16:0, Fragment m/z 559,3). Weitere Induktionen der Ionenzerfälle nach

Selektion des Molekülions und deren MS2-Fragmente führen zur Eliminierung

der Sulfoquinovose (m/z 224,9) im MS3-Massenspektrum. Die detektierte

Sulfoquinovose bestätigt die Struktur vorkommender SQDG (Abb. 5.14).

Abb. 5.14 a) MS2-Massenspektrum des SQDG-Standard-Molekülion von m/z 815,3; b) MS3-

Spektren der MS2-Fragmentionen m/z 537,3 und 559,3 im negative ion mode aufgenommen bei

einem Eintrag von 22 µJ Laserenergie

Ergebnisse

- Seite 72 -

Eine vollständige Identifizierung der SQDG-Struktur mit den dargestellten

massenspektrometrischen Daten ist allerdings aufgrund der fehlenden Interpre-

tation der sn-Position der Fettsäuren (Kap. 5.4.3.1) noch nicht abschließend

möglich.

5.4.3 MALDI ToF der SQDG aus phototrophen Mikroorganismen

Die aufgereinigten, potentiellen SQDG-Fraktionen der Rohextrakte von photo-

trophen Mikroorganismen werden nach den vorangegangenen Unter-

suchungen der Aliquots mit analytischer DC hinsichtlich ihrer SQDG-Struk-

turen mit MALDI trap ToF Hybrid MSn untersucht. Die Grundlage der massen-

spektrometrischen Auswertungen basiert auf Referenzspektren des kommer-

ziell verfügbaren Standards und den im Folgenden dargestellten analytischen

Daten der identifizierten SQDG aus der Rotalge P. purpureum.

5.4.3.1 Rhodophyta

SQDG von Porphyridium pupureum im MS1 , MS2 und MS3

In den vorliegenden massenspektrometrischen Untersuchungen der aufge-

reinigten Fraktion von P. purpureum werden SQDG erstmals mit MALDI trap

ToF MSn strukturell analysiert. Im MS1-Massenspektrum der potentiellen

SQDG-Fraktion werden Molekülionen von m/z 817,6, m/z 839,6 und m/z 841,6

und das postulierte post source decay-Fragmention m/z 537,3 detektiert. Das

Fragmention wird durch Selektionen der Molekülionen in der Ionenfalle und

Stoßexperimenten mit Argon in den einzelnen MS2-Massenspektren bestätigt.

Es resultiert aus den jeweiligen Molekülionen nach neutralem Verlust der

ungesättigten Fettsäuren Linolsäure (C18:2), Eicosapentaensäure (C20:5) und

Eicosatetraensäure (C20:4). Nach Selektion der Molekülionen und der MS2-

Fragmentionen im Qtrap und Induktion der spezifischen Fragmentierung durch

CID kann jeweils das Fragmention m/z 224,9 in MS3-Experimenten detektiert

werden. Es basiert auf dem Strukturelement der Sulfoquinovose (Schema 5.1).

Die Interpretation der Daten aus den MS1- und MS2-Experimente erlaubt das

Postulat vorkommender SQDG mit den inkorporierten Fettsäuren C18:2/C16:0,

C20:5/C16:0 und C20:4/C16:0 (Abb. 5.15).

Ergebnisse

- Seite 73 -

Abb. 5.15 MS1-Massenspektrum von SQDG aus P. purpureum im negative ion mode (oben). MS2-

Spektren von (a) m/z 839,6 (SQDG C20:5, C16:0) und m/z 841,6 (SQDG C20:4, C16:0), MS3-

Spektren von (b) m/z 537,4 und m/z 537,3 aufgenommen bei einem Laserenergieeintrag von 7 µJ

(MS1) bzw. 22 µJ (MS2, MS3)

Ergebnisse

- Seite 74 -

Schema 5.1 a) Fragmentierung der SQDG in MS1, MS2 und MS3-Massenspektren, b) Enzyma-

tischer Verdau von SQDG aus P. purpureum mit der regioselektiven Rhizopus arrhizus Lipase

resultiert in der Hydrolyse der sn-1 veresterten Fettsäure

Enzymatischer Verdau der SQDG von P. purpureum

Die vollständige Strukturcharakterisierung der SQDG erfordert die Bestim-

mung von den sn-Positionen der Fettsäuren am Glycerol. Durch den enzyma-

tischen Verdau der SQDG aus P. purpureum mit der sn-1-regioselektiven Lipase

aus Rhizopus arrhizus und ergänzenden massenspektrometrischen Unter-

suchungen können die internen Positionen der Fettsäuren bestimmt werden.

Der enzymatische Verdau der SQDG-Fraktion mit anschließender Aufreinigung

der gebildeten Sulfoquinovosylmonoacylglyceride (SQMG) kann qualitativ mit

der analytischen DC kontrolliert werden. Das gewünschte Molekül SQMG hat

aufgrund der höheren Polarität und damit der höheren Retardation an der

stationären Phase Kieselgel 60 im Vergleich zu den SQDG einen kleineren Rf-

Wert (Abb. 5.16). Das ausgeprägte Tailing im Konzentrationsprofil des poten-

tiellen SQMG-Spots bestätigt eine ionische Gruppe in den in diesen Spots

verankerten Verbindungen.

Die geringen Intensitäten der Spots aufgereinigter, potentieller SQMG deuten

auf einen kleinen Gehalt an Substanz in der Probe. Die Substanzmenge ist

jedoch für die Aufnahme von Massenspektren ausreichend. Das MS1-Spektrum

der verdauten SQDG-Fraktion mit den drei unterschiedlichen SQDG-Struk-

turen zeigt das alleinige Molekülion m/z 555,4 (Abb. 5.17). Der Verdau der

SQDG-Moleküle aus P. purpureum resultiert dabei in der Hydrolyse der

ungesättigten Fettsäuren (C20:5, C20:4, C18:2) an sn-1-Position des Glycerols.

Das detektierte Molekülion m/z 555,4 steht für ein SQMG-Molekül mit

Palmitoylrest an der sn-2-Position. Ableitend von diesen Daten kann für die

Ergebnisse

- Seite 75 -

Alge P. purpureum die Bildung folgender SQDG postuliert werden: SQDG

C20:5/C16:0, SQDG C20:4/C16:0 und SQDG C18:2/C16:0.

Abb. 5.16 Analytische DC der unverdauten aufgereinigten SQDG aus P. purpureum sowie diese

SQDG verdaut mit R. arrhizus Lipase (SQMG). a) LM CH2Cl2/MeOH 2:1 (v/v), b) LM EtAc/

MeOH/1M Ac 24:6:1 (v/v/v).

Basierend auf den Daten der MS2-Experimente von dieser SQDG-Fraktion (Abb.

5.15) wird aufgrund des neutralen Verlustes der jeweiligen ungesättigten

Fettsäure aus den Molekülionen eine Korrelation zu den Untersuchungen des

enzymatischen Verdaus gefunden. Nach Selektion eines SQDG-Molekülions

und den Stoßexperimente resultieren die induzierten Fragmentierungen im

neutralen Verlust der Fettsäure an sn-1-Position.

Ein Vergleich der MS2-Massenspektren der SQDG-Moleküle mit dem MS2-

Fragmention m/z 537 und dem MS1-Massenspektrum von SQMG m/z 555

belegt einen Massenshift von 18 Da als Folge der Hydrolyse und verbleibender

Hydroxylgruppe am SQMG-Molekül (Schema 5.1).

Ergebnisse

- Seite 76 -

Abb. 5.17 MS1-Massenspektrum der R. arrhizus verdauten SQDG (SQMG C16:0) aus P. pur-

pureum im negative ion mode bei einem Laserenergieeintrag von 7 µJ

Die Identifizierung der MALDI trap ToF Hybrid MSn-Fragmente erlaubt die

Bestimmung der vollständigen SQDG-Struktur mit den sn-Position der Fett-

säuren. Basierend auf diesen Resultaten kann auch die Struktur des kom-

merziellen SQDG-Standards mit den vormals aufgezeigten Massenspektren

(Kap. 5.2.2, Abb. 5.12, Abb. 5.14) bestimmt werden. Das MS2-Massenspektrum

zeigt die Fragmentionen m/z 537,3 und m/z 559,3 durch neutrale Verluste des

Linolenoyl- (C18:3) und des Palmitoylrestes (C16:0) von der sn-1-Position aus

dem Molekülion m/z 815,6 (s. Abb. 5.14). Das Molekülion des Standards

resultiert somit aus den beiden SQDG-Molekülen (C18:2/C16:0, C16:0/C18:2).


Heterosigma carterae

Die in der analytischen DC identifizierten, potentiellen SQDG von H. carterae

sind durch Massenspektrometrie bestätigt worden. Das hochaufgelöste MS1-

Massenspektrum der SQDG-Fraktion zeigt die Molekülionen m/z 791,7 und

m/z 837,9 mit entsprechendem Isotopenpattern. Die MS2-Fragmentionen m/z

535,3 bzw. 535,4 reflektieren den Neutralverlust von Palmitinsäure (C16:0) aus

dem Molekülion m/z 791,7 und von Eicosapentaensäure (C20:5) aus m/z 837,9.

Das im MS2-Massenspektrum detektierte Fragmention m/z 535 ist strukturell

durch einen Palmitoleoylrest (C16:1) an der sn-2-Position des Glycerols

Ergebnisse

- Seite 77 -

bestimmt. Des Weiteren ist im MS2-Spektrum die Abspaltung von Sulfo-

quinovose (m/z 225) aus den SQDG ersichtlich (Abb. 5.18).

Ableitend aus der Gesamtheit der massenspektrometrischen Daten kann in

H. carterae unter den verwendeten Kultivierungsparametern die Bildung der

Verbindungen SQDG (C16:0/C16:1) und SQDG (C20:5/C16:1) nachgewiesen

werden.

Abb. 5.18. a) MS1-Massenspektrum von SQDG aus H. carterae im negative ion mode; MS2-

Massenspektrum von (b) m/z 791,7 (SQDG C16:0/C16:1) und m/z 837,9 (SQDG C20:5/C16:1),

Laserenergieeintrag 7 µJ (MS1) bzw. 22 µJ (MS2)

Phaeodactylum tricornutum-Stämme

Die Ergebnisse der Adsorptions/Desorptions-Trennfraktionen aus den Algen

P. tricornutum 1a, P. tricornutum 1b und P. tricornutum 6 zeigen qualitativ in der

analytischen DC sowie in den MALDI-Massenspektren equivalente Ergebnisse,

Ergebnisse

- Seite 78 -

die das Vorkommen von SQDG in diesen Stämmen bestätigen. Die Auswertung

von Massenspektren der selektierten P. tricornutum-Stämme erfolgt daher bei-

spielhaft mit den Daten des Stammes P. tricornutum 1b.

Das MS1-Massenspektrum der Fraktion von P. tricornutum 1b zeigt die Molekül-

ionen m/z 791,8 und m/z 839,8 (Abb. 5.19). Zusätzlich wird in diesem Spektrum

die Fragmentierung mit dem m/z-Wert 821,9 einer weiteren Verbindung als

Basepeak detektiert. Eine massenspektrometrische Charakterisierung dieser

Verbindung erfolgt in Kap. 5.4.4.

Abb. 5.18. a) MS1-Massenspektrum von SQDG aus P. tricornutum 1b im negative ion mode; MS2-

Spektren von (b) m/z 791,8 (SQDG C16:1/C16:0) und c) m/z 839,8 (SQDG C20:5/C16:0);

Laserenergieeintrag 7 µJ (MS1) bzw. 22 µJ (MS2)

Ergebnisse

- Seite 79 -

Die Molekülmassen m/z 791,8 und m/z 839,8 werden in der Ionenfalle selektiert

und die Bildung der MS2-Fragmentionen (m/z 537,4, m/z 537,3 und m/z 224,9)

wird durch CID mit Argon induziert. Die SQDG-Fragmentionen (m/z 537,4

bzw. m/z 537,3) tragen an sn-2-Position einen Palmitoylrest (C16:0) und resul-

tieren aus dem neutralen Verlust der Palmitoleinsäure (C16:1) und der Eicosa-

pentaensäure (C20:5). Auch die Eliminierung der Sulfoquinovose mit m/z 224,9

wird in den MS3-Massenspektren nachgewiesen (Abb. 5.19). Basierend auf den

massenspektrometrischen Daten wird in P. tricornutum 1b und auch den

weiteren selektierten P. tricornutum-Stämmen 1a und 6 die Biosynthese von

SQDG (C16:1/C16:0 und C20:5/C16:0) bestätigt.

5.4.3.3 Chlorophyta

In den aufgereinigten Fraktionen der Chlorella-Stämme C. vulgari, C. salina und

C. kessleri können keine SQDG-assoziierten Peaks im Massenspektrum der

MALDI-Messung gefunden werden (Daten nicht gezeigt). Dies bestätigt die

Auswertung der analytischen DC, in der ebenso keine potentiellen SQDG-Spots

visualisiert worden sind.

5.4.3.4 Cyanophyta

Arthrospira platensis N-39

Für die Fraktion des Cyanobakteriums A. platensis N-39 kann im MS1-Massen-

spektrum kein relevanter Massenpeak für SQDG nachgewiesen werden. Dieses

Ergebnis korreliert mit den Daten der DC-Auswertung (Kap. 5.3.2.4).

Arthrospira platensis N-46

Die MALDI ToF-Messungen der potentiellen SQDG-Fraktion des Cyanobak-

teriums A. platensis N-46 bestätigen die SQDG-Bildung und sind konform mit

der Auswertung der analytischen DC dieser Fraktion.

Das hochaufgelöste MS1-Massenspektrum der Fraktion zeigt das Molekülion

m/z 817,6 mit einem Isotopenpattern. Das MS1-Fragmention m/z 537,3 wird in

den MS2-Experimenten nach Selektion des Molekülions m/z 817,6 in der Qtrap

durch CID bestätigt. Es resultiert aus dem Neutralverlust der Linolsäure (C18:2)

und ist strukturell durch einen sn-1-positionierten Palmitoylrest (C16:0)

Ergebnisse

- Seite 80 -

charakterisiert. Ein weiteres Fragmention m/z 561,4 wird im MS2-Massen-

spektrum durch Neutralverlust der sn-1-veresterten Palmitinsäure (C16:0) vom

Molekülion m/z 817,6 detektiert. An der sn-2-Position dieses Fragmentions ist

eine Linolsäure (C18:2) inkorporiert. Die Eliminierung von Sulfoquinovose

wird erneut durch das Ion m/z 224,8 im MS2-Massenspektrum bestätigt

(Abb. 5.20).

Unter den gegebenen Kultivierungsbedingungen können für das Cyanobak-

terium A. platensis N-46 die Bildung der unterschiedlichen SQDG-Strukturen

(C18:2/C16:0 und C16:0/C18:2) mit gleicher Molekülmasse (m/z 817,6) massen-

spektrometrisch nachgewiesen werden.

Abb. 5.20 a) MS1-Massenspektrum von SQDG aus A. platensis N-46 im negative ion mode; MS2-

Spektren von (b) m/z 817,6 (SQDG 18:2/C16:0 bzw. SQDG C16:0/C18:2), Laserenergieeintrag

7 µJ (MS1) bzw. 22 µJ (MS2)

Ergebnisse

- Seite 81 -

Scytonema hofmanii

Die massenspektrometrischen Untersuchungen bestätigen ebenso wie die DC-

Daten der aufgereinigten Fraktion von S. hofmanii die Bildung von SQDG in

diesem Organismus.

Das MS1-Massenspektrum zeigt das Molekülion m/z 817,5. Nach Selektion

dieses Molekülions in der Qtrap und dessen Fragmentierung durch CID können

die m/z-Werte 537,5 und 224,9 im MS2-Massenspektrum ermittelt werden. Das

Fragmention m/z 537,5 wird bereits im MS1-Massenspektrum als post source

decay oder in source decay-Fragment nach Eliminierung von Linolsäure an sn-1-

Position detektiert (Abb. 5.21).

Abb. 5.21 a) MS1-Massenspektrum von SQDG aus S.hofmanii im negative ion mode; MS2-

Spektrum von (b) m/z 817,5 (SQDG C18:2/C16:0); Laserenergieeintrag 7 µJ (MS1) bzw. 22 µJ

(MS2)

Ergebnisse

- Seite 82 -

Das MS2-Fragmention m/z 537,5 und das MS1-Molekülion m/z 817,5 werden

durch einen sn-2-Palmitoylrest gekennzeichnet. Das aufgenommene MS2-

Massenspektrum zeigt die Eliminierung der Sulfoquinovose mit m/z 224,9. Die

Gesamtheit der massenspektrometrischen Daten bestätigen die SQDG-Struktur.

In dem Cyanobakterium S. hofmanii wird durch die Untersuchungen die

Bildung des SQDG C18:2/C16:0 nachgewiesen.

Nostoc punctiforme

Die anhand der DC postulierten SQDG in der aufgereinigten Fraktion von

N. punctiforme können mittels MALDI trap ToF Hybrid MSn bestätigt werden.

Im MS1-Massenspektrum der SQDG-Fraktion wird der m/z-Wert 817,7

detektiert. Die Auswertung des hochaufgelösten Isotopenpatterns von m/z

817,7 kennzeichnet eine Signalüberlappung von Isotopomeren der mono-

isotopischen m/z-Werte 815,6; 817,7 und 819,6. Nach Selektion des Molekülions

m/z 815,7 im Qtrap und dessen Fragmentierung durch CID können die Ionen

m/z 537,3 bzw. m/z 559,3 als Neutralverlust von Linolensäure (C18:3) bzw.

Palmitinsäure (C16:0) im MS2-Massenspektrum nachgewiesen werden. Des

Weiteren wird auch die Eliminierung der Sulfoquinovose mit m/z 224,9 im MS2

detektiert (Abb. 5.22). Die MS1 und MS2-Spektren von m/z 815,6 stimmen mit

hoher Signifikanz mit denen des kommerziell erhältlichen Standards überein,

so dass die Bildung von SQDG (C18:3/C16:0 und C16:0/C18:3) in N. punctiforme

nachgewiesen werden kann.

Das MS2-Experiment des Molekülions m/z 817,7 zeigt die Fragmentionen

m/z 537,4 und m/z 561,5 sowie die Eliminierung der Sulfoquinovose als

m/z 224,9 im Massenspektrum. Die Fragmentionen m/z 537, 4 bzw. m/z 561,4

resultieren aus dem neutralen Verlust der Linolsäure (C18:2) bzw. der Palmitin-

säure (C16:0) aus dem Molekül durch CID. Für das Molekülion m/z 817,7

können daher die Strukturen SQDG C18:2/C16:0 und SQDG C16:0/C18:2

bestimmt werden.

Für das Molekülion m/z 819,6 können aufgrund der ungenügenden Auflösung

der Ionenoptik die MSn-Experimente nicht eindeutig ausgewertet werden.

Nach Zusammenfassung der massenspektrometrischen Daten wird die Bildung

von vier verschiedenen SQDG-Strukturen SQDG C18:3/C16:0, SQDG C16:0/

Ergebnisse

- Seite 83 -

C18:3, SQDG C18:2/C16:0 und SQDG C16:0/C18:2 in N. punctiforme eindeutig

nachgewiesen.

Abb. 5.22 a) MS1-Massenspektrum von SQDG aus N. punctiforme im negative ion mode; MS2-

Spektren von b) m/z 815,6 (SQDG C18:3/C16:0 bzw. SQDG C16:0/C18:3) und m/z 817,6 (SQDG

C18:2/C16:0 bzw. SQDG C16:0/C18:2) aufgenommen bei einem Laserenergieeintrag von 7 µJ

(MS1) bzw. 22 µJ (MS2)

5.4.3.5 Zusammenfassung der identifizierten SQDG

Die Auswertung der massenspektrometrischen Daten von SQDG aus den

phototrophen Mikroorganismen zeigt ein breites Spektrum von Strukturen mit

unterschiedlichsten Fettsäurepattern (Tab 5.2). Die identifizierten SQDG-Produ-

zenten der Mikroalgen P. purpureum, H. carterae, P. tricornutum 1a, 1b und 6

bilden SQDG mit sn-2 inkorporierter Palmitinsäure (C16:0). In der sn-1-Position

der SQDG werden vielfach ungesättigte Acylreste (C20:4; C20:5, C18 :3, C18:2)

oder einfach ungesättigte Acylreste (C16:1, C18:1) detektiert.

Ergebnisse

- Seite 84 -

Die SQDG-produzierenden Cyanobakterien (A. platensis N-46, S. hofmanni,

N. punctiforme) zeigen zumeist die Bildung eines größeren Spektrums an SQDG-

Strukturen. Bei den Stämmen A. platensis N-46 und N. punctiforme ist die Inkor-

peration der Palmitinsäure (C16:0) sowohl an sn-1 als auch an sn-2-Position des

SQDG manifestiert. Die Variation des Fettsäurespektrums hinsichtlich der sn-

Positionierung am Molekülgerüst erhöht die Anzahl möglicher Regioisomere.

Tab. 5.2 SQDG-Strukturen selektierter phototropher Mikroorganismen

Organismus MS1 (m/z) m/z Acylreste

(berechnet) sn-1-Position sn-2-Position

Rhodophyta

P. purpureum

817,6

839,6

841,6

817,5

839,5

841,5

Linoleoyl (C18:2)

Eicosapentaenoyl (C20:5)

Eicosatetraenoyl (C20:4)

Palmitoyl (C16:0)

Palmitoyl (C16:0)

Palmitoyl (C16:0)

Heterokontophyta

H. carterae

791,7

837,9

791,5

837,5

Palmitoyl (C16:0)


Palmitoleoyl (C16:1)


P. tricornutum 1a

791,6

839,6

791,5

839,5



Palmitoyl (C16:0)

Palmitoyl (C16:0)

P. tricornutum 1b

791,8

839,8

791,5

839,5



Palmitoyl (C16:0)

Palmitoyl (C16:0)

P. tricornutum 6

791,5

839,5

791,5

839,5



Palmitoyl (C16:0)

Palmitoyl (C16:0)

Cyanophyta

A. platensis N-46

817,6 817,5 Linoleoyl (C18:2)

Palmitoyl (C16:0)

Palmitoyl (C16:0)

Linoleoyl (C18:3)

S. hofmanni 817,5 817,5 Linoleoyl (C18:2) Palmitoyl (C16:0)

N. punctiforme

815,6

817,7

815,5

817,7

Linolenoyl (C18:3)

Palmitoyl (C16:0)

Linoleoyl (C18:2)

Palmitoyl (C16:0)

Palmitoyl (C16:0)

Linoleoyl (C18:2)

Palmitoyl (C16:0)

Linolenoyl (C18:3)

5.4.4 MALDI ToF von Ac-SQDG aus phototrophen Mikroorganismen


Die zwei neuartigen SQDG-Strukturen der selektierten Phaeodactylum-Stämme

(P. tricornutum 1a, 1b und 6) können mittels MALDI trap ToF Hybrid MSn

identifiziert werden. Die Auswertung der massenspektrometrischen Daten

wird exemplarisch mit den Ergebnissen der aufgereinigten Fraktion von

Ergebnisse

- Seite 85 -

P. tricornutum 1b dargestellt, da die drei Stämme identische Verbindungen

produzieren .

Untersuchungen der Ac-SQDG im MS1, MS2, MS3

Das MS1-Massenspektrum dieser Fraktion zeigt neben den genannten,

identifizierten Molekülionen m/z 791,8 (SQDG C16:1/C16:0) und m/z 839,8

(SQDG C20:5/C16:0) zusätzlich die Molekülionen m/z 1075,9 und m/z 1123,9.

Im MS2-Massenspektrum können die Fragmentionen m/z 508,9 und m/z 821,1

(bzw. 821,7) nachgewiesen werden. Das Fragmention m/z 821,1 resultiert aus

einem Neutralverlust von Palmitoleinsäure (C16:1) und Eicosapentaensäure

(C20:5) aus den Molekülionen m/z 1075,9 und m/z 1123,9 gemäß den bereits

dargestellten Eliminierungen an der sn-1-Position von SQDG (Schema 5.2, Abb.

5.23). Das MS2-Fragmention m/z 508,9 reflektiert die Eliminierung einer Sulfo-

quinovose mit einer veresterten Eicosapentaensäure (C20:5). Aus den MS1 und

MS2-Massenspektren kann für beide Ac-SQDG-Strukturen ein sn-2-verknüpfter

Palmitoylrest bestimmt werden.

Schema 5.2 Postulierte Fragmentierungen von Ac-SQDG im MS1, MS2 und MS3, isoliert aus

P. tricornutum 1a, P. tricornutum 1b und P. tricornutum 6

Ergebnisse

- Seite 86 -

Abb. 5.23 a) MS1-Massenspektrum von Ac-SQDG aus P. tricornutum 1b im negative ion mode. b)

MS2-Spektren von m/z 1075,9 (SQDG C16:1/C16:0/C20:5) und m/z 1123,9 (SQDG C20:5/C16:0/

C20:5) und c ) MS3-Spektren von m/z 654,1 aufgenommen bei einem Laserenergieeintrag von

7 µJ (MS1) bzw. 22 µJ (MS2, MS3)

Ergebnisse

- Seite 87 -

Die Regioposition der Eicosapentaensäure (C20:5) an der Sulfoquinovose wird

durch MS3-Experimente bestimmt. Die Selektion des Molekülions m/z 1123,9

und des MS2-Fragmention m/z 821,7 im Qtrap resultiert in den MS3-Fragment-

ionen m/z 654,1 und m/z 241,7 durch CID. Das MS3-Fragment m/z 241 stellt ein

Biradikalanion dar, welches durch homolytische Abspaltungen der Eicosa-

pentaensäure (C20:5) vom SQDG und einer weiteren homolytischen Spaltung

zwischen der Glycerol-Einheit und der Sulfoquinovose entsteht (Schema 5.2.).

Die MS3-Experimente führen weiterhin zu einer zweifachen intramolekularen

Spaltung des Hexose-Ringes zwischen den Kohlenstoffatomen 2´und 3´ sowie

zwischen dem Kohlenstoffatom 5´und dem im Vollacetal gebundenen Sauer-

stoffatom. Das resultierende Fragmention m/z 654,1 ist infolge von homo- und

heterolytischer Ringspaltung ein Radikalanion. Die Interpretation der massen-

spektrometrischen Daten erlaubt ausschließlich eine Positionierung der veres-

terten Eicosapentaensäure (C20:5) an Position 2´ der Gesamtstruktur. Der MS3-

Zerfall des Molekülion m/z 1075,9 kann analog übertragen werden.

Die Ac-SQDG-Moleküle (SQDG C16:1/C16:0/C20:5, SQDG C20:5/C16:0/C20:5)

von P. tricornutum 1a, 1b und 6 stellen SQDG mit Palmitoleoyl- (m/z 1075,9)

oder Eicosapentaenoylrest (m/z 1123,9) an der sn-1-Position, Palmitoylrest an

der sn-2-Position des Glycerols und Eicosapentaenoylrest an der 2´-Position der

Sulfoquinovose dar.

5.4.5 MS-Analyse separierter Ac-SQDG/SQDG-Fraktionen

Die separierten Ac-SQDG/SQDG-Fraktionen werden zusätzlich zur DC

(Kap. 5.3.4) massenspektrometrisch untersucht. Die Elution des Ac-SQDG

(m/z 1124,1) erfolgt in Fraktion 1. Fraktion 2 enthält Ac-SQDG mit den m/z-

Werten 1124,3 und 1075,8. Die SQDG m/z 839,7 und m/z 791,7 werden in

Fraktion 4 eluiert (Abb. 5.24). Die massenspektrometrischen Daten bestätigen

die bereits in der analytischen DC nachgewiesene Trennung von SQDG und

Ac-SQDG durch das Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren mit unmodi-

fiziertem Kieselgel.

Ergebnisse

- Seite 88 -

Abb. 5.24 Analytische DC (DC-Platte Kieselgel 60, LM EtAc/ MeOH/ 1M Ac, 24:6:1, v/v/v) a) der

aufgereinigten Ac-SQDG/SQDG-Fraktion aus P. tricornutum 1b mit den MS1-Spektren der

daraus aufgereinigten Fraktionen 1, 2 und 4 im negative ion mode, Laserenergieeintrag 7 µJ

5.4.6 Enzymatischer Verdau der Ac-SQDG

Das MS1-Spektrum einer Ac-SQDG Fraktion wird durch die Ionen mit den m/z-

Werten 1075,9 und 1123,9 gekennzeichnet. Für eine bestätigende Struktur-

charakterisierung ist diese Fraktion mit der regioselektiven Lipase von

R. arrhizus verdaut und anschließend erneut massenspektrometrisch vermessen

worden.

Das MS1-Massenspektrum der verdauten Ac-SQDG zeigt das Molekülion

m/z 555,2. Dieser Befund kennzeichnet, dass die Lipase sowohl die Fettsäure an

der sn-1-Position und auch der 2´-Position der Ac-SQDG hydrolysiert

(Schema 5.3, Abb. 5.25).

Schema 5.3 Regioselektive enzymatische Hydrolyse der sn-1- und der 2´-Position veresterten

Fettsäuren der Ac-SQDG

Ergebnisse

- Seite 89 -

Abb. 5.25 MS1 von SQMG (C16:0) nach Lipase-Verdau (R. arrhizus) von Ac-SQDG, isoliert aus

P. tricornutum 1b, im negative ion mode, Laserenergieeintrag 7 µJ

5.5 HPLC-ESI-Massenspektrometrie zur Quantifizierung von SQDG

5.5.1 Etablierung der chromatographischen Trennung

Als Basis für Prozessoptimierungen der SQDG-Produktion in phototrophen

Mikroorganismen ist eine Methode zur Quantifizierung mit HPLC-ESI-MS

etabliert worden.

Das Chromatogramm des kommerziell erhältlichen SQDG-Standards zeigt

einen breiten Peak mit einer Vielzahl an internen Maxima (Daten nicht gezeigt).

Ableitend aus diesem Ergebnis kann keine zufriedenstellende chromato-

graphische Auflösung erreicht werden.

Daher erfolgt für die quantitative Kalibrierung die Gewinnung eines SQDG-

Standard aus P. purpureum, mit dem die folgenden HPLC-Parametereinstel-

lungen für die LC-MS-Analytik der SQDG ermittelt worden sind:

C18-Säule (Lichrosorb 100 RP 18, 250*4 mm, 7µm)

30°C Säulenofentemperatur

25 µl Injektionsvolumen

0,4 ml min-1 Flussrate

30 MPa maximaler Druck

Zeitprogramm: isokratische Elution

97:3 für 3 min

Gradientenelution

Ergebnisse

- Seite 90 -

97:3 auf 92:8 (A:B) für 7 min;

isokratische Elution

92:8 (A:B) für 5 min

mit Lösemittel A-DCM/ACN/2-Propanol/MeOH 10:10:10:50 (v/v/v/v)

und Lösemittel B-MeOH

Die HPLC-Elution des SQDG-Standards erfolgt nach einer Retentionszeit von

4,10 Minuten. Das Chromatogramm zeigt einen Peak mit einem engen Konzen-

trationsprofil (Abb. 5.26).

Abb. 5.26 HPLC-ESI-MS-Chromatogramm des SQDG-Standards (100 ppm) isoliert aus

P. purpureum, im total ion collection mode (TIC); C18-Säule, isokratisch 97:3 A:B für 3 min,

Gradient 97:3 A:B zu 92:8 A:B für 7 min und 92:8 A:B für 5 min (A: DCM/ACN/2-Propa-

nol/MeOH 10:10:10:50 (v/v/v/v), B: MeOH)

Die Massenspektren von SQDG aufgenommen durch HPLC-ESI-MS bzw.

MALDI trap ToF Hybrid MS (negative ion mode) entsprechen einander. Die

SQDG sind in beiden Spektren durch die m/z-Werte 817, 839 und 841

gekennzeichnet (Abb. 5.27 bzw. Abb. 5.15). Die ESI-MS-Ergebnisse bestätigen

zusätzlich zu den MALDI-Untersuchungen ebenso das Vorkommen der SQDG

(C18:2/C16:0, C20:4/C16:0 und C20:5/C16:0).

Ergebnisse

- Seite 91 -

Zur Erstellung einer Kalibriergerade sind verschiedene Konzentrationen SQDG

mit der HPLC aufgetrennt worden. Nach Peakextration im Bereich von m/z 839

bis 842 resultiert für verschiedene Konzentrationen (10 ppm, 50 ppm, 100 ppm,

500 ppm) folgende Kalibriergerade

SQDG [ppm] = Area [-]/195492 (Formel 5.1)

mit einem Bestimmtheitsmaß (R2) von 0,95 (Abb. 5.28).

Abb. 5.27 ESI-Massenspektrum des SQDG-Standards isoliert aus P. purpureum

Abb. 5.28 Kalibriergerade des SQDG-Standards (isoliert aus P. purpureum) ermittelt mit der

HPLC-ESI-MS

Ergebnisse

- Seite 92 -

5.6 Untersuchungen zur Optimierung der SQDG-Bildung

Nachfolgend sind erste Untersuchungen zur Steigerung der SQDG-Produktion

mit dem Modellorganismus A. platensis N-46 durchgeführt worden. Das Cyano-

bakterium ist hinsichtlich seiner Kultivierungsanforderungen (z. B. Medium,

Temperatur) bereits gut charakterisiert und vorangegangene analytische Unter-

suchungen bestätigen die SQDG-Bildung in diesem Stamm. Die SQDG-Biosyn-

these soll durch Variation der Bestrahlungsstärke und der Phosphatquelle/-

konzentration beeinflusst werden. Nach Kultivierung, Extraktion der Biomasse

und Aufarbeitung der Extrakte im Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren

erfolgt die quantitative Bestimmung der Produktausbeute mittels HPLC-ESI-

MS.

5.6.1 Variation der Bestrahlungsstärke

In diesem Versuchsansatz ist A. platensis N-46 in den PSM bei unterschiedlichen

Bestrahlungsstärken (30 µE m-2 s-1, 60 µE m-2 s-1, 80 µE m-2 s-1, 110 µE m-2 s-1 und

140 µE m-2 s-1) unter sonst gleichen Prozessparametern im Parallelansatz

kultiviert worden. Die zunehmende Bestrahlungsstärke von 30 µE m-2 s-1 auf

110 µE m-2 s-1 führt zu einer 160 %igen Steigerung der maximalen Biomasse-

konzentration von 0,79 gBTM l-1 auf 2,05 gBTM l-1. Der Kulturansatz 110 µE m-2 s-1

erreicht im Vergleich zu den anderen Ansätzen ein Maximum an gebildeter

Biomasse. Eine weitere Erhöhung der PPFD auf 140 µE m-2 s-1 resultiert in der

Reduktion der BTM auf 1,29 gBTM l-1 (Abb. 5.29).

Die ermittelten maximalen Wachstumsraten (µmax) variieren zwischen den

Kultivierungen mit den Bestrahlungsstärke von 60, 80, 110 und 140 µE m-2 s-1

nicht signifikant und liegen im Bereich von µmax 0,59 bis 0,60 d-1. Der

Kultivierungsansatz mit 30 µE m-2 s-1 divergiert zu diesen Ergebnissen und

erreicht eine geringere maximale Wachstumsrate von µmax 0,46 d-1.

Makroskopische Beobachtungen der Kultivierungen zeigen eine Aufhellung

der Biomasse mit ansteigender Bestrahlungsstärke (Abb. 5.29).

Ergebnisse

- Seite 93 -

Abb. 5.29 a) Vergleich der maximalen Biomassekonzentration in der Kultivierung von

A. platensis N-46 bei unterschiedlichen Bestrahlungsstärken (30, 60, 80, 110 und 140 µE m-2s-1) in

den PSM, b) Foto der Kultivierung nach t = 6 d

Die Ernte der Biomasse zur Aufreinigung der SQDG erfolgt zu Beginn der

stationären Wachstumsphase und variiert aufgrund des unterschiedlichen

Wachstums der einzelnen Kultivierungsansätze zeitlich (80 µE m-2 s-1 nach

162,5 h; 60 µE m-2 s-1, 110 µE m-2 s-1 und 140 µE m-2 s-1 nach 190 h; 30 µE m-2 s-1

nach 218 h). Die qualitative Kontrolle der aufgereinigten SQDG-Fraktionen mit

analytischer DC zeigt in allen Kultivierungsansätzen die Bildung von SQDG

(Abb. 5.30).

Ergebnisse

- Seite 94 -

Die spezifische Produktausbeute wird durch Zunahme der Bestrahlungsstärke

von 60 µE m-2 s-1 (0,40 mgSQDG gBTM-1) auf 140 µE m-2 s-1 (0,76 mgSQDG gBTM-1) um ca.

90 % gesteigert (Abb. 5.30). Die maximale spezifische Ausbeute von

0,83 mgSQDG gBTM-1 wird jedoch in der Kultivierung mit einer eingestellten PPFD

von 30 µE m-2 s-1 bestimmt. Im Vergleich zum Kulturansatz mit einer Bestrah-

lungsstärke von 60 µE m-2 s-1 wird die spezifische SQDG-Ausbeute um ca. 107 %

erhöht.

Abb. 5.30 Vergleich der SQDG-Ausbeuten bei Variation der Bestrahlungsstärke (30, 60, 80 ,110,

140 µE m-2 s-1) a) qualitativ in der DC, b) quantitativ bestimmt mittels HPLC-ESI-MS (RZA

80 µE m-2 s-1 nach t=162,5 h; 60, 110 und 140 µE m-2 s-1 nach t=190 h; 30 µE m-2 s-1 nach t=218 h

Prozesszeit)

Im Gegensatz zur ermittelten spezifischen SQDG-Ausbeute unterscheiden sich

die ermittelten Raum-Zeit-Ausbeuten der SQDG für die Ansätze 30µE m-2 s-1,

und 60 µE m-2 s-1 nicht signifikant (0,07 bzw. 0,06 mgSQDG l-1 d-1). Durch die Zu-

nahme der PPFD von 60 µE m-2 s-1 auf 110 µE m-2 s-1 wird eine Steigerung der

Ergebnisse

- Seite 95 -

RZA um ca. 165 % auf 0,16 mgSQDG l-1 d-1 erzielt. Durch eine weitere Erhöhung

der Bestrahlungsstärke von 110 µE m-2 s-1 auf 140 µE m-2 s-1 wird die RZA jedoch

auf 0,12 mgSQDG l-1 d-1 verringert. Insgesamt wird die maximale RZA

(0,16 mgSQDG l-1 d-1) in diesem Versuch im Kultivierungsansatz mit einer Bestrah-

lungsstärke von 110 µE m-2 s-1 erzielt (Abb. 5.30).

5.6.2 Variation der Phosphatquelle/-konzentration

In den folgenden Untersuchungen ist der Einfluss der Phosphatquelle und der

Phosphatkonzentration auf die SQDG-Produktion in A. platensis untersucht

worden. Die Phosphatquelle Dikaliumhydrogenphosphat (K2HPO4, Ortho-

phosphat, Standardkultivierung) wird äquimolar durch Dikaliumpyrophosphat

(K2P2O7) im Medium substituiert. In zwei weiteren Kultivierungsansätzen wird

das substituierte Kaliumpyrophosphat um den Faktor 10 reduziert. Zusätzlich

wird bei einem dieser Ansätze die Bestrahlungsstärke zum Ende der exponen-

tiellen Wachstumsphase von 60 auf 0 µE m-2 s-1 eingestellt.

Die maximalen Biomassekonzentrationen der Ansätze mit K2P2O7 (1:1 bzw.

1:10) im Medium zeigen im Vergleich zur Kultivierung mit Standardmedium

keine signifikanten Unterschiede. Sie liegen im Bereich von 1,10 bis 1,24 gBTM l-1

(Abb. 5.31). Im Gegensatz dazu erreicht der Ansatz mit eine veränderten

Bestrahlungsstärke (60 � 0 µE m-2 s-1, 1:10 K2P2O7) im Vergleich zur Standard-

kultivierung eine um 44 % reduzierte maximale Biomasseausbeute von

0,70 gBTM l-1. Die Zellen wachsen nach Veränderung der Bestrahlungsstärke

nicht mehr weiter und gehen früher in die stationäre Wachstumsphase über

(Abb. 5.32).

Während der exponentiellen Wachstumsphase liegen die maximalen Wachs-

tumsraten aller Ansätze im Bereich von 0,59 bis 0,65 d-1 und variieren nicht

signifikant.

Die Ernte der Biomasse erfolgt zu Beginn der stationären Wachstumsphase

(Standardansatz und Ansatz 1:10 K2P2O7 60�0µE m-2 s-1 nach t=184,5 h; Ansatz

1:10 K2P2O7 und Ansatz 1:1 K2P2O7 nach t=193 h). Die analytische DC der aus

der Biomasse aufgearbeiteten Proben weist qualitativ das Vorkommen von

SQDG in allen Ansätzen nach (Abb. 5.33).

Ergebnisse

- Seite 96 -

Abb. 5.31 Vergleich der maximal Biomassekonzentration in der Kultivierung von

A. platensis N-46 bei Variation der Phosphatquelle (Standard K2HPO4, K2P2O7) und der

Phosphatkonzentration (1:1, 1:10) in den PSM bei einer Bestrahlungsstärke von 60 µE m-2 s-1

bzw. im Ansatz 60 � 0 µE m-2 s-1 nach 141,5 h für weitere 43 h

Abb. 5.32 Zeitliche Verläufe der Biomassekonzentration BTM der Kulturansätze 1:10 K2P2O7 mit

konstanter Bestrahlungsstärke (I0) von 60 µE m-2 s-1 und 1:10 K2P2O7 mit I0 60 � 0 µE m-2 s-1

während der Kultivierung von A. platensis N-46 in den 1 l Photobioreaktoren (PSM)

Ergebnisse

- Seite 97 -

Abb. 5.33 Vergleich der SQDG-Ausbeuten in der Kultivierung von A. platensis N-46 bei

Variation der Phosphatquelle K2HPO4 (Standard) und K2P2O7) sowie der Phosphatkonzentra-

tion (1:1, 1:10) in den PSM bei einer Bestrahlungsstärke von 60 µE m-2 s-1 bzw. in einem Ansatz

60 � 0 µE m-2 s-1 nach t= 141,5 h für t=43 h a) qualitativ in der DC, quantitativ bestimmt mittels

HPLC-ESI-MS (RZA Standard K2HPO4 und 1:10 K2P2O7, 60 � 0 µE m-2 s-1 nach t=184,5 h; 1:10

K2P2O7 und K2P2O7 nach t=193 h)

Die quantitative Bestimmung mit HPLC-ESI-MS belegt die Steigerung der

spezifischen SQDG-Ausbeute um ca. 40 % von 0,73 mgSQDG gBTM-1 (Standard) auf

1,03 mgSQDG gBTM-1, wenn die Phosphatquelle K2HPO4 im Kultivierungsmedium

äquimolar mit Kaliumpyrophosphat (K2P2O7)ersetzt wird. Die Kultivierung mit

einem geringeren Phosphatanteil im Kulturmedium (1:10 K2P2O7) resultiert im

Vergleich zur Standardkultivierung in einer ca. 10 % höheren spezifischen

SQDG-Ausbeute (0,80 mgSQDG gBTM-1).

Für den Ansatz mit veränderter Bestrahlungsstärke (60�0 µE m-2 s-1) und 1:10

K2P2O7 wird in dieser Versuchsreihe mit 1,44 mgSQDG gBTM-1 die größte spezifische

SQDG-Ausbeute ermittelt. Im Vergleich zur Standardkultivierung (K2HPO4,

60 µE m-2s-1) kann die spezifische Ausbeute um ca. 100 % gesteigert werden.

Ergebnisse

- Seite 98 -

In der ermittelten Raum-Zeit-Ausbeute der SQDG-Bildung der einzelnen Kulti-

vierungsansätze sind nur geringe Unterschiede erkennbar. Die kleinste RZA-

Ausbeute von 0,11 mgSQDG l-1 d-1 wird dabei in der Kultur mit der geringeren

Phosphatkonzentration (1:10 K2P2O7) ermittelt. Die höchste RZA wird mit

0,15 mgSQDG l-1 d-1 bei der Kultivierung mit Kaliumpyrophosphat (1:1 K2P2O7) im

Medium erreicht. Dies bedeutet im Vergleich zur Standardkultivierung mit

einer RZA von 0,12 mgSQDG l-1 d-1 eine Steigerung um ca. 25 %.

5.7 Biologische Aktivitäten der SQDG/Ac-SQDG

Die aufgereinigten und strukturcharakterisierten Fraktionen der SQDG bzw.

Ac-SQDG werden in verschiedenen Assays hinsichtlich ihrer antiviralen

Aktivität mit HCMV als Targetvirus und ihrer inhibierenden Wirkung gegen-

über der HIV-Reversen Transkriptase getestet. Die Aktivitätsuntersuchungen

erfordern zusätzlich die Bestimmung der Zytotoxizität von potentiellen Wirk-

stoffen.

5.7.1 Antiviraler Bioassay mit HCMV

5.7.1.1 Herstellung von hochtitrigen Virusstöcken

Die Etablierung des antiviralen Testsystems erfordert einen Virusstock mit

einer hohen Anzahl von infektiösen Viruspartikeln (Virustiter, APU ml-1).

Diesbezüglich sind vergleichende Untersuchungen zur Herstellung des Virus-

stocks nach zwei verschiedenen Methoden durchgeführt worden.

Methode 1

Die MRC-5-Wirtszellen werden bei einer Konfluenz von 10 bis 20 % (~3 bis

8*103 LZZ cm-2) mit einer MOI von 0,01 infiziert und der Virusstock nach ca.

10 d p. I. bei einer Wirtszellvitalität von größer 85 % geerntet.

Methode 2

Die MRC-5-Wirtszellen werden bei 80 % Konfluenz (~ 3*104 LZZ cm-2) mit einer

MOI von 0,1 infiziert und der Virusstock 7 d p. I. geerntet.

Ergebnisse

- Seite 99 -

Zusätzlich zu den beiden genannten Methoden ist der Einfluss der FKS-

Konzentration (5 bzw. 10 %) im Medium auf den Virustiter des generierten

Virusstockes untersucht worden.

Nach Auswertung der Immunoperoxidasefärbung von viralen IE-Proteinen

infizierter Wirtszellen kann für die Anzucht des Virusstockes nach Methode 1)

ein um den Faktor 3 bzw. 5 höherer Virustiter für die Kultivierungen mit 5 bzw.

10 % FKS im Vergleich zu Methode 2) verzeichnet werden (Abb. 5.34). Im

Versuchsansatz mit 5 % FKS werden Virustiter von 8,03*105 APU ml-1

(Methode 1) bzw. von 2,73*105 APU ml-1 (Methode 2) erzielt, während für die

Anzucht des Virusstocks mit 10 % FKS Virustiter von 6,30*105 APU ml-1

(Methode 1) bzw. von 1,24*105 APU ml-1 (Methode 2) ermittelt werden können.

Diese Ergebnisse lassen auch auf die Reduktion der Virusinfektion durch

höhere FKS-Konzentrationen im Medium schließen. Die Steigerung der FKS-

Konzentration von 5 auf 10 % im Medium vermindert den Virustiter um ca.

20 % bei Herstellung nach Methode 1) und um ca. 55 % nach Methode 2).

Abb. 5.34 Virustiter der hergestellten Virusstöcke nach Methode 1: TOI 10-20 % Konfluenz der

Wirtszellen, Ernte ~ 10 d p. I. und nach Methode 2: TOI 80 % Konfluenz der Wirtszellen, Ernte

7 d p. I.; quantifiziert durch IE-Antikörperfärbung nach 24 h p. I.

Ergebnisse

- Seite 100 -

5.7.1.2 Vergleich der Assays IE-POX und DE-POX

Die vergleichende Quantifizierung nach Immunoperoxidasefärbung viraler IE

bzw. DE-Proteine infizierter Zellen zeigt, dass die Bestimmung des Virustiters

in der POX-Färbung der DE-Proteine eine Größenordnung in der ermittelten

APU ml-1 höher liegt als in der IE-Proteinfärbung (Abb. 5.35). Die nach DE- und

IE-POX-Färbung unterschiedlich ermittelten Virustiter beeinflussen die Aus-

wertung antiviraler Wirksamkeiten von Substanzen bezogen auf die ermittelte

Viruslast [%] jedoch nicht, da die Infektionen unabhängig vom ermittelten Titer

mit ~ 80 APU Well-1 erfolgt. Die antiviralen Untersuchungen mit der

Referenzsubstanz Dextransulfat bestätigen dies, da die ermittelte IC50-Werte

(IC50,IE 1,6 µg ml-1, IC50,DE 1,3 µg ml-1) um maximal 0,3 µg ml-1 variieren (Kap.

5.7.1.3).

Die Ergebnisse der ermittelten Virustiter im IE- als auch im DE-HCMV-POX-

Assay belegen eine virusinhibierende Wirkung von FKS bei der Infektion der

Wirtszellen. Die Verwendung von 10 % FKS im Medium reduziert die detek-

tierte Anzahl infizierter Zellen bei beiden Methoden der Immunoperoxidase-

färbungen. In allen nachfolgenden antiviralen Assayuntersuchungen sind daher

die infizierten Zellen ausschließlich in einem Medium mit einer maximalen

FKS-Konzentration von 5 % kultiviert worden. Eine weitere Reduktion des

FKS-Anteils im Medium würde das Wachstum der MRC-5-Zellen inhibieren.

Abb. 5.35 Virustiter der hergestellten Virusstöcke nach POX-Färbung infizierter Zellen mit IE-

(1d p. I.) und DE-Antikörpern (3 d p. I.), Anzucht in Medium mit 5 und 10 % FKS, Infektion TOI

bei 10–20 % Konfluenz, Ernte 10 d p. I. .

Ergebnisse

- Seite 101 -

5.7.1.3 Etablierung des HCMV-Assays mit Standardsubstanzen

Im Rahmen der antiviralen Untersuchungen ist ein antiviraler IE-HCMV-POX-

Testassay etabliert worden. Dieser detektiert die Inhibierung der Virusad-

sorption/-fusion mit der Wirtszelle oder eines anderen viralen Replikations-

schrittes bis zur zeitlichen Expression der IE-Proteine. Die Anwendbarkeit des

IE-POX-HCMV-Assays ist zunächst mit den antiviralen Referenzsubstanzen

Dextransulfat und Ganciclovir überprüft worden.

Im Assay ist durch Detektion der IE-Proteine zu verschiedenen Zeitpunkten

post infectum die Aktivität von Dextransulfat getestet worden. Die Viruslast

wird dabei in allen Ansätzen mit den verschieden langen Inkubationszeiten (24,

30, 48 und 72 h p. I.) konzentrationsabhängig mit einem vergleichbaren Trend

inhibiert (Daten nicht gezeigt). In den kinetischen Ansätzen der IE-POX-

Färbung wird für Dextransulfat ein mittlerer IC50-Wert von 1,6 µg ml-1

bestimmt. Dieser variiert maximal um 0,3 µg ml-1. Der ermittelte IC50,IE-Wert

von Dextransulfat weicht geringfügig von dem IC50,DE-Wert (1,3 µg ml-1) ab,

welcher von Dr.-Ing. S. Thulke, Charité Berlin im DE-HCMV-POX-Assays

bestimmt worden ist.

Abb. 5.36 Vergleich der Wirksamkeit der antiviralen Standardsubstanzen Dextransulfat (DS)

und Ganciclovir (GV) in den antiviralen Assays mit IE- und DE-POX-Antikörperfärbung

Ergebnisse

- Seite 102 -

Die Verwendung des replikationsinhibierenden HCMV-Standardtherapeuti-

kums Ganciclovir (GV) zeigt im Vergleich zu Dextransulfat (DS) ausschließlich

im Assay der DE-POX-Färbung eine Reduktion der Viruslast (Abb. 5.36). Die in

den Assays untersuchten Konzentrationen orientierten sich dabei an den Kon-

zentrationen (IC50,DS 1,3 µg ml-1, IC50,GV 16 µg ml-1), welche die Viruslast um 50 %

im DE-HCMV-Assay gehemmt haben [Thulke, 2007], bzw. stellen die ungefähr

doppelte Konzentration der IC50,DE (DS 3 µg ml-1, GV 30 µg ml-1) dar.

Im Assay der POX-Färbung viraler IE-Proteine werden für Ganciclovir Virus-

lasten detektiert, die dem Ansatz der Positivkontrolle ohne Virustatikum

entsprechen. Im Gegensatz zu Dextransulfat kann der Assay mit der IE-POX-

Färbung die antivirale Aktivität von Ganciclovir nicht erfassen und ist daher

nicht geeignet für die Identifizierung replikationsinhibierender Substanzen.

5.7.2 Anti-HCMV Aktivität der SQDG

Die aus den phototrophen Mikroorganismen aufgereinigten SQDG-Fraktionen

sind hinsichtlich einer antiviralen Wirksamkeit mit dem etablierten IE-HCMV-

POX-Virusassay getestet worden.

Die SQDG-Fraktionen zeigen dabei eine konzentrationsabhängige Abnahme

der Viruslast im IE-HCMV-POX-Assay und die ermittelten IC50-Werte liegen im

Bereich von 19 µg ml-1 bis 93 µg ml-1. Die Standardabweichungen der ermittel-

ten Viruslasten sind bei den eingesetzten SQDG-Inhibitorkonzentrationen

besonders bei kleinen Konzentrationen sehr groß. Beispielsweise kann für

isolierte SQDG aus P. purpureum bei einer Konzentration von 25 µg ml-1 im

Vergleich zum Standard ohne Inhibitor eine mittlere Viruslast von 108 %

detektiert werden, wobei die Standardabweichung 57 % beträgt.

Die Ergebnisse der antiviralen Untersuchungen von SQDG-Fraktionen aus den

selektierten Mikroalgen werden im Folgenden dargestellt.

5.7.2.1 Rhodophyta

Die aus P. purpureum isolierte SQDG-Fraktion zeigt bei Verwendung von

Konzentrationen im Bereich von 50 bis 200 µg ml-1 die Reduktion der Viruslast.

Ableitend aus der konzentrationsabhängigen Inhibierung kann ein IC50-Wert

von 65 µg ml-1 ermittelt werden (Abb. 5.37).

Ergebnisse

- Seite 103 -


Die SQDG-haltige Fraktion von H. carterae belegt die Reduktion der Viruslast in

Korrelation mit einer Erhöhung der SQDG-Konzentration von 25 auf

200 µg ml-1. Im Vergleich zur Positivkontrolle ohne Inhibitor wird bei einer

SQDG-Konzentration von 57 µg ml-1 (IC50) nur noch die Hälfte der Zellen

infiziert (Abb. 5.37).

Abb. 5.37 Anti-HCMV Aktivität der SQDG-Fraktionen aus H. carterae und P. purpureum als

ermittelte Viruslast im IE-HCMV-POX-Assay

Für P. tricornutum 1a, P. tricornutum 1b und P. tricornutum 6 sind zunächst die

Desorptions/Adsorptions-Trennfraktionen untersucht worden, die sowohl

SQDG als auch Ac-SQDG beinhalten. Die Untersuchung der separierten SQDG

und Ac-SQDG werden in Kap. 5.7.4 dargelegt.

Die Fraktionen weisen im IE-HCMV-POX-Assay eine konzentrationsabhängige

Inhibierung der Virusreplikation auf. Aus diesen Ergebnisse können IC50-Werte

im Bereich von 33 bis 72 µg ml-1 ermittelt werden. Im Vergleich weist die

aufgereinigte Fraktion von P. tricornutum 1a mit einer IC50 von 33 µg ml-1 eine

geringfügig höhere antivirale Wirkung als die SQDG-Fraktionen von P. tricor-

nutum 1b (IC50 45 µg ml-1) und von P. tricornutum 6 (IC50 72 µg ml-1) auf (Abb.

5.38).

Ergebnisse

- Seite 104 -

Abb. 5.38 Anti-HCMV Aktivität der aufgereinigten Fraktionen mit SQDG und Ac-SQDG aus

P. tricornutum 6, P. tricornutum 1a und P. tricornutum 1b als ermittelte Viruslast im IE-HCMV-

POX-Assay

5.7.2.3 Cyanophyta

Für die SQDG-Fraktionen der Cyanobakterien A. platensis, S. hofmanni und

N. punctiforme ergeben sich unterschiedliche Werte hinsichtlich der Inhibierung

der HCMV-Replikation im IE-HCMV-POX-Assay.

Die SQDG-Fraktion von A. platensis N-46 zeigt bei den eingesetzten Konzen-

trationen von 25 µg ml-1 und 50 µg ml-1 einen geringfügigen Anstieg der Virus-

last (111 bzw. 116 %) im Vergleich zur Viruslast der Kontrolle ohne Inhibitor

(100 %). Eine Erhöhung der Konzentration von 75 µg ml-1 auf 200 µg ml-1 resul-

tiert in einer Reduktion der Viruslast, so dass für diese SQDG-Fraktion ein IC50-

Wert von 93 µg ml-1 ermittelt werden kann (Abb. 5.39).

Eine effektivere antivirale Wirkung im IE-HCMV-POX-Assay kann für die

SQDG-Fraktionen der Cyanobakterien S. hofmanni und N. punctiforme nachge-

wiesen werden (Abb. 5.39). Die 50 %ige Reduktion der Viruslast (IC50) erfolgt

bei diesen Fraktionen entsprechend der Berechnung bereits bei Konzen-

trationen von 19 µg ml-1 (S. hofmanni) bzw. 44 µg ml-1 (N. punctiforme).

Ergebnisse

- Seite 105 -

Abb. 5.39 Anti-HCMV Aktivität der aufgereinigten SQDG-Fraktionen aus den Cyanobakterien

A. platensis N-46, S. hofmanni und N. punctiforme als ermittelte Viruslast im IE-HCMV-POX-

Assay

5.7.3 Anti-HCMV-Aktivität und Zytotoxizität der SQDG

Zusätzlich zu den Untersuchungen der isolierten SQDG im antiviralen IE-POX-

HCMV-Testassay sind weitere Tests hinsichtlich der Zytotoxizität auf die

MRC-5 Wirtzelllinie und der antiviralen Inhibierung im DE-HCMV-POX-Assay

von Dr.-Ing. S. Thulke (Charité Berlin) erfolgt.

Die zytotoxische Wirkung der SQDG und damit der CC50-Wert wird über die

metabolische Umsetzung des Tetrazoliumsalzes im WST-1-Testes ermittelt. Im

WST-1 Test können nach 1 d Inkubation der Zellen mit den SQDG nur für die

SQDG-Fraktionen von N. punctiforme und S. hofmanni die CC50-Wert mit

315 µg ml-1 bzw. 110 µg ml-1 ermittelt werden (Tab. 5.3). Für die anderen unter-

suchten SQDG-Fraktionen wird dabei die CC50 bis zur maximal eingesetzten

Konzentration der SQDG nicht erreicht. Eine Behandlung der MRC-5 Zellen mit

den SQDG-Fraktionen über eine Inkubationsdauer von 3 d resultiert in CC50-

Werten im Bereich von 55 µg ml-1 bis 275 µg ml-1. Die SQDG-Fraktion von

S. hofmanii weist im Vergleich zu den restlichen Proben mit einem CC50-Wert

von 55 µg ml-1 die höchste Zytotoxizität auf. Zusammenfassend wird eine hohe

zytotoxische Wirkung der untersuchten SQDG auf die Wirtszellen MRC-5

festgestellt.

Die weiterführenden antiviralen Untersuchungen der SQDG-Fraktionen im DE-

HCMV-POX-Assay bestätigen die im IE-HCMV-POX-Assay nachgewiesene

Ergebnisse

- Seite 106 -

antivirale Wirkung dieser Verbindungsklasse. Die ausgeprägteste Inhibierung

des HCMV weist die SQDG-Fraktion von S. hofmanii mit IC50,IE 19 µg ml-1 und

IC50,DE 1,3 µg ml-1 auf. Die ermittelten IC50-Werte der unterschiedlichen POX-

Färbemethoden unterscheiden sich bei dieser Fraktion um eine Größen-

ordnung. Im Gegensatz dazu liegen die IC50-Werte der SQDG-Fraktion von

N. punctiforme (IC50,IE 44 µg ml-1 und IC50,DE 38 µg ml-1) bei der Auswertungen

beider Testassays in der gleichen Größenordnung und unterscheiden sich

untereinander um ca. 15 %. Die IC50-Werte der weiteren SQDG-Fraktionen

weisen im DE-HCMV-POX-Assay im Vergleich zum IE-HCMV-POX-Assay

eine um den Faktor 2 bis 4 höhere Konzentration auf (Tab. 5.3).

Tab. 5.3 Antivirale Aktivitäten des IE-HCMV-POX- und des DE-HCMV-POX-Assay im

Vergleich sowie die Zytotoxizität gegenüber MRC-5-Wirtszellen von SQDG-Fraktionen

phototropher Mikroorganismen (p. I. – post infectum)

SQDG-Fraktion IC50 [µg ml-1]

IE-HCMV-POX

(1d p. I.)

IC50 [µg ml-1]

DE-HCMV-POX

(3 d p. I.)

CC50 [µg ml-1]

MRC-5

(1 d)

CC50 [µg ml-1]

MRC-5

(3 d)

[Thulke, 2007]

Rhodophyta

P. purpureum 65 192 >660 115

Heterokontophyta

H. carterae 57 226 >2000 95

P. tricorntum 1a 33 127 >2000 275

P. tricorntum 1b 45 150 >1750 80

P. tricorntum 6 72 113 >1250 70

Cyanophyta

A. platensis N-46 93 200 >750 150

S. hofmanni 19 1,3 110 55

N. punctiforme 44 38 315 185

Referenzsubstanzen

Dextransulfat 1,6 1,3 21400 -

Ganciclovir - 14 6000 -

Die im DE-HCMV-POX-Assay bestimmten IC50-Werte der SQDG-Fraktionen

von S. hofmanii und von N. punctiforme liegen in der gleichen Größenordnung

der Referenzsubstanzen Ganciclovir und Dextransulfat. Die anderen SQDG-

Fraktionen liegen in den ermittelten IC50-Werten im IE-HCMV-POX-Assay

hinsichtlich ihrer Wirksamkeiten um ein bzw. zwei Größenordnungen höher.

Ergebnisse

- Seite 107 -

5.7.4 Anti-HCMV-Aktivität und Zytotoxizität der Ac-SQDG

Die separierten Ac-SQDG- bzw. SQDG-Fraktionen aus P. tricorntum 1b sind

hinsichtlich ihrer anti-HCMV Aktivität und ihrer Zytotoxizität untersucht

worden (Durchführung des DE-HCMV-POX-Assay und des Zytotoxizitäts-

testes von Dr. S. Thulke, Charité Berlin). Die aufgereinigten Fraktionen bein-

halten Ac-SQDG (C20:5/C16:0/C20:5) in Fraktion 1, die Ac-SQDG (C20:5/C16:0/

C20:5 und C16:1/C16:0/C20:5) in Fraktion 2 und die SQDG (C20:5/C16:0 und

C16:1/C16:0) in Fraktion 4.

Für die aufgereinigten Ac-SQDG-Fraktionen können inhibierende Wirkungen

beobachtet werden: Im DE-HCMV-POX-Assay reduziert die Ac-SQDG-Frak-

tion 1 die Viruslast bei einer Konzentration von 50 µg ml-1 um 13 %. Bei einer

Konzentration von 150 µg ml-1 wird die HCMV-Replikation fast vollständig

inhibiert (Abb. 5.40).

Abb. 5.40 Anti-HCMV Aktivität der aufgereinigten Ac-SQDG-Fraktionen 1 (Fr I, C20:5/C16:0/

C20:5), Ac-SQDG-Fraktionen 2 (Fr II, C20:5/C16:0/C20:5 und C16:1/C16:0/C20:5) isoliert aus

P. tricornutum 1b im DE-HCMV-POX-Assay 3 d p. I. (DE-HCMV-POX-Assay Dr.-Ing. S. Thulke,

Charite´ Berlin) bzw. im IE-HCMV-POX-Assay 1 d p. I. (Fraktion 1 nicht vermessen)

Die antivirale Wirkung kann auch für Fraktion 2 beobachtet werden. Die

Viruslast wird bei 50 µg ml-1 um 36 % bzw. bei 150 µg ml-1 um 88 % im

Vergleich zur Kontrolle ohne Inhibitor vermindert. Untersuchungen mit der

Ac-SQDG-Fraktion 2 im IE-HCMV-POX-Assay belegen ebenso eine inhi-

Ergebnisse

- Seite 108 -

bierende Wirkung. Dabei wird die Virusreplikation bei einer verwendeten

Konzentration von 50 µg ml-1 um 40 % und bei 150 µg ml-1 um 74 % inhibiert.

In den Zytotoxizitätstests mit MRC-5-Zellen können bei Inkubation über 3 d für

die Ac-SQDG-Fraktionen die CC50-Werte von 285 µg ml-1 (Fraktion1) bzw.

190 µg ml-1 (Fraktion 2) bestimmt werden. Für die Fraktion 4 (SQDG-Fraktion)

liegt der CC50-Wert über der maximal eingesetzten Konzentration von

250 µg ml-1 und kann damit nicht ermittelt werden (Tab. 5.4).

Tab. 5.4 Zytotoxizität der separierten SQDG- und Ac-SQDG-Fraktionen aus P. tricornutum 1b

gegenüber MRC-5-Wirtszellen (Daten Dr. S. Thulke, Charité Berlin).

Fraktion Ac-SQDG bzw. SQDG CC50 [µg ml-1]

MRC-5 (3d)

Fraktion 1 Ac-SQDG (C20:5/C16:0/C20:5) 285

Fraktion 2 Ac-SQDG (C20:5/C16:0/C20:5)

Ac-SQDG (C16:1/C16:0/C20:5)

190

Fraktion 4 SQDG (C20:5/C16:0)

SQDG (C16:1/C16:0)

>250

5.7.5 Enzymatischer Bioassay mit der Reversen Transkriptase von HIV

Zusätzlich zu den antiviralen Untersuchungen der SQDG-Fraktionen im zell-

kulturbasierten Assay mit HCMV sind Untersuchungen zur Inhibierung von

HIV-Reverse Transkriptase (HIV-RT) erfolgt.

5.7.5.1 Etablierung des HIV-Reverse Transkriptase-Assays

Für die Untersuchungen zum Einfluss der SQDG auf die HIV-RT-Aktivität ist

zunächst ein entsprechender HIV-RT-Assay etabliert worden. Dazu werden

verschiedene HIV-RT-Enzymkonzentrationen, Inkubationszeiten und –tem-

peraturen zur Synthese des RNA-DNA-Hybridstranges getestet. Dabei sind

folgende Parametereinstellungen ermittelt worden:

eingesetzte Enzymmenge 0,05 bis 0,4 units

Inkubationstemperatur 30°C

Inkubationszeit 10 min

Ergebnisse

- Seite 109 -

Für die Kalibriergerade, die bei jeder Messung der HIV-RT-Aktivität mitgeführt

wird, ergibt sich für die Korrelation von eingesetzter Menge an HIV-RT und

detektiertem Fluoreszenzsignal des RNA-DNA-Farbstoffkomplexes ein Kor-

relationskoeffizient von R2 0,99 (Abb. 5.41).

Abb. 5.41 Etablierung des HIV-RT-Assays mit der Kalibriergerade nach Vermessung der

Fluoreszenz verschiedener Konzentrationen eingesetzter HIV- RT

5.7.6 Anti-HIV-RT Aktivität der SQDG

Die Untersuchungen im HIV-RT-Assay mit den verschiedenen SQDG-Frak-

tionen belegen eine Inhibierung der Enzymaktivität, die im Folgenden genauer

erläutert wird.

5.7.6.1 Rhodophyta

Die SQDG-Fraktion aus P. purpureum zeigt im HIV-RT-Assay bei einer verwen-

deten Menge von 1 µg eine Steigerung der Enzymaktivität auf 123 % im

Vergleich zur Positivkontrolle ohne Inhibitor. Die Erhöhung der eingesetzten

Menge führt zur Reduktion der RT-Aktivität um 84 % (5 µg) bzw. 97 % (10 µg)

(Abb. 5.42).

Ergebnisse

- Seite 110 -


Die SQDG-Fraktion von H. carterae zeigt im HIV-RT-Assay eine SQDG-konzen-

trationsabhängige Reduktion der HIV-RT-Aktivität (Abb. 5.42). Die Zugabe von

1 µg SQDG-Fraktion zum RNA-Reaktionsmix reduziert die gemessene Enzym-

aktivität von HIV-RT um ca. 50 %. Die Erhöhung der Mengen auf 5 µg und

10 µg vermindert die HIV-RT-Enzymaktivität um 83 % bzw. 91 % im Vergleich

zum Reaktionsmix ohne Inhibitor.

Abb. 5.42 Anti-HIV-RT-Aktivität der SQDG-Fraktionen von P. purpureum und H. carterae im

HIV-RT-Assay als prozentualer Anteil der Enzymaktivität im Vergleich zur Kontrolle ohne

Inhibitor

Die aufgereinigten Fraktionen der P. tricorntum-Stämme, die sowohl die struk-

turgleichen SQDG als auch die Ac-SQDG enthalten, variieren in ihrer

enzyminhibierenden Wirkung. Dies entspricht nicht den Erwartungen

bezüglich der Aktivität dieser Fraktion und wird in Kap. 7.7.4 diskutiert.

Die Adsorptions/Desorptions-Trennfraktion von P. tricornutum 6 vermindert

die HIV-RT-Aktivität bei einer eingesetzten Menge von 1 µg um 85 %. Im

Gegensatz dazu werden für die Fraktionen von P. tricornutum 1a bzw.

P. tricornutum 1b bei einer verwendeten Mengen von 1 µg die Enzymaktivitäten

nicht so ausgeprägt inhibiert (um 9 % bzw. 26 %). Die Verwendung von 5 µg

bzw. 10 µg der SQDG-Fraktionen aus den Phaeodactylum-Stämmen reduziert die

Enzymaktivität um 77 bis 96 % (5 µg) bzw. um 92 bis 97 % (10 µg, Abb. 5.43).

Ergebnisse

- Seite 111 -

Abb. 5.43 Anti-HIV-RT-Aktivität der SQDG-Fraktionen aus P. tricornutum 6, P. tricornutum 1a,

P. tricornutum 1b im HIV-RT-Assay als prozentualer Anteil der Enzymaktivität im Vergleich zur

Kontrolle ohne Inhibitor

5.7.6.3 Cyanophyta

Die Untersuchungen der SQDG-Fraktionen aus den Cyanobakterien A. platen-

sis, S. hofmanni und N. punctiforme zeigen, dass eine eingesetzte Konzentration

von 1 µg die HIV-RT-Aktivität bereits um 44 bis 66 % reduziert (Abb. 5.44). Die

SQDG-Fraktion von A. platensis zeigt im Vergleich zu den Fraktionen aus

S. hofmanni und N. punctiforme im HIV-RT-Assay eine ausgeprägtere Inhi-

bierung bei Verwendung höhere Fraktionsmengen. In dem Ansatz mit 5 µg

wird die HIV-RT bereits um mehr als 90 % und im Ansatz mit 10 µg nahezu

vollständig inhibiert. Die SQDG-Fraktionen von S. hofmanni und N. punctiforme

weisen beide ähnliche konzentrationsabhängige Inhibierungen der HIV-RT-

Aktivität auf. Bei den eingesetzten Quantitäten von 5 µg bzw. 10 µg wird im

Assay die Enzymaktivität um über 70 % bzw. 90 % gesenkt.

Ergebnisse

- Seite 112 -

Abb. 5.44 Anti-HIV-RT-Aktivität der SQDG-Fraktionen aus A. platensis N-46, S. hofmanni,

N. punctiforme im HIV-RT-Assay als prozentualer Anteil der Enzymaktivität im Vergleich zur

Konrolle ohne Inhibitor

5.7.6.4 Zusammenfassung der anti-HIV-RT-Aktivitäten

Für alle SQDG-Fraktionen der untersuchten Mikroorganismen kann das

Potential einer Inhibierung der HIV-RT-Aktivität festgestellt werden. Die

Verwendung von 10 µg aufgereinigter Fraktionen reduziert die Enzymaktivität

der im Assay eingesetzten HIV-RT (0,4 units) jeweils um ca. 90 %.

Fehlerbetrachtung -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

- Seite 113 -

6 Fehlerbetrachtung

6.1. Prozessbegleitende Analytik

Die Beurteilung des Wachstums einer Zellsuspension erfolgt über die Zellzahl

und die Biotrockenmassekonzentration (BTM). Die BTM wird indirekt über die

Messung der OD (Dreifachbestimmung) anhand einer OD/BTM-Kalibrier-

gerade ermittelt. Morphologische und physiologische Veränderungen der

Zellen im Verlauf der Kultivierung finden dabei keine Berücksichtigung, so

dass Abweichungen der tatsächlichen Biomasse (bestimmt als Trockenmasse) in

Korrelation zur OD auftreten können. Die Wägung der Biotrockenmasse kann

entsprechend den Angaben des Hersteller der Feinwaage (Sartorius, Göttingen)

nach Kalibrierung des Gerätes mit +/- 0,1 mg angegeben werden. Das

Spektralphotometer weist eine Messungenauigkeit von +/- 0,005 % auf. Die OD-

Bestimmungen zeigen Messwertabweichungen von maximal 5 % innerhalb der

Dreifachbestimmung. Die Zellzahl wird mikroskopisch durch dreifache Aus-

zählung der Zellen in einer Zählkammer bestimmt. Die dabei auftretende

prozentuale Standardabweichung ist zumeist kleiner 10 %. In Ausnahmefällen

insbesondere bei geringen Zellzahlen zu Beginn einer Kultivierung können

auch Fehlerabweichungen von maximal 20 % bei der ermittelten Zellzahl

auftreten.

Die pH-Messung unterliegt der Geräteungenauigkeit des pH-Meters. Der

ermittelte pH-Wert kann eine Abweichung von +/- 0,05 pH-Einheiten zum

realen Wert haben.

6.2 Aufarbeitung der SQDG

Die Inertisierung der verwendeten Glasgeräte, die Ausarbeitung von Standard-

arbeitsanweisungen für die einzelnen Aufarbeitungsschritte (Nachspülen von

Filtern nach Extraktionen, etc.) und die Lösemittelentfernung über einen

Stickstoffstrom minimiert den Produktverlust und ermöglicht die Aufarbeitung

auch geringster SQDG-Konzentrationen aus der Biomasse.

Die Aufreinigung der SQDG durch präparative Dünnschichtchromatographie

resultiert in einer nicht reproduzierbaren, quantitativen Gewinnung der SQDG,

da dieses Verfahren ohne Visualisierung des Produktes angewendet wird. Das

Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren zur Aufarbeitung der SQDG-Frak-


- Seite 114 -

tionen über zwei in Reihe geschaltete Säulen (s. Kap. 4.2.4) führt zur gewünsch-

ten quantitativen und reproduzierbaren Gewinnung des Produktes.

6.3 MALDI trap ToF Hybrid MSn

Die Zwei-Punkt-Kalibrierung des Massenspektrometers mit den Phospho-

lipidstandards ergibt einen errechneten Fehler von 0,6 Da im Massenbereich

von m/z 535,5 bis m/z 861,5 (negative ion mode). Die Abweichungen der für die

SQDG-Struktur errechneten und der im Massenspektrum gemessenen Mole-

külionen betragen +/- 0,1 Da.

6.4 HPLC-ESI-MS

Die ermittelte HPLC-ESI-MS-Kalibriergerade des SQDG-Standards aus

P. purpureum (SQDG C20:4/C16:0, C20:5/C16:0), die auf der Detektion der Peak-

extraktion im Massenbereich von m/z 839 bis m/z 842 basiert, weist ein

Bestimmtheitsmaß (R2) von 0,95 auf. Die Dreifachbestimmungen der einzelnen

SQDG-Proben, die aus A. platensis N-46 isoliert worden sind (SQDG m/z 817,5;

Peakextraktion m/z 817 bis m/z 819), zeigen maximale Abweichungen der

einzelnen Messwerte von 15 %. Die bestimmten SQDG-Konzentrationen (Drei-

fachbestimmungen der Probe) unterscheiden sich in den zweifachen Auf-

arbeitungsansätze (Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren) um maximal

33 %.

6.5 Biologische Assays

Die Bestimmung der antiviralen Aktivität von SQDG-Fraktionen im IE-POX-

Assay beruht auf Sechsfachbestimmungen der einzelnen eingesetzten Konzen-

trationen. Die besonders bei kleinen Inhibitorkonzentrationen ermittelte, sehr

hohe Standardabweichung (Bsp. SQDGP. purpureum 25 µg mittlere Viruslast 108 %

mit einer Standardabweichung von 57%, Kap. 5.7.2) kann auf eine stochastische

Verteilung von SQDG-Inhibitormolekülen und Wirktarget zurückgeführt wer-

den. Die aus einer Sechsfachbestimmung resultierenden Mittelwerte ergeben

reproduzierbare Ergebnisse des biologischen Testassay. Die Wirksamkeiten der

SQDG sind in zeitlich unabhängig voneinander durchgeführten IE-POX-Assays

bestätigt worden (Daten nicht gezeigt). Die Ermittlung der IC50-Werte beruht


- Seite 115 -

auf der Trendlinie einer mathematischen Funktion zweiten Grades, die alle

eingesetzten Inhibitorkonzentrationen mit den Mittelwerten der reduzierten

Viruslast berücksichtigt. Die Vergleichbarkeit ermittelter IC50-Werte von Dex-

transulfat verifiziert die Ergebnisse einer antiviralen Wirkung in unabhängig

voneinander durchgeführten HCMV-Assays (IE-POX, DE-POX).

Die Durchführung der Inhibierungsuntersuchungen der HIV-RT durch SQDG

zeigt bei den eingesetzten Konzentrationen von 1 µg, 5 µg und 10 µg bei einer

Fünffachbestimmung Abweichungen von maximal 20 %.

Diskussion

- Seite 116 -

7 Diskussion

7.1 Selektion phototropher Mikroorganismen

Die Entstehung von Biomolekülen auf der Erde und deren heutiges Vorkom-

men in Lebewesen steht im engen Zusammenhang mit der chemischen und bio-

genen Evolution der Erde. Das Screening SQDG-produzierender Stämme be-

rücksichtigt daher eine frühzeitige evolutionären Entwicklung, deren Zusam-

menhang nachfolgend beschrieben wird:

In der Uratmosphäre haben anorganische gasförmige Verbindungen wie Koh-

lendioxid, Stickstoff, Wasserdampf, Ammoniak, Cyan-, Schwefel- und Chlor-

wasserstoff sowie organische Kohlenwasserstoffe wie Methan dominiert. Der

vorherrschende Vulkanismus auf der Erde mit durchschnittlichen Tempera-

turen von 350 K kann die Bildung strukturell einfacher, biogener Moleküle, wie

Glycin und Alanin, aus den oben genannten Verbindungen begünstigt haben

[Miller, 1953]. Die Synthese von Biomoleküle (Peptide, Proteine, Glucane) und

die Entstehung von Phasengrenzsystemen für den Energie – und Stofftransport

sind Voraussetzung für die Entwicklung von Protobionten (Vorlebewesen) und

den Urlebewesen als höher entwickelte Lebensformen. Die Urlebewesen unter-

scheiden sich von den Protobionten durch verschiedene Stoffwechselfunk-

tionen und den genetischen Code, der die Vermehrung von ihnen ermöglicht

[Hollitscher, 1984; Rauchfuss, 2005].

Die ersten Lebewesen sind aufgrund des fehlenden Sauerstoffs in der Atmos-

phäre Anaerobier gewesen. Der Verbrauch des organischen Materials durch

einen anaeroben Stoffwechsel und die limitierte organische Synthese auf der

Erde führen zu einer negativen Bilanz der vorhandenen, organischen Verbin-

dungen. Die Entstehung des autotrophen Stoffwechsels mit einer anoxygenen

Photosynthese ist daher für die Erhaltung des Lebens auf der Erde essentiell

gewesen. Purpurbakterien und Grüne Schwefelbakterien nutzen zur Energie-

gewinnung in der Photosynthese Schwefelwasserstoff oder organische Verbin-

dungen [Hollitscher, 1984; Schlegel, 1992].

Da die Bildung von SQDG in dem Purpurbakterium Rhodobacter sphaeroides,

einem Vertreter der frühzeitlichen Photosynthese, nachgewiesen worden ist

[Benning et al., 1993], könnten bereits SQDG in Thylakoidmembranen der ersten

photosynthetisch aktiven Organismen vorhanden gewesen sein.

Diskussion

- Seite 117 -

Das Vorkommen von Phosphatidylglycerol als weiterer wichtiger Bestandteil

der Thylakoidmembran ist zu diesem erdgeschichtlichen Zeitpunkt unwahr-

scheinlich. Organische Phosphorverbindungen werden für viele essentielle

Lebensprozesse in Organismen benötigt und ihre Verfügbarkeit ist in der

frühen Erdentwicklung limitiert [Rauchfuss, 2005]. Ableitend daraus kann

postuliert werden, dass zum Zeitpunkt der Entstehung des autotrophen

Stoffwechsels SQDG die einzigen anionischen Lipidkomponenten der photo-

synthetisch aktiven Membran gewesen sind. Die zunehmende Verfügbarkeit

von organischen Phosphorverbindungen könnte zur partiellen Substitution der

anionischen SQDG durch Phosphatidylglycerol in der Thylakoidmembran

geführt haben.

Im weiteren Verlauf der Evolution sind aus den Probioten Archaebakterien und

Bakterien (Prokaryoten) entstanden. Aus den Bakterien gehen später Cyano-

bakterien mit der Fähigkeit einer oxygenen Photosynthese hervor [Hollitscher,

1984]. Die Eukaryoten haben sich frühzeitig in der Evolution von den Archae-

bakterien abgespalten und phylognetisch zu heterotrophen, phagotrophen oder

begeißelten Einzellern mit einer Zellkompartimentierung entwickelt (Abb. 7.1)

[van den Hoek et al., 1993].

Cyanobakterien sind vermutlich die Hauptbeute der primitiven Flagellaten und

sind in der letzten Entwicklungsstufe nicht verdaut worden. Die unverdauten

Cyanobakterien haben ihre Zellwand zurückgebildet und sich zu Chloroplasten

entwickelt (Endosymbiontentheorie). Die Gene verschiedener Chloroplasten-

proteine sind im Laufe der Evolution in das Kerngenom translokalisiert

worden, so dass nur noch ein Teil der ursprünglichen prokaryotischen DNA im

Organell selbst codiert wird [Hollitscher, 1984; Schlegel, 1992; van den Hoek et

al., 1993].

Die Endosymbiontentheorie wird durch die homologen, genetischen Sequenzen

der ribosomalen 16S RNA von den Chloroplasten und von den Cyanobakterien

bestätigt [van den Hoek et al., 1993]. Des Weiteren kann mit dieser Methode ein

monophyletischer Ursprung des endosymbiontischen Cyanobakteriums durch

die Sequenzhomologie der 16S rRNA von Chloroplasten verschiedener Algen-

abteilungen (Glaucophyta, Euglenophyta, Heterokonotphyta, Chlorophyta)

Diskussion

- Seite 118 -

nachgewiesen werden [Cedergren et al., 1988; Giovanni et al., 1988; Gouy and

Li, 1989; van den Hoek et al., 1993].

Abb.7.1 Evolution der Cyanobakterien und phototropher Mikroorganismen unter Berück-sichtigung der Endosymbiontentheorie (eingerahmte Algenabteilungen im Screening nach potentiellen SQDG-produzierenden Stämmen verwendet)

Die Nachkommen der begeißelten, photosynthetisierenden Eukaryoten stellen

die Vertreter der Mikroalgenabteilung Glaucophyta dar. Ihre Chloroplasten

stehen morphologisch sowie molekulargenetisch zwischen den Cyanobakterien

und den Chloroplasten anderer Algen. Des Weiteren können Reste von Pepti-

doglucanen (Zellwand der Cyanobakterien) in den Zellen der Glaucophyta

nachgewiesen werden [Shivji et al., 1992; van den Hoek et al., 1993].

Die Algen der Abteilung Rhodophyta sind vermutlich evolutionär aus Vertre-

tern der photoautotrophen, eukaryotischen Glaucophyta entstanden. Die dop-

pelte Chloroplastenhülle basiert als innere Hülle aus der Plasmamembran des

Diskussion

- Seite 119 -

endosymbiontischen Cyanobakteriums und als äußere aus der Nahrungs-

vakuole des Wirtes [van den Hoek et al., 1993].

Die Spezies der Chlorophyta sind ebenso wie die Stämme der Rhodophyta aus

den Glaucophyta hervorgegangen. Die Chloroplasten sind von einer normalen

doppelten Membran umgeben [van den Hoek et al., 1993].

Im Gegensatz zu den Chlorophyta und Rhodophyta können bei der Algenab-

teilung Heterokontophyta die Chloroplasten auf endosymbiontisch, einge-

schlossene, eukaryotische Glaucophyta zurückgeführt werden. Die Chloro-

plasten der Heterokontophyta werden nicht nur von einer doppelten Chloro-

plastenhülle, sondern auch von einer Falte des Endoplasmatischen Retikulum

(Chloroplasten-ER) umhüllt [Whatley and Whatley, 1981; van den Hoek et al.,

1993].

Für die Vertreter der anderen Algenabteilungen Cryptophyta, Haptophyta,

Dinophyta und Euglenophyta kann aufgrund der höheren Variation der

Chloroplasten in ihrer Feinstruktur eine Evolution dieser Organellen aus

verschiedenen Algen abgeleitet werden [van den Hoek et al., 1993]. Da bisher

keine SQDG-Bildung in diesen Algenabteilung nachgewiesen worden ist,

könnte es im Laufe der Evolution zu einer Substitution von SQDG durch PG in

der Thylakoidmembran gekommen sein.

Die Auswahl der potentiell SQDG-produzierenden Stämme für das Screening

erfolgt unter Berücksichtigung der frühen evolutionären Entwicklung ent-

sprechend der Endosymbiontentheorie und des damit verbundenen Vor-

kommens von SQDG in Thylakoidmembranen.

7.2 Kultivierungen

Die Anreicherung des Prozessgases mit Kohlendioxid führt bei der Kulti-

vierung phototropher Mikroorganismen zu einer Steigerung der CO2-Fixierung

durch Ribulosebisphosphat-Carboxylase/-Oxygenase (Rubisco) im Calvinzyklus der

Photosynthese. Die dafür erforderlichen Reduktionsequivalente werden durch

die Lichtreaktion zur Verfügung gestellt. Photosynthetisch aktivere Zellen sind

dabei durch eine höhere Chloroplasten-Proliferation gekennzeichnet. Die

Vermehrung der Chloroplasten bedingt eine verstärkte Bildung der Thylakoid-

Diskussion

- Seite 120 -

membranen in den Zellen, so dass folglich die Synthese der Membranmoleküle

SQDG und PG forciert wird.

Mit beginnender stationärer Wachstumsphase sinkt der DNA-Gehalt in den

Zellen infolge einer verminderten Zellteilung, so dass DNA-gebundenes

Phosphat freigesetzt wird. Das freigesetzte Phosphat könnte zur Bildung von

Phospholipiden genutzt werden, die bei einer fortführenden Kultivierung die

SQDG in den Thylakoidmembranen ersetzen könnten. Die Ernte der Biomasse

für die Untersuchungen zur Bildung von SQDG in phototrophen Mikroorganis-

men erfolgt daher zu Beginn der stationären Wachstumsphase vor einer

möglichen Substitution der Targetmoleküle.

Im Folgenden werden die Kultivierungsergebnisse von den ausgewählten

Mikroorganismen innerhalb einer Algenabteilung im Überblick diskutiert:

Die Kultivierung von P. purpureum erzielt bis zur Ernte in der stationären

Wachstumsphase eine Biomasseausbeute von 4,5 gBTM l-1 und eine Zellzahl von

6,2*107 ZZ ml-1. Die Zellzahl in der Kultursuspension nimmt zu diesem Prozess-

zeitpunkt nicht weiter zu, jedoch hat die Biomassekonzentration aufgrund der

zunehmenden Zellgröße noch nicht den stationären Zustand erreicht.

Die unterschiedlichen Biomassen– und Zellzahlausbeuten bei der Kultivierung

der Phaeodactylum tricornutum-Stämme 1a (1,6 gBTM l-1, 4,4*107 ZZ ml-1) im

Vergleich zum Stamm 1b (0,3 gBTM l-1, 7,8*106 ZZ ml-1) bzw. zum Stamm 6

(0,5 gBTM l-1, 2,75*106 ZZ ml-1) kann auf die Mediumzusammensetzung zurück-

geführt werden. Zur Kultivierung von P. tricornutum 1a ist ein modifiziertes

Trebonmedium eingesetzt worden. Im Vergleich zum Brackwassermedium,

welches für die Phaeodactylum-Stämme 1b und 6 verwendet worden ist, enthält

das modifizierte Trebonmedium den fünffachen Nitratanteil als bevorzugte

Stickstoffsubstratquelle. Das Kultivierungsmedium für H. carterae ASM 30+ V

enthält eine dem modifiziertem Trebonmedium equimolare Menge an Nitrat.

Die maximal erreichte Biomasseausbeute von H. carterae liegt mit 1 gBTM l-1 in der

Größenordnung der Kultivierung von P. tricornutum 1a. Aufgrund der größeren

Zellmorphologie von H. carterae liegt die maximal erreichte Zellzahl

(8*105 ZZ ml-1) ein bis zwei Größenordnungen unterhalb derjenigen der Phaeo-

dactylum-Stämme.

Diskussion

- Seite 121 -

Die Kultivierungen der Chlorella-Stämme C. vulgaris und C. salina unterscheiden

sich bezüglich ihrer Biomasseausbeute (4,0 gBTM l-1 bzw. 4,8 gBTM l-1) und der

erreichten Zellzahlen (3,6*108 ZZ ml-1 bzw. 3,9*108 ZZ ml-1) nicht signifikant, da

beide Stämme mit vergleichbaren Kultivierungsparametern kultiviert worden

sind. Die unterschiedlichen Kultivierungsmedien, modifiziertes Seewasserme-

dium (C. salina) und Medium für einzellige Grünalgen (C. vulgaris), zeigen

keinen Einfluss auf die Biomasseausbeuten, da wichtige Nähstoffe wie Nitrat

und Phosphat in equimolaren Mengen im Medium vorliegen. Der Stamm

C. kessleri zeigt im Medium für einzellige Grünalgen im Vergleich zu den

genannten Stämmen eine 2,25 bis 2,75fach Steigerung der Biomassekonzen-

tration (11,0 gBTM l-1) und eine 1,5 bis 1,6fach höhere Zellzahl (5,8*108 ZZ ml-1).

Ursache für die signifikanten Unterschiede des Biomassewachstums kann in

der optimierten Kultivierungstemperatur von 30 °C im Vergleich zur Standard-

kultivierungstemperatur von 24 °C liegen.

Im Gegensatz zu den Cyanobakterien A. platensis N-39 (1,9 gBTM l-1), A. platensis

N-46 (1,3 gBTM l-1) und S. hofmanni (1,2 gBTM l-1) erzielt N. punctiforme eine 2,5 bis

3,5fach höhere Biomassekonzentration (4,7 gBTM l-1). Dieser signifikante Unter-

schied ist im Vergleich zur Kultivierung der A. platensis-Stämme auf eine län-

gere Kultivierungsdauer von N. punctiforme bis zum Erreichen der stationären

Wachstumsphase (227,5 h) zurückzuführen. Die höhere Biomassekonzentration

von N. punctiforme gegenüber S. hofmanii kann auf bessere Kultivierungsbe-

dingungen hinsichtlich von Medienzusammensetzung, Kultivierungstempera-

tur oder der Bestrahlungsstärke zurückgeführt werden.

7.3 Down Stream Processing für SQDG

7.3.1 Etablierung der Trennmethoden für SQDG

Strukturcharakterisierende und biologische Untersuchungen der SQDG erfor-

dern eine etablierte Produktaufarbeitung. Eine Vielzahl der Literaturarbeiten

beschreibt zumeist die Dünnschichtchromatographie (DC) für die SQDG-Auf-

reinigung aus den Rohextrakten phototropher Mikroorganismen [Anderson et

al., 1975; El-Sheek and Rady, 1995; Berge et al., 2002]. Die DC stellt hierfür eine

schnelle und kostengünstige Methode mit hoher Trennleistung für Verbin-

dungen mit unterschiedlichen Polaritäten dar. Verbindungen mit vergleich-

baren Polaritäten (ähnliche Rf-Werte), wie beispielsweise im Extrakt von

Diskussion

- Seite 122 -

P. purpureum können in der präparativen DC qualitativ nur ungenügend von-

einander separiert werden. Die DC-aufgereinigte Fraktion zeigt zwei Spots in

der analytischen DC (Abb. 5.6).

Die SQDG können in der analytische DC nach einer Derivatisierung mit Orcinol

als violette Spots detektiert werden. Das Orcinol reagiert unter Wasserabspal-

tung mit der glycosidisch gebundenen Hexose von SQDG protonenkatalysiert

zu 4-Hydroxymethylfurfural (violetter Spot). Die Färbereaktion mit Orcinol ist

unspezifisch, da im Vergleich zum SQDG-Standard auch Rohextraktverbin-

dungen mit höheren Retentionsfaktoren als violette Spots in der DC erkennbar

sind (Abb. 5.6).

Ein weiteres Kriterium zur Identifizierung von SQDG in der DC ist der

Vergleich der Rf-Werte mit dem kommerziell erhältlichen Standard. Solche

Untersuchungen der aufgereinigter DC-Fraktionen stellen auch in Ergänzung

mit GC-Untersuchungen hinsichtlich methylierter Fettsäuren und Alditol-

Zuckerderivate [Berge et al., 2002] keine ausreichenden Strukturcharak-

terisierung dar. Vorkommende strukturähnliche Glycolipide (z. B. Monogalac-

tosyldiacylglyceride (MGDG) und SQDG, die ein gleiches Fettsäurespektrum

aufweisen, können mittels DC und der zusätzlichen GC-Detektion der Fett-

säuren nicht voneinander unterschieden werden. Eine strukturbestimmende

Analytik der SQDG ist daher notwendig und erfolgt in der vorliegenden Arbeit

über massenspektrometrische Untersuchungen des Gesamtmoleküls.

Im Gegensatz zur DC weist das Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren eine

hohe Trennleistung von Verbindungen mit ähnlichem Retentionsverhalten,

aber unterschiedlichen Ladungen (Trennung nach pKs-Wert) auf. Ebenso eignet

sich die Methode des Adsorptions/Desorptions-Trennverfahrens nicht nur für

die Gewinnung des Produktes für Strukturcharakterisierungen, sondern resul-

tiert im Vergleich zur DC in höheren Substanzmengen für vielfältige bio-

logische Untersuchungen. Aufgrund der Maßstabsvergrößerung dieser Metho-

de kann eine höhere Produktmenge aufgearbeitet werden.

Nach Durchführung des Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren werden in

Fraktion 1 sämtliche ungeladene Stoffe des Rohextraktes eluiert. Durch Varia-

tion der beschriebenen Methode von Rizoh und Doulis [2001] werden die

SQDG bereits in der zweiten Fraktion eluiert ([Rizov and Doulis, 2001] Frak-

Diskussion

- Seite 123 -

tion 5). Die definierte NH4Ac-Konzentration in dem verwendeten Elutions-

mittel 2 könnte zusätzlich zu den SQDG (pKS ~ 5,7 [Morimoto et al., 1993])

anionische Substanzen mit gleichem bzw. geringerem pks-Wert eluieren (z. B.

Phospholipide). Derartige anionische Verbindungen, die in der analytischen DC

ein ähnliches Retentionsverhalten wie der SQDG-Standard aufweisen, könnten

als vorkommende SQDG in dieser Fraktion postuliert werden. Daher muss das

Vorkommen von SQDG in dieser Trennfraktion mit massenspektrometrischen

Analytikmethoden verifiziert werden.

Die Durchführung biologischer Wirksamkeitsstudien erfordert im Anschluss an

das Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren eine Entsalzung der gewonnenen

SQDG-Fraktion. Vorkommende höhere Salzkonzentrationen könnten die Test-

resultate biologischer Untersuchungen negativ beeinflussen. Das bereits für

Lipide eingesetzte Zweiphasensystem nach Folch et al. [1956] mit dem ternären

Lösemittelgemisches DCM/MeOH/Wasser (8:4:3, v/v/v) führt in den einge-

setzten Molanteilen zu einem Zweiphasensystem, in dem das eingesetzte

NH4Ac-Salz in der wässrigen Phase abgetrennt werden kann. Das zusätzliche

Ansäuern der wässrigen Phase neutralisiert die Ladung der SQDG und

begünstigt eine Anreicherung des Wirkstoffes in der lipophilen Phase (Kap.

5.3.1.3, Abb. 5.6).

In der Literatur werden neben der DC und des Adsorptions/Desorptions-

Trennverfahren von Rizov und Doulis [2001] andere mehrstufige SQDG-Auf-

arbeitungsmethoden beschrieben: Gustafson et al. [1989] reinigen beispielsweise

die SQDG über drei Stufen mit Größenausschluss- und zwei Reverse Phase

Chromatographien auf. Arbeiten von Reshef et al. [1997] beschreiben die SQDG-

Aufreinigung über drei Stufen mit Normal Phase-, Größenausschluss- und

Normal Phase Chromatographien. Im Vergleich zu diesen Methoden ermöglicht

die etablierte Methode des Adsorptions/Desorptions-Trennverfahren in Kombi-

nation mit der Entsalzung im Zweiphasensystem eine zeit- und kostensparende

Variante der SQDG-Aufarbeitung, bei der ein größerer Produktverlust ausge-

schlossen werden kann.

Diskussion

- Seite 124 -

7.3.2 SQDG in phototrophen Mikroorganismen

Der lipophile Rohextrakt der Rotalge P. purpureum ist zur Etablierung der

beiden präparativen SQDG-Aufarbeitungsmethoden DC und Adsorptions/

Desorptions-Trennverfahren verwendet worden (Abb. 5.6, Kap. 5.4.3.1,

Kap. 7.3.1). Die Ergebnisse der präparativen DC und des Adsorptions/Desorp-

tions-Trennverfahren (Fraktion 2) in der analytischen DC erlauben das Postulat

auf das Vorkommen von SQDG in den aufgereinigten Fraktionen.

Die Adsorptions/Desorptions-Trennfraktion 1 beinhaltet entsprechend den

analytischen DC-Ergebnissen Verbindungen, die in ihrem Retentionsverhalten

den postulierten SQDG der Fraktion 2 entsprechen. Eine Elution der SQDG in

Fraktion 1 und damit eine Überladung der Säule kann aufgrund von voran-

gegangenen Beladungsuntersuchungen der Säule (Daten nicht gezeigt) ausge-

schlossen werden. Der Spot in Fraktion 1 resultiert daher aus ungeladenen

Verbindungen, die eine ähnliche Polarität wie die SQDG aufweisen.

Die analytische DC der Adsorptions/Desorptions-aufgereinigten Rohextrakte

von H. carterae, P. tricornutum 1a, P. tricornutum 1b und P. tricornutum 6 weisen

ebenso wie die Fraktion von P. purpureum Spots auf, die im Retentionsverhalten

mit dem SQDG-Standard vergleichbar sind (Abb. 5.7). Das Vorhandensein von

SQDG in H. carterae wird bereits durch Untersuchungen von Keusgen et al.

bestätigt, der diese Verbindungsklasse in der Glycolipidfraktion dieser Alge

mittels LC MS/MS identifiziert hat [Keusgen et al., 1996; Keusgen et al., 1997].

Die identifizierten SQDG-Strukturen von Keusgen et al. werden mit der

Strukturidentifizierung in der vorliegenden Arbeit im Kap. 7.4.3 genauer dis-

kutiert.

Im Gegensatz zu den selektierten Stämmen der Rhodophyta und Heterokonto-

phyta weisen die aufgearbeiteten Rohextrakte aus den Chlorella-Stämmen

C. kessleri, C. vulgaris und C. salina in der DC keine Verbindungen im SQDG-

relevanten Rf-Bereich auf (Abb. 5.8). Es kann vermutet werden, dass die unter-

suchten Stämme in der beginnenden stationären Wachstumsphase (Ernte der

Biomasse) keine SQDG bilden oder die synthetisierten SQDG in Konzentration

unterhalb der DC-Nachweisgrenze vorliegen.

Die analytischen Ergebnisse des aufgereinigten Rohextraktes aus A. platen-

sis N-39 entsprechen ebenso nicht den Erwartungen der Vorselektion, weil

Diskussion

- Seite 125 -

keine relevanten SQDG-Spots in der DC detektiert werden können. Eine Varia-

tion der Kultivierungsparameter (Kultivierungssystem PSM oder Medusa,

Bestrahlung I0 80�180 µE m-2 s-1 oder 200 µE m-2 s-1, Variation der Erntezeit,

Daten nicht gezeigt) beeinflusst das Ergebnis der Auswertung nicht. Das

Vorkommen von SQDG kann jedoch im Rohextrakt des artverwandten

Stammes A. platensis N-46 postuliert werden. Dieser ist unter den gleichen

Parametern wie A. platensis N-39 kultiviert worden, so dass aufgrund der nahen

Verwandtschaft ein negativer Einfluss der SQDG-Biosynthese in den beiden

Cyanobakterien unter den gegebenen Bedingungen ausgeschlossen werden

kann. Die Varianz der SQDG-Bildung nahe verwandter Stämme könnte auf

einer genetischen Veränderung begründet sein, welche in Kap. 7.4.3 näher

diskutiert wird.

Zusätzlich zu P. purpureum, den selektierten Heterokontophyta und A. platen-

sis N-46 kann die Bildung von SQDG auch in den Cyanobakterien S. hofmanii

und N. punctiforme postuliert werden.

7.3.3 Ac-SQDG in phototrophen Mikroorganismen

Die DC-Daten der aufgereinigten Rohextrakte von den Phaeodactylum tricornu-

tum-Stämmen (Adsorptions/Desorptions-Trennfraktion 2) geben Hinweise auf

das Vorhandensein von acylierten SQDG (Kap. 5.3.3.1). Ac-SQDG werden

aufgrund eines vergleichbaren pKs-Wertes in der selben Adsorptions/

Desorptions-Fraktion wie die SQDG eluiert (stationäre Phase aminopropyl-

modifiziertes Kieselgel) sowie mit einer Orcinolfärbereaktion detektiert. Des

Weiteren weisen sie im Vergleich zu SQDG einen lipophileren Charakter auf,

der in höheren Retentionsfaktoren der Verbindungen in der DC resultiert. Die

zwei Spots mit den höheren Rf-Werten (Rf1 0,56, Rf2 0,63) könnten dabei zwei

verschiedene Ac-SQDG beinhalten. Die Bestätigung der Ac-SQDG-Struktur ist

jedoch nur durch massenspektrometrische Messungen möglich (Kap. 7.4.4).

7.3.4 Etablierung chromatographischer Trennmethoden für Ac-SQDG

Die Adsorptions/Desorptions-Aufreinigung der lipophilen Extrakte aus den

Phaeodactylum tricornutum-Stämmen unter Verwendung von aminopropylmodi-

fiziertem Kieselgel als stationäre Phase (erste Dimension) erzielt eine Gewin-

nung von SQDG und Ac-SQDG in einer Fraktion. Das Adsorptions/Desorp-

Diskussion

- Seite 126 -

tions-Trennverfahren der ersten Dimension kann aufgrund vergleichbarer pKs-

Werte nicht zwischen den SQDG und den Ac-SQDG diskriminieren.

Die Trennung der SQDG und Ac-SQDG erfolgt in der zweiten Dimension mit

unmodifiziertem Kieselgel (Polarität). Die gewonnenen Fraktionen 1 und 2

beinhalten Ac-SQDG; in Fraktion 4 sind SQDG enthalten. Das Adsorptions/

Desorptions-Trennverfahren, welches eine batchweise Elution mit einer Löse-

mittelzusammensetzung steigender Polarität nutzt, ist für die Trennung der

beiden postulierten Ac-SQDG nicht ausreichend. Die verschiedenen Ac-SQDG

weisen nur geringe Unterschiede in ihrer Polarität aufweisen. Eine Separation

beider Moleküle könnte über eine HPLC-Trennmethode mit einem konti-

nuierlich steigenden Gradienten erzielt werden. Eine solche Methode würde die

kontinuierliche Wechselwirkung der Moleküle mit stationärer und mobiler

Phase ausnutzen, so dass über die Laufstrecke eine Separation beider Verbin-

dungen (verschiedene Retentionszeiten) erzielt werden könnte.

7.4 MALDI trap ToF Hybrid MSn Massenspektrometrie

7.4.1 Matrixoptimierung

Die Verwendung der Matrix ILM 1 in der MALDI ToF Analytik der SQDG zeigt

im Vergleich zur konventionellen Matrix DHB höhere Signalintensitäten der

Molekül- und Fragmentionen in den Massenspektren bei gleicher Laser-

intensität. Das Chromophor des ILM 1 absorbiert die Laserenergie besser als

DHB und beeinflusst das Responseverhalten der Probe positiv. Unter-

suchungen anderer Lipidproben mit ionischer Liquidmatrix belegen homo-

genere Spots des Kokristallisates von Matrix und Analyt, so dass infolge eines

höheren Responseverhaltens geringere Laserintensitäten zur Aufnahme der

Spektren benötigt werden [Mank et al., 2004; Li et al., 2005].

Ein Nachteil, der die Auswahl des ILM 1 als bevorzugte Matrix zugunsten von

DHB beeinträchtigt, stellt das niedriger S/N-Verhältnis in den Massenspektren

von ILM 1 dar.

7.4.2 MALDI ToF des SQDG-Standards

Der m/z-Wert des SQDG-Standards kann sowohl im positive (m/z 815,6, [M-H]-)

als auch im negativen ion mode (m/z 861,5; [M+2Na-H]+) detektiert werden.

Diskussion

- Seite 127 -

Aufgrund der besseren Laserresponse in den MSn-Experimenten der SQDG er-

folgen weitere Untersuchungen der SQDG ausschließlich im negative ion mode.

Die Interpretation der MS2-Spektren des Standards mit der veresterten Palmi-

tinsäure (C16:0) und der veresterten Linolensäure (C18:3) belegt die Elimi-

nierung beider Fettsäuren. Die Bestimmung der sn-Position von Fettsäuren und

damit die vollständige Strukturcharakterisierung der SQDG ist aus den MS2-

Massenspektren nicht möglich. Die Positionen der Fettsäuren können jedoch

durch einen regiospezifischen Verdau eindeutig bestimmt werden.

Im MS3 wird die SQDG-Struktur abschließend durch die Eliminierung der

Sulfoquinovose (m/z 224,9) eindeutig bestätigt.

7.4.3 MALDI ToF von SQDG aus phototrophen Mikroorganismen

Die MS-Spektren der Adsorptions/Desorptions-Fraktion aus P. purpureum be-

stätigen das Vorkommen von SQDG mit den Acylresten Linoeyl-/Palmitoyl-

(C18:2/C16:0, m/z 817,6), Eicosapentaenoyl-/Palmitoyl- (C20:5/C16:0, m/z 839,6)

und Eicosatetraenoyl-/Palmitoyl- (C20:4/C16:0, m/z 841,6). Die beobachteten

MSn-Eliminierungen sind vergleichbar denen des Standards und bestätigen die

vorkommenden Fettsäuren und die Sulfoquinovose in der SQDG-Struktur.

Die vollständige strukturelle Charakterisierung der SQDG mit interner sn-

Positionierung der Fettsäuren erfordert jedoch einen enzymatischen Verdau mit

der regioselektiven Lipase von R. arrhizus (sn-1 spezifisch, EC 3.1.1.3) [Fischer et

al., 1973; Tulloch et al., 1973]. Die Hydrolyse der SQDG-Fraktion aus P. pur-

pureum resultiert in einem SQMG mit m/z 555,4, welches einen Palmitoylrest an

der sn-2-Position trägt. Aufgrund der enzymatischen Hydrolyse verbleibt die

Hydroxylgruppe am SQMG, weist im Vergleich zum Tochterion (m/z 537,3

bzw. m/z 537,4) einen Massenshift von 18 Da auf und bestätigt damit die

SQDG-Struktur in ihrer molekularen Gesamtheit.

Vergleichende massenspektrometrische Untersuchungen der SQDG und der

SQMG lassen eine Fragmentierungsregel deduzieren, die eine Eliminierung von

den ungesättigten Fettsäuren aus SQDG von P. purpureum an sn-1-Position

während des Ionisationsprozesses beschreibt. Diese erstmals beschriebene

Diskussion

- Seite 128 -

Regel bietet die Grundlage der vollständigen Strukturidentifizierung weiterer

SQDG.

Die massenspektrometrischen Daten bestätigen das Vorkommen der SQDG-

strukturen (C18:2/C16:0, C20:5/C16:0 und C20:4/C16:0) in P. purpureum. Im

Gegensatz dazu enthält der kommerziell verfügbare Standard die beiden

SQDG-Regioisomere (C18:3/C16:0 und C16:0/C18:3), die im MS1 mit m/z 815,6

bestimmt werden. Sie variieren in der sn-Position der Fettsäuren, so dass im

MS2 zwei Fragmentionen (m/z 537,3 und m/z 559,3) entstehen.

Die Strukturuntersuchungen der isolierten SQDG erlauben zusätzlich anhand

des identifizierten Fettsäurespektrums die Unterscheidung zwischen prokaryo-

tischem und eukaryotischem Biosyntheseweg:

Der eukaryotische Anabolismus des DAG ist im Cytosol der Eukaryoten

lokalisiert. Er ist charakterisiert durch die Veresterung von Palmitinsäure

(C16:0), Stearinsäure (C18:0) oder Ölsäure (C18:1) an der sn-1-Position und

einer ungesättigten C18-Fettsäure an der sn-2 Position des Glycerolgerüstes

(Abb. 7.2) [Frentzen et al., 1984; Browse et al., 1986]

Abb. 7.2 Eu- und prokaryotische Biosynthese von SQDG

Diskussion

- Seite 129 -

Der prokaryotische Anabolismus des SQDG-Precursormoleküls Diacylglycerol

(DAG) erfolgt in Prokaryoten und in Chloroplasten von Eukaryoten. Er ist

charakterisiert durch Ligation von Linolsäure (C18:2) an der sn-1 Position des

Glycerol-3-Phosphates, einer anschließenden Ligation von Palmitinsäure

(C16:0) an der sn-2-Position [Bertrams and Heinz, 1981; Frentzen et al., 1983]

und einer abschließenden Dephosphorylierung [Joyard and Douce, 1977, 1979;

Joyard et al., 1986] (Abb. 7.2). Das Vorkommen von mehrfach ungesättigten

Fettsäuren der SQDG in den Chloroplasten basiert auf der Oxidation lang-

kettiger Fettsäuren durch Desaturasen.

Infolge der Endosymbiontentheorie wird die Koexistenz von pro- und eukaryo-

tischem SQDG-Biosyntheseweg sowohl in der Alge P. purpureum als auch im

Spinat erwartet (Kap. 7.1). So kann beispielsweise anhand der isolierten und

identifizierten SQDG (C18:3/C16:0 bzw. C16:0/C18:3) aus dem Spinat (Standard)

ein prokaryotischer und ein eukaryotischer Biosyntheseweg abgeleitet werden.

Im Gegensatz dazu kennzeichnet das Fettsäurespektrum der SQDG aus

P. purpureum (C18:2/ C16:0, C20:4/C16:0, C20:5/C16:0) ausschließlich den pro-

karyotischen Anabolismus für diese Verbindung (Abb. 7.2).

In der Endosymbiontentheorie wird davon ausgegangen, dass Cyanobakterien

von den Algen der Abteilung Glaucophyta eingeschlossen worden sind und die

Rhodophyta sich evolutionär aus den Glaucophyta entwickelt haben (Kap. 7.1)

[van den Hoek et al., 1993]. Die Biosynthese des Precursormoleküls DAG

könnte während der Evolution in P. purpureum aus dem Cytosol eliminiert und

vollständig von den Chloroplasten übernommen worden sein, so dass auf-

grund des vorkommenden SQDG-Fettsäurepatterns ausschließlich ein pro-

karyotischer Biosyntheseweg nachgewiesen werden kann. Bisher ist die

Endosymbiontentheorie zumeist durch molekulargenetische Methoden der

Sequenzhomologie von 16S rRNA belegt worden [Cedergren et al., 1988; Gouy

and Li, 1989; van den Hoek et al., 1993]. Die vorliegenden Untersuchungen

bestätigen jedoch die Endosymbiontentheorie auf der Ebene der strukturellen

Beschaffenheit von SQDG und den Biomembranen.

Ebenso wie für P. purpureum wird der prokaryotische Biosyntheseweg in den

eukaryotischen Heterokontophyta-Stämmen H. carterae (SQDG (C16:0/C16:1;

C20:5/C16:1)), P. tricornutum 1a, 1b und 6 (SQDG (C16:1/C16:0; C20:5/C16:0))

Diskussion

- Seite 130 -

durch eine sn-2 Position einer C16-Fettsäure in den identifizierten SQDG

gekennzeichnet. Die langkettigen sn-1 veresterten Eicosapentaensäuren der

SQDG C20:5/C16:1 (H. carterae) sowie der SQDG C20:5/C16:0 (P. tricornutum)

entstehen nach Elongation einer α-Linolensäure und anschließender Desa-

turierung.

Die Strukturen der SQDG von H. carterae sind bereits in Untersuchungen von

Keusgen et al. [1997] mittels aufwendiger Strukturuntersuchungen nachge-

wiesen worden. Dabei werden die Fettsäuren als Nicotinderivate mit GC/MS

und später in der SQDG-Gesamtstruktur mit LC MS/MS und NMR identifiziert.

Der prozentuale Anteil der SQDG an den Glycolipiden beträgt entsprechend

diesen Experimenten 75 %. Davon sind 53 % SQDG C16:0/C16:1 bzw. 22 %

SQDG C20:5/C16:0. Zusätzlich sind geringe Mengen der SQDG (C14:0/C16:1,

C16:0/C14:0, C15:0/ C16:1, C16:1/C16:1, C18:3/C16:1) nachgewiesen worden, die

in den vorliegenden Untersuchungen mit MALDI ToF nicht identifiziert wer-

den können.

Sowohl die Messungen der SQDG mit MALDI trap ToF MSn als auch die LC

MS/MS erfolgen im negative ion mode, so dass die SQDG als Molekülionen

[M-H]- detektiert werden können. Des Weiteren weisen die LC MS/MS-indu-

zierten Zerfälle mit den Fragmentionen der MALDI ToF MSn-Experimente

Ähnlichkeiten auf. In beiden Fällen kann die Sulfoquinovose als Struktur-

element der SQDG mit dem m/z-Wert 225 detektiert werden. Während der LC

MS/MS-Messungen werden die Acylreste der SQDG substituiert, wobei der

Zerfall entsprechend der Interpretation von Keusgen et al. [1997] nicht sn-

spezifisch erfolgt. Die Aufklärung des sn-spezifischen Fettsäurespektrums

erfolgt in diesen Untersuchungen ausschließlich durch regioselektive, enzyma-

tische Hydrolyse. Insgesamt stellt der experimentelle Ablauf zur Identifizierung

von SQDG aus Rohextrakten von Keusgen et al. einen höheren Aufwand dar.

Ebenso aufwendige Untersuchungen zur Isolierung und strukturellen Identi-

fizierung von SQDG-Strukturen in C. vulgaris NIES 227 werden von Morimoto

et al. [1993] durchgeführt. Dabei werden die SQDG dieser Alge mittels FAB-MS,

NMR und zusätzlich deren Sulfonogruppe mit IR identifiziert. Eine einfachere

Methode auf Basis des dünnschichtchromatograpischen Trennverhaltens und

der Bestimmung der Fettsäuren durch GC nutzen El Sheek und Rady zur

Diskussion

- Seite 131 -

Verifizierung von SQDG in C. kessleri (SAG211-11h) [El-Sheek and Rady, 1995].

Entgegen den Erwartungen entsprechend der Untersuchungsergebnissen von

Morimoto et al., El Sheek und Rady können in den untersuchten stammver-

wandten Chlorella-Stämme C. kessleri (SAG 211-11g), C. vulgaris (SAG 211-1) und

C. salina (C29) mit MALDI trap ToF MSn in Übereinstimmung zu den Resultaten

der analytischen DC (Kap. 7.3.2) keine SQDG nachgewiesen werden. Es ist

möglich, dass es aufgrund der angewendeten Prozessparameter (Kultivierungs-

system, Medium, Bestrahlungsstärke) zu keiner SQDG-Bildung in diesen

Chlorella-Stämmen kommt. Des Weiteren könnte zum Zeitpunkt der Ernte

(Übergang in die stationären Wachstumsphase) die SQDG-Konzentration in der

Biomasse unterhalb des Detektionslimits der DC und der MALDI ToF liegen.

Daraus ableitend ist eine quantitative Gewinnung von SQDG aus den

selektierten Chlorella-Stämme unter den gegebenen Kultivierungsbedingungen

auch in anderen Wachstumsphasen unwahrscheinlich, da die SQDG-Biosyn-

these in P. purpureum und den Heterokontophyta zumindest in der beginnen-

den stationären Wachstumsphase (Zeitpunkt der Ernte) nachgewiesen werden

kann und eine vermehrte SQDG-Bildung in keiner anderen Wachstumsphase

untersucht worden ist.

Die Unterschiede bezüglich des Nachweises von SQDG in nahe verwandten

Stämmen wird bei den selektierten A. platensis-Stämmen besonders deutlich.

Für A. platensis N-39 kann im Gegensatz zu A. platensis N-46 sowohl massen-

spektrometrisch als auch dünnschichtchromatographisch keine SQDG-Bildung

nachgewiesen werden. In diesem Stamm könnte eine Mutation in einem der

sqdg-Gene vorliegen, so dass eine vollständige Biosynthese der SQDG nicht

stattfindet. In Experimenten mit dem Purpurbakterium R. sphaeroides und den

Cyanobakterien Synechococcus sp. sowie Synechocystis sp. sind in den iden-

tifizierten SQDG-Genen sqdA, sqdB, sqdC, sqdD und sqdX Mutationen

chemisch induziert worden, so dass keine SQDG gebildet werden können

[Benning and Somervil, 1992b, a]. Derartige genetische Veränderungen könnten

auch unter natürlichen Bedingungen ablaufen.

Die Wildtypen der Cyanobakterien mit der Fähigkeit einer SQDG-Bildung

sollten die SQDG entsprechend den Erwartungen ausschließlich nach dem pro-

karyotischen Biosyntheseweg produzieren. Die Biosynthese der SQDG-Regio-

Diskussion

- Seite 132 -

isomere (SQDG (C18:2/C16:0); (C16:0/C18:2)) in A. platensis N-46 ist jedoch auf

das Vorkommen beider Biosynthesewege (prokaryotisch, eukaryotisch) zurück-

zuführen. Ein eukaryotischer Biosyntheseweg für Glycolipide ist bereits durch

Untersuchungen von Quoc et al. im Cyanobakterium Spirulina platensis (Arthro-

spira platensis) nachgewiesen worden [Quoc et al., 1993; Quoc and Dubacq,

1997]. In diesen Untersuchungen führt die Supplementierung von Oleat in das

Kulturmedium von S. platensis zur Bildung von MGDG, deren prozentualer

Linolsäureanteil mehr als 50 % der Gesamtfettsäuren entspricht. Die Durch-

führung eines enzymatischen Verdaus mit sn-1 spezifischer Lipase der

gebildeten MGDG führt zu Monogalactosylmonoacylglyceriden (MGMG) mit

sn-2-ständiger Linolsäure. Dieser Befund kennzeichnet einen eukaryotischen

Biosyntheseweg der MGDG. Die gebildeten MGDG weisen Linolsäure an sn-1

und sn-2 Position auf. Quoc et al. postulieren ableitend aus diesen Unter-

suchungen, dass das Enzym 1-Monoacyl-glycerol-3-phosphattransferase bei erhöh-

ter Oleatkonzentration nicht zwischen Palmitat und Oleat diskriminiert und

somit auch das Oleat an sn-2 Position der MGDG eingebaut wird [Quoc et al.,

1993].

Die Koexistenz von pro- und eukaryotischem Biosyntheseweg in S. platensis ist

nach Supplementierung von γ-Linolensäure zum Kulturmedium ebenso für die

Lipide MGDG, DGDG, PG sowie SQDG beobachtet worden. Eine Temperatur-

erniedrigung von 35 auf 24 °C in diesen Untersuchungen erhöht den Anteil

eukaryotisch gebildeter SQDG von 15 auf 29 % [Quoc and Dubacq, 1997]. Eine

niedrigere Kultivierungstemperatur bewirkt dabei unter gleichen Prozessbe-

dingungen (supplementierte γ-Linolensäure) ein steigendes Verhältnis von

eukaryotisch zu prokaryotisch gebildeten Lipiden (MGDG, DGDG, PG) in

S. platensis. Eine direkte Veresterung der supplimentierten γ-Linolensäure an

das Glycerolgerüst der Lipide ist für die Zelle energetisch günstiger als eine de

novo Fettsäurebiosynthese aus Acetyl-CoA. Vor diesem Hintergrund ist auch

eine Veresterung der γ-Linolensäure an beiden sn-Positionen der Lipide

verständlich. Darüberhinaus führt der vermehrte Einbau von γ-Linolensäure in

Membranlipide bei niedrigeren Temperaturen zur Erhaltung der Membran-

fluidität [Quoc and Dubacq, 1997].

Diskussion

- Seite 133 -

Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen erstmalig die Bildung von eukaryotisch

synthetisierten SQDG (16:0/C18:2) in A. platensis N-46 nach, ohne dass dem

Kulturmedium C18-Fettsäuren zugesetzt worden sind. Der eukaryotische Bio-

syntheseweg ist unter diesen Kultivierungsbedingungen für die Lipide MGDG

und DGDG, jedoch nicht für die anionischen Lipide SQDG und PG von Quoc

und Dubacq bestätigt worden. In diesen Untersuchungen ist nur ein geringer

Anteil von 1,2 % für MGDG und 0,8 % für DGDG als eukaryotische Lipide

detektiert worden [Quoc and Dubacq, 1997].

Das untersuchte Cyanobakterium N. punctiforme bildet ebenso wie A. platensis

N-46 SQDG nach dem prokaryotischen (SQDG C18:3/C16:0, SQDG C18:2/C16:0)

und dem eukaryotischen Biosyntheseweg (SQDG C16:0/C18:3, SQDG C16:0/

C18:2). Im Gegensatz dazu ist im Extrakt des Cyanobakteriums S. hofmanni aus-

schließlich ein prokaryotisches SQDG C18:2/C16:0 massenspektrometrisch

nachgewiesen worden.

Nach der klassischen Einteilung erfolgt die Biosynthese prokaryotisch gebil-

deter Lipide in Cyanobakterien oder Chloroplasten eukaryotischer Zellen. Die

eukaryotische Biosynthese des Precursormoleküls DAG erfolgt hingegen aus-

schließlich im Cytosol von Eukaryonten. Daher steht die nachgewiesene

Koexistenz des eukaryotischen und prokaryotischen SQDG-Biosyntheseweges

in Cyanobakterien (z. B. A. platensis, N. punctiforme) im Widerspruch zur

klassischen Einteilung der Synthesewege.

Entsprechend der Endosymbiontentheorie haben sich aufgenommene Cyano-

bakterien in der frühen Evolutionsphase zu Chloroplasten eukaryotischer Zel-

len entwickelt, in denen ein prokaryotischer Biosyntheseweg der Lipide erfolgt.

Die gebildeten SQDG sind in ihrer Struktur durch eine sn-2-veresterte Palmitin-

säure charakterisiert (s. P. purpureum, Kap. 7.4.3.1).

Im Laufe der Evolution werden sich Cyanobakterien auch hinsichtlich des

Lipidstoffwechsels verändert haben. Dabei könnte sich neben dem vorhan-

denen klassischen Biosyntheseweg (prokaryotisch) ein weiterer (eukaryo-

tischer) entwickelt haben. Das Vorkommen beider Stoffwechselwege in Cyano-

bakterien führt zu unterschiedlichen Lipidstrukturen, die beispielsweise die

Membranstabilität positiv beeinflussen können.

Diskussion

- Seite 134 -

Eine weiterer Erklärungsansatz könnte sein, dass Cyanobakterien bereits in der

frühen Evolution Merkmale eukaryotischer Biomembranen aufgewiesen haben.

Nach endosymbiontische Aufnahme kann es zu einer metabolischen Neustruk-

turierung des Lipidstoffwechsels gekommen sein, infolge dessen Chloroplasten

SQDG ausschließlich nach dem prokaryotischen Stoffwechselweg synthe-

tisieren.

Fazit:

Die MALDI trap ToF Hybrid MSn ermöglicht die Charakterisierung der SQDG.

Die Positionierung der Fettsäuren erfolgt anhand der Fragmentierungsregel, die

durch einen enzymatischen Verdau mit der Lipase der SQDG aus R. arrhizus

und anschließenden MS1-Untersuchungen verifiziert worden ist. Anhand des

identifizierten Fettsäurespektrums der SQDG kann zwischen pro- und eukaryo-

tischem Biosyntheseweg in phototrophen Mikroorganismen unterschieden

werden. Die in den selektierten Mikroalgen P. purpureum, H. carterae, P. tricor-

nutum 1a, P. tricornutum 1b und P. tricornutum 6 nachgewiesenen SQDG mit

einer sn-2-veresterten C16-Fettsäure und einer ungesättigten Fettsäure an sn-1

Position bestätigen einen prokaryotischen Biosyntheseweg in den eukaryo-

tischen Mikroalgen entsprechend der Endosymbiontentheorie (Kap. 7.1 bzw.

Kap. 7.4.3).

Im Gegensatz zu den Mikroalgen ist in einigen, selektierten Cyanobakterien

(A. platensis N-46, N. punctiforme) neben der Bildung der prokaryotischen SQDG

(sn-2-Palmitoylrest) auch die eukaryotische Synthese von SQDG (sn-2-C18-Fett-

säure) beobachtet worden. Die bisherige Zuordnung eines ausschließlich

prokaryotischen Biosyntheseweg in Cyanobakterien widerspricht somit den

erzielten Ergebnissen (Kap. 7.4.3).

7.4.4 MALDI ToF von Ac-SQDG aus phototrophen Mikroorganismen

In den Mikroalgen P. tricornutum 1a, 1b und 6 können mittels MALDI trap ToF

Hybrid MSn zusätzlich zu den SQDG (C16:1/C16:0; C20:5/C16:0) die Ac-SQDG

(sn-1/sn-2/2´, C16:1/C16:0/C20:5; C20:5/C16:0/C20:5) nachgewiesen werden.

Die vorliegenden MSn-Experimente der Ac-SQDG von P. tricornutum 1b bestä-

tigen die Veresterung der Eicosapentaensäure an 2´-Position der Sulfoquino-

vose. FAB-CAD-MS/MS- und NMR-Untersuchungen der Ac-SQDG-Moleküle

Diskussion

- Seite 135 -

(C18:3/C16:0/C18:4, C18:3/C16:0/C18:3 und C18:2/ C16:0/C18:4) aus Chlamydom-

onas reinhardtii von Rieckhof et al. belegen ebenso die 2´-Position der Fettsäure

an der Sulfoquinovose [Riekhof et al., 2003]. Ein Vergleich der Ac-SQDG aus

den P. tricornutum-Stämmen und aus C. reinhardtii zeigt das Vorkommen von

vielfach ungesättigten Fettsäuren an der 2´-Position. Hingegen besitzen struk-

turähnliche Ac2-SQDG aus Scytonema sp. gesättigte Palmitoylreste an 2´-und 3´-

Position der Sulfoquinovose [Reshef et al., 1997].

Die identifizierten Ac-SQDG-Strukturen aus den P. tricornutum-Stämmen sind

zur Strukturbestätigung mit einer sn-1-regioselektiven Lipase aus R. arrhizus

hydrolysiert worden. Entsprechend der Regioselektivität dieser Lipase ist zu

erwarten [Fischer et al., 1973; Tulloch et al., 1973], dass ausschließlich die Fett-

säure an sn-1-Position der Ac-SQDG hydrolisiert wird. Die MALDI ToF-Daten

des verdauten Produktes von Ac-SQDG belegen einen m/z-Wert von 555,2

(Abb.5.25), der das Molekülion von SQMG C16:0 repräsentiert. Folglich diskri-

miniert die Lipase bei der Hydrolyse nicht zwischen der sn-1 und der 2`-Position

der Ac-SQDG und hydrolisiert die Fettsäuren an beiden Positionen. Diese

Ergebnisse ergeben neue Erkenntnisse, da die Ac-SQDG mit der 2´-veresterten

Fettsäure keine nativen Substrate für die Lipase aus R. arrhizus darstellen. Die

beobachtete Substraterweiterung dieser Lipase könnte weitere, neuartige

Anwendungen z. B. in der Biotransformation von Lipiden ermöglichen, die

technisch von Bedeutung sind.

Der enzymatische Verdau der Ac-SQDG aus den P. tricorntum-Stämmen

bestätigt in massenspektrometrischen Untersuchungen die Struktur der Ac-

SQDG zusätzlich. Das detektierte SQMG C16:0 im Massenspektrum charak-

terisiert dabei zusätzlich zu den MSn-Experimenten die sn-2-Position der

Palmitoylreste in den Strukturen von Ac-SQDG.

Die Synthese der Ac-SQDG in den P. tricornutum-Stämmen kann hinsichtlich

ihrer Funktion als Bestandteil der Thylakoidmembran abgeleitet werden. Im

Vergleich zu den SQDG können Ac-SQDG aufgrund ihres lipophileren

Charakters leichter in die Thylakoidmembran eingebaut werden. Der Einbau

lipophilerer Ac-SQDG mit der 2´-positionierten Eicosapentaensäure erhöht

aufgrund des hohen Desaturierungsgrades dieser Fettsäure zusätzlich die Flui-

dität der Thylakoidmembran.

Diskussion

- Seite 136 -

7.5 HPLC-ESI-MS

Die HPLC-ESI-Massenspektrometrie ermöglich durch Peakextraktion eine

Quantifizierung der SQDG. Der kommerziell verfügbare SQDG-Standard

(SQDG aus Spinacia oleracea) weist jedoch im HPLC-Chromatogramm keine

Gauss`sche Verteilung des Analytpeaks auf und kann daher in der Etablierung

der HPLC-Analytik nicht verwendet werden. Das unzureichende Auflöse-

vermögen des Analytpeaks könnte auf undefinierter Addukte oder vorkom-

mende SQDG-Stereoisomere im Standard zurückgeführt werden.

Im Gegensatz zum kommerziell verfügbaren Standard kann für den selbst her-

gestellten SQDG-Standard aus P. purpureum ein hochaufgelöster, definierter

Peak im HPLC-Chromatogramm detektiert werden(Abb. 5.26). Die geringen

Standardabweichungen und Variation in den Retentionszeiten der SQDG-

Standards (tR 3,8 bis 4,2 min) erlaubt eine Quantifizierung von SQDG in den

Proben mittels HPLC-ESI-MS.

7.6 Untersuchungen zur Optimierung der SQDG-Bildung

Die Variation der Bestrahlungsstärke von 30 auf 110 µE m-2 s-1 führt in der

Kultivierung von A. platensis N-46 zur Steigerung der Biomassekonzentration

bis zur Ernte von 0,79 gBTM l-1 auf 2,05 gBTM l-1. Das Wachstum des Ansatzes mit I0

30 µE m-2 s-1 (µmax 0,46 d-1) ist aufgrund einer Lichtlimitierung im Vergleich zu

den anderen Kultivierungen (µmax 0,59 bis 0,60 d-1) reduziert. Es führt in den

Zellen zu einer geringeren Ausbeute an Reduktionsäquivalenten (ATP, NADP+)

in der lichtabhängigen Reaktion der Photosynthese, so dass nachfolgend im

Calvin Zyklus weniger Kohlendioxid zum Aufbau organischen Materials fixiert

werden kann.

Die geringere Biomasse der Kultivierungen mit einer PPFD von 60 bzw.

80 µE m-2 s-1 im Vergleich zur Kultivierung 110 µE m-2 s-1 kann infolge höherer

Zelldichten bei fortgeschrittener Prozesszeit ebenso in einer Lichtlimitierung

begründet sein.

In einer weiteren Versuchsreihe der vorliegenden Arbeit ist gezeigt worden,

dass eine Veränderung der Bestrahlungsstärke von 60 auf 0 µE m-2 s-1 nach 141,5

Prozessstunden zum Ende der exponentiellen Wachstumsphase im Vergleich

zur konstanten Bestrahlung (60 µE m-2 s-1, 1,10 g l-1) zu einer geringeren Bio-

massekonzentration bei der Ernte führt (0,70 g l -1). Die Zellen in diesem Ansatz

Diskussion

- Seite 137 -

gehen nach Änderung der Bestrahlungsstärke in die stationäre Wachstums-

phase über. Das fehlende Licht verhindert, dass die Zellen unter autotrophen

Wachstumsbedingungen (keine organische C-Quelle) Photosynthese betreiben

und weiter Biomasse aufbauen.

Zusätzlich zur Lichtlimitation kann auch eine höhere Bestrahlungsstärke

(140 µE m-2 s-1 PPFD) zu einer reduzierten Biomassebildung (Lichtinhibierung)

führen. Die intensive Bestrahlung führt zu hohen Elektronenflussraten im

Photosystem der Zellen. Da der Elektronenfluss durch Plastochinon begrenzt

ist, kommt es zum Rückstau der Elektronen und der Akkumulation der

energiereichen Zustände im Chlorophyll. Dies verursacht eine fortlaufende,

irreversible Schädigung des Photosynthesesystems [Lawlor, 1992] und hat eine

geringere Biomassekonzentration zur Folge.

Die Variation der Phosphatquelle/-konzentration (1:1 K2HPO4, 1:1 K2P2O7, 1:10

K2P2O7) beeinflusst im Gegensatz zur Bestrahlungsstärke die Biomassekonzen-

tration (1,24 gBTM l-1, 1,18 gBTM l-1, 1,10 gBTM l-1) nicht. Hinsichtlich der SQDG-

Bildung belegen die Untersuchungen der Phosphatvariation, dass in den

Ansätzen mit K2P2O7 (Pyrophosphat) mehr SQDG in der Biomasse gebildet

wird als in der Standardkultivierung mit K2HPO4 (Orthophosphat) im Medium.

Pyrophosphat weist im Vergleich zum Orthophosphat ein größeres

Gruppenübertragungspotential auf, wodurch eine energetisch günstigere

Übertragung der Pyrophosphatgruppe auf andere Biomoleküle favorisiert ist.

Die gesteigerte SQDG-Bildung kann somit auf das höhere

Gruppenübertragungspotenzial des Pyrophosphates zurückgeführt werden,

wodurch die intramolekulare Stoffwechselprozesse ebenso die SQDG-

Biosynthese mit geringerem Energieaufwand ablaufen.

Der Parameter Phosphatkonzentration im Medium, der in diesen Versuchen

ebenso untersucht worden ist, wird häufig in der Literatur im Zusammenhang

mit einer gesteigerten SQDG-Bildung diskutiert. Phosphat kann unter limi-

tierenden Bedingungen aus den Phosphatidylglycerolen (PG) der Thylakoid-

membran für die Aufrechterhaltung biochemischer Prozesse im Organismus

(z. B. DNA-Synthese) gewonnen werden. Die PG können dabei durch SQDG

ersetzt werden, so dass der Anteil acidischer Lipide in der Thylakoidmembran

konstant bleibt [Benning et al., 1993; Güler et al., 1996; Essigmann et al., 1998].

Diskussion

- Seite 138 -

Beispielsweise ist unter phosphatlimitierenden Bedingungen in R. sphaeroides

die SQDG-Produktion um den Faktor acht und in A. thaliana um den Faktor

drei erhöht worden [Benning et al., 1993; Essigmann et al., 1998]. Im Gegensatz

zu diesen Befunden wird die Bildung der SQDG in der Biomasse von

A. platensis N-46 um 20 % reduziert (1,03 mgSQDG gBTM-1 � 0,80 mgSQDG gBTM-1),

wenn eine zehnfach geringere K2P2O7-Konzentration im Kulturmedium ver-

wendet wird. Es kann angenommen werden, dass die niedrige Phosphat-

konzentration in den Versuchen (285 µM Phosphat, 1:10 K2P2O7) noch nicht im

Bereich einer Limitierung für A. platensis N-46 liegt. Andererseits ist es möglich,

dass entgegen den Resultaten der Literatur eine phosphatlimitierende Kulti-

vierung die SQDG-Bildung in A. platensis N-46 nicht erhöht.

In den Untersuchungen mit verschiedenen Bestrahlungsstärken wird der maxi-

male SQDG-Gehalt in der Biomasse (0,83 mgSQDG gBTM-1) im Ansatz 30 µE m-2s-1

erzielt. Die hohe SQDG-Konzentration könnte auf einer Vergrößerung der

Thylakoidmembran und erhöhter Bildung von Photosynthesepigmenten in der

Zelle (z. B. Chlorophyll a) beruhen, so dass eine optimale Photonenausnutzung

für die Photosynthese (Lichtreaktion) gewährleistet werden kann [Anderson,

1986; Dubinsky et al., 1995]. Diese Vermutung kann durch makroskopische

Beobachtungen während der Kultivierungen bestätigt werden. Die Zellen

weisen infolge einer erhöhten Bildung des Photosynthesepigments Chlorophyll

eine dunklere Färbung der Biomasse auf (Abb. 5.29).

Die Zunahme der SQDG-Produktion mit Steigerung der PPFD von 60 µE m-2s-1

(0,40 mgSQDG gBTM-1) auf 140 µE m-2s-1 (0,76 mgSQDG gBTM-1) belegt einen weiteren

Zusammenhang zwischen Bestrahlungsstärke und SQDG-Bildung. Bei fort-

schreitender Kultivierung und Zunahme der Biomasse schatten sich die Zellen

gegenseitig immer mehr ab. Für eine effektive Ausnutzung eingestrahlter

Lichtenergie wird vermutlich die photosynthetische Membran vergrößert,

damit weiterhin ausreichend Reduktionsäqivalente für den anschließenden

Calvinzyklus zur Verfügung zu stehen [Anderson, 1986]. Da die Lichtver-

hältnisse in den höher bestrahlten Kulturansätzen im Vergleich zum Prozess-

start mehr differieren, kann dies zu einer höheren SQDG-Ausbeute führen.

Der gezielte Wechsel der Bestrahlungsstärke wirkt sich schließlich während der

Kultivierung auch positiv auf die SQDG-Bildung aus. Der Kultivierungsansatz

Diskussion

- Seite 139 -

1:10 K2P2O7/60�0 µE m-2s-1 belegt eine 1,8fache Steigerung der SQDG-Bildung

(1,44 mgSQDG gBTM-1) im Vergleich zur Kultivierungen unter sonst gleichen Be-

dingungen (0,80 mgSQDG gBTM-1). Bei Lichtmangel reagieren vermutlich die

Cyanobakterienzellen ähnlich den Pflanzen, bei denen Regulationsmechanis-

men zum Entgegenwirken des Lichtmangels aktiviert werden [Anderson, 1986].

So kann beispielweise eine erhöhte Bildung von SQDG und anderen Thylakoid-

membranlipiden induziert werden.

Zusammenfassend kann aus den vorliegenden Daten eine optimierte SQDG-

Produktion in einem zweistufigen Prozess abgeleitet werden. Die Zellen könn-

ten unter optimalen Wachstumsbedingungen für die Bildung einer maximalen

Biomassekonzentration mit einer PPFD von 110 µE m-2s-1 bis zum Ende der

exponentiellen Wachstumsphase kultiviert werden. Danach kann durch Reduk-

tion der Bestrahlungsstärke auf 0 µE m-2s-1 die SQDG-Bildung im zweiten

Prozessabschnitt induziert werden, so dass in der geernteten Biomasse der

frühen stationären Wachstumsphase maximale SQDG-Konzentrationen vor-

liegen.

7.7 Antivirale Bioaktivität

7.7.1 Antiviraler Bioassay mit HCMV

In Voruntersuchungen zur Etablierung des antiviralen Assays sind zur HCMV-

Vermehrung zwei Methoden getestet worden. Der Vergleich belegt anhand der

erzielten Virustiter, dass die Methode 1 (Infektion bei 10-20 % Konfluenz, MOI

0,01, Ernte Virusstock ~ 10 d p. I.) besser zur Gewinnung von hochinfektiösen

Virusstöcken als Methode 2 (Infektion bei 80 % Konfluenz, MOI 0,1, Ernte

Virusstock ~ 7 d p. I.) geeignet ist (Abb. 5.34).

Die Virusinfektion der Wirtszellen erfolgt nach einer stochastischen Verteilung.

Eine Koinfektion von einer einzelnen Wirtzellen mit Wildtyp- und vorkom-

menden Deletionsviruspartikeln kann daher bei geringen MOI (Methode 1)

ausgeschlossen werden. Es ist unwahrscheinlich, dass zwei Viruspartikel (Wild-

typ- und Deletions-) eine Zelle gleichzeitig infizieren. Werden jedoch Zellen bei

hohen MOI mit Wildtyp- und Deletionsviren infiziert, würden sich bei einer

doppelten Infektion einer Zelle die Deletionsviruspartikel infolge einer zeitlich

schnelleren Replikation des kleineren Virusgenoms erhöht vermehren.

Diskussion

- Seite 140 -

Die Infektion der Wirtszellen nach Methode 1 zu einem frühen Zeitpunkt ihres

Wachstums beugt außerdem einem möglichen Sauerstoff- oder Nährstoff-

mangel aufgrund höherer Zelldichten vor. Diese würden in einer Zellkultur die

Virusreplikation in Zellen reduzieren, da lebensnotwendige Stoffwechselvor-

gänge in der Zelle gegenüber der Virusvermehrung bevorzugt ablaufen.

Entsprechend der Methode 1 wird der virushaltige Kulturüberstand (Virus-

stock) vor der Absterbephase der Wirtszellen (Vitalität >85 %) geerntet. Dies

verhindert die Freisetzung von Deletionsviruspartikeln infolge einer erhöhten

Zelllyse während der Absterbephase der Zellkultur.

Im Gegensatz zur Methode 1 können bei der Gewinnung von Virusstöcken

nach Methode 2 Deletionsviruspartikel aufgrund der höheren MOI beim

Infizieren (MOI 0,1) und der späteren Infektion im Wirtszellwachstum besser

vermehrt werden. Ein Fortführen der Infektion bei der Herstellung weiterer

Virusstockgenerationen nach Methode 2 würde das Verhältnis von Deletions-

mutanten zur Gesamtviruszahl mit zunehmender Generation der hergestellten

Virusstöcke erhöhen (Passage Effect). Die Infektiösität des Virusstocks

(APU ml-1) mit hochinfektiösen Wildtypviruspartikeln würde mit steigender

Virusgeneration geringer werden. Dies ist nicht nur bei der Virusstockpro-

duktion, sondern auch bei der Durchführung der antiviralen Untersuchungen

unerwünscht.

Die Voruntersuchungen belegen ebenso, dass bei Verwendung höherer FKS-

Konzentrationen (10 % statt 5 %) im Medium weniger infektiöse Viruspartikel

nachgewiesen werden können (Abb. 5.34). Dies kann auf anwesende Immuno-

globuline im FKS zurückgeführt werden, die eine Virusadsorption an die Wirts-

zelle verhindern. Damit die Wirkungen der eigentlich zu testenden Substanzen

nicht durch falsch positive Ergebnisse in Anwesenheit höherer FKS-Konzen-

trationen fehlinterpretiert wird, ist in Experimenten mit Virus stets mit einer

geringen, konstanten FKS-Konzentration von 5 % gearbeitet worden.

Der etablierte HCMV-Assay basiert auf der Inhibierung der viralen Adsorption

und Fusion von HCMV an die MRC-5-Wirtszellen über Immunoperoxidase-

färbung der viralen IE-Proteine (IE-POX-HCMV-Assay). Der Assay ermöglicht

aufgrund der POX-Färbung frühzeitig exprimierter IE-Proteine die Bestim-

mung der antiviralen Aktivität von adsorptions-/fusionsinhibierenden Substan-

Diskussion

- Seite 141 -

zen (z. B. Dextransulfat). Die IE-Proteine können bereits 24 Stunden nach der

Infektion der Wirtszellen mit Virus nachgewiesen werden. Eine Verwendung

dieses Assays für das Screening nach neuen, antiviralen Substanzen ermöglicht

im Vergleich zu anderen Assays (z. B. DE-POX-Assay) eine zeitnahe Bewertung

des antiviralen Potentials dieser Substanzen. Zusätzliche Experimente von

wirksamen Substanzen in einem anderen Testassay (DE-POX-Assay) dienen für

weiterführende Untersuchungen (vgl. Dextransulfat, Abb. 5.35).

Antivirale Therapeutika mit dem Target der viralen DNA-Replikation redu-

zieren die Viruslast im IE-POX-Assay nicht (Abb. 5.35). Die Inhibierung der

Virusreplikation beispielsweise durch Ganciclovir erfolgt im Schritt der viralen

DNA-Replikation, so dass die frühere Expression der viralen IE-Proteine noch

stattfindet. Derartige Substanzen führen bezüglich ihrer Wirksamkeit zu falsch

negativen Resultaten im IE-POX-Assay. Der etablierte Assay ist daher nicht zur

alleinigen Beurteilung der antiviralen Wirkung heranzuziehen. Die Ergebnisse

des IE-POX und des DE-POX-Assay können zudem in Kombination wichtige

erste Hinweise für den Wirkmechanismus der getesteten antiviralen Substanz

liefern.

7.7.2 Anti-HCMV Aktivität und Zytotoxizität der SQDG

Die aufgereinigten SQDG-Fraktionen selektierter, phototropher Mikroorganis-

men reduzieren die Viruslast im IE-HCMV-POX-Assay konzentrationsab-

hängig. Aufgrund des Dipolcharakters der SQDG könnten Dipol-Dipol-Wech-

selwirkungen von SQDG mit der Virushülle oder mit den viralen Bindungs-

stellen auf der Wirtszelloberfläche die Virusadsorption inhibieren. Durch spezi-

fische Interaktionen der SQDG mit den virusfusionsvermittelnden Integrinen

auf der Wirtszelle oder den möglichen HCMV-Wirtszellrezeptoren können

virusspezifische intrazelluläre Signalkaskaden aufgehoben werden. Zukünftige

Untersuchungen der SQDG und freier Viruspartikel können, entsprechend den

Ergebnisse bezüglich der Bindung, Aufschluss über den Mechanismus der Inhi-

bierung geben. Des Weiteren können Immunoperoxidasefärbungen der Inte-

grine von Zellen klären, ob die SQDG mit den Integrinen spezifisch wechsel-

wirken.

Ein Vergleich der ermittelten IC50-Werte der SQDG von P. purpureum, H. car-

terae, P. tricornutum 1a, P. tricornutum 1b, P. tricornutum 6 und A. platensis N-46

Diskussion

- Seite 142 -

im IE-POX- und im DE-POX-HCMV-Assay belegt, dass die Viruslast im IE-

POX-HCMV-Assay bei gleichen SQDG-Konzentrationen stärker reduziert wird

(kleinere IC50) als die Viruslast im DE-POX-HCMV-Assay. Die geringere Bil-

dung der IE-Proteine in infizierten Zellen (IE-POX-HCMV-Assay), die mit

SQDG inkubiert worden sind, kann auf eine Suppression der IE-Protein-

Expression durch die SQDG zurückgeführt werden. Die IE-Proteine, die als

virale Transaktivatoren während der Virusreplikation fungieren, werden

jedoch nicht vollständig durch die SQDG inhibiert. Eine Proteinsynthese der

viralen DE-Proteine, welche virale Transaktivatoren benötigt, könnte bei einer

verminderten Bildung der Transaktivatoren (IE-Proteine) zeitverzögert ablau-

fen [Thulke, 2007]. In Übereinstimmung zu den erzielten Ergebnissen würde

eine zeitverzögerte Expression viraler DE-Proteinen infolge einer supprimierten

IE-Protein-Expression zu einer höheren Anzahl gefärbter Zellen im DE- als im

IE-POX-HCMV-Assay führen.

Im Vergleich zu anderen untersuchten Fraktionen weist vor allem die SQDG-

Fraktion des Cyanobakteriums S. hofmanii (SQDG C18:2/C16:0) eine höhere

antivirale Aktivität im IE-POX- (IC50 19 µg ml-1) und im DE-POX-HCMV-Assay

(IC50 1,3 µg ml-1) auf. Die antivirale Testung der SQDG von N. punctiforme

(SQDG (C18:3/C16:0, C16:0/C18:3, C18:2/C16:0, C16:0/C18:2),) belegt eine hohe

Wirksamkeit dieser Fraktion (IC50,IE 44 µg ml-1, IC50,DE 38 µg ml-1), welche im

Vergleich zu den Ergebnisse der SQDG von S. hofmanii nicht so ausgeprägt ist.

Im Gegensatz zu den anderen, untersuchten SQDG zeigen die SQDG von

S. hofmanii und N. punctiforme im IE-POX-HCMV-Assay eine geringere oder

vergleichbare Reduktion der Viruslast wie im DE-POX-HCMV-Assay. Diese

Ergebnisse stimmen weitgehend mit der Wirkweise von Dextransulfat überein,

welches ähnliche Ergebnisse in beiden POX-Assays erzielt. Schlussfolgernd

daraus kann für die SQDG aus S. hofmanii und N. punctiforme als Wirkmechanis-

mus zunächst eine spezifische Inhibierung der Virusadsorption und -fusion

angenommen werden.

Im Gegensatz zu den SQDG von S. hofmanni weisen die SQDG von A. pla-

tensis N-46 mit dem selben Fettsäurespektrum (C16:0, C18:2) eine unter-

schiedliche Bioaktivität auf. Die geringere antivirale Wirksamkeit von den

SQDG aus A. platensis N-46 (IC50,IE 93 µg ml-1, IC50,DE 200 µg ml-1) kann in der

Diskussion

- Seite 143 -

Variation der sn-Position der Fettsäuren begründet sein. A. platensis N-46 bildet

die SQDG (C18:2/C16:0, C16:0/C18:2) nach dem pro- und eukaryotischen,

S. hofmanni hingegen ausschließlich nach dem prokaryotischen Biosyntheseweg.

Die dargelegten biologischen Untersuchungen belegen daher, dass die sn-Posi-

tionen der Fettsäuren am SQDG-Molekül Einfluss auf die antivirale Wirksam-

keit haben. Daraus kann abgeleitet werden, dass eukaryotisch gebildete SQDG

C16:0/C18:2 weniger wirksam als prokaryotisch gebildete SQDG C18:2/C16:0

sind. Die sn-1 Position des Linoylrestes prokaryotischer SQDG (S. hofmanni)

kann vermutlich eine spezifische Bindung mit den virusadsorptionsver-

mittelnden Integrinen oder einem möglichen Wirtzellrezeptor bevorzugt ein-

gehen, so dass die HCMV-Adsorption verhindert wird.

Des Weiteren zeigen die antiviralen Untersuchungen im DE-POX-HCMV-

Assay, dass SQDG mit vielfach ungesättigten Fettsäuren, wie SQDG (C20:5/

C16:0, C20:4/C16:0) aus P. purpureum bzw. SQDG C20:5/C16:1 aus H. carterae,

eine niedrigere antivirale Aktivität (IC50 192 µg ml-1 bzw. IC50 226 µg ml-1) als

andere SQDG mit Fettsäuren geringer Kettenlänge und höheren Sättigungsgrad

aufweisen. Die geringere Wirksamkeit der SQDG mit vielfach ungesättigten

Fettsäuren könnte auf eine veränderte räumliche Molekülstruktur der SQDG

zurückzuführen sein, welche die Effektivität der antiviralen Inhibierung

reduziert. Die isolierten Fraktionen aus den P. tricorntum-Stämmen mit SQDG

C20:5/C16:0 werden bei diesem Erklärungsansatz nicht berücksichtigt, da sie

zusätzlich auch Ac-SQDG beinhalten.

Die zusätzlich zu den antiviralen Untersuchungen durchgeführten Zytotoxizi-

tätsuntersuchungen der SQDG-Fraktionen von P. purpureum, H. carterae, P. tri-

cornutum 1a, P. tricornutum 1b, P. tricornutum 6 und A. platensis N-46 weisen im

WST-1-Test nach eintägiger Inkubation keine zytotoxische Wirkung gegenüber

MRC-5-Wirtszellen auf. Die CC50-Werte können mit den vorliegenden Konzen-

trationen der SQDG nicht abschließend bestimmt werden bzw. sind größer als

660 µg ml-1. Hingegen wird im Zytotoxizitätsassay bei Inkubation der MRC-5-

Zellen über drei Tage ein CC50-Wert im Bereich von 70 bis 275 µg ml-1 ermittelt

[Thulke, 2007].

Im Vergleich zu den SQDG aus P. purpureum, H. carterae, P. tricornutum 1a, 1b,

6, A. platensis N-46 belegen die ermittelten CC50-Werte des WST-1-Testes, dass

Diskussion

- Seite 144 -

die SQDG aus S. hofmanni (SQDG C18:2/C16:0) und N. punctiforme (SQDG

C18:2/C16:0) höhere Toxizitäten aufweisen. Nach eintägiger Inkubation der

Zellen können für diese isolierten SQDG-Fraktionen CC50-Werte von 110 µg ml-1

(S. hofmanni) bzw. 315 µg ml-1 (N. punctiforme) und nach dreitägiger Inkubation

CC50-Werte von 55 µg ml-1 (S. hofmanni) bzw. 185 µg ml-1 (N. punctiforme)

bestimmt werden [Thulke, 2007]. Die erhöhte Zytotoxizität kann auf das Fett-

säurespektrum dieser SQDG mit einer ungesättigten C18-Fettsäuren an sn-1 und

der Palmitinsäure an sn-2-Position zurückgeführt werden. Die anderen Frak-

tionen, welche eine geringere Zytotoxizität aufweisen, beinhalten teilweise

zusätzlich zu diesen SQDG auch solche mit C20-Fettsäuren an sn-1 und C16-

Fettsäuren an sn-2-Position (P. purpureum, H. carterae, P. tricornutum 1a, 1b, 6)

bzw. Palmitinsäure an sn-1- und Linolensäure an sn-2-Position (A. platen-

sis N-46).

Die Bestimmung der Zytotoxizität im angewandten WST-1-Test basiert auf der

Aktivität mitochondrialer Dehydrogenasen, die in Korrelation zur Anzahl vitaler

Zellen gestellt wird. Es ist möglich, dass die SQDG-Inkubation der Zellen über

drei Tage die Enzymaktivität der Dehydrogenasen hemmt. Daher wäre es für die

Beurteilung der zytotoxischen Wirkung von SQDG notwendig, die Zyto-

toxizität der Verbindungen in anderen Testassays, wie dem LDH- oder dem

Neutralrot-Assay, zu überprüfen. Der LDH-Assay basiert auf der Messung der

Aktivität von freigesetzter, intrazellulärer LDH aus toten Zellen, so dass die

Anzahl toter Zellen bestimmt werden kann. Im Gegensatz zu diesem Test

ermittelt der Neutralrot-Assay die Anzahl lebender Zellen indirekt durch

Akkumulation des Farbstoffes im Lysozym (Kap. 2.1.3.1).

Im Hinblick auf die Anwendbarkeit von Virustatika ist der Selektivitätsindex

(SI=CC50/IC50) von entscheidender klinischer Relevanz, da er das therapeutische

Potenzial des Virustatikums bestimmt. Der SI-Wert der isolierten SQDG aus

P. purpureum, H. carterae, P. tricornutum 1a, P. tricornutum 1b und P. tricornu-

tum 6 sowie A. platensis N-46 kann nach Durchführung der Testassays (WST-1,

IE-HCMV-POX-Assay) über eine Inkubationszeit von einem Tag aufgrund der

geringen zytotoxischen Wirkung der SQDG nicht bestimmt werden. Die

erhöhte nachweisbare zytotoxische Wirkung nach einer dreitägigen Inkubation

(WST-1, IE-HCMV-POX-Assay) dieser SQDG resultiert in SI-Werten kleiner 1,

Diskussion

- Seite 145 -

so dass die SQDG für eine therapeutische Anwendung zunächst ohne Bedeu-

tung sind.

Für die HCMV-inhibierenden SQDG von S. hofmanii (SQDG C18:2/C16:0) und

N. punctiforme (SQDG (C18:2/C16:0, C16:0/C18:2, C18:3/C16:0, C16:0/C18:3))

können SI-Werte von 6 bzw. 7 nach eintägiger Inkubation sowie SI-Werte von

42 bzw. 5 nach dreitägiger Inkubation ermittelt werden. Dabei ist die SQDG-

Fraktion von S. hofmanii aufgrund des ermittelten höheren SI-Wertes und der

strukturell definierten Wirkstoffkomponente SQDG C18:2/C16:0 für die Ent-

wicklung neuer Wirkstoffkandidaten von besonderem Interesse.

Zusammenfassend können die SQDG von S. hofmanni und N. punctiforme als

vielversprechende anti-HCMV Substanzen aus phototrophen Mikroorganismen

eingestuft werden. Das therapeutische Potential dieser SQDG-Leitstrukturen

könnte durch spezifische Derivatisierungen in geeigneter Weise hinsichtlich der

pharmakologischen Eigenschaften so verändert werden, dass die Zytotoxizität

der Verbindung unter Beibehaltung ihrer antiviralen Wirksamkeit reduziert

wird.

7.7.3 Anti-HCMV-Aktivität und Zytotoxizität der Ac-SQDG

Die untersuchten Ac-SQDG von P. tricornutum 1b (Ac-SQDG (C20:5/C16:0/

C20:5 und C16:1/C16:0/C20:5)) wirken im WST-1-Test auf die Wirtszelllinie zyto

toxischer (CC50 >250 µg ml-1 bzw. 190 µg ml-1) als die isolierten SQDG von die-

sem Stamm (SQDG C20:5/C16:0, C16:1/C16:0, CC50>250 µg ml-1). Die erhöhte

Zytotoxizität der Ac-SQDG kann auf den 2´-positionierten Eicosapentaenoylrest

an der Sulfoquinovose zurückgeführt werden, da sich die Ac-SQDG und die

SQDG hinsichtlich ihrer Molekülstruktur lediglich darin unterscheiden. Ent-

scheidend für die Bioaktivität könnten dabei auch die Kettenlänge oder der

Desaturierungsgrad der Eicosapentaensäure sein.

Die antiviralen Untersuchungen der Ac-SQDG-Fraktion (C20:5/C16:0/C20:5 und

C16:1/C16:0/C20:5) zeigen eine ähnliche Reduktion der Viruslast in beiden vira-

len Assays (IE-POX bzw. DE-POX) (Abb. 5.40). Diese Ergebnisse stehen im

Gegensatz zu den Ergebnissen der SQDG-Fraktion, bei der im IE-POX-HCMV-

Assay infolge der ermittelten, kleineren IC50-Werte eine höhere antivirale Akti-

vität als im DE-POX-HCMV-Assay detektiert worden ist (Tab. 5.3). Die

ähnlichen Ergebnisse von den Ac-SQDG in beiden Assays (IE-POX, DE-POX)

Diskussion

- Seite 146 -

weisen auf einen vergleichbaren Wirkmechanismus wie Dextransulfat hin, da

für diese Substanz die bestimmten IC50-Werte miteinander vergleichbar sind.

Als Wirkmechanismus kann daher für die Ac-SQDG die Inhibierung von Virus-

adsorption bzw. -fusion abgeleitet werden.

Zusammenfassend belegen die vorliegenden, antiviralen Untersuchungen am

Beispiel der Fraktion aus P. tricornutum 1b, dass die Ac-SQDG als neuartige,

potentiell antivirale Komponenten identifiziert werden können.

7.7.4 Inhibierung der HIV-RT durch SQDG

Die SQDG-Fraktionen aus P. purpureum, H. carterae, A. platensis N-46, N. puncti-

forme, S. hofmanni und die SQDG/Ac-SQDG-Fraktionen aus P. tricornutum 1a,

P. tricornutum 1b, P. tricornutum 6 weisen eine konzentrationsabhängige, inhi-

bierende Wirkung auf das Enzym HIV-RT auf. Diese Ergebnisse sind in

Übereinstimmung mit Untersuchungen von Reshef et al. [1997], in denen

ebenso für die SQDG (C18:1/C16:0, C18:2/C16:0, C18:3/C16:0) aus den Cyano-

bakterien Oscillatoria tricoides, O. limnetica, Phormidinum tenue und die zweifach

acylierten SQDG (C18:2/C16:0/C16:0/C16:0) aus Scytonema sp. eine Inhibierung

der HIV-RT detektiert worden ist. Reshef et al. postulieren, dass die Wirksam-

keit der SQDG bzw. Ac2-SQDG auf der Interaktion ihrer Acylreste mit dem

hydrophoben Teil des Enzyms und ihrer Sulfonogruppe mit positiv geladenen

Seitenketten der HIV-RT beruht [Reshef et al., 1997].

In diesen Untersuchungen kann eine geringere inhibitorische Wirkung der Ac2-

SQDG von Scytonema sp. (IC50 2,95 µM) im Vergleich zu den SQDG (IC50 0,024

bis 0,112 µM) belegt werden. Dies kann in den zusätzlichen Palmitoylresten der

Ac2-SQDG-Struktur und einer daraus resultierenden sterischen Hinderung der

Interaktion mit dem Enzym begründet sein [Reshef, 1997]. Im Gegensatz zu

diesen Untersuchungen weisen die SQDG/Ac-SQDG-Fraktionen von P. tricor-

nutum-Stämmen mit den Ac-SQDG (2´-positionierter Eicosapentaenoylrest)

gegenüber HIV-RT eine ähnliche Aktivität wie die SQDG-Fraktionen anderer

selektierter, phototropher Mikroorganismen auf. Dies lässt zunächst auf keine

signifikante sterische Behinderung der Interaktion zur Inhibierung der HIV-RT

schließen.

Die geringen Unterschiede in der Wirksamkeit der verschiedenen SQDG/Ac-

SQDG-Fraktion von den P. tricornutum-Stämmen auf die HIV-RT-Enzymaktivi-

Diskussion

- Seite 147 -

tät könnte auf der prozentualen Zusammensetzung von einzelnen SQDG und

Ac-SQDG mit ihren unterschiedlichen Fettsäurespektren in dieser Fraktion

basieren. Reshef et al. bestätigen den Einfluss des Fettsäurespektrum auf das

Potential der Inhibierung. Die untersuchten SQDG (C18:1/C16:0, C18:2/C16:0,

C16:0/C16:0) variieren in den ermittelten IC50-Werten der HIV-RT-Enzym-

reaktion (0,024 µM; 0,077 µM; 0,112 µM) [Reshef et al., 1997]. Eine Relation

zwischen den SQDG-Strukturen und ihrer Wirksamkeit kann aufgrund der

begrenzten Daten aus den vorliegenden Untersuchungen und den Ergebnissen

von Reshef et al. nicht eindeutig abgeleitet werden.

Eine Ausnahme der konzentrationsabhängigen Inhibierung einer SQDG-Frak-

tion kann für die SQDG von P. purpurem bei einer eingesetzten Menge von 1 µg

beobachtet werden. Im Vergleich zu den Proben ohne Inhibitor wird in diesem

Messansatz eine enzymatischen HIV-RT-Aktivität von 125 % im Testassay

ermittelt. Die höheren, eingesetzten Mengen dieser SQDG-Fraktion (5 µg,

10 µg) belegen jedoch die inhibierende Wirkung der SQDG auf die HIV-RT. Die

Enzymaktivitätssteigerung bei einer eingesetzten Menge von 1 µg kann daher

vermutlich auf einen Messfehler zurückgeführt werden.

Insgesamt bestätigen die Inhibierungen der HIV-RT durch die SQDG- bzw.

SQDG/Ac-SQDG-Fraktionen zusätzlich zu den antiviralen POX-HCMV-Assay-

untersuchungen das antivirale Potential dieser Substanzklassen.

7.8 Gesamtfazit

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass anhand der Substanzklasse

potentiell antiviraler SQDG eine erfolgreiche Strategie der Entwicklung von

Wirkstoffkandidaten aus natürlichen Quellen, wie den phototrophen Mikro-

organismen, herausgearbeitet worden ist. Der Ablauf der Identifizierung poten-

tieller Virustatika aus natürlichen Quellen umfasst dabei die Selektion und

Kultivierung phototropher Mikroorganismen, das Down Stream Processing der

SQDG, die Strukturcharakterisierung mit MALDI trap ToF Hybrid MSn sowie

biologische Wirksamkeitsuntersuchungen.

1) Selektion und Kultivierung

Die Selektion potentieller SQDG-Produzenten entsprechend des Vor-

kommens in artverwandten Stämmen und die Berücksichtigung der

Diskussion

- Seite 148 -

Endosymbiontentheorie sowie der erdgeschichtlichen Entwicklung er-

höhen die Trefferquote im Screening nach potentiellen SQDG-Bildnern.

Sterilisierbare Photobioreaktoren, wie die PSM, ermöglichen die Pro-

duktion ausreichender Biomassemengen zur Gewinnung dieser Wirk-

stoffe.

2) Down Stream Processing

Die Etablierung der Aufarbeitungsmethoden DC und Adsorptions/

Desorptions-Trennverfahren ermöglicht die Gewinnung von SQDG für

die Strukturanalytik. Durch die Möglichkeit des Scale-up des Adsorp-

tions/Desorptions-Trennverfahren können SQDG in ausreichenden

Mengen für biologische Wirksamkeitsuntersuchungen gewonnen wer-

den.

3) MALDI trap ToF Hybrid MSn

Die MALDI trap ToF Hybrid MSn -Technik ist für die Strukturcharak-

terisierung der SQDG geeignet. Aufgrund massenspektrometrischer

Daten von SQDG aus P. purpureum ist eine Fragmentierungsregel der

bevorzugten Eliminierung der Fettsäure an sn-1- Position abgeleitet

worden. Diese Regel ermöglicht die vollständige Strukturcharakteri-

sierung von SQDG weiterer phototropher Mikroorganismen nach dieser

etablierten Methode.

Zusätzlich zu den SQDG können Ac-SQDG aus den P. tricornutum-Stäm-

men durch die MALDI ToF-Massenspektrometrie in ihrer Molekular-

struktur bestimmt werden.

4) Biologische Aktivitäten

Die SQDG bzw. Ac-SQDG inhibieren die Replikation von HCMV und

die enzymatische Aktivität der HIV-RT. Die beobachtete Zytotoxizität

der SQDG bestätigt die biologische Wirksamkeit der Substanzen.

Insgesamt können sowohl die SQDG als auch die Ac-SQDG als potentiell

antivirale Wirkstoffkandidaten eingestuft werden.

Ausblick und Perspektiven

- Seite 149 -

8 Ausblick und Perspektiven

Die vermehrt auftretenden Resistenzentwicklungen gegen konventionell

verwendete Virustatika und das Überspringen pathogener Viren vom Wirt Tier

auf den Wirt Mensch (z.B. SARS, H5N1) resultieren in unkalkulierbaren Risiken

für pandemische Ausbreitungen, die zukünftig neue Medikamente gegen virale

Erkrankungen erfordern. Sulfoquinovosyldiacylglyceriden (SQDG) aus

phototrophen Mikroorganismen sind in der vorliegenden Arbeit als potentielle,

antivirale Wirkstoffe gegen das humane β-Herpesvirus HCMV bestätigt

worden. Zusätzlich zur antiviralen Aktivität weisen die SQDG weitere

biologische Aktivitäten, beispielsweise antineoplastische (Inhibierung der

DNA-Polymerase) und immunosppressive (Inhibition von P- und S-Selektine)

auf [Ohta et al., 1998; Hanashami et al., 2000; Matsumoto et al., 2002; Yamamoto

et al., 2004], die in der Entwicklung neuer Pharmazeutika Berücksichtigung

finden könnten.

In den vorliegenden Untersuchungen kann für die SQDG neben der antiviralen

Wirkung gegen das HCMV eine signifikante Zytotoxizität auf die verwendete

Wirtszelllinie MRC-5 nachgewiesen werden. Die pharmakologische

Anwendung der SQDG als Virustatika oder auch als Immunosuppressiva

erfordert zunächst eine Reduktion der zytotoxischen Wirkung dieser

Verbindungsklasse. Spezifische chemische Derivatisierungen der SQDG-

Leitstruktur könnten ihre Zytotoxizität unter Beibehaltung ihrer antiviralen

Aktivität reduzieren. Die verschiedenen SQDG mit einem unterschiedlichen

Fettsäurespektrum zeigen in den Untersuchungen eine Varianz im

therapeutische Potential. SQDG mit kürzerkettigen Fettsäuren und sn-2

verknüpfter Palmitinsäure (C16:0, prokaryotische SQDG) weisen im Vergleich

zu den anderen SQDG eine höhere antivirale Aktivität auf. Eine Substitution

der längerkettigen durch kürzerkettige Fettsäuren in der SQDG-

Molekülstruktur könnte daher die Anwendbarkeit als potentielles Virustatikum

verbessern. Die modifizierten SQDG, für die im in vitro Assay eine

vielversprechende Wirksamkeit mit hohem therapeutischem Potential belegt

werden kann, müssten im Rahmen von präklinischen Untersuchungen

hinsichtlich ihres Wirkmechanismus in vitro und in vivo am Tiermodell genauer

untersucht werden.

Ausblick und Perspektiven

- Seite 150 -

Eine Verwendung der SQDG als Therapeutikum erfordert einen definierten

Produktionsprozess, der die Gewinnung des Wirkstoffes unter

reproduzierbaren Bedingungen erlaubt. Zudem ist es zur kosteneffektiven

Produktion der SQDG notwendig, die Bildung von SQDG in der Biomasse

weiter zu optimieren. Die Versuche der Prozessoptimierung lassen erkennen,

dass die Ausbeute durch gezielte Veränderungen der Bestrahlungsstärke

während des Prozesses weiter gesteigert werden kann.

Insgesamt sollte auch zukünftig das erfolgversprechende drug discovery auf

Basis des gezielten Wirkstoffscreenings aus phototrophen bzw. marinen

Mikroorganismen weiter verfolgt werden. Diese Organismengruppe

synthetisiert eine Vielzahl von komplexen Verbindungen, die bisher

unzureichend hinsichtlich ihrer Vielfalt und Wirksamkeiten untersucht worden

sind.

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Anhang

- Seite 168 -

10 Anhang

A.1 Verwendete Kultivierungsmedien

A.1.1 Medium für einzellige Grünalgen [Kuhl and Lorenzen, 1964]

Komponente Stammlösung

[g l-1]

Nährlösung

[ml l-1]

Qualität Bezugsquelle

KNO3 1,0111 reinst Merck, 1.05063

NaH2PO4*H2O 0,621 reinst Merck, 1.05063

Na2HPO4*2H2O 0,089 p. A. Merck, 1.06580

MgSO4*7H2O 0,2465 reinst Merck, 1.05882

Ca2Cl2*2H2O 0,0147 p. A. Fluka, 21101

Fe-EDTA-Lösung1) 1

Mikronährlösung**2) 1

1) Fe-EDTA-Lösung


[g l-1]

Nährlösung

[ml l-1]


FeSO4*7H2O 6,9 p. A. Merck, 1.03965

Na2EDTA 9,3 Ph. Eur. Merck, 1.08421

Die Salze werden in 800 ml Reinwasser bei 100°C gelöst und nach dem Abkühlen auf

Raumtemperatur auf 1000 ml aufgefüllt.

2) Mikronährlösung**


[g l-1]

Nährlösung

[ml l-1]


H3BO3 0,061 Ph.Eur. Roth, P010.1

MnSO4*H2O 0,169 p. A. Merck, 1.02786

ZnSO4*7H2O 0,2868 p. A. Merck, 1.08883

CuSO4*5H2O 2,5*10-3 Ph. Eur. Merck 1.59253

(NH4)6Mo7O24*4H2O 12,35*10-3 Ph. Eur. Merck, 1.59050

Anhang

- Seite 169 -

A.1.2 Modifiziertes Seewassermedium

Komponente Stammlösung [g l-1]

Nährlösung [ml l-1]


KNO3 50 20 reinst Merck, 1.05063

K2HPO4 1 20 reinst Merck, 1.05101

MgSO4*7H2O 1 20 reinst Merck, 1.05882

Mikronährlösung III1) 5

Tropic Marin2) 181

Reinwasser 723

Nach dem Autoklavieren werden folgende Lösungen dem Medium zugesetzt:

Erdextrakt3) 30

Vitamin B12 5,0*10-3 1 Fluka, 95190

1) Mikronährlösung III

Lösung A




ZnSO4*7H2O 1 1 p. A. Merck, 1.08883

MnSO4*4H2O 1 2 p. A. Merck, 1.02786

H3BO3 2 5 Ph.Eur. Roth, P010.1

Co(NO3)2*6H2O 0,2 5 p. A. Merck, 1.02554

Na2MoO4*2H2O 0,2 5 p. A. Merck, 1.06521

CuSO4*5H2O 0,005 1 Ph. Eur. Merck 1.59253

Reinstwasser 881 - -

Lösung B




FeSO4*7H2O 7 p. A. Merck 1.03965

Na2EDTA 4 Ph. Eur. Merck, 1.08421

Reinstwasser Add 1000 - -

Die Lösungen A und B werden getrennt autoklaviert und nach dem Abkühlen

vereinigt.

Anhang

- Seite 170 -

2) Tropic Marin

Tropic Marin ist ein synthetischer Meerwasserersatz aus chemisch reinen

Salzen. Es enthält die 70 Spurenelemente des Meeres in der entsprechenden

Konzentration. Die Stammlösung wir aus 166g/l Tropic Marin (Dr. Biermann

GmbH, Wartenberg, pH~7,0) hergestellt und bei Raumtemperatur gelagert.

3) Erdextrakt:

Für die Herstellung des Erdextraktes werden 1800 g Gartenerde ohne Dünge-

und Pflanzenschutzmittel oder Lehm mit zwei Liter Reinwasser in einem Gefäß

innerhalb von 24 Stunden zweimal autoklaviert (121°C, 1h). Die Erde wird

anschließend abzentrifugiert (Megafuge 1.0R, Kendro Heraeus/Thermo Electron

Cooperation, Langenselbold, 3219*g, 30 min) und der gewonnene Überstand

(Erdextrakt, OD620<0,2, pH~7,0), der gewonnene Überstand in Schottflaschen

portioniert und ein weiteres Mal autoklaviert (121°C, 30 min). Der Erdextrakt

wird bis zur Verwendung im Kühlschrank gelagert.

A.1.3 Artifizielles Seewassermedium mit Vitaminen (ASM30+V) [Schlösser, 1994]


[g l-1]

Nährlösung

[ml l-1]


NaCl 30 p. A. Fluka, 71381

TRIS 1 p. A. PROLABO,

28812.265


KCl 60 10 p. A. Merck, 1.04936

NaNO3 100 10 p. A. Merck, 1.06537

CaCl2*2H2O 30 10 p. A. Fluka, 21101

KH2PO4 5 10 p. A. Merck, 1.04873

Spurenelementlösung1)

Reinwasser 944

Vitamin B1 1,2 0,5 Fluka 04573

pH-Wert 8,0


Vitamin B12 0,01 0,5 Fluk,a 95190

Anhang

- Seite 171 -

1) Spurenelementlösung




Na2EDTA 0,75 Ph. Eur. Merck, 1.08421

Das Na2EDTA muss zunächst im Reinstwasser vollständig gelöst sein, bevor die folgenden Salze hinzugegeben werden:

FeCl3*6H2O 0,097 p. A. Merck, 1.03943

MnCl2*4H2O 0,041 p. A. Merck, 1.05927

ZnCl2 5*10-3 p. A. Merck, 1.08816

CoCl2*6H2O 2*10-3 Ph. Eur. Merck 1.59242

Na2MoO4*2H2O 4*10-3 p. A. Merck, 1.06521

Reinstwasser Add 1000

A.1.4 Brackwassermedium [Schlösser, 1994]







Mikronährlösung1) 5

Tropic Marin2) 90

Reinwasser 815


Erdextrakt3) 30

Vitamin B12 5,0*10-3 1 Fluka, 95190

1) Mikronährlösung und 2) Tropic Marin s. modifiziertes Seewassermedium

A.1.5 Modifiziertes Trebonmedium [Walter, 1999]




KNO3 1 reinst Merck, 1.05063


FeSO4*7H2O 0,0014 p. A. Merck 1.03965

Tropic Marin 181

Reinwasser Add 990


K2HPO4 43,5 10 reinst Merck, 1.05101

Mikronährstoffe I1)

1:10 verdünnt 0,1

Mikronährstoffe II2)

1:10 verdünnt 0,1

Anhang

- Seite 172 -

1) Mikronährstoffe I)

Komponente Stammlösung [mg l-1]



ZnSO4*7H2O 74 p. A. Merck, 1.08883

H3BO3 5,7 Ph.Eur. Roth, P010.1

CoSO4*7H2O 23,8 p. A. Fluka, 60860

CuSO4*5H2O 23,6 Ph. Eur. Merck, 1.59253

MnSO4*4H2O 410 p. A. Merck, 1.02786

Reinwasser Add 1000

2) Mikronährstoffe II)




(NH4)6Mo7O24*4H2O 9,2 Ph. Eur. Merck, 1.59050

NH4VO3 2,5 p. A. Merck, 1.01226

Reinwasser Add 1000

A.1.6 Artifizielles Seewassermedium ASW [Jones et al., 1963]






MgCl2*6H2O 5,6 p. A. Merck, 1.05833

CaCl2*2H2O 1,5 p. A. Fluka, 21101

KNO3 1 reinst Merck, 1.05061

KH2PO4 0,07 p. A. Merck, 1.04873

NaHCO3 0,04 p. A. Merck, 1.04873

TRIS-HCl-Puffer1) 20

Spurenelementlösung2) 1

Eisen-Chelat-Lösung3) 1

Reinwasser Add 978

Der pH-Wert des Mediums beträgt pH 7,6.

1) TRIS-HCl-Puffer

Für die Herstellung des TRIS-HCl-Puffers werden 12,14 g TRIS (Tris(hydroxy-

methyl)aminomethan-Puffer, p. A. PROLABO 28812265) in 50 ml Reinstwasser

gelöst, der pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf pH 7,6 eingestellt und die

Lösung anschließend auf 100 ml aufgefüllt.

Anhang

- Seite 173 -

2) Spurenelementlösung




ZnCl2 40*10-3 p. A. Merck, 1.08816

H3BO3 0,6 Ph. Eur. Roth, P010.1

CoCl2*6H2O 15*10-3 Ph. Eur. Merck, 1.59242

CuCl2*6H2O 40*10-3 p. A. Merck 1.02733

MnCl2*4H2O 0,4 p. A. Merck, 1.05927

(NH4)6Mo7O24*4H2O 0,37 Ph. Eur. Merck, 1.59050


3) Eisen-Chelat-Lösung

Die Eisen-Chelat-Lösung wird durch Lösen von 2,4 g FeCl3*6H2O (Ph. Eur.,

Merck 1.03943) in 1 l 0,05 M Na2-EDTA (Ph. Eur., Merck 1.08421) und

Einstellung des pH-Wertes auf pH 7,6 hergestellt.

A.1.7 Spirulina Medium

Lösung A




NaHCO3 13,61 p. A. Merck, 1.04873

Na2CO3 4,03 p. A. Merck, 1.06392

K2HPO4 0,5 reinst Merck, 1.05101

Reinwasser Add 1000

Lösung B




NaNO3 2,5 p. A. Merck, 1.06537

K2SO4 1 p. A. Roth, P022.1



CaCl2*2H2O 0,04 p. A. Fluka, 21101

Spurenelementlösung1) 6

Mikronährlösung2) 1


Vitamin B12 1,5*104 1

Die Lösungen A und B werden nach dem separaten Autoklavieren vereinigt.

Anhang

- Seite 174 -

1) Spurenelementlösung: s. Artifizielles Seewassermedium mit Vitaminen

(ASM30+V)

2)Mikronährlösung




Na2EDTA 1 50 Ph. Eur. Merck, 1.08421

H3BO3 61,8 10 Ph. Eur. Roth, P010.1

CuSO4*5H2O 1,96 10 Ph. Eur. Merck 1.59253

ZnSO4*7H2O 4,4 10 p. A. Merck, 1.08883

CoCl2*6H2O 2,0 10 Ph. Eur. Merck 1.59242

MnCl2*4H2O 1,26 10 p. A. Merck, 1.05927

Na2MoO4*2H2O 1,26 10 p. A. Merck, 1.06521


A.1.8 Modifiziertes Medium BG 11

Das Medium BG 11 wird durch Lösen von 1,64 g l-1 BG11 Broth (Fluka, 14310)

in Reinstwasser hergestellt. Das Fertigsalzmedium enthält die folgenden

Komponenten 1,5 g l-1 NaNO3, 31,4 mg l-1 K2HPO4, 36,0 mg l-1 MgSO4, 36,7 mg l-1

CaCl2, 1 mg l-1 Na2EDTA, 5,6 mg l-1 Citronensäure, 6 mg l-1 Ammoniumeisen

(III)citrat.

Die Modifikation des Mediums BG 11 erfolgt durch Zugabe von 0,1 ml l-1 1:10

verdünnter Mikronährlösung I1) und 0,1 ml l-1 1:10 verdünnter Mikronähr-

lösung II1).

1,2) s. Modifiziertes Trebonmedium

A.1.9 Basalmedium [Schlösser, 1994]







MikronährlösungIII1) 5 -

Reinwasser 905 -


Erdextrakt2)

1) Mikronährlösung III und 2) Erdextrakt s. Modifiziertes Seewassermedium

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