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Aus der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer-,Gesichtschirurgie

des Universitätsklinikums Erlangen

Direktor: Prof. Dr. Dr. Dr. F.W. Neukam

Tierexperimentelle Studie zur Knocheneinheilung chemisch

oberflächenmodifizierter Implantate im Typ- 2 diabetischen Schwein

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor medicinae dentariae

der Medizinischen Fakultät der

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Tobias Möst

aus

Füssen

Erlangen, Januar 2011

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-

Universität Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler

Referent: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Karl Andreas Schlegel

Koreferent: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. Friedrich Wilhelm

Neukam

Tag der mündlichen Prüfung: 19.10.2011

In aller Liebe meiner verstorbenen Mutter

IV

INHALTSVERZEICHNIS

I. Zusammenfassung ...................................................................................................... 6 1. Hintergrund.......................................................................................................................... 6 2. Methoden............................................................................................................................... 6 3. Ergebnisse ............................................................................................................................. 6 4. Praktische Schlussfolgerungen...................................................................................... 7

II. Summary....................................................................................................................... 8 1. Background........................................................................................................................... 8 2. Methods.................................................................................................................................. 8 3. Results .................................................................................................................................... 8 4. Practical Conclusions......................................................................................................... 9

III. Einleitung..................................................................................................................10 1. Diabetes und Auswirkungen auf die Implantologie..............................................10 2. Implantatoberflächen im Wandel der Zeit...............................................................11 3. Einheilung dentaler Implantate...................................................................................12

IV. Ziele der Arbeit........................................................................................................14

V. Material und Methode ............................................................................................15 1. Implantatsystem ...............................................................................................................15 2. Versuchstiere, Versuchstieranzahl und Bildung der Versuchstiergruppen.15 3. Induktion des experimentellen Diabetes .................................................................18 4. Art, Durchführung und Dauer des Eingriffs .............................................................19 5. Opferung der Versuchstiere..........................................................................................21 6. Aufbereitung der Prüfkörper .......................................................................................21 6.1. Röntgen, Fixierung, Dehydrierung, Infiltration, Einbettung................................... 21 6.2. Trenndünnschliffverfahren nach Donath und Breuner............................................ 22

7. Histologie: Toluidinblau-O- Färbung .........................................................................23 8. Immunhistochemie ..........................................................................................................26 8.1. Anfertigung der Schnitte mit dem Rotationsmikrotom............................................ 28 8.2. Färbevorgang .............................................................................................................................. 28 8.3. Auswertung der Immunhistologie ..................................................................................... 31

9. Statistik ................................................................................................................................33

VI. Ergebnisse.................................................................................................................34 1. Knochen-Implantat-Kontakt.........................................................................................34 1.1. Kalotte ............................................................................................................................................ 34

V

1.2. Unterkiefer ................................................................................................................................... 36 2. Ergebnisse der Lichtmikroskopie ...............................................................................38 2.1. Collagen Typ-‐I ............................................................................................................................. 38 2.2. Osteocalcin ................................................................................................................................... 42

VII. Diskussion ...............................................................................................................47

VIII. Literaturverzeichnis...........................................................................................55

IX. Abkürzungsverzeichnis........................................................................................70

X. Anhang.........................................................................................................................71

XI. Danksagung ..............................................................................................................74

IX. Zusammenfassung 6

I. ZUSAMMENFASSUNG

1. Hintergrund

Diabetes Mellitus wird als relative Kontraindikation für Implantatbehandlungen

klassifiziert. Ein Grund dafür liegt in der erhöhten Verlustrate, die bei

diabetischen Patienten verglichen mit der gesunden Bevölkerung beobachtet

werden kann. Ziel dieser Studie ist, die periimplantäre Knochenneubildung am

diabetischen Tiermodell zu untersuchen und die Unterschiede der

Osseointegration zwischen modifizierten (SLActive®) und konventionellen

(SLA®) Titanimplantaten zu evaluieren.

2. Methoden

In 15 Hausschweinen (4 gesunde Kontroll- und 11 diabetische Schweine) wurden

Implantate in die Kalotte und den Unterkiefer inseriert, nachdem in den

diabetischen Schweinen eine signifikante Veränderung im Hart- und

Weichgewebe verifiziert werden konnte. 30 und 90 Tage nach der Implantation

wurde der Knochen-Implantat-Kontakt (KIK) anhand von 30 µm dicken,

Toluidinblau-O gefärbten Schliffpräparaten ermittelt. Zusätzlich wurde mittels

immunhistochemischer Färbemethode die Expression der Knochenmatrixproteine

Collagen Typ-I und Osteocalcin zu beiden Opferungszeitpunkten evaluiert.

3. Ergebnisse

Der KIK war in der diabetischen Gruppe sowohl in der Kalotte als auch im

Unterkiefer nach 30 und 90 Tagen vermindert. SLActive® Implantate zeigten im

Vergleich zu SLA® Implantaten einen höheren KIK in beiden Modellen. Die

Expression des Knochenmatrixproteinsproteins Collagen Typ-I war in der Kalotte

der diabetischen Versuchstiergruppe zu beiden Untersuchungszeitpunkten erhöht

(30 Tage SLA®: 24,19 ± 9,94 vs. 28,26 ± 7,71 SLActive®: 23,75 ± 9,89 vs. 22,54

± 6,06 90 Tage SLA®: 25,51 ± 2,77 vs. 25,80 ± 5,02 SLActive®: 21,15 ± 5,43 vs.

21,97 ± 8,47). Die Expression des Knochenmatrixproteins Osteocalcin war in der

Kalotte der diabetischen Versuchstiergruppe an beiden Opferungszeitpunkten

nach der Implantatinsertion verringert (30 Tage SLActive®19,94 ± 5,44 vs. 17,64

± 6,23 90 Tage SLA® 25,36 ± 5,70 vs. 20,21 ± 4,73).

IX. Zusammenfassung 7

4. Praktische Schlussfolgerungen

Dieser Studie kann entnommen werden, dass die unbehandelte

Stoffwechselerkrankung Diabetes Mellitus einen negativen Einfluss auf die

Osseointegration von dentalen Implantaten hat. Dieser pathologischen

Nebenwirkung kann durch neu entwickelte Implantatoberflächen entgegengewirkt

werden. Die modifizierte SLA®- Oberfläche bewirkt eine beschleunigte

Osseointegration dentaler Implantate, so dass eine Diabeteserkrankung in

unbehandelter Form keine Kontraindikation für eine Implantatinsertion darstellt.

IX. Summary 8

II. SUMMARY

1. Background

Diabetes mellitus is currently classified as a relative contraindication for implant

treatment. One reason is the higher failure rate, which can be observed in diabetic

patients compared to the general population. Aim of this study was to investigate

peri-implant bone formation in a diabetic animal model and to evaluate the

differences between modified (SLActive®) and conventional (SLA®) titanium

implants on the osseointegration.

2. Methods

In 15 domestic pigs (4 healthy controls and 11 diabetic) implants were inserted in

the calvaria and lower jaw after significant histopathological changes in the hard

and soft tissue could be verified in the diabetic animals. 30 and 90 days after

implant placement the bone-implant-contact (BIC) was appraised by 30µm thick,

toluidinblue-O stained grinded supplements. Additionally the expression of bone-

matrix-proteins collagen type-I and osteocalcin were evaluated at both times of

devotement by using immunohistochemical-staining methods.

3. Results

BIC in the calvaria and lower jaw was reduced in the diabetic group after 30 days

and after 90 days. SLActive®-implants showed a higher BIC in the calvaria as

well as in the lower jaw compared to the SLA® implants. Collagen type-I protein

expression was higher in the diabetic group at both time points of sacrifice (30

days SLA®: 24,19 ± 9,94 vs. 28,26 ± 7,71 SLActive®: 23,75 ± 9,89 vs. 22,54 ±

6,06 90 days SLA®: 25,51 ± 2,77 vs. 25,80 ± 5,02 SLActive®: 21,15 ± 5,43 vs.

21,97 ± 8,47). After the insertion of the implants the expression of the bone-

matrix-protein osteocalcin was reduced in the diabetic group at both times of

sacrifice. (30 days SLA®: 16,48 ± 5,24 vs. 22,10 ± 3,44 SLActive®: 19,94 ± 5,44

vs. 17,64 ± 6,23 90 days SLA®: 25,36 ± 5,70 vs. 20,21 ± 4,73 SLActive®: 20,80 ±

5,81 vs. 20,80 ± 5,14) .

IX. Summary 9

4. Practical Conclusions

The negative impact of untreated diabetes mellitus on osseointegration of dental

implants is revealed in this study. This pathologic adverse reaction could be

prevented by new developed implant surfaces. The modified SLA® surface

provokes an accelerated osseointegration of dental implants. This is why

untreated diabetes is no longer a contraindication for implant insertion.

IX. Einleitung 10

III. EINLEITUNG

1. Diabetes und Auswirkungen auf die Implantologie

Diabetes Mellitus ist ein Sammelbegriff für Störungen des Zuckerstoffwechsels, deren Leitbefund durch einen zu hohen Blutzuckerspiegel charakterisiert ist. Diese Hyperglykämie ist das Ergebnis einer defekten Insulinsekretion, Insulinantwort oder beidem gleichzeitig. Beim „primär insulinabhängigen Diabetes mellitus“ (Typ-I Diabetes) handelt es sich um eine Autoimmunerkrankung, bei der das körpereigene Immunsystem die insulinproduzierenden β-Zellen des Pankreas zerstört. Es resultiert ein zunehmender Insulinmangel, der sich bei 80-90% der zerstörten β-Zellen als Typ-I Diabetes manifestiert. Im Gegensatz dazu steht der „Nicht primär insulinabhängiger Diabetes mellitus“ (Typ-II Diabetes). Hierbei handelt es sich um eine Störung am Zielort, z.B. an der Zellmembran eines Muskels. Das vorhandene Insulin ist in seiner Wirkung ineffizient und die gewünschte Wirkung bleibt aus (Insulinresistenz). Die Internationale Diabetes Federation (IDF) schätzt, dass im Jahr 2010 weltweit 239 Millionen an Diabetes leiden. Diese Summe wird innerhalb der nächsten 15 Jahre auf 380 Millionen zunehmen. Der steigende Lebensstandard und das fehlerhafte Ernährungsbewusstsein sind Gründe für die Diabeteserkrankung von etwa 7,4 (2007) Millionen Menschen in Deutschland. Im internationalen Vergleich reiht sich Deutschland damit auf den 5. Platz nach Indien, China, USA und Russland ein. Laut der IDF betrug die nationale Prävalenz 11,8 % aller deutschen Bundesbürger zwischen dem 20. und 79. Lebensjahr. Leider ist dieser Trend nicht rückläufig und Berechnungen zur Folge wird 2025 in dieser Bevölkerungsgruppe die nationale Prävalenz auf 13,3% ansteigen [74]. Dieser Tendenz entsprechend nimmt die Anzahl der an Diabetes erkrankten Patienten, die zahnärztliche und/oder Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgische Versorgung benötigen, stetig zu. Da sich eine Implantatinsertion als effektive Methode zur Versorgung von teilbezahnten und zahnlosen Patienten etabliert hat, wird auch in diesem Bereich ein stetiger Patientenzuwachs zu beobachten sein [5, 8, 78]. Klinische Studien konnten zeigen, dass Implantate bei diabetischen Patienten erfolgreich gesetzt werden können [8, 10, 34, 44], die Erfolgsrate aber im Vergleich zu gesunden Patienten verringert ist [35, 36, 79, 86]. Dabei scheint der Diabetes wesentliche Voraussetzungen für eine erfolgreiche Osseointegration von Implantaten zu beeinflussen. Es konnte gezeigt werden, dass

IX. Einleitung 11

sich Diabetes sowohl auf die Knochenneubildung wie auch auf die Knochendichte und –mineralisation nachteilig auswirkt [30, 38, 46, 111]. Entscheidend für eine regelrechte Knochenheilung und –mineralisation ist eine frühe Vaskularisierung durch Gefäßneubildung (Neoangiogenese) [20, 37]. Gerade im Fall des Diabetes ergibt sich hierbei die Problematik, dass Angiopathien bei diesem Krankheitsbild die häufigste Sekundärkomplikation darstellen [72]. Pathophysiologisch sind diese Angiopathien unter anderem gekennzeichnet durch einen veränderten Blutfluss, eine gesteigerte Gefäßpermeabilität, eine veränderte Endothelfunktion und eine verminderte Mikrozirkulation. Die daraus resultierenden Wundheilungsstörungen im Bereich des Weich- und Hartgewebes stellen somit eine der Hauptkomplikationen der diabetischen Stoffwechsellage dar.

2. Implantatoberflächen im Wandel der Zeit

Implantationen im Bereich des Schädels sind keine Entwicklung, die ihren

zeitlichen Ursprung im 20. Jahrhundert finden. Ein aus Stein simpel hergestellter

unterer Schneidezahn, der in den Alveolarfortsatz eingebracht wurde zeigt, dass

bereits vor der „Entdeckung Amerikas“ im Honduras bereits „Implantologie“

betrieben wurde. Dort gefundene Schädel beweisen dies [6]. Seit Beginn des 19.

Jahrhunderts werden Implantate im Kieferbereich aus unterschiedlichsten

Materialien beschrieben. Die damals verwendeten Werkstoffe waren Blei, Silber,

Gold, Platin, Guttapercha, Gummi, Kautschuk, Porzellan u.a.[13, 41]. Da primär

geglaubt wurde, dass Edelmetalle verträglicher seien, wurden die Implantate in

diesem Zeitraum aus sehr „edlen“ Legierungen hergestellt (z.B.Platin-Irridium).

Erst 1940 kamen korrosionsbeständige Stahlimplantate (Vittalium u.a.) auf den

Markt. Keramiken und das „nicht-edle“ Titan, welches heute bevorzugt wird,

gelten seit 1960 als geeignete Biomaterialien für enossale Implantate [27]. Studien

konnten bewiesen, dass Implantatoberflächen mit Mikrostrukturen, die man z.B.

durch den Prozess des Sandstrahlens oder des Ätzens mit Säuren erhält, eine

höhere Erfolgsrate und beschleunigte Osseointegraton aufweisen als

unbehandelte, glatte Oberflächen [4, 56, 65, 73]. Gesteigerte Zellproliferation und

–migration [118], ebenso wie gesteigerte Knochenapposition [14] und Knochen-

Implantat-Kontakt [60] sind Auffälligkeiten, welche die Überlegenheit von

mikrostrukturierten Oberflächen unterstreichen. Diese Erkenntnisse bilden die

Grundvoraussetzung für die heutige Forschung an dentalen Implantatoberflächen.

Neueste Erkenntnisse aus der Physik, Chemie und Biologie werden für die

IX. Einleitung 12

Oberflächenentwicklung dentaler Implantate herangezogen. Mit der Entwicklung

von sich selbstorientierenden Titanröhrchen (TiO2-nanotubes), konnte von

Wilmowsky C. 2007 an einer experimentellen Studie am Schwein zeigen, dass

Oberflächen mit dieser Beschichtung, im Durchmesser von 30 nm, einen positiven

Einfluss auf die Osteoblastenaktivität haben [107]. Unlängst wurden

Wissenschaftler auf den Mechanismus der Interaktion zwischen extrazellulärer

Matrix und Zellmembranrezeptoren aufmerksam [7, 69]. Dabei fiel auf, dass die

Aminosäurensequenz Arginin-Glycin-Aspartat (RGD) die Zelladhäsion der

Osteoblasten beschleunigt [114]. Seitdem wird diese Sequenz für eine

Biofunktionalisierung von Implantatoberflächen genutzt [91]. Durch Weitere

Modifikationen der Oberflächentextur der Implantate kann deren Einheilung

zusätzlich verbessert werden [22, 26, 39, 64]

Die Firma Straumann reagierte auf die bereits oben beschriebene Entwicklung der

Implantatoberflächen mit einer „Aktivierung“ der von ihnen entwickelten SLA®

Beschichtung, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde.

3. Einheilung dentaler Implantate

Die wissenschaftliche Grundlage der knöchernen Einheilung dentaler Implantate

beschreibt Brånemark mit dem Prozess der Osseointegration. Dieser Begriff

bezeichnet den direkten und funktionellen Verbund zwischen dem organisierten

lebenden Knochen und der Oberfläche des belasteten Implantats [17]. Bezüglich

des Einheilmodus werden zweiphasige von einphasigen Implantatsystemen

unterschieden. Im Rahmen dieser Studie heilten die Implantate submukosal ein,

was der zweiphasigen Methode entspricht. Seit der Einführung oraler enossaler

Implantate hat sich eine unbelastete Einheilungsphase von drei bis sechs Monaten

je nach Qualität des Implantatlagers etabliert. Obwohl der exakte Mechanismus

des Knochen- Implantat Verbundes bislang nicht vollständig geklärt ist, kann

davon ausgegangen werden, dass die sich bildende Passivierungsschicht des

Titans maßgeblich die knöcherne Einheilung beeinflusst [57]. Bei der

Implantation kommt es initial zu einer Adsorption von Proteinen, Thrombozyten

und anderen Makromolekülen an der Implantatoberfläche [88, 97]. Über diese

Schicht läuft die Osseointegration der Implantate ab [19, 97]. Hierbei spielen die

an der Oberfläche freigesetzten Zytokine (Mitogene und Morphogene) eine

wichtige Rolle für die Attraktion von osteogenen Zellen, welche als Ostetoblasten

IX. Einleitung 13

die Oberfläche besiedeln und durch diesen unmittelbar nach der Implantation

stattfindenden Prozess eine Kontaktosteogenese der Implantate ermöglichen [28,

88]. Dieser Prozess der Osteokonduktion korreliert mit der Beschaffenheit der

Implantatoberfläche. Die sich anschließende Knochenneubildungskaskade kann in

einen mehrstufigen Prozess untergliedert werden. In der frühen Phase der

Osseointegration sezernieren differenzierende osteogene Zellen eine

Kollagenmatrix, die als Gerüst für die spätere Mineralisation dient [95]. Der

gebildete, unreife Geflechtknochen ist charakterisiert durch eine zufällige

Anordnung von Kollagenfasern und zahlreiche, unregelmäßig geformte

Osteozyten. Diese Knochenvorstufe entwickelt sich später zu lamellären Knochen

weiter, der sich durch einen hohen Mineralisationsgehalt und dicht gepackte,

parallel angeordnete Kollagenfaserschichten mit alternierenden

Verlaufsrichtungen auszeichnet [93]. Die letzte Phase der Osseointegration

beschreibt der Prozess des „bone remodelling“ [28]. Diese Phase ist

charakterisiert durch eine funktionelle Anpassung des Knochens an die Belastung.

Im Rahmen dieser Studie sind die Knochenmatrixproteine Collagen Typ-I und

Osteocalcin von besonderem Interesse, da durch sie die voranschreitende

Osseointegration beschrieben werden kann.

IX. Ziele der Arbeit 14

IV. ZIELE DER ARBEIT

Ziele dieser experimentellen Großtierstudie sind:

- Evaluation der Unterschiede bezüglich des Knochen-Implantat-Kontakts

und der Osseointegration im diabetischen und stoffwechselgesunden

Schwein.

- Unterschiede des Knochen-Implantat-Kontakts bei der Anwendung zweier

verschiedener Implantatoberflachen (SLA® und SLActive®) der Firma

Straumann zu zwei unterschiedlichen Opferungszeitpunkten (nach 30

Tagen und 90 Tagen).

- Immunhistochemische Untersuchung der periimplantären Region mit

besonderem Augenmerk auf die für die Osseointegration

charakteristischen Proteine Collagen Typ-I und Osteocalcin.

IX. Material und Methode 15

V. MATERIAL UND METHODE

1. Implantatsystem

Die bone level Implantate entsprechen dem „Straumann Standard Implantat“ mit

einer Länge von 10 mm und einem Durchmesser Ø =4,1 mm.

Bei den SLA®-Oberflächen werden durch grobes Sandstrahlen mit Korund-

Partikeln eine Makrorauheit der Titanoberfläche erreicht. Danach folgt für einige

Minuten ein starkes Säurebad mit einer Mischung aus HCl und H2SO4 bei

erhöhter Temperatur. Dadurch entstehen die feinen 2–4 µm großen

Mikrogrübchen, die in der grob gesandstrahlten Fläche eingelagert sind [98].

SLActive® -Oberflächen hingegen sind molekular optimierte SLA®-Oberflächen.

Die Oberfläche zeichnet sich durch eine große Hydrophilie und einen hohen

Betrag von freier Oberflachenenergie aus. Diese Eigenschaften sind das Resultat

der besonderen Behandlung der SLA®-Oberfläche, die einerseits durch eine

Hydroxylierung und Hydratisierung der Ti- Oberfläche unter N2 Atmosphäre und

andererseits durch eine anschließende Lagerung in isotonischer Salzlösung

erreicht wird. Bei dieser Form der Aufbewahrung gehen Cl- Ionen der

isotonischen Lösung elektrostatische Bindungen mit der aktivierten Oberfläche

ein und sichern damit die optimale Vorbehandlung der Implantatoberfläche.

2. Versuchstiere, Versuchstieranzahl und Bildung der

Versuchstiergruppen

Das Schwein ist als Großtier ebenso wie Schaf und Hund für die experimentelle

Knochenchirurgie geeignet [3, 48, 94, 112]. Eine wichtige Voraussetzung dafür

ist, dass die morphologischen, anatomischen und physiologischen Gegebenheiten

eines Versuchstieres möglichst eng mit den Bedingungen beim Menschen

übereinstimmen, um tierexperimentell gewonnene Ergebnisse auch auf den

Menschen übertragen zu können. Die Knochenneubildungsrate des Schweins

beträgt 1,2 - 1,5 µm/die. Im Vergleich zum Hund (1,5 - 2,0 µm/die) entspricht sie

damit nahezu der Knochenregenerationsgeschwindigkeit des Menschen mit 0,8 -

1,0 µm/die [61]. Gewebedurchblutung, zirkulatorische Vorgänge und

Frakturheilung sind mit den Verhältnissen beim Menschen zu vergleichen. Auch


mikroskopisch lassen sich hinsichtlich der Knochenstruktur zwischen der Dicke

der Spongiosabälkchen (267 zu 276 µm) und dem Durchmesser der

intertrabekulären Markräume (1418 zu 322 µm) in den Femur- bzw.

Tibiametaphysen zwischen Mensch und Schwein geringere Unterschiede

nachweisen als beispielsweise zwischen Mensch und Hund (267 zu 282 µm, bzw.

1418 zu 258 µm) [12]. Daher wurde das Hausschwein gewählt, da sich knöcherne

Regenerationsvorgänge verlässlich auf den Menschen übertragen lassen [32, 33].

Nach Genehmigung des Tierversuches durch die zuständige

Tierversuchskommision der Regierung von Mittelfranken, Ansbach

(Genehmigungsnr. 54-2531-25/07) wurden 15 Tiere in die Studie eingeschlossen,

die hier auf 4 Versuchsgruppen aufgeteilt wurden. Es gab 2 Opferungszeitpunkte

in der jeweils diabetische und gesunde Schweine geopfert wurden. Am ersten

Opferungstermin (nach 30 Tagen Einheilung) wurden 7 Tiere (2 mit gesunder und

5 mit diabetischer Stoffwechsellage) geopfert. Nach 90 Tagen post

implantationem wurden die übrigen Tiere (2 mit gesunder und 6 mit diabetischer

Stoffwechsellage) geopfert.


Abbildung 1: Übersicht über den zeitlichen Verlauf der Doktorarbeit


3. Induktion des experimentellen Diabetes

Entsprechend der Studie von Koopmann et al. wurde Streptozotocin (Pharmacia

& Upjohn Company, Kalamazoo, MI) in einer physiologischen Kochsalzlösung

auf 1g/10ml, 90 mg/kg Körpergewicht verdünnt und über einen Zugang an der

Ohrvene über 30 min infundiert [58]. Die Kanülenapplikation und Infusionsgabe

fanden nach Medikation mit Midazolam (1mg/kg/KG) (Dormicum®, Hoffmann-

La Roche, Grenzach-Wyhlen) und Ketavet® (10mg/kg/KG) (Ketavet®,

Pharmacia, Erlangen) in Sedierung statt.

Die Applikation des Medikaments wurde 4-5 Stunden nach der morgendlichen

Fütterung durchgeführt. Während der ersten 3 Tage nach der Streptozotocin

Behandlung wurde Futter ad libitum gewährt um eine Hypoglykämie zu

vermeiden [42]. Über die folgenden 4 Tage wurde das Futter weiter ad libitum

gegeben, allerdings von 06:00 bis 07:00 Uhr und von 15:00 bis 16:00 Uhr, um die

Futteraufnahme in Relation zur 24h Urin-Glukose Ausscheidung der diabetischen

Schweines setzen zu können. Damit wurde sichergestellt, dass die Schweine

täglich Futter im isoenergetischen Level von 1045 kJ ME/kg Körpergewicht

aufnehmen. Ab dem 8.Tag nach Streptozotocin Behandlung wurden die Schweine

mit einem begrenzten und isoenergetischen Level von 1045 kJ ME/kg KG pro

Tag während der gesamten Studie gefüttert.

Vom Zeitpunkt der Gabe von Streptozotocin bis zur Implantation der Implantate

wurde ein Zeitraum von 15 Monaten gewählt. Die gewählte Streptozotocin

Konzentration entsprach in dieser Studie 90 mg/kg Körpergewicht. Marshall et al.

konnten in ihrer Studie zeigen, dass eine Gabe von 60 mg Streptozotozin/kg

Körpergewicht, nach einer initialen Behandlung über 8 Tage mit 30 mg

Streptozotozin/kg Körpergewicht, die beste Methode darstellt um einen deutlichen

Insulinmangel künstlich zu induzieren [70, 71]. Neben der Hypoglycämie und der

verminderten Insulinantwort konnte Marshall eine signifikante Zunahme an

Triglyceriden und ein Rückgang des Albuminspiegels im Blutplasma nachweisen

[70].

Da Marshall et al. eine Dosierung von 60 mg/kg Körpergewicht gewählt hat, war

davon auszugehen, dass bei der von uns vorgesehenen Streptocotozin-Dosierung

von 90 mg/kg Körpergewicht ebenfalls pathologischen Veränderungen beobachtet

werden können. Die induzierten pathologischen Folgeerkrankungen können mit


den Kriterien der Diabetesdefinition der American Diabetes Association 2006

(ADA) und World Health Organisation 1999 (WHO) erklärt werden:

- oftmaliges Urinieren

- ungewöhnlich größer Durst, Hunger

- ungewöhnlicher Gewichtsverlust

- Taubheitsgefühl an den Extremitäten

- verzögerte Wundheilung

- multiple Entzündungen

4. Art, Durchführung und Dauer des Eingriffs

Die Insertion der dentalen Implantate erfolgte bei den Versuchstieren in die

Schadelkalotte (Os frontale) und in den Unterkiefer (Mandibula). Durch einen

perkutanen Zugang im Bereich der Kalotte und der Mandibula wurde die Haut

inzidiert, das subcutane Bindegewebe und das Periost mobilisiert, sodass die

knöchernen Anteile des Os frontale bzw. der Mandibula dargestellt werden

konnten. Die Insertionstechnik unterschied sich in beiden Zielregionen nicht und

entspricht dem Procedere, welches von der Firma Staumann (Straumann Holding

AG, Basel, Schweiz) empfohlen wird.

Die Implantate wurden daraufhin in die Zielregion mittels einer Handratsche (35

Ncm) inseriert und das Implantatinnengewinde mit einer Verschlussschraube

gesichert. Das Periost wurde abschließend wieder repositioniert und wie die Haut

mit resorbierbaren Vicrylfäden (Vicryls 3.0®, Ethicon GmbH & Co. KG,

Norderstedt, Deutschland) vernäht. Zur postoperativen Schmerzkontrolle erhielt

jedes Tier 3 Tage lang alle 12 Stunden 0,1 mg/kg KG Buprenorphin (Temgesic®,

Essex Pharma GmbH, München, Deutschland) s.c.. Zusätzlich wurde eine

Antibiotikaprophylaxe mit Streptomycin (15mg/kg) (Streptomycin "Grünenthal" 1

g®, Grünethal, Stolberg, Deutschland) für 3 Tage eingeleitet.

Insgesamt wurden 136 Implantate inseriert. Dabei fanden an der Kalotte 58 und

an der Mandibula 78 randomisierte Implantationen statt.


Abbildung 2: vereinfachte Darstellung der Implantatlokalisation im Unterkiefer

Abbildung 3: vereinfachte Darstellung der Implantatlokalisation in der Kalotte


Abbildung 4: Intraoperatives Bild der Implantatinsertion. links: Kalotte, rechts:

Unterkiefer

5. Opferung der Versuchstiere

Nach Erreichen der geplanten Einheilzeit der Implantate erfolgte die Opferung der

Tiere zur Materialgewinnung. Die Schweine erhielten zur Sedierung eine i.m.-

Injektion in die Nackenregion mit Azaperone (1 mg/kg) (Stresnil®, Janssen-Cilag

GmbH, Neuss, Deutschlandund) und Midazolam (1 mg/kg) (Dormicum®,

Hoffmann-La Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland). Danach erfolgte die

Tötung durch eine intravasale Injektion von 20%-iger Pentobarbitallösung in die

Ohrvene bis zum Herzstillstand. Nun wurden die Kalotten und Mandibulae

entnommen und bis zum Beginn der mikroradiographischen und

immunhistochemischen Aufbereitung bei -80 Grad Celsius tiefgefroren.

6. Aufbereitung der Prüfkörper

6.1. Röntgen, Fixierung, Dehydrierung, Infiltration, Einbettung

Die auf – 80 ºC tiefgefrorenen Präparate wurden zunächst aufgetaut und zur

Vereinfachung der Defektauffindung mit einem Tischröntgengerät, (Faxitron R®,

Faxitron x-ray Corporation, Illinois, USA), eine Präparatröntgenaufnahme

angefertigt (40-45 kV, 0,25 mA und 5 Minuten). Im aufgetauten Zustand wurden


die Kalotten und die Kiefer mit Hilfe des Standard-Trenn-Systems der Fa. Exakt

(Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Germany) so gesägt, dass die einzelnen

Defekte in einer zur Einbettung praktikablen Größe vorlagen. Zur Fixierung

wurden die Probenblöcke über einen Zeitraum von 2 Tagen in 1,4%-igem

Paraformaldehyd (PFA) bei Zimmertemperatur gelagert. Für weitere

Untersuchungen mussten die Proben dehydriert werden, was in einer

aufsteigenden Alkoholreihe bei Raumtemperatur im Entwässerungsautomaten

(Shandon Citadel 1000®, Shandon GmbH, Frankfurt, Germany) erfolgte. Als

Intermedium kam Xylol zum Einsatz. Die Immersion erfolgte in drei Stufen,

wobei die Präinfiltration 1 im Entwässerungsautomaten, die Präinfiltrationen 2

und 3 sowie die Infiltration selbst bei 4 Grad Celsius, unter kontinuierlichem

Rühren stattfand. Ein Zeitintervall von 6 Tagen pro Medium bei einer

Probengröße von 1-2 cm3 hat sich hierbei bewährt (siehe Anhang).

Dem Problem früherer Ansätze, dass eine immunhistochemische Untersuchung

keine adäquaten Ergebnisse aufgrund der Denaturierung der nachzuweisenden

Proteine – infolge der sich entwickelnden Temperatur bei der Polymerisation des

Einbettmediums – lieferte, konnte erfolgreich mit dem Einsatz eines besonderen

Einbettmediums (Technovit® 9100 NEU, Heraeus/Kulzer,Abteilung Kulzer,

Werheim, Germany) begegnet werden. Hierbei handelt es sich um ein

Kaltpolymerisationssystem auf Methylmethacrylatbasis, welches unter

Sauerstoffausschluss nach Vermengen der Stammlösung A und B bei minus 4 ºC

innerhalb von 2 Tagen auspolymerisiert.

6.2. Trenndünnschliffverfahren nach Donath und Breuner

Die Verarbeitung der auspolymerisierten Kunststoffblöcke und der darin

enthaltenen Proben erfolgte nach dem Trenndünnschliffverfahren [31]. Zunächst

wurde der Kunststoff der eingebetteten Knochenblöcke mit Hilfe einer speziellen

Bandsäge (Exakt 310®, Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Germany) auf 4-

5 mm Probenüberstand reduziert. Danach wurden die Knochenproben mit einem

durch die Mitte des Implantatbereichs gelegten Längsschnittes in zwei Teile

geteilt, so dass auf beiden Längsschnitten das Implantat inklusive des

randständigen Knochens vorhanden war. Der erste Schnitt wurde zur Anfertigung

der Mikroradiographie und anschließender Histologie verwendet, der zweite Teil

wurde zum Anfertigen der Immunhistologie zurückgelegt.

Bei der weiteren Aufbereitung wurden zunächst die Außenflächen der


eingebetteten Knochenproben mit Technovit® 4000 (Haereus- Kulzer, Abteilung

Kulzer, Wehrheim, Germany) und einer Präzisions-Klebepresse (Exakt

Apparatebau GmbH, Norderstedt, Germany) auf Plexiglasobjektträger aufgeklebt.

Die Objektträger wurden nun in die Präzisionsschleifmaschine (Exakt

Apparatebau GmbH, Norderstedt, Germany) eingespannt und unter

Wasserkühlung bei rotierender und oszillierender Bewegung mit einem

Schleifpapier der Körnung 1200 plan geschliffen und anschließend mit

Schleifpapieren der Körnung 2500 und 4000 hochglanzpoliert. Auf die plane,

hochglanzpolierte Innenfläche der Knochenblöcke wurden wiederum mit Hilfe

der Präzisions-Klebepresse und dem Zyanoacrylat Technovit 7210 VI- C®

(Heraeus- Kulzer, Abteilung Kulzer, Wehrheim, Germany), einem lichthärtenden

Kunststoff, planparallel Plexiglasobjektträger aufgeklebt. Im den darauffolgenden

Arbeitsschritt wurde von den Knochenproben mit dem Exakt-Trennsystem, unter

ständiger Wasserkühlung, eine ca. 300 µm dünne Scheibe abgetrennt.

7. Histologie: Toluidinblau-O- Färbung

Nachdem für die Erstellung der Mikroradiographien die unentkalkten

kunststoffeingebetteten Schliffe mit Hilfe der Schleifmaschine (Exakt

Apparatebau GmbH, Norderstedt) auf 100 bis 120 µm reduziert und im Faxitron

R® Tischröntgengerät mit 11 kV Röhrenspannung und 0,25 mA für 6 Minuten

bestrahlt wurden, folgten weitere Arbeitsschritte für die Toluidin-Blau-O Färbung.

Die Dünnschliffpräparate wurden weiter auf 30 µm reduziert, poliert und für 5

Minuten in 10%igem H2O2 kontinuierlich bewegt. Nach Spülung unter

fließendem, kaltem Leitungswasser und Trocknung erfolgte für 15 Minuten die

Färbung in Toluidinblau-O-Lösung. Überschüssige Farbe wurde durch Abspülen

unter Leitungswasser entfernt. Nach Einhalten einer kurzen Trocknungszeit

wurden die Schliffe mit Technovit 7200® (Heraeus-Kulzer, Abteilung Kulzer,

Werheim, Germany) eingedeckt und zum Polymerisieren für 8 Minuten unter

Blaulicht gelegt. Danach konnten die gefärbten Schliffe lichtmikroskopisch

untersucht werden. Mineralisiertes Hartgewebe stellt sich ungefärbt bis blassblau

dar. Zellen, Zellkerne, Osteoidsäume, Kittlinien, Kollagenfasern und

Weichgewebe färben sich unterschiedlich blau. Mastzellgranula, Knorpelmatrix

und frühe Wundheilungsareale werden metachromatisch rotviolett gefärbt,

verkalkte Knorpelmatrix stellt sich dunkelblau dar. Die Proben wurden durch ein

Zeiss Lichtmikroskop (Axioskop®, Zeiss, Jena, Deutschland) mit einer


Videokamera eingelesen. Als Software stand das Programm KS 300® (Zeiss, Jena,

Deutschland) zur Verfügung. Die digitalisierten Aufnahmen wurden

unkomprimiert im tif.-Dateiformat gespeichert und mit Hilfe der Software

Bioquant OSTEO V7.10.10® (BIOQUANT Image Analysis Corporation,

Nashville, USA) ausgewertet. Das Ziel bei dieser Auswertung war, den Knochen-

Implantat-Kontakt (KIK) zu ermitteln. Dabei wurde zunächst die

Implantatoberfläche bestimmt und als 100% angenommen. Im zweiten Schritt

wurde die ermittelte Implantatoberfläche als knochenfrei oder -bedeckt markiert.

Das Auswertungsprogramm berechnete darauf den prozentualen Anteil der von

Knochen bedeckten Implantatoberfläche. Bei Implantaten, die in die Kalotte

inseriert wurden, wurden 4 regions of interest (ROI) gewählt. Die Regionen

wurden sowohl in coronalen als auch apikalen Bereich rechts und links des

Implantates gewählt (siehe Abbildung 6). Im Bereich des Unterkiefers wurden aus

anatomischen Gründen nur 2 ROI bestimmt, die im coronalen Implantatbereich

rechts und links gewählt wurden.

Abbildung 5: Toluidinblau-O-Färbung Kalotte (links) und Unterkiefer (rechts),

10-fache Vergrößerung.


Abbildung 6: Toluidinblau-O Färbung: Abbildung der Regions Of Interest

(ROIs) der Kalotte mit Bildern der Auswertung des Knochen-Implantat-Kontakts

(10-fache Vergrößerung).

Abbildung 7: Auswertung einer ROI mit dem Programm Bioquant-OSTEO® in

10x Vergrößerung. Nach der Festlegung der ROI wurde die Implantatoberfläche

bestimmt. Die Implantatoberfläche wird als osseointegriert (=grüne Linie im

Overview) oder frei von Knochen markiert (=rote Linie im Overview). Das

Bildbearbeitungsprogramm berechnet daraus den prozentualen Oberflächenanteil

der von Knochen besiedelt wurde. Der KIK beträgt in diesem Beispiel 91,02%.


8. Immunhistochemie

Unter Immunhistochemie wird die Sichtbarmachung und Lokalisierung von Ge-

webeantigenen durch Ausnutzung der Komplexbildung bei Antikörperzugabe

verstanden. Knochenmatrixproteine sind maßgeblich an Knochenumbau und

Knochenregeneration beteiligt. Deren Nachweis gibt Aufschluss über den

zeitlichen Knochenregerationsprozess.

Im Rahmen dieser Studie wurden folgende Färbungen durchgeführt:

Collagen Typ-I: Die in der extrazellulär Matrix am häufigsten zu findende

Proteine gehören der Familie der Kollagene an. Kollagene bilden das

Strukturelement aller Bindegewebe. Alle Mitglieder der Kollagenfamilie zeichnen

sich durch wiederholende Tripeptid-Sequenzen (Gly-X-Y) aus, welche die

Voraussetzung für die Bildung der charakteristischen trimeren Tripelhelix

darstellen. Collagen Typ-I Tripelhelixes sind Heterotrimere, welche durch 2

identische α1(I)-Ketten und einer α2(I)- Kette charakterisiert sind. Es hat eine

molare Masse von ca. 285kD ist ungefähr 1,4 nm dick und 300nm lang.

Die Biosynthese der Collagen α- Ketten beginnt am rauen endoplasmatischen

Retikulum (ER). Das Endprodukt ist das Prokollagen, welches sowohl am N- und

C- Terminus ein Telopeptid und Propeptid (=Registrierpeptid) enthält. Das

Prokollagen verlässt darauf das ER und gelangt zum Golgi-Apparat, wo es an

Prolin- und Lysinresten, Vitamin C abhängig, hydroxyliert und glykosyliert wird.

Die beiden Propeptide werden ebenfalls mit Zuckerresten modifiziert. Nun erfolgt

die Aneinanderlagerung der Prokollagene zu einer Tripelhelix. Mit der

Ausbildung von stabilisierenden Disulfidbrücken ist die intrazelluläre Synthese

abgeschlossen. Im extrazellulären Raum werden die Propeptide abgespalten,

wodurch Tropokollagen entsteht. Tropokollagen lagert sich zu Fibrillen

zusammen, deren Umlagerung nicht mehr säureempfindlich ist. Mehrere

Kollagenfasern lagern sich dann zu Kollagenbündeln zusammen und die Synthese

ist abgeschlossen.

Collagen Typ-I gehört wie die Collagen Typen II, III, V and XI zu den fibrillären

Kollagenen. Diese zeichnen sich durch die Fähigkeit aus, hochorientierte

supermolekulare Aggregate zu bilden, die einen Durchmesser von 25-400 nm

erreichen können. Collagen Typ-I bildet mehr als 90% der organischen Masse des

Knochens und ist das „Hauptkollagen“ in Bändern, Haut, Cornea und vielen


intestinalen Bindegeweben. Studien konnten zeigen, dass Collagen Typ-I ein

Reservoir für Wachstumsfaktoren (z.B.IGF-I and –II) und Cytokinen bildet, die in

der fibrillären Struktur des Kollagens gespeichert werden [11]. Collagen Typ-I

hat außerdem direkten Einfluss auf Signalwirkungen und Aktivitäten innerhalb

der Osteoblasten [56], wie z.B. auf Apoptose [117], Zellproliferation [40],

Differenzierung und Mineralisation der extrazellulären Matrix [68].

Osteocalcin: Extrazelluläre Martixproteine, wie z.B. Osteocalcin, Osteopontin

oder Osteonectin werden während des Prozesses der Osteoblastendifferenzierung

und Mineralisation synthetisiert und sezerniert [84]. Osteocalcin oder auch „bone

gliaprotein“ genannt, ist ein nicht kollagenes Protein mit einem Gewicht von 5800

kDa. Es ist das gemeinsame Produkt von Odontoblasten und Osteoblasten [25].

Osteocalcin ist das häufigste nichtkollagene Protein im Knochen und ist

größtenteils in der Matrix des Knochens inkorporiert, wo es von Hydroxyapatit

umgeben ist. Die besonders hohe Affinität zu Hydroxyapatit erklärt sich aus der

Struktur des negativ geladenen Proteins. Die α-helicale Sekundärstruktur

begünstigt die Anlagerung von fünf Ca2+-Ionen, die genau der räumlichen

Anordnung der Ca2+-Ionen im Hydroxyapatit entspricht [47]. Im Blutserum ist

Osteocalcin nur in geringem Maße gelöst. Die Serumkonzentration stellt dabei

einen sensiblen Marker für Knochenumbauprozesse dar und korreliert mit den

histomorphometrischen Index für Knochenumbauprozesse [25, 63, 89, 99]. Die

Funktion dieses Proteins im Knochenstoffwechsel ist nicht gänzlich geklärt.

Studien nehmen an, dass Osteocalcin die Mineralisation beeinflusst, durch die

Möglichkeit Hydroxyapatit mit einer hohen Affinität zu binden. Neben der

Bindungsfähigkeit schreibt man Osteocalcin auch Fähigkeiten in der

Zellkommunikation und in Verstärkung der Genxpression von Osteoblasten und

Osteoclasten zu [24, 81]. Thorwarth et al. nimmt in seiner Studie an, dass die

Anwesenheit von Osteocalcin, hervorgerufen durch die Kalzifizierung der

Osteoblasten im Kollagengerüst, charakteristisch für die Mineralisation während

der Knochenbildung ist [104]. Wolf et al. hingegen geht davon aus, dass

Osteocalcin die Knochenbildung reguliert [113]. An der Regulation dieses

Knochenmatrixproteins sind mehrere Hormone beteiligt. Das Vitamin D3 zieht in

der Maus eine dosisabhängige Reduktion der Osteocalcinproduktion nach sich.

Der Transforming Growth Faktor β (TGF-β) inhibiert [82] wohingegen der Insulin

Like Growth Faktor -I (ILG-I) die Osteocalcinproduktion dosisabhängig


stimuliert. Das Parathyroid Hormon (PTH) übernimmt die stimulierende Rolle in

der Expression des Osteocalcin Gens [53, 115].

8.1. Anfertigung der Schnitte mit dem Rotationsmikrotom

Die in Technovit® 9100 eingebetteten Knochenproben [15] wurden zum

Anfertigen der Mikrotomschnitte mit Technovit 3040 auf konfektionierte Kunst-

stoffträger aufgeklebt. Diese Träger ermöglichten ein stabiles Adaptieren an die

Spannzange des verwendeten Leica® Mikrotoms RM2265 (Leica Microsystems,

Nussloch GmbH, Germany). Bei dem verwendeten Mikrotom handelte es sich um

ein vollautomatisches Rotationsmikrotom, bei dem das Messer horizontal fest

eingespannt ist. Die Schnitte wurden durch senkrechte kontinuierliche

Vorschubbewegung der Probe zum Messer gewonnen. Es wurden 3 µm dicke

Schnitte angefertigt. Die Probenblöcke wurden während des Schneidevorgangs

mit 30%igem Alkohol benetzt und die Schnitte durch Aufschwimmen mit einem

Pinsel auf die Objektträger (Super Frost, Firma Menzel- Gläser, Braunschweig,

Germany) gezogen. Anschließend wurden die Proben mit 96%igem Alkohol

überdeckt, auf dem Objektträger zentriert, geglättet mit einer 0.025 mm dicken

Polyethylenfolie (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Germany) abgedeckt und der

überschüssige Ethanol durch Auspressen entfernt. Die gewonnenen Schnitte

wurden für 24 Stunden bei 60 °C in einer Objektträgerpresse komprimiert, um

zum einen das endgültige verflüchtigen des Alkohols und zum anderen eine

ausreichende Adhäsion der Knochenschnitte an die Objektträger zu erreichen.

Nach dem Trocknen der Schnitte wurden die Polyethylenfolien von den

Objektträgern entfernt und diese bis zum Färbevorgang aufbewahrt.

8.2. Färbevorgang

Bevor die immunhistologischen Färbung mit Antigen- Antikörper-

Komplexierung begonnen werden konnte, wurden an allen Schnitten dieselbe

Vorbehandlung durchgeführt. Die Vorbehandlung ist gegliedert in eine

Entacrylierung und eine anschließende Rehydrierung. Entacryliert wurden die

Schnitte in 2‐Methoxyethylacetat (MEA, Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn,

Deutschland) unter ständiger Bewegung. Rehydriert wurden die Schnitte in einer

absteigenden Alkoholreihe. Im Anschluss wurden die Proben in 10%iger

Ethylendiamintetraessisäure- Lösung (DakoTM, Glostrup, Dänemark) entkalkt und

danach unter fließendem Leitungswasser gespült um vorhandene Rückstände zu


beseitigen. Es folgten 2 Bäder mit AquaDest und Waschpuffer (Dako Wash

Buffer х10, Code S3006, DakoTM, Glostrup, Dänemark) bevor die Zielantigene

der Proben für 22 Minuten bei fast kochendem Citrat (Dako Cytomation Target

Retrieval Solution Citrate pH 6, х10, Code S2369), bei einem pH von 6,0

demaskiert wurden. Das Bad hatte des Weiteren zur Folge, dass durch die

Formalinfixierung verursachte Proteinvernetzungen wieder aufgehoben wurde.

Nach dem Kochvorgang hat sich ein Abkühlen im Citrat- Puffer und ein

nochmaliges Aufbewahren in Waschpuffer als besonders erfolgversprechend

erwiesen. (genaue Rezepte pro Färbung siehe Anhang)

Nun folgte der vollautomatische Hauptfärbevorgang mit Hilfe des DAKO

Cytomation Autostainers plus (DakoTM, Glostrup, Dänemark). Bei jedem

Färbevorgang wurde eine Negativkontrolle mitgeführt, welche mit Ausnahme des

jeweiligen Primärantikörpers mit den gleichen Reagenzien wie die zu färbenden

Proben behandelt wurden. Im Weiteren Färbeverlauf wurde zunächst die

Peroxidase mit einer 3%igen Wasserstoffperoxid/ TBS- Pufferlösung blockiert

und die Objektträger mit TBS- Puffer gespült. Zur Vermeidung unspezifischer

Reaktionen folgte eine Proteinblockierung (DAKO Protein- Block- Serum Free,

Code X0909, DAKOTM, Carpinteria, Kalifornien, USA).

Die Detektierung und somit Lokalisierung der spezifischen Gewebeantigene

erfolgte mit Hilfe der Labeled-(Strept)-Avidin-Biotin (LSAB)-Methode. Um diese

Methode umzusetzen, hat sich das Detektionssystem der Firma DAKO (Dako

REALTM Detection System Alkaline Phospatase/RED Rabbit/Mouse Code

K5005, DakoTM, Glostrup, Dänemark) als besonders erfolgversprechend erwiesen.

Die LSAB- Färbetechnik ist charakterisiert durch mehrere Schritte. Zunächst

wurden die Proben mit dem jeweiligen unkonjugierten Primärantikörper

behandelt, der mit seinem F(ab)2-Fragment an sein spezifisches Gewebsantigen

bindet und somit einen Antigen- Antikörper- Komplex bildet. Die jeweiligen

Antikörper wurden jeweils mit Antibodydiluent (Dako REALTM Antibody

Diluent, Code S2022, DakoTM, Glostrup, Dänemark) auf die gewünschte

Konzentration verdünnt (Tabelle 3). Nach zwischenzeitigem Spülen mit TBS-

Puffer erfolgte im nächsten Schritt die Zugabe eines gegen das Fc- Fragment des

Primärantikörpers gerichteten biotinilierten Sekundärantikörpers. Bei der LSAB-

Methode folgte nun im dritten Schritt das Auftragen des DAKOTM Streptavidin

Peroxidase (HRP). Dabei macht man sich der Affinität des

peroxidasekonjugierten Streptavidins an den biotinilierten Sekundärantikörper zu


Nutze. Bei dem Substratsystem handelt es sich um eine wasserstoffperoxidhaltige

Einkomponenten- Substratlösung mit 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC), welches

an das Enzym bindet. Das Substrat wird am aktiven Zentrum des Enzyms

umgesetzt und es entsteht ein kontrastreiches rotes Endprodukt am Ort des

Zielantigens. Nach abschließendem Spülen mit destilliertem Wasser wurden die

Objektträger für die manuelle Hämalaun Gegenfärbung entnommen. Nach

mehreren Minuten der Färbung in gefiltertem Hämalaun (Microscopy Mayers

Hämalaunlösung, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) wurde der überflüssige

Farbstoff unter fließendem Leitungswasser entfernt und die Objektträger für

mehrere Minuten in destilliertes Wasser gegeben. Abschließend wurden diese

getrocknet, mit einem Deckglas und dem Einschlussmedium (Microscopy

Aquatex®, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) eingedeckt.

Antikörper Hersteller Typ gewonnen aus Konzentration

Collagen I

(Col- I)

Abcam,

Cambridge, USA

monoklonal Maus 1:10000

Osteocalcin

(OC 4-30)

Takara, Bio Inc.,

Japan

monoklonal Maus 1:10000


Tabelle 1: Beschreibung der verwendeten Primärantikörper

8.3. Auswertung der Immunhistologie

Nach der immunhistologischen Färbung wurden die Schnitte unter dem

Mikroskop (Axio®, Carl Zeiss GmbH, Jena, Germany) mit einer Digitalkamera

(Axio Cam®, Carl Zeiss GmbH, Jena, Deutschland) fotografiert. Um eine

verlässliche Aussage über die jeweiligen nachzuweisenden Proteine zu treffen

wurden insgesamt fünf ROIs ausgewählt (siehe Abbildung 8). Vier der ROIs

befinden sich unmittelbar in Implantatnähe, wobei zwei Bereiche coronal und

zwei Bereiche apikal gewählt wurden. Das fünfte ROI wurde als Kontrollbereich

in einem größeren Abstand zum Implantat gewählt. Die Zielbereiche waren für

jedes Präparat gleich. Für die Auswertung der Osteocalcin und Collagen Typ-I

gefärbten Schnitte wurden Bilder in 20-facher Vergrößerung angefertigt und im

unkomprimiertem tiff- Dateiformat gespeichert. Diese Bilder wurden mit dem

Programm Bioquant OSTEO® V7.10.10 (BIOQUANT Image Analysis

Corporation, Nashville, TN, USA) ausgewertet. Dabei wurde die angefärbte

Fläche bezogen auf die Gesamtfläche bestimmt und in Prozent angegeben.


Abbildung 8: Darstellung der regions of interest (ROI) zur Evaluation der

immunhistochemischen Schnitte. Pro Implantat wurden 5 identische ROIs

gewählt. ROI 1-4 wurden direkt in periimplantären Region gewählt. ROI 5 wurde

im ortsständigen Knochen gewählt und dient zur Bestimmung der

Standartexpression der Knochen- Matrix- Proteine.


Abbildung 9: ROI- Auswertung einer Osteocalcin-Färbung mit dem Programm

Bioquant-OSTEO® in 20-facher Vergrößerung. Immunhistologisch angefärbte

Ostocalcin Proteine wurde mit Hilfe des Bildanalyseprogramms markiert und

daraus der prozentuale Flächenanteil der Osteocalcin exprimierenden Bereiche

an der Gesamtfläche der ROI berechnet. In diesem Beispiel liegt die Osteocalcin-

Expression bei 19,80% (roter Kreis).

9. Statistik

Die Auswertung der Proben erfolgte unabhängig durch zwei Untersucher. Die

gewonnen Ergebnisse wurden aggregiert und in das

Tabellenkalkulationsprogramm Excel 2007® (Microsoft Corp., Redmond, WA,

USA) übertragen. Um die Ergebnisse graphisch darzustellen wurden in der

jeweiligen Versuchstiergruppe arithmetische Mittelwerte errechnet und die

Standartabweichung ermittelt. Bei der Erstellung der Graphen wurde die

Standartabweichung additiv auf den Mittelwert aufgetragen. Zur Berechnung

signifikanter Unterschiede wurde der Wilcoxon-Rank-Test mit dem Programm

AXUM® (Math-Software, Cambridge, USA) herangezogen und ein

Signifikanzniveau von p=0,05 angewendet.

IX. Ergebnisse 34

VI. ERGEBNISSE

1. Knochen-Implantat-Kontakt

1.1. Kalotte

30 Tage

Die SLA®- Beschichtung wies zu diesem Zeitpunk bei gesunder Stoffwechsellage

einen KIK von 86,5% (Standartabweichung ±10,15%) auf. Die SLActive®

Beschichtung erreichte hier einen Wert der gleichen Größenordnung von 84,29%

(±9,60%).

Größere Unterschiede ließen sich bei der Evaluation der Tiere mit diabetischer

Stoffwechsellage erkennen. Der errechnete Mittelwert der Gruppe mit SLA®-

Implantaten betrug 67,12% (±25,24%) und der Mittelwert der SLActive®

Beschichtung lag bei 75,15% (±14,36%).

90 Tage

Der Mittelwert der nach diesem Zeitraum bei der gesunden Gruppe mit SLA®-

Implantaten ermittelt wurde lag bei 84,20% (± 15,06%). Im Vergleich dazu stieg

der KIK- Wert der SLActive® beschichteten Implantaten auf 89,58% (±10,95%).

In der Gruppe mit diabetischer Stoffwechsellage erreichte die SLA®-

Beschichtung einen gemittelten Wert von 62,20% (±22,04%). Dieses Ergebnis

steht dem Mittelwert von 81,47% (±13,76%) der SLActive®- Beschichtung

gegenüber.

IX. Ergebnisse 35

Signifikante Werte ergaben sich für folgende Versuchstiergruppen:

• 30 Tage SLA® gesund gegen 30 Tage diabetisch SLA®: p = 0,0000

• 30 Tage SLActive® gesund gegen 30 Tage diabetisch SLActive®:

p = 0,0108

• 90 Tage SLA® gesund gegen 90 Tage diabetisch SLA®: p = 0,0001

• 90 Tage gesund SLActive® gegen 90 Tage diabetisch SLActive®:

p = 0,0000

• 90 Tage diabetisch SLA® gegen 90 Tage diabetisch SLActive®: p = 0,0002

Graph 1: Auswertung des KIKs in [%] in der Kalotte bei der

stoffwechselgesunden und diabetischen Versuchsgruppe an Implantaten mit

SLA®- und SLActive® Oberfläche zum Opferungszeitpunkt nach 30 bzw. 90 Tagen.

* p < 0,05 Wilcoxon-Rank-Test, Konfidenzintervall 0,95 .

** p < 0,01, Kofidenzintervall 0,99

IX. Ergebnisse 36

1.2. Unterkiefer

30 Tage

Bei der Auswertung der Implantate, die im Unterkiefer inseriert wurden lag der

Mittelwert des KIKs für Implantate der SLA®-Beschichtung in der

stoffwechselgesunden Kontrollgruppe bei 69,55% (±28,80%). Die modifizierte

SLActive®- Beschichtung erreichte in derselben Versuchstiergruppe 72,99%

(±26,71%).

Bei der Betrachtung der Werte für die Tiere mit diabetischer Stoffwechsellage lag

der Wert für die SLA®- Beschichtung bei 62,18% (±22,50%) und für die

SLActive®- Beschichtung bei 66,28% (23,08%).

90 Tage

Für die Implantate mit der SLA®- Beschichtung, die in der gesunden

Versuchsgruppe gesetzt wurden, ergabt sich für den KIK nach einem

Einheilungszeitraum von 90 Tagen ein Mittelwert von 77,28% (±24,84%). Die

SLActive®- Beschichtung erreichte im Vergleich dazu einen KIK- Wert von

89,07% (±18,24%).

Für die Implantate der diabetischen Versuchstiere wurde für die SLA®-

Beschichtung ein Mittelwert von 78,26% (± 18,34%) und für die SLActive®-

Beschichtung 80,76% (±21,82%) erreicht.


• 30 Tage gesund SLActive® gegen 90 Tage gesund SLActive®: p = 0,0315

• 30 Tage diabetisch SLA® gegen 90 Tage diabetisch SLA®: p = 0,0009

• 30 Tage diabetisch SLActive® gegen 90 Tage diabetisch SLActive®:

p = 0,0129

IX. Ergebnisse 37

Graph 2: Auswertung des KIK in [%] im Unterkiefer bei der

stoffwechselgesunden und diabetischen Versuchsgruppe an Implantaten mit

SLA®- und SLActive® Oberfläche zum Opferungszeitpunkt nach 30 bzw. 90 Tagen.

* p < 0,05 Wilcoxon-Rank-Test, Konfidenzintervall 0,95 .

** p < 0,01 Kofidenzintervall 0,99

IX. Ergebnisse 38

2. Ergebnisse der Lichtmikroskopie

2.1. Collagen Typ-I

30 Tage

Bei der Auswertung der Collagen Typ-I Färbung erreichte die gesunde

Versuchsgruppe im Abschnitt des Kontrollbereiches im Mittel 25,87% (±4,20%)

während der Mittelwert der diabetischen Gruppe bei 25,63% (± 7,01%) lag.

Im periimpläntären Bereich konnte bei der gesunden Kontrollgruppe mit SLA®-

Beschichtung im Mittel 24,19% (±9,94%) der ausgewerteten Fläche angefärbt

werden. Die weiterentwickelte SLActive®- Oberfläche erzielte bei gleichen

Bedingungen einen Mittelwert von 23,75% (±9,89%).

Bei der stoffwechselkranken Gruppe erzielte die SLA®- Beschichtung ein

Mittelwert von 28,26% (±7,71%). Die SLActive®- Implantatbeschichtung

erreichte in dieser Versuchstiergruppe 22,54% (±6,06%).

Graph 3: Auswertung Collagen Typ-I in der Kalotte, angefärbte Fläche in [%]

im periimplantären Bereich und Kontrollbereich in der stoffwechselgesunden und

diabetischen Versuchsgruppe an Implantaten mit SLA®- und SLActive®

Oberfläche nach 30 Tagen Einheilungszeit. .

** p < 0,01 , Wilcoxon-Rank-Test, Kofidenzintervall 0,99

IX. Ergebnisse 39

90 Tage

Nach einem Einheilungszeitraum von 90 Tagen lag der Mittelwert im

Kontrollbereich der gesunden Versuchsgruppe bei 24,58% (±3,63%). Nach

gleicher Einheilungszeit konnte in der Region des Kontrollbereichs bei

diabetischer Stoffwechsellage ein Mittelwert von 23,18% (±8,84%) festgestellt

werden.

Im periimplantären Bereich erreichte die gesunden Versuchsgruppe mit SLA®-

beschichteten Implantaten ein Mittelwert von 25,51% (±2,77%). Nach gleich

langer Einheilungszeit konnte für die SLActive®- Beschichtung ein Mittelwert

von 21,15 % (±5,43%) festgestllt werden.

Für die Tiere mit diabetischer Stoffwechsellage konnte für die SLA®-

Beschichtung ein Wert von 25,81% (±5,02%) ermittelt werden. Der Mittelwert

der SLActive®- Beschichtung siedelte sich in dieser Versuchstiergruppe bei

21,97% (±8,47%) an.

Graph 4: Auswertung Collagen Typ-I in der Kalotte, angefärbte Fläche in [%]

im periimplantären Bereich und Kontrollbereich in der stoffwechselgesunden und


Oberfläche nach 90 Tagen Einheilungszeit.

IX. Ergebnisse 40

Graph 5: Auswertung Collagen Typ-I in der Kalotte, angefärbte Fläche in[%]im

periimplantären Bereich und Kontrollbereich in der stoffwechselgesunden und


Oberfläche nach 30 und 90 Tagen Einheilungszeit.


• 30 Tage diabetisch SLA® gegen 30 Tage diabetisch SLActive®: p = 0,0018

IX. Ergebnisse 41

Abbildung 10: Collagen Typ-I gefärbte periimplantäre Bereiche, 10-facher

Vergrößerung (oben) und 20-facher Vergrößerung (unten).

IX. Ergebnisse 42

2.2. Osteocalcin

30 Tage

Der Mittelwert, der mit Osteocalcin Antikörper markierten Fläche, lag in der

stoffwechselgesunden Kontrollgruppe nach einem Einheilungszeitraum von 30

Tagen im Kontrollbereich bei 17,75% (±5,25%). In der diabetischen

Versuchstiergruppe konnte hier ein Mittelwert von 14,06% (±6,09%) festgestellt

werden.

Im periimplantären Bereich wies die SLA® Beschichtung in der gesunden

Versuchtiergruppen ein Mittelwert von 16,48% (±5,24%) auf. Die SLActive®

Beschichtung zeigte in dieser Gruppe einen Mittelwert von 19,94% (±5,44).

Bei der diabetischen Versuchsgruppe war der Mittelwert der angefärbten Fläche

der SLA®- Oberflächen bei 22,10% (±3,24%), bei der Gruppe der SLActive®-

Oberflächen lag der Mittelwert bei 17,64% (±6,23%). .

Graph 6: Auswertung Osteocalcin, angefärbte Fläche in [%] im periimplantären

Bereich und Kontrollbereich in der stoffwechselgesunden und diabetischen

Versuchsgruppe nach 30 Tagen Einheilungszeit in der Kalotte.

*p < 0,05 Wilcoxon-Rank-Test, Konfidenzintervall 0,95 ,

** p < 0,01, Kofidenzintervall 0,99

IX. Ergebnisse 43

90 Tage

Für die Kontrollbereiche lagen die gemittelten Werte bei gesunder

Stoffwechsellage bei 17,04% (±5,76%), welcher bei der diabetischen

Versuchsgruppe mit einem Mittelwert von 17,41% (±6,75%) geringfügig erhöht

waren.

Nach einem Einheilungszeitraum von 90 Tagen ergabt sich im periimplantären

Bereich für die SLA®- Beschichtung bei gesunder Stoffwechsellage ein

Mittelwert von 25,36% (±5,70%). Der Wert der SLActive® Beschichtung lag

dabei bei einem Mittelwert von 20,80% (±5,81%).

Bei den Tieren mit diabetischer Stoffwechsellage ist bei der SLA® Gruppe

20,21% (±4,73%), während für die SLActive® Oberflächen ein Mittelwert von

20,80% (±5,14%) ermittelt wurde.

Graph 7: Auswertung Osteocalcin, angefärbte Fläche in [%] im periimplantären

Bereich und Kontrollbereich in der stoffwechselgesunden und diabetischen

Versuchsgruppe nach 90 Tagen Einheilungszeit in der Kalotte.

* p < 0,05 Wilcoxon-Rank-Test, Konfidenzintervall 0,95

IX. Ergebnisse 44

Graph 8: Auswertung Osteocalcin der Kalotte, angefärbte Fläche in [%] im

periimplantären Bereich und Kontrollbereich in der stoffwechselgesunden und


Oberfläche nach 30 und 90 Tagen Einheilungszeit. .

**p < 0,01 Wilcoxon-Rank-Test, Konfidenzintervall 0,99


• 30 Tage gesund SLA® gegen 30 diabetisch SLA®: p = 0,0002

• 30 Tage diabetisch SLA® gegen 30 diabetisch SLActive®: p = 0,0189

• 90 Tage gesund SLA® gegen 90 Tage gesund SLActive®: p = 0,0254

• 30 Tage gesund SLA® gegen 90 Tage gesund SLA®: p = 0,0003

IX. Ergebnisse 45

Abbildung 11: Osteocalcin gefärbte periimplantäre Bereiche, 10-facher

Vergrößerung (oben) und 20-facher Vergrößerung (unten).

IX. Ergebnisse 46

Tabelle 2: Wertetabelle der Ergebnisse des KIKs, der Collagen Typ-I und

Osteocalcin Färbung. Alle Werte sind Prozentangaben.

IX. Diskussion 47

VII. DISKUSSION

Aufgrund der stetig steigenden Lebenserwartung [1] und des zunehmenden

Lebensstandards in unserer Bevölkerung wird sich in den kommenden Jahren das

Patientenklientel eines Zahnarztes bzw. eines Mund-Kiefer-Gesichtschirurgen

ändern. Chronische Erkrankungen wie beispielsweise der Diabetes Mellitus

müssen daher bei der Behandlungsplanung und –durchführung stärker

berücksichtigt werden.

Im Rahmen dieser Studie wurde die induzierte Diabeteserkrankung nicht mit

Insulin therapiert. Studien konnten zeigen, dass der therapierte Diabetes

hinsichtlich der Osseointegration dentaler Implantate verglichen mit der

untherapierten Form deutliche Unterschiede aufweist. Eine systematische

Literaturübersicht von 18 Studien konnte zeigen, dass es unter optimaler

Kontrolle der Blutglucosekonzentration zu einer erfolgreichen Osseointegration

dentaler Implantaten kommt, während ein schlecht eingestellter Diabetes die

Osseointegration der Implantate negativ beeinflusst [52].

Primäre Fragestellung der Untersuchung war die Evaluation der Unterschiede

bezüglich des Knochen-Implantat-Kontakts (KIK) in diabetischen und

stoffwechselgesunden Tieren. Das Ergebnis dieser Studie ergab einen signifikant

schlechteren KIK bei stoffwechselkranken Tieren sowohl im Unterkiefer als auch

im Oberkiefer. In der Kalotte der gesunden Tiere konnte nach 30-tägiger

Einheilung für die SLA®- Beschichtung eine signifikante Überlegenheit

(p=0,0001) gegenüber der Einheilung bei diabetischen Tieren ermittelt werden.

Die Dominanz der gesunden Versuchsgruppe zeigt sich auch bei den verwendeten

SLActive®- Implantaten. Hier ist ebenso die Knochenanlagerung signifikant höher

(p=0,0108). Nach 90 Tagen zeigte sich ebenfalls eine signifikant bessere

Knocheneinheilung in der Stoffwechselgesunden Gruppe. SLA® und SLActive®

beschichtete Implantate wuchsen auch hier besser ein (p=0,0001 für SLA®,

p=0,0346 für SLActive®). Diese Überlegenheit spiegelt sich auch in der

Einheilung der Implantate im Unterkiefer wieder. Hier ist der Mittelwert, der von

Knochen besiedelten Implantatoberflächen ebenfalls höher. Die Ergebnisse beider

Opferungszeitpunkte sind jedoch nicht signifikant (1.Opferung SLA® p=0,4458,

1. Opferung SLActive® p=0,3786, 2.Opferung SLA® p=0,8468, 2.Opferung

IX. Diskussion 48

SLActive® p=0,1291).

Insgesamt konnte bei gesunden Tieren sowohl in der Kalotte als auch im

Unterkiefer ein besserer Knochen-Implantat-Kontakt nachgewiesen werden.

Diese Beobachtung lässt sich durch pathologische Veränderungen, die mit der

Diabeteserkrankung einhergehen, erklären. Studien konnten zeigen, dass in

diabetischen Ratten die Expression von Osteoblasten um 10% niedriger ist als in

der gesunden Versuchsgruppe. Folglich wird weniger Osteoid, die Vorstufe des

mineralisierten Knochens, produziert, so dass die tägliche Knochenappositionsrate

um 86% geringer ist als in der gesunden Versuchsgruppe [106]. Siqueira et al.

konnte in einer experimentellen Studie an diabetischen Ratten zeigen, dass auch

hier die Knochenneubildung um 50% reduziert ist (p < 0,001) und die

Kontaktfläche zwischen Knochen und Implantat nach 3-wöchiger Einheilung

signifikant (p < 0,01) geringer ist [96]. Weitere Studien belegen die schlechtere

Knochenanlagerung an das Implantat [45, 50, 76, 87, 90, 100].

Der Grund für die verzögerte Knochenanlagerung liegt in der vielseitigen

pathologischen Wirkung des Diabetes, die sich auch auf die Osteoblasten

auswirkt. Die Expression von Transkriptionsfaktoren, welche den Phänotyp des

Osteoblasten steuern, ist bei Diabetikern nicht physiologisch [66]. Die diabetische

Versuchsgruppe zeichnet sich dabei durch eine wesentlich geringere Expression

von Genen aus, welche die Knochenmatrixproteine kodieren [66]. Entsprechend

dieser Beobachtungen können keine hohen Konzentrationen an

Transkriptionsfaktoren, welche für die Differenzierung des Osteoblasten

verantwortlich sind, nachgewiesen werden [66]. In der diabetischen

Versuchstiergruppe ist eine verminderte Expression des Proteins c-fos zu

beobachten. C-fos ist das Produkt der c-fos mRNA und zählt zur Familie der

Immediate Early Gene (IEG)- Transkriptionsfaktoren. C-fos spielt eine wichtige

Rolle in der Regulation der Proteinexpression für die Knocheneinheilung [75].

Diese Faktoren werden, induziert durch bone morphogenic proteins (BMPs), in

großen Mengen während der Phase der Präosteoblastenproliferation exprimiert

[85]. Des Weiteren konnten weniger Transkriptionsfaktoren Cbfa1 und Runx-2 in

der Versuchsreihe der diabetischen Tiere exprimiert werden.

Neben der Inhibition der Transkriptionsfaktoren wird angenommen, dass Diabetes

auch über einen anderen Weg pathologisch auf die Osteoblasten wirkt. Durch den

IX. Diskussion 49

gestiegenen Glukosemetabolismus verändert sich der Energiestoffwechsel mit

ansteigender Milchsäure- Synthese sodass Osteoblasten mittels pH-sensitiven

Kanälen auf das veränderte Säure-Base-Milieu mit reduzierter Mineralisation und

verringerter Genexpression reagieren [16, 51]. Diese Minderexpression hat eine

verzögerte Osteoblastendifferenzierung zur Folge, wodurch die Expression der

Knochen-Matrix-Proteine eingeschränkt wird.

Der Vergleich der Mittelwerte des KIKs zwischen Kalotte und Unterkiefer weist

Unterschiede in der von Knochen besiedelten Implantatoberfläche auf. Aus dieser

Studie ist ersichtlich, dass sowohl in der gesunden als auch in der diabetischen

Kalotte zu beiden Opferungszeitpunkten, im Vergleich zum Unterkiefer, ein

größerer Anteil der Implantatoberflächen osseointegriert war. Für dieses Ergebnis

wird die unterschiedliche Knochenqualität in Kalotte und Unterkiefer

verantwortlich gemacht. Die Kalotte weist im Vergleich zum Unterkiefer eine

dünner ausgebildete Kortikalis bei ebenfalls feinerer Spongiosazeichnung auf

[105]. Die trabekuläre Struktur der Kalotte zieht eine höhere Stoffwechselaktivität

nach sich, wodurch das Regenerationspotential höher ist als im Unterkiefer, in

dem der kompakte Anteil überwiegt [119].

Aus den ermittelten Ergebnissen lässt sich neben der Abhängigkeit der

Osseointegration von der Implantatlokalisation auch eine Abhängigkeit von der

Implantatoberfläche erkennen. Im Vergleich der SLA®- zur SLActive®-

Oberfläche scheint die modifizierte SLA®- Beschichtung schneller in den

Knochen einzuheilen. Die Neuanlagerung des Knochens an die

Implantatoberfläche ist in der Kalotte bei gesunder Stoffwechsellage zum zweiten

Opferungszeitpunkt an die SLActive®- Oberfläche besser (p = 0,1988) als bei

SLA® beschichteten Implantaten. Die Überlegenheit der SLActive®-

Beschichtung spiegelt sich auch in den diabetischen Tieren zu beiden

Opferungszeitpunkten wieder. (1.Opferung: p = 0,1548 ; 2. Opferung: p =

0,0002). Im Unterkiefer hingegen waren die SLActive® beschichteten Implantate

in allen Versuchstiergruppen überlegen.

Die Erklärung der Überlegenheit in der Knochenanlagerung liegt in der Struktur

der SLActive®- Oberfläche. Flüssigkeiten weisen auf SLActive®- Oberflächen

einen Kontaktwinkel von 0° auf, SLA® Oberflächen dagegen einen Kontaktwinkel

von 138,3° [116]. Mit diesem Unterschied lässt sich die Hydrophilie und hohe

Oberflächenenergie der modifizierten SLA®- Beschichtung beschreiben.

IX. Diskussion 50

SLActive®- Beschichtungen haben höhere O- und Ti- Molekül Konzentrationen

(60,1 und 23%), im Vergleich zu SLA®- beschichteten (50,2 and 14,3%) und

weniger (14,9%) C-Moleküle als SLA®- beschichtete Implantate (34,2%). Dieser

Unterschied in der Molekülverteilung zieht eine veränderte Zellantwort nach sich.

Es konnte beobachtet werden, dass bei SLActive®- Implantaten 30% weniger

Zellen exprimiert werden, jedoch der Phänotyp der Osteoblasten früher

ausdifferenziert wird. Verglichen mit SLA®-Implantaten, ist die Aktivität der

alkalischen Phosphatase, ein Marker für die frühe Osteoblastendifferenzierung,

um 100% erhöht [116]. Des weiteren zeigen SLActive®- Oberflächen einen

positiven Effekt auf die Expression von Transkriptionsfaktoren. Das TGF-1 β

Level ist um das 2,5 fache und der PGE2 ist mehr als das 10-fache im Vergleich

zu SLA®- beschichteten Implantaten erhöht [116]. Einen weiteren Vorteil stellt

die Herstellung und die Lagerung der SLActive®- Implantate dar.

Titanoberflächen haben die Eigenschaft in Kontakt mit Sauerstoff eine 2-5 nm

dicke Oxidschicht (Passivierung) auszubilden. Jedoch ist diese Oxidation direkt

nach der Implantatherstellung nicht gewünscht, da die Oberfläche von einem

Hydrokarbon Monolayer oder anderen anorganischen Bestandteilen kontaminiert

werden könnte [54]. Aus diesem Grund findet die Herstellung unter einer

Stickstoff-Atmosphäre statt und wird im nichtoxidiertem Zustand steril verpackt.

Weitere Studien belegen die überlegene Osseointegration der modifizierten

SLA®- Oberfläche gegenüber der SLA®- Oberfläche [14, 21, 92].

Bei der Betrachtung der Knochen-Matrix-Proteine fällt auf, dass sich ein

Unterschied in der Proteinexpression zwischen den gesunden und diabetischen

Tieren erkennen lässt. Collagen Typ-I wird nach 30 Tagen Einheilungszeit bei den

diabetischen Tieren mit SLA®- Implantaten stärker exprimiert als bei den Tieren

mit gesunder Stoffwechsellage. Jedoch ist dieser Unterschied nicht signifikant

(p=0,1772). Nach 90 Tagen scheint ebenfalls die Collagen Typ-I Expression in

den diabetischen Tieren vermehrt stattzufinden. Bei beiden Implantatoberflächen

konnten bei diabetischen Tieren vermehrt Collagen Typ-I Proteine detektiert

werden im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe (SLA®: p=0,8367 und

SLActive®: p=0,7238). Das Ergebnis lässt sich durch eine gestörte Mineralisation

des neugebildeten Knochens erklären, für die die Diabeteserkrankung

verantwortlich gemacht wird. Dieser Zusammenhang ergibt sich aus folgenden

Studien. Thorwarth et al. konnte zeigen, dass Collagen Typ-I einen Indikator für

IX. Diskussion 51

die frühe Knochenneubildung darstellt, dessen Expressionsmaximum im gesunden

Organismus nach 2 Wochen erreicht wird [104]. 30 Tage nach der Implantation

konnte Thorwarth et al. immer noch hohe Expressionswerte von Collagen Typ-I

ermitteln, die nach der 4. Woche abfallen. Das die Mineralisation steuernde

Protein Osteocalcin wird auch nach 4 Wochen nur in einer kleinen Menge

synthetisiert. Das Maximum wird hier nach 12 Wochen erreicht [104]. Die höhere

Expression des Collagen Typ-I Proteins nach 30 Tagen in den diabetischen Tieren

ist durch eine verminderte Ca2+ Aufnahme des Osteocalcins erklärbar. Die

Maskierung des Collagen-Typ I Proteins wird so verhindert wodurch es weiter

angefärbt werden kann [108]. Diese Erkenntnis verifiziert das Ergebnis des

2.Opferungszeitpunks (90 Tage = ca. 12 Woche). Die Osteocalcinexpression

erreicht nach Thorwarth et al. zu diesem Zeitpunkt sein Maximum [104], was zur

Folge hat, dass mehr Collagen Typ-I unmaskiert im Knochen des diabetischen

Schweins vorliegt. Mit diesem Erklärungsansatz lässt sich jedoch nicht das

Ergebnis der SLActive®- beschichteten Implantate beschreiben. Die SLActive®

beschichteten Implantaten sind in allen Versuchstiergruppen den SLA®-

Implantate unterlegen. Nach Wall et al. wäre zu erwarten, dass der Umsatz der

Knochen-Matix-Proteine an der modifizierten Implantatbeschichtung größer ist

als an der SLA® beschichteten [109]. Er konnte zeigen, dass in der frühen Phase

der Knochenneubildung viele Transkriptionsfaktoren vermehrt exprimiert werden.

Er stellte erhöhte Werte konnte für β-Catenin WNT5a, BSP und Runx2 fest [109].

Dies könnte zur Folge habe, dass die Osseointegration an der Oberfläche der

SLActive® Implantate schneller ablief und der von Thorwarth et al. beschrieben

Peak der Collagen Typ-I Expression, der eigentlich nach 30 Tagen der

Implantatinsertion zu erwarten wäre, zum ersten Opferungszeitpunkt schon

vorüber war.

Gegensätzlich zur Collagen Typ-I Expression stellt sich die Expression des

Knochen-Matrix-Proteins Osteocalcins dar. Bei der Betrachtung der

Osteocalcinexpression sieht man, dass 30 Tage nach der Implantatinsertion bei

SLActive® (p=0,6065) und im Kontrollbereich (p=0,9153) bei gesunder

Stoffwechsellage mehr Osteocalcin vorhanden zu sein scheint als in der

diabetischen Versuchsgruppe. Gleiches fällt nach 90 Tagen Einheilungszeit bei

den Versuchstieren mit der SLA®- Beschichtung auf (p=0,8637).

Einen Grund für die verringerte Osteocalcinexpression veröffentlichte Botolin et

IX. Diskussion 52

al. im Jahr 2005. Er konnte zeigen, dass in diabetischen Tieren die Expression der

mRNA für Osteocalin verringert ist [15]. Ogawa kam im Jahr 2007 zu einem

ähnlichen Ergebnis. Er stellte fest, dass eine hohe Blutglukosekonzentration im

Osteoblasten die Synthese für AGE Rezeptoren ansteigen lässt. Die Anwesenheit

von Glucose hat dabei keine Auswirkung auf die Mineralisation der Osteoblasten.

Anders verhält sich der Osteoblast in einer Umgebung mit hoher Konzentration an

Glucose und AGEs (advanced glycation endproducts). AGE stellen das

Endprodukt einer nichtenzymatischen Reaktion dar. Aldehydgruppe der Glucose

bildet spontan Schiff`sche Basen mit den Aminogruppen der Proteine. Diese

Reaktion ist reversibel, ihr Ausmaß hängt von der Dauer und der Höhe der

Glucosekonzentration ab. In einer folgenden ebenfalls nicht enzymatischen

Amadori- Umlagerung bildet sich aus der Schiff`schen Base ein Ketamin, welches

vom Organismus nicht mehr gespalten werden kann. Innerhalb weniger Wochen

erfolgen weitere Umlagerungen und es entstehen Glykierungsendprodukte,

(AGEs). Ogawa konnte zeigen, dass bei diesen Bedingungen die

Mineralisationsrate signifikant abfällt und die Osteocalcin mRNA Expression

verringert wird. Glucose oder AGEs allein haben keine Wirkung auf die

Osteoblastendifferenzierung, während die Kombination aus beiden einen

synergistischen vermindernden Effekt auf die Osteocalcinexpression und damit

auch auf die Mineralisation haben [83]. Der Zeitpunkt der Osteocalcinexpression

ist derselbe wie im Stoffwechselgesunden, lediglich die Expressionsmenge von

Osteocalcin ist unterdrückt [66]. Weitere Studien belegen eine eingeschränkte

Expression des Osteocalcins bei Diabeteserkrankung [59, 67, 80, 111].

Thorwarths et al. Erkenntnissen entsprechend, kann den Ergebnissen dieser Studie

entnommen werden, dass die Mittelwerte der Osteocalcinexpression sowohl in der

diabetischen als auch in der gesunden Versuchstiergruppe nach 90 Tagen der

Einheilung höher sind als nach 30 Tagen. Die SLA®- Beschichtung weist nach 30

Tagen im stoffwechselgesunden Schwein einen Mittelwert von 16,48 (±5,24)%

auf, nach 90 Tagen einen Mittelwert von 25,36 (±5,70)% auf. Dies ist signifikant

höher (p=0,0003) als die erreichten Mittelwerte zum 1.Opferungszeitpunkt. Ein

ähnliches Ergebnis erzielt die SLActive®- Beschichtung in den diabetischen

Tieren, wobei der Unterschied nicht signifikant (p=0,8230) ist. Thorwarth

erkannte bereits 2005, dass Osteocalcin ein Indikator für die späte

Knochenneubildung darstellt, dessen Expressionsmaxium in der 12. Woche liegt

IX. Diskussion 53

[104].

Bei der Betrachtung der Unterschiede bezüglich der Implantatoberflächen lässt

sich nicht erkennen, dass die SLActive® Oberfläche einen signifikant positiven

Effekt auf die Osteocalcinexpression hat. Mit einer Ausnahme, im gesunden Tier

zum 1. Opferungszeitpunkt (p = 0,0105), decken sich die Ergebnisse dieser Studie

nicht mit den Ergebnissen aus der Literatur. Zhao et al. zeigte in seiner in vitro

Studie, dass die Osteocalcinexpression auf der Oberfläche von SLActive®-

Implantaten um 40% erhöht ist im Vergleich zu SLA®- Implantaten [116].

Wie im Gliederungspunkt V „Material und Methode“ beschrieben weist

Osteocalcin eine hohe Affinität zu Ca2+ des Hydroxyapatits auf und ist dadurch

maßgeblich an der Mineralisation des Knochens beteiligt. Die geringere

Osteocalcin Expression in den diabetischen Tieren hat folglich negative

Auswirkungen auf Knochenmineralisation [47]. Balint et al. konnte 2001 in einer

Studie zeigen, dass ein direkter Zusammenhang zwischen der erhöhten

Blutglukosekonzentration und der erschwerten Calcium Aufnahme der

Osteoblasten besteht [9]. Die verzögerte Calciumaufnahme hat zur Folge, dass

die Bildung eines durchschnittlichen Osteons bei diabetischer Stoffwechsellage 8-

10fach so lang wie bei einem Gesunden dauert [55, 62]. Die Ergebnisse der

Knochendichtebestimmung können der Dissertation von Herrn Seidl entnommen

werden.

Wie eingangs erwähnt, stellt eine eingeschränkte Wundheilung nach der

Definition der WHO und AHA eine bekannte pathologische Begleiterscheinung

einer Diabeteserkrankung dar. Die beobachteten Wundheilungsstörungen sind zu

großen Teilen auf eine gestörte Angiogenese zurückzuführen [72]. Die veränderte

Gefäßeinsprossung bildet jedoch die Grundvoraussetzung für die

Knochenneubildung und -mineralisation [30, 37]. Der Pathomechanismus des

Diabetes Mellitus lässt Ähnlichkeiten in der Gefäßbildung am Herzen erkennen.

Es konnte gezeigt werden, dass durch die Schädigung von Endothelzellen und

Monozyten die Gefäßneubildung beeinträchtigt wird [2, 110]. Studien belegen,

dass die hohe Glucose- Konzentration des Blutes für die endotheliale Dysfunktion

verantwortlich gemacht wird. Ein möglicher Mechanismus stellt die durch

Prostanoide induzierte Vasokonstriktion dar, die von zu hohen Glucosespiegel des

Blutes induziert wird [103]. Des Weiten erscheinen die Endothelzellen gequollen,

die Nucleoli vergrößert und abgelagert [77]. Endotheliale Progenitorzellen bei

IX. Diskussion 54

Diabetikern sind in ihrer Proliferation im Vergleich zum Gesunden eingeschränkt

[102].

Die pathologische Hyperglycämie hat auch direkten Einfluss auf die Proteine.

Durch die permanent hohe Blutzuckerkonzentration kommt es zu bereits

beschrieben Reaktionen mit Proteinen sowohl im extrazellulären als auch

intrazellulären Raum [29]. Die AGE- Bildung verändert die funktionellen

Eigenschaften von wichtigen Matrixproteinen. AGEs bewirken z.B., durch

intermolekulare Verbindung mit Collagen Typ-I, dass es zu einer Veränderung in

der räumlichen Proteinstruktur kommt [101]. Die irreversible Bindung mit AGEs

verändert die Funktion von intakten Gefäßen, die Elastizität der großen Gefäße ist

verringert und die Plasmaextravasation entlang der Gefäße erhöht [18, 49]. Eine

weitere pathologische Veränderung bezieht sich auf das Collagen Typ-IV der

Basalmembran. Durch die Modifikation wird der laterale Verbund inhibiert [23]

und die Zell- Bindungsdomäne dahingehend verändert, dass die endotheliale

Zelladhäsion verringert wird [43]. Diese Entwicklungen ziehen einen gestörten

Blutfluss nach sich, welcher eine eingeschränkte Blutversorgung im

Endstromgebiet der Kapillaren zur Folge hat und damit eine Knochenneubildung

behindert.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine pathologische Wirkung des Diabetes

auf die Implantateinheilung zu erkennen ist. In dieser Studie war der KIK, die

Knochendichte, die Osteocalcin- und Collagen Typ-I Expression in der

diabetischen Versuchsgruppe als pathologisch einzustufen. Als weiteres Ergebnis

kann hervorgehoben werden, dass die neu einwickelte SLActive® Beschichtung

einen positiven Effekt auf die Knocheneinheilung hat. Diese Erkenntnis hat zur

Folge, dass diese Implantatoberfläche sich besonders für Patienten eignet, deren

Wundheilung gestört ist, z.B. nach Tumorerkrankung mit Strahlentherapie oder

Diabetes Mellitus. Im gesunden Patienten hat die beschleunigte Osseointegration

eine schnellere Sofortbelastung der Implantate zur Folge.

IX. Literaturverzeichnis 55

VIII. LITERATURVERZEICHNIS

[1] Lebenserwartung in Deutschland [cited; Available from:

http://www.destatis.de/jetspeed/portal/cms/Sites/destatis/Internet/DE/Content/Stat

istiken/Bevoelkerung/GeburtenSterbefaelle/Tabellen/Content50/Lebenserwartung

Deutschland,templateId=renderPrint.psml

[2] Abaci A, Oguzhan A, Eryol NK, Ergin A. (1999) Effect of potential

confounding factors on the thrombolysis in myocardial infarction (TIMI) trial

frame count and its reproducibility. Circulation. 100(22):2219-2223.

[3] Abd-el N. (1975) Züchtung eines Miniaturschweines als Versuchs- und

Laboratoriumtier. Dissertation. Agr. Fak. der Universität Göttingen.

[4] Abrahamsson I, Berglundh T, Linder E, Lang NP, Lindhe J. (2004) Early

bone formation adjacent to rough and turned endosseous implant surfaces. An

experimental study in the dog. Clin Oral Implants Res. 15(4):381-392.

[5] Adell R, Lekholm U, Rockler B, Branemark PI. (1981) A 15-year study of

osseointegrated implants in the treatment of the edentulous jaw. Int J Oral Surg.

10(6):387-416.

[6] Andrews R. (1893) Prehistoric crania from Central America. Int Dent J.

3:914-915.

[7] Anselme K, Bigerelle M, Noel B, Dufresne E, Judas D, Iost A, Hardouin

P. (2000) Qualitative and quantitative study of human osteoblast adhesion on

materials with various surface roughnesses. J Biomed Mater Res. 49(2):155-166.

[8] Babbush CA. (1986) Titanium plasma spray screw implant system for

reconstruction of the edentulous mandible. Dent Clin North Am. 30(1):117-131.

[9] Balint E, Szabo P, Marshall CF, Sprague SM. (2001) Glucose-induced


inhibition of in vitro bone mineralization. Bone. 28(1):21-28.

[10] Balshi TJ, Wolfinger GJ. (1999) Dental implants in the diabetic patient: a

retrospective study. Implant Dent. 8(4):355-359.

[11] Bautista CM, Mohan S, Baylink DJ. (1990) Insulin-like growth factors I

and II are present in the skeletal tissues of ten vertebrates. Metabolism. 39(1):96-

100.

[12] Beddoe AH. (1978) A quantitative study of the structure of trabecular bone

in man, rhesus monkey, beagle and miniature pig. Calcif Tissue Res. 25(3):273-

281.

[13] Berry A. (1888) Lead roots of theeth for implantation. J Dent Sci. 8:549-

553.

[14] Bornstein MM, Valderrama P, Jones AA, Wilson TG, Seibl R, Cochran

DL. (2008) Bone apposition around two different sandblasted and acid-etched

titanium implant surfaces: a histomorphometric study in canine mandibles. Clin

Oral Implants Res. 19(3):233-241.

[15] Botolin S, Faugere MC, Malluche H, Orth M, Meyer R, McCabe LR.

(2005) Increased bone adiposity and peroxisomal proliferator-activated receptor-

gamma2 expression in type I diabetic mice. Endocrinology. 146(8):3622-3631.

[16] Brandao-Burch A, Utting JC, Orriss IR, Arnett TR. (2005) Acidosis

inhibits bone formation by osteoblasts in vitro by preventing mineralization.

Calcif Tissue Int. 77(3):167-174.

[17] Branemark P. Einführung in die Osseointegration. Quintessenz. Berlin.

1985.

[18] Brownlee M. (2001) Biochemistry and molecular cell biology of diabetic


complications. Nature. 414(6865):813-820.

[19] Brunski JB, Puleo DA, Nanci A. (2000) Biomaterials and biomechanics of

oral and maxillofacial implants: current status and future developments. Int J Oral

Maxillofac Implants. 15(1):15-46.

[20] Burkhardt R, Kettner G, Bohm W, Schmidmeier M, Schlag R, Frisch B,

Mallmann B, Eisenmenger W, Gilg T. (1987) Changes in trabecular bone,

hematopoiesis and bone marrow vessels in aplastic anemia, primary osteoporosis,

and old age: a comparative histomorphometric study. Bone. 8(3):157-164.

[21] Buser D, Broggini N, Wieland M, Schenk RK, Denzer AJ, Cochran DL,

Hoffmann B, Lussi A, Steinemann SG. (2004) Enhanced bone apposition to a

chemically modified SLA titanium surface. J Dent Res. 83(7):529-533.

[22] Buser D, Schenk RK, Steinemann S, Fiorellini JP, Fox CH, Stich H.

(1991) Influence of surface characteristics on bone integration of titanium

implants. A histomorphometric study in miniature pigs. J Biomed Mater Res.

25(7):889-902.

[23] Charonis AS, Tsilbary EC. (1992) Structural and functional changes of

laminin and type IV collagen after nonenzymatic glycation. Diabetes. 41 Suppl

2:49-51.

[24] Chenu C, Colucci S, Grano M, Zigrino P, Barattolo R, Zambonin G,

Baldini N, Vergnaud P, Delmas PD, Zallone AZ. (1994) Osteocalcin induces

chemotaxis, secretion of matrix proteins, and calcium-mediated intracellular

signaling in human osteoclast-like cells. J Cell Biol. 127(4):1149-1158.

[25] Christenson RH. (1997) Biochemical markers of bone metabolism: an

overview. Clin Biochem. 30(8):573-593.

[26] Cook SD, Kay JF, Thomas KA, Jarcho M. (1987) Interface mechanics and


histology of titanium and hydroxylapatite-coated titanium for dental implant

applications. Int J Oral Maxillofac Implants. 2(1):15-22.

[27] Cranin A. (1958) A method of maxillary denture stabilisation. J Amer

Dent Assoc. 57:188.

[28] Davies JE. (1998) Mechanisms of endosseous integration. Int J

Prosthodont. 11(5):391-401.

[29] Degenhardt TP, Thorpe SR, Baynes JW. (1998) Chemical modification of

proteins by methylglyoxal. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 44(7):1139-1145.

[30] Devlin H, Garland H, Sloan P. (1996) Healing of tooth extraction sockets

in experimental diabetes mellitus. J Oral Maxillofac Surg. 54(9):1087-1091.

[31] Donath K, Breuner G. (1982) A method for the study of undecalcified

bones and teeth with attached soft tissues. The Sage-Schliff (sawing and grinding)

technique. J Oral Pathol. 11(4):318-326.

[32] Eitel F, Seiler H, Schweiberer L. (1981) [Morphologic examination of

animal-experiment results: comparison with regeneration of the human bone-

structure. I. Research methods (author's transl)]. Unfallheilkunde. 84(6):250-254.

[33] Eitel F, Seiler H, Schweiberer L. (1981) [Morphological examination of

animal-experiment results: comparison with regeneration of the human bone-

structure. II. Research results (author's transl)]. Unfallheilkunde. 84(6):255-264.

[34] Farzad P, Andersson L, Nyberg J. (2002) Dental implant treatment in

diabetic patients. Implant Dent. 11(3):262-267.

[35] Fiorellini JP, Chen PK, Nevins M, Nevins ML. (2000) A retrospective

study of dental implants in diabetic patients. Int J Periodontics Restorative Dent.

20(4):366-373.


[36] Fiorellini JP, Nevins ML. (2000) Dental implant considerations in the

diabetic patient. Periodontol 2000. 23:73-77.

[37] Glowacki J. (1998) Angiogenesis in fracture repair. Clin Orthop Relat Res.

(355 Suppl):S82-89.

[38] Goodman WG, Hori MT. (1984) Diminished bone formation in

experimental diabetes. Relationship to osteoid maturation and mineralization.

Diabetes. 33(9):825-831.

[39] Gotfredsen K, Wennerberg A, Johansson C, Skovgaard LT, Hjorting-

Hansen E. (1995) Anchorage of TiO2-blasted, HA-coated, and machined

implants: an experimental study with rabbits. J Biomed Mater Res. 29(10):1223-

1231.

[40] Green J, Schotland S, Stauber DJ, Kleeman CR, Clemens TL. (1995) Cell-

matrix interaction in bone: type I collagen modulates signal transduction in

osteoblast-like cells. Am J Physiol. 268(5 Pt 1):C1090-1103.

[41] Greenfield E. (1910) An artifical root. Dent Brief. 15:837.

[42] Grussner R, Nakhleh R, Grussner A, Tomadze G, Diem P, Sutherland D.

(1993) Streptozotocin-induced diabetes mellitus in pigs. Horm Metab Res.

25(4):199-203.

[43] Haitoglou CS, Tsilibary EC, Brownlee M, Charonis AS. (1992) Altered

cellular interactions between endothelial cells and nonenzymatically glucosylated

laminin/type IV collagen. J Biol Chem. 267(18):12404-12407.

[44] Hamada MO, Garrett NR, Roumanas ED, Kapur KK, Freymiller E, Han T,

Diener RM, Chen T, Levin S. (2001) A randomized clinical trial comparing the

efficacy of mandibular implant-supported overdentures and conventional dentures

in diabetic patients. Part IV: Comparisons of dietary intake. J Prosthet Dent.


85(1):53-60.

[45] Hasegawa H, Ozawa S, Hashimoto K, Takeichi T, Ogawa T. (2008) Type

2 diabetes impairs implant osseointegration capacity in rats. Int J Oral Maxillofac

Implants. 23(2):237-246.

[46] He H, Liu R, Desta T, Leone C, Gerstenfeld LC, Graves DT. (2004)

Diabetes causes decreased osteoclastogenesis, reduced bone formation, and

enhanced apoptosis of osteoblastic cells in bacteria stimulated bone loss.

Endocrinology. 145(1):447-452.

[47] Hoang QQ, Sicheri F, Howard AJ, Yang DS. (2003) Bone recognition

mechanism of porcine osteocalcin from crystal structure. Nature. 425(6961):977-

980.

[48] Hönig J, Merten H. (1993) Das Göttinger Miniaturschwein als

Versuchstier in der humanmedizinischer osteologischen Grundlagenforschung. Z

Zahnärztliche Implantol. 2:237-243.

[49] Huijberts MS, Wolffenbuttel BH, Boudier HA, Crijns FR, Kruseman AC,

Poitevin P, Levy BI. (1993) Aminoguanidine treatment increases elasticity and

decreases fluid filtration of large arteries from diabetic rats. J Clin Invest.

92(3):1407-1411.

[50] Iyama S, Takeshita F, Ayukawa Y, Kido MA, Suetsugu T, Tanaka T.

(1997) A study of the regional distribution of bone formed around hydroxyapatite

implants in the tibiae of streptozotocin-induced diabetic rats using multiple

fluorescent labeling and confocal laser scanning microscopy. J Periodontol.

68(12):1169-1175.

[51] Jahr H, van Driel M, van Osch GJ, Weinans H, van Leeuwen JP. (2005)

Identification of acid-sensing ion channels in bone. Biochem Biophys Res

Commun. 337(1):349-354.


[52] Javed F, Romanos GE. (2009) Impact of diabetes mellitus and glycemic

control on the osseointegration of dental implants: a systematic literature review. J

Periodontol. 80(11):1719-1730.

[53] Jiang D, Franceschi RT, Boules H, Xiao G. (2004) Parathyroid hormone

induction of the osteocalcin gene. Requirement for an osteoblast-specific element

1 sequence in the promoter and involvement of multiple-signaling pathways. J

Biol Chem. 279(7):5329-5337.

[54] Kasemo B, Lausmaa J. (1988) Biomaterial and implant surfaces: on the

role of cleanliness, contamination, and preparation procedures. J Biomed Mater

Res. 22(A2 Suppl):145-158.

[55] Kelin M, Frost H. (1964) The numbers of bone resorption and formation

foci in rib. Henry Ford Hosp Med Bull. 12:527-536.

[56] Kieswetter K, Schwartz Z, Hummert TW, Cochran DL, Simpson J, Dean

DD, Boyan BD. (1996) Surface roughness modulates the local production of

growth factors and cytokines by osteoblast-like MG-63 cells. J Biomed Mater

Res. 32(1):55-63.

[57] Klokkevold PR, Nishimura RD, Adachi M, Caputo A. (1997)

Osseointegration enhanced by chemical etching of the titanium surface. A torque

removal study in the rabbit. Clin Oral Implants Res. 8(6):442-447.

[58] Koopmans SJ, Mroz Z, Dekker R, Corbijn H, Ackermans M, Sauerwein H.

(2006) Association of insulin resistance with hyperglycemia in streptozotocin-

diabetic pigs: effects of metformin at isoenergetic feeding in a type 2-like diabetic

pig model. Metabolism. 55(7):960-971.

[59] Lappin DF, Eapen B, Robertson D, Young J, Hodge PJ. (2009) Markers of

bone destruction and formation and periodontitis in type 1 diabetes mellitus. J

Clin Periodontol. 36(8):634-641.


[60] Le Guehennec L, Goyenvalle E, Lopez-Heredia MA, Weiss P, Amouriq Y,

Layrolle P. (2008) Histomorphometric analysis of the osseointegration of four

different implant surfaces in the femoral epiphyses of rabbits. Clin Oral Implants

Res. 19(11):1103-1110.

[61] Lee WR, Marshall JH, Sissons HA. (1965) Calcium Accretion and Bone

Formation in Dogs: An Experimental Comparison between the Results of Ca-45

Kinetic Analysis and Tetracycline Labelling. J Bone Joint Surg Br. 47:157-180.

[62] Levin ME, Boisseau VC, Avioli LV. (1976) Effects of diabetes mellitus on

bone mass in juvenile and adult-onset diabetes. N Engl J Med. 294(5):241-245.

[63] Lieberman JR, Daluiski A, Einhorn TA. (2002) The role of growth factors

in the repair of bone. Biology and clinical applications. J Bone Joint Surg Am. 84-

A(6):1032-1044.

[64] Lim YJ, Oshida Y, Andres CJ, Barco MT. (2001) Surface

characterizations of variously treated titanium materials. Int J Oral Maxillofac

Implants. 16(3):333-342.

[65] Lincks J, Boyan BD, Blanchard CR, Lohmann CH, Liu Y, Cochran DL,

Dean DD, Schwartz Z. (1998) Response of MG63 osteoblast-like cells to titanium

and titanium alloy is dependent on surface roughness and composition.

Biomaterials. 19(23):2219-2232.

[66] Lu H, Kraut D, Gerstenfeld LC, Graves DT. (2003) Diabetes interferes

with the bone formation by affecting the expression of transcription factors that

regulate osteoblast differentiation. Endocrinology. 144(1):346-352.

[67] Lumachi F, Camozzi V, Tombolan V, Luisetto G. (2009) Bone mineral

density, osteocalcin, and bone-specific alkaline phosphatase in patients with

insulin-dependent diabetes mellitus. Ann N Y Acad Sci. 1173 Suppl 1:E64-67.


[68] Lynch MP, Stein JL, Stein GS, Lian JB. (1995) The influence of type I

collagen on the development and maintenance of the osteoblast phenotype in

primary and passaged rat calvarial osteoblasts: modification of expression of

genes supporting cell growth, adhesion, and extracellular matrix mineralization.

Exp Cell Res. 216(1):35-45.

[69] MacDonald DE, Markovic B, Allen M, Somasundaran P, Boskey AL.

(1998) Surface analysis of human plasma fibronectin adsorbed to commercially

pure titanium materials. J Biomed Mater Res. 41(1):120-130.

[70] Marshall M. (1979) Induction of chronic diabetes by streptozotocin in the

miniature pig. Res Exp Med (Berl). 175(2):187-196.

[71] Marshall M, Sprandel U, Zollner N. (1975) [Streptozotocin diabetes in a

miniature pig (author's transl)]. Res Exp Med (Berl). 165(1):61-65.

[72] Martin A, Komada MR, Sane DC. (2003) Abnormal angiogenesis in

diabetes mellitus. Med Res Rev. 23(2):117-145.

[73] Martin JY, Schwartz Z, Hummert TW, Schraub DM, Simpson J, Lankford

J, Jr., Dean DD, Cochran DL, Boyan BD. (1995) Effect of titanium surface

roughness on proliferation, differentiation, and protein synthesis of human

osteoblast-like cells (MG63). J Biomed Mater Res. 29(3):389-401.

[74] Mbanya J-C, Gan D, Allgot B, Bakker K, Brown JB, Ramachandran A,

Roglic G, Shaw J, Silink M, Siminerio L, Williams R, Zimmet P. DIABETES

ATLAS Thired Edition. 2006 [cited; 3:[Available from:

http://www.diabetesatlas.org/sites/default/files/IDF%20Diabetes%20Atlas-

2007%20(3rd%20edition).pdf

[75] McCabe LR, Banerjee C, Kundu R, Harrison RJ, Dobner PR, Stein JL,

Lian JB, Stein GS. (1996) Developmental expression and activities of specific fos

and jun proteins are functionally related to osteoblast maturation: role of Fra-2

and Jun D during differentiation. Endocrinology. 137(10):4398-4408.


[76] Mellado-Valero A, Ferrer Garcia JC, Herrera Ballester A, Labaig Rueda C.

(2007) Effects of diabetes on the osseointegration of dental implants. Med Oral

Patol Oral Cir Bucal. 12(1):E38-43.

[77] Meraji S, Jayakody L, Senaratne MP, Thomson AB, Kappagoda T. (1987)

Endothelium-dependent relaxation in aorta of BB rat. Diabetes. 36(8):978-981.

[78] Mericske-Stern R. (1994) Overdentures with roots or implants for elderly

patients: a comparison. J Prosthet Dent. 72(5):543-550.

[79] Morris HF, Ochi S, Winkler S. (2000) Implant survival in patients with

type 2 diabetes: placement to 36 months. Ann Periodontol. 5(1):157-165.

[80] Motyl K, McCabe LR. (2009) Streptozotocin, Type I Diabetes Severity

and Bone. Biol Proced Online.

[81] Mundy GR, Poser JW. (1983) Chemotactic activity of the gamma-

carboxyglutamic acid containing protein in bone. Calcif Tissue Int. 35(2):164-

168.

[82] Noda M. (1989) Transcriptional regulation of osteocalcin production by

transforming growth factor-beta in rat osteoblast-like cells. Endocrinology.

124(2):612-617.

[83] Ogawa N, Yamaguchi T, Yano S, Yamauchi M, Yamamoto M, Sugimoto

T. (2007) The combination of high glucose and advanced glycation end-products

(AGEs) inhibits the mineralization of osteoblastic MC3T3-E1 cells through

glucose-induced increase in the receptor for AGEs. Horm Metab Res. 39(12):871-

875.

[84] Ohsawa K, Neo M, Matsuoka H, Akiyama H, Ito H, Kohno H, Nakamura

T. (2000) The expression of bone matrix protein mRNAs around beta-TCP

particles implanted into bone. J Biomed Mater Res. 52(3):460-466.


[85] Ohta S, Hiraki Y, Shigeno C, Suzuki F, Kasai R, Ikeda T, Kohno H, Lee

K, Kikuchi H, Konishi J, et al. (1992) Bone morphogenetic proteins (BMP-2 and

BMP-3) induce the late phase expression of the proto-oncogene c-fos in murine

osteoblastic MC3T3-E1 cells. FEBS Lett. 314(3):356-360.

[86] Olson JW, Shernoff AF, Tarlow JL, Colwell JA, Scheetz JP, Bingham SF.

(2000) Dental endosseous implant assessments in a type 2 diabetic population: a

prospective study. Int J Oral Maxillofac Implants. 15(6):811-818.

[87] Ottoni CE, Chopard RP. (2004) Histomorphometric evaluation of new

bone formation in diabetic rats submitted to insertion of temporary implants. Braz

Dent J. 15(2):87-92.

[88] Park JY, Davies JE. (2000) Red blood cell and platelet interactions with

titanium implant surfaces. Clin Oral Implants Res. 11(6):530-539.

[89] Peretz A. (1993) [Osteocalcin, marker of bone metabolism]. Bull Mem

Acad R Med Belg. 148(1-2):90-96; discussion 97-99.

[90] Quintero DG, Winger JN, Khashaba R, Borke JL. (2010) Advanced

glycation endproducts and rat dental implant osseointegration. J Oral Implantol.

36(2):97-103.

[91] Rezania A, Healy KE. (1999) Biomimetic peptide surfaces that regulate

adhesion, spreading, cytoskeletal organization, and mineralization of the matrix

deposited by osteoblast-like cells. Biotechnol Prog. 15(1):19-32.

[92] Schatzle M, Mannchen R, Balbach U, Hammerle CH, Toutenburg H, Jung

RE. (2009) Stability change of chemically modified sandblasted/acid-etched

titanium palatal implants. A randomized-controlled clinical trial. Clin Oral

Implants Res. 20(5):489-495.

[93] Schenk RK, Buser D. (1998) Osseointegration: a reality. Periodontol 2000.


17:22-35.

[94] Schlegel KA, Lang FJ, Donath K, Kulow JT, Wiltfang J. (2006) The

monocortical critical size bone defect as an alternative experimental model in

testing bone substitute materials. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol

Endod. 102(1):7-13.

[95] Schlegel KA, Thorwarth M, Plesinac A, Wiltfang J, Rupprecht S. (2006)

Expression of bone matrix proteins during the osseus healing of topical

conditioned implants: an experimental study. Clin Oral Implants Res. 17(6):666-

672.

[96] Siqueira JT, Cavalher-Machado SC, Arana-Chavez VE, Sannomiya P.

(2003) Bone formation around titanium implants in the rat tibia: role of insulin.

Implant Dent. 12(3):242-251.

[97] Sodek J, Cheifetz S, Davies J. (1999) Molecular regulation of

osteogenesis. Bone Engineering.31-43.

[98] Straumann. Implantatinsertion. 15.09.2010 [cited; Available from:

http://www.straumann.ch/pc_15x_526_sla_healing_time.pdf

[99] Swaminathan R. (2001) Biochemical markers of bone turnover. Clin Chim

Acta. 313(1-2):95-105.

[100] Takeshita F, Iyama S, Ayukawa Y, Kido MA, Murai K, Suetsugu T.

(1997) The effects of diabetes on the interface between hydroxyapatite implants

and bone in rat tibia. J Periodontol. 68(2):180-185.

[101] Tanaka S, Avigad G, Brodsky B, Eikenberry EF. (1988) Glycation induces

expansion of the molecular packing of collagen. J Mol Biol. 203(2):495-505.

[102] Tepper OM, Galiano RD, Capla JM, Kalka C, Gagne PJ, Jacobowitz GR,


Levine JP, Gurtner GC. (2002) Human endothelial progenitor cells from type II

diabetics exhibit impaired proliferation, adhesion, and incorporation into vascular

structures. Circulation. 106(22):2781-2786.

[103] Tesfamariam B, Brown ML, Deykin D, Cohen RA. (1990) Elevated

glucose promotes generation of endothelium-derived vasoconstrictor prostanoids

in rabbit aorta. J Clin Invest. 85(3):929-932.

[104] Thorwarth M, Rupprecht S, Falk S, Felszeghy E, Wiltfang J, Schlegel KA.

(2005) Expression of bone matrix proteins during de novo bone formation using a

bovine collagen and platelet-rich plasma (prp)--an immunohistochemical analysis.

Biomaterials. 26(15):2575-2584.

[105] Truhlar RS, Orenstein IH, Morris HF, Ochi S. (1997) Distribution of bone

quality in patients receiving endosseous dental implants. J Oral Maxillofac Surg.

55(12 Suppl 5):38-45.

[106] Verhaeghe J, van Herck E, Visser WJ, Suiker AM, Thomasset M, Einhorn

TA, Faierman E, Bouillon R. (1990) Bone and mineral metabolism in BB rats

with long-term diabetes. Decreased bone turnover and osteoporosis. Diabetes.

39(4):477-482.

[107] von Wilmowsky C, Bauer S, Lutz R, Meisel M, Neukam FW, Toyoshima

T, Schmuki P, Nkenke E, Schlegel KA. (2009) In vivo evaluation of anodic TiO2

nanotubes: an experimental study in the pig. J Biomed Mater Res B Appl

Biomater. 89(1):165-171.

[108] von Wilmowsky C, Stockmann P, Harsch I, Amann K, Metzler P, Lutz R,

Möst T, Neukam FW, Schlegel KA. (2010) Histopathological changes in the hard

and soft tissue due to diabetes mellitus negatively affect peri-implant bone

formation in the diabetic domestic pig - an 18 month study. Journal of Clinical

Periodontolgy.

[109] Wall I, Donos N, Carlqvist K, Jones F, Brett P. (2009) Modified titanium


surfaces promote accelerated osteogenic differentiation of mesenchymal stromal

cells in vitro. Bone. 45(1):17-26.

[110] Waltenberger J. (2001) Impaired collateral vessel development in diabetes:

potential cellular mechanisms and therapeutic implications. Cardiovasc Res.

49(3):554-560.

[111] Ward DT, Yau SK, Mee AP, Mawer EB, Miller CA, Garland HO, Riccardi

D. (2001) Functional, molecular, and biochemical characterization of

streptozotocin-induced diabetes. J Am Soc Nephrol. 12(4):779-790.

[112] Wissing H, Stürmer K, Breidenstein G. Die Wertigkeit verschiedener

Versuchstierspecies für experimentelle Untersuchungen am Knochen. Hefte zur

Unfallheilkunde. 1990:479-488.

[113] Wolf G. (1996) Function of the bone protein osteocalcin: definitive

evidence. Nutr Rev. 54(10):332-333.

[114] Xiao Y, Truskey GA. (1996) Effect of receptor-ligand affinity on the

strength of endothelial cell adhesion. Biophys J. 71(5):2869-2884.

[115] Yu S, Franceschi RT, Luo M, Zhang X, Jiang D, Lai Y, Jiang Y, Zhang J,

Xiao G. (2008) Parathyroid hormone increases activating transcription factor 4

expression and activity in osteoblasts: requirement for osteocalcin gene

expression. Endocrinology. 149(4):1960-1968.

[116] Zhao G, Schwartz Z, Wieland M, Rupp F, Geis-Gerstorfer J, Cochran DL,

Boyan BD. (2005) High surface energy enhances cell response to titanium

substrate microstructure. J Biomed Mater Res A. 74(1):49-58.

[117] Zhao W, Byrne MH, Wang Y, Krane SM. (2000) Osteocyte and osteoblast

apoptosis and excessive bone deposition accompany failure of collagenase

cleavage of collagen. J Clin Invest. 106(8):941-949.


[118] Zinger O, Zhao G, Schwartz Z, Simpson J, Wieland M, Landolt D, Boyan

B. (2005) Differential regulation of osteoblasts by substrate microstructural

features. Biomaterials. 26(14):1837-1847.

[119] Zitzmann NU, Scharer P, Marinello CP. (1999) Factors influencing the

success of GBR. Smoking, timing of implant placement, implant location, bone

quality and provisional restoration. J Clin Periodontol. 26(10):673-682.

IX. Abkürzungsverzeichnis 70

IX. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Abkürzung Erklärung

IDF Internationale Diabetes Federation

ADA American Diabetes Association

WHO World Health Organisation

RGD Arginin-Glycin-Aspartat

dpi Digits per inch

tif Tagged image file

EDTA Ethylendiamintetraacetat

MEA Methoxyehtylacatat

ROI Region of Interest

PMMA Polymethylmetacrylat

KIK Knochen-Implantat-Kontakt

AGE Advanced Glycation Endproducts

LSAB Labeled-(Strept)-Avidin-Biotin

AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol

vWF Von Willebrand Faktor

GP Glykoproteinkomplex

ER Endoplasmatisches Retikulum

TGF Transforming Groth Factor

IGF Insulin Like Groth Factor

IEG Immediate Early Gene

BMP Bone Morphogenic Proteins

PGE2 Prostaglandin E2

IX. Anhang 71

X. ANHANG

Dehydration, Intermedium, Präinfiltration , Infiltration

Stufe: Lösung: Konzentration: Zeit: Entwässerung 1 Ethanol 70% 6 Tage Entwässerung 2 Ethanol 80% 6 Tage Entwässerung 3 Ethanol 90% 6 Tage Entwässerung 4 Ethanol 96% 6 Tage Entwässerung 5 Ethanol 100% 6 Tage Entwässerung 6 Ethanol 100% 6 Tage Entwässerung 7 Ethanol 100% 6 Tage Intermedium 1 Xylol 6 Tage Intermedium 2 Xylol 6 Tage Präinfiltration 1 Xylol/Technovit 9100 Basis stab. + Härter 1 5 Tage Präinfiltration 2 Technovit 9100 Basis stab. + Härter 1 2 Tage Präinfiltration 3 Technovit 9100 Basis entstab* + Härter 1 2 Tage Infiltration

Technovit 9100 Basis entstab* + Härter 1 + PMMA Pulver

7 Tage

* Basislösung wurde vor Verwendung mit Hilfe von Aluminiumoxid entstabilisiert

Herstellung der Gebrauchslösungen aus den Technovit- Komponenten

Materialnummer 1 2 3 4 5

Bezeichnung Basis-Lösung

PMMA- Pulver Härter 1 Härter 2 Regler

Präinfiltration 200 ml 1 g Infiltration ad 250 ml 20 g 1 g Stammlösung A ad 500 ml 80 g 3 g Stammlösung B ad 50 ml 4 ml 2 ml

Rezept der Toluidinblau-O Färbelösung

Ansatz A 800ml AquaDest 8 g Natrium- Tetraborat 8 g Toluidinblau-O (Chroma 1B481) 15 min Rühren Ansatz B 200ml AquaDest 2 g Pyronon G (Merck 107518) 15 min Rühren

15 min Ansatz A und Ansatz B mischen und anschließend 2x filtrieren

12 Tage Lichtgeschützte Reifung der Lösung

IX. Anhang 72

Färberezept Toluidinblau-O Lösung Zeitdauer: Anwendung: Einsortieren von ja 10 Objektträgern in die Glasküvette 15 min Schliffpräparate in 30 % H2O2 schwenken 5 min Fließendes Leitungswasser Trocknen der Präparate mit Papiertüchern 15 min Färbung in Toluidinblau-O (Rezept siehe unten) 5 min Fließendes Leitungswasser Lichtgeschützte Lagerung der Präparate

Färberezept Collagen Typ-I

manuell: 3 x 20 min Entacrylierung in MEA

5 x 3min absteigende Alkoholreihe (Ethanolkonz.: 100%, 100%, 97%,90%,70%)

3 min Aqua dest 20 min Entkalken in 10%iger EDTA-Lösung 10 min Ausspülen unter fließendem Leitungswasser

3 x 2 min Aqua dest 3 x 2 min DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4

25 min Kochen im Citrat-Puffer mit pH 6,0 bei 95°C 25 min Abkühlen im Citratpuffer mit pH 6,0

3 x 2min DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4

im Autostainer: 15 min Avidin (DAKO X0590)

Spülen mit Aqua dest 15 min Biotin (DAKO X0590)

Spülen mit Aqua dest 20 min Proteinblock (DAKO X 0909)

60 min Primärantikörper Osteocalcin 1:10´000 verdünnt mit Antibody Diluent

Spülen mit Aqua dest 15 min biotinylierter Sekundärantikörper (Lösung A)

Spülen mit Aqua dest 15 min Streptavidin-AP-Komplex (Lösung B)

Spülen mit Aqua dest 8 min Chromogen RED (DAKO K5005)


10 min Spülen mit Aqua dest

manuell: 5 min Gegenfärbung mit Hämalaun (DAKO S3301) 5 min Ausspülen unter fließendem Leitungswasser 5 min Aqua dest

Mit Aquatex eindecken

IX. Anhang 73

Färberezept Osteocalcin

manuell: 3 x 20 min Entacrylierung in MEA

5 x 3min absteigende Alkoholreihe (Ethanolkonz.: 100%, 100%, 97%,90%,70%)

3 min Aqua dest 20 min Entkalken in 10%iger EDTA-Lösung 10 min Ausspülen unter fließendem Leitungswasser

3 x 2 min Aqua dest 3 x 2 min DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4

25 min Kochen im Citrat-Puffer mit pH 6,0 bei 100°C 25 min Abkühlen im Citratpuffer mit pH 6,0

3 x 2min DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4

im Autostainer: 15 min Avidin (DAKO X0590)

Spülen mit Aqua dest 15 min Biotin (DAKO X0590)

Spülen mit Aqua dest 30 min Proteinblock (DAKO X 0909)

60 min Primärantikörper Osteocalcin 1:10´000 verdünnt mit Antibody Diluent

Spülen mit Aqua dest 15 min biotinylierter Sekundärantikörper (Lösung A)

Spülen mit Aqua dest 15 min Streptavidin-AP-Komplex (Lösung B)



10 min Spülen mit Aqua dest

manuell: 5 min Gegenfärbung mit Hämalaun (DAKO S3301) 5 min Ausspülen unter fließendem Leitungswasser 5 min Aqua dest

Mit Aquatex eindecken

IX. Danksagung 74

XI. DANKSAGUNG

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Dr. med. dent. K.A. Schlegel für

die Planung des Versuchsvorhabens sowie für Motivation, Gespräche und Hilfe

über die Dissertation hinaus. Seine Anleitung zur wissenschaftlichen Tätigkeit

und seine zuverlässige Betreuung hat wesentlichen Anteil am Gelingen dieser

Arbeit.

Herrn Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. F.W. Neukam, Direktor der Klinik

und Poliklinik für Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgie der Friedrich Alexander

Universität Erlangen-Nürnberg gilt mein Dank für die Schaffung der notwendigen

Vorraussetzungen zur Durchführung dieser Arbeit im S1-Labor der Klinik.

Ein besonderer Dank gilt meinem Betreuer, Herrn Dr. med. dent C. von

Wilmowsky für die gewissenhafte Betreuung und die fachliche Beratung. Mein

persönlicher Dank gilt meinem Projektpartner und Freund Christian Seidl für die

freundschaftliche und erfolgreiche Zusammenarbeit.

Ich danke Frau Dr. J. Ries, Frau S. Schönherr, Frau H. Heider und Frau E. Diebel

für die wertvolle Einarbeitung und tatkräftige Unterstützung im Labor. Ihre

Ratschläge und Anregungen waren mir stets eine große Hilfe.

Am Ende gilt ein ganz besonderer Dank meinen lieben Eltern. Durch ihre unent-

wegte Hilfe und großzügige Unterstützung in allen Jahren haben sie die vorlie-

gende Dissertation erst ermöglicht.

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