Tierärztliche Hochschule Hannover

Genetische Charakterisierung von europäischen

Fledermaustollwutviren in Deutschland und

Untersuchungen zu ihrer spatiotemporalen Diversität

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von

Conrad Martin Freuling

Nauen

Hannover 2009

Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. I. Greiser-Wilke und Prof. Dr. Moennig,

Institut für Virologie an der Tierärztlichen Hochschule

Hannover

2. PD Dr. F-J. Conraths, Friedrich-Loeffler-Institut,

Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Institut für

Epidemiologie, Wusterhausen

1. Gutachter: Prof. Dr. Moennig

2. Gutachter: PD Dr. große Beilage

Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2009

Diese Arbeit wurde gefördert durch ein Stipendium der Akademie für Tiergesundheit e.V.

(AfT).

Für Christiane und meine Familie

Teile dieser Arbeit wurden vorab veröffentlicht:

Originalartikel:

Freuling, C.M, N. Johnson, D.A. Marston, T. Selhorst, L. Geue, A.R. Fooks, N. Tordo, T.

Müller (2008):

A random grid based molecular epidemiological study on EBLV isolates from Germany

Dev Biol (Basel).;131 :301-9.

Freuling, C.M, E.Grossmann, F. J. Conraths, A. Schameitat, J. Kliemt, E. Auer, I. Greiser-

Wilke, and T. Müller (2008). First Isolation of EBLV-2 in Germany.

Veterinary Microbiology 131:26-34.

Vortrag:

Freuling, C.M, N. Johnson, D.A. Marston, T. Selhorst, L. Geue, A.R. Fooks, N. Tordo, T.

Müller (2007):

A random grid based molecular epidemiological study on EBLV isolates from Germany

Joint OIE/WHO/EU International Conference “Towards the Elimination of Rabies in Eurasia”

Paris (OIE Headquarters), 27-30 May 2007

Poster:

Freuling, C.M. T. Selhorst, B. Hoffmann und T. Müller (2008):

New Aspects in Molecular Epidemiology of Bat Rabies in Germany

XIX International Conference on Rabies in the Americas (RITA)

September 28–October 3, 2008

Centers for Disease Control and Prevention

1600 Clifton Road, NE, Atlanta, GA

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS ......................................................................................................... 5 

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................................................................................. 7 

1  Einleitung ......................................................................................................................... 11 

2  Literatur ............................................................................................................................ 13 

2.1  Taxonomie ................................................................................................................. 13 

2.2  Übertragung ............................................................................................................... 17 

2.3  Morphologie .............................................................................................................. 19 

2.4  Virusgenomstruktur ................................................................................................... 20 

2.5  Virusproteine ............................................................................................................. 21 

2.5.1  Das Nukleoprotein (N-Protein) .......................................................................... 21 

2.5.2  Das Phosphoprotein (P-Protein) ......................................................................... 21 

2.5.3  Das M-Protein .................................................................................................... 22 

2.5.4  Das Glykoprotein (G-Protein) ............................................................................ 22 

2.5.5  Der GL-nicht translatierte Bereich ..................................................................... 23 

2.5.6  Das L-Protein ..................................................................................................... 23 

2.6  Molekulare Differenzierung von Lyssaviren ............................................................. 24 

2.6.1  Typisierung anhand antigener Eigenschaften .................................................... 24 

2.6.2  Differenzierung basierend auf genetischen Eigenschaften ................................ 24 

2.6.3  Grundlagen phylogenetischer Analysen ............................................................. 27 

2.7  Fledermaustollwut ..................................................................................................... 29 

2.7.1  Amerika .............................................................................................................. 29 

2.7.2  Afrika ................................................................................................................. 30 

2.7.3  Australien und Asien .......................................................................................... 32 

2.7.4  Europa ................................................................................................................ 33 

2.7.5  Charakterisierung und molekulare Epidemiologie von EBLV .......................... 38 

3  Eigene Untersuchungen .................................................................................................... 42 

3.1  Material und Methoden ............................................................................................. 42 

3.1.1  Material .............................................................................................................. 42 

3.1.2  Methoden ............................................................................................................ 44 

3.1.3  Statistische Auswertung ..................................................................................... 59 

3.2  Ergebnisse .................................................................................................................. 61 

3.2.1  Auswahl der Isolate ............................................................................................ 61 

3.2.2  RT-PCR .............................................................................................................. 63 

3.2.3  Sequenzanalyse des N-Gens ............................................................................... 63 

3.2.4  Alignment und Analyse der nicht-kodierenden NP-Region .............................. 80 

3.2.5  Analyse der GL-nicht-kodierenden Region ....................................................... 82 

3.2.6  Analyse der Aminosäuresequenz des N-Proteins ............................................... 87 

3.2.7  Nachweis von EBLV-2 in Deutschland ............................................................. 89 

4  Diskussion ........................................................................................................................ 93 

4.1  Schlussfolgerungen .................................................................................................. 108 

4.2  Ausblick ................................................................................................................... 109 

5  Zusammenfassung .......................................................................................................... 111 

6  Summary ........................................................................................................................ 113 

7  Literaturverzeichnis ........................................................................................................ 115 

8  Anhang ........................................................................................................................... 136 

8.1  Verwendete Isolate .................................................................................................. 136 

8.2  Software ................................................................................................................... 137 

9  Danksagung .................................................................................................................... 138 

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

A Adenosin, oder auch Ampere

ABLV Australian Bat Lyssavirus, Australisches

Fledermaustollwutvirus

APS Ammoniumpersulfat

Aqua bidest Aqua bidestillata, zweifach destilliertes Wasser

ARV Aravan Virus

AS Aminosäure

ATCC American Type Culture Collection

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise

C Cytosin

ca. circa

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

ddNTP Didesoxyribonukleotidtriphosphat

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat

DUVV Duvenhage Virus

EBLV European Bat Lyssavirus, Europäisches

Fledermaustollwutvirus

EDTA Ethylendiamintetraazetat

ELISA Enzym-linked-immunosorbent-assay

EMEM Eagle's Minimum Essential Medium

g Gramm bzw. Erdbeschleunigung

G Guanin, auch Glykoprotein

GIS Geographische Informationssysteme

GT Genotyp

h hora, Stunde

ICTV International Committee on Virus Taxonomy

IFT Immunfluoreszenztest

IGR intergenische Regionen

IRD Infrared dye, Infrarotfarbstoff

kB Kilobasen

KHUV Khujand Virus

LBV Lagos bat Virus

mAK monoklonaler Antikörper

min Minute bzw. Minuten

mM Millimolar

MMLV-RT Moloney murine leukemia virus- reverse Transkriptase

MOKV Mokolavirus

N-J Neighbor-Joining-Methode

NRL Nationale Referenzlabor

Nt Nukleotide

OTU Operational taxonomic unit

PBS phosphat buffered saline, phosphatgepufferte Salzlösung

PCR polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion

pg Pikogramm

pH negativ dekadischer Logarithmus der

Wasserstoffionenkonzentration

pmol Pikomol

PRRSV Porzines Reproduktives und Respiratorisches Syndrom Virus

RABV Rabies Virus

RNA ribonucleic acid , Ribonukleinsäure

RNAse Ribonuklease

RNP Ribonukleoproteinkomplex

RT reverse Transkriptase

RTCIT Rapid Tissue Culture Infection Test

RT-PCR Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription

SAD-L16 Street Alabama Dufferin, modifizierter Impfstamm

SDS sodiumdodecylsulfate, Natriumdodecylsulfat

s Sekunden

spp. Spezies

T Thymin

Ta annealing temperature, Anlagerungstemperatur

Taq Thermus aquaticus (Bakterium)

TBE Tris-Borat-EDTA

Tm melting temperature, Schmelztemperatur

TSN Tierseuchennachrichtensystem

Tth Thermus thermophilus (Bakterium)

U allein Uracil, bei Enzymen Angabe der Aktivität in units

UpM Umdrehungen pro Minute

UTR/NTR untranslated region, nicht translatierte Region

UV ultraviolett

V Volt

W Watt

WCBV West Caucasian Bat Lyssavirus

WHO world health organisation, Weltgesundheitsorganisation

x fach / fache

z. B. zum Beispiel

11

1 EINLEITUNG

Die Tollwut ist eine der ältesten bekannten Zoonosen. Die klinische Manifestierung dieser

Krankheit mit einem in aller Regel tödlich endenden Verlauf hat die Menschen von jeher in

ihren Bann gezogen. Bereits aus dem Altertum gibt es Hinweise auf Tollwuterkrankungen. So

wird beispielsweise in der Eshunna, einem Gesetztestext aus Mesopotamien, verfasst ca. 2300

vor unserer Zeitrechnung (v.u.Z), der Besitzer eines Hundes zur Entschädigung verpflichtet,

wenn sein Tier den Tod eines Menschen verursacht. Auch aus China liegen historische

Berichte vor, welche Hinweise auf das Vorkommen von Tollwut bei Hunden Jahrhunderte

v.u.Z. liefern. Bereits in der Historia Animalum Aristotele aus dem vierten Jahrhundert v.u.Z.

wird geschildert, dass der Biss eines tollwütigen Hundes zur Übertragung der Krankheit auf

andere Tiere führt.

Erst in der Neuzeit konnten durch Tierversuche die Eigenschaften des ätiologischen Agens

näher beleuchtet werden. Es gelang Pasteur im Jahr 1896 zum ersten Male, einem jungen

Mann, der von einem tollwütigen Hund gebissen worden war, durch eine Impfung das Leben

zu retten (WILKINSON, 1988). Die Bekämpfung der urbanen Form der Tollwut in Europa

beinhaltete die Kontrolle, Quarantäne und gegebenenfalls die Tötung streunender Hunde.

Dann führte jedoch in der Mitte des 20sten Jahrhunderts eine Tollwutepidemie zur weiten

Verbreitung der sylvatischen Tollwut in Europa. Hierbei war der Rotfuchs (Vulpes vulpes)

Hauptüberträger. Durch die orale Immunisierung der Füchse, einem modernen Mittel der

Tierseuchenbekämpfung, ist es gelungen, die Tollwut in weiten Teilen Europas zu tilgen.

Dennoch hat diese Infektionskrankheit in vielen Entwicklungsländern Asiens und Afrikas

nichts von ihrem Schrecken verloren.

Wenig bekannt ist, dass neben der klassischen Tollwut, die durch das Rabies Virus

hervorgerufen wird, in Europa wie in den meisten Regionen der Welt Fledermaustollwut

vorkommt. Die in Europa isolierten Erreger sind zwar mit dem klassischen Tollwutvirus

verwandt, stellen aber ein separates Infektionsgeschehen dar und bilden als Europäische

Fledermaustollwutviren Typ 1 und 2 zwei separate Genotypen innerhalb des Genus

Lyssavirus. Fledermäuse sind somit das Reservoir von 6 der 7 klassifizierten

Lyssavirusgenotypen.

12

Der erste Nachweis von Fledermaustollwut in Europa wurde 1954 in Deutschland erbracht.

Seit dem wurden zunächst sporadisch, seit 1985 regelmäßig Fledermaustollwutfälle gemeldet.

Zwischen 1954 und 2007 ist in Deutschland insgesamt bei 201 Fledermäusen das

Tollwutvirus nachgewiesen worden. Die Tatsache, dass in Europa an beiden

Fledermaustollwutvarianten Menschen nach dem Biss tollwütiger Fledermäuse verstorben

sind, unterstreicht die Relevanz der Fledermaustollwut für den öffentlichen

Gesundheitsschutz.

Über die Fledermaustollwut in Europa und Deutschland ist wenig bekannt. Zwar hat

Deutschland im europäischen Vergleich eine relativ große Zahl von Nachweisen an

Fledermaustollwut, Untersuchungen an deutschen Fledermaustollwutisolaten beschränkten

sich bisher aber auf großräumige Analysen mit wenigen Isolaten.

Unter Verwendung eines Geographischen Informationssystems (GIS) und mit Hilfe eines

Raster-basierten Ansatzes wurden aus dem Virusarchiv am Nationalen Referenzlabor für

Tollwut Fledermaustollwutisolate zur weiteren genetischen Charakterisierung ausgewählt.

Um Erkenntnisse über die Diversität dieser Viren und deren spatiotemporale Verbreitung in

Deutschland zu gewinnen, wurden die Nukleotidsequenzen von drei Genomabschnitten

sequenziert und vergleichend analysiert. Die Untersuchungen wurden am nationalen

Referenzlabor für Tollwut am Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Epidemiologie, in

Wusterhausen, durchgeführt.

13

2 LITERATUR

2.1 Taxonomie

Die Erreger der Tollwut sind Einzelstrang-RNA-Viren negativer Polarität des Genus

Lyssavirus, welches zusammen mit weiteren Genera (Ephemerovirus, Vesiculovirus,

Novirhabdovirus, Cytorhabdovirus, Nucleorhabdovirus) die Familie der Rhabdoviridae in der

Ordnung Mononegavirales bildet. Innerhalb des Genus Lyssavirus werden laut dem

International Committee on Virus Taxonomy (ICTV) verschiedene Spezies unterschieden

(TORDO et al., 2004); im internationalen Schrifttum ist allerdings die Bezeichnung Genotyp

(GT) gebräuchlich. Bislang sind insgesamt 11 Lyssaviren bekannt, die aufgrund ihrer

antigenen Struktur und phylogenetischen (N-, G- und P-Gene) Eigenschaften in verschiedene

taxonomische Einheiten eingeteilt werden können (Tabelle 2-1).

GT I umfasst das Tollwutvirus (Rabies Virus, RABV), welches nahezu weltweit vorkommt

und Erreger der „klassischen Tollwut“ ist. Empfänglich für dieses Virus sind alle Säugetiere.

Reservoirspezies sind karnivore Haus- und Wildtiere sowie in Amerika auch Fledermäuse

(Anon., 2004). Das Lagos Bat Virus (LBV) repräsentiert den GT 2 und wurde aus frugivoren

und insektivoren Fledermäusen in verschiedenen Ländern Afrikas isoliert (MARKOTTER et

al., 2006a). Das Mokolavirus (MOKV) als Vertreter des GT 3 wurde aus Spitzmäusen

(Crocidura ssp.), Nagetieren, Hunden und Katzen isoliert. Daher wird vermutet, dass kleinere

terrestrische Tierarten Reservoirspezies für MOKV sind. Bisher konnte das MOKV nur auf

dem afrikanischen Kontinent nachgewiesen werden (SABETA et al., 2007). Auch GT 4

(Duvenhage Virus, DUVV) wurde bisher nur in Ländern des südlichen Afrikas gefunden.

Reservoirspezies für diesen GT sind insektivore Fledermäuse (PAWESKA et al., 2006).

Die europäische Fledermaustollwut wird durch zwei verschiedene Tollwutviren, dem

European Bat Lyssavirus-Typ 1 (EBLV-1) und 2 (EBLV-2), hervorgerufen, welche die

Genotypen 5 und 6 repräsentieren. Man geht derzeit davon aus, dass EBLV-1 und EBLV-2

vornehmlich mit Eptesicus- bzw. Myotis-Arten assoziiert sind (AMENGUAL et al., 1997).

Das Australian Bat Lyssavirus (ABLV) als Vertreter des GT 7 ist sowohl bei insektivoren

Fledermäusen als auch bei Flughunden (Pteroiden) auf dem australischen Festland

nachgewiesen worden (GUYATT et al., 2003; GOULD et al., 2002; GOULD et al., 1998).

14

Zwischen 1995 und 2005 wurden vier weitere Lyssavirusvarianten aus Fledermäusen in

verschiedenen Regionen Asiens isoliert: Aravan Virus (ARV), Khujand Virus (KHUV), Irkut

Virus (IRV) und West Caucasian Bat Virus (WCBV) (KUZMIN et al., 2005; ARAI et al.,

2003; KUZMIN et al., 2003; BOTVINKIN et al., 2003b). Eine Klassifizierung als neue

Genotypen steht noch aus. Fledermäuse sind Reservoir und Vektor für 6 der bislang 7

bekannten Genotypen.

0.05

LBV

MOKV

RABV

ABLV

EBLV-1

DUVV

IRKV ARAV

WCBV

KHUV EBLV-2

Phylogruppe IPhylogruppe IIWCBV

Abbildung 2-1: Phylogenetischer Baum der Lyssavirus-Genotypen basierend auf N-Gen-Sequenzen (modifiziert nach KUZMIN et al., 2005)

15

Basierend auf phylogenetischen Analysen in Kombination mit Untersuchungen zur

Immunogenität und Pathogenität können Lyssaviren in mindestens zwei verschiedene

Phylogruppen eingeteilt werden. Phylogruppe I umfasst die Genotypen 1, 4, 5, 6 und 7 sowie

die vorläufigen Genotypen ARV, KHUV und IRV, während die Genotypen 2 (LBV) und 3

(MOKV) zur Phylogruppe 2 zusammengefasst werden können (KUZMIN et al., 2005;

BADRANE et al., 2001). Das WCBV ist der bislang am meisten divergierende Vertreter

innerhalb des Genus Lyssavirus und keiner der beiden Phylogruppen zuzuordnen (Abb. 2-1).

KUZMIN (2005) wies nach, dass sich auch die molekularen Eigenschaften von WCBV von

denen der etablierten Phylogruppen unterscheiden.

16

Tabelle 2-1: Lyssavirus Klassifikation nach ICTV (mod. nach WHO Tech.Rep.Ser.; 918)

Virus Abkürzung Genotyp Wirtsspektrum Verbreitung

Rabies virus RABV I

Wild- und Haustiere, hämatophage und insektenfressende Fledermäuse (Nord-, Südamerika), Mensch

Europa, Asien, Amerika, Asien

Lagos bat virus LBV II fruchtfleischfressende Fledermäuse (Megachiroptera)

Afrika

Mokola virus MOKV III ? Afrika

Duvenhage virus DUVV IV insektenfressende Fledermäuse Afrika

European bat lyssavirus 1 EBLV 1 V

insektenfressende Fledermäuse (Eptesicus serotinus)

Europa

European bat lyssavirus EBLV 2 VI

insektenfressende Fledermäuse (Myotis ssp)

Europa

Australian bat lyssavirus ABLV VII

Flughunde und insektenfressende Fledermäuse (Mega/Microchiroptera)

Australien

Aravan virus ARAV ? insektenfressende Fledermäuse (isoliert aus Myotis blythi)

Zentralasien

Khujand virus KHUV ? insektenfressende Fledermäuse (isoliert aus Myotis mystacinus)

Zentralasien

Irkut virus IRKV ? insektenfressende Fledermäuse (isoliert aus Murina leucogaster)

Ostsibirien

West Causcasian bat virus WCBV ?

insektenfressende Fledermäuse (isoliert aus Miniopterus schreibersi)

Kaukasusregion

17

2.2 Übertragung

Die Übertragung von Tollwutvirus erfolgt in den meisten Fällen durch Bissverletzungen.

Tollwütige Tiere, welche vermehrungsfähiges Virus über den Speichel ausscheiden, führen

zur Verbreitung der Infektionskrankheit, indem sie das Virus über den Biss transdermal in

empfängliche Wirte inokulieren (WARRELL und WARRELL, 2004). Die Übertragung von

Tollwutvirus kann auch durch direkten Kontakt von Schleimhäuten (Mund- bzw.

Maulschleimhaut, Bindehaut) mit infektiösem Material (Speichel, Nervengewebe,

Cerebrospinalflüssigkeit) erfolgen. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass die Tollwut-

Epidemie unter Kudu-Antilopen (Tragelaphos strepsiceros) in Namibia durch das

gegenseitige Belecken, einem charakteristischen Sozialverhalten dieser Tiere, hervorgerufen

wird (BARNARD et al., 1982).

Die unmittelbare Virusübertragung zwischen Fledermäusen ist noch wenig erforscht; man

nimmt jedoch an, dass die Übertragung ähnlich wie bei terrestrischen Säugern durch

Bissverletzung erfolgt (HUGHES et al., 2006). Auch eine Übertragung via Aerosol wird

diskutiert (GIBBONS, 2002).

Nach dem Eintritt des Virus in subkutane Gewebe kann in der quer gestreiften Muskulatur die

erste Virusreplikation stattfinden. Das Tollwut-Virus bindet an den nikotinergen Azetyl-

Cholin-Rezeptor (NAChR) der neuromuskulären Endplatte, von wo aus nachfolgend

Nervenzellen infiziert werden. SHANKAR (1991) und JACKSON (2002) konnten zeigen,

dass auch ein direkter Eintritt von Virus in die peripheren Nervenzellen möglich ist. Neben

dem Azetyl-Cholin-Rezeptor wurden noch zwei weitere Rezeptoren, ein Neuronen-

Adhäsionsmolekül (NCAM) und p75NTR, ein Rezeptor neurotropher Faktoren,

nachgewiesen. Da in vitro eine Reihe anderer Zelltypen mit Tollwut-Virus infizierbar sind,

müssen weitere ubiquitäre Rezeptoren vorhanden sein, an welche das Tollwutvirus binden

kann (FINKE und CONZELMANN, 2005). Trotz Abwesenheit von p75NTR konnten

neuronale Zellen mit Tollwut infiziert werden (TUFFEREAU et al., 2007).

Das Tollwutvirus der amerikanischen Silver-haired bats (SHBRV) hat offenbar eine höhere

Affinität zu Fibroblasten und epithelialen Zellen und repliziert auch bei geringeren

18

Temperaturen in vitro, was möglicherweise eine Adaptation des Virus an die spezifischen

Übertragungswege bei Fledermäusen nahe legt (MORIMOTO et al., 1996).

Ausgehend von der peripheren Inokulation wandert das Virus durch axonalen Transport

zentripetal zum Zentralnervensystem (TSIANG, 1979). Hierbei scheint das Phosphoprotein

eine Bindung mit einer leichten Kette des Dynein-Proteins (LC 8) einzugehen (JACOB et al.,

2000; RAUX et al., 2000). Neuere Untersuchungen zeigten, dass es bei Inokulation von

genetisch modifizierten Tollwutviren des Stammes SAD-L16, denen die Bindungsstelle zu

LC 8 fehlt, zu einer Verzögerung der Virusausbreitung kommt, die histologischen

Veränderungen bei Mäusen lassen sich jedoch nicht signifikant von denen nicht veränderter

SAD–L16 Virusvarianten unterscheiden (RASALINGAM et al., 2005).

Nach der Infektion des Rückenmarks erreicht das Virus über den bereits erwähnten axonalen

Transport, und durch direkte Ausbreitung das Gehirn und führt dort zu Veränderungen der

Nervenzellphysiologie (JACKSON, 2002). Innerhalb des Zentralnervensystems findet eine

rapide Virusvermehrung statt (HEMACHUDHA et al., 2002). Erneut ist es der transaxonale

Transport, der zur zentrifugalen Ausbreitung des Virus in periphere Gewebe genutzt wird. Mit

der Infektion der Speicheldrüsen und dem Ausscheiden von infektiösem Virus im Speichel

unmittelbar vor dem Auftreten der klinischen Symptome kann das Virus auf weitere Wirte

übertragen werden und somit einen Infektionszyklus aufrechterhalten.

Die pathophysiologischen Veränderungen, die sich im Verlauf der Meningoencephalitis im

Zentralnervensystem manifestieren, führen über eine Atemlähmung zum Tod (JACKSON,

2002).

19

2.3 Morphologie

Lyssavirus-Partikel sind geschoßartig geformt und starr. Sie sind ca. 180 nm lang und

besitzen einen Durchmesser von 75nm. Eine Lipid-Doppelschicht, die der Wirtszelle

entstammt, bildet die äußere Hülle. Glykoproteine (G-Proteine) formen so genannte „Spikes“

und bedecken, mit Ausnahme des stumpfen Endes, die gesamte Virionenoberfläche und

bilden auch das Hauptoberflächenantigen (TORDO und POCH, 1988). Über eine

Transmembrandomäne ist das G-Protein in der Membran verankert (Abb. 2-2).

Innerhalb der Hülle formen das RNA-Molekül, das Nukleoprotein und das Phosphoprotein

einen aktiven Ribunukleoproteinkomplex (RNP), der eine feste helikale Struktur mit 30-35

Schlaufen bildet. Zwischen dem RNP und der Virushülle befindet sich das Matrixprotein.

(WUNNER et al., 1988).

Abbildung 2-2: Schematischer Aufbau des Tollwutvirions (Le Mecier, URL http//www.virustaxonomyonline.com)

20

2.4 Virusgenomstruktur

Lyssaviren besitzen eine nicht-segmentierte, negativ-Strang-RNA mit einer Länge von rund

12 kb (MARSTON et al., 2007; CONZELMANN et al., 1989; TORDO et al., 1986b). Das

Genom kodiert eine kurze, nicht translatierte leader-Sequenz und fünf Strukturproteine: das

Nukleoprotein (N-Protein), das Phosphoprotein (P-Protein), das Matrixprotein (M-Protein),

das Glykoprotein (G-Protein) und die virale Polymerase (L-Protein). Zwischen den

kodierenden Genabschnitten liegen nicht-translatierte Regionen (untranslated regions, UTR)

unterschiedlicher Länge (MARSTON et al., 2007; TORDO et al., 1986). Innerhalb dieser

Bereiche befinden sich zwischen Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen

sogenannte intergenische Regionen (IGR). Im Genom der EBLVs beispielsweise umfasst die

IGR im N-P-Bereich 2 Nukleotide, im P-M- und im M-G-Bereich jeweils 5 Nukleotide. Die

GL-IGR ist die längste und besteht bei EBLV-1 aus 20 und bei EBLV-2 aus 18 Nukleotiden

(MARSTON et al., 2007).

Abbildung 2-3: Darstellung des Genomaufbaus von Lyssaviren am Beispiel EBLV-1. Unterhalb der Gene (Balken) ist die Größe in nt angegeben. Nicht-translatierte Regionen (Linien) sind ebenfalls dargestellt.

21

2.5 Virusproteine

2.5.1 Das Nukleoprotein (N-Protein)

Das phosphorylierte N-Protein besteht aus 450 Aminosäuren. N-Proteine sind eng mit der

viralen RNA assoziiert und bilden gemeinsam mit dem Phosphoprotein den RNP. Die

Assoziation der RNA mit dem N-Protein schützt die RNA vor Ribonukleasen und ist

vermutlich ein wichtiger Faktor bei der Transkription (TORDO et al., 1986a).

Das Nukleoprotein induziert nur eine geringe protektive Immunreaktion. Verschiedene

Epitope, sogenannte antigenic sites, sind für das N-Protein beschrieben worden. Diese

befinden sich an den Aminosäurepositionen 313-337, 358-367, 374-383 und 410-413 (GOTO

et al., 2000; WUNNER, 1991; ERTL et al., 1991; DIETZSCHOLD et al., 1988). Die

Phosphorylierung des N-Proteins erfolgt an einer Serin-Aminosäure an Position 389

(DIETZSCHOLD et al., 1987). Das Nukleoprotein spielt beim Nachweis von Tollwutviren

mittels direkten Immunfluoreszenztests (IFT) unter Verwendung von FITC-markierten,

polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern eine wichtige Rolle (DEAN et al., 1996).

2.5.2 Das Phosphoprotein (P-Protein)

Das multifunktionelle Phosphoprotein besteht aus 297 Aminosäuren und ist als wichtiger

Kofaktor mit der viralen Polymerase (L-Protein) und dem Nukleoprotein assoziiert (CHENIK

et al., 1994). Das Virion enthält ca. 950 phosphorylierte P-Proteine. Das P-Protein hat

Bedeutung beim axonalen Transport des Virions durch Bindung an die Dynein-Light-Chain

(LC8) (JACOB et al., 2000; RAUX et al., 2000). Als Bindungsstelle der LC8 an das

Phosphoprotein wurde die Aminosäureposition 139-151 identifiziert (MEBATSION, 2001).

Die Positionen 75-90, 83-172 und 191-206 sind als weitere lineare Epitope identifiziert

worden, deren Funktion noch weitgehend unbekannt ist (RAUX et al., 1997). Das P-Protein

ist auch an der Regulation der Immunantwort infizierter Zellen beteiligt (BRZOZKA, 2006).

22

2.5.3 Das M-Protein

Das M-Protein befindet sich auf der Innenseite der Virionhülle und ist mit der

zytoplasmatischen Domäne des G-Proteins und dem RNP verbunden. Neben der Eigenschaft

als Strukturprotein hat das M-Protein auch eine Bedeutung beim Virus-Budding und der

Regulation von Transkription und Replikation (FINKE et al., 2003; MEBATSION et al.,

1999). Das M-Protein scheint auch eine Hemmung der zellulären Translation in infizierten

Zellen zu induzieren, und somit die Virusreplikation zu begünstigen (KOMAROVA et al.,

2007).

2.5.4 Das Glykoprotein (G-Protein)

Das unreife virale G-Protein besteht aus 524 Aminosäuren. Es lässt sich in vier Abschnitte

einteilen: einem Signalpeptid, bestehend aus 19 hydrophoben Aminosäuren, der Endodomäne,

einem Transmembranabschnitt und einer Ektodomäne. Nach dem Transport des G-Proteins

zum rauhen Endoplasmatischen Retikulum erfolgt die Abspaltung des Signalpeptids, so dass

das reife virale G-Protein 504 Aminosäuren besitzt. G-Protein-Trimere bilden auf der

Virionoberfläche sogenannte Spikes, welche mit Zellrezeptoren interagieren und damit die

Internalisierung des Virions in die Zelle vermitteln (COLL, 1995). Das G-Protein hat eine

große Bedeutung beim „Budding“-Prozess, bei welchem die Zellmembran beim Verlassen der

Zelle als Hülle das Virion umschliesst (MEBATSION et al., 1996a).

Innerhalb der Ektodomäne des G-Protein befinden sich zwei wichtige Epitope, die als

antigenic sites II (AS 34-42 und 198-200) und III (AS 330-338) bezeichnet werden

(PREHAUD et al., 1988; DIETZSCHOLD et al., 1983; LAFON et al., 1983). Die antigenic

site III beinhaltet die Position 333, welche einen großen Einfluss auf die Pathogenität des

Virus hat. Mutationen von Arginin zu Lysin oder Isoleucin an dieser Position führten zu einer

deutlichen Reduzierung der Pathogenität von Tollwutviren (TUFFEREAU et al., 1989;

DIETZSCHOLD et al., 1983). Innerhalb der antigenic site III liegt auch die Position 330

(Lysin), die wichtig für die Bindung des Virions an Motoneuronen ist (COULON et al.,

1998). Im Gegensatz zu anderen untersuchten Lyssaviren sind sowohl Position 333 als auch

330 bei EBLV-1 und 2 konserviert (MARSTON et al., 2007).

23

Das G-Protein ist das einzige Protein des Tollwutvirus, welches virusneutralisierende

Antikörper (VNA) induzieren kann und ist daher für die Ausbildung der Immunantwort von

essentieller Bedeutung (WIKTOR et al., 1973).

2.5.5 Der GL-nicht translatierte Bereich

Lyssaviren besitzen zwischen dem G-Protein-Gen und dem L-Protein-Gen einen

Genomabschnitt, der als GL-nicht-translatierter Bereich bezeichnet wird. Die Länge dieses

Bereiches ist je nach Genotyp variabel, bei EBLV-1 ist dieser Abschnitt 560 bp groß

(MARSTON et al., 2007). Es wurde vermutet, dass dieser Bereich ein Überbleibsel eines

Gens darstellen könnte, da Vertreter verwandter Virusfamilien, wie das Vesiculäre Stomatitis

Virus (VSV) oder das Sendai Virus, eine für ein Protein kodierende Sequenz aufweisen und

entsprechende Start- und Stopsignale nachweisbar sind. Dementsprechend wurde dieser

Bereich lange Zeit als Pseudogen ψ (psi) bezeichnet und seine Bedeutung in der Evolution

unsegmentierter negativ-Strang-RNA Viren diskutiert (TORDO et al., 1986b). Neuere

Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass dieser Abschnitt einen 3’-nicht-translatierten

Bereich darstellt (RAVKOV et al., 1995). Die Funktion dieses Bereichs könnte die

Regulierung der Expression des L-Proteins sein (MARSTON et al., 2007).

2.5.6 Das L-Protein

Die RNA-abhängige RNA-Polymerase ist mit 2142 Aminosäuren das größte virale Protein

und wird demnach L (für "large" = groß) Protein genannt. Das L-Protein bildet zusammen mit

dem Phosphoprotein einen Enzymkomplex mit mehreren Funktionen: (i) RNA-abhängige

RNA-Polymerase, (ii) Guanylyl-Transferase und (iii) Poly-A-Synthetase (CHENIK et al.,

1998; CONZELMANN, 1998).

Das L-Protein ist mit ca. 25 Molekülen pro Virion das Protein mit der geringsten Häufigkeit.

Im Gegensatz dazu sind 1800 N-Protein-Moleküle im Virion vorhanden (WUNNER et al.,

1988).

24

2.6 Molekulare Differenzierung von Lyssaviren

2.6.1 Typisierung anhand antigener Eigenschaften

Die erste Differenzierung der Lyssaviren von anderen Rhabdoviren gelang mithilfe

serologischer Methoden wie dem Serumneutralisationstest, der Komplementbindungsreaktion

oder dem Hämagglutinationshemmtest. Innerhalb der Lyssaviren konnten

Kreuzneutralisationsversuche mit Versuchstieren die zuvor beobachteten Antigen-

Unterschiede grundsätzlich bestätigen. Die Untersuchungen mit polyklonalen Seren trugen

zur Unterscheidung von Tollwutvirus (RABV) und 5 Tollwut-ähnlichen Viren, Mokola-

Virus, Lagos-Bat-Virus, Duvenhage-Virus, Obodhiang-Virus und Kotonkan-Virus bei

(RUPPRECHT et al., 1991; KING und CRICK, 1988). Die beiden aus Insekten isolierten

Rhabdoviren, Obodhiang-Virus und Kotonkan-Virus, zeigten dabei Reaktionsmuster, die auf

eher entfernte Verwandtschaftsverhältnisse schließen ließen. Jüngste Untersuchungen

klassifizieren beide Viren als Mitglieder des Genus Ephemerovirus innerhalb der Familie

Rhabdoviridae (KUZMIN et al., 2006). Die Entwicklung monoklonaler Antikörper (mAK)

revolutionierte die Typisierung von Virusvarianten. Der Einsatz von mAK, die gegen das

Nukleokapsid oder gegen das Glykoprotein des Tollwutvirus gerichtet sind, führte zu einer

feineren Differenzierung, sowohl innerhalb der RABV (Sero-, Genotyp 1) als auch zwischen

den einzelnen Serotypen (siehe Tabelle 2-1).

2.6.2 Differenzierung basierend auf genetischen Eigenschaften

Die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction PCR) ermöglichte erstmals den

diagnostischen Nachweis von Tollwutvirus-spezifischer RNA und damit weitergehende

genetische Untersuchungen. Neben genotypspezifischen RT-PCR-Protokollen

(MARKOTTER et al., 2006a; EAST et al., 2001) wurden auch Pan-Lyssavirus PCR-

Protokolle entwickelt. Hierbei erfolgt die grobe Differenzierung der jeweiligen GT in einem

zweiten Amplifikationsschritt mit GT-spezifischeren Primern (HEATON et al., 1997). Eine

endgültige Klassifizierung nach diesem Schema ist jedoch nur über eine Southern-

25

Hybridisierung bzw. mithilfe eines PCR-ELISA möglich (BLACK et al., 2000). Die RT-PCR

kann auch zum Nachweis und zur Bestimmung von Tollwut-Varianten innerhalb eines

Genotyps genutzt werden (ITO et al., 2003; NADIN-DAVIS et al., 1996). Die

Weiterentwicklung der PCR zur realtime RT-PCR für Tollwut schaffte die Voraussetzung

zum schnellen, sensitiven und spezifischen Nachweis von Tollwutvirusgenom. Die realtime

RT-PCR wird vor allem als Bestätigungstest bei IFT fraglichen bzw. negativen Ergebnissen

mit Personenkontakt in der Tollwutdiagnostik eingesetzt. Dabei werden die zum Nachweis

der Spezifität eingesetzten Sonden genutzt, um zwischen einzelnen Genotypen zu

unterscheiden (WAKELEY et al., 2005). Eine weitere Möglichkeit ist, diese Sonden so zu

entwickeln, dass sie innerhalb eines GTs Virusvarianten selektiv erkennen, wie dies

beispielsweise für PRRSV-Stämme beschrieben ist (KLEIBOEKER et al., 2005). Der Einsatz

von markierten Sonden, die spezifisch für Virusvarianten sind, kann auch bei der in-situ-

Hybridisierung zur Differenzierung von Tollwutviren genutzt werden (NADIN-DAVIS et al.,

2003). Die Untersuchung von Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLP) ist

eine weitere Möglichkeit zur Differenzierung von Tollwutviren. Hirzu wird ein Teil des

RNA-Genoms mittles RT-PCR amplifiziert und mit Restriktionsenzym behandelt.

Sequenzunterschiede führen zu unterschiedlichen Schnittmustern. Diese Technik wird zur

Unterscheidung von Feld- und Impfvirusstämmen herangezogen. Bei epidemiologischen

Untersuchungen zur Tollwut dient die RFLP meist als Grobeinteilung für im Feld

vorkommende RABV-Varianten und wird häufig durch Typisierung mittels mAk oder

Sequenzanalysen untermauert (SCHAEFER et al., 2005; ITO et al., 2001).

Die gebräuchlichste Methode für molekulare Charakterisierungen bei Lyssaviren ist die

Sequenzanalyse (WU et al., 2007). Die molekulare Typisierung und der phylogenetische

Vergleich von Sequenzdaten sind wichtige Hilfsmittel für die Tollwutüberwachung,

Epidemiologie, Risikoanalyse und Pathogenese (BROOKES et al., 2004). Sequenzanalysen

des N-Gens bildeten zudem die Grundlage für die Einteilung der Lyssaviren in die derzeit

bekannten Genotypen (KISSI et al., 1995; BOURHY et al., 1993).

26

Tabelle 2-1: Genotypübergreifende phylogenetische Studien

Genotypen Genabschnitt Autor

1, 4, 5-6 N BOURHY et al., 1992

1-6 G TORDO et al., 1993

1-6 N BOURHY et al., 1993

1-6 N KISSI et al., 2001

1-7 G BADRANE et al., 2001

1-7 N, G JOHNSON et al., 2002

1-7 P NADIN-DAVIS et al 2003

1-7 G GYATT et al., 2003

1-7 N, GOULD et al., 2002

1-7 (9) N, P, G KUZMIN et al., 2005

1-7 (11) N, P, G KUZMIN et al., 2003

1-7 L BOURHY et al., 2005*

1-7 (11) N, P, G WU et al., 2007

* Das L-Gen verschiedener Rhabdoviren wurden vergleichend untersucht

Es wurde postuliert, dass aufgrund der funktionellen Verbindung der einzelnen Proteine auch

die Gene bei Lyssaviren nicht unabhängig voneinander evolvieren und folglich alle Gene für

phylogenetische Untersuchungen geeignet seien (WU et al., 2007). Sequenzanalysen

verschiedener Gene von Lyssaviren ergaben dabei vergleichbare phylogenetische Bäume. So

können zur Differenzierung zwischen Genotypen auch kurze Genabschnitte des N-Gens oder

des G-Gens eingesetzt werden (JOHNSON et al., 2002). Beispielsweise wurden für ihre

Untersuchungen zur evolutionären Entwicklung der Lyssaviren in Bezug zur Tollwut bei

terrestrischen Karnivoren und Fledermäusen Sequenzen verwendet, welche für die

Ektodomäne des G-Proteins kodieren (BADRANE et al., 2001). Eine Zusammenfassung

relevanter genoptyp-übergreifender Untersuchungen, bei denen das N-, P-, G- oder auch L-

Gen für Sequenzanalysen verwendet wurden, findet sich in Tabelle 2-2.

Bislang wird jedoch für molekularepidemiologische und phylogenetische Untersuchungen

vorwiegend das N-Gen verwendet. Es scheint aufgrund seines hohen Konservierungsgrades

27

dafür besonders geeignet. und sollte daher als verbindliches Einteilungskriterium von

Tollwutviren in Lyssavirus-Genotypen genutzt werden (KUZMIN et al., 2005). Ein effektives

Verfahren zur Charakterisierung von Tollwutviren bekannter Lyssavirusgenotypen basiert auf

der Amplifizierung und anschließenden direkten Sequenzierung eines 600 bp langen

Genomabschnittes im N-Gen (HEATON et al., 1997). Ein wichtiger Vorteil in der

Verwendung des N-Gens liegt in der Verfügbarkeit bereits vorhandener Sequenzen in

internationalen Gendatenbanken (GenBank, EMBL), die somit umfassende vergleichende

phylogenetische Untersuchungen möglich machen (BROOKES et al., 2004). Zudem können

die erzielten Ergebnisse direkt mit denen aus Studien zur Typisierung bzw. Differenzierung

von Lyssaviren mittels anti-Nukleokapsid-mAK in Beziehung gebracht und verglichen

werden. Die GL-nicht-kodierende Region gilt als sehr variabel (BADRANE et al., 2001;

TORDO et al., 1993; SACRAMENTO et al., 1991). Da dieser Bereich keinem starken

Selektionsdruck unterliegt, kann es hier gehäuft zur Akkumulation von Mutationen kommen.

Diese Veränderungen der Sequenzen im GL-Bereich können jedoch zur Differenzierung von

jüngeren phylogenetischen Gruppen genutzt werden (COETZEE und NEL, 2007; NEL et al.,

2005; SABETA et al., 2003).

2.6.3 Grundlagen phylogenetischer Analysen

Phylogenetische Analysen, die auf molekularen Daten beruhen, sind häufig ein wichtiger

Bestandteil von epidemiologischen Studien. Solche Analysen können beispielsweise dazu

dienen, Hypothesen über den Ursprung und Verlauf eines Seuchenausbruchs zu generieren,

die Klassifizierung von Spezies oder Genotypen zu ermöglichen oder den evolutionären

Ursprung von einzelnen Gruppen zu erklären. Sequenzdaten (Nukleotidsequenzen,

Aminosäuresequenzen) sind mittlerweile die am weitesten verbreitete Datengrundlage für die

phylogenetische Analyse. Dies ist in der wachsenden Automatisierung der Sequenzierung und

in der zunehmenden Rechenkapazität moderner Computer begründet.

Die zu vergleichenden Datensätze müssen zunächst in einer Form vorliegen, die eine Analyse

möglich macht. Anschließend kann ein Sequenzvergleich (Alignment) erfolgen.

Zur phylogenetischen Analyse der Sequenzdaten und Darstellung als Dendogramm (Baum)

können verschiedene Methoden angewendet werden, die nach SWOFFORD (1996) in zwei

28

grundsätzliche Herangehensweisen unterschieden werden: (i) einem definierten Algorithmus

folgend wird der Baum erstellt und (ii) nach definierten Kriterien werden alle möglichen

Bäume verglichen und bewertet. Die Distanz-Matrix-Methoden, wie UPGMA (Unweight

Pair-Group Method with Arithmetic Means) und die Neighbor-Joining-Methode (NJ),

gehören zur ersten Gruppe. Bei der UPGMA-Methode wird eine Cluster-Analyse der

Abstandsmatrix durchgeführt. Bei jedem Schritt werden die OTUs (operational taxonomic

units – Ausdruck für die eingegebenen Organismen, deren Eigenschaften verglichen werden)

mit den geringsten Abständen einer höheren Ebene zugeordnet, wobei die Distanz zwischen

zwei Clustern der Mittelwert der paarweisen Distanzen aller Objekte in beiden Clustern ist.

Im Gegensatz zum UPGMA-Verfahren geht der NJ-Algorithmus von einem sternförmigen

Baum ohne Hierarchie aus. Basierend auf einer Distanz-Matrix werden Nachbarn mit der

geringsten Distanz zu einem Knoten, also einem hypothetischen Vorläufer der OTUs,

verbunden. Iterativ wird die Distanz-Matrix neu berechnet und ein ungewurzelter, additiver

Baum konstruiert (SAITOU und NEI, 1987). Zu den charakterbasierten Methoden gehören

die Maximum Parsimony und die Maximum Likelyhood Algorithmen.

Wichtiger Bestandteil von phylogenetischen Analysen ist die statistische Absicherung der

Ergebnisse. Das am häufigsten zur Anwendung kommende Verfahren ist das Bootstrapping,

eine statistische Methode, die in die phylogenetische Analyse integriert wurde

(FELSENSTEIN, 1985). Durch das zufällige Kopieren und Ersetzten einzelner Datenbereiche

bei gleichzeitiger Konstanz der Gesamtdatenmenge wird aus dem Ausgangsdatensatz eine

Vielzahl neuer Datensätze generiert. Alle neuen Datensätze werden in die phylogenetische

Analyse integriert, die phylogenetischen Bäume miteinander verglichen und ein Konsensus-

Baum erstellt. Der Bootstrap-Wert gibt die Wahrscheinlichkeit an, mit welcher die Annahme

erfüllt wird, dass die im Konsensus-Baum gefundene Verzweigung auch bei den einzelnen

OTUs wiederzufinden ist.

Zur Auswertung von Sequenzdaten stehen verschiedene kommerziell erhältliche oder frei

verfügbare Software-Programme zur Verfügung. Die große Zahl der Programme kann unter

http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.html eingesehen werden.

29

2.7 Fledermaustollwut

Die Ordnung Chiroptera stellen mit mehr als 800 Arten die zweitgrößte Gruppe der

Säugetiere auf der Erde. Die Vertreter dieser Ordnung lassen sich morphologisch in die

Unterordnungen Megachiroptera (Flughunde) und Microchiroptera (Fledermäuse) einteilen.

Als sehr alte Säugetierordnung haben sich die Chiroptera fast jede ökologische Nische

erschlossen und kommen, mit Ausnahme der Antarktis, auf allen Kontinenten vor (KING et

al., 2004).

Neuere Untersuchungen zeigen, dass auch eine Einteilung der Chiroptera anhand des

Vorhandenseins von Echoortung in Yinchiroptera und Yangchiroptera möglich ist (TEELING

et al., 2005). Bei der Verwendung des Begriffes Fledermaustollwut wird im Weiteren nicht

zwischen Unterordnungen differenziert.

2.7.1 Amerika

Der amerikanische Kontinent ist die einzige Region auf der Welt, wo Fledermaustollwut

durch das RABV (GT1) hervorgerufen wird. Neben Fledermäusen als Reservoir zirkuliert das

RABV in karni- bzw. omnivoren Säugetierspezies, wie zum Beispiel Waschbären,

Polarfüchsen, Graufüchsen, Koyoten und Stinktieren sowie in verwilderten und streunenden

Hunden in Mittel- und Südamerika (BRASS, 1994). Amerika ist der einzige Kontinent der

Welt, auf dem mit RABV nur ein Lyssavirus GT vorkommt (CLIQUET und PICARD-

MEYER, 2004).

Die ersten Fälle von Fledermaustollwut wurden 1930 in der Karibik beschrieben. Es wurde

gezeigt, dass blutleckende (hämatophage) Fledermäuse, sogenannte Vampirfledermäuse der

Gattung Desmodus, an Ausbrüchen von Tollwut bei Rindern und beim Menschen beteiligt

waren (BRASS, 1994). Schätzungsweise bis zu 500.000 Weiderinder fallen in Mittel- und

Südamerika jährlich der Fledermaustollwut zum Opfer (MCCOLL et al., 2000). Darüber

hinaus sind bis Mitte der 1990er Jahre mehr als 500 Fälle von Tollwutübertragung auf

Menschen durch Fledermäuse aus Lateinamerika bekannt geworden (BRASS, 1994).

30

Im Jahr 1954 wurde in Florida, USA, erstmals Tollwut bei einer fruchtfleischfressenden

Fledermaus nachgewiesen. In den darauf folgenden Jahren wurde bei nahezu allen auf dem

nordamerikanischen Kontinent beheimateten Fledermausspezies (n = 38) Tollwut

diagnostiziert. Im Jahr 2006 wurden allein in den USA 1692 Tollwutfälle bei einheimischen

Fledermäusen gemeldet. Damit sind Fledermäuse diejenige Spezies in den Vereinigten

Staaten, die nach den Waschbären am häufigsten tollwutpositiv getestet wird (BLANTON et

al., 2007). Fledermaustollwutvarianten sind mittlerweile die häufigste Ursache für humane

Todesfälle in den USA, wobei im Einzelfall nicht immer ein direkter Kontakt zu infizierten

Fledermäusen nachgewiesen werden konnte (MESSENGER et al., 2002).

Phylogenetische Untersuchungen zur Fledermaustollwut auf dem amerikanischen Kontinent

konnten belegen, dass sich die RABV-Varianten bei Fledermäusen von denen terrestrischer

Säugetiere deutlich unterscheiden (DAVIS et al., 2006). Auch innerhalb der amerikanischen

Fledermauspopulationen werden Virusvarianten unterschieden. Diese Varianten scheinen mit

bestimmen Fledermausspezies assoziiert zu sein (NADIN-DAVIS et al., 2001). Mitunter

kommt es aber auch zu Nachweisen einzelner Fledermaus-spezifischer RABV-Varianten bei

anderen Tierarten (LESLIE et al., 2006). Diese als spill-over bezeichnete Virusübertragung

von Reservoirtieren zu anderen empfänglichen Tieren oder dem Menschen ist bei der durch

RABV verursachten Fledermaustollwut häufig. In den meisten Fällen führt eine spill over-

Infektion zu einer Sackgasse im Infektionszyklus. In Arizona, USA, konnten jedoch jüngst

bei Stinktieren über einen gewissen Zeitraum wiederholt Fledermaustollwut-Varianten in

einem eng begrenzten Gebiet nachgewiesen werden, die einen etablierten Speziesübergang

(sustained spill over) vermuten lassen (LESLIE et al., 2006; SMITH et al., 2001). Es wird

angenommen, dass ein historischer spill-over vor Tausenden von Jahren zum Übergang von

Fledermaustollwut auf terrestrische Reservoirspezies führte. Diese Überschreitung der

Artbarriere war der entscheidende Ausgangspunkt für die Entwicklung der klassischen Form

der Tollwut (BADRANE und TORDO, 2001).

2.7.2 Afrika

Der afrikanische Kontinent ist neben Asien von der klassischen Tollwut (RABV) am stärksten

betroffen. Zusätzlich zu RABV wurden in Afrika drei weitere Lyssavirusgenotypen

31

nachgewiesen - Lagos Bat Virus (LBV, GT 2), Mokola Virus (MOKV, GT3) und Duvenhage

Virus (DUVV, GT 4).

Eine Assoziation der Fledermaustollwut in Afrika ist bisher nur für LBV und DUVV

eindeutig belegt. Im Jahre 1954 wurde nach dem Bekanntwerden von Tollwut in insektivoren

Fledermäusen ein Virus aus einem Flughund (Eidolon spp.) aus Lagos, Nigeria, isoliert. Erst

1970 gelang die Charakterisierung als Rhabdovirus; spätere Untersuchungen zeigten

Unterschiede zum klassischen Tollwutvirus. Der Fundort spiegelte sich in der heutigen

Bezeichnung des Virus wider. Weitere Nachweise von LBV gab es in Zimbabwe, Kenia,

Senegal, Guinea, Ägypten, Äthiopien und Südafrika. Die Mehrzahl aller Isolate stammt aus

Fledermäusen; Spill-over-Infektionen wurden bei Katzen, Hunden und einer Manguste (Atilax

paludinosus) nachgewiesen (MARKOTTER et al., 2006a; MARKOTTER et al., 2006b;

BRASS, 1994). Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass LBV-Isolate eine sehr hohe

intragenotypische Variabilität besitzen. Würden die von KUZMIN et al. (2005)

vorgeschlagenen Kriterien zur Einteilung von Lyssavirusgenotypen berücksichtigt, müssten

einige Vertreter der LBV in einem neuen Genotyp zusammengefasst werden (MARKOTTER,

2007). Eine Entscheidung darüber steht noch aus.

Das zweite Fledermaus-assoziierte Lyssavirus wurde 1970 in Südafrika aus einem Menschen

isoliert, nachdem dieser von einer insektivoren Fledermaus gebissen worden war und an den

Folgen der tollwutähnlichen Infektion verstarb. Das isolierte Lyssavirus wurde als

Duvenhage-Typ bezeichnet. Das später als GT 4 klassifizierte Virus ist auch aus insektivoren

Fledermäusen in Zimbabwe und Südafrika isoliert worden und verursachte weitere Todesfälle

bei Menschen in Südafrika (PAWESKA et al., 2006) und bei einem Menschen in den

Niederlanden, nachdem er sich in Kenia infiziert hatte (VAN THIEL et al., 2008). Der einzige

Genotyp, dessen Assoziation zu Fledermäusen bisher nicht belegt wurde, ist das MOKV (GT

3). Es wurde bislang nur bei terrestrischen Tierarten in Afrika nachgewiesen (SABETA et al.,

2007). Da Fledermäuse Reservoir und Vektor für 6 der bislang 7 bekannten Genotypen sind,

liegt jedoch die Vermutung nahe, dass das Virusreservoir für MOKV ebenfalls Fledermäuse

sein könnten.

Lange wurde über ein Vorkommen von EBLV-1 auf dem afrikanischen Kontinent spekuliert.

Bisher ist das Virus dort nicht nachgewiesen worden; die Existenz ist angesichts der

Verbreitung der im Süden Spaniens EBLV-positiv getesteten Fledermäusspezies Eptesicus

32

serotinus isabellinus bis nach Nordafrika jedoch wahrscheinlich (VÁZQUEZ-MORÓN et al.,

2008). Auch kann das Vorkommen der in Zentralasien isolierten vorläufigen Genotypen

WCBV, ARAV und KHUV in Afrika nicht ausgeschlossen werden, da sich das

Verbreitungsgebiet der betroffenen Fledermausspezies auch über Teile des Mittelmeerraumes

erstreckt.

2.7.3 Australien und Asien

Lange Zeit galt Australien als tollwutfrei, bis 1996 im Rahmen der Surveillance von Hendra-

Virus in Flughunden ein Lyssavirus isoliert wurde, das nachfolgend als Australian bat

lyssavirus (ABLV) bezeichnet und als neuer Genotyp 7 klassifiziert wurde (GOULD et al.,

1998). Zudem konnten zwei humane Tollwutfälle aus demselben Jahr auf Infektionen mit

ABLV durch Kontakt zu Fledermäusen zurückgeführt werden. Seit dem ist ABLV aus

verschiedenen Flughundarten (Pteropus alecto, P. poliocephalus, P. scapulatus und P.

conspicillatus) und aus der frugivoren Fledermausart Saccolaimus flaviventris isoliert worden.

Phylogenetische Analysen zeigten, dass innerhalb der beiden Gruppen von endemisch

infizierten Fledermausspezies jeweils spezifische ABLV-Varianten unterschieden werden

können (GUYATT et al., 2003). Man vermutet, dass ABLV auch außerhalb Australiens

vorkommen könnte; Nachweise wurden bislang nicht erbracht. Serumproben aus

Fledermäusen auf den Phillipinen und Thailand konnten ABLV neutralisieren

(LUMLERTDACHA et al., 2005; ARGUIN et al., 2002). Allerdings können Seren auch

kreuzreaktive Eigenschaften gegenüber anderen Lyssavirus-GTs aufweisen.

Über das Vorkommen von Fledermaustollwut in Asien ist wenig bekannt. Es gibt einzelne

Fallberichte aus der Türkei, Indien und Thailand aus den vergangenen Jahrzehnten, jedoch

fehlen entscheidende Hintergrundinformationen (BRASS, 1994). Nach Angaben chinesischer

Wissenschaftler gibt es Hinweise auf die Zirkulation von RABV-Varianten in Fledermäusen

in China mit einem berichteten Todesfall (TANG et al., 2005). Diese Darstellung ist unter

Berücksichtigung des bislang bekannten geographischen Vorkommens von

Lyssavirusgenotpen bei Fledermäusen in der Fachwelt allerdings umstritten.

1991 und 2001 konnten in den zentralasiatischen Staaten Kirgisien und Tadschikistan zwei

Lyssaviren aus Fledermäusen isoliert werden, die als Aravan-Virus (ARV) und Khujand-

33

Virus (KHUV) bezeichnet wurden (KUZMIN et al., 2003). Im Jahr 2002 gelang die

Isolierung des Irkutsk-Virus (IRKV) aus Fledermäusen in Westsibirien, sowie des West

Caucasian bat virus (WCBV) aus der Spezies Minopterus schreibersii in der Kaukasusregion

(BOTVINKIN et al., 2003a). Weitere Nachweise dieser Lyssaviren sind bislang nicht erfolgt,

doch ergaben serologische Untersuchungen Hinweise auf eine weitreichende Zirkulation

dieser oder anderer genetisch verwandter Lyssaviren in Fledermäusen Asiens

(LUMLERTDACHA et al., 2005). Alle vier Lyssavirusisolate sind aufgrund ihrer genetischen

Eigenschaften vorläufige Genotypen, wobei das WCBV als das genetisch am weitesten

entfernt verwandte Virus im Genus Lyssavirus gilt und auch keiner der beiden Phylogruppen

zuzuordnen ist (vgl. Abschnitt 2.1). Der Umstand, dass es sich bei den Vertretern der

asiatischen Lyssaviren bislang nur um Einzelnachweise handelt, erschwert die Einordnung in

eigenständige Genotypen.

2.7.4 Europa

Im Jahr 1954 wurde in Hamburg der erste Fall einer Tollwutinfektion bei Fledermäusen in

Deutschland festgestellt (MOHR, 1957). Dies war auch der Erstnachweis von

Fledermaustollwut in Europa überhaupt. In den nachfolgenden Jahrzehnten ist in weiteren

Ländern Europas Tollwut bei Fledermäusen nachgewiesen worden (Tabelle 2-2).

Zwischen 1977 und 2006 wurden insgesamt 826 Fälle von Fledermaustollwut an das WHO

Collaborating Centre for Rabies Surveillance and Research, am Friedrich-Loeffler-Institut

(FLI) Wusterhausen berichtet (Abbildung 2-4). Die Mehrzahl der Fälle wurde aus den

Niederlanden (283), aus Dänemark (222) und Deutschland (192) gemeldet. Aber auch in

Polen, Frankreich und Spanien sind gehäuft Fledermaustollwutfälle nachgewiesen worden.

34

Tabelle 2-2: Erstnachweis von Fledermaustollwut in den verschiedenen europäischen Ländern, modifiziert nach KING et al., 2004

Jahr Land Spezies Bemerkung

1954 Deutschland (BRD) ?

1956 Jugoslawien Nyctalus noctula

1957 Türkei Rhinolophus ferrumequinum

1964 Ukraine Eptesicus serotinus

1969 Griechenland ?

1972 Polen Eptesicus serotinus

1984 Niederlande ? Pers. Mitt. B.KOOI

1985 UdSSR Human

1985 Finnland (Schweiz) Human EBLV-2

1985 Dänemark Eptesicus serotinus

1987 Spanien ?

1989 Frankreich Eptesicus serotinus

1989 Tschechoslovakei ?

1992 Schweiz Myotis daubentoni EBLV-2

1996 Vereinigtes Königreich Myotis daubentoni EBLV-2

1998 Slovakei ?

1999 Ungarn Eptesicus serotinus

Da die Zahl von Fledermäusen, die auf Tollwut untersucht wurden, zwischen den einzelnen

Ländern Europas stark schwankt, ist davon auszugehen, dass die Fledermaustollwut in ganz

Europa verbreitet ist. Wie BOURHY (1992) anhand von Restriktionsanalysen und

Sequenzvergleichen des N-Gens zeigte, konnten die beiden anfänglich als Biotypen

35

vermuteten Virusvarianten EBLV-1 und EBLV-2 genetisch deutlich voneinander

unterschieden und als weitere Genotypen identifiziert werden. Diese Ergebnisse wurden von

nachfolgenden Untersuchungen bestätigt (AMENGUAL et al., 1997).

Abbildung 2-4: Darstellung der Fledermaustollwutfälle in Europa zwischen 1977 und 2006 anhand der berichteten Fälle (Quelle: WHO Collaborating Centre for Rabies Surveillance and Research, FLI, Wusterhausen)

Die überwältigende Mehrheit der diagnostizierten Fledermaustollwutfälle in Europa waren

auf EBLV-1 zurückzuführen, lediglich 14 sind bislang als EBLV-2 charakterisiert worden.

Während die Breitflügelfledermaus (Eptesicus serotinus) das Reservoir für EBLV-1 zu sein

scheint (BOURHY et al., 1992), ist EBLV-2 bisher nur aus Fledermäusen des Genus Myotis

(Myotis daubentonii und Myotis dasycneme) in den Niederlanden, der Schweiz und dem

Vereinigten Königreich isoliert worden (VOS et al., 2007a; HARRIS et al., 2007; FOOKS et

al., 2003c). Weitere Hinweise auf die Zirkulation von EBLV-1 in europäischen

Fledermauspopulationen lieferten Untersuchungen aus Spanien (AMENGUAL et al., 2007;

36

SERRA-COBO et al., 2002; PEREZ-JORDA et al., 1995; VÁZQUEZ-MORÓN et al., 2008)

und dem Vereinigten Königreich (HARRIS et al., 2006). Interessanterweise konnte 1999 bei

einem Nilflughund (Rousettus aegyptiacus) aus dem Rotterdamer Zoo, der nach Dänemark

verbracht wurde, nach dem Verenden des Tieres EBLV-1a isoliert werden. Die Umstände,

unter denen es zu der Infektion mit dieser Virusvariante kam, konnten nicht geklärt werden

(VAN DER POEL et al., 2000).

In Deutschland gab es zwischen 1954 und 1985 nur vereinzelte Nachweise von

Fledermaustollwut (Tabelle 2-3). Zumeist handelte es sich um verhaltensauffällige

Fledermäuse mit Bisskontakt zu Menschen, welche nachfolgend positiv getestet wurden

(SCHNEIDER, 1982; HENTSCHKE und HELLMANN, 1975; WERSCHING und

SCHNEIDER, 1969; PITZSCHKE, 1965). Zu dieser Zeit konnten die verursachenden

Virusvarianten noch nicht von dem klassischen RABV unterschieden werden. Um daher die

Bedeutung der Fledermaustollwut für die Tollwutsituation in Deutschland abschätzen zu

können, wurden Mitte der 1950er Jahre von DENNIG (1958) umfangreichere

Untersuchungen durchgeführt, bei denen Seren von 295 Fledermäusen verschiedener Spezies

auf das Vorkommen neutralisierender Antikörper und 92 Fledermausgehirnsuspensionen im

Mausinokulationstest auf Tollwut getestet wurden. Weder Virus noch Antikörper konnten mit

Sicherheit nachgewiesen werden. Auch PITZSCHKE (1965) untersuchte 35 Fledermäuse mit

negativem Ergebnis. Eine positiv getestete Breitflügelfledermaus wurde von ihm als

Zufallsbefund betrachtet. Um nähere Informationen zur Fledermaustollwut zu erlangen,

wurden Infektionsversuche initiiert. Damit sollte die Empfänglichkeit einheimischer

Fledermäuse gegenüber Infektionen mit dem klassischen RABV untersucht werden

(SCHINDLER und DENNIG, 1958). Eine erste Charakterisierung von einem

Fledermaustollwutvirusisolat lieferten WERSCHING und SCHNEIDER (1969), die

Infektionsversuche mit einem aus einer Breitflügelfledermaus isolierten Virus durchführten,

und Unterschiede in der Pathogenität zu dem klassischen Tollwutvirus nachweisen konnten.

Sie gingen allerdings noch von der Fledermaus als Endglied der Infektionskette aus.

37

Tabelle 2-3: Auflistung der berichteten Fledermaustollwutfälle in Deutschland (BRD u. DDR) von 1954 bis 1985

Jahr Ort Spezies Referenz

1954 Hamburg ? MOHR (1957)

1963 Jena E. Serotinus PITZSCHKE (1964)

1968 Hamburg ? WERSCHING und SCHNEIDER (1969)

1970 Stade ? SCHNEIDER (1982)

1973 Berlin Myotis myotis HENTSCHKE und HELLMANN (1974)

Erst nach dem Auftreten von Fledermaustollwut 1985 im benachbarten Dänemark und einer

von der WHO und dem grünen Kreuz initiierten Tagung in Marburg zum Thema

Fledermaustollwut wurden vermehrt Fledermäuse zur Untersuchung an die zuständigen

Veterinäruntersuchungsämter eingesandt. Während 1985 Fledermaustollwut bei 3

Breitflügelfledermäusen in Norddeutschland festgestellt wurde, erhöhte sich diese Zahl auf 17

im Folgejahr. Niedersachsen initiierte als erstes Bundesland bereits 1986 eine systematische

Untersuchung zur Fledermaustollwut unter Leitung des Tierseuchenbekämpfungsdienstes und

der Fachbehörde für Naturschutz. Von 376 untersuchten Tieren aus den Fundjahren zwischen

1979 und 1989 waren 19 im Immunfluoreszenztest positiv (POTT-DÖRFER, 1991;

SEIDLER et al., 1987).

Von 1954 bis 2007 wurden in Deutschland innerhalb der Tollwutroutineuntersuchungen mehr

als 900 Fledermäuse untersucht. Die Mehrzahl der Einsendungen stammte aus den

Bundesländern Niedersachsen, Sachsen, Schleswig-Holstein, Brandenburg, Mecklenburg-

Vorpommern und Berlin. In den übrigen Bundesländern wurden im gleichen Zeitraum jeweils

weniger als 50, in einigen Bundesländern sogar weniger als 20 Fledermäuse untersucht

(MÜLLER et al., 2007).

Das Vorkommen von Fledermaustollwut in Deutschland ist hauptsächlich auf den Norden des

Landes beschränkt (Abbildung 3-1). Die meisten Fälle wurden in Niedersachsen, Schleswig-

Holstein und Berlin festgestellt. Im Nordwesten, insbesondere in Niedersachsen, ist ein

signifikant höheres Vorkommen von Feldermaustollwutfällen gegenüber anderen Regionen

38

Deutschlands zu verzeichnen, welche auf ein Endemiegebiet für Fledermaustollwut des Typs

EBLV-1 hinweisen. Vermutlich gibt es dort Bedingungen, welche die Persistenz von EBLV-1

in der Fledermauspopulation begünstigen, wie beispielsweise eine erhöhte Populationsdichte

der Reservoirspezies, der Breitflügelfledermaus (MÜLLER et al., 2007). Zwar kommt diese

Spezies in ganz Deutschland vor, der Verbreitungsschwerpunkt liegt aber im Norddeutschen

Tiefland (PETERSEN et al., 2004).

Mit mehr als 90 % aller Fledermaustollwutfälle, bei denen die Fledermausspezies bestimmt

wurde, ist die Breitflügelfledermaus die am häufigsten betroffene Art in Deutschland. Weitere

Nachweise von EBLV mittels direktem IFT erfolgten in Deutschland bei Myotis myotis,

Myotis daubentoni, Pipistrellus pipistrellus, Nyctalus noctula, Pipistrellus nathusii und

Plecotus auritus. Mittels der sensitiveren molekularbiologischen Nachweismethoden konnte

EBLV-Genom bei Myotis nattereri, Miniopterus schreibersii, Rhinolophus ferrumequinum

und Barbastella barbastellus nachgewiesen werden (MÜLLER et al., 2007).

2.7.5 Charakterisierung und molekulare Epidemiologie von EBLV

Fledermaustollwutviren aus Europa wurden ursprünglich als „Duvenhage–like“ eingestuft und

dem Serotyp 4 (Duvenhage, DUVV) zugeordnet, da sie bei der Antigentypisierung ein

ähnliches Reaktionsmuster zeigten (SCHNEIDER, 1982). Im Zuge weiterer diagnostischer

Untersuchungen wurden Hinweise auf Unterschiede zwischen Fledermaustollwutisolaten aus

Eptesicus serotinus und denen aus Myotis ssp. gefunden (KING et al., 2004). Spätere Studien

konnten dann mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern zeigen, dass sich die in Europa von

Fledermäusen isolierten Lyssaviren und ein nicht-klassifizierter humaner Tollwut-Fall aus

Finnland in zwei separate Antigenprofile einteilen ließen (MONTAÑO-HIROSE et al., 1990;

KING et al., 1990).

Die erste umfassendere molekulare Charakterisierung von EBLV beinhaltete die Typisierung

von neun EBLV-1 und zwei EBLV-2-Isolaten mittels RFLP, sowie deren Typisierung mit

mAk und Sequenzvergleichen des N-Gens (BOURHY et al., 1992). In dieser Studie konnten

frühere Ergebnisse, wonach Fledermaustollwutvirusisolate aus Deutschland, Polen und

Dänemark aufgrund unterschiedlicher Reaktionsmuster mit Anti-G-mAk in separate Gruppen

eingeteilt werden konnte (RUPPRECHT et al., 1991), nicht bestätigt werden. Sowohl mit

39

serologischen als auch mit RFLP- und Sequenzuntersuchungen konnten EBLV-1 und 2 als

eigene Genotypen charakterisiert werden (BOURHY et al., 1992).

AMENGUAL (1997) untersuchte 47 EBLV-Isolate mithilfe partieller Sequenzierung eines N-

terminalen 400 bp-Fragmentes des N-Gens, deren Ergebnisse zur Unterteilung der EBLV in

die Subtypen EBLV-1a und 1b, sowie EBLV-2a und 2b führte. Letztere Unterteilung wurde

durch umfangreichere Studien nicht bestätigt (DAVIS et al., 2005). Für EBLV-1a wurde eine

West-Ost-Verbreitung und für EBLV-1b eine Nord-Süd-Verbreitung in Europa postuliert.

Aufgrund der begrenzten Verbreitung wurde spekuliert, dass sich insbesondere EBLV-1b in

jüngerer Zeit aus Nordafrika kommend nach Europa ausgebreitet hat (AMENGUAL et al.,

1997).

Der Subtyp EBLV-1a wurde in der Ukraine, Polen, Tschechien, der Slowakei, Deutschland,

Dänemark und den Niederlanden (DAVIS et al., 2005). Während aus Spanien bisher nur

Nachweise von EBLV-1b vorliegen, wurden in Frankreich, den Niederlanden, Deutschland

und Polen beide Subtypen identifiziert (MÜLLER et al., 2007; SMRECZAK et al., 2007;

VAN DER POEL et al., 2005; PICARD-MEYER et al., 2004a, DAVIS et al., 2005).

Die Sequenzierung des kompletten Virusgenoms von EBLV-1 und 2 zeigte, dass EBLV-

Isolate im Vergleich zu RABV eine höhere Identität in den Aminosäure- und

Nukleotidsequenzen aufweisen. Im N-Gen liegt diese innerhalb des Genotyps EBLV-1

zwischen 97,8 und 100 % und bei EBLV-2 zwischen 97,3 und 98,8 % (MARSTON et al.,

2007). Vergleichende Sequenzanalysen von EBLV-Isolaten des N-Gens, G-Gens und der

nicht-kodierenden Regionen zeigten für EBLV-1 eine der geringsten Mutationsraten für

RNA-Viren (DAVIS et al., 2005). Beim Genotyp EBLV-1 unterscheiden sich die Subtypen a

und b dahingehend, dass EBLV-1b eine größere genetische Diversität aufweist als EBLV-1a.

DAVIS (2005) nutzte bei phylogeographischen Untersuchung der Fledermaustollwut in

Europa die Sequenzdaten des N-Gens, G-Gens und der genflankierenden Regionen. Die

phylogenetische Gruppierung der EBLV-Isolate war dabei konsistent, unabhängig davon,

welcher Genbereich für die Analyse verwendet wurde.

40

Tabelle 2-4: Genetische Charakterisierung von Fledermaustollwutvirusisolaten aus Europa. Mit * gekennzeichnete EBLV-1 Isolate stammen aus Deutschland

Autor Anzahl der Isolate

Gen FragmentgrößeEBLV-1 EBLV-2

BOURHY et al., 1992 9 4* 2 N 1531

AMENGUAL et al., 1997 40 13* 7 N 400

FOOKS et al., 2003 14 3* 8 N 400

JOHNSON et al., 2003 3 12 N 400

PICARD-MEYER et al., 2004 14 - - N 400

DAVIS et al., 2005 58 12* 6 N,G 1353

VAN DER POEL et al., 2005 45 - - N 396

MÜLLER et al., 2007 47 47* N, NP 331

MARSTON et al., 2007 1 1* 1 alle 11966

Aufgrund der hohen Identität von EBLV-1a-Sequenzen aus verschiedenen Regionen Europas

wurde über eine Virusübertragung über weite Distanzen für diese Variante spekuliert.

Dagegen lässt die Struktur des phylogenetischen Baumes von EBLV-1b eher auf eine

geringere Kontaktrate zwischen Fledermäusen schließen. Für beide Subtypen wurde eine

positive Korrelation zwischen geographischer und genetischer Distanz nachgewiesen (DAVIS

et al., 2005). Bei der phylogenetischen Analyse von EBLV-Sequenzen aus den Niederlanden

anhand eines 396 bp großen Fragments des N-Gens konnten verschiedene Cluster identifiziert

werden. Zwei dieser Cluster enthielten nur Isolate aus jeweils definierten geographischen

Regionen (VAN DER POEL et al., 2005).

EBLV-Isolate aus Deutschland, die von AMENGUAL (1997) und DAVIS (2005) untersucht

wurden, sind sämtlich als EBLV-1a charakterisiert worden. Die erste umfangreiche Studie zur

Epidemiologie der Fledermaustollwut in Deutschland beinhaltete auch phylogenetische

Analysen, wobei Gensequenzen einer Länge von 331 bp aus dem N-Gen und dem NP-Bereich

41

untersucht wurden (MÜLLER et al., 2007). Die große Mehrzahl der 47 sequenzierten Isolate

wurden als EBLV-1a identifiziert. Darüber hinaus konnte zum ersten Mal der Nachweis des

Subtyp EBLV-1b bei einem Isolat aus dem Saarland erbracht werden.

Die phylogenetische Analyse der partiellen N-Gen-Sequenzen mit dem Genotyp RABV als

Outgroup bestätigte frühere Aussagen, wonach innerhalb der beiden Subtypen 1a und 1b eine

geringe Variabilität zu erkennen ist (DAVIS et al., 2005), was sich in wenigen

Verzweigungen mit niedrigen Bootstrap-Werten manifestierte. Viele der Virusisolate hatten

in dem untersuchten Genabschnitt eine identische Sequenz (MÜLLER et al., 2007). Dennoch

konnten innerhalb von EBLV-1a zwei vermeintliche Cluster identifiziert werden. Während

Isolate des einen Clusters ausnahmslos aus Niedersachsen stammen, kommen Isolate des

zweiten Clusters nur in den Bundesländern Sachsen-Ahnhalt, Thüringen und Sachsen vor.

Allerdings konnte daraus der Einfluss der geographischen Herkunft auf die Phylogenie nicht

abgeleitet werden (MÜLLER et al., 2007). Neuere Sequenzanalysen im NP-Bereich von

weiteren Fledermaustolltwuvirusisolaten aus Deutschland bestätigten die Existenz von

EBLV-1b im Südwesten Deutschlands und konnten einen epidemiologische Zusammenhang

mit dem EBLV-1b-Vorkommen im benachbarten Frankreich nachweisen (JOHNSON et al.,

2007).

42

3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN

3.1 Material und Methoden

3.1.1 Material

3.1.1.1 Zellen

Zellen der Zelllinie Na 42/13 (murine Mausneuroblastomzellen, Katalognummer: 229,

Zellbank, Friedrich-Loeffler-Institut, Riems) wurden für die Anzucht und Isolierung von

EBLV eingesetzt.

3.1.1.2 Virusisolate

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Isolate von EBLV aus dem Tollwutvirusarchiv des

Nationalen Referenzlabors (NRL) für Tollwut am Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für

Epidemiologie, verwendet. Die EBLV stammten von im Immunfluoreszenztest (IFT) positiv

getestetem Probenmaterial tollwutverdächtiger Fledermäuse, die in den letzten 50 Jahren

(1954 bis 2007) in Deutschland im Rahmen der Tollwutroutinediagnostik an die zuständigen

Veterinäruntersuchungsämter der Länder eingesandt wurden. Auf Anfrage wurden das

positive Gehirnmaterial zur Bestätigung der Diagnose, zur Virusisolierung sowie zur weiteren

Identifizierung und Charakterisierung an das NRL übergeben und archiviert. Jedes Isolat ist

durch eine Labornummer eindeutig identifiziert. Darüber hinaus fanden weitere Isolate aus

retrospektiven Untersuchungen zur Fledermaustollwut der Jahre 1996-2007

Berücksichtigung, an denen sich 12 von 16 Bundesländern beteiligten (MÜLLER, 2007).

43

3.1.1.3 Sonstige Materialien

Puffer

0,5 M EDTA (pH 8,0) EDTA- Natriumsalz 186,2 g

bidest. Wasser ad 1000,0 ml

TE-Puffer 10 mM Tris pH 8,0

1mM EDTA

50x TAE-Puffer Tris 242,0 g

Essigsäure 1M 57,1 ml

0,5 M EDTA (pH 8,0) 100,0 ml

bidest. Wasser ad 1000,0 ml

5x TBE-Puffer Tris 54,0 g

Borsäure 27,5 g

0,5 M EDTA (pH 8,0) 20,0 ml

bidest. Wasser ad 1000,0 ml

APS-Lösung 10% (w/v) APS in bidest. Wasser

Orange G (Probenladepuffer) Orange G 0,125 g

Ficoll 400 15,0 g

5x TAE ad 100 ml

44

3.1.2 Methoden

3.1.2.1 Virusisolierung in der Zellkultur

Aufgrund der begrenzten Menge von Gehirnmaterial von Fledermäusen war in den meisten

Fällen eine Virusanzucht in der Zellkultur erforderlich. Für die Virusisolierung und -anzucht

diente der Rapid Tissue Culture Infection Test (RTCIT) unter Mitführung von Positiv- und

Negativkontrollen (WEBSTER und CASEY, 1996). Aus dem Gehirn IFT-positiver

Fledermäuse wurde eine 20%ige Suspension unter Verwendung von Minimum Essential

Medium (MEM) hergestellt, bei 4 °C für 30 min inkubiert, anschließend bei 600 x g für

10 min zentrifugiert und der Überstand separiert. Murine Neuroblastomazellen (Na42/13)

wurden in einer Konzentration von 2x106 Zellen/ml in Dextran-Gebrauchslösung

aufgenommen. Jeweils 0,5 ml Zellsuspension wurden mit 0,5 ml des Überstandes der

20%igen Gehirnsuspension gemischt und bei 37 °C und 3-5 % CO2 für 30 min im Brutschrank

inkubiert und dabei 2-3 Mal durchmischt. Nach Zentrifugation bei 600 x g für 10 min wurde

das Zellpellet in 10 ml Dulbeccos’s Minimum Essential Medium (DMEM, Biochrom, Berlin)

resuspendiert und anschließend 8ml in eine Gewebekulturflasche (T25) und 2 ml in 6- bzw.

24-Loch-Platten oder Petrischalen (35/10mm) ausgesät. Nach Inkubation der Virus-

Zellsuspension bei 37 °C und 3-5 % CO2-Gehalt für weitere 3-4 Tage erfolgte die Kontrolle

des Viruswachstums in den zeitgleich infizierten Petrischalen. Nach Absaugen des

Zellkulturmediums und 1x Spülung mit TW-Puffer wurden die Zellen mit 80%igem Aceton

für 30 min bei 4 oC fixiert und anschließend luftgetrocknet. Die Anfärbung von infizierten

Zellen erfolgte mit einem kommerziell erhältlichen, polyklonalen FITC-markiertem Anti-

Tollwut-Konjugat (SIFIN, Berlin) für 30 Minuten bei 37 °C in einer feuchten Kammer.

Abschließend wurden die Petrischalen zweimal mit TW-Puffer und Aqua Bidest gespült.

Die Auswertung erfolgte unter einem inversen Fluoreszensmikroskop bei ca. 300-facher

Vergrößerung unter Betrachtung des gesamten markierten Bereiches. Der Nachweis

tollwutspezifischer Fluoreszenzen in den Zellen galt als Indiz für eine erfolgreiche

Virusanzucht. Je nach EBLV-Isolat mussten die infizierten Zellkulturen solange passagiert

werden, bis mindestens 60 % der Zellen infiziert waren. Dazu wurde das Zellkulturmedium

verworfen, der Zellrasen mit 2 ml Trypsin überschichtet, für 1 min inkubiert und nachfolgend

45

wurde das Trypsin wieder abgeaugt. Die Zellen, die sich gelöst hatten, wurden in

Wachstumsmedium aufgenommen und in einem Verhältnis von 1:2 bis 1:3 erneut in

Gewebekulturflaschen bzw. Petrischalen ausgesät. Anschliessend wurde der

Zellkulturüberstand abgenommen, portioniert und bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung

gelagert.

3.1.2.2 Auswahl der Virusisolate

Zunächst wurde anhand der nationalen Tollwutdatenbank (MÜLLER et al., 1994) sowie des

Tierseuchennachrichtensystems (TSN) ein Abgleich der bestätigten Fledermaustollwutfälle in

Deutschland im Zeitraum 1954 – 2007 mit den im Virusarchiv vorhandenen EBLV-Isolaten

vorgenommen. Nach Auswertung der Daten wurden die für das Veterinärwesen zuständigen

Untersuchungsämter der Länder gebeten, weitere bzw. fehlende EBLV-Isolate aus den

Bundesländern zur Verfügung zu stellen, um eine möglichst flächendeckende geographische

Analyse zu ermöglichen. Für alle verfügbaren EBLV-Isolate wurden Angaben zur

geographischen Herkunft (Fundort), zum Funddatum oder dem Jahr der Isolierung und der

Spezies aus den Laborbüchern erhoben und gegebenenfalls mit den in den Datenbanken

vorhandenen Angaben abgeglichen.

Der Fundort der Tollwutfälle war für den Zeitraum 1954 – 1994 als Gemeinde (territorialer

Grundschlüssel) und für den Zeitraum 1994 – 2007 über die Funktionen innerhalb der

Tierseuchenmeldung für das TSN als genaue georeferenzierte Angabe oder Gemeinde

verfügbar. Mit Hilfe der GIS Software Kartenexplorer (FLI, Wusterhausen, Deutschland), die

am Institut für Epidemiologie des Friedrich-Loeffler-Institutes entwickelt wurde, erfolgte

zunächst eine kartographische Darstellung der Tollwutfälle und aller vorhandenen EBLV-

Isolate aus dem NRL Archiv. Für Fledermaustollwutfälle und EBLV-Isolate, für die nur die

Gemeinde als Fundort bekannt war, wurde jeweils ein beliebiger Punkt innerhalb der

Gemeinde für die kartographische Darstellung und weitere geographische Analysen

festgelegt.

Die Auswahl von EBLV-Isolaten für die anschließende Sequenz- und phylogentische Analyse

erfolgte unter folgenden Prämissen: die Stichprobe repräsentiert - a) die geographische

Herkunft aller verfügbaren EBLV-Isolate sowie - b) die räumliche und zeitliche

46

Tollwutsituation bei Fledermäusen im Zeitraum 1954-2007 in Deutschland. Dazu wurde mit

Hilfe des Kartenexplorers ein 30 km x 30 km großes Raster über die Fläche Deutschlands

gelegt und die Anzahl von Rasterzellen ermittelt, denen EBLV-Isolate zugeordnet werden

konnten. Aus jeder so ermittelten Rasterzelle wurde mindestens ein EBLV-Isolat ausgewählt.

In Rasterzellen, die mehr als ein EBLV-Isolat enthielten, fand eine Auswahl nach dem

Zufallsprinzip (random sampling) statt. Danach erfolgte eine weitere selektive Auswahl, um

die zeitliche Komponente (Zeitraum 1954 - 2007) zu berücksichtigen.

3.1.2.3 Isolation von Virus RNA

Zur Extraktion von Virus-RNA wurde der kommerziell erhältliche RNA-Extraktionskit

RNeasy© (Qiagen, Hilden, Deutschland) entsprechend den Instruktionen des Herstellers

verwendet. Silikat-Gel-Membranen in Säulen bilden dabei eine RNA-bindende Matrix. Je

nach Verfügbarkeit wurden entweder 200 µl Zellkulturüberstand oder 30 mg

Gehirnsuspension mit 350 µl Lösungspuffer RLT versetzt und gemischt. Nach Fällung der

RNA durch Zugabe von 1 Volumen 70%igen Ethanols wurde das Reaktionsgemisch auf eine

Säule aufgetragen und für 15 s bei 6608 x g zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Die

Säule wurde mit 700 µl Puffer RW1 überschichtet und erneut für 15 s bei 6608 x g

zentrifugiert. Anschließend erfolgten zwei Waschschritte mit je 500 µl Ethanolwaschpuffer

RPE, wobei nach der ersten Zentrifugation (15 s) und dem Verwerfen des Eluates im zweiten

Waschschritt die Säule für 2 min zentrifugiert wurde. Die Säule wurde nachfolgend in einem

neuen sterilen und wieder verschließbaren 1,5 ml Auffangbehältnis platziert. Nach Zugabe

von 30 µl RNase freiem H2O auf jede Säule erfolgte ein letzter Zentrifugationsschritt bei

6608 x g für 1 min. Die im Eluat gewonnene RNA wurde bei -80 °C gelagert oder bei

sofortiger Weiterverwendung in einen Kühlblock gestellt.

3.1.2.4 Diagnostische RT-PCR

Zur Bestätigung von IFT-positiven Proben sowie zur Differenzierung zwischen EBLV-1 und

EBLV-2 wurde eine diskriminatorische RT-PCR eingesetzt, die ein Fragment des

47

Nucleoprotein-Phosphoproteingens amplifiziert (VOS et al., 2004a). Dieses Fragment ist bei

der EBLV-1 und EBLV-2 spezifischen RT-PCR 370 nt bzw. 270 nt groß. Die Primer und

deren Positionen im Virusgenom sind in Tabelle 3-1 angegeben.

Tabelle 3-1: Darstellung der Primer für die diagnostische RT-PCR für EBLV-1 und EBLV-2 (mod. nach VOS et al., 2004)

Name Sequenz Länge Position bei

EF157976 Fragmentgröße

EBLV-1-fwd 5’-AAG AGC TAC AGG ATT ACG AGG-3’ 21 nt 1161–1181 370 nt

EBLV-1-rev 5’-GAC AAA GAT CTT GCT CAT GA-3’ 20 nt 1534–1515

EBLV-2-fwd 5’-TCA TGG TCA ATG GGG GAA AG-3’ 20 nt 1226–1245 270 nt

EBLV-2-rev 5’-TTG GGA TGG AGC AGG AAG AG-3’ 20 nt 1455–1436

3.1.2.4.1 RT-PCR

Für die RT-PCR kam ein kommerziell erhältliches Kit zum Einsatz (SuperScript™.III

Platinum®One-Step Quantitative RT-PCR System, Invitrogen, Carlsbad, USA), bei dem

beide Reaktionsschritte hintereinander in einem Ansatz ablaufen. Die Negativstrang-EBLV-

RNA wurde zunächst in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben: Random Primer

(Hexamere) banden bei ca. 45°C – 60 °C an die RNA und davon ausgehend wurde durch das

Enzym M-MLV (Murine Moloney Leukaemia Virus) Reverse Transkriptase die RNA in

cDNA umgeschrieben (KOTEWICZ et al., 1985). Bei der anschliessenden PCR fungieren die

beiden, den zu amplifizierenden Genabschnitt einschließenden Primer als Startsequenz für die

Taq-Polymerase. Die Amplifikation des Genbereichs erfolgt durch die zyklisch ablaufenden

Prozesse Denaturierung, Anlagerung und Kettenverlängerung (MULLIS et al., 1986).

Temperaturen von ca. 90 - 95°C führen bei der Denaturierung zur Trennung der beiden DNA-

Stränge. Durch eine Reduktion der Temperatur auf 45°C – 55 °C können sich die spezifischen

Oligonukleotide and den Matrizenstrang anlagern. Dieser Schritt wird als Annealing

bezeichnet. Anschließend wird, ausgehend von den Primern, der Strang durch die DNA-

abhängige DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxyribonukleotide (dNTP) bei 72 °C

verlängert (Elongation). Diese als Zyklus bezeichnete Reaktionsabfolge wird 25 bis 40 Mal

wiederholt.

48

Tabelle 3-2: Mastermix Reaktionsansatz je Probe für die RT-PCR

Reaktionssubstrate Volumen

Rnase freies Bidest 16µl

2x Reaction Mix 25µl

Vorwärts Primer (10 µM) 1µl

Rückwärts Primer (10µM) 1µl

SuperScript III RT/ Platinum Taq Mix 2µl

EBLV RNA 5µl

Gesamtvolumen 50 µl

Zunächst wurde in einem speziellen, nur dafür vorgesehenen Raum ein Master-Mix für die

RT-PCR hergestellt. Neben dem RT-PCR Kit wurden die entsprechenden Primer und RNAse

freies Aqua bidest. hinzugegeben, um je Gefäß 45 µl Reaktionsgemisch bereitzustellen. Die

EBLV-RNA wurde in einem anderen Raum unter Verwendung einer Sicherheitskabine dem

Reaktionsgemisch hinzugefügt. Die einzelnen Reaktionsgefäße wurden sofort danach in einen

Thermocycler (Bio-Rad, München) gegeben.

Die RT-PCR zur Detektion von EBLV-Genmaterial besitzt folgende Spezifikation: Der RT-

Schritt erfolgte bei 50 °C und einer Inkubationszeit von 30 min, gefolgt von einer initialen

Denaturierung der cDNA bei 95 °C für 15 min. Die Amplifikation umfasste 35 Zyklen von

94°C für 30 s, 54 °C für 30 s und 72 °C für 60 s. Für die abschließende Elongation wurde das

Reaktionsgemisch bei 72°C für 5 min inkubiert. Sämtliche Reaktionsmaterialen wurden in

Kühlblöcken gelagert, um vorzeitige unspezifische Reaktionen zu verhindern. Um

Kontaminationen zu vermeiden, wurden Vorsichtsmassnahmen eingehalten (KWOK und

HIGUCHI, 1989). Bei allen Reaktionsansätzen wurden positive und negative Kontrollen

mitgeführt.

3.1.2.4.2 Agarose-Gelelektrophorese

Bei der Amplifikation von Virus-RNA im Verlauf einer PCR entsteht eine große Anzahl von

DNA-Fragmenten gleicher und spezifischer Größe, die durch die Position der Primer

49

bestimmt wird. Der Nachweis dieser Fragmente wurde durch Gelelektrophorese erbracht.

Dazu wurde zunächst 1g Agarose (Gibco BRL Life Technologies, Paisley, Vereinigtes

Königreich) in 100 ml 1xTBE-Puffer aufgekocht, mit 1 μl Etidiumbromid pro 10 ml gemischt

und in eine Gelkammer gegossen. Diese wurde nach dem Erstarren in eine mit 0,5xTBE-

Puffer gefüllte Elektrophoresekammer überführt. Anschließend wurden 5 µl PCR-Produkt mit

1 µl Auftragepuffer (6x Bromphenolblau) gemischt und in die Kammern des Gels übertragen.

Zusätzlich wurden je nach erwarteter Fragmentgröße ein DNA Größenmarker (100 bp-Marker

oder 1 kb-Marker) mitgeführt. Die elektrophoretische Auftrennung der Fragmente erfolgte bei

einer Spannung von 120 mV für 1h. Als Indikator diente das Migrationsverhalten des

Probenauftragepuffers. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden mittels eines UV-

Transilluminators sichtbar gemacht, wobei sich das im Gel befindliche Ethidiumbromid als

interkalierender Farbstoff in die DNA einlagerte, durch UV Licht (518 nm) angeregt wurde

und Licht der Wellenlänge 650 nm emitierte. Alle PCR-Ergebnisse wurden mithilfe eines

digitalen Bildbearbeitungssystems gespeichert.

50

3.1.2.5 Sequenzierung von EBLV-1

3.1.2.5.1 Design von Primern für die long-PCR

Basierend auf den vorhandenen Sequenzen eines EBLV-1-Isolates aus Hamburg aus dem Jahr

1968 (Genbank: EF 157976, MARSTON et al., 2007) wurden Oligonukleotide (Primer) für

die anschliessend zu sequenzierenden Genabschnitte ausgewählt. Unter Verwendung des

Programms PrimerSelect© aus dem Lasergene-Software-Paket (Lasergene 7.0, DNASTAR

Inc., Madison, USA) wurden Primer für den Bereich Nucleoprotein-Phosphoprotein und den

Glykoprotein-Polymerase-Gen (GL-nicht translatierter Bereich) generiert. Die Synthese der

Primer erfolgte durch die Firma MWG Biotech, Ebersbach. Das Primerpaar NP-fwd und NP-

rev umspannte einen Genabschnitt von 1600 nt, während die Primer GL-fwd und GL-rev ein

775 nt-großes Fragment einschließen (Tabelle 3-3).

Tabelle 3-3: Verwendete Primer für die long-PCR

Name PCR-Primer Sequenz Länge Tm Position* Fragmentgröße

NP-fwd 5'-GTAACACCCCTACAATGG-3' 18 nt 53.7°C 57-74 1574

NP-rev 5'-GGTGGGCTTGACTATCCT-3' 18 nt 56.0°C 1631-1614

GL-fwd 5'-CATGTTGCAAAAGGTTC-3' 17 nt 47.9°C 4749-4765 775

GL-rev 5'-AATTGCTTCTCAGGTCT-3' 17 nt 47.9°C 5524-5508

*bezogen auf Referenzisolat EF157976

Die RT-PCR zur Amplifikation der long-Fragmente erfolgte im Wesentlichen wie in Kapitel

RT-PCR (3.1.2.4.1) beschrieben. Die veränderten Temperaturprofile sind in Tabelle 3-4

dargestellt.

Tabelle 3-4: RT-PCR Temperaturprofil für die NP-Fragmente und GL-Fragmente. Die veränderte Extensionszeit für den GL-Bereich ist durch * gekennzeichnet

Reaktionsschritt Temperatur Zeit Zyklen

Reverse Transkription 50°C 30 min 1x

Denaturierung 94°C 2 min 1x

PCR Denaturierung 94°C 15s

}40x Anlagerung 54°C 30s

Extension 68°C 1,5 (1*) min

End-Extension 68°C 5 min 1x

51

3.1.2.5.2 Sequenzierung der PCR-Produkte

Die Sequenzierung der Genabschnitte erfolgte nach der Kettenabbruchmethode (SANGER et

al., 1977) mit floureszenz-markierten IRD800-Primern. Entsprechende Sequenzierprimer

wurden mit dem Programm PrimerSelect© ausgewählt. Die Primer wurden so ausgewählt,

dass jeder Abschnitt des Genombereiches mindestens von je einer vorwärts und einer reversen

Sequenz überlesen wurde.

Tabelle 3-5: Verwendete IRD800 markierte Sequenzierprimer

Primer Sequenz Position*

vorwärts 5'-GTAACACCCCTACAATGG-3' 57-74

5'-CCATAATCAGCTGGTCTCGGT-3' 100-120

5'-GGGACCCTACGACACCTGAACA-3' 459-480

5'-GGGTTCATCAAGCAAATC-3' 800-817

5'-AGCAGAAAGCACTAAGGTTGATGT-3' 1183-1206

rückwärts 5'-GGTGGGCTTGACTATCCT-3' 1631-1614

5'-TTTAATCTCCCTCCGTTCATCATA-3' 1320-1297

5'-AGACACCAACCCCGAACA-3' 793-776

5'-TGAGCCTATAAAGACAGAGA-3' 521-502

*bezogen auf Referenzisolat EF157976

Die Menge der PCR-Fragmente wurde entsprechend der Dicke der Banden im

Elektrophorese-Gel geschätzt, um sie anschließend im Verhältnis 1:10 bis 1:100 mit Aqua

dest. zu verdünnen. Im Regelfall wurden bei einer Verdünnung von 1:50 gute Ergebnisse

erzielt. Von dieser Verdünnung wurden 15 µl des DNA-Aliquots mit 5 µl IRD800-

Sequenzierprimer (3 pmol/µl) (Tabelle 3-5) zu einem DNA/Primer-Premix gemischt.

Anschließend wurden je 4 µl dieses Gemisches jeweils zu 1 μl A-, C-, G- bzw.T-Reagenz

eines kommerziell erhältlichen Sequenzierkits (DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing

Kit, GE Healthcare, NY, USA) hinzugegeben, abzentrifugiert (1000 UpM, 15 s), mit Chill-out

Liquid Wax (MJ Research, Cambridge, USA) überschichtet und in einen vorgeheizten

Thermocycler verbracht. Die Konditionen für die Sequenzierreaktionen sind in Tabelle 3-6

beschrieben.

52

Tabelle 3-6: Temperaturprofil für die Sequenzierreaktionen

Reaktionsschritt Temperatur Dauer

Anzahl der

Zyklen

Denaturierung 95°C 5 min 1x

Denaturierung 95°C 15 s

}30 Anlagerung 50°C 30 s

Extension 68°C 1 min

End- Extension 68°C 5 min 1x

Nach der Sequenzierung erfolgte ein Abbruch der Reaktion durch Zugabe von 4 µl

Formamid-Puffer (im Kit enthalten) und anschließende Denaturierung (70 °C, 1 min). Die

elekrophoretische Auftrennung der Proben und die Ermittlung der Sequenz erfolgten in einem

automatischen Sequenziergerät „LI-COR DNA Sequencer ReadIR 4200“ (MWG-Biotech,

Ebersberg, Deutschland).

Zunächst wurde dazu eine Gelmatrix gegossen. Zwei Glasplatten wurden mit 70%igem

Ethanol gründlich gereinigt, mithilfe eines Abstandhalters (0,25 mm) mit Schraubschienen

zusammengesetzt und gleichmäßig zusammengedrückt. Anschließend wurden 25 ml Sequagel

XR© mit 6,25 ml Sequagel Puffer, 0,33 ml DMSO und 0,25 ml 10 % APS gemischt und das

Gel unter Verwendung einer 10 ml-Pipette luftblasenfrei gegossen. Der Einsatz eines

Vorformer-Kamms ermöglichte eine glatte Gelkante für den späteren Einsatz des

Zahnkamms. Nach der Polymerisation des Gels wurde es in die Gerätekammer des

Sequenzierautomaten gehängt, die Pufferbehälter mit 0,5xTBE-Puffer gefüllt und nach

vorheriger Reinigung des Haifischzahn-Kammes in das Gel eingebracht. In jede Kammer

wurden ca. 1,5 µl Probe gefüllt. Die elektrophoretische Auftrennung der Proben erfolgte unter

folgenden Konditionen: Spannung 1500 V, Stromstärke 37,5 A, Leistung 50,0 W, Temperatur

50 °C, Rahmen 25. Die Basenabfolge wurde mithilfe des zum Sequenziergerät LICOR

gehörenden Softwarepakets BaseImageIR™ Version 02.31 mit den Komponenten Data

Collection und Image Analysis ermittelt.

53

3.1.2.6 Speziesbestimmung von Fledermäusen

Ein Genabschnitt des Cytochrom B wurde nach dem von HARRIS (2008) beschriebenen

Verfahren amplifiziert und anschließend sequenziert.

3.1.2.6.1 DNA-Extraktion

Die Extraktion von genomischer DNA erfolgte unter Verwendung des kommerziellen DNA

Extraktionskits NucleoSpin Tissue™ (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland). Von der

Fledermaus wurden 35 μg Organprobe (Niere) entnommen. Diese wurde homogenisiert, mit

180 μl Lösungspuffer T1 und 25 μl Proteinase K überschichtet, durchmischt und über Nacht

bei 56 °C inkubiert. Anschließend wurden dem Lysat 200 μl Puffer B3 hinzugefügt, gevortext

und bei 70 °C für 10 min inkubiert. Nach Zugabe von 210 μl Ethanol (96-100%ig) und

nachfolgender Durchmischung (Vortex, wurde das Reaktionsgemisch auf eine Säule

aufgetragen, für 1 min bei 11.000 UpM zentrifugiert und der Durchfluss verworfen.

Anschließend erfolgten zwei Waschschritte der Membran mit zunächst 500 µl Waschpuffer

BE und anschliessend 500 µl B5. Die Säule wurde jeweils für 1 min bei 11.000 UpM

zentrifugiert und das Eluat wurde verworfen. Die Trocknung der Säule erfolgte durch

Zentrifugation für 1 min bei 11.000 UpM. Die Säule wurde nachfolgend in einem neuen

sterilen wiederverschließbaren 1,5 ml Auffangbehältnis platziert. Nach Zugabe von 100 μl

vorgewärmtem (70 °C) Elutionpuffer BE auf die Säule erfolgte ein letzter

Zentrifugationsschritt bei 10.000 UpM für 1 min. Die im Eluat gewonnene DNA wurde bei -

80 °C gelagert oder bei sofortiger Weiterverwendung in einen Kühlblock gestellt.

3.1.2.6.2 Cytochrom B-PCR

Die PCR zur Amplifikation eines 900 nt großen Fragments des Cytochrom B-Gens erfolgte

unter Verwendung eines kommerziellen PCR Kits (Platinum® Taq DNA Polymerase,

Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland). Ein PCR-Mastermix mit folgenden Bestandteilen je

Reaktion wurde vorbereitet: 5 µl PCR Puffer (10x), 1 µl dNTPs (10 mM), 1.5 μl MgCl2 (50

mM), 1 µl Vorwärts-Primer Mix (Barb F1/BWF/WF) (0.2 µM), 1 µl of Rückwärts-Primer

(Barb R2/BWR/WR) (0.2 µM), and 2 µl of TaqPolymerase (0.5 U/ml) (HARRIS et al., 2008).

54

Tabelle 3-7 : Zur Amplifikation verwendete Primer und ihre Position im CytB-Gen. Die Primer BWF und BWR amplifizieren cytB von M. brandtii und M. mystacinus, die Primer WF und WR nur M. mystacinus (nach HARRIS et al., 2008)

Name Sequenz Position

BarbF1 5’ - CCT CAA ATA TTT CAT CAT GAT G – 3’ 71-92

BarbR2 5’ - GTC CTC CAA TTC ATG TTA GG – 3’ 1022-1002

BWF 5’ - GAC CAA CAT TCG AAA ATC – 3’ 3-20

BWR 5’ - GTG ATG CTG CGT TGT TTG – 3’ 930-947

WF 5’ – CCT GCC CCA TCA AAT ATC TC – 3’ 64-83

WR 5’ – GGA ATT GAT CGT AGG ATT GCG – 3’ 834-854

Das Reaktionsgemisch wurde mit Aqua bidest auf 45 µl je Reaktion aufgefüllt, auf

Reaktionsgefäße verteilt und 5 µl Fledermaus-DNA beziehungsweise eine Negativkontrolle

(H2O) hinzugefügt. Die Bedingungen für den Thermocycler sind Tabelle 3-8 beschrieben. Die

Visualisierung der PCR-Fragmente erfolgte mittels Gel-Elektrophorese analog zu der in

Kapitel 3.1.2.4.2 beschriebenen Verfahrensweise.

Tabelle 3-8: Temperaturprofil für die cytB-PCR (nach HARRIS et al., 2008)

Reaktionsschritt Temperatur Dauer Anzahl der Zyklen

Denaturierung 95°C 15min 1x

Denaturierung 95°C 50 s

}37x Anlagerung 50°C 50 s

Extension 72°C 1 min

End- Extension 72°C 10 min 1x

3.1.2.6.3 Sequenzierung

Das durch die cytB-PCR gewonnene Amplifikat wurde anschließend nach der im Kapitel

3.1.2.5 geschilderten Vorgehensweise sequenziert. Hierzu wurden IRD800-markierte Primer

55

basierend auf BarbF1 und BarbR2 eingesetzt. Die Bedingungen der Sequenzier-PCR sind in

Tabelle 3-6 angegeben.

3.1.2.6.4 Vergleich mit Sequenzen aus GenBank

Die erhaltene Gensequenz wurde im FASTA-Format gespeichert und mit in der Genbank

veröffentlichten cytB-Gensequenzen anderer Fledermausspezies verglichen.

56

3.1.2.7 Analyse der Sequenzdaten der EBLV-1-Isolate

3.1.2.7.1 Aufbereitung der Rohdaten

Die Nukleotidsequenzen lagen nach dem ersten Kontrollschritt im Datenformat Sequence

Chromatogram File (SCF) vor. Hierbei handelt es sich um ein Speicherformat für

Sequenzdaten, das neben der eigentlichen Basenabfolge auch das Chromatogramm der

Fluoreszensmessung beinhaltet. Alle SCF Dateien eines Isolates wurden nach einem

Alignment im Programms SeqMan® verglichen. Nicht eindeutige Nukleotidpositionen wurden

im Chromatogramm und direkt am Sequenziergerät kontrolliert. Eine erneute

Sequenzierreaktion wurde durchgeführt, wenn keine eindeutige Abklärung der Fehler

erfolgen konnte. Die Konsensussequenz der zu einem Isolat gehörenden Einzelsequenzen

wurde als Datei im Lasergene-Format seqfile abgespeichert.

3.1.2.7.2 Alignment der Sequenzen

Die Trimmung der SEQ-Dateien erfolgte unter Verwendung des Programms. Basierend auf

bereits veröffentlichten Sequenzen wurden alle Sequenzen auf die entsprechende Länge der

Gensegmente gekürzt:

Nukleoprotein (kodierend): 1353 nt

Nukleoprotein-Phosphoprotein intergenetischer Bereich 90 nt

Glykoprotein L-Protein – intergenetischer Bereich 560 nt

Anschließend wurden die Einzelsequenzen der Isolate in Dateien im FASTA-Format

exportiert, um sie für weitere Anwendungen nutzbar zu machen. Das Alignment erfolgte mit

dem Programm MEGA Version 4.0 (TAMURA et al., 2007), in welchem ein Alignment-

Explorer implementiert ist. Das paarweise und multiple Alignment erfolgte unter Verwendung

von CLUSTAL W (THOMPSON et al., 1994).

57

3.1.2.7.3 Analyse der untersuchten Genabschnitte

Die 1353 nt langen Sequenzen für das N-Gen wurden vom Alignment-Explorer als MEGA-

Datei exportiert, um sie weiter im Data-Explorer des Programms MEGA© Version 4.0 zu

verwenden. Die Programmoberfläche bietet verschiedene Möglichkeiten und Verfahren, die

Sequenzdaten zu analysieren. Die Basenabfolgen für die NP- und GL-intergenetischen

Bereiche wurden analog erfasst.

Charakterisierung der Genabschnitte

Das Alignment der Sequenzen wurde im Data-Explorer auf das Vorkommen variabler

Nukleotidpositionen untersucht. Basierend auf ersten Ergebnissen wurden die Sequenzen in

Gruppen eingeteilt. Anschließend wurden die durchschnittliche Distanz aller Sequenzen

sowie die innerhalb einzelner Gruppen berechnet. Hierbei wurde die Distanz als p-Distanz

(Verhältnis der Anzahl von Nukleotidunterschieden zur Zahl der untersuchten Nukleotide) als

Maßstab gewählt (TAMURA et al., 2007).

Distanzberechnungen und Analyse der Aminosäuresequenz

Die Nukleotidsequenzen wurden durch das im Data-Explorer implementierte Programm zur

Berechnung der paarweisen Distanzen eingelesen und miteinander verglichen. Die Ausgabe

erfolgte in einer Abstandsmatrix, wobei als Kriterium die Anzahl der Nukleotidunterschiede

gewertet wurde. Die als Textdatei ausgegebene Matrix wurde in das

Tabellenkalkulationsprogramm Office-Excel (Microsoft©, Redmond, USA) exportiert. Die

Daten zu den einzelnen Isolaten, wie Jahr der Isolierung, geographischer Ursprung,

Labornummer, wurden mit den Daten aus den genetischen Analysen vervollständigt, um

weitere Berechnungen durchzuführen.

Die Nukleotidsequenzdaten wurden im Data-Explorer in Aminosäuresequenzen

umgeschrieben und auf das Auftreten von Aminosäureaustauschen untersucht.

58

Phylogenetische Analysen

Die phylogenetischen Analysen erfolgten unter Verwendung des im Programm MEGA©

Version 4.0 implementierten Neighbour-Joining-Verfahrens (SAITOU und NEI, 1987) mit

dem Substitutionsmodell für Nukleotide nach Jukes-Cantor (JUKES und CANTOR, 1969).

Zur Ermittlung von Konfidenzwerten wurde dieses mit einem Bootstrap-Verfahren gekoppelt,

wobei 1000 Wiederholungen durchgeführt wurden. Die Ausgabe der Informationen erfolgte

als phylogenetisches Baumdiagramm. Um Cluster zu identifizieren wurde der

phylogenetische Baum kondensiert, das heißt, nur Abzweigungen mit Bootstrap-Werten über

50 % wurden als repräsentativ gewertet. Alle Isolate eines Astes wurden einem Cluster

zugeordnet. Um Gruppen innerhalb des Data-Explorers zu bilden, wurde die Cluster-

Einteilung benutzt.

3.1.2.8 Kartographische Darstellung

Die kartographische Darstellung der Daten zur Fledermaustollwut, zur Auswahl der

sequenzierten Virusisolate sowie der entsprechend der phylogenetischen Analyse erhaltenen

Cluster von Virusisolaten erfolgte mit Hilfe des Kartenexplorers (Version.1.41).

3.1.2.9 Abstandsberechnungen zwischen den Fundorten

Für jedes EBLV-Isolat wurden mit Hilfe des Kartenexplorers des Tierseuchen

Nachrichtensystems (TSN) die Koordinaten für den geographischen Fundort im Gauss-

Krüger (PD) Format bestimmt. Anhand der ermittelten Rechtswerte und Hochwerte konnte

der Abstand zwischen zwei Fundorten A und B mittels folgender Formel berechnet werden:

²)()²Re(Re HochwertBHochwertAchstwertBchtswertAAB −+−=

59

Mithilfe dieser in das Tabellenkalkulationsprogramm Office-Excel© (Microsoft, Redmond,

USA) eingefügten Formel wurde eine Abstandsmatrix zwischen allen ausgewählten Isolaten

generiert.

3.1.3 Statistische Auswertung

3.1.3.1 Verhältnis von genetischer zu zeitlicher Distanz

Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die genetische Distanz zwischen den Isolaten im

Bezug zum Referenzisolat linear mit der zeitlichen Distanz zunimmt. Dabei wurde die

zeitliche Distanz als Abstand zwischen den Isolierungszeitpunkten in Jahren und die

genetische Distanz als Anzahl von Nukleotidunterschieden im N-Gen gemessen. DJ und DG

sind dabei Zufallsvariablen. Das lineare Regressionsmodell DGi,j=β0+β1DJ

i,j+εi,j wurde

aufgestellt (SOKAHL und ROHLF, 1994), um die HypotheseH0: β1≤0 gegen die

AlternativhypotheseH1: β1>0 mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von α = 0,05 zu testen.

Dabei sind DJ und DG die Distanz in Jahren bzw. die georaphische Distanz. Die Variable β0

ist der y-Achsenabschnitt; β1 stellt die Steigung der Regressiongeraden dar und εi,j ist der

Fehlerkoeffizient.

Zur Durchführung des Tests wurde das Statistikprogramm SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary,

USA) verwendet.

3.1.3.2 Verhältnis von geographischer zu genetischer Distanz

Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die geographische Entfernung zwischen den Isolaten

für den untersuchten Wertebereich linear mit den genetischen Distanzen zunimmt. Dabei

wurde die geographische Distanz als Euklidische Distanz und die genetische Distanz als

Anzahl von Nukleotidunterschieden im N-Gen gemessen. DK und DG sind dabei

60

Zufallsvariablen. Das statistisches Modell DKi,j=β0+β1DG

i,j+εi,j basierend auf linearer

Regression wurde aufgestellt, um die Hypothese H0: β1≤ 0 gegen die Alternativhypothese H1:

β1>0 mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von α = 0,05 zu testen. Dabei sind DK und DG die

Euklidische Distanz bzw. die genetische Distanz. Die Variable β0 ist der y-Achsenabschnitt;

β1 stellt die Steigung der Regressiongeraden dar und εi,j ist der Fehlerkoeffizient.

Um die Modellparameter nicht zu verletzen, wurde die Quadratwurzel aus DK gezogen, so

dass folgende Formel angewandt wurde: +D+ =D ,ji,G

01ji,K

jiεββ

Zur Durchführung der Tests wurde das Statistikprogramm SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary,

USA) verwendet.

61

3.2 Ergebnisse

3.2.1 Auswahl der Isolate

Zwischen 1954 und 2007 wurden 201 Fälle von Tollwut bei Fledermäusen an das Nationale

Referenzlabor für Tollwut gemeldet (Abbildung 3-1). Im Virusarchiv des NRL am FLI in

Wusterhausen befinden sich 112 Isolate (Stand Dezember 2007).

Abbildung 3-1: Darstellung der Fledermaustollwutfälle in Deutschland zwischen 1954 und 2007 (links) und der am NRL verfügbaren EBLV-1 Isolate (rechts)

Die Einteilung der Fläche Deutschlands in Rasterzellen einer Größe von 30 km x 30 km ergab

eine Anzahl von insgesamt 474 Rasterzellen. Tollwutpositive Fledermäuse aus dem Zeitraum

62

1954 - 2007 entfielen auf 86 verschiedene Rasterzellen, wobei aus 46 Zellen Virusisolate am

NRL zur Verfügung standen. In 26 dieser Rasterzellen war jeweils nur ein Isolat

georeferenziert und wurde entsprechend ausgewählt. Aus den übrigen Rasterzellen mit mehr

als einem Isolat (max. 6) fand eine Auswahl nach dem Zufallsprinzip statt (Abbildung 32).

Abbildung 3-2: Darstellung des 30km-Rasters mit verfügbaren EBLV-Isolaten (EBLV-1) (links) und selektierte Gridzellen mit entsprechenden Isolaten (rechts)

Insgesamt 25 Isolate wurden aus Breitflügelfledermäusen (Eptesicus serotinus) isoliert. Bei

20 Isolaten lagen keine Angaben zur Speziesbestimmung der jeweiligen Fledermaus vor. Um

einen möglichen Einfluss der Fledermausspezies auf die phylogenetische Diversität zu

analysieren, wurden die Isolate mit den Labor-Nummern 976, 5226 und 5250 selektiv in die

Untersuchung einbezogen, da diese Isolate von Fledermäusen der Arten Fransenfledermaus

(Pipistrellus nathusii, 976), Braunes Langohr (Plecotus auritus, 5226) und einer

Zwergfledermaus (Pipistrellus pipistrellus, 5250) stammen.

63

3.2.2 RT-PCR

Die ausgewählten Primer für die Amplifikation von Genfragmenten für das Nukleoprotein

und den GL-nicht-translatierten Bereich waren in der RT-PCR spezifisch für EBLV-1.

Die Amplifikate hatten eine Länge von 1574 bp für das N-Gen und den NP-nicht-

translatierten Bereich sowie 775 bp für den GL-nicht-translatierten Bereich bei allen

selektierten Isolaten. Dadurch konnten auch alle sich anschließenden Analyseschritte

durchgeführt werden.

3.2.3 Sequenzanalyse des N-Gens

Die 48 untersuchten EBLV-1-Isolate zeigten innerhalb des N-Gens eine durchschnittliche p-

Distanz von 0,00875, wobei 45 bzw. 3 Isolate entsprechend phylogenetischer Analysen

jeweils EBLV-1a oder EBLV-1b zugeordnet werden konnten (siehe Kapitel 3.2.3.2).

Abbildung 3-3: Anzahl der variablen Positionen in verschiedenen Abschnitten des N-Gens innerhalb der Gruppe EBLV-1a

0

1

2

3

4

5

6

7

1-60

61-1

20

121-

180

181-

240

241-

300

301-

360

361-

420

421-

480

481-

540

541-

600

601-

660

661-

720

721-

780

781-

840

841-

900

901-

960

961-

1020

1021

-108

0

1081

-114

0

1141

-120

0

1201

-126

0

1261

-132

0

1321

-135

6

Abschnitt im N-Gen

Anza

hl v

aria

bler

Pos

ition

en

64

Innerhalb der EBLV-1a Gruppe wurde eine mittlere p-Distanz von 0,0047 berechnet. Die

mittlere p-Distanz in der Gruppe EBLV-1b betrug 0,01553. Im gesamten N-Genabschnitt mit

1356 bp Länge wurden 114 variable Positionen gefunden, in denen sich die Isolate in

mindestens einem Nukleotid voneinander unterschieden.

Abbildung 3-4: Anzahl der variablen Positionen in verschiedenen Abschnitten des N-Gens innerhalb der Gruppe EBLV-1b

Innerhalb der Gruppe EBLV-1a (n=45) konnten 60 variable Stellen identifiziert werden,

wobei 31 jeweils nur bei einem Isolat einen Nukleotidaustausch zeigten. Die variablen Stellen

waren dabei ungleichmäßig im N-Gen verteilt (Abbildung 3-3). Während 37 (62%) der

variablen Positionen im ersten Genabschnitt bis Position 660 lagen, wies der Abschnitt von

661-1356 nur 23 (38%) Nukleotidaustausche auf. Die drei Isolate des Subtyps EBLV-1b

unterschieden sich in 31 Stellen. Die meisten Unterschiede gab es in dem Genabschnitt

zwischen Position 121 und 180. Wie in Abbildung 3-4 zu erkennen, häuften sich diese

Positionen im vorderen Genabschnitt. Der Vergleich der Konsensussequenzen von EBLV-1a

0

1

2

3

4

5

6

1-60

61-1

20

121-

180

181-

240

241-

300

301-

360

361-

420

421-

480

481-

540

541-

600

601-

660

661-

720

721-

780

781-

840

841-

900

901-

960

961-

1020

1021

-108

0

1081

-114

0

1141

-120

0

1201

-126

0

1261

-132

0

1321

-135

6

Abschnitt im N-Gen

Anza

hl v

aria

bler

Pos

ition

en

65

und 1b zeigt dagegen variable Positionen, und zwar gehäuft im vorderen und hinteren

Genbereich, wogegen der zentrale Genabschnitt weniger Unterschiede hatte (Abbildung 3-4).

Zwischen Position 1255 und 1342 ware alle Sequenzen beider Subtypen identisch. Dagegen

unterschieden sich EBLV-1a und EBLV-1b in den Positionen 333-337 in 4 von 5

Nukleotiden.

66

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

EBLV-1a ATGGATGTTAACAAGGTTGTTTTTAAGGTCCATAATCAGCTGGTCTCGGTAAGACCTGAGGTGATTTCTGATCAGTATGAGTATAAGTACCCTGCTATTA M D V N K V V F K V H N Q L V S V R P E V I S D Q Y E Y K Y P A I

EBLV-1b .............G.........................T............A..............................C..A........C..C. M D V N R V V F K V H N Q L V S V K P E V I S D Q Y E Y K Y P A I

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

EBLV-1a AAGACAAGAAGAAACCAAGCATCACTCTCGGAAAAGATCCCGATTTGAAAACAGCCTACAAGTCTATCTTGTCAGGGATGAATGCTGCTAAATTAGACCC K D K K K P S I T L G K D P D L K T A Y K S I L S G M N A A K L D P

EBLV-1b ................G..........................C..................................................G..T.. K D K K K P S I T L G K D P D L K T A Y K S I L S G M N A A K L D P

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

EBLV-1a AGATGACGTCTGCTCTTATTTAGCTGGAGCCATGGTCTTGTTTGAGGGCATCTGCCCGGAAGATTGGACTAGTTACGGAATCAACATTGCTAAGAAAGGT D D V C S Y L A G A M V L F E G I C P E D W T S Y G I N I A K K G

EBLV-1b ...................................................A...........C.................................... D D V C S Y L A G A M V L F E G I C P E D W T S Y G I N I A K K G

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

EBLV-1a GACAAGATAACACCTGCTACGTTAGTGGACATTCACAGGACGAACACTGAGGGCAACTGGGCTCAAACAGGAGGTCAAGATCTCACTCGGGACCCTACGA D K I T P A T L V D I H R T N T E G N W A Q T G G Q D L T R D P T

EBLV-1b ................................CA.TC............................................................... D K I T P A T L V D I N R T N T E G N W A Q T G G Q D L T R D P T

410 420 430 440 450 460 470 480 490 500....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

EBLV-1a CACCTGAACATGCATCTCTGGTTGGACTTCTTCTCTGTCTTTATAGGCTCAGTAAGATAGTAGGACAGAATACGGGGAACTATAAGACCAATGTGGCAGA T P E H A S L V G L L L C L Y R L S K I V G Q N T G N Y K T N V A D

EBLV-1b ..................................T.....C..C.....A.................................................. T P E H A S L V G L L L C L Y R L S K I V G Q N T G N Y K T N V A D

510 520 530 540 550 560 570 580 590 600....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

EBLV-1a TAGAATGGAACAGATCTTTGAGACTGCCCCATTTGTCAAGATTGTGGAACACCACACATTGATGACCACCCACAAGATGTGTGCCAACTGGAGCACTATA R M E Q I F E T A P F V K I V E H H T L M T T H K M C A N W S T I

EBLV-1b .................................C.................................................................. R M E Q I F E T A P F V K I V E H H T L M T T H K M C A N W S T I

610 620 630 640 650 660 670 680 690 700....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

EBLV-1a CCTAATTTTAGATTCTTGGCAGGGGCTTATGACATGTTTTTTGCCAGAATTGAGCACCTGTATTCTGCAATTCGGGTTGGGACAGTGGTTACTGCTTATG P N F R F L A G A Y D M F F A R I E H L Y S A I R V G T V V T A Y

EBLV-1b .................................................................................................... P N F R F L A G A Y D M F F A R I E H L Y S A I R V G T V V T A Y

710 720 730 740 750 760 770 780 790 800....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

EBLV-1a AGGATTGTTCGGGGTTGGTGTCTTTCACAGGGTTCATCAAGCAAATCAATTTGACAGCCAGGGAGGCCATATTATACTTCTTCCACAAGAACTTCGAGGA E D C S G L V S F T G F I K Q I N L T A R E A I L Y F F H K N F E E

EBLV-1b ..........A...........C...........................C....................C............................ E D C S G L V S F T G F I K Q I N L T A R E A I L Y F F H K N F E E

810 820 830 840 850 860 870 880 890 900....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

EBLV-1a AGAGATCAAGAGAATGTTTGAGCCAGGGCAAGAAACAGCTGTTCCGCACTCGTATTTCATCCACTTCAGATCACTTGGACTCAGTGGGAAGTCTCCTTAT E I K R M F E P G Q E T A V P H S Y F I H F R S L G L S G K S P Y

EBLV-1b ...................................................A.....................T.G.....T.................. E I K R M F E P G Q E T A V P H S Y F I H F R S L G L S G K S P Y

910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

EBLV-1a TCATCCAATGCGGTTGGGCATGTGTTTAACCTGATTCACTTTGTGGGTTGTTACATGGGCCAAATCAGATCTTTAAATGCCACTGTCATTCAGAGTTGTG S S N A V G H V F N L I H F V G C Y M G Q I R S L N A T V I Q S C

EBLV-1b ..............A......................................T..........................T................... S S N A V G H V F N L I H F V G C Y M G Q I R S L N A T V I Q S C

1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

EBLV-1a CACCCCATGAAATGTCAGTTTTGGGGGGTTATCTAGGGGAGGAGTTTTTCGGGAAGGGAACATTTGAGAGGCGGTTCTTCAGAGATGAGAAAGAGCTACA A P H E M S V L G G Y L G E E F F G K G T F E R R F F R D E K E L Q

EBLV-1b ...................C...........C..........................C........A.....A......C....C.........T.... A P H E M S V L G G Y L G E E F F G K G T F E R R F F R D E K E L Q

67

1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. ..| .. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. .. |.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |

EBLV-1a CACCCCATGAAATGTCAGTTTTGGGGGGTTATCTAGGGGAGGAGTTTTTCGGGAAGGGAACATTTGAGAGGCGGTTCTTCAGAGATGAGAAAGAGCTACA A P H E M S V L G G Y L G E E F F G K G T F E R R F F R D E K E L Q

EBLV-1b ...................C...........C..........................C........A.....A......C....C.........T.... A P H E M S V L G G Y L G E E F F G K G T F E R R F F R D E K E L Q

1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. ..| .. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. .. |.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |

EBLV-1a GGATTACGAGGCAGCAGAAAGCACTAAGGTTGATGTAGCATTGGCAGATGATGGGACAGTGAATTCGGATGATGAAGACTTCTTTTCGGGAGACACGAGA D Y E A A E S T K V D V A L A D D G T V N S D D E D F F S G D T R

EBLV-1b ........................C........C................................A................................. D Y E A A E S T K V D V A L A D D G T V N S D D E D F F S G D T R

1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. ..| .. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. .. |.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |

EBLV-1a AGCCCAGAGGCAGTATACACCAGGATTATGATGAACGGAGGGAGATTAAAAAGGTCTCACATAAAGAGATATGTCTCAGTGAGTGCAAACCATCAGGCCA S P E A V Y T R I M M N G G R L K R S H I K R Y V S V S A N H Q A

EBLV-1b ...........T................................G....................................................... S P E A V Y T R I M M N G G R L K R S H I K R Y V S V S A N H Q A

1310 1320 1330 1340 1350.. ..| ... .| ... .|. .. .|. ... |. ... |.. ..| .. ..| ... .| ... .|. .. .|.

EBLV-1a GGCCTAATTCCTTTGCAGAGTTTCTCAACAAGACGTATTCTAGTGATCCCAGATAA R P N S F A E F L N K T Y S S D P R *

EBLV-1b ........................................................ R P N S F A E F L N K T Y S S D P R *

Abbildung 3-5: Alignment der Konsensus-Sequenzen von EBLV-1a und EBLV-1b und dieabgeleitete Aminosäuresequenzen. Bei Position 333-337 unterschieden sich die Subtypen in 4von 5 Nukleotiden.

68

3.2.3.1 Paarweise Distanzberechnung und Analyse

3.2.3.1.1 Abhängigkeit der genetischen Distanz vom Jahr der Isolierung

Die in MEGA implementierte Funktion der Distanzberechnug wurde genutzt, um eine

Distanzmatrix für alle untersuchten Isolate zu erstellen. In Verbindung mit den zu den

Isolaten zur Verfügung stehenden Informationen wie Jahr der Isolierung und Fundort wurden

die Distanzen analysiert. Abbildung 3-6 zeigt das Jahr der Isolierung und die genetische

Distanz bezogen auf das Referenzisolat Hamburg (1968). Die untersuchten Isolate

entstammen den Zeitraum 1970 - 2007, wobei der überwiegende Anteil zwischen 1985 und

2005 isoliert wurde.

0

10

20

30

40

50

60

1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010

Jahr der Isolierung

Anza

hl d

er N

ukle

otid

unte

rsch

iede

Abbildung 3-6: Darstellung der genetischen Distanz (Anzahl der Nukleotidunterschiede) und dem Jahr der Isolierung in Bezug zum Referenzisolat Hamburg (EF 157976) aus dem Jahr 1968. Die 3 Isolate mit mehr als 50 Nukleotidaustauschen sind Vertreter des Subtyps EBLV-1b.

Nur die Isolate 12868 (1970) und 12871 (1983) sind vor 1985 isoliert worden. Bezüglich des

Referenzisolates 12865 (Hamburg, 1968) wiesen alle untersuchten Isolate weniger als 10

Unterschiede innerhalb der 1356 Nukleotidsequenz des N-Gens auf. Ausnahmen bildeten die

69

drei Isolaten des Subtyps EBLV-1b, die sich innerhalb dieses Genabschnitts in mehr als 50

Nukleotiden von 12865 unterschieden.

Abbildung 3-7: Statistischer Zusammenhang zwischen der Anzahl der Nukleotidaustausche und der zeitlichen Distanz. Isolate des Subtyps EBLV-1b wurden nicht berücksichtigt

Eine statistische Auswertung des Subtyps EBLV-1b war aufgrund der geringen Anzahl der

Isolate nicht möglich.

Werden die Isolate des Subtyps EBLV-1a gesondert betrachtet (Abbildung 3-7), so ist in

Bezug auf das Referenzisolat Hamburg (1968) eine statistisch signifikante Zunahme (p<0,05)

der genetischen Unterschiede mit wachsendem zeitlichen Abstand nachweisbar. Die H0-

Hypothese wird abgelehnt; demzufolge nimmt die genetische Distanz mit zunehmender

zeitlicher Distanz für den untersuchten Wertebereich linear zu. Der Schätzer für den

Parameter ist β1= 0,199. Für die Regressionsgerade ergibt sich somit folgende Formel:

Anzahl der Nukleotidaustausche = 0,666 + 0,199 * Distanz in Jahren

70

3.2.3.1.2 Abhängigkeit der genetischen Distanz von der geographischen Distanz

Werden sämtliche geographischen und genetischen Distanzen der untersuchten Isolate in

Bezug zueinander gesetzt, können 3 Punktwolken unterschieden werden (Abbildung 3-8).

Vertreter des Subtyps EBLV-1a wiesen mit maximal 14 Nukleotidunterschieden eine

geographische Distanz von bis zu 500 km untereinander auf. Alle geographischen Distanzen,

die mit mehr als 40 Austauschen assoziiert waren, zeigten jeweils Beziehungen zwischen

Vertretern des Subtyps EBLV-1a und -1b. Da die drei EBLV-1b Isolate einen engeren

geographischen Ursprung (Saarland) haben, ist der Abstand zu den EBLV-1a Isolaten

zwischen 300 km und 700 km groß (Abbildung 3-8). Neben diesen beiden großen Gruppen

separieren sich zwei Werte mit einer genetischen Distanz von 20-30 Nukleotidunterschieden

und einem geographischen Abstand von <50 km. Diese Punkte stellen die Beziehung

innerhalb der EBLV-1b Gruppe zwischen den Isolaten 5006, 15571 und 13403 dar.

0

10

20

30

40

50

60

0 100 200 300 400 500 600 700

Abstand (in Kilometer)

Anza

hl d

er U

nter

schi

ede

Abbildung 3-8: Beziehung zwischen geographischer und genetischer Distanz (N-Gen) der untersuchten Isolate

71

Innerhalb des Subtyps EBLV-1a waren einige Isolate identisch und die maximale Differenz

betrug 13 Nukleotidunterschiede. Die mittlere Anzahl der Nukleotidunterschiede als Maß der

genetischen Distanz betrug 6,4.

Abbildung 3-9: Beziehung zwischen geographischer und genetischer Distanz der untersuchten Isolate des Subtyps EBLV-1a (N-Gen)

Es bestand ein signifikanter Zusammenhang zwischen geographischer und genetischer

Distanz der untersuchten deutschen EBLV-1a Isolate in Deutschland (p<0,05). Die

Quadratwurzel der geographischen Distanz nahm mit wachsender Anzahl von

Nukleotidaustauschen für den untersuchten Wertebereich zu (Parameterschätzer β1= 18,75).

Demzufolge wird die H0-Hypothese abgelehnt.

72

3.2.3.2 Phylogenetische Analyse mit den N-Gensequenzen

Die phylogenetische Analyse mit den Sequenzen der kompletten N-Gene der 48 Isolate von

Fledermaustollwutvirusisolaten aus Deutschland mit Hilfe der NJ-Methode bestätigte die

vorangegangenen Sequenzanalysen, wonach eine Unterteilung der Isolate in zwei separate

Untergruppen vorgenommen werden kann. Das Dendrogramm hat zwei Cluster und spiegelt

die Existenz der Subtypen EBLV-1a und -1b wider (Abbildung 3-10). Sämtliche Vertreter des

Subtyps EBLV-1a wurden im Norddeutschen Tiefland nachgewiesen. Dagegen stammten die

drei EBLV-1b Isolate aus dem Saarland und repräsentieren die bis dahin südlichsten

Nachweise von EBLV-1 in Deutschland. Die aus den Jahren 2000 (5006) und 2006 (15571)

stammenden Isolate des Subtyps EBLV-1b sind näher miteinander verwandt als mit dem

dritten Isolat (13403) aus dem Jahr 1986. Für diese Verzweigung wurde ein Bootstrap-Wert

von 99% ermittelt (Abbildung 3-10).

EBLV-1b

EBLV-1a

Abbildung 3-10: Räumliche Verteilung der beiden Sybtypen EBLV-1a und 1b

73

Im Vergleich zu EBLV-1b zeigten die EBLV-1a-Isolate eine homogenere Struktur mit

geringeren Astlängen innerhalb der Verzweigung des phylogenetischen Baumes. Die

Bootstrap-Werte für die einzelnen Verzweigungen lagen zwischen 15 und 96%. Um die

Isolate innerhalb der EBLV-1a-Phylogruppe in Cluster einzuteilen, erfolgte eine

Umwandlung des phylogenetischen Baumes in eine kondensierte Form, wobei nur

Verzweigungen mit einem Bootstrap-Wert von über 50 berücksichtigt wurden. Diese

Herangehensweise erlaubte die Unterteilung in fünf Cluster (A - E).

74

EBLV

-1b

EBLV

-1a

489557785782577631321345013452

67951554813394915

1164713323

12865

134154644

1341613414

1344552261340813406

134098624

1287113407

525429769923131

134185250976

13401134281343813453

1343915730

9335248

1092710924

1342213403

15571500699

64

67

96

77

74

59

58

50

68

70

63

38

57

65

80

76

65

33

60

99

59

52

64

41

30

19

36

15

65

0.005

489557785782577631321345013452

67951554813394915

1164713323

12865

134154644

1341613414

1344552261340813406

134098624

1287113407

525429769923131

134185250976

13401134281343813453

1343915730

9335248

1092710924

1342213403

15571500699

64

67

96

77

74

59

58

50

68

70

63

38

57

65

80

76

65

33

60

99

59

52

64

41

30

19

36

15

65

0.005

Abbildung 3-12: Phylogenetischer Baum der mit den Sequenzen des N-Gens erstelltwurde. Die Berechnung erfolgte mit der NJ-Methode. Die Bootstrap-Werte (1000Wiederholungen) der Verzweigungen sind angegeben.

75

Der Cluster A umfasste insgesamt 12 Isolate und konnte nochmals in die Untergruppen A1

und A2 unterteilt werden. Zur Gruppe A1 gehören 6 Isolate (4895, 5782, 5776, 5778, 3132

und 13450), von denen die Isolate 5782, 5776, 5778 und 3132 im N-Gen identische

Sequenzen hatten. Diese Isolate wurden zwischen 1999 und 2001 in Thüringen und Sachsen-

Anhalt erhalten, wobei entsprechend den Angaben zu den Fundorten die überwiegende

Mehrzahl aus einem eng begrenzten Gebiet im südlichen Sachsen-Anhalt und dem

angrenzenden Norden Thüringens stammte. Nur Isolat 13450 aus dieser Gruppe wurde aus

einer Fledermaus in Berlin isoliert. Die Untergruppe A2 setzte sich ebenfalls aus 6 Isolaten

(Labor-Nummer: 13452, 6795, 15548, 915, 11647 und 13394) zusammen, die fast alle ihren

Ursprung in den östlichen Bundesländern Sachsen, Brandenburg, Berlin und Mecklenburg-

Vorpommern hatten.

4895

5778

5782

5776

3132

13450

13452

6795

15548

13423

915

11647

0.0005

A1

A2

Abbildung 3-13: Cluster A: Geographischer Ursprung der Isolate und phylogenetischer Baum (Ausschnitt)

76

Die beiden südlichsten Isolate 6795 und 13452 unterschieden sich dabei von den restlichen

Mitgliedern dieser Gruppe. Die Ausnahme für den gesamten Cluster A stellt lediglich Isolat

915 dar, welches aus Niedersachsen stammte (Abbildung 3-13).

Fünf Isolate aus den nördlichen Bundesländern Schleswig-Holstein (Labor-Nummer: 13423,

13415, 13416), Hamburg (12865) und Mecklenburg-Vorpommern (4644) bildeten den

Cluster B. Innerhalb dieses Clusters waren die Isolate 13415, 13416 und 4644 enger

assoziiert. Die Darstellung der Herkunft der Isolate zeigt, dass diese drei Isolate auch

geographisch dicht beieinander liegen (Abbildung 3-14). Mit Isolat 12865 enthält dieser

Cluster das älteste aus Deutschland zur Verfügung stehende Isolat, welches im Jahr 1968 in

Hamburg aus einer infizierten Fledermaus isoliert wurde (WERSCHING und SCHNEIDER,

1969). Dieses Isolat ist identisch mit der VLA-Archivnummer RV9 (9395GER) und die

komplette Sequenz des Genoms ist unter der Zugangsnummer EF157976 in internationalen

Genbanken hinterlegt (MARSTON et al., 2007).

13394

12865

13415

4644

13416

0,0005

13394

12865

13415

4644

13416

0,0005

Abbildung 3-14 Cluster B: Geographischer Ursprung der Isolate und phylogenetischer Baum (Ausschnitt)

Der Cluster C setzt sich aus 12 Isolaten zusammen. Die Isolate 5226, 8624, 12871, 13406,

13407, 13408 und 13409 sind im Verhältnis zu den anderen Vertretern dieses Clusters

77

homogener und gruppieren sich unmittelbar nach der Verzweigung. Sie sind in den Jahren

zwischen 1983 (12871) und 2003 (8624) isoliert worden. Die restlichen Isolate dieses

Clusters stammen aus den Jahren 1998 bis 2000. Alle Isolate dieses Clusters stammen aus

dem Land Niedersachsen, wobei innerhalb dieses Bundeslandes eine regionale Häufung nicht

beobachtet werden konnte (Abbildung 3-15). Das Isolat 5226 ist das einzige bekannte EBLV-

Isolat aus einem Braunen Langohr (Plecotus auritus).

Abbildung 3-15: Cluster C: Geographischer Ursprung der Isolate und phylogenetischer Baum (Ausschnitt)

78

13418

5250

976

1340113428

13438

0,0002

Abbildung 3-16: Cluster D: Geographischer Ursprung der Isolate und phylogenetischer Baum (Ausschnitt)

Der Cluster D setzt sich aus 6 Isolaten aus den Bundesländern Schleswig-Holstein,

Niedersachsen und Nordrhein-Westfalen zusammen. Die Isolate stammen aus den Jahren

1986 (13418) und 1994 (5250). Während die Isolate 976, 13401, 13418 und 13428

geographisch mit der Nähe zur Nordseeküste assoziiert zu sein scheinen, stammen die beiden

anderen Isolate dieses Clusters eher aus im Süden Niedersachsens bzw aus dem Norden von

Nordrhein-Westfalen. Diese geographische Verteilung spiegelte sich allerdings nicht im

phylogenetischen Baum wider (Abbildung 3-16). Innerhalb dieses Clusters befinden zwei

Isolate, die aus einer Zwergfledermaus (Pipistrellus pipistrellus, Isolat 5250) und einer

79

Fransenfledermaus (Pipistrellus nathusii, Isolat 976) stammten. Beide Isolate liegen im

phylogenetischen Baum sehr dicht beieinander.

15730

933

5248

10927

10924

0,0005

Abbildung 3-17: Cluster E: Geographischer Ursprung der Isolate und phylogenetischer Baum (Ausschnitt)

Die Isolate 933, 5248, 10924, 10927 und 15730 bilden den Cluster E. Das Isolat 15730

befindet sich am ersten Ast innerhalb dieses Clusters mit einem Bootstrap-Wert von 52%.

Dieses Isolat stammt aus einer Breitflügelfledermaus aus Hartmannsdorf, Landkreis Dahme-

Spree, Brandenburg. Die Isolate 10924 und 10927 sind im phylogenetischen Baum eng

verwandt. Sie wurden im Jahr 2004 aus Fledermäusen im Nordosten Niedersachsens

(Landkreis Leer) isoliert. Bei den beiden weiteren Vertretern dieses Clusters handelt es um

Isolate aus Bremen (933) und aus dem Landkreis Stade (5248) aus den Jahren 2000

beziehungsweise 1993.

80

3.2.4 Alignment und Analyse der nicht-kodierenden NP-Region

Der nicht-kodierende Bereich zwischen N- und P-Gen umfaßt 90 Nukleotide. Bei zwei

Isolaten (3132, 5778) besteht dieser Abschnitt aus 91, bei zwei weiteren (5006, 15771) aus 95

Nukleotiden. Die zusätzlichen Nukleotide sind Insertionen in der Transkriptions-

Termination/Polyadenylationssignalsequenz (TTP) (Abbildung 3-18).

EF157976 AATTGGAAAGAAAAA------AA-CTAACACCACT5776 AATTGGAAAGAAAAA------AAACTAACACCACT3132 AATTGGAAAGAAAAA------AAACTAACACCACT5006 AATTGAAAAGAAAAAGAAAAAAA-CTAACACCACT 15571 AATTGAAAAGAAAAAGAAAAAAA-CTAACACCACT

Transkriptions-Terminations/

Polyadenylationssignalsequenz (TPP)Intergenische Region

Initiationssignalsequenz

Abbildung 3-18: Alignment von ausgewählten Isolaten in der NP-Region mit dem Isolat Sequenz des Hamburger Isolates (GenBank EF157976) als Referenz. Die Transkriptions-Termination/Polyadenylationssignalsequenz (TPP) und die Initiationsequenz für die Transkription des nachfolgenden P-Gens sind grau hinterlegt. Zwischen diesen beiden Motiven befindet sich die intergenische Region (IGR).

Innerhalb des Subtyps EBLV-1a wurde als Maß der genetischen Distanz eine mittlere p-

Distanz von 0,0041 berechnet. Von 6 variablen Positionen lagen 5 N-terminal, während sich

nur eine einzige variable Position P-terminal befand. Die mittlere p-Distanz innerhalb des

Subtyps EBLV-1b betrug 0,0222, wobei die 4 ermittelten variablen Positionen alle innerhalb

des N-terminalen Bereiches lagen. Die Analyse mittels der NJ-Methode zeigte wie im N-Gen

ebenfalls eine Auftrennung der Isolate in die zwei Subtypen EBLV-1a und EBLV-1b. Die

Sequenzen der Isolate 5782, 5778, 5776 und 3132 sowie das Isolat 4895 wurden innerhalb des

Subtyps EBLV-1a getrennt gruppiert (Abbildung 3-19). Die Isolate 15571 und 5006 des

Subtyps EBLV-1b sind in diesem Abschnitt identisch, unterscheiden sich aber von Isolat

13403.

81

Abbildung 3-19: Phylogenetischer Baum berechnet mit NJ-Methode mit Sequenzen der NP-Region (90nt). Schwarzes Dreieck: übrige Vertreter (N=40) des Subtyps EBLV-1a mit identischen Sequenzen. Die Bootstrap-Werte (1000 Wiederholungen) sind an den entsprechenden Ästen aufgeführt.

5782 5776 5778 3132

4895

EBLV-1a

13403 15571 5006

EBLV-1b

66

9844

52

42

0.005

82

3.2.5 Analyse der GL-nicht-kodierenden Region

Mit Ausnahme eines Isolates umfasst der GL-nicht-kodierende Bereich bei allen untersuchten

EBLV-1 Isolaten 560 bp. Nur bei Isolat 5782 aus einer Fledermaus (Spezies unbekannt) aus

der Gemeinde Horburg-Maßlau, Kreis Merseburg-Querfurt, Sachsen-Anhalt besitzt dieser

Bereich eine Länge von 525 bp, die die Folge einer Deletion von 35 Nukleotiden an Position

5319-5353 des Genoms ist (Abbildung 3-20).

Abbildung 3-20: Alignment ausgewählter Sequenzen eines Bereiches der GL nicht-kodierenden Region. Die 35 nt-Deletion in der Sequenz von Isolat 5782 ist hervorgehoben und die Position in Bezug zur Sequenz EF157976 angegeben.

Innerhalb der EBLV-1a Gruppe gab es in diesem Abschnitt 52 variable Positionen. Die

berechnete mittlere genetische Distanz (p-Distanz) war 0.0095. Die drei Isolate der EBLV-1b

Gruppe unterschieden sich in 27 Positionen mit einer durchschnittlichen p-Distanz von

0.0333. Die Verteilung dieser Positionen in diesem Bereich war nicht gleichmäßig, sondern

ein Bereich mit wenigen Austauschen im Zentrum ist flankiert von Abschnitten mit deutlich

mehr Austauschen (Abbildung 3-21). Mit Ausnahme des ersten Abschnitts und des Abschnitts

von Position 421-480 unterschieden sich die beiden Subtypen 1a und 1b kaum in der

Verteilung.

83

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1-60 61-120 121-180 181-240 241-300 301-360 361-420 421-480 481-540 541-560

Abschnitt im GL-Bereich

Anza

hl v

aria

bler

Pos

ition

en

EBLV1aEBLV1b

Abbildung 3-21: Vergleich der Anzahl variabler Positionen in verschiedenen Abschnitten des GL-Bereiches zwischen EBLV-1a und EBLV-1b

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

N NP GL

Untersuchte Genabschnitte

p-W

erte

(Dur

chsc

hnitt

)

EBLV-1aEBLV-1b

Abbildung 3-22: Vergleich der durchschnittlichen p-Distanzen der untersuchten Genabschnitte der Subtypen EBLV-1a und 1b. Die Ergebnisse basieren auf dem paarweisen Vergleich der Sequenzen (500 Wiederholungen)unter Verwendung von Jukes-Kantor-Algorithmen. Die jeweiligen Konfidenzgrenzen sind angegeben.

84

3.2.5.1 Phylogenetische Analyse der Sequenzen des GL-Bereichs und Vergleich mit dem N-Gen

Die phylogenetische Analyse der Sequenzen des GL-Bereichs der untersuchten EBLV-Isolate

führte zur einer Topologie, die in Abbildung 3-23 dargestellt ist. Auffällig ist die Struktur des

phylogenetischen Baumes, der eine Zweiteilung aufweist und auch hier die Unterscheidung in

die Subtypen EBLV-1a und -1b zulässt. Innerhalb des Subtyps EBLV-1b sind die Isolate

5006 und 15571 näher verwandt als das dritte existierende Isolat 13403. Der Subtyp EBLV-1a

zeigte einen homogenen Aufbau mit wenigen Abzweigungen. Die größte separate Gruppe

innerhalb dieses Subtyps stellten Isolate dar, welche mehrheitlich in der Analyse des N-Gens

als Cluster A klassifiziert wurden. Mit dem Isolat 3131 gruppierte sich allerdings auch ein

Vertreter des Clusters C in diesen Hauptast. Die Unterteilung in die Untergruppen A1 und A2

war bei beiden Bäumen (N-Gen und GL-Bereich) vergleichbar. Eine weitere Gruppe von

Isolaten, die sich abgrenzten, sind die als Cluster B identifizierten Isolate. Vom Hauptast

dieser Gruppe zweigte das Isolat 933 ab, welches in der Gruppierung im N-Gen zum E-

Cluster gerechnet wurde.

Von den 6 Isolaten, welche als Cluster D identifiziert wurden, stellten nur 4 (976, 5250,

13401 und 13428) einen separaten Ast innerhalb des phylogenetischen Baumes dar. Die

beiden anderen Isolate positionieren sich entweder separat (13438) oder sind identisch mit

einem anderen, nicht klassifizierten Isolat (13418 mit 13439). Die drei Isolate 10924, 10927

und 15730 bilden einen separaten Ast und entsprechen dem Cluster E. Als weiteres Isolat

dieses Clusters im N-Gen stellte Isolat 933 insofern eine Ausnahme dar, als dass es näher mit

Cluster B assoziert schien. Die übrigen Isolate, die entweder nicht klassifiziert wurden oder

dem Cluster C oder D zugehörig sind, können anhand der Topologie des GL-Baumes nicht

gruppiert werden.

Die phylogenetische Analyse sowohl der N-Gensequenz, der NP-Region als auch des GL-

Bereiches lässt eine Differenzierung in die Subtypen EBLV-1a und -1b zu. Die Etablierung

von Clustern, wie sie anhand der Analyse des N-Gens erfolgte, kann im Wesentlichen im GL-

Bereich bestätigt werden. Größte Übereinstimmungen gibt es dabei in der als Cluster A

85

bezeichneten Gruppe von Isolaten. Auch die Einteilung in die Untergruppen A1 und A2 ist

zwischen den beiden Genabschnitten konsistent. Allerdings gibt es einige Isolate, die mit den

Sequenzen im GL-Bereich anders gruppiert werden als mit denen des N-Gens.

86

Abbildung 3-23: Phylogenetischer Baum mit den Sequenzen des GL-NTR mittels NJ-Methode. Bootstrap-Werte (1000 Wiederholungen) sind angegeben. Die Beschriftung der Isolate bezieht sich auf die Einteilung anhand des N-Gens.

915 15548 11647 7695 13423 13452

A 2

13445C 3131

3132 4895

5778 5782

A 1

A 1 5776A 1 13450

C 12871 E 933

4644 13415. 13416

13394 12865

B

C 8624 976 5250 13401

13428

D

C 5185C 13409

13453C 5254

D 13438C13407

13414C13406

13422D13418

13439C 13408

C5226C 2976

1092410927

15730E

E5248E10925

13403500615571 EBLV-1b99

23

19

88

64

87

91

67

463662

83

87

4399

65

50

45

44

66

65

39

8

27

0.005

87

3.2.6 Analyse der Aminosäuresequenz des N-Proteins

Die aus den Sequenzdaten abgeleitete Aminosäuresequenz des Nukleoproteins zeigte nur

geringe Unterschiede zwischen den Isolaten. Die Positionen der Austausche und Isolate sind

in Tabelle 3-9 dargestellt. Im Vergleich zur Sequenz des Referenzisolates Hamburg (1968)

haben 11 Vertreter des Subtyps von EBLV-1a Aminosäureaustausche. Die Isolate 13428 und

13438 zeigen an zwei unterschiedlichen Positionen Austausche, während die übrigen Isolate

nur einen Austausch aufweisen. Zwischen der Referenzsequenz und den drei Vertretern des

Subtyps EBLV-1b sind 7 Aminosäureaustausche im N-Gen nachweisbar, wobei die Isolate

auch innerhalb des Subtyps an fünf Positionen Unterschiede zeigen.

Tabelle 3-9: Aminosäureaustausche im Vergleich zu Referenzisolat Hamburg (1968, EF157976). Grau hinterlegte Isolate entstammen dem Subtyp 1b

Position Aminosäure Isolat-Nr.

5 K>R 15571, 5006

18 R>K 15571, 5006, 13403

51 T>S 13403

67 S>P 13423

87 E>K 13438, 13428

111 I>V 15571

112 H>N 15571, 5006,13403

131 D>E 13403

132 P>S 13403

175 T>I 8624

176 A>P 13415

262 H>Q 2976

418 R>S 992, 3131

448 S>N 5250, 13428, 13438, 13401, 976

88

Mit den AS-Sequenzen des N-Proteins wurde eine phylogenetische Analyse durchgeführt. Für

die Berechnung des NJ-Baumes wurde bei identischen Sequenzen nur eine ausgewählt

(12865). Wie in Abbildung 3-24 zu erkennen, sind die beiden Subtypen EBLV-1a und 1b mit

einem Bootstrap-Wert von 87 deutlich voneinander zu unterscheiden. Vom Hauptast zweigt

innerhalb des Subtyps EBLV-1a ein weiterer Ast mit den Isolaten 976, 5250 und 13401

(Niedersachsen). Die Isolate 13428 (Aurich, NI) und 13438 (Harsewinkel, NW) scheinen

innerhalb dieses Subtyps am weitesten phylogenetisch von den übrigen Isolaten entfernt zu

sein.

Abbildung 3-24: Phylogenetischer Baum, der mit den Aminosäresequenzen den N-Proteins erstellt wurde. Die Berechnung erfolgte mittels NJ-Methode. Die Bootstrap-Werte (1000 Wiederholungen) der Verzweigungen sind angegeben.

13428

13438

13401

976

5250

12865

2976

13394

8624

EBLV-1a

13403

15571

5006

EBLV-1b

0.001

71

67

87

72

89

3.2.7 Nachweis von EBLV-2 in Deutschland

3.2.7.1 RT-PCR- Ergebnis und Sequenzvergleich

Eine am 24.08.2007 an das NRL übersandte Hirnprobe (Lab. Nr.16618) einer mittels IFT

positiv auf Tollwut getesteten Fledermaus aus Bad Buchau, Landkreis Biberach, Baden-

Württemberg, ergab in der diagnostischen RT-PCR ein Amplifikat, das auf das Vorliegen

einer Infektion mit EBLV-2 schließen ließ.

Abbildung 3-25: Elektropherogramm der RT-PCR für EBLV-2 (links) und EBLV-1 (rechts) der Probe 16618. Ein 270 nt großes Fragment spezifisch für EBLV-2 wurde amplifiziert.

Um das Ergebnis der RT-PCR zu bestätigen, wurden die ersten 400 nt des N-Gens

sequenziert (nach JOHNSON et al., 2003) und mit Sequenzen von Lyssavirusisolaten anderer

Genotypen verglichen. Dabei konnte eine Übereinstimmung von 72,7 % mit Sequenzen von

klassischen Tollwutviren (GT 1) (Fuchsvariante, Deutschland), beziehungsweise von 73,0 %

(SAD B19) festgestellt werden. Der Sequenzvergleich mit einem EBLV-1 Isolat (GT 5) aus

Deutschland ergab eine Identität von 72,2 %, während ein EBLV-2 Isolat (GT 6) aus der

Schweiz zu 97,2 % übereinstimmte (Abbildung 3-26).

90

Abbildung 3-26: Alignment des Isolates 16618_Ger mit EBLV-2 (N9337_SWI, Gen Bank: AY863407 ), EBLV-1 (RV9_GER, Genbank: EF 157976), einem Impfvirusstamm für die orale Immunisierung (SAD B19, Genbank: EF206709 ) und einer Fuchsvariante aus Deutschland (RV313_GER, Genbank: AY062070)

Die phylogenetische Untersuchung basierend auf einem Vergleich der 400 nt langen Sequenz

mit bereits veröffentlichten EBLV-Sequenzen zeigte, dass sich das Isolat 16618_GER

innerhalb des GT 6 (EBLV-2) gruppiert, während GT 5 (EBLV-1) als Outgroup fungiert

(Abbildung 3-27).

91

Die EBLV-2-Sequenzen erschienen als heterogene Gruppe, wobei die Isolate aus den

Niederlanden (9018HOL, 94112HOL, 9375HOL) sowie ein Isolat aus Finnland (N9007FIN)

separate Untergruppen darstellten.

Abbildung 3-27: Phylogenetischer Baum berecht mit NJ-Methode mit Sequenzen eines 400 nt Fragmentes des N-Gens. EBLV-1 RV9 GER fungiert als Outgroup. Bootstrap-Werte sind angegeben.

Isolat Genotyp Land Ort Spezies GenBank

16618 GER EBLV-2 Deutschland Bad Buchau M. daubentonii

02053 SWI EBLV-2 Schweiz NA ? AY863408

RV 1333 EBLV-2 VK Angus Human AY247650

9337 SWI EBLV-2 Schweiz Versoix M. daubentonii AY863407

9375 HOL EBLV-2 Niederlande Roden M. dasycneme AY863404

94112 HOL EBLV-2 Niederlande Andijk M. dasycneme AY863405

9018 HOL EBLV-2 Niederlande Wommels M. dasycneme AY863403

9007 FIN EBLV-2 Finnland Helsinki Human AY863406

RV 9 GER EBLV-1 Deutschland Hamburg ? EF 157976

92

3.2.7.2 Speziesbestimmung der EBLV-2 positiven Fledermaus

Die zur Untersuchung gelangte Fledermaus wurde von Fledermaussachverständigen aufgrund

morphologischer Kriterien als Wasserfledermaus identifiziert (DIETZ und VON

HELVERSEN, 2004). Der Sequenzvergleich eines 705 nt großen Fragments des

CytochromB-Gens der EBLV-2 positiven Fledermaus (Labornummer 16626) mit einer in

GenBank veröffentlichten Sequenz von Myotis daubentonii (EU153125.1) ergab eine

Übereinstimmung von über 99 %. 10 20 30 40 50 60 70

. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |ACATCAGACaCCGCAACAGCCTTTAACTCAGTCACCCATATTTGTCGAGACGTAAACTACCGCTGAATTC 16626............................................................G.......CT EU153125

80 90 100 110 120 130 140. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |TACGCTACCTACATGCAAACGGAGCCTCCATATTTTTAATTTGCCTATACCTCCATGTAGGACGAGGTCT 16626.....................................T................................ EU153125

150 160 170 180 190 200 210. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |TTATTATGGCTCCTACCTATATACAGAAACTtGAAACGTTGGAGTtATCCTGCTAaTTGCTGTAATAGCT 16626.......................................................T.............. EU153125

220 230 240 250 260 270 280. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |ACAGCCTTTATAGGATACGTACTTCCATGAGGCCAAATATCCTTCTGAGgAGCaACTGTAAtTACTaATC 16626...................................................................... EU153125

290 300 310 320 330 340 350. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |TcCTATCTGCaATcCCATATATTgGCACAGACCTTGTAGAATGAATTTGAGGCGGCTTTTCCGtTGATAA 16626..T................................................................... EU153125

360 370 380 390 400 410 420. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |GGCCACCCTAACTCGATTTTtCGCCTTCCACTTTCTACTGCCATTCATCAtTGCAGCTATAGTTATAGTA 16626...................................................................... EU153125

430 440 450 460 470 480 490. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |CATCTCTTAtTTCTTCATGAAACAGGATCTAACAACCCAATAGGAATTCCCTCTGACACAGATATAATTC 16626...................................................................... EU153125

500 510 520 530 540 550 560. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |CATTCCACCCTTACTACACAATTAAAGACATTCTTGGCCTTCTACTAATAATTATAGCACTACTATTATT 16626...................................................................... EU153125

570 580 590 600 610 620 630. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |AGTACTATTCTCCCCCGATATACTGGgAGACCCCGATAATTACACACCAGCAAATCCACTAAATACCCCA 16626...................................................................... EU153125

640 650 660 670 680 690 700. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |CCTCATATTAAACCAGAATGATATTTTCTATTCGCATACGCAATCCTACGATCAATTCCAAATAAATTAG 16626...................................................................... EU153125

Abbildung 3-28: Alignment der partiellen CytochromB-Sequenz der Fledermaus (Lab.-Nr.16626) mit der entsprechenden Sequenz einer Myotis daubentonii veröffentlicht in der Genbank (EU153125.1)

93

4 DISKUSSION

Mit 120 Isolaten verfügt das Virusarchiv des NRL über eine beachtliche Sammlung von

EBLV-Isolaten. Wichtige Voraussetzung zur Selektion einer repräsentativen Auswahl von

Fledermaustollwutvirusisolaten waren die Verfügbarkeit von Daten, wie Jahr der Isolierung,

die Spezies und der geographische Ursprung. Diese Daten sind für die Darstellung der

Tollwutfälle mithilfe geographischer Informationssysteme notwendig. Die hier gewählte

Herangehensweise zur Auswahl der Isolatel mit Hilfe des Raster-basierten Verfahrens

gewährleistete, dass die räumliche Verteilung aller verfügbaren Isolate berücksichtigt wurde,

und somit auch die real zirkulierenden Virusvarianten widerspiegelte. Ein Random sampling,

bei dem aus der Anzahl der zur Verfügung stehenden Isolate eine Menge beliebig ausgewählt

wird, wäre bei der vorliegenden EBLV-Isolatesammlung nicht sinnvoll gewesen, da wichtige

Informationen, wie die zum geographischen Ursprung, unberücksichtigt geblieben wären.

Wäre die Auswahl nach dem Kriterium der Zugehörigkeit in administrative Einheiten erfolgt,

so hätte dies zu einer Vorselektion geführt. Würden beispielsweise nur 5 Isolate pro

Bundesland ausgewählt, wäre zwar gewährleistet, dass in Bundesländern mit geringer Anzahl

von Isolaten diese berücksichtigt worden wären, jedoch würden dann in Flächenländern mit

einer größeren Anzahl von Isolaten, wie Niedersachsen, alle Isolate möglicherweise nur aus

einer begrenzten Region stammen.

Die Sequenzierung und die anschließende phylogenetische Analyse der gewonnenen Daten

sind ein Beitrag zur Charakterisierung und Differenzierung von

Fledermaustollwutvirusisolaten aus Europa. Die Typisierung mittels monoklonaler Antikörper

und RFLP konnten EBLV-Isolate bislang nur grob in die Genotypen 5 und 6 einteilen. Zudem

sind die Ergebnisse auf der Basis von mAKs, die gegen das Glykoprotein gerichtet sind, nicht

konsistent (BOURHY et al., 1992; RUPPRECHT et al., 1991).

Wie im Abschnitt 2.6.2 beschrieben, wurden bisher zur genetischen Charakterisierung von

EBLVs verschiedene Genabschnitte verwendet. Um einen zukünftigen Vergleich mit

veröffentlichten Sequenzen in der Genbank zu gewährleisten, wurde zunächst der in

phylogenetischen Studien bei Lyssaviren am häufigsten verwendete Genabschnitt, das N-Gen,

untersucht. Zusätzlich wurde auch der N-P Übergangsbereich untersucht, da die am NRL für

94

Tollwut etablierte, diskriminierende diagnostische RT-PCR für EBLV-1 und -2 ebenfalls

diesen Bereich als Zielsequenz nutzt und Sequenzdaten vorliegen (MÜLLER et al., 2007;

VOS et al., 2004b). Dementsprechend wurden das komplette N-Gen und der

Übergangsbereich zum Phosphoproteingen zur Sequenzierung ausgewählt. Das N-Gen gilt

genotypübergreifend als besonders konserviert (MARSTON et al., 2007; KUZMIN et al.,

2005), wogegen der GL- nicht-translatierte Bereich bei GT1 variabler ist (SACRAMENTO et

al., 1992). Da diese Region bisher nicht Bestandteil phylogenetischer Studien mit EBLVs,

sondern nur bei RABV (GT1) war (vgl. Abschnitt 2.6.2), wurde dieser Bereich herangezogen,

um zu überprüfen, ob er für eine weitere Feindifferenzierung von EBLV-Isolaten geeignet ist.

Die Sequenzanalyse des N-Gens der EBLV-1-Isolate aus Deutschland bestätigte

vorangegangene Studien (MÜLLER et al., 2007; DAVIS et al., 2005; AMENGUAL et al.,

1997), wonach dieser Bereich eine hohe Sequenzidentität und genetische Stabilität aufweist.

Dennoch konnten geringe genetische Unterschiede festgestellt werden, die eine eindeutige

Unterscheidung in die Subtypen EBLV-1a und -1b erlauben. Isolate des Subtyps EBLV-1b

wiesen eine mehr als fünffach größere Variabilität auf, als die des Subtyps EBLV-1a. Damit

werden Ergebnisse von DAVIS (2005) bestätigt. Bei beiden Gruppen war eine Häufung der

variablen Positionen innerhalb des N-terminalen Abschnitts des N-Gens feststellbar

(Abbildung 3-3 und 3-4). Bezogen auf die Aminosäuresequenzunterschiede bestätigte sich

diese Beobachtung für alle untersuchten EBLV-1-Isolate (Tabelle 3-9). Somit entsprechen die

Ergebnisse weitestgehend denen einer anderen Studie, die Lyssaviren aus sechs

verschiedenen Genotypen im N-Gen vergleichend untersuchte, und zeigte, dass der mittlere

Abschnitt eher konserviert ist. Die für die amino- und karboxyterminalen Enden des für das

N-Protein kodierenden Genabschnittes sind dagegen variabler (KISSI et al., 1995).

Beim Vergleich der N-Gen-Sequenzen von EBLV-1a und -1b ist ein variabler Bereich

interessant, der sich als Marker für die Differenzierung beider Subtypen eignen könnte

(Abbildung 3-5). Die Sequenzunterschiede um Position 335 des N-Gens könnten Zielsequenz

von Subtyp-spezifischen Primern einer differenzierenden RT-PCR sein. Weiterhin wäre es

möglich, ein Restriktionsenzym so auszuwählen, das es an dieser Position spezifisch nur das

Genom eines Subtyps schneidet und so zur Unterscheidung mittels RFLP herangezogen

werden könnte. Diese Region könnte auch als Zielsequenz für eine Subtyp-spezifische Sonde

95

bei der Etablierung eines differenzierenden realtime-RT-PCR-Assays genutzt werden. Vorteil

einer solchen Herangehensweise wäre die unmittelbare Diagnose von EBLV-1 und zudem die

Unterscheidung der Subtypen 1a oder 1b.

Die phylogenetische Analyse basierend auf den kompletten N-Gen-Sequenzen zeigte, dass

weitere EBLV-1b-Varianten in Deutschland vorkommen. Auch die Abgrenzung der beiden

Subtypen EBLV-1a und -1b voneinander wurde bestätigt. Es wurde postuliert, , dass die

Virusübertragung bzw. der Austausch von Virusvarianten zwischen Fledermauspopulationen

innerhalb Europas über weite Strecken erfolgt (DAVIS et al., 2005). Die in dieser Arbeit

gefundene Gruppierung von EBLV-Isolaten in die Cluster A - E und deren eindeutige

geographische Zuordnung lieferte jedoch Indizien, dass die Existenz charakteristischer

genetischer EBLV-Varianten mit deren Vorkommen in bestimmten geographischen Regionen

innerhalb Deutschlands assoziiert ist (Abbildung 3-1). Ähnliche Beobachtungen wurden in

den Niederlanden gemacht (VAN DER POEL et al., 2005). Da die genetische Distanz in

direktem Zusammenhang zur geographischen Entfernung der EBLV-1-Isolate untereinander

stand (Abbildung 3-7), könnte dies darauf hindeuten, dass die Virustransmission innerhalb der

Breitflügel- bzw. anderer Fledermauspopulationen viel engräumiger, d. h. innerhalb geringer

Entfernungen abläuft, als bisher angenommen wurde. Ausnahmen von dieser Beobachtung

bilden die Isolate 915 und 15730 aus den beiden Clustern A und E im Osten beziehungsweise

Nordwesten Deutschlands, deren Ursprung jeweils weit von den restlichen EBLV-Isolaten

dieser Cluster entfernt ist. Eine mögliche Erklärung für diese Abweichung könnte das

Migrationsverhalten der Reservoirspezies Eptesicus serotinus liefern. Breitflügelfledermäuse

werden generell als sehr ortstreu eingeschätzt (PETERSEN et al., 2004). Auswertungen von

Beringungsaktionen in Deutschland zeigten, dass Tiere dieser Spezies nur einen sehr geringen

Aktivitätsradius haben. In seltenen Fällen sind wurden aus Brandenburg stammenden

Breitflügelfledermäuse in Niedersachsen gefunden (HUTTERER et al., 2005).

Die Untersuchungsergebnisse belegen weiterhin einen statistisch gesicherten Zusammenhang

zwischen der Nukleotidsequenzdivergenz und dem Zeitraum, der zwischen der Isolierung

einzelner Isolate von EBLV-1a liegt (Abbildung 3-7). Allerdings weisen alle untersuchten

Isolate weniger als 10 Unterschiede innerhalb der 1356 bp der Nukleotidsequenz des N-Gens

auf, so dass zwar von einem Zusammenhang ausgegangen werden kann, die Relevanz für die

Divergenz aber als gering einzuschätzen ist. Bei ähnlichen Untersuchungen konnte

96

AMENGUAL (1997) bei Isolaten aus Deutschland und den Niederlanden keinen linearen

Zusammenhang zwischen dem Zeitpunkt der Isolierung und der Zahl an Substitutionen

herstellen.

Da die Evolution unter dem Einfluss der Zeit steht, wird die molekulare Uhr („molecular

clock theory“) auf viele phylogenetische Datensätze angewandt, obwohl die Grundannahme,

dass die Mutationsrate identisch für alle untersuchten Individuen ist, gar nicht erfüllt wird

(HOLDER und LEWIS, 2003). So ist gerade die Validität solcher auf dieser Theorie

basierenden Modelle für RNA-Viren umstritten (HOLMES, 2003). Auch reicht die zeitliche

Spanne, welche die vorliegende Studie innerhalb der Virusevolution von EBLV-1

repräsentiert, kaum aus, um Ableitungen über den Zeitpunkt der Aufspaltung bestimmter

Subtypen zu machen.

Die große Sequenzidentität innerhalb der EBLV-1a-Gruppe birgt die Gefahr in sich, dass

schon geringfügig fehlerhafte Sequenzen zu falschen Schlussfolgerungen hinsichtlich der

phylogenetischen Verwandtschaft zwischen den Isolaten führen können (CLARK und

WHITTAM, 1992). Obwohl die Sequenzierung von Virusgenom aus Originalmaterial

erstrebenswert ist, da die Wahrscheinlichkeit sehr hoch ist, dass durch die Amplifizierung

mittels RT-PCR und anschließender Sequenzierung vorrangig die Konsensussequenz der

dominanten Quasispezies nachgewiesen wird, konnte dies nur in wenigen Ausnahmen

durchgeführt werden. Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass RNA-Viren aufgrund

von hohen Mutationsraten und einer fehlenden Fehlerkorrekturfunktion (proofreading) der

Polymerase als heterogene Populationen auftreten (DOMINGO und HOLLAND, 1997;

DRAKE, 1993). Diese sogenannten Quasispezies bestehen unter konstanten

Umweltbedingungen aus einem Pool von Viren mit verwandten aber teilweise oft hohen

heterologen Genomen, wobei eine stabile Spezies hiervon dominant auftritt (KISSI et al.,

1999; MORIMOTO et al., 1998). Eine Adaptation an neue Umweltbedingungen kann somit

schnell erfolgen, da lediglich jeweils angepasste Mutanten selektiert werden müssen

(MORIMOTO et al., 1998). Durch die Zellkultur-Passage der Original-Gehirnsuspension

könnte ein genetischer Flaschenhals („genetic bottleneck“) auftreten, wodurch diejenige

Subpopulationen einen Selektionsvorteil erlangen, die am besten an das Wachstum in der

ausgewählten Zellkultur adaptiert ist und sich demzufolge in der Nukleotidsequenz von der

dominanten Linie unterscheiden (LI und ROOSSINCK, 2004).

97

Für die Existenz derartiger Quasispezies und den Einfluss der Passagierung auf die Sequenz

des Genoms gibt es für EBLV-1 kaum Belege, zumal EBLV-1 innerhalb der RNA-Viren eine

niedrige Mutationsrate aufweisen (DAVIS et al., 2005). Indiz für die Stabilität ist auch die

Tatsache, dass Isolate, die mit dem Isolat 12865 aus Hamburg aus dem Jahr 1968 identisch

sind, in verschiedenen Instituten (Institut Pasteur, Paris, Frankreich; AY062082 und VLA,

Weybridge, Vereinigtes Königreich, AY863348) unabhängig voneinander in Zellkulturen

und/oder Mäusen angezüchtet und später sequenziert worden sind, ohne dass Mutationen zu

erkennen waren. Lediglich bei Sequenzanalysen von Fledermaustollwutvirusisolaten aus

Frankreich wies ein in der Zellkultur passagiertes EBLV-1-Isolat eine durch wenige

Mutationen charakterisierte unterschiedliche Nukleotidsequenz im Vergleich zum Virus aus

dem Hirnmaterial auf (PICARD-MEYER et al., 2004a).

Die Anzucht und Passage hatte auch bei GT1 scheinbar keinen Einfluss auf die

Nukleotidsequenz. So konnte KISSI (1999) keine Mutationen nach serieller Passage eines

Fuchsvirusisolates (RABV) in Mäusen nachweisen. Auch für Zellkultur-adaptierte RABV-

Stämme ist eine ähnlich hohe genetische Stabilität nach mehreren Passagen nachgewiesen

worden (BECKERT et al., 2008; MEBATSION et al., 1996b).

Die Virusisolierung und –vermehrung von EBLVs in der Zellkultur ist zudem für die

Archivierung sowie für weitere wissenschaftliche Studien unerlässlich, da das zur Verfügung

stehende Gehirn der europäischen Fledermäuse nur ein geringes Volumen besitzt. Durch

Wiederholungs bzw. Bestätigungstests in der Routinediagnostik kann oft das gesamte

Hirnmaterial aufgebraucht sein, so dass für weiterführende Untersuchungen kaum

Möglichkeiten bestehen. Da auch die längerfristige Aufbewahrung von extrahierter Virus-

RNA durch physikalische und chemische Prozesse negativ beeinträchtigt werden kann, ist die

Virusisolierung und –vermehrung in der Zellkultur durch keine andere Methode ersetzbar.

Auch die intrakraniale Inokulation von Mäusen (Mausinokulationstest, MIT), birgt

hinsichtlich des Selektionsdruckes die gleichen Risiken und stellt nicht zuletzt aus Gründen

des Tierschutzes keine sinnvolle Alternative dar (ANON., 2008).

Die RT-PCR kann für fehlerhafte Sequenzen eine Ursache darstellen, da die verwendeten

Enzyme MMLV-reverse Transkriptase und die Taq-Polymerase eine gewisse Fehlerrate

aufweisen (BRACHO et al., 1998). Dementsprechend wird für die Sequenzierung von RNA-

98

Viren und deren Quasispezies eine DNA-Polymerase mit Fehlerkorrekturfunktion

(Proofreading) empfohlen (MALET et al., 2003). Die in dieser Studie eingesetzte

Platinum®Taq-DNA-Polymerase entspricht dieser Forderung, denn sie ist ein Gemisch

mehrerer Polymerasen, wobei die Pyrococcus-GB-D-Polymerase eine Proofreading-Funktion

besitzt. Fehler sind durch diesen Amplifikationsschritt folglich kaum zu erwarten. Durch die

direkte Sequenzierung von PCR-Produkten ohne vorheriges Klonieren wurde zudem

vermieden, dass etwaige Polymerasefehler doch zu fehlerhaften Sequenzen führen.

Eine weitere Quelle für inkorrekte Sequenzen könnte das Einlesen der Nukleotidsequenzen in

der Sequenziermaschine sein. Alle untersuchten Genabschnitte eines Isolates werden daher

sowohl vorwärts als auch rückwärts überlappend sequenziert und eingelesen, um Lesefehler

zu erkennen. Dabei werden die Nukleotidsequenzen fortlaufend mit einer Referenzsequenz

verglichen und variable Positionen gesondert notiert. Vor dem Fertigstellen wurden alle

Teilsequenzen eines Isolates zusammengeführt und verglichen, wobei bei auftretenden

Unstimmigkeiten die Sequenzierung wiederholt wurde. Gegebenenfalls wurde ein neues RT-

PCR-Produkt hergestellt, um die Sequenzierung zu optimieren. Trotz aller

Vorsichtsmassnahmen ist das Auftreten von Sequenzierfehlern nicht gänzlich auszuschließen,

kann aber bei sorgfältiger Arbeit auf etwa 1/10000 Nukleotide herabgesetzt werden, wodurch

der Einfluss dieser Fehler auf die Analyseergebnisse nicht mehr relevant ist (CLARK und

WHITTAM, 1992).

Ein Beleg für die Genauigkeit der Sequenzen ist der statistisch signifikante Zusammenhang

zwischen geographischer und genetischer Distanz der untersuchten EBLV-1 Isolate

(Abbildung 3-7 Abbildung 3-8). Beim zufälligen Auftreten von Sequenzierfehlern, die zu

falschen Nukleotidaustauschen geführt hätten, wäre eine statistisch belegte Abhängigkeit

nicht mehr nachweisbar gewesen.

Für die phylogenetische Analyse der Sequenzdaten stehen eine Vielzahl von Methoden und

Programmen zur Verfügung. Da die Neighbour-Joining-Methode bei wenigen variablen

Merkmalen Vorteile besitzt und zudem eine sehr schnelle Datenverarbeitung erlaubt

(HOLDER und LEWIS, 2003), wurde sie in diesem Fall ausgewählt. Andere Algorithmen

wurden in dieser Arbeit nicht berücksichtigt, da bei verschiedenen Studien zur Phylogenie bei

Lyssaviren festgestellt worden ist, dass sich die Topologie der phylogenetischen Bäume

99

zwischen den verwendeten Methoden nicht unterschied (METLIN et al., 2007; FRANKA et

al., 2006).

Die hohe Identität der Nukleotidsequenzen im N-Gen spiegelt sich bei den abgeleiteten

Aminosäuresequenzen wider. Innerhalb des Subtyps EBLV-1a und -1b konnten verglichen

mit dem Referenzisolat 12865 jeweils 7 variable Positionen ermittelt werden (Tabelle 3-9).

Das Clustering, welches mit den AS-Sequenzen des N-Gens gefunden wurde, korreliert mit

der Einteilung auf Basis der N-Gen-Sequenzen nur bedingt (Abbildung 3-24). Während die

Isolate 976, 5250, 13401, 13428 und 13438 aus dem Cluster E einen gemeinsamen

Aminosäureaustausch aufweisen und eine Extragruppe darstellen, ist die abgeleitete AS-

Sequenz der Mehrzahl der EBLV-1a-Isolate im Vergleich zur Referenzsequenz (Isolat 12865)

identisch. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass es innerhalb der zirkulierenden EBLV-1a-

Viruspopulation zwar zu Mutationen kommt, die sich in der Nukleotidsequenz und somit

auch in der Phylogenie manifestieren und geographisch zugeordnet werden können, allerdings

meist aus stillen Mutationen bestehen.

Vielmehr deutet die relativ geringe Rate von nicht-synonymen Mutationen darauf hin, dass

die Proteine einem starken Selektionsdruck ausgesetzt sind. Zudem befinden sich die

Aminsäureaustausche ausnahmslos an Positionen (Tabelle 3-9), bei denen ein Einfluss auf die

antigenen Eigenschaften bisher nicht nachgewiesen wurden (Siehe Absatz 2.5.1). Folglich

dürften sich die EBLV-1a Isolate der Cluster A-E kaum in ihren biologischen Eigenschaften

unterscheiden.

Vergleichende Studien an RABV-Isolaten zeigten, dass der N-P-nicht-translatierte Bereich im

Gegensatz zum N-Gen variabler ist (KISSI et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit konnten

jedoch bei den untersuchten Isolten nur wenige Sequenzunterschiede in diesem Bereich

identifiziert werden. Zwar war die Analyse dieses Genabschnittes ausreichend, um zwischen

den Subtypen EBLV-1a und -1b zu differenzieren, jedoch erlaubte die phylogenetische

Analyse mit den 90 nt-langen Sequenzen nicht die Differenzierung in die Cluster A-E wie bei

Verwendung der Sequenzen des N-Gens (Abbildung 3-19). Innerhalb des Subtyps-1a konnten

mit den Sequenzen des N-P-nicht-translatierten Bereiches nur wenige Isolate in separate

Cluster eingeordnet werden. Diese entstammen ausnahmslos dem mit den N-Gensequenzen

indentifizierten A1-Cluster.

100

Auch in der phylogenetischen Analyse mit Sequenzen des G-L-nicht-translatierten Bereiches

konnte kein so feines Clustering gefunden werden wie mit den eher konservierten N-

Gensequenzen. Die Ergebnisse widersprechen damit den Erwartungen, wonach dieser

Genabschnitt besonders für phylogenetische Untersuchungen bei geringen

Sequenzvariationen, wie für das RABV gezeigt (COETZEE und NEL, 2007; NEL et al.,

2005; PAEZ et al., 2003), geeignet sei. Ein Vorteil der GL-Region gegenüber anderen

Genabschnitten für phylogenetische Studien kann somit für Lyssaviren des Genotyps EBLV-1

nicht bestätigt werden. Dieser Bereich ist als Pseudogen ψ (psi) bezeichnet worden, da beim

Pasteur-Virusstamm Strukturen entdeckt worden waren, welche auf frühere Start- und

Stopsignale hindeuteten (TORDO et al., 1986b). Neueren Untersuchungen zufolge handelt es

sich aber hierbei um einen 3’-nicht-kodierenden Bereich (RAVKOV et al., 1995).

Die Ursache für die geringere Variabilität der G-L-Region bei EBLV-1 könnte darin

begründet liegen, dass die virale RNA in diesem Bereich, obwohl nicht kodierend, doch über

die Bildung von Sekundärstrukturen Einfluss auf die Transkription und Translation des

nachfolgenden Polymerasegens hat, oder als Bindungsstelle für zelluläre Signalpeptide

fungiert, wie dies für andere codierende Genbereiche bereits beschrieben wurde (BLONDEL

et al., 2002; RAUX et al., 2000). Bisher ist für diesen Abschnitt nur nachgewiesen, dass die

relativ große IGR die Transkription des nachfolgenden Polymerasegens dahingehend

herabreguliert, dass die Polymerase das am wenigsten transkribierte Protein des Virus

darstellt (FINKE et al., 2000). Die Tatsache, dass die Transkriptionsprozesse bei Lyssaviren

nicht unabhängig voneinander ablaufen, sondern sich gegenseitig beeinflussen und

aufeinander aufbauen, hat zur Folge, dass Mutationen eines einzelnen Motivs Veränderungen

in der Virustranskription und –replikation sowie der Pathogenität nach sich zieht (WU et al.,

2007). Da Mutationen in diesem Abschnitt somit auch die Eigenschaften des Virus

beeinflussen, wäre eine unabhängige Evolution dieses Abschnitts nicht möglich und er verhält

sich ähnlich stabil wie die anderen untersuchten Abschnitte. Die große Stabilität des EBLV-1-

Genoms lässt darauf schliessen, dass das Virus optimal an die Zirkulation innerhalb der

Reservoirspezies angepasst ist und die meisten Mutationen, die auftreten, negativ selektiert

werden (VOS et al., 2007).

101

Während es für andere Viren, wie beispielsweise für das der Klassischen Schweinepest

(KSPV), festlegte Konventionen gibt, um Isolate eindeutig mittels Sequenzanalyse

bestimmter Genomabschnitte zu typisieren (GREISER-WILKE et al., 2006), ist eine

Standardisierung bei Lyssaviren bisher nicht erfolgt. Einen Quasi-Standard für Lyssaviren

stellt die Sequenzierung des Genomabschnittes dar, der für die ersten 400 nt des N-Proteins

kodiert (BROOKES et al., 2004). Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte, ist

eine Differenzierung zwischen den Subtypen 1a und 1b mit jedem untersuchten Genabschnitt

möglich. Aufgrund der relativ großen Unterschiede zwischen den Subtypen könnten auch sehr

kurze Genabschnitte und vermutlich sogar eine subtypspezifische Sonde bei der realtime-RT-

PCR für eine solche Unterscheidung ausreichen.

Um epidemiologische Zusammenhänge zur Fledermaustollwut in Deutschland und Europa

herauszustellen, könnte die Analyse des gesamten N-Gens wertvolle Ergebnisse liefern. So

war bei der phylogenetischen Analyse mit einem nur 331 nt großen Fragment eine

geographische Clusterung deutscher Isolate vermutet worden, konnte jedoch nicht eindeutig

belegt werden (MÜLLER et al., 2007). Zu ähnlichen Ergebnissen führte eine Studie auf der

Basis eines 400 nt Fragments des N-Gens (JOHNSON et al., 2002), die lediglich eine

Unterscheidung in die Subtypen 1a und 1b ermöglichte. Auch durch die Analyse der

Sequenzen des kompletten Glykoprotein-Gens war keine weitere Differenzierung möglich

(DAVIS et al., 2005). Möglicherweise sind auch die Sequenzen anderer Genabschnitte zur

Charakterisierung nicht besser geeignet (WU et al., 2007). Wie aber die vorliegende Studie

zeigt, können Untersuchungen einzelner, relativ langer Genabschnitte wichtige Beiträge zur

Erreger-Wirt-Infektionskette leisten.

Die bestätigte große Stabilität des N-Gens innerhalb der EBLV-1-Isolate hat zur Konsequenz,

dass phylogenetische Analysen nur geringe Konfidenzwerte (Bootstrap-Werte) liefern. Die

Verzweigungen stellen aber trotzdem die verwandtschaftlichen Verhältnisse repräsentativ dar,

da schon wenige Nukleotidaustausche einen Entwicklungsschritt ausmachen können.

Der nicht-translatierte Bereich zwischen N- und P-Gen besteht aus ca. 90 Nukleotiden. Bei

insgesamt vier Isolaten wurden Abweichungen in Form von Insertionen in diesem Bereich

festgestellt. Die zusätzlichen Nukleotide sind Insertionen im Bereich des Transkriptions-

Termination/Polyadenylationssignals (Abbildung 3-20). Die Isolate 3132 und 5778 aus der

EBLV-1a-Gruppe wiesen eine singuläre A-Insertion auf. Beide Isolate entstammen

102

phylogenetisch dem Cluster A1 und besitzen im N-Gen identische Sequenzen.

Interessanterweise fehlte bei den weiteren Mitgliedern dieses Clusters A1 (5782, 5776) diese

Insertion. Im Gegensatz dazu hatten die Isolate 5006 und 15771 aus der EBLV-1b-Gruppe

eine 6-nt-Insertion auf (Abbildung 3-18). Diese 6-nt-Insertion war auch bei einem EBLV-1b

Isolat aus Frankreich vorhanden (JOHNSON et al., 2007). Die drei Isolate, die diese Insertion

aufwiesen, wurden in räumlicher Nähe zueinander gefunden, was eine Zirkulation dieser

Virusvariante in einem räumlich abgegrenzten Gebiet im Grenzbereich zwischen Frankreich

und Deutschland nahelegt. Die Tatsache, dass diese Insertion bei in einem dritten EBLV-1b-

Isolat aus dem Saarland (13403) aus dem Jahr 1987 nicht nachgewiesen werden konnte, weist

auf eine relativ junge Veränderung des Genoms, da zwischen der ersten Isolierung (1989) und

dem letzten Nachweis (2006) einer solchen Variante 17 Jahre vergangen sind (JOHNSON et

al., 2007). Die Entstehung dieser Insertionen ist ungeklärt. Möglicherweise spielt ein so

genannter „Stotter-Mechanismus" der RNA-abhängigen RNA-Polymerase bei der

Polyadenylation viraler mRNA-Moleküle dabei eine wichtige Rolle (KOLAKOFSKY et al.,

2005). Obwohl dieses „Stottern“ normalerweise nur bei der Transkription auftritt, ist es

möglich, dass dies auch bei der Virusreplikation durch die RNA-abhängige RNA-Polymerase

erfolgte.

Der GL-nicht-translatierte Bereich umfasste bei allen untersuchten EBLV-1-Isolaten 560 nt

und entsprach damit dem von MARSTON (2007) angegebenen Werten. Eine Ausnahme

bildete Isolat 5782, bei dem dieser Bereich nur 525 nt hatte. Dies ist auf eine Deletion von

35 nt zurückzuführen, zwischen Positionen 5319-5353 des Genoms (Abbildung 3-20). Auch

diese Deletion konnte bei anderen Isolaten, die ansonsten identische Nukleotidsequenzen

hatten, nicht nachgewiesen werden.

Derart auffällige Sequenzunterschiede sind bisher, mit Ausnahme der 6 nt-Insertion im N-P-

Bereich (JOHNSON et al., 2007), bei Lyssaviren nicht beschrieben worden. Über die

Bedeutung kann nur spekuliert werden. Dass diese Veränderungen keinen negativen Einfluss

auf die Fitness des Virus haben, wird dadurch unterstützt, dass Isolate mit dieser Insertion im

N-P-Bereich mindestens 17 Jahre in der Wirtspopulation zirkulierten. Simulationen zur

dreidimensionalen Struktur dieses Abschnitts mit und ohne Insertion zeigten, dass beide stem-

loop-Strukturen ausbilden, die typisch für virale Polyadenylationssignale sind. Die Position

der Insertionen an der Polyadenylierungsstelle des N-Gens könnte ein Hinweis auf eine

103

mögliche Beeinflussung der Transkription des N-Gens sein, die Folgen für die virale

Eigenschaften, die Virus-Wirt-Interaktion oder die Virulenz der EBLV-Isolate haben könnte.

Gleiches gilt für die Deletion im GL-nicht-translierten Bereich. Die Länge des nicht-

translatierten Abschnitts kann die Transkription des nachfolgenden L-Gens beeinflussen

(FINKE et al., 2000). Je länger dieser Abschnitt ist, desto mehr wird die Transkription des L-

Gens reduziert, was wiederum eine verringerte Expression und erhöhte Pathogenität zur Folge

hat (MARSTON et al., 2007). Demnach könnte die Verkürzung des GL-nicht-translatierter

Bereich um 35 nt die Pathogenität des betreffenden EBLV-Isolates herabsetzen. Bei

Flaviviren beispielsweise war ein Dengue-Virusstammes durch eine 30 nt-Deletion in der 3’-

nicht-translatierten Region attenuiert (TROYER et al., 2001). Eine geringere Pathogenität von

EBLVs könnte bei Fledermäusen, die möglicherweise anders als bei anderen Säugetieren eher

geringe Kontaktraten zwischen infizierten und empfänglichen Tieren aufweisen, die

Persistenz derartiger Virusvarianten innerhalb der Population fördern und somit vorteilhaft für

deren Verbreitung sein.

Um einen möglichen Einfluss der beobachteten Insertionen bzw. Deletionen auf die

Viruseigenschaften zu untersuchen, könnten zunächst in vitro-Versuche durchgeführt werden.

Die Wachstumskinetik von Virusvarianten mit und ohne Insertionen in Zellkulturen könnte

vergleichend untersucht werden. Darüber hinaus eröffnet die Methode der „reverse genetics“

die Möglichkeit, die Insertionen bzw Deletionen in bereits bestehende Genome von „back

bone“ Stämmen wie beispielsweise von SAD-L16-Stamm an den entsprechenden Stellen zu

inkorporieren (FINKE et al., 2000), und so die Auswirkungen auf die Transkription und

Translation in Zellkulturen genauer zu untersuchen (FABER et al., 2004). Eine anschließende

Studie mit auf diese Weise genetisch veränderten Viren in Mäusen könnte Hinweise auf eine

mögliche Auswirkung der genetischen Veränderungen in Form der Insertionen bzw.

Deletionen auf die Pathogenität liefern (MORIMOTO et al., 2000). Die Mutationen könnten

auch als spezifische Marker herangezogen werden, um die Zirkulation und

Ausbreitungstendenz von bestimmten EBLV-Virusvarianten in der Fledermauspopulation zu

verfolgen.

Von den mehr als 32 verschiedenen Fledermausspezies Europas kommen 24 in Deutschland

vor (DIETZ et al., 2007). Auf die Breitflügelfledermaus (E. serotinus) entfallen dabei 92.5 %

104

aller Fledermaustollwutfälle in Deutschland, bei denen eine Artbestimmung des Wirtes

vorgenommen wurde (MÜLLER et al., 2007). In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals

Virusisolate, die im Rahmen einer retrospektiven Studie am NRL aus dem Braunen Langohr

(Plecotus auritus), der Fransenfledermaus (Pipistrellus nathusii) und der Zwergfledermaus

(Pipistrellus pipistrellus) isoliert wurden, näher untersucht. Zwar sind auch in anderen

europäischen Ländern EBLV-Infektionen bei anderen Fledermausspezies nachgewiesen

worden (KING et al., 2004), waren mit Ausnahme weniger Isolate aber nicht Bestandteil von

molekularbiologischen Charakterisierungen. Bei einer tollwutpositiven Zwergfledermaus aus

Frankreich war eine RABV-Variante nachgewiesen worden, was höchstwahrscheinlich eine

Laborkontamination war (PICARD-MEYER et al., 2004b). Die im Rahmen dieser Arbeit

gefundene große Übereinstimmung dieser Sequenzen zu denen anderer Isolate, welche aus

Breitflügelfledermäusen (Eptesicus serotinus) oder aus nicht identifizierten Fledermäusen

isoliert wurden, und die Eingruppierung in die geographischen Cluster sind Indizien dafür,

dass es sich in diesen Fällen um spill-over-Infektionen aus der Reservoirspezies handelt. So

können beispielsweise die Isolate aus der Fransen- und der Zwergfledermaus dem Cluster C

zugeordnet werden (Abbildung 3-16). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in

Deutschland keine Fledermausspezies-spezifische EBLV-1-Varianten vorkommen. Obwohl

etliche andere Spezies im Rahmen der Routineuntersuchung untersucht worden sind, ist die

Spezies oftmals nicht bestimmt oder das Ergebnis nicht übermittelt worden, was eine

Bestätigung dieser Hypothese erschwert.

Aufgrund ihres seltenen Vorkommens und ihrer ökologischen Bedeutung stehen alle

Fledermausarten in Deutschland und Europa unter besonderem Schutz (ANON. 2005), so

dass sich die Tollwutsurveillance bei Fledermäusen nur auf wenige frischtot gefundene Tiere

beschränkt. Dadurch bleibt der Nachweis von EBLV-Infektionen häufig ein Zufallsbefund.

Im Gegensatz zur Tatsache, dass die zwei in Europa vorkommenden

Fledermaustollwutviusspezies auf wenige Reservoirspezies, Eptesicus serotinus (EBLV-1)

und Myotis daubentonii und Myotis dasycneme (EBLV-2) beschränkt zu sein scheinen, ist bei

allen in Nordamerika beheimateten Fledermausarten Tollwut nachgewiesen worden (DAVIS

et al., 2006). Phylogenetische Untersuchungen von Tollwutviren, die auf dem

nordamerikanischen Kontinent vorkommen, konnten zudem belegen, dass die RABV-

105

Varianten bei Fledermäusen nicht nur von denen terrestrischer Säugetiere deutlich

abzugrenzen sind (DAVIS et al., 2006), sondern dass sie sich auch bei verschiedener

Fledermausarten unterscheiden (NADIN-DAVIS et al., 2001). Aber auch dort sind spill-over

Infektionen von Varianten des RABV zwischen verschiedenen Fledermausarten beobachtet

worden (NADIN-DAVIS et al., 2001). Ein weiterer signifikanter Unterschied zwischen

Nordamerika und Europa ist die Zahl der festgestellten Fledermaustollwutfälle. Während in

Europa im Jahr 2006 nur bei 34 Fledermäusen Tollwut nachgewiesen wurden (ANON.,

2006), waren es im gleichen Jahr allein 1692 Fledermäuse in den Vereinigten Staaten

(BLANTON et al., 2007). Ursache hierfür könnten die Unterschiede in der

Fledermaustollwutuntersuchung, die Verbreitung und Dichte der verschiedenen

Fledermausarten und nicht zuletzt die unterschiedlichen Eigenschaften der verschiedenen

Lyssavirusgenotypen sein. Das seltene Auftreten von EBLV in Europa ist vermutlich auf die

Anpassung des Virus an seine Reservoirspezies zurückzuführen, die sowohl die Virulenz als

auch die Fähigkeit zur Übertragung auf andere Spezies vermindert (VOS et al., 2007a).

EBLV-2 wurde erstmals 1984 in Finnland nachgewiesen, nachdem ein schweizer Biologe an

einer Tollwutinfektion verstarb (LUMIO et al., 1986). Es gibt allerdings keine weiteren

Hinweise auf Fledermaustollwut in diesem Land, so dass davon ausgegangen wird, dass der

Biologe durch einen Fledermausbiss in der Schweiz infiziert wurde (KING et al., 2004).

Bisher ist EBLV-2 bei Fledermäusen nur in der Schweiz, den Niederlanden und dem

Vereinigten Königreich nachgewiesen worden (HARRIS et al., 2007). Die Niederlande waren

dabei bislang das einzige Land, in welchem sowohl EBLV-1 als auch EBLV-2-Infektionen in

der Fledermauspopulation festgestellt werden konnten (VAN DER POEL et al., 2005).

Das im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Virusisolat aus einer Wasserfledermaus (Myotis

daubentonii) aus dem Kreis Biberach stellt den Erstnachweis dieses Genotyps (GT6) in

Deutschland dar. Entsprechend war aus epidemiologischer Sicht die Notwendigkeit gegeben,

die morphologische Artbestimmung der Wirtsspezies genetisch eindeutig zu verifizieren.

Frühere Berichte, wonach bereits 1986 eine Wasserfledermaus (Myotis daubentonii) aus

Lüneburg mit EBLV-2 ifiziert war (JOHNSON et al., 2003), können durch Nachverfolgung

der Dokumentation am NRL nicht bestätigt werden. Bei einer in der Genbank veröffentlichten

Sequenz eines EBLV-2-Isolates (AY212117) mit der zusätzlichen Information, dass das

106

Ursprungsland Deutschland ist, handelt es sich offensichtlich um ein Isolat aus dem Archiv in

Tübingen, welches zur weiteren Charakterisierung an andere Labore übersandt wurde.

Fälschlicherweise ist dann dem Isolat Deutschland als Ursprungsland zugeordnet worden.

Leider ist für Lyssavirusisolate keine einheitliche Nomenklatur etabliert, so dass identische

Isolate in verschiedenen Tollwutlabors unter anderen Labornummern vorliegen, und eine

Identifizierung und die Zuordnung epidemiologisch relevanter Daten, wie der geographische

Ursprung, im Einzelfall schwierig sein kann.

Dass EBLV-2 in Deutschland nicht bereits früher nachgewiesen wurde, obwohl in den

Nachbarländern Schweiz und den Niederlanden EBLV-2-Fälle auftraten, war bereits

Gegenstand von Diskussionen (MÜLLER et al., 2007; VOS et al., 2007b). Die geographische

Nähe des Fundortes zur Schweiz (ca. 60 km) und der Zusammenhang zu dem dortigen

Vorkommen von EBLV-2 wird durch die phylogenetische Analyse untermauert, die zeigt,

dass das deutsche EBLV-2-Isolat die höchste Identität zu schweizer Isolaten aufweist.

Obwohl genaue Daten über die Verbreitung und Migration von Wasserfledermäusen in dieser

Region fehlen, scheinen Kontaktmöglichkeiten zwischen Fledermäusen aus dem

süddeutschen Raum und der benachbarten Schweiz gegeben zu sein. Zwischen ihren

Sommer- und Winterquartieren legen Wasserfledermäuse Entfernungen zwischen in der

Regel 100 - 150 km zurück (HUTTERER et al., 2005).

Eine Ursache für die unterschiedlichen Fallzahlen von EBLV-1 und 2 in Europa könnten die

verschiedenen Reservoirspezies für diese beiden Genotypen sein. Die Breitflügelfledermaus

(Eptesicus serotinus) ist weit verbreitet und eine Fledermausart, die häufig in der Nähe von

Siedlungen angetroffen wird. EBLV-2 dagegen scheint mehr mit der Wasserfledermaus bzw.

der Teichfledermaus (Myotis daubentonii und Myotis dascyneme) assoziiert zu sein (FOOKS

et al., 2003).

Obwohl die Wasserfledermaus in Deutschland zu den häufigeren Arten zählt (PETERSEN et

al., 2004), sind bisher nur wenige Tiere auf Tollwut untersucht worden. In einer

retrospektiven Studie zur Fledermaustollwut in Deutschland wurden zwischen 1997 und 2007

mehr als 1800 Fledermäuse untersucht. Davon waren 45 Wasserfledermäuse. Lediglich eine

107

Teichfledermaus ist bisher untersucht worden. Alle Ergebnisse in diesem Zeitraum waren

negativ1.

Studien aus dem Vereinigten Königreich zeigten, dass ca. 2 % der Wasserfledermäuse

neutralisierende Antikörper gegen EBLV-2 besitzen und von 113 untersuchten Tieren sechs

EBLV-2 positiv waren (HARRIS et al., 2006). Dagegen wurden nach 1997 bei der

Fledermaustollwutüberwachung in den Niederlanden keine weiteren Fälle von EBLV-2

festgestellt (VAN DER POEL et al., 2005). Interessanterweise wurden alle Fledermäuse in

den Niederlanden, die EBLV-2 positiv waren, als Teichfledermäuse (Myotis dasycneme)

identifiziert, wogegen die restlichen EBLV-2 Fälle in Europa bei Wasserfledermäusen

(Myotis daubentonii) oder bei spill-over-Infektionen im Menschen gefunden wurden.

Phylogenetisch stellen die aus Myotis dasycneme isolierten Viren eine separate Untergruppe

dar. Aufgrund der begrenzten Anzahl der positiven Fälle und den wenigen Isolaten kann

weder die Fledermausspezies, noch der geographische Ursprung als Ursache für diese

Gruppierung bestätigt oder ausgeschlossen werden. Weiterhin wurde vermutet, dass die

Adaptation an die Reservoirspezies die Virulenz von EBLV vermindern könnte, so dass

weniger Fälle beobachtet werden (VOS et al., 2007b; VAN DER POEL et al., 2005). Vor dem

Hintergrund der Untersuchungszahlen und der geringen Inzidenz von EBLV-2 kann eine

weitaus größere Verbreitung für EBLV-2 in Europa angenommen werden.

1 Persönliche Mitteilung Dr. T. Müller, am 03.03.2008

108

4.1 Schlussfolgerungen

Die partielle Sequenzierung von Genomfragmenten ist eine geeignete Methode um EBLV

Isolate näher zu charakterisieren. Die zuvor bei EBLV-1 beobachtete hohe Sequenzidentität

konnte in dieser Arbeit bei Isolaten aus Deutschland bestätigt werden. Durch die

phylogenetische Analyse des kompletten N-Gens in Kombination mit Daten zum

geographischen Ursprung wurden Isolate Clustern zugeordnet, die teilweise abgegrenzte

Gebiete umfassen. Dies wird als Hinweis darauf gewertet, dass die Virustransmission zumeist

innerhalb eines begrenzten Gebietes erfolgt und mit der Populations- und Migrationsbiologie

der Reservoirspezies Eptesicus serotinus im Zusammenhang steht.

Neben der Sequenzierung und dem Vergleich des N-Gens führten auch Analysen der nicht-

translatierten Genabschnitte im N-P und G-L Übergangsbereich zu einer Unterscheidung der

EBLV-Isolate aus Deutschland in die beiden Subtypen 1a und 1b. Zudem zeigten diese

Abschnitte bisher bei EBLV nicht beobachtete Variationen Länge des Genoms. So konnten

bei einzelnen Isolaten Insertionen in NP-Bereich bzw. eine 35 nt-Deletion im GL-Bereich

nachgewiesen werden.

Der Erstnachweis von EBLV-2 in Deutschland zeigt, dass Aufgrund der geringen

Untersuchungszahlen kaum Aussagen über das wirkliche Verbreitungsgebiet dieses Genotyps

in Deutschland und in Europa gemacht werden können.

109

4.2 Ausblick

Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern Hinweise auf das Auftreten regionaler Varianten

innerhalb der EBLV-1a Population. Um dies zu bestätigen, sollten alle EBLV-Isolate des

Virusarchivs am NRL nach diesem Schema typisiert und analysiert werden. Um

epidemiologische Auswertungen zu machen und um die Anforderungen der Konvention

EUROBATS zu erfüllen (ANON. 2006), sind detaillierte Angaben zum Fundort, Jahr der

Isolierung und betroffene Spezies unerlässlich. Auch könnten vergleichend zusätzliche Isolate

aus den europäischen Nachbarländern hinzugezogen werden. Obwohl sich das N-Gen als

geeignet gezeigt hat, die EBLV-1 Isolate zu typisieren, sollten weitere Genabschnitte in

gleicher Weise untersucht werden. So könnten Untersuchung des P-Gens und des G-Gens im

Vergleich zu RABVwichtige Hinweise auf Pathogenitätsmarker liefern.

Eine Schwierigkeit bei der Interpretation der Ergebnisse ist die Tatsache, dass in der

Mehrzahl positiv untersuchter Fledermäuse die genaue Spezies nicht bestimmt wurde

(MÜLLER et al., 2007). Somit sind Aussagen zum Vorkommen von EBLV-1 in bestimmten

Spezies vorsichtig zu machen. Eine Möglichkeit, dies in Zukunft zu verbessern, stellt die

Speziesbestimmung mittels partieller Sequenzierung des Cytochrom B-Gens, wie für den

EBLV-2 Fall beschrieben, dar (HARRIS et al., 2008). Die Differenzierung der Spezies durch

genetische Analyse stellt hier ein modernes Instrument dar, diese Informationen zu

generieren, auch wenn beispielesweise der Tierkörper für weitere Untersuchungen nicht mehr

zur Verfügbar steht. Mit der zunehmenden Zahl von in internationalen Genbanken

eingestellten Sequenzen von Wirtstieren kann es zukünftig möglich sein, die Phylogenie von

EBLV-1 und -2 mit denen der Fledermäuse zu vergleichen. Dies könnte weitere Hinweise auf

die Mechanismen der Transmission von EBLV in Fledermauspopulationen liefern.

Die epidemiologische Aussagekraft der phylogenetischen Untersuchungen kann durch die

Einbeziehung weiterer Daten, wie detaillierte Verbreitungskarten von Fledermausspezies,

untermauert werden. Über die genaue Verbreitung der einzelnen Fledermausspezies in

Deutschland liegen bisweilen nur fragmentierte Daten vor. In Kooperation mit den

Fledermaussachverständigen könnten Häufungen bei Fledermaustollwut mit dem

110

Vorhandensein von Wochenstubenkolonien und Winterquartieren im Zusammenhang

analysiert werden.

Welche Rolle die Variabilität der nicht-translatierten Bereiche auf die Eigenschaften des

Virus hat, ist nicht geklärt. Um dies näher zu beleuchten, könnte die Wachstumskinetik in

Zellkulturen vergleichend untersucht werden. Auch ist es möglich, über reverse genetics

spezifische Virusmutanten zu erzeugen und in Versuchen deren Eigenschaften zu studieren.

Die große Anzahl der Sequenzen für das N-Gen wird es zukünftig erlauben, auf dieser Basis

real-time RT-PCR-Assays für EBLV-1 zu entwickeln, um die Diagnostik sowohl in Bezug

auf Sensitivität als auch auf Spezifität zu verbessern.

111

5 ZUSAMMENFASSUNG

Conrad Martin Freuling: Genetische Charakterisierung von

Fledermaustollwutvirusisolaten aus Deutschland

Bisherige Untersuchungen von deutschen Fledermaustollwutvirusisolaten wiesen

ausnahmslos European Bat Lyssavirus Typ 1 (EBLV-1) nach. Mithilfe eines Raster-basierten

Ansatzes wurden 48 Fledermaustollwutvirusisolate aus Deutschland repräsentativ ausgewählt

und durch die direkte Sequenzierung des N-Gens, und der nicht-translatierte Bereiche

zwischen dem N und P-Gen (NP-NTR) bzw. dem G und L-Gen (GL-NTR) vergleichend

charakterisiert. Die Ergebnisse bestätigten vorangegangene Studien an EBLV-1 Isolaten,

wonach die Sequenzen innerhalb dieses Genotyps eine hohe Identität aufweisen, was auf eine

große Stabilität des Genoms bei der Viruszirkulation schliessen lässt. Es konnte jedoch

erstmals gezeigt werden, dass bestimmte genetische Cluster der EBLV-1 Viruspopulation in

Deutschland auch räumlich gehäuft auftreten. Alle drei untersuchten Genabschnitte konnten

dabei zur Unterscheidung in die beiden zirkulierenden Subtypen 1a und 1b genutzt werden.

Die größtmögliche Differenzierung wurde bei Verwendung der N-Gensequenzen erreicht.

Anders als von RABV erwartet, war die Variabilität der GL-NTR nicht ausreichend für

detaillierte phylogenetische Analysen. Interessanterweise konnten im NP-NTR bei zwei

Isolaten eine 6 nt-Insertion bzw. bei einem Isolat eine 2 nt-Insertion nachgewiesen werden.

Zudem wurde bei einem Isolat eine Deletion von 35 nt im GL-NTR festgestellt. Die Folgen

dieser Mutationen auf virale Eigenschaften sind Gegenstand weiterer Untersuchungen, da

diese bei Lyssaviren zuvor noch nicht beschrieben worden waren.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals der Nachweis von EBLV-2 bei einer

Wasserfledermaus im Süden Deutschland erbracht. Der Vergleich der Sequenzen von 400 nt

des N-Gens zeigt hohe Identität mit Isolaten aus der angrenzenden Schweiz und gibt

Hinweise auf einen epidemiologischen Zusammenhang im Infektionsgeschehen. Um die

betroffene Fledermausspezies eindeutig identifizieren zu können, wurde eine partielle

Sequenzierung des cytochrom-B-Gens durchgeführt, und in die Fledermaustollwutdiagnostik

am NRL etabliert.

112

113

6 SUMMARY

Conrad Martin Freuling: Genetic characterization of bat lyssaviruses isolates from

Germany

Previous studies on German EBLV isolates confirmed the presence of EBLV-1, and a

preliminary epidemiological study indicated a distinct geographical distribution of EBLV-1 in

Germany. Using a random grid sampling procedure based on GIS, 48 isolates were selected to

further investigate the spatial and temporal distribution of EBLV-1 variants in Germany. The

nucleoprotein-gene (N), the nucleoprotein-phosphoprotein spanning untranslated region (NP-

UTR) and the UTR between G and L-gene of each isolate were sequenced using direct cycle

sequencing. Results of the subsequent phylogenetic analysis of the N-gene confirmed

previous studies on European EBLVs, showing a high sequence identity among German

EBLV-1a isolates. This indicates genomic stability of the virus during the transmission cycle.

However, when combining the data sets for geographic origin and phylogeny, clustering of

isolates became evident.

The gene fragments studied were shown to be suitable for distinguishing between the

circulating EBLV subtypes 1a and 1b. The best differentiation, however, was seen when

analysing sequences of the complete N-gene. The variability of the GL-region was not

sufficient for the discrimination of clusters, an unexpected finding in respect to studies on

RABV. Interestingly, 6 bp insertions in two isolates as well as a single nucleotide insertion in

a different isolate were detected in the N-P UTR. Within the UTR between G and L-gene one

isolate showed a 35 pb deletion. The effect of those changes on viral properties remains

elusive as such mutations had not been described for lyssaviruses before.

For the first time the presence of EBLV-2 was confirmed in a daubenton’s bat from the South

of Germany. Partial sequencing of the N-gene revealed a high degree of identity with other

EBLV-2 isolates from Switzerland, suggesting epidemiological association. To identify the

species of the bat involved, sequencing of the partial cytB-gene proved very effective , and

the method was established in the NRL.

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VERORDNUNGEN 2005 Verordnung zum Schutz wild lebender Tier- und Pflanzenarten (Bundesartenschutzverordnung -BArtSchV) vom 16.02.2005. Bundesgesetzblatt I , 258, 896.

136

8 ANHANG

8.1 Verwendete Isolate Labornummer Jahr Spezies Ort Kreis Bundesland

915 1996 E. serotinus Osnabrück Osnabrück Niedersachsen 933 1993 E. serotinus Oldendorf Stade Niedersachsen 976 1992 P. nathusii Marienhafen Aurich Niedersachsen 992 1998 E. serotinus Moordorf/Südbrookmer Aurich Niedersachsen

2976 1999 ? Hassbergen Nienburg a.d. Wese Niedersachsen 3131 1999 ? Winsen (Luhe) Harburg Niedersachsen 3132 1999 E. serotinus Jena,Stadt/THÜ Jena Stadt Thüringen 4644 1997 ? Plate Schwerin Meck-Vorpommern 4895 2000 ? Freyburg Burgenlandkreis Sachsen-Anhalt 5006 2000 ? Wadgassen Saarlouis Saarland 5185 2000 E. serotinus Hitzhausen Osnabrück Niedersachsen 5226 1996 P. auritus Lingen Emsland Niedersachsen 5248 2000 E. serotinus Bremen Grohn Bremen Bremen 5250 1994 P. pipistrellus Ricklinger Holz Hannover Niedersachsen 5254 2000 E. serotinus Osterode Osterode Niedersachsen 5776 2001 ? Halle/Saale,St. Halle, Stadt Sachsen-Anhalt 5778 2001 ? Bernburg (Saale Leipziger Land Sachsen-Anhalt 5782 2001 ? Horburg-Maßlau Merseburg-Querfurt Sachsen-Anhalt 6795 2002 E. serotinus Luckenwalde Teltow-Fläming Brandenburg 8624 2003 E. serotinus Osterholz-Schar Osterholz Niedersachsen 10924 2004 ? Ostrhauderfehn Leer Niedersachsen 10925 2004 ? Emden,Stadt Leer Niedersachsen 10927 2004 ? Hesel/NDS Leer Niedersachsen 11647 2005 E. serotinus Kyritz Ostprignitz-Ruppin Brandenburg 12865 1968 ? Hamburg Hamburg Hamburg 12868 1970 ? Stade Stade Niedersachsen 12871 1983 ? Bremerhaven Bremerhaven Bremen 13394 1978 ? Klixbüll Nordfriesland Schleswig-Holstein 13401 1986 ? Cuxhaven Cuxhaven Niedersachsen 13403 1986 ? Neunkirchen Neunkirchen Saarland 13406 1985 E. serotinus Nienburg Nienburg Niedersachsen 13407 1985 E. serotinus Rodenberg/Deister Grafschaft Schaumb Niedersachsen 13408 1986 E. serotinus Langwedel-Etelsen Verden Niedersachsen 13409 1986 E. serotinus Negenborn Holzminden Niedersachsen 13414 1988 E. serotinus Bad Bramstedt Segeberg Schleswig-Holstein 13415 1988 E. serotinus Gleschendorf Ostholstein Schleswig-Holstein 13416 1988 E. serotinus Lübeck Stadt Lübeck Schleswig-Holstein 13418 1988 E. serotinus Tetenhusen Schleswig-Flensbur Schleswig-Holstein 13422 1989 ? Reher Steinburg Schleswig-Holstein 13423 1989 E. serotinus Berlin Sadt Berlin Berlin 13428 1990 ? Aurich Aurich Niedersachsen 13438 1990 ? Harsewinkel Gütersloh Nordrhein-Westfalen 13439 1990 ? Itzehoe Steinburg Schleswig-Holstein 13445 1996 E. serotinus Hinte Aurich Niedersachsen 13450 1998 E. serotinus Berlin Steglitz Berlin Berlin 13452 1999 E. serotinus Borna Borna Sachsen 13453 1999 E. serotinus Riepsdorf Ostholstein Schleswig-Holstein 15548 2006 E. serotinus Rostock Rostock Mecklenburg-Vorpommern 15571 2006 E. serotinus Wadern Merzig Saarland 15730 2004 E. serotinus Hartmannsdorf Oberspreewald-Laus Brandenburg

137

8.2 Software

BaseImageIR™Version 02.31, (MWG, Ebersberg, Deutschland)

Lasergene 6.0 package (DNA Star, Madison, USA) mit den Programmen SeqMan, MegAlign,

PrimerSelect, EditSeq

MEGA: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Software Version 4.0

Internet: http://www.megasoftware.net/

Kartenexplorer: GIS-Software basierend auf ESRI-Modulen [MapObjects® LT und

MOLegend (ESRITM , Environmental Systems Research Institute, Inc., Redlands, USA)].

entwickelt am Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit,

Institut für Epidemiologie

Internet: http://www.bfav.de/kartenexplorer/

138

9 DANKSAGUNG

An erster Stelle sei Frau Professorin Greiser-Wilke und Herrn Professor Moennig vom Institut

für Virologie der Stiftung Tierärztlichen Hochschule und Herrn PD Conraths vom Institut für

Epidemiologie des Friedrich-Loeffler-Instituts herzlichst gedankt für die Übernahme und

Betreuung meiner thematischen Fragestellung.

Ferner gilt mein ganz besonderer persönlicher Dank Herrn Dr. Thomas Müller vom

Nationalen Referenzlabor für Tollwut am FLI, der mich während der gesamten Zeit

unterstützte, motivierte, förderte und forderte und bei allen Fragen ein offenes Ohr hatte.

Ein großes Dankeschön auch für die Unterstützung bei der Einarbeitung in die

molekularbiologischen Techniken an Dr. Geue und an Susann Schares und Aline Beckert für

die gemeinsame Zeit beim Sequenzieren und die Unterstützung.

Für die kreativen Diskussionen und fachlichen Hinweise, insbesondere für die Statistik,

bedanke ich mich bei PD Thomas Selhorst. Zum Schluss sei meiner Frau Christiane für die

Geduld, Unterstützung und Aufmunterung während der gesamten Zeit gedankt. Ebenso sei

allen denen ein Dankeschön ausgesprochen, die nicht namentlich Erwähnung fanden, aber

zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.