1

Thiole und Disulfide

2

Redoxpotential im Cytoplasma ist negativ => reduzierende Bedingunegn

• Glutathion ist Reduktionsmittel im Cytoplasma• Glutathion reduziert Disulfide im Cytoplasma

3

Redox equlibriaRedox shuffling: Einfügen von Disulfidbrücken in einem Redoxpuffer, meist Glutathion (GSH) und Glutathiondisulfid (GSSG).

Redox equlibria

4

ThiolbestimmungDTNB: Dithionitrobenzoesäure: Messung bei pH 7.5-8.5Δ Absorption bei 412 nm. ε= 13,600 M-1 cm-1 pro Thiol.

Riddles P.W., Blakeley R.L., Zerner B. (1983) Reassessment of Ellman's reagent, Methods Enzymol. 91, 49-60.

ThiolbestimmungDTP: Dithiopyridin: Messung bei pH 4; Delta Absorptionbei 343 nm. ε= 7,600 M-1 cm-1 per Thiol.

Pedersen, A. O., and Jacobsen, J. (1980) Reactivity of the thiol group in human and bovine albumin at pH 3-9, as measured by exchange with 2,2'-dithiodipyridine. Eur. J. Biochem. 106, 291-5.

5

DisulfidbestimmungNTSB: Nitro-sulfonobenzoesäure: Messung bei pH 9.5; Delta Absorptionbei 343 nm. ε= 13,600 M-1 cm-1 pro Dissulfid.

Thannhauser TW, Konishi Y, Scheraga HA. (1987) Analysis for disulfide bonds in peptides and proteins. Methods Enzymol. 143, 115-9.

Cofaktoren

Was kann man sehen,wie kann man Sie detektieren?

6

Cofaktoren

Organische Cofaktoren Anorganische Cofaktoren

Cofaktoren

Coenzyme=Organische / Metallorganische Cofaktoren

Andere

Prostethische Gruppe, wenn fest/kovalent an das Protein gebunden.

Apo-protein/-enzym (- p. Gruppe)

Holo-protein/-enzym (+ p. Gruppe)

7

Einschub Absorptionsspektroskopie

Viele organsiche Cofaktoren besitzen konjugierte ΠElektronen Systeme und absorbieren Licht im sichtbarenBereich.

Die Proben haben eine Farbe !

Ist eine Probe gefärbt => Absorptionsspektrum

Einschub Absorptionsspektroskopie• Schnell, einfach, zuverlässing• Beachte: Nur klare, partikelfreie Lösungen messen.

Lichtstreuung beinträchtigt Spektren.=> Zentrifugieren, Filtern

• Lambert- Beer: A= ε • c • d ⇒Konzentrationsbestimmung

Lambert-Beer nicht mehr linear bei zu hoher Absorption oder auchKonzentration von Molekülen (z.B. durch Lichtstreuung)

8

Einschub Fluoreszenzspektroskopie• Schnell, einfach, zuverlässing

• Fluoreszenz meist sensitiver als Absorption.

Einschub Fluoreszenzspektroskopie

• Anregungswellenlänge < Emittierte Wellenlänge

Fluoreszenz

Absorption

Messprinzip

9

Einschub Fluoreszenzspektroskopie

• AnregungsspektrumEmittiertes Licht wird beobachtet, Anregungswellenlängewird “abgefahren” / “abgerastert”.

• EmissionsspektrumEs wird bei einer Wellenlänge angeregt; das emittierte Lichtwird als Spektrum aufgezeichnet.

CofaktorenOrganische Cofaktoren

• Häm, Chlorophylle

Ausgeprägte Absorption, großes konjugiertes Doppelbindungssystem

Cytochrom c, ε410 nm =106 000 M-1 cm-1

Quantifizierung / Identifizierung über Absorptionsspektren

Bei Häm: Spektren oxidiert und reduziert sehr charakteristisch für unter-schiedliche Häm-Spezies. Reduktionsmittel z.B. NaDithionit

Häm b

10

Häm, ChlorophylleAbsorptionsspektrenAusgeprägte Absorption, ε ≥ 100 000 M-1 cm-1

Quantifizierung / Identifizierung über Absorptionsspektren

300 350 400 450 500 550 600 650

0

200

400

600

800

1 000

1 200

1 400

Wavelength [nm]

Bsp. 9 Hämgruppen/Protein

BiopterinBiologisch aktivTetrahydrobiopterin

Bsp: NO Synthase; Aromatische Aminoäuren Stoffwechsel, DOPA Synthese

Nicht kovalent gebunden

Oxidation an Luftsauerstoff zuDihydropterin

11

BiopterinBiologisch aktivTetrahydrobiopterin

Oxidation an Luftsauerstoff zuDihydropterin

HPLC• High Performance Liquid Chromatography

12

HPLC• High Performance Liquid Chromatography

HPLC: RP = Reversed Phase

• Historisch: “Normal Phase”Normalphase bezeichnet polare StationärePhase und unpolare Mobile Phase; z.B. Dünnschichtchromatografie

• Reversed Phase bezeichnet unpolareStationäre Phase und polare/mittelpolareMobile Phase.

13

BiopterinOxidation zu Dihydropterin = Biopterin

Detektion mittels HPLC und Fluorezenz, Anregung 360 nm, Emission 450 nm.

Thiamin -pyrophosphat/-diphosphat

• TPP/TDP Bindung Mg2+ abhängig

C-Umlagerungen

Bsp. Oxidative Decarboxylierung durch Pyruvatdecarboxylase

Nicht kovalent gebunden

14

Thiamin -pyrophosphat/-disphosphat

Detektion, Quantifizierung: reine Thiamin-species über Umwandlung in Thiochrom und Fluoreszenzdetektion oder Gemische über HPLC mitFluoreszenzdetektion; Anregung 377 nm, Emission 450 nm.

Ref. J Chromatogr. 307:283-94 (1984)

Flavine

15

Flavine

Flavine

FMN FAD

16

FlavineFlavine (Flavus, lat. gelb)

Meist FMN oder FAD in Proteinen nicht kovalent abersehr fest gebunden.

Sehr sehr wenige Enzyme mit Riboflavin.

Flavoprotein sind meist Redoxenzyme.

Manche Enzyme binden Flavine kovalent.

1. Nachweis: per Auge und Absorptionsspektrum.

Flavin fungiert als Redoxkatalyst.

Kovalent gebundene Flavine

17

Flavine: Absorption

Flavine: Absorption

Absorption Flavin und andere Cofaktoren überlagern sich oft. Hier z.B. 4Fe-4S Cluster und FAD

18

Flavine

Flavine / Redoxwechsel

z.B. Reaktion mit NADH

Chemischreduziert mitNaDithionit

19

Flavine: Redoxmediatoren

• Flavine können je nach Proteinumgebung1 e- und/oder 2 e- Elektrontransferkatalysieren.

20

Flavine

Flavine: Analyse

•Proteinfällung mit z.B. Trichloressigsäure,

•Abzentrifugieren

•Überstand abnehmen und neutralisieren mit K2HPO4

oder Na2CO3.

•Entsalzen

•Reversed Phase HPLC, Fluoreszenzdetektion

21

Flavine: AnalyseFMN vs FAD Fluoreszenz

FMN (0.27) hat eine höhere Quantenausbeute als FAD (0.03).

Isoalloxazin Fluoreszenz ist gequench’t durch Adenin.

Flavine: AnalyseFMN vs FAD Fluoreszenz

22

Flavine: AnalyseFMN vs FAD Fluoreszenz

Flavine: AnalyseFMN vs FAD Fluoreszenz