(Aus dem Kaiser Wilhehn-Institut/fir Biologie, Berlin-Dahlem, Abteilung M. HARTMAZ~ und der Zoologischen Station in Neapel.)

(~BER DAS VEI~HALTEN DES STOLONIALEN GEWEBES DER ASCIDIE CLAVELINA LEPADIFORMIS I N VITRO 1.

Von ILSE I~ISC~,~.

Mit 7 Textabbildungen.

(Eingegange,~ am 27. Oktober 1937.)

Von den in der gewebezfiehterischen Literatur erSrterten Fragen er- scheinen entwicklungsphysiologisch vor ahem zwei besonders interessant :

1. Entdifferenzieren sich die Gewebe nach der Explantat ion ? 2. Warum ist eine Gewebekultur im aUgemeinen nur bei embryo-

nalen Zellen mSglich ? Manche Gewebeztichter deuten gewisse morphologisehe und funk-

tionelle Ver/~nderungen, welche die Zellen in vitro zeigen, als l~olge einer Entdifferenzierung, so z. B. vor allem CHA~PY und OLIvo. Dagegen wurde von anderer Seite, besonders yon A. FISCHER und R. PA~KV,~, in verschiedenen Untersuchungen nachgewiesen, dal] die Zellen in der Kul tur ihre spezifischen Merkmale und besonders auch physiologische Eigenschaften, wie etwa ihre inh/~rente Wachstumsenergie oder bei b6s- artigen Geweben den Grad der Malignit/it dauernd bewahren.

Wenn in dieser Hinsicht die Meinungen der Forscher heute noch recht verschieden sind, so mag das wohl auch mit darauf beruhen, da[~ manche dem Begriff Differenzierung einen rein morphologischen Inhal t gaben und demzufolge von einer Entdifferenzierung sprachen, wenn in vitro bestimmte strukturelle Eigentfimlichkeiten der Zellen zuriick- gebildet wurden, ohne dabei jedoeh an eine rfickl/tufige Umwandlung der Zellen zu einem wirklich embryonalen und auch wieder omnipotenten Typus zu denken. Diese Auffassung wurde sehr eindeutig von BE~ILL ge/~uBert: "Dedifferentiation does not effect the real nature of a cell but only its structural expression. The direction of spezialization once determined is irreversible. Dedifferentiated cells are able to rediffe- rentiate only along the original line." Indessen vertreten einige Autoren doch auch ganz best immt die Ansicht, dal~ die Differenzierung der Zellen ein v6llig reversibler Vorgang sei und die Gewebezelle im Entdifferen- zierungsproze~ den Weg der ontogenetisehen Entwicklung in umgekehrter Richtung zurficklege.

Der Diskussion fiber die Entdifferenzierung in vitro lagen bisher nur Befunde an Vertebraten zugrunde. Es erschicn deshalb wichtig zu

1 Ausgefiihrt mit Unterstfitzung der Deutschen Forsehungsgemeinsehaft.

384 Ilse Fischer: ~ber das Verhalten des stolonialcn Gewebes

wissen, wie sich in dieser Hinsicht die Gewebe yon Wirbellosen verhalten, die sich oft durch ein hohes RegenerationsvermSgen auszeichnen; und bei denen die Regenerationsprozesse vielfach auf einer Ent- oder Um- differenzierung yon Zellen beruhen sollen. So hatte I)RIESCIt vermutet, dab bei der Aseidie Clavelina nach Verwundungen oder anderen Sch~- digungen eine Entdifferenzierung yon Zellen einsetze, die sieh sp~iter in den Regeneraten wieder differenzieren. Dieser Meinung schloB sich sp~ter vor allem ScHunZ an, der bei Clavelina im Verlauf yon Reduk- tionserseheinungen, die der Regeneration vorausgehen, eine Entdifferen- zierung der Organe etwa zum Stadium der embryonalen Organanlage besehrieb. Andererseits hatte nun vor allem BRIEN festgestellt, dab tiberall im K6rper der Clavelina auch in den Stolonen und in den so- genannten ,,Winterknospen" undifferenzierte Zellen vorkommen, die bei der Knospung die Organe der neuen Clavelina bilden.

Es ersehien deswegen lohnend, zu untersuchen, wie sich das stoloniale Gewebe yon Clavelina nach der Explantation verh~lt: ob alle Elemente in vitro auswachsen, ob sich die differenzierten Zellen entdifferenzieren, und ob es auch in vitro zu einer Differenzierung und Regeneration der Gewebe kommt. Vom Standpunkt des Gewebeziichters aus waren E x- plantationsversuche an diesem Gewebe auch noch aus folgenden Er- w~gungen heraus interessant: In den Stolonen kommen nebeneinander differenzierte und embryonale Zellen vor. Nun sind die meisten Gewebe nur w~hrend einer bestimmten Periode der ontogenetischen Entwicklung ziichtbar, nur wenige Zellen, wie Lymphocyten, fibrocyten~hnliche Formen und die b6sartigen Geschwulstzellen, maehen hiervon eine Aus- nahme. Man hat diese Erseheinung, die allerdings kaum ]emals Gegen- stand spezieller Untersuchungen oder eingehenderer Er6rterungen ge- wesen ist, mit dem durch die spezielle Funktion in bestimmter Richtung festgelegten Metabolismus der Zelle zusammengebraeht oder mit ,,hor- monalen Einflfissen" des Spenders, die mit dessem Alter sieh ~ndern. Es war nieht eine L6sung dieses Problems an dem vorliegenden Objekt zu erwarten, aber es werden bier vielleieht bestimmte Fragen auftauchen, die fiir eine weitere Kl~rung desselben wesentlieh sein k6nnen; denn hier sind die Verh~ltnisse sehr viel einfacher: Beziehungen zum Alter des Tieres, von dem die Explantate stammen, zu hormonalen Einfliissen usw. fallen weg. AuBerdem befinden sich in den Winterknospen alle Zellen in einem l~uhestadium, so dab auch funktionelle Zust~nde beim Auswaehsen der Zellen keine Rolle spielen kSnnen. Wenn sich hier charakteristisehe Unterschiede in der Ziichtbarkeit der verschiedenen Elemente ze[gten, so muBte dies auf Faktoren zuriickgefiihrt werden, die in den Zellen selbst bzw. in ihrer friiheren Lebensgeschiehte be- grtindet sind.

Die experimentellen Untersuehungen wurden im Friihjahr 1937 an der Zoologisehen Station in Neapel durehgefiihrt. Es war ein besonders

der Asci(tie Clavelina lc])adiformis in vitro. '~85

gliieklieher Umstand , dab gleiehzeitig dort yon RIES das Verhal ten der differenzierten und undifferenzier ten Zellen yon Clavelina in vivo unte rsucht und besonders ihr Schicksal bei der Redukt ion, der Knospung und Regenerat ion verfolgt wurde 1. Denn fiber diese Erscheinungen lagen bis in neueste Zeit noch e inander widersprechende Angaben vor (vgl. die Arbei ten yon SPEK, B~IE~r B~RI~L). AuBerdem war es fiir die vorliegenden Unte r suchungen natfirlich besonders wertvoll, unmi t t e lba r das Verhal ten der Zellen in vitro mi t dem bei Regenerationsvorg/ingen in vivo vergleichen zu k6nnen.

Material und Teehnik. Explantiert wurde das Gewebe aus den Stolonen oder den sogenarmten ,,Winter-

knospen", die als besondere Dauerstadien des stolonialen Systems unter ungfinstigen Verh/~ltnissen gebildet werden, und aus denen sparer neue kleine Clavelinen hervor- knospen. Ieh babe zu den Explantationsversuchen immer nur solche Tiere ver- wendet, die am gleiehen Tage frisch aus dem Meere geholt worden waren.

Zur Desinfektion wurden die Tiere vor der Explantation 10 Min. lang in sterilem Seewasser mit einem Zusatz yon 0,4% Chloramin gewasehen, was sie gut ver- trugen und wodureh immer eine v611ige /iuflere Sterilit/~t erreicht wurde. Darauf wurden die Tiere bzw. die Winterknospen in reines steriles Seewasser fibertragen, das so oft gewechselt wurde, bis die Wasehfliissigkeit nicht mehr nach Chlor roch. Dazu ist mindestens ein 6--10maliges Wechseln des Wassers erforderlich. Nun wurde die Zellulosehiille aufgeschnitten. Bei den Winterknospen quillt dann das Gewebe manchmal als ein mehr oder minder loekerer Zellbrei hervor, aber es lassen sich doeh noch kleine Stiickchen zusammenhangenden Gewebes in das Kultur- medium tibertragen. Handelte es sieh um die Stolofortsi~tze einzelner Tiere, so wurden die Clavelinen vorsiehtig mit Irispinzetten aus der Zellulosehiille heraus- genommen. Man mug dabei peinlichst eine Verletzung des Darmes vermeiden, da sonst immer die ganze Sterilit/tt wieder verloren geht. Die Stolonenfaden wurden mit einem feinen Messerchen abgeschnitten und in das Ziichtungsmedium iibertragen. Es war nStig, sie dann im Medium noch mehrfach anzuschneiden, denn die Zellauswanderung erfolgte immer nur an den Schnittfl/i.ehen, die bei so feinen haarf6rmigen Gebilden wie diesen Stolonen natiirlich verh/s klein waren.

Es kam nun vor allem darauf an, ein ad/~quates Medium fiir die Ziichtung dieses Gewebes zu Iinden. Naeh den Erfahrungen an Vertebratenkulturen war eine ge- rinnungsf/thige Flfissigkeit erforderlich, der man wachstumsfSrdernde Substanzen zusetzen konnte. Es ist wichtig, dab die auswachsenden Zellen im Medium einen Geriistapparat vorfinden, der irgendwie der Struktur des geronnenen Vertebraten- plasmas entspricht; denn es hat sieh herausgestellt, dab die ausgewanderten Zellen nur an den Grenzfl/~chen zwischen der festen und der fliissigen Phase entlang kriechen.

Ich habe folgende Medien ausprobiert: 1. Reines steriles Seewasser, 2. Seewasser 6% Glucose, 3. Gelatine in Seewasser gel6st (0,5--10%), 4. Agar in Seewasser

gel6st (0,1--1%), 5. Mischungen dieser Agar- und Gelatinel6sungen, 6. kiinstliche PeptonlSsungen nach MVRRAY, 7. Mischungen der PeptonlSsungen mit Agar oder GelatinelSsungen, 8. H/~molymphe yon Phallusia.

Um wachstumsf6rdernde Substanzen hinzuzufiigen, wurden jeweils zugesetzt: I. ttfihnerembryonalextrakt im Verh/iltnis 1:2, 2. einige Tropfen einer Abkochung yon Gartenerde, wie sie im Kaiser Wilhelm-Institut ffir Biologie in Berlin-Dahlem bei der Kultur yon Algen verwandt wird.

1 Vgl. die beiden Arbeiten yon RI~S im gleichen IIefte dieses Archivs.

~V, 7%ollx' A r i ' h iv f. En lwiek l l lno . s lne ( .han ik . I'Id, 127. 25

386 Ilse Fischer: l~ber das Verhalten des stolonialen Gewebes

Leider verliefen alle Versuche mit kiinstlichen festen Medien (Agar, Gelatine) durchaus negativ. Nur in ganz seltenen Fallen kam es zu einer Auswanderung einzelner Zellen, die sich aber nie gowebeartig zu einer Wachstumszone zusammen- sehlossen. Es liegt in der Literatur zwar eine Reihe yon Angaben vor, nach denen Gewebe in Agar auswachsen (KRo~TowsKI, LOEB, L~WIS, I~G~BRIG~S~) ; indessen hat A. FISCH~.R wohl recht, wenn er meint, dab es sich in diesen FMlen nur darum gehandelt hahen kann, da6 einzelne Zellen in Spalten des Mediums eingedrungen waren. In reinem sterilem Seewasser kam es oft auch zu einer Zellauswanderung, doch gingen die Explantate innerhalb yon 24--36 Stunden zugrunde. Zus~tze yon Glucose, Hiihnerembryonalextrakt und Erdabkochung verlangerten das Leben der Kulturen. Gtinstiger waren jedoch die MvRAYschenPeptonlSsungen und Pepton- 15sung-4-Embryonalextrakt. Am besten aber wuehsen die Kulturen in einem Medium aus, das aus 2 Teilen H~molymphe yon Phallusia und 1 Teil Hiihner- embryonalextrakt (mit einem Zusatz yon 1 Tropfen ]~rdabkochung auf 10 Tropfen E-Extrakt) bestand. Ich babe daher zu den meisten Explantationsversuchen dieses Medium verwandt.

Wenn in einem h~ngenden Tropfen yon der iibliehen GrSBe explantiert wurde, zog sich das Gewebe jedoch bald kugelig zusammen. Handelte es sich um verzweigte Stolonen, so rundeten sich vor allem die Schnittfl~chen ab, an dencn sich bald wieder das Oberfl~chenepithel formierte. Zu weiteren Regenerationserscheinungen kam es aber ebensowenig wie zu einer Zellauswanderung. Nur gelegentlich 16sten sich einzelne Zellen ab, die ffei im Medium schwammen. War aber der Medium- tropfen besonders klein oder an den Rand des Objekttr~gers geflossen, so begarm zwischen der 6.--12. Stunde nach der Explantation eine lebhafte Zellauswanderung, und die ausgewanderten Zellen schlossen sich sparer gewebeartig zusammen. Vermutlich spiclen dabei vor allem Obcffl~tchcnkr~fte eine Rolle; das Explantat wird am Glimmer durch Adhesion festgehalten. Die es umgebende Fliissigkeitslamelle scheint den auswandernden Zellen zun~chst eine geniigende Stiitze zu bieten. Bekanntlich sollen Spannungen und Oberfl~chenkr~fte die Zellauswanderung direkt begiinstigen, Iffach den VersuChen yon WEIss, die kiirzlich yon DttGGV.LI best~tigt wurden, wachsen Fibroblastenkulturen jeweils am intensivsten in Richtung der st~rksten Spannung. Deswegen setzte ich nun, da ich gezwungen war, mit einem fliissigen Medium zu arbeiten, dem Kulturtropfen jeweils feint Glasi~den (Glaswolle) zu, um die Oberflachenspannung zu erhShen und erreichte so regelm~Big eine Zell- auswanderung und Bildung typischer Wachstumszonen.

Ich mSchte jedoch ausdriicklich hervorheben, dab diese Technik noch sehr viel zu wiinschen iibrig l~13t. Oft starben plStzlich ganze Kulturen ab, denn die so gebildeten Fliissigkeitsgrenzfl~tchen scheinen auf die Dauer den ausgewachsenen Zellen doch keine hinreichende Stiitze zu bieten. Auch erwies es sich als nStig, die Kulturen t~glich zu waschen und umzusetzen, da in der relativ geringen Fliissig- keitsmenge, die ihnen zur Verfiigung steht, leicht eine ~mderung der Salzkonzen- tration eintreten kann, wogegen die Gewebszcllen sehr empfindlich sind. Es gelang auch schlieBlich, bei der Kultur yon embryonalem Sepiagewebe, die Technik durch Ziichtung in Htihnerplasma, das dem Seewasser durch Zugabe der fehlcnden Salze isotonisch gemacht worden war, zu verbressen 1. Indessen waren zu dcr Zeit die Versuche mit Clavelina schon abgeschlossen und auch das Ende meines Neapeler Aufenthaltes herangekommen, so dab ich die im folgenden geschilderten Explanta- tionsversuche nieht noch einmal mit Hiihnerplasma wiederholen konnte.

Leider war es nicht mtiglich, die sehr kleinen und zartcn Kulturen beim Um- se tzen auszuscheiden und zu teilen, da sie dabei regelmiiBig zerrissen wurden. Wenn man die Triimmer dann in frisches Medium iibertrug, wuchsen sie nicht wieder aus, da sie offenbar meehanisch sehr stark geschadigt worden waren. Ich muBte

x Verh. dtseh, zool. Ges. 1987.

der Ascidie Clavelina lepadiformis in vitro. 387

mich daher ausschliel~lich der MAxI~owschen ~dethode bedienen. Dabei setzt man die Kultur auf einem besonderen kleinen Glimmer an, der mit einem TrSpfchen einer steri]en Flfissigkeit an dem Deckglimmer angeklebt wird. Die Kultur kann dann beim Umsetzen immer wieder mit dem kleinen Glimmer abgehoben werden. Diese Technik ist ffir die Wachstumsprozesse nicht besonders giinstig. Nach E. MAY~R spielt tfir das Wiedereinsetzen des Wachstums bei jeder Passage das Zusammenziehen der Kulturen nach dem Herausschneiden aus dem Medium eine wesentliche Rolle. Die MAxiMowsche Methode bot jedoch die einzige MSglichkeit, bei Clavelina das Wachstum der Kulturenl~ngere Zeit (5--6 Wochen) aufreehtzuerhalten. Es war dies wichtig, um zu entseheiden, ob es sich wirklich um ein Wachstum in vitro auf Grund der ~qahrstoffe des Mediums handelte, oder ob nur eine Zell~us- wanderung und Epithelbildung vorlag. Das Auftreten yon Mitosen in der Wachs- tumszone vermag diese Frage noch nicht zu entseheiden. Denn eine Zeitlang kSnnen sich die Zellen noch vermSge ihrer eigenen Residualenergie teilen. Nach den Effahrungen an Vertebratenkulturen diirfte jedoch die Residualenergie bei den meisten Geweben wohl in einem Zeitraum yon etwa 2 bis 3 Wochen erschSpft sein (vgl. A. FIscheR 1930, R. PA~nKER 1936). Unsicher bleibt bei der hier angewandten Versuehsanordnung jedoch, wieweit die Ernahrung und das Waehstum der Kulturen mit gefSrdert wurde durch Stoffe, die bei der Autolyse abgestorbener Zellen frei wurden (s. S. 397). Indessenwar beidiesenUntersuchungenauchnicht beabsichtigt, quantitative Ermittelungen fiber die Wachstumsenergie der Kulturen und die wachs- tumsf5rdernde Wirkung des Mediums anzustellen, sondern es sollte in erster Linie untersucht werden, ob das stoloniale Gewebe fiberhaupt in vitro ausw~chst, wdche Elemente sich in der Kultur vermehren und welche Veranderungen sie dabei erfahren.

Ich habe die Kulturen vor allem eingehend im Leben beobaehtet, da es sehr darauf ankam, eine grSl]ere Zahl mSglichst lange am Leben zu erhalten. Zur Vitalf~rbung dienten basische Vitalfarbstoffe, in erster Linie Neutralrot und Toluidinblau. Ich habe dabei jeweils yon einer in sterilem destilliertem Wasser angesetzten 1%igen LSsung einige Tropfen einer grS~eren Menge yon sterilem Seewasser zugesetzt, bis dieses zart hellrosa oder hellblau angefi~rbt war und dann die LSsung steril filtriert, um den ausgeflockten Farbstoff zu eutfernen. Die wirkliehe Konzentration der angewandten FarbstofflSsung war infolgedessen nicht bekannt, sie spielt aber auch, sower Vitalfarbungen nur morphologischen Zweeken dienen, keine Rolle.

Fixiert habe ich nach BovI~, BOVI~-ALLE~, CHAMPY und Z~K~R. Es wurden haupts~chlich Totalpraparate yon den Kulturen angefertigt und mit tt~malaun gef~rbt. Eine gro~e Zahl der Kulturen wurde taglich mit dem Zeichenapp~rat gezeichnet, um ihren jeweiligen Zuwachs zu ermitteln. Die Mikrophotographien wurden mit einer Aufsatzkamera (Makam yon Leitz) hergestellt.

Das Ausgangsmaterial .

Die Stolonen u n d Win te rknospen sind ~ui~erlich ebenso wie die einzelnen Tiere yon der Zellulosehfille umgeben. Es handel t sieh um histologiseh sehr einfach gebaute Organe. I n beiden f inden sich die gleichen Zell typen. D~s eigentliche stoloniale Gewebe besteht aus regellos einzeln oder in Gruppen durcheinander liegenden undifferen- zierten Zellen (Neoblasten), mi t P igment beladenen Exkretzellen, den eigenart igen , ,Tropfenzellen" und den sogenannten , ,Zellpaketen", und ist umschlossen yon einem Epi thel ektodermaler Herkunf t aus hohen zylinderfSrmigen Zellen.

Die embryoncden Zellen (Abb. 1) sind kleine blasige Gebilde, die amSboid beweglich sind. Auger einigen winzigen, stark l ichtbrechenden

25*

388 Ilse Fischer: t~ber das Verhalten des stolonialen Gewebes

Granula lassen sie im Leben keine besonderen Strukturen erkennen. In fixierten Prs zeichnen sie sich durch einen relativ groBen, chromatinreiehen Kern aus (s. Abb. 5 und 6 bei RIEs). Sie linden sich iiberall ira K6rper der Clavelinen zwischen den anderen Geweben. Ur- spriinglich yon SEELIG~.~ als Mesenehymzellen beschrieben, wurden sie sp/iter yon BRIEN als cellules blastog6n6tiques charakterisiert. RIES hat sie neuerdings als I~eoblasten bezeichnet. Es handelt sich um typische

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.~_bb. 1. Auswanderung verschiedener a m f b o i d bewegl icher Zellen _aus dem Mutters t i ick (Gewebe aus e iner Winterknospe) . E twas schemat is ier t .

embryonale, noch in keiner Weise differenzierte Zellen. Ihre embryonale Natur kommt auch in ihrem lebhaften TeilungsvermSgen zum Ausdruck. Besonders h/~ufig teflen sie sich zu Beginn der Knospung. Nach den Beobachtungen yon RIES ist vor allem auch w/~hrend der Reduktion und bei Regenerationsvorg/~ngen anfangs eine intensive mitotisehe Ver- mehrung dieser Zellen festzustellen. Bei der Entwicklung der Winter- knospen und in den Regeneraten differenzieren sieh diese Neoblasten zu verschiedenen Geweben und bauen die Organe des neuen Clavelinen- kSrpers auf.

Alle fibrigen Elemente in den Winterkn0spen und Stolonen sind differenzierte Zellen (Abb. 1).

Die ,,Exkretzellen" zeichnen sich durch schollige, br/~unlich gef/~rbte Einschliisse aus, mit denen sie ganz vollgepfropft sind.

Die ,,Trop/enzellen" fallen durch groBe, stark lichtbrechende Ein- schluBk5rper auf, die mit basisehen Vitalfarbstoffen f~rbbar sind. Nach

(Icr Ascidic C lavclin~r lcpadiformis in vitro. ;{89

den Untersuchungen von SPEK sollten sie einen Stamm undifferenzierter omnipotenter Zellen darstellen und bei der Knospenbildung und Re- generation die ffihrende Rolle spielen. Iqach den neueren Befunden yon RI~s handelt es sich jedoch ira Gegenteil um sehr spezialisierte Zellen, welche 11. a. die besondere Aufgabe haben, die Tunica zu bilden.

Die eigenartigen Zellpakete (s. Abb. 1, 2) stellen Aggregate degene- rierender Zellen verschiedener differenzierter Gewebe dar (vg]. RI]~s,

Abb. 2. E x p l a n t a t des stolonialen Gewebes einer Winterknospe. E t w a 3 S tunden nach der Exp lan t a t i on lebend pho tograph ie r t . Rech t s un t en und links oben sin4 , ,Ze l lpake te" zu erkennen, links un t en embryona le Zellen, Neoblasten. I n der Mitre liegen verschiedene Zellformen, die durch ihre ~be re inande r l age rung in tier Pho tograph ie n ich t deutl ich zu untersche iden sind. Es hande l t sich vorwiegen4 u m embryona le Zellen und Zellpakete.

S. 341 f.). 8CHULTZ hatte diese Gebilde als mesodermale Zellhaufen ge- deutet, wi~hrend SrEK in ihnen ,,zusammengekrochene" Tropfenzellen saK. Nach RI~s haben diese degenerierenden Zellen noeh eine trophische Bedeutung: sie werden wahrend der Knospung und Regeneration yon den die neuen Organe aufbauenden Zellen resorbiert.

Unter Einwirkung ungiinstiger Lebensverh/~ltnisse wandern aus dem K6rper der Clavelinen Zellpakete, Tropfenzellen, Exkretzellen und embryonale Zellen in versti~rktem MaBe in die Stolonen ein und sammeln sich besonders an deren Enden an, die blasig anschwellen; sie bilden so die obenerw/~hnten Winterknospen.

390 Ilse Fischer: t?ber das Verhal ten des stolonialen Gewebes

Morphologie und Wachstum der Kulturen. Die explantierten Gewebe flieBen an den Schnittriindern meist sofort

etwas aus und ziehen sich gleiehzeitig mehr oder weniger kugelig zu- sammen (Abb. 2). Bei ls Stolonen runden sich indessen nur die Schnittfls ab (Abb. 3). Einzelne Zellen 15sen sich mitunter bald, nachdem das Gewebe in das Kulturmedium gebracht wurde, vom Ex- plantar los und schwimmen frei im Medium. Wenn sie dabei irgendwo am Glimmerpls oder an einem Glasfaden h~ngen bleiben, strecken

sie darauf meist Pseudopodien aus und kriechen langsam urn- her (Abb. 1).

Eine aktive Zellauswande- rung ist dagegen frfihestens nach 6--12 Stunden zu beob- achten, sie ist daran zu er- kennen, dab die vom Mutter- stfick sich lSsenden Elemente yon vornherein am5boide B e - wegungen ausfiihren. Im Gegen- satz zu C~a~u nach dessen Angaben die Zellauswanderung bei Ptychodera schon im Laufe der ersten halben Stunde~ in

Abb.3. Kultur36StundennachderExplantation. vitro einsetzt, habe ieh eine Der urspriingliche Stolofaden nnd die Wachstums- wirkliehe Zellauswanderung

zone sind gut zu unterscheiden. Leben4 photographiert, hie unmittelbar nach der Ex-

plantation beobachten kSnnen. An der Zellauswanderung beteiligen sich vor aUem die embryonalen

Zellen und die Tropfenzellen, in geringerem Mal]e die Epithelzellen. Bei den Zellpaketen und den Exkretzellen bin ich nicht ganz sicher, ob sie nicht gr5Btenteils passiv bei der Auflockerung des Mutterstfickes mit in die Wachstumszone gelangen.

Die ausgewanderten Zellen schlieBen sich bald gruppenweise zu- sammen, wobei ihre Protoplasmaausl~ufer mitein~nder verschmelzen. Es handelt sich anfangs immer nur um einen lockeren gruppenweisen ZusammenschluB yon Zellen, die sieh dann manehma] wieder trennen. Nach 12--24 Stunden aber hat sich meistens eine zusammenh~ngende ,,Wachstumszone" um das explantierte Gewebestfiek gebildet (Abb. 3). In ihr haben sich die verschiedenen Zelltypen zu einem lfickenlosen Gewebeverband epithelartig zusammengeschlossen. Ein ,,fibrocyten- ~hnliches" Wachstum babe ich niemals beobachtet, und es wurde auch bei friiheren Versuchen, Gewebe yon Wirbellosen zu zfichten, nieht festgestellt (vgl. Bo~usLAv, C~-~Y, Ko~IcEc u.a.). Indessen glaube ieh niche, dab dieser Wachstumsmodus den Geweben der Wirbellosen fehlt,

der Ascidie Clavelina lepadiformis in vitro. 391

sondern nehme an, dab das epithelartige Waehstum (Abb. 4 und 5) dureh die Ziichtung in einem flfissigen Medium und im vorliegenden Falle besonders durch die Erh6hung der Oberfl~chenspannung bedingt ist. Auch bei Vertebratenkulturen wird die Wachstumsart vielfaeh durch die Spannungen im Medium beeinfluBt. Es sei hier an die bekalmten Untersuchungen yon WEISS, die kiirzlich yon D(~oo~I~I best~tigt wurden, erinnert. :Nach GI~OSSFELD (1934) waehsen aueh die :Fibroblasten des Hiihnchens epithelartig aus, wenn man sie in einem flfissigen Medium an der Oberfl~che des Deekglases ztichtet. Eine eigenartige Erseheinung

Abb. 4 . 6 Tage al te K u l t u r des stolonialen Ge- webes. Ansgesproehen epi the lar t ige Wachs- tumszone . Rein epi thelar t iges W a e h s t n m ! Fix ier t naeh Bov i~ , gefi~rbt rnit I{~malaun.

_A_bb. 5. Zellen aus der Wachs tumszone der in Abb. 4: darffestellten 7~ultur bei st~irkerer

Vergr52erung.

finder sich ferner bei den Kulturen von Clavelina, die vielleieht mit dutch Oberfl~chenkritfte zwischen den Zellen zu erkl~tren ist. Die Zell- w~nde sind oft auff~Lllig versti~rkt, so dal~ sie i~ui~erlich eine gewisse Xhnlichkeit mit pflanzlichen Zellen erlangen. Vielleicht stiitzen sieh die Ze]len gegenseitig, und es entstehen so Spannungen an der Oberfl~Che der Zellen, wodurch das Plasma sich dort verdichtet, denn in vivo sind die ,,ZeUw:s keineswegs in diesem Mai~e ausgepr~gt. Das epithel- artige Waehstum der Kulturen bleibt auch weiterhin erhalten (Abb. 4).

Am ersten bis zweiten Tage nach der Explantation beobachte~ man h~ufig Mitosen in der Wachstumszone. Fiir das Vorkommen amitoti- seher Zellteilungen haben sich keine Anhaltspunkte ergeben. Nach 48 Stunden nimmt die Zahl der Mitosen a]lmahlieh ab, doch sind aueh naeh mehreren Wochen noch Zellteilungen und ein deutlicher Zuwaehs der Kulturen zu beobaehten (Abb. 5). Dieses Waehstum ist auf die waehstumsf6rdernden Stoffe im Medium zuriiekzufiihren. Denn allein auf Kosten der Residualenergie und der dureh Zellzerfall frei werdenden Niihrstoffe ware ein solcher Zuwachs der Kulturen, wie ihn die Abb. 5 demonstriert, wohl nieht mSglich. Vor allem sprieht fiir diese Annahme

392 Ilse Fischer: ~ber das Verhalten des stolonialen Gewebes

auch, dab die Wachstumsprozesse so lange Zeit beobachtet werden konnten. Nach Untersuchungen von R. PAiCKER (1936) erlischt bei Fibroblastenkulturen das Wachstum schon nach 10 Tagen, wenn sie ohne wachstumsf6rdernde Substanzen in reinem Plasma geziichtet werden. Dabei ist auch noch zu bedenken, dai] die Wachstumsfi~higkeit der Kulturen an sich zweifellos noch gr61]er war, als bei der gegebenen Versuchsanordnung festgestellt werden konnte. Die Z/ichtung der

Kulturen naeh MAXlMOW

.~bb. 6. Zuwachs einer nach MAXIMOW gezt ichteten K u l t u r im Verlauf Yon 30 Tagen. I n den ers ten 7 Tagen wurde der t~igllche Fl~chenznwachs eingezeichnet, sparer der

yon je 5 Tagen.

fiir lange Zeit auf einem Glimmer ermSglicht nach den Erfahrungen an Ver, tebratenkulturen 1/s nicht einen solchen Zu- wachs des Gewebes, als wenn die Kulturen 6fter aus dem Medium heraus- geschnitten und geteilt werden.

In den Explantaten vermehren sich wohl aus- schliel]lich die embryo- nalen Zellen (s. S. 394f.). Dadurch erh/s man bald eine Art Reinkultur, zu- mal die differenzierten Elemente nach einiger Zeit grSBtenteils zu- grunde gehen. Die abge- storbenen Zellen werden

ganz allm/~hlich yon den tiberlebenden Elementen der Kultur resorbiert. Sie scheinen keinen sch/~digenden Einflu$ auf die benachbarten Zellen auszutil~en, denn man findet neben abgestorbenen Zellen solche, die vSllig gesund sind und sich mitotisch teilen. A. F i s c h e r berichtet, dab man bei der Kul tur bSsartiger Gewebe stets auch sehr viele degenerierende und abgestorbene Zellen zwischen sich lebhaft mitotisch vermehrenden finder, und dab das Leben und das Wachstum der Kulturen selbst durch gr61~ere Mengen toten Gewebes nicht beeintr/~ehtigt wird. Das tote Zel!material tr/~gt offenbar auch mit zur Ern/s der iiberlebenden Zellen bei. Mit dem Absterben einzelner Zellen in den Kulturen hat offenbar die Erschei- hung, dab bei den vorliegenden Explantationsversuchen oft katastrophen- artig ganze Kulturen abstarben, nichts zu tun. Das erste Anzeichen daftir war, dab plStzlieh tiberall in der Waehstumszone die Kerne siehtbar wurden. Wenn man dann die Kulturen sofort wuseh und umsetzte, liegen sie sieh manchmal noeh retten. [Nach Untersuehungen yon

der Ascidie Clavelin~ lepadiformis in vitro. 393

ZEIGE~ (1935) und RIES (1937a) werden die Kerneiweige absterbender Zellen zun~chst reversibel entmischt, wodureh die Kernstrukturen sicht- bar werden.]. Ich glaube, dag dieses Absterben ganzer Kulturen auf technische M/~ngel des Ztichtungsverfahrens zurfiekzufiihren sind. Die Kulturen wachsen sozusagen nur in einer Fliissigkeitslamelle. Durch geringste Verdunstungserscheinungen kann infolgedessen schon die Salz- konzentration des Mediums in einer erhebliehen, das Leben der Zellen beeintr/~chtigenden Weise ver~ndert werden. Die abgestorbenen Kulturen zeigen lange Zeit keine auff/tlligen Ver~nderungen. Da Bakterien in den Kulturen nicht vorhanden sind und autolytische Prozesse oft erst nach Woehen oder Monaten einsetzen, kann es leicht passieren, dab man sozusagen nur die ,,Leichen" yon Kulturen noeh eine Zeitlang welter um- setzt. Vielleicht sind auf diese Weise aueh manche Literaturangaben zu verstehen, naeh denen man Gewebe yon Wirbellosen lange Zeit in vitro (naeh GOLDSCHMIDT 6 Monate lang!) halten kann, ohne sie zu wasehen. Sicher 1/~Bt sieh hingegen sofort bei vitaler F~rbung erkennen, ob das Gewebe noeh lebt. Es fehlt dann die typische Speicherung des Farbstoffes in den Zellgranula, und man erh/~lt stat t dessen eine diffuse Anf~rbung des Plasmas oder eine histologische F/~rbung der Kerne. Aueh in fixierten Pr/~paraten ist totes und lebendes Gewebe leicht zu unter- scheiden. Die Kerne toter Zellen fi~rben sich sehlecht oder gar nicht mehr mit den Kernfarbstoffen, die vielfach intensiv das Plasma tingieren.

Das stoloniale Gewebe wuchs in den Kulturen stets histiotypisch (Abb. 4, 5, 7), nie organotypisch. Auch Regenerationserseheinungen konnten in vitro nieht beobachtet werden. Es kam nicht einmal zur Abseheidung membran6ser Gebilde durch die Tropfenzellen, die bei frei im Seewasser liegenden Stolozapfen yon RI~s h~ufig beobachtet wurde (s. RIES, S. 367).

Als einen gewissen Ansatz zu Regenerations- und Differenzierungs- prozessen glaubte ich anfangs folgende Erseheinungen deuten zu kSnnen: Wenn das Gewebe in einen relativ grol3en Mediumtropfen gebracht worden war, so klebte das Explantat meist nicht am Glimmer lest. Das Gewebe zog sich dann stark zusammen, und es formierte sieh iiberall an den Sehnittfl/~chen das Deckepithel: ieh kann nicht mit Sicherheit entscheiden, ob es dabei zu einer mitotischen Vermehrung der Epithel- zellen kommt, oder ob diese nur dureh Wanderung und Ausbreitung die ,,Wundfl/~ehen" verschliegen. Es kam bei solchen Exp]antaten meist nicht mehr zu einer Zellauswanderung und Bildung von Waehstums- zonen. Dagegen lieg sich deutlich erkennen, wie sieh im Innern die Zellen irgendwie gruppenweise anordneten. Jedoch zeigte sich auch nach 1/~ngerer Zeit niemals eine Ausdifferenzierung yon Geweben oder Organanlagen. Die gruppenartigen Zellaggregate bestanden grSgten- teils aus degenerierenden Elementen, es sehien sich hier um /~hnliehe Vorg/~nge wie bei der Zellpaketbildung (s. S. 397) zu handeln. Nur dal3

394 Ilse Fischer: ~ber das Verhalten des stolonialen Gewebes

die Zahl der sieh gruppenweise zusammenschlieBenden Zellen hier noch grSl~er war als in den Zellpaketen.

Das u der einzelnen Zelltypen in vitro. a) Die Neoblasten zeichnen sich in vitro dureh ihre lebhafte mitotische

Vermehrung aus, die dazu ffihrt, daI~ schon nach wenigen Tagen alle anderen Elemente in den Kulturen stark zurfickgedr~ngt erscheinen.

Nach 14 Tagen finder man in der Wachstumszone ~ast nur noch embryonale Zellen, d . h . eben diese Neoblasten (Abb. 4, 5, 7), neben wenigen degenerie- renden Epithelzellen,Trop- fenzellen und Zellpaketen. Die Kulturen machen in- folgedessen bald den Ein- druekvon,,Reinkulturen". Die Neoblasten, die sich in d e r Waehstumszone lfik- kenlos zusammen gesehlos- sen haben, sind durehweg yon polygonaler, mehr oder weniger kugeliger Gestalt,

Abb. 7. Zel len aus der W a c h s t u m s z o n e e iner 14 Tage nachdem sic ws der a l t e n K u l t u r l ebend p h 0 t o g r a p h i e r t . ' Blas ige d i c h t z u s a m m e n g e l a g e r t e Neoblas ten . Z e l l g r a n u l a per ipher . Zellauswanderung infolge K e r n s t r u k t u r n i c h t s i c h t b a r . I n e inigen Zellen eine ihrer amSboiden Beweg-

, , s c h a t t e n h a f t e " A n d e u t u n g der Luge des Kernes . Lebend photographiert, lichkeit die verschieden-

sten Formen angenommen batten und aueh als lange, sehmale, spindelige Zellen aufgetreten waren, die sehr mesenchymalen Zellen glichen. Diese amSboide Formver~nder- lichkeit zeigen aber immer nur die am Glimmer oder an Glasfs ent- langkriechenden Zellen. Ich babe des 5fteren auch die frei wandernden Neoblasten sich teilen sehen. Es ist dies insofern bemerkenswert, als mit Ausnahme der Monocyten in Gewebekulturen freie Zellen sieh niemals teilen sollen. Naeh Befunden yon H. MEYER, die ieh bestatigen kann, vermSgen allerdings auch freie Zellen des Irisepithels sich in vitro mitotisch zu teilen.

In lebenden und ungef~rbten Kulturen erseheinen die Neoblasten oft als helle, glasklare Bls (Abb. ], 7), in denen nur wenige, etwa 3--5 das Lieht starker breehende KSrnchen zu erkennen sind. Andere Strukturen, auch der Kern sind meist nieht sichtbar. Jene Granula liegen in der Regel an der Peripherie der Zellen. Das mag damit zu- sammenh~ngen, dai~ der Kern der Neoblasten relativ grog ist und die PIasmagranula infolgedessen an den Rand der Zelle gedriingt werden.

der Ascidie Clavelina lepadiformis in vitro. 395

Sie vermSgen basische Vitalfarbstoffe zu speichern und lassen sich mit Osmiums~ure schwitrzen. W~hrend der Mitose werden diese Granula regelms auf beide Tochterzellen vertei]t. Man finder sie infolgedessen stets in allen Zellen. HSchstwahrscheinlich handelt es sich um Lipo- ehondrien. Es ist bemerkenswert, dal3 sie in der Mehrzahl der embryo- nalen Zellen naeh der Explantation kaum oder nur wenig vermehrt erseheinen, w~hrend bei anderen Zellen, etwa der Pankreaszelle oder der Irisepithelzelle, die Zahl der Lipochondrien in vitro meist erheblich zunimmt. Ieh habe indessen das Verhalten dieser und der iibrigen Zellstrukturen in den embryonalen Zellen von Clavelina nicht besonders eingehend untersueht. Die Zellen sind so klein (die kugeligen Formen erreichen hSchstens einen Durchmesser yon etwa 6 #), dab eine Analyse der feineren cytologisehen Strukturen sehr mtihsam und auch wenig ergiebig ist. Leider gilt dies besonders auch in b.ezug auf die einzelnen Vorg~nge w~hrend der Mitose. Die zahlreiehen und winzig kleinen Chromosomen sind aul~erdem meist dieht miteinander verklumpt. In den Ruhezellen liegt der Kern in der Regal am Rande der Zellen.

In itlteren Kulturen erseheint das Plasma an der Peripherie der die Wachstumszone bildenden embryonalen Zellen oft ziemlieh verdichtet (worauf ich schon oben hingewiesen habe; s. S. 391). Diese Erseheinung fehlt indessen vSllig bei den frei bewegliehen Zellen, was aueh wiederum daftir spricht, dab sie meehanisch bedingt ist. Besondere Differenzierungs- erscheinungen konnte ich an diesen Zellen in vitro hie beobachten.

Die Neoblasten haben das VermSgen, abgestorbene Zellen und rest- liehe Plasmasehollen yon der Autolyse verfallenen Zellen zu phago- cytieren. Man kann sich yon dem Phagocytosevorgang schwer durch direkte Beobachtung iiberzeugen, wohl aber, indem man dieselbe Zelle in kiirzeren Zeitabst~nden zeichnet. Die Ze]len, welche abgestorbenes Zellmaterial aufgenommen haben, schwellen oft sehr erheblich an. Das ganze Innere wird yon den aufgenommenen Plasmamassen stark auf- getrieben, gelegentlich umspannt das Plasma der phoeytierenden Zelle nur noch als eine feine Haut einige grol3e oder mehrere kleinere tote Plasmaschollen, der Kern liegt dann peripher und ist meist sehr flach- gedriickt. In don Ku]turen degeneriert oft aueh ein Tei lder embryonalen Zelten und stirbt ab, ohne dab dadureh das allgemeine Wachstum der Kulturen beeintr/~chtigt wird. Die degenerierenden embryonalen Zellen fallen zunachst dadurch auf, dal~ die vitalf~rbbaren Granula erheblieh ansehwellen; dann bilden sich gro~e, zum Tell fetthaltige Vakuolen; sehlieBlieh entmischt sich das ganze Plasma tropfig; der Kern wird pyknotiseh und zerfi~llt sparer.

Manchmal sehliel3en auch mehrere absterbende embryonale Zellen sich gruppenweise zusammen, um sieh yon dem umgebendem lebenden Gewebe als ein besonderer Bezirk abzutrennen. Sie bilden dabei jedoeh kein Syneytium, denn die Grenzen der einzelnen Zellen sind noeh lange zu erkennen.

396 Ilse Fischer: ~ber das Verhalten des stolonialen Gewebes

Manchmal wandern die Neoblasten aueh in gr6Bere Komplexe ab- gestorbener Zellen, der differenzierten Zellen und der embryonalen Gewebe ein. ])as tote Gewebe seheint sie nicht irgendwie zu schs Es hat den Ansehein, dal~ sie die durch Autolyse ffei werdenden Stoffe resorbieren, t t ier k6nnen vielleicht sp/~ter einmal genauere Unter- suchungen einsetzen, etwa indem man versuehen wiirde, das stoloniale Gewebe ohne N~hrstoffe und wachstumsfSrdernde Substanzen zu zfichten.

Zweifellos erscheint es nun sehr merkwiirdig, dab die sich lebhaft teilenden embryonalen Elemente in der Kultur so leicht degenerieren. Es ist zwar m6glieh, dab dies mit den verhi~ltnisms ungiinstigen Kulturbedingungen zusammenhi~ngt. Indessen m6chte ich meinen, da]~ sieh hierin aueh eine Eigentiimlichkeit dieser Zellen offenbart, ganz abgesehen davon, dal3 diese vielleicht bei der vorliegenden Versuchs- anordnung besonders hervortrat. Es handelt sich bei den embryonalen Zellen wohl um Elemente von relativ kurzer Lebensdauer. Dieser Sehlul~ daft vor allem deswegen gezogen werden, well sich bei der Regeneration in vivo die gleiche Erscheinung zeigt: Ri~s beobachtete bei den Re- generationstieren w/~hrend der Restitution stets auffi~llig viele in den Zellpaketen zugrunde gehende embryonale Zellen (s. Rx~s, S. 344). Daraus folgt meines Eraehtens, wie sehr RIES Recht hatte, diese Zellen als Neoblasten zu bezeichnen, denn es ist eines der wesentlichsten Merk- male neoplastischer Elemente, besonders der in den Geschwiilsten auf- tretenden, da~ sie bei intensiver mitotischer Vermehrung sehr h~ufig degenerieren und absterben.

b) Die Epithelzellen beteiligen sich ebenfalls an der Zetlauswanderung und nehmen anfangs gr6Bere zusammenh/~ngende Bezirke der Waehs- tumszone ein. Sie verlieren dabei ihre polare Orientierung und breiten sich, wie alle anderen Zellen, flach am Glimmer aus. Sie unterseheiden sich yon den embryonalen Zellen dadurch, da$ sie mehr vitalf~rbbare Granula als jene enthalten und in fixierten Pr/~paraten dureh ihren sehr viel chromatin/~rmeren und daher blasseren Kern. Es I/iI~t sich sehwer entscheiden, ob sich die Epithelze]len nach der Explantation noch ge- legentlich teilen, da die einzelnen Zellen in lebenden und ungef/irbten Kulturen nicht immer sicher als solche zu erkennen sind. Nach Vital- fi~rbungen und in fixierten Pr/iparaten habe ich jedenfalls keine Mitosen an Epithelzellen feststellen k6nnen.

Im Gegensatz zu den embryonalen Zellen vermehren sich bei den Epithelzellen die Lipochondrien in vitro sehr stark. Es seheint, dal~ die Lipochondrienabk6mmlinge in /s Weise wie in kultivierten Vertebratenzellen Neutralfette anreichern und sich in gr61]ere Fett- vakuolen umwandeln. Schon naeh wenigen Tagen sind die Epithel- zellen stark verfettet. Diese Zellen sterben dann grSl~tenteils unter tropfiger Entmisehung des Cytoplasmas und Kernpyknose bald ab. Die toten Zelleiber bleiben als solche sehr lange, bis zu 3--4 Wochen, in den Kulturen erhalten und schwinden allm~hlich dureh eine langsam fort-

der Ascidie Clavelina lepadiformis in vitro. 397

schreitende Autolyse und Resorption durch die fiberlebenden Zellen der Kultur, vor allem der embryonalen Zellen.

c) Die Trop/enzellen. Da es sich nach SP~K bei diesen Zellen um undifferenzierte, omnipotente Zellen handeln sollte, yon denen bei der Knospung der Winterknospen und bei Regeneraten die gesamten Neu- bfldungen ausgehen sollten, h~be ich besonders darauf geachtet, ob sich in vitro entsprechende Erscheinungen beobachten liel3en. Allein ebenso- wenig wie Tunieabildungen (s. S. 393) lieB sich irgendeine gewebliche Organisierung oder Differenzierung an den Tropfenzellen erkennen. Die Tropfenzellen teilen sich naeh der Explantation auch nicht mehr mito- tisch. Es liel~ sich das viel leichter und mit grSl~erer Sicherheit als bei den Epithelzellen feststellen, da die Tropfenzellen durch ihre groi]en Einschlui~kSrper immer leicht als solche zu erkennen sind. In ~lteren Kulturen sterben sie unter ~hnlichen Erscheinungen wie die Epithel- zellen allmi~hlich ab.

d) Die Exkretzellen kSnnen in vitro recht lange, bis zu 6 Wochen, fiberleben. Ieh habe keine in mitotischer Teilung gesehen. Es hat zwar in vielen Kulturen den Anschein, als ob sich die Exkretzellen vermehren. Ieh glaube aber, diese Erscheinung ist haupts~chlieh darauf zuriick- zuffihren, da~ mit der Zeit in vielen Zellen Plasmaabbauprodukte in Form yon Pigmenten gespeichert werden. Man kann dabei alle ~ber- g~nge yon wefl~lichen opaken bis zu gelbbri~unlichen und tiefdunkel- braunen Sehollen auffinden. Besonders hs zeigt sich eine solehe Pigmentierung der Plasmaabbauprodukte in Expl~ntaten, die in vitro nicht auswuchsen (s. S. 393). In solehen Explantaten k5nnen schlieBlich fast alle Zellen im Innern braune Pigmentsehollen enthalten.

Die ZellpaIcete erfahren unter fortschreitender Autolyse ihrer Bestand- teile eine allm~hliche AuflSsung. Es l~l~t sich bestimmt sagen, dab niemals in Zellpaketen eingeschlossene Elemente sich noch mitotiseh teilen. Degenerierende Epithel- und Tropfenzellen und auch embryonale Elemente schlieBen sich manchmal gruppenweise nach der Explantation zusammen (s. S. 395). Diese Gebilde sind yon den ursprfinglichen Zell- paketen oft kaum zu unterscheiden. Auch sie verfallen einer allm~hlich einsetzenden Autolyse, die zu einem vSlligen Schwinden der typischen Kern- und Plasmastrukturen ffihrt, bis von den einzelnen Zellen nur noch ,,Plasmabl~schen" fibrigbleiben. Sehr merkwiirdig ist dabei, da~ diese degenerierenden Zellen nicht zu einer gemeinsamen Plasmamasse zusammenfliel~en, sondern die Bezirke der einzelnen Zell'en bis zuletzt deutlich zu erkennen sind.

Auswertung der Yersuche. Das stoloni~le Gewebe yon Clavelina konnte 6 Wochen lang im

Explantat in vitro gezfichtet werden. Durch Zellauswanderung und Zellteilung entstanden typische Gewebekulturen wie bei Wirbeltieren. Besonderheiten - - rein epithelartiges Wachstum in zusammenhi~ngen-

398 Ilse Fischer: Ober das Verhalten des stolonialen Gewebes

den Membranen an der Oberfl/~che des Glimmerpl/~ttchens - - h/~ngen mit den Kulturbedingungen (Zfiehtung in einem flfissigen Medium) zusammen und stellen keine Eigenart der Wirbellosenzelle dar. Ob eine Dauerkultur des stolonialen Gewebes m5glieh sein wfirde, I/~l~t sich naeh den bisherigen Experimenten zwar noch nicht sagen, indessen haben sich keine Anhaltspunkte ergeben, die etwa dagegen spreehen.

An den in den Explantaten vorhandenen differenzierten Elementen (Tropfenzellen und Epithelzellen) waren keine Entdifferenzierungs- erscheinungen zu beobachten. Die Ver/s die sie naeh der Explantation zeigten - - Verlust der Polarit/~t bei den Epithelzellen und Vermehrung der vitalf/s Granula - - dfirften dureh die Aus- breitung der Zellen am Glimmer und vielleieht auch mit dureh eir/e Anpassung an das Milieu zu erkl/~ren sein. JedeIffalls kam es nach der Explantation zu keiner merkbaren mitotischen Vermehrung dieser Zellen. Ihr Verhalten in vitro lieB also in keiner Weise erkennen, dab sie irgendwie wieder die Potenz embryonaler Zellen erlangt h/~tten. Wahrseheinlich handelt es sich um weitgehend spezialisierte Zelltypen, bei denen eine solche Umstimmung nieht mehr oder wenigstens nicht dureh die Explantation mSglich ist. Dafiir sprieht aueh, dab sie in den Kulturen verh/fltnism/~Big bald zugrunde gehen.

Die Neoblasten hingegen zeigten eine lebhafte mitotisehe Vermehrung naeh der Explantation und behielten dieses VermSgen w/~hrend der Versuehe dauernd bei. Sie bewahrten in vitro die ihnen aueh in vivo eigenen F/~higkeiten zur Phagoeytose und Zellpaketbildung.

Bemerkenswert ist die Tatsache, dab die Neoblasten, aus denen sich bei der Entwicklung der Winterknospen die Organe der jungen Clavelina bilden und yon denen bei den l~egenerationserseheinungen in vivo die Restitution der Organe ausgeht, sich in vitro nicht zu differenzieren vermochten. Man kSnnte annehmen, dab vielleieht die Steigerung der Teilungsprozesse unter dem EinfluB der wachstumsfSrdernden Sub- stanzen oder die wohl haupts/~chlich rein meehanisch bedingte An- ordnung der Zellen und ihre Ausbreitung auf dem Deekgtas Differen- zierungsprozesse gehemmt h~tten. Indessen kennen wir aus der gewebe- ziiehterischen Literatur viele Beispiele yon Differenzierungsprozessen, die in Gewebekulturen und in Gegenwart wachstumsfSrdernder Substanzen vor sieh gingen. Es sei hier an die Arbeiten von ST~G~WAYS und H. B. F]~LT. (1926), F ] ~ (1931), F]~LL und I~O]3I~SGN (1930) fiber die Entwicklung des Auges und des Femurs des Hfihnerembryos i n vitro, yon OT.IVO (1925) fiber die Differenzierung der Herzanlage in der Gewebe- kultur erirmert. Ferner beschrieb MAXIMOW (1929) eine Umwandlung von Lymphoblasten in zur Phagocytose bef/~higte Polyblasten in Kulturen yon Blutzellen des Kaninehens, die sich weiterhin zu typischen Fibro- blasten und sehlieBlich zu Fibroeyten differenzierten, die in der Kultur kollagene Fibrillen bildeten. Entsprech_ende Erscheinungen waren bei den Neoblasten, die zwar in einem flfissigen Medium, aber sonst naeh der MAxlMowsehen Methode geziichtet wurden, auch nieht andeutungs-

der Ascidie Clavelina lepadiformis in vitro. 899

weise zu beobachten (s. S. 393). Es kam aueh naeh 1/~ngerer Zeit weder zu eytologischen Differenzierungen noch zu organoiden Waehstums- erseheinungen. Man mu[~ wohl annehmen, dal~ bei den Differenzierungs. prozessen w/~hrend der Knospung und bei den l%generationsvorgi~ngen noeh besondere Faktoren eine 1%olle spielen, die unter den Kul~ur- bedingungen in vitro nicht zur Wirkung gelangen konnten. MSglieher- weise liegen die Ursachen der Differenzierung nieht in den Neoblasten selbst. Es ergibt sich mithin die Frage, ob es sich bei der Weiterentwiek- lung und Spezialisierung der Neoblasten in Knospen und Regeneraten um abh/~ngige Differenzierungsvorg~nge handelt. Vorl/~ufig is~ indessen nicht mSglieh, fiber alas Vorhandensein oder Fehlen eines Selbstdifferen- zierungsvermSgens der Neoblasten im stolonialen Gewebe yon Glavelina irgendwelehe Vermutungen anzustellen, da aus den bisher vorliegenden Untersuchungen fiber die Entwieklung der Winterknospen und die Regenerationserseheinungen in dieser Hinsicht noeh keine Sehlfisse zu ziehen sind.

Vom Standpunkt des Gewebezfichters aus ist das wesentliehste Ergebnis der hier beschriebenen Explantationsversuehe wohl die Tat- sache, dab nut die Neoblasten sieh in vitro vermehrten, w~hrend die dffferenzierten Zellen allmi~hlieh zugrunde gingen. Es ist nicht aus- zuschlieSen, da$ dies mit den bis jetzt nicht vollkommenen Kultur- bedingungen zusammenh/~ngt (a. S. 386), die vielleieht ftir die differen- zierten Zellen in hSherem MaSe als ffir die Neoblasten ungfinstig gewesen sein kSnnten. MSglieherweise sind auch die Neoblasten besonders be- f&higt, die Ni~hrstoffe des Mediums aufzunehmen, und spreehen infolge- dessert aueh auf die waehstumsfSrdernden Stoffe desselben an. Die Neoblasten seheinen abet fiberhaupt auf wesenthehe Ver/~nderung in ihren Umweltsbedingungen mit Zellteflung zu reagieren. Daffir spricht aueh ihr Verhalten w/~hrend der Knospung und l~egeneration in vivo. Zu Beginn dieser Vorgi~nge kommt es stets zu einer lebhaften mitotischen Vermehrung der Neoblasten, w~hrend die differenzierten Gewebe /~hn- hch wie nach der Explantation zugrunde gehen (siehe die vorstehende Arbeit yon EI~s). So dfirfte es sieh bei der elektiven Zfichtbarkeit der Neoblasten aus dem stolonialen Gewebe wohl nicht nut um einen teeh- niseh bedingten Zufall handeln, sondern es seheint dies in Zusammen- hang mit der dan Zellen auch in vivo eigenen Teilungsbereitschaft zu stehen. Da$ es sich dabei einerseits um undifferenzierte, andererseits um differenzierte Zellen handelt, halte ieh nicht fiir wesentlich. Dffferenzierte Wirbeltierzellen vermehren sich aueh in Gewebekulturen. Indessen haben wir einige Anhaltspunkte daffir, dab dabei aueh die Teilungs- bereitschaft, die der Zelle an sich eigen ist, nine Rolle spielt, vor allem bei solehen Zelltypen, bei denen das TeilungsvermSgen sich im Laufe der ontogenetischen Entwicklung wesentheh itndert. Die exokrine Pankreaszelle z. B. w/ichst am besten vom 18.--19. Tage der Embryonal- entwieklung aus. Sp/~ter ist eine Gewebekultur nur noch zu erreichen, ~ven~ ~ n dis Zei~en nach Injek~ic_~~ yogi Pilocarpin a,uf dem St.adium

400 Ilse Fischer: l~ber das Verha.lten des stolenialen Gewebes

der frfihen Sekretrestitution explantiert, aber nur so lange, bis etwa am 14. Tage nach dem Schlfipfen der Kficken die mitotische Vermehrung der Zellen erliseht und das Wachstum durch VolumenvergrSl~erung der Zellen beginnt (s. J. FISCHER und RI~s, 1936; J. F~SCH]~R, 1937). Dies Verhalten der Pankreaszelle stellt keinen Sonderfall dar. Die gewebe- ziichterische Literatur enth/~lt genaue Angaben, auf welchem Ent- wicklungsstadium des Spenders man die verschiedenen Gewebe ,,explan- tieren soll", um gut wachsende Gewebekulturen zu erhalten. Das am h/~ufigsten kultivierte Gewebe des embryonalen Hfihnerherzens w~chst am besten aus, wenn man Herzen yon 7--9t~gigen Embryonen explan- tiert, bei s Embryonen und Kiicken nimmt die inh/~rente Wachs- tumsenergie der Kulturen allm/~hlich ab. In diesem Zusammenhange ist erw/~hnenswert, dab naeh OLIvO (1929) die mitotische Vermehrungsfis keit der Herzmuskelzellen beim Kiicken am 5. Tage nach dem Schlfipfen v611ig erlischt und das ganze weitere Wachstum des Herzens nur noeh auf VolumenvergrSl~erung der einzelnen Zellen beruht. Dementsprechend gehen die Herzmuskelzellen nach A. FIsc~E~ in vitro in den Kulturen meist sehr bald zugrunde. Es hat den Anschein, als ob bei manehen differenzierten Zellen ihre ganze Lebensgeschichte in bestimmter Rich- tung festgelegt sei und durch die Explantation nicht mehr umgestimmt werden kann. Dieser den Zellen eigene Lebenszyklus kann sich mitunter aueh in der Gewebekultur durchsetzen. Bei Irisepithelkulturen zeigen sich z. B. meist nach 3 Monate langer Zfiehtung in vitro zu einer Zeit, da etwa in vivo die Zellteilungen aufhSren, ausgesprochene Degenera- tionserscheinungen und eine Verminderung der Wachstumsintensit/~t der Kulturen (J. FIscHI~, 1937). Infolgedessen ist mit Irisepithelzellen bis- her auch noch keine unbegrenzte Dauerzfiehtung gelungen, wie etwa bei den Fibroblasten. Die/~lteten Irisepithelkulturen, die in der Literatur beschrieben wurden (EBELING), erreichten nur ein Alter von 18 Monaten.

Diese Erfahrungen an Gewebekulturen stehen in Einklang mit ge- wissen Vorstellungen der klassischen ttistologie, besonders mit den Gedankeng/~ngen BIzzoz]~Ros. BIZZOZERO teilte die Zellen der Gewebe ein in ,,perenne und stabile" Elemente, denen im einzelnen eine lange Lebensdauer zukommt, bei friihzeitigem Verlust des TeilungsvermSgens, und ,,labile" Elemente, die bei kurzer Lebensdauer ihre mitotische Vermehrungsf~higkeit nie verlieren (zu den letzteren kann man zweifellos die hier beschriebenen •eoblasten der Clavelina rechnen).

Die ,,labilen Elemente" verhalten sich in der Gewebekultur auch ganz anders als die ,,stabilen" und wohl irreversibel differenzierten Zellen. So sind z .B. Epidermis und Blutzellen nieht nur in einer be- stimmten Entwicklungsperiode des Spenders in vitro zfichtbar. ~hnlieh verhalten sich in dieser I-[insicht die Fibroblasten bzw. Fibrocyten, fiber deren Natur und Herkunft allerdings die Meinung der Histologen noch weit auseinander gehen. Vieles spricht daffir, dal~ bei diesen Zellen die Differenzieru]ag vielleicht ein reversibler Prozel3 ist, so vor allem die Beobachtung yon A. F I s c ~ fiber die Umwandlung von Fibrocyten in

der Ascidie Clavelina lepadiformis in vitro. 401

Makrophagen in einer Reinkultur, die besondere Beaehtung verdient, da sic neben einigen entspreehenden Befunden MAxi~ows eine der wenigen sicheren Angaben fiber eine derartige Umstimmung differen- zierter Zellen in Gewebekulturen darstellt.

Es ist allerdings wohl noch nicht geniigend gekl~rt, wieweit die unbegrenzte Zfichtbarkeit dieser bindegewebigen Elemente auf ihrem unverminderten TeilungsvermSgen bzw. auf der Umkehrbarkeit des Differenzierungsprozesses beruht, oder ob neben den differenzierten Zellen d'auernd einzelne in einem weniger differenzierten Zustand erhalten bteiben, von denen dann immer wieder die Neubildungen ausgehen kSnnten, so wie in den Geweben yon Clavelina die undifferenten Neo- blasten sich finden, die bei der Entwicklung der Winterknospen und in Rege- neraten die differenzierten Gewebe aus sich hervorgehen lassen, und die in dieser Hinsieht etwa den pflanzlichen Meristemen vergleichbar sind.

Sollte es sich herausstellen, da$ die Differenzierung tatsi~chlich bei manchen Zelltypen ein irreversibler, bei anderen dagegen ein reversibler Proze~ ist, so hat dieses verschiedene Verhalten der Zellen im Grunde genommen nichts~berraschendes. Kennen wir doch auch bei derEizellent- wicklung ~hnlich versehiedene Zelltypen in den extremen Fallen der Regulations- und der Mosaikeier.

CA~R]~L hat immer wieder betont, dal] Zellen in der Gewebekultur nicht altern. Schon die Existenz des jetzt 25j~hrigen CARREL-Stammes und viele andere Erfahrungen an Gewebekulturen best~tigen diese Ansicht. Es fragt sich abet, ob sie ganz allgemein fiir alle Zellen in der Gewebekultur gilt, oder ob die bei irreversibel differenzierten, nicht mehr teilungsf~higen Zellen frtiher oder sparer auftretenden Degene- rationserscheinungen doeh einem ,Altern" vergleichbar sind, das schliel~- lich zu einem ,,physiologischen Zelltod" ffihrt.

Die Methode der Gewebeziichtung bietet die MSglichkeit einer experimentellen Analyse der hier angedeuteten Probleme durch syste- matische Explantation verschiedener Gewebe auf verschiedenen onto- genetischen Entwieklungsstufen, wobei allerdings auch das Verhalten der betreffenden Zelltypen in vivo in bezug auf diese Fragen vergleichs- weise zu untersuchen w~re.

Zusammenfassung. 1. Es gelang, das stoloniale Gewebe yon Clavelina lepadi/ormis

6 Wochen lang in vitro zu ziichten. 2. An dem der Explantation folgenden Tage kam es zu einer lebhaften

Zellauswanderung aus den Explantaten, an der sich sowohl die embryo- nalen als auch die differenzierten Elemente des stolonialen Gewebes beteiligten und eine typische Wachstumszone um das Mutterstfick bildeten.

3. Es teilten sich jedoch nur die embryonalen Zellen (Neoblasten) und erlangten so in wenigen Tagen das l~bergewicht fiber die differenzierten Elemente der Kultur, so dab sich vor allem in der Wachstumszone bald fast ausschlieBlich nut embrvonale Elemente f~nden. W. 14oux' A r c h i v f. E n t w i c k l u n g s m e c h a n i k . Bd. 137. 26

402 Ilse Fischer: Uber das Verhalten des stolonialen Gewebes

4. Die differenzier ten Zellen (Epithelzel len, Tropfenzellen, Exkre t - zellen) v e r m e h r t e n sich in v i t ro nicht . Die Epi the lze l len ver loren ihre polare Orientierung. Sic waren abe t durch ihre besonders groBe Zahl an v i t a l f~rbbaren Granu la und durch ihre K e r n s t r u k t u r immer yon den embryona len Zellen zu unterseheiden. Ebenso waren die Tropfenzel len und die Exkre tze l l en s tets als solehe zu erkennen. Es e rgaben sich also keine Anha l t spunk t e fiir eine Entd i f ferenzierung der ZeUen.

5. Die differenzier ten Zellen gingen nach einiger Zeit in den K u l t u r e n zugrunde. Abges torbene Zellen und Zel lbes tandte i le werden yon den iiber- lebenden Zellen der K u l t u r phagocyt ie r t . Gelegentl ieh sehlieBen sieh die degener ierenden Zellen g r u p p e n w e i s e zu besonderen Aggrega ten zusam- m e n , die sich yon dem i ibr igen Gewebe absondern . Diese Vorg~nge entsprechen wei tgehend der Ze l lpake tb i ldung in vivo.

6. D i e K u l t u r e n w u e h s e n stets h is t io typisch, n ieorganotyp iseh . Regene- ra t ionserseheinungen waren aueh n ich t andeutungsweise zu erkennen.

7. Die Neoblas ten zeigten auch naeh l~ngerer Zei t in v i t ro keine An- zeiehen einer Differenzierung.

8. Da das stoloniale Gewebe sieh in v i t ro n ich t differenzierte, hande l t es sich bei der En twick lung der Neoblas ten in K nospe n und Regenera t en vermut l ieh u m eine , ,abh~ngige Differenzierung".

9. Neben den sich lebhaf t mi to t i seh te i lenden embryona len Zellen wurden in den K u l t u r e n s tets auch degener ierende gefunden. Es wird daraus der SchluB gezogen, dab die Lebensdauer der einzelnen Zellen bei diesen Neoblas ten r e l a t iv kurz sein muB.

10. Die Beziehungen zwischen der Z i ich tbarke i t der Gewebe in v i t ro und dem Tei lungsvermSgen und der Differenzierung ihrer Zellen werden erSr ter t .

Sehri f t tum. Berili, N. J.: Cell division and differentiation in asexual and sexual development.

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l Sofern Rz~s ohne Jahreszahl zitiert ist, handel t es sich um Hinweise auf die beiden Arbei ten im gleiehen Hef t diescs Archivs.