Zwischenbericht zum FuE-Vorhaben · 2014. 3. 27. · Ansatz der Nutzung in vitro produzierter...

Abschlußbericht zum FuE-Vorhaben ZE: Baumschulen Oberdorla GmbH FKZ 22028507 – 07NR285 Burgstraße 57 99986 Oberdorla Vorhabenbezeichnung: Verbundvorhaben MYKOTREE: Erhöhung der Pflanzenausbeute und des Biomasse-ertrags schnellwachsender Gehölze für geringwertige Standorte durch den Einsatz in vitro vermehrter arbusculärer Mykorrhiza-Pilze Teilvorhaben 1: Etablierung der In-vitro-Vermehrung sowie Ermittlung von Wachstums- und Leistungsparametern Laufzeit des Vorhabens: Juni 2008 – Mai 2011 Verlängert bis März 2012 Berichtszeitraum: Juni 2008 – März 2012 Oberdorla, den Dr. Hardy Dembny (Projektleiter)

Baumschulen Oberdorla GmbH Seite 2

1. Zielstellungen und Rahmenbedingungen

Holz als nachwachsender Rohstoff für energetische und stoffliche Verwertung gewinnt zunehmende Bedeutung (Bemmann 2010, Große 2010). Unter ökonomischen und ökologischen Gesichtspunkten sind der Nutzung einheimischen Waldholzes Grenzen gesetzt. Der Ausbau der Nutzung regenerativer Energien und neue Möglichkeiten für die stoffliche Verwertung von Holz verschärfen diesen Konflikt. Die Erhöhung des einheimischen Holzangebots wird nur möglich sein durch Erhöhung der Leistungsfähigkeit wertvoller und/oder schnellwachsender Gehölze generell und insbesondere auf geringwertigen Standorten, die für eine effektive landwirtschaftliche Produktion nur eingeschränkt nutzbar sind. Das Projekt MYKOTREE leistet dabei einen Beitrag zur Nutzung geringwertiger Standorte für die Produktion holzartiger Biomasse über eine Effizienzsteigerung mittels des Einsatzes arbusculärer Mykorrhizapilze (AMP). Über den neuartigen Ansatz der Nutzung in vitro produzierter Mykorrhizapilze sollten an besonders wertvollen in vitro klonierten Laubgehölzen wie Vogelkirsche und Aspe die Steigerung des Biomassezuwachses auf geringwertigen Standorten nachgewiesen werden.

2. Vorgehensweise

In vitro vermehrte Gehölze bedingen andere und zusätzliche Schritte in der Anzucht zum gebrauchs(pflanz)fertigen Gehölz. Deshalb wurde neben der Pflanzung entsprechender Varianten auf den Versuchsflächen der Pflanzenanzucht in verschiedenen Stadien besondere Aufmerksamkeit gewidmet. Zudem galt es, die Symbiosepartner Gehölz und AMP unter geeigneten Bedingungen in vitro zusammenzubringen. Daher wurden wesentliche Parameter der In vitro-Kultur von Vogelkirschen und Aspen einer kritischen Betrachtung unterzogen. Die Planung dieser Arbeiten erfolgte unter Abstimmung mit den Partnern in diesen Schritten:

1) Bereitstellung mykorrhizierten Pflanzgutes für die Begründung der Versuchsflächen über Gefäßversuche

2) Applikation von AMP während der Überführung in vitro vermehrter Gehölze in konventionelles Anzuchtsubstrat

3) Applikation und Keimung von AMP-Sporen in Gegenwart bewurzelter Gehölze in vitro

Während für die Schritte 1) und 2) auf einschlägige Erfahrungen zur Anwendung von AMP zurückgegriffen werden konnte, ist die Mykorrhizierung in vitro erst durch die entsprechende Produktion von in vitro-Pilzsporen durch die Amykor GmbH möglich gewesen. 3. Wissenschaftlich-technischer Stand bei Beginn des Projektes

Von wertvollen und / oder schnellwachsenden Laubgehölzen werden zunehmend Klone selektiert, die in ihren Wuchseigenschaften deutlich über dem Standard liegen, jedoch häufig nicht über klassische Vermehrungsmethoden zu produzieren sind. In-vitro-Vermehrung ist dabei das Mittel der Wahl. Mykorrhizierung von Gehölzen als Mittel zur besseren Adaptation an bestimmte Standortverhältnisse sowie zur Leitungssteigerung ist unter Einsatz konventioneller In-vivo-Mykorrhiza auf dem Vormarsch (Feldmann 2008). Die Vermehrung dieser Mykorrhiza-Pilze in vitro und


die Erzeugung aseptischer Sporenpräparate eröffnete neue Möglichkeiten für die Mykorrhizierung in vitro vermehrter Gehölze. Die Realisierung dieses Schritts sowie die Bestimmung des Effekts der Mykorrhizierung auf geringwertigen Standorten waren zwei Zielsetzungen des Projekts. 4. Zusammenarbeit mit Partnern

Das vorliegende Projekt wurde gemeinsam mit den Partnern

Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Correnstrasse 3, 06466 Gatersleben

und

AMykor GmbH; Kühlturmstrasse Geb. 25.34.00, 06803 Greppin

realisiert. Mit der Koordinierung der Arbeiten insbesondere bei der Auswahl und Betreuung der Versuchsflächen in Nordwestthüringen wurde die Arand Unternehmensberatungs-gesellschaft mbH, Felchtaer Landstrasse 98, 99974 Mühlhausen beauftragt. Insgesamt 9 Projekttreffen (ca. 2 je Jahr) dienten der Abstimmung der Arbeiten sowie der Darstellung der erreichten Ergebnisse. 5. Methodik der Herangehensweise 5.1. Untersuchungen zur in vitro-Vermehrung von schnellwachsenden Gehölzen

Standardmäßig wurden kontinuierlich Pflanzen in vitro und nach Überführung und Akklimatisation in Kultursubstrat auch ex vitro für Inokulationsexperimente und zur Pflanzenanzucht für die Versuchsflächen hergestellt. Dies erfolgte mit einem breiten Spektrum von 24 Klonen der Vogelkirsche und 10 Klonen der Aspe. Diese Klonzahl wurde später reduziert um eine bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse vor allem vor dem Hintergrund von Nachpflanzungen auf den Versuchsflächen zu erreichen. Dies erfolgte nach erprobten Standardprotokollen.

Für den Schwerpunkt der In-vitro-Inokulation der Gehölze mit In-vitro-Mykorrhiza war vor allem die Aufgabe zu lösen, die sehr unterschiedlichen Medienbedingungen für die Kultivierung der Pflanzen einerseits und der Mykorrhiza-Pilze andererseits anzupassen.

Medienbestandteil Bewurzelung Pflanze (1/2 MS)

Kultivierung Mykorrhiza (MSR)

Relation zwischen …

Salzgehalt Hoch Mittel 2 : 1

Phosphat Hoch Sehr Gering 20 : 1

Magnesium Hoch Sehr Hoch 1 : 2

Nitrat Hoch Gering 10 : 1

Eisen Mittel Gering 5 : 1

Sachcharose Mittel Gering 2 : 1

Phytohormone (Auxin)

Notwendig Ohne -

pH-Wert 5,8 5,5 ähnlich


Neben den unterschiedlichen Zusammensetzung der Kulturmedien sind auch zeitliche Abläufe der Kulturentwicklung in vitro und der Entwicklung einer Mykorrhiza deutlich verschieden (Entwicklungszeitraum Mykorrhiza ca. 80 – 100 Tage). Vor diesem Hintergrund wurden besonders Bewurzelungs- und Kulturversuche mit Vogelkirschen forciert, um bewurzelte Pflanzen in vitro solange und unter solchen Bedingungen zu erhalten, dass die sich über mehrere Wochen erstreckende Sporenkeimung arbuskulärer Mykorrhiza-Pilze vollziehen kann. Es sollten folgende Fragen geklärt werden: Welchen Einfluß hat auxinhaltiges bzw. auxinfreies MSR-Medium auf die

Bewurzelungsrate und Sproßqualität ? Welchen Einfluß hat die Zugabe von Flüssigmedium unterschiedlicher

Konzentration auf Sproß-und Wurzelwachstum ? Wie sind Sporenkulturen zu handhaben um eine in vitro-Inokulation

durchführen zu können? Die Bewurzelung erfolgte auf modifiziertem Minimalmedium nach Strullu / Romand / Declerck ( MSR – Medium ). Zur Anwendung kam sowohl hormonfreies als auch auxinhaltiges Medium (IES 0,2 mg/L, IBS 0,6 mg/L, NES 0,2mg/l ). Als Kulturgefäße dienten Standard-Plastikbecher der Abmessung 108 x 82 mm mit 55 ml Nährmedium. In jedes Kulturgefäß wurden 20 Mikrostecklinge zur Bewurzelung eingesetzt und im Klimaraum bei 22 °C und 15 h Licht kultiviert. Nach 6 bis 18 Wochen Kulturzeit erfolgte die Bonitur von Bewurzelungsrate und Sproßqualität. 5.2. Pflanzenanzucht

Gefäßversuche zur Mykorrhizierung waren ursprünglich nur als Übergang und zum Vergleich für die Anlage der Versuchsflächen geplant. Entgegen dieser Planung stellte sich im Verlauf der Arbeiten heraus, dass bereits in vitro mykorrhizierte Pflanzen innerhalb des Projektzeitraums nicht zur Verfügung stehen werden. Daher wurden zusätzliche Gefäßversuche zur Anzucht größerer Pflanzen für die Ergänzung der Versuchsflächen angelegt (siehe 5.3.). Dabei wurde zu unterschiedlichen Zeiten der Pflanzenentwicklung Mykorrhiza zur Pflanze appliziert (konventionell als Beimischung zum Substrat während des Pikierens, während des Topfens, im Tauchverfahren, durch Angießen mit Sporensuspension). Als Pikier- bzw. Topfsubstrat wurde das in der Baumschule in den jeweiligen Arbeitsschritten gebräuchliche Fertigsubstrat der Firmen Stender AG bzw. Klasmann-Deilmann AG mit Langzeitdünger (0,5 – 2 kg/m³) verwendet. 5.3. Anlage der Freilandversuchsflächen

Durch das Vorhandensein einer ausreichenden Pflanzenanzahl aus den Gefäß-versuchen 2008 konnten im Frühjahr 2009 nicht nur 3 Versuchsflächen auf geringwertigen Standorten in Nordwestthüringen angelegt werden, sondern überzählige Pflanzen (vor allem der Kontrollserien) wurden auf eine Kleinfläche bei Rustebach verbracht.. Bei einem Pflanzverband von 2 x 2 m wurde jeweils abwechselnd 1 Reihe Aspen und 1 Reihe Vogelkirschen gepflanzt. Bedingt durch die unterschiedliche Gestalt der Versuchsflächen variiert die Baumanzahl in den einzelnen Reihen zwischen 45 und 55. Auf den Versuchsflächen wurde durch mehrmalige Mahd der Beikräuterbewuchs niedrig gehalten, zusätzlich kamen Maßnahmen zur Schermausabwehr zum Einsatz. Zum Schutz der Pflanzungen gegen Wildverbiss wurden diese komplett eingezäunt


Im Herbst 2009 und 2010 wurden witterungsbedingte gravierende Ausfälle durch Nachpflanzungen ausgeglichen bzw. die Nutzung der Flächen durch weitere Varianten erweitert. 5.4. Probennahme und Meßwerterhebung

Sowohl von den Bäumen aus den Gefäßversuchen als auch von den Freiland-versuchsflächen wurden jeweils im Herbst neue Wurzelproben entnommen und den Partnern zur Analyse übergeben. Zur statistischen Auswertung einer größeren Anzahl von Proben sowie zur Darstellung der Abhängigkeit des Nachweises von AMP von der Wachstumsaktivität der Pflanze (Jahresdynamik) wurden größere Mengen unbehandelter und behandelter Pflanzen in der Multiplatte mit den Partnern ausgetauscht. Neben Ausfallbonituren wurden in den Wintermonaten bzw. nach Abschluß der Wachstumsperiode (bei Gefäßversuchen) zur Bestimmung des Biomassezuwachses Messungen der Sproßlänge und –dicke in Anlehnung an das Methodenhandbuch des Verbundprojekts „ProLoc“ (Hofmann et.al. 2008) durchgeführt.

6. Detaillierte Ergebnisdarstellung

6.1. Bewurzelung und Akklimatisation von Vogelkirschen Als Voraussetzung für eine erfolgreiche Überführung der Pflanzen in Erde sind 2 Bedingungen zu erfüllen: Bewurzelung, gute Sproßqualität. Ausgehend vom für die Mykorrhiza-Entwicklung günstigen MSR-Medium wurden verschiedene Faktoren in dieser Hinsicht untersucht. Auch in vitro nehmen bewurzelte Pflanzen Nährstoffe leichter auf, so dass die Notwendigkeit des Einsatzes von Auxinen zur Wurzelbildung untersucht wurde. Tabelle 1: Bewurzelungsrate und Sproßqualität von Vogelkirschen nach 6 Wochen Kulturzeit auf Minimalmedium (geeignet für Mykorrhiza)

Vogel-kirschklon

Anzahl BW auf MSR hormonfrei

BW-Rate in %

Sproßqualität 1 = schlecht 5= sehr gut

Anzahl BW auf MSR mit Auxinen

BW-Rate in %

Sproßqualität 1 = schlecht 5 = sehr gut

Aphrodite 120 90 4 240 95 3

Apollo 120 90 3 240 90 4

Bacchus 120 45 3 240 50 2

Concordia 120 90 3 240 95 2

Deo 120 240 95 3

Fidius 120 90 4 240 95 3

Mars 120 20 3

Die Versuchsergebnisse bestätigen, dass mit Auxinen eine bessere Bewurzelungs-rate erzielt wird, eine Verbesserung der Sproßqualität damit nicht zwangsläufig verbunden ist. Diese nimmt über längere Zeiträume drastisch ab, so dass durch die Zugabe verdünnter Nährlösungen das Nährstoffdefizit reduziert wurde.


Tabelle 2: Sproßqualität von 7 Vogelkirschklonen nach 3-maliger Zugabe von hormonfreiem Flüssigmedium unterschiedlicher Konzentration (Bedeutung der Boniturnoten siehe Tab. 1)

Sproßqualität MSR hormonfrei Sproßqualität MSR mit Auxinen

Bez. Klon Kontrolle 3 x FLM ¼ MS

3 x FLM ½ MS

Kontrolle 3 x FLM ¼ MS

3 x FLM ½ MS

Aphrodite 1 3 4 1 2 2

Apollo 2 3 3 2 3 3

Bacchus 1 2 3 1 2 2

Concordia 1 2 4 2 3 3

Deo 1 2 2

Fidius 2 3 4 1 2 2

Mars 1 2 4

Die Bewurzelungsrate hatte sich nach 18-wöchiger Kulturzeit bei keinem Vogel-kirschklon erhöht. Das Längen- und Dickenwachstum der Wurzeln hatte jedoch deutlich zugenommen Bei den Varianten auf auxinhaltigem MSR-Medium war damit augenscheinlich eine deutliche Verschlechterung der Sproßqualität verbunden. Die Blätter zeigten trotz 3-maliger Zugabe von Flüssigmedium Mangelerscheinungen, die von Blattaufhellungen bis zum vollständigen Verlust von Chlorophyll reichten.

Abb. 1: Vogelkirschen bewurzelt in vitro mit Auxin, 18 Wochen nach Versuchsbeginn (oben links), - Sproßqualität bei Kontrolle unbehandelt (oben rechts), 3malige Zugabe von ¼ konzentriertes Medium MS (unten links), 3malige Zugabe ½ konzentriertes Medium MS (unten rechts)


In Abstimmung mit dem Partner AMykor GmbH wurde weniger der Nitratgehalt als der Phosphatgehalt kritisch für die Mykorrhiza-Entwicklung angesehen, so das in weiteren Versuchsreihen sowohl im absoluten Gehalt als auch in der Dynamik (Zugabe Flüssigmedium) der Phosphatgehalt variiert wurde.

Tabelle 3: Sproßqualität auf MSR-Medium mit variiertem Phosphatgehalt ( Boniturnote 5 = sehr gut, Boniturnote 1 = schlecht )

Bez. Klon MSR MSR 2-fach Phosphat

MSR 4-fach Phosphat

MSR 8-fach Phosphat

MSR 16-fach Phosphat

Aphrodite 2 2 3 3 3

Apollo 2 3 3 3 3

Bacchus 3 3 4 3 3

Concordia 3 3 4 3 3

Fidius 2 3 3 4 2

Deo 3 3 4 3 2

Abb. 2: Sproßqualität bewurzelter Vogelkirschen nach 10 Wochen auf MSR-Medium mit unterschiedlichen Phosphatkonzentrationen (v.l.: 2fach, 4fach, 16fach, vgl. Tab. 3) Bei geringer Nitrat-Konzentration (MSR-Medium) hat die Phosphatkonzentration nur einen geringen Einfluß auf die Sproßentwicklung, so daß nur eine geringe oder eine

Abb. 3: Sproßqualität bewurzelter Vogelkirschen nach 10 Wochen auf ½ MS-Medium mit unterschiedlichen Phosphatkonzentrationen (v.l.: voll, ¼, 1/16)


unstete Verbesserung der Sproßentwicklung durch eine erhöhte Phosphatkonzen-tration gegeben ist. Bei Verwendung des Bewurzelungsmediums (½ MS) mit verringerten Phosphat-konzentrationen verschlechtert sich die Sproßqualität je näher sich die Phosphat-konzentration der des MSR-Medium nähert (Abb. 3). Damit zeigt sich, daß vor allem die Makronährstoffe einen großen Einfluß auf die Qualität der bewurzelten Pflänzchen haben. Eine verbesserte Wurzelbildung führt nicht zu einer besseren Langzeitentwicklung; es ist eher zu schlußfolgern, dass mit besserer Wurzelbildung die vorhandenen Nährstoffe schneller aufgenommen uns verbraucht werden, so dass nachfolgend die Sproßentwicklung gehemmt ist oder sich Wachstumsdepressionen einstellen. Diese treten in vitro erheblich schneller auf als in vivo. Da selbst bei einer Co-Kultur von Mykorrhiza-Kulturen und bewurzelten Pflanzen keine Pilzhyphen als Indikator für eine Mykorrhizaentwicklung zu beobachten waren, wurden die Versuche zur Anpassung der Kulturmedien eingestellt. Technologisch wäre ein solcher langer Entwicklungszeitraum für die Mykorrhizierung sowieso nicht umzusetzen, da nach max. 6 Wochen eine Überführung in Erdsubstrat vorzunehmen ist. Die Inokulation in vitro würde sich nur auf die Zugabe der Sporen beschränken, die günstigerweise auch beim Transfer ins Gewächshaus erfolgen kann. 6.2. Überführung von in vitro-Pflanzen in Kultursubstrat Die Mykorrhizierung in vitro vermehrter Gehölzpflanzen beim Pikieren hat unab-hängig von der Applikationsart nur sehr eingeschränkt einen direkten Einfluß auf das Ergebnis während der Akklimatisierung. Insbesondere mit Pflanzenmaterial in guter Sproß- und Wurzelqualität lässt sich eine Förderung durch AMP kaum zeigen. Dies liegt wesentlich daran, dass die Entwicklung einer Mykorrhiza über Zeiträume verläuft (mind. 10 Wochen), die zu lang sind für wichtige Entwicklungsschritte während der Akklimatisierung (Wurzelwachstum, Sproßentwicklung, die innerhalb von 4-6 Wochen eine Pflanzengröße von 10-15 cm bedingen).

Überlebensrate Pikieren

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

Aphro

dite

Concord

ia

Apollo

Hypnos

Fid

ius

Favoniu

s

Dik

e

Deo

Ero

s

Neptu

n

Mars

Hekto

r

Klo

n 5

21

Klo

n 5

23

Klo

n 5

34

Klo

n 5

51

Klo

n 5

56

Klo

n 5

79

Klo

n 5

35

Klo

n 6

14

Klo

n 6

16

Klo

n 6

32

Mitt

el

Kontrolle Amykor INOQ

Abb. 4: Überlebensrate in vitro bewurzelter Vogelkirschen 6 Wochen nach Pikieren (Akklimatisierung); Probenumfang je 25 oder 50 Pflanzen


Überlebensrate Pikieren

-60,0%

-40,0%

-20,0%

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

Hyp

no

s

Klo

n 5

21

Ero

s

Ap

hro

dite

De

o

Klo

n 5

34

Klo

n 6

16

Klo

n 5

35

Fid

ius

Ne

ptu

n

Co

nco

rdia

Ap

ollo

Fa

vo

niu

s

Klo

n 5

23

Klo

n 6

32

Klo

n 5

56

Klo

n 6

14

Dik

e

Ma

rs

Klo

n 5

79

Klo

n 5

51

Ve

rän

de

run

g z

ur

Ko

ntr

olle

Amykor INOQ

Abb. 5: veränderte Darstellung der Ergebnisse aus Abb. 4 zur Demonstration des Klon-einflusses auf die Wirksamkeit einer Mykorrhizierung während der Pflanzenüberführung

Sowohl bei Vogelkirschen als auch bei Kirschunterlagen, bei denen in großem Umfang neue Applikationsverfahren getestet wurden, hat Mykorrhizierung nur dann einen nachweisbaren Einfluß auf die Mortalität im Akklimatisierungsprozeß, wenn die Ausfallrate in der Kontrolle hoch ist. Dies deckt sich mit Beobachtungen, die mit der Kirschunterlage Piku1 in mehreren Überführungszyklen gemacht wurden. Hier konnte kaum eine deutliche Verringerung der Ausfallrate, die bei Piku1 sehr stark schwankt, erreicht werden. Dies liegt auch daran, dass Piku1 unter günstigen Bedingungen ohne Mykorrhiza schnell ein verzweigtes feines Wurzelsystem (gewünschter Effekt der Mykorrhizierung) ausbildet. Vielmehr ist eine deutliche Korrelation zwischen Sproßqualität und Überlebensrate im Akklimatisierungsprozeß zu beobachten.

Abb. 6: Akklimatisierung von Vogelkirschen (4 Wochen nach Pikieren) in Abhängigkeit von der Vorsortierung – Größenklasse 1 (sehr gut entwickelt, links), Größenklasse 3 (klein, schwach entwickelt, rechts)


Akklimatisierung Kirsch-UL

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Kon

trolle

Wur

zel

Spo

ren

Platte

n

INOQ

Kon

trolle

Wur

zel

Spo

ren

Platte

n

An

teil

unter 10 cm über 10 cm Fehl

Abb. 7: Akklimatisierung von Kirschunterlagen der Sorten Piku® 1 (links) und GiSelA® 3 (rechts) nach unterschiedlicher Verfahrensweise zur Mykorrhizierung (Wurzel bzw. Spore: Tauchapplikation einer Wurzel-Sporen-Suspension bzw. reiner Sporen-Suspension, Platten: Angießen des Substrats mit einer Sporen-Suspension, INOQ: Einmischen eines kommer-ziellen Mykorrhiza-Granulats in das Substrat), Darstellung der Mortalität (fehl) und Klassifizierung des Pflanzengröße (Probenvolumen: 16.250 Pflanzen) Überführungstermin Juli 2010, Auswertung Januar 2011

Da eine Mykorrhizierung in vitro nicht möglich war, ist der Überführungsprozeß der früheste Zeitpunkt für die Applikation von AMP, auch wenn unmittelbar kein Effekt zu beobachten ist. Andererseits wird hierbei der Grundstein gelegt, für eine längere und

Abb. 8: Applikation einer AMP-Sporensuspension im Tauchverfahren beim Pikieren (links) und Pflänzchen im Multiwell-Tray, der mit Sporensuspension überschichtet wird (rechts, Folienabdeckung entfernt). Pflänzchen werden mit Kulturmedium pikiert!

damit stärkere Förderung des Wachstums in nachfolgenden Phasen. So erklärt sich das Fehlen eines deutlichen Effekts in Abb. 7 auch mit der späten Applikation im Sommer, die erst zum Triebabschluß eine Symbiose führte. Während in den Jahren 2009 und 2010 parallel zu den Applikationsversuchen während der Überführung Mykorrhiza auch zur Pflanzenanzucht appliziert wurde (Gefäßversuche) erfolgte die Mykorrhizierung nachfolgend nur noch während der Akklimatisierungsphase. Standardprozedur ist dabei das Einmischen eines


Pflanzengröße

0

25

50

75

100

Aph

rodite

Apo

llo

Con

cord

iaDike

Fidius

Mar

s

Nep

tun

Klon

523

Klon

579

cm


Sproßdicke

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

Aph

rodite

Apo

llo

Con

cord

iaDike

Fidius

Mar

s

Nep

tun

Klon

523

Klon

579

mm


Mykorrhiza-Granulats in das Pikiersubstrat. Solche Granulate sind wegen der angestrebten breiten Anwendungsmöglichkeiten überwiegend Mischungen verschiedener Mykorrhiza-Stämme und damit für Untersuchungen zur AMP-Stamm – Wirt – Wechselwirkung nur bedingt geeignet. In vitro erzeugte AMP-Sporen liegen als Suspension vor und können im Gieß- oder Tauchverfahren ausgebracht werden. Letzteres ist besonders zeitaufwändig (siehe Abb. 8). Wesentlich eleganter, zeitsparender und kostengünstiger ist die direkte Applikation der Sporensuspension an die zu pikierende Pflanze in entsprechenden Bewurzelungstrays (Patent der Fa. Vitroplus, Burgh-Hamsteede, NL). Um die bewurzeltenPflänzchen aus dem Tray zu lösen, ist das Überschichten mit Wasser notwendig. Dabei kann auch und gerade eine AMP-Sporensuspension zum Einsatz kommen. Erstmals in 2012 konnte dieseTechnologie in größerem Umfang getestet werden. Abgesehen von technolo-gischen Veränderungen zur Beschickung der Trays bei der Bewurzelung ergibt sich eine deutliche Zeiteinsparung bei der Überführung. Je Tray sind 200mL Über-schichtungslösung notwendig. Ausgehend von einer in vitro Sporensuspension von Glomus intraradices kann nahezu jede beliebige Sporenkonzentration je Pflanze eingestellt werden. In den Tests wurde mit ca. 50 Sporen je Pflanze gearbeitet. Untersuchungen zum Grad der Mykorrhizierung stehen allerdings noch aus. 6.3. Gefäßversuche

Die Gefäßversuche dienten sowohl der Erzeugung von mykorrhiziertem Pflanzgut für die Anlage der Feldversuche auf den geringwertigen Standorten als auch der Bestimmung erster Effekte der Mykorrhizierung nach einer Vegetationsperiode. Da sich wegen der Ausfälle auf den Versuchsflächen und Verzögerungen bei der Inokulation in vitro kurzfristig weiterer Bedarf an Vogelkirschpflanzgut ergab, wurden die Gefäßversuche in den Folgejahren wiederholt. Dadurch konnten Faktoren, die neben der Auswahl des Mykorrhiza-Präparates einen Einfluß auf den Biomasse-zuwachs haben, bestimmt werden.

Abb. 9: Wachstum getopfter Vogelkirschen nach Mykorrhizierung während der Akklimati-sierungsphase (Pflanzenentwicklung ca. 3 Monate im Sommer 2008 nach 7 Wochen Akklimatisierung), Einmischen von Mykorrhiza-Granulat (2 Herkünfte) in Pikiersubstrat


Sproßlänge

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

Deo Fidius Concordia Dike

cm

Kontr. mit Myk.

Sproßdicke

8,50

9,00

9,50

10,00

10,50

Deo Fidius Concordia Dike

mm

Kontr. mit Myk.

Abb. 10: Wachstum getopfter Vogelkirschen nach Zugabe des Mykorrhiza-Granulats während des Topfens (Pflanzenentwicklung ca. 6 Monate im Sommer 2009) unter Verwendung verholzter, überwinterter Jungpflanzen, die im Vorjahr nicht inokuliert wurden.

Abb. 11: Wachstum getopfter Vogelkirschen in Abhängigkeit von verschiedenen Zeitpunkten der Applikation der AMP (Variante 1: Applikation der AMP während der Akklimatisations-phase im Sommer des Vorjahres, Variante 2: Zugabe des AMP-Granulats zur vorher unbehandelten Pflanze während des Topfens), Wachstumsperiode: 5 Monate im Sommer 2010

Alle Gefäßversuche zeigten die fördernde Wirkung einer Mykorrhizierung auf das Längen- und/oder Dickenwachstum getopfter Vogelkirschen. Das etwas uneinheit-liche Bild über das Ausmaß dieser Wirkung kann nur unter Berücksichtigung des Einflusses anderer Wachstumsfaktoren erklärt werden. Optimale Wachstums-bedingungen insbesondere in der Nährstoff- und Wasserversorgung erlauben ein Pflanzenwachstum, das durch eine Mykorrhizierung kaum zusätzlich stimuliert werden kann. Wenn zudem die Zeit für die Ausbildung der Pilz-Pflanze-Beziehung von der Phase des stärksten Wachstums überlagert wird, so fällt die Wirkung entsprechend geringer aus. So ist zu erklären, dass in 2009 eine Förderung durch AMP vor allem bei der Sproßlänge nicht gegeben ist (Abb. 10). Das Längenwachstum wird bereits im Hochsommer mit Verringerung der Tageslänge abgeschlossen. Demgegenüber zeigt das Dickenwachstum gerade im Frühherbst noch eine hohe Aktivität, so dass zum einen die Messung vor Abschluß desselben (Abb. 11) ungenügende Ergebnisse liefert und zum anderen der Effekt einer Mykorrhizierung kaum sichtbar ist.


Sproßdicke

8

9

10

11

Deo Con Aphro Fidius

mm

Kontrolle Variante 1 Variante 2

Abb. 12: Wachstum getopfter Vogelkirschen in Abhängigkeit von verschiedenen Zeitpunkten der Applikation der AMP (vgl. Abb. 11; Bestimmung der Sproßdicke nach 7 Monaten Kultur)

Im Frühherbst bei verringertem Nährstoffangebot wird durch die dann ausgebildete Mykorrhiza eine zusätzliche Stimulierung des Dickenwachstums erreicht (Abb. 12). Eine frühzeitige Infektion mit AMP stabilisiert die Beziehung Pilz-Pflanze, so dass eine Wachstumsförderung über den gesamten Zeitraum der Kultur gegeben ist (Abb. 12, Var. 1). Neben der Abschätzung der Förderung des Wachstums durch Mykorrhizierung in der Größenordnung von 3 - 8% insbesondere beim Dickenwachstum ist aus diesen Versuchen wesentlich die Frühzeitigkeit der Applikation des Mykorrhiza-Präparates hervorzuheben. Die Dauer der Ausbildung einer effektiv wirksamen Symbiose ist bei der Planung des Anwendungszeitraums unbedingt zu berücksichtigen (siehe Abb. 7.) 6.4. Biomassezuwachs von Vogelkirschen und Aspen auf Versuchsstandorten in Nordwestthüringen Die ausgewählten Versuchsstandorte unterscheiden sich sowohl hinsichtlich Höhenlage und Niederschlag als auch in der Qualität des Bodens. Details sind in Tab. 5 gegenübergestellt. Tab. 5: Übersicht der Standorteigenschaften

Standort Boden Höhenlage Niederschlag

Urbach Ton (flachgründig) 400 m 550 mm

Kalteneber Lehmiger Ton 454 m 725 mm

Bockelnhagen Sandiger Lehm 350 m 850 mm

Der Standort Kalteneber ist besonders windexponiert.

Abb. 13: Klimadaten der Station Mühlhausen im Jahr 2010 (trockener April, gefolgt vom kühlen feuchten Mai, warme trockene Hauptwachstumszeit Juni/Juli, kühler nasser Spätsommer)


Da keine direkten Klimadaten auf den Versuchsflächen erhoben wurden, zeigt beispielhaft das Klimadiagramm von Mühlhausen, den klassischen Verlauf der Witterung auch in den Versuchsjahren.

Abb. 14: Übersicht der Pflanzungen an den 3 Versuchsstandorten Bockelnhagen (links), Urbach (oben rechts) und Kalteneber (unten rechts) im Jahr 2010.

Abb. 15: Versuchsstandort Bockelnhagen im Frühjahr 2012, Aspen (links) und Vogelkirschen (rechts im Vordergrund) mit Zuwächsen von über 1m pro Jahr.


Abb. 16: Dicken- und Höhenzuwachs von Vogelkirschen und Aspen auf 3 gering-wertigen Standorten (U = Urbach, B = Bockelnhagen, K = Kalteneber) nach einer Vegetationsperiode (2010) in Abhängigkeit von der Mykorrhizierung während der

Pflanzenanzucht. Wie bei den Gefäßversuchen festgestellt, ist eine Stimulierung des Pflanzen-wachstums eher am Parameter Dickenwachstum als am Längenwachstum erkennbar. In weit stärkerem Maße bestimmen allerdings Lage (Klima-verhältnisse) und Bodenqualität der Versuchsflächen die Größe des Zuwachses. Insbesondere die Aspen zeigten bereits im 1. Jahr einen Zuwachs von fast 10 mm im Stammdurchmesser bei über 60 cm durchschnittlichem Längenzuwachs. Unter diesen günstigen Bedingungen fällt die zusätzliche Stimulierung mit max. 7% im Längenzuwachs eher gering aus. Der sehr karge Boden (siehe Abb. 14) am Standort Urbach hatte zunächst einen Triebabschluß zur Folge, so daß nur im Dickenwachstum eine Zunahme zu verzeichnen war. Insgesamt liegt der Biomassezuwachs auf dieser Fläche im Vergleich zum Standort Bockelnhagen nur bei ca. 2%. Im Mittel des Zuwachses zwischen beiden Flächen liegt der Standort Kalteneber. An diesem Grünlandstandort, der klimatisch (Exposition, Höhe, Niederschlag) dem Standort Urbach gleichzusetzen ist, sind die Bodenverhältnisse für die Anpflanzung besser geeignet als in Urbach. Hier zeigt


sich auch eine deutliche Steigerung durch die Applikation von AMP. Diese beträgt im ersten Vegetationsjahr zwischen 30% und 80% gegenüber der Kontrolle.

Abb. 17: Dicken- und Höhenzuwachs von Vogelkirschen und Aspen auf 3 geringwertigen Standorten (U = Urbach, B = Bockelnhagen, K = Kalteneber) in der zweiten Vegetations-periode (2011) in Abhängigkeit von der Mykorrhizierung während der Pflanzenanzucht (2009)

Im Folgejahr war der Biomassezuwachs insgesamt besser als im ersten Vegetationsjahr. Auch am Standort Urbach konnte sowohl ein höherer Zuwachs generell als auch eine zusätzliche Steigerung an mykorrhizierten Bäumen gemessen werden. Allerdings trifft dies nur für Aspen zu. Für die Vogelkirschen scheint der Standort auch mit Mykorrhizierung nicht geeignet. Dies kann sowohl an den extremen klimatischen Bedingungen als auch am erhöhten Salzgehalt der Böden (auf ähnlichen Flächen in der Gemarkung sind Steckholz- und Sämlingspflanzungen komplett gescheitert: Reinewart 2011, pers. Mitt.). Am Standort Kalteneber zeigt sich erneut eine Förderung des Dickenwachstums an mykorrhizierten Bäumen. Dieser Effekt fällt im Längenwachstum schwächer aus.


Obwohl am Standort Bockelnhagen das Wachstum insgesamt stärker ausfällt als im ersten Vegetationsjahr erfährt das Dickenwachstum mykorrhizierter Bäume eine zusätzliche Stimulation. Insgesamt ist zu erkennen, dass in den Pflanzungen die Varianten mykorrhizierter Bäume einen besseren Zuwachs als die Kontrolle zeigen. Unter Zugrundelegung einer Biomassefunktion ergibt dies im Mittel eine Förderung des Biomassezu-wachses um ca. 15%. 6.5. Mykorrhizierung von Kirschunterlagen (GiSelA)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

5-7 mm 7-9 mm 9-12 mm sonst.

Kontrolle Mykorrhiza

Abb. 15: Größenklassenausbeute (sortiert nach Sprossdurchmesser als Qualitäts- und Verkaufsmerkmal) von Kirschunterlagen im Jahr 2011 (sonst. = unverkäufliche Ware)

Im Jahr 2011 wurde unter Ausnutzung der Erkenntnisse der Gefäßversuche eine Mykorrhizierung vom Kirschunterlagen vorgenommen (Probenumfang insgesamt 50.000 Pflanzen). Wesentliches Qualitätsmerkmal bei Kirschunterlagen ist der Stammdurchmesser in 10 cm Höhe, der der Sortierung zugrunde liegt. Im Vergleich zur Kontrolle konnte eine deutliche Erhöhung des Anteils stärkerer Ware nach Mykorrhiza-Anwendung im Pikiersubstrat verzeichnet werden. Wiederholungen in 2012 und den Folgejahren werden zeigen, inwieweit die relativ warme Witterung des Oktober 2011 zu diesem Ergebnis (50% mehr Anteil in Größenklasse 7-9 mm) beigetragen hat. Ökonomisch ergibt sich ein Vorteil von 15% in dieser Größenklasse gegenüber der schwächeren Ware.

7. Darstellung des Aufwandes der Arbeiten Im Rahmen des Projektes wurden an 4 Standorten in Nordwestthüringen Versuchs-pflanzungen aus Vogelkirschen und Aspen in unterschiedlichen Varianten der Applikation von arbuskulärer Mykorrhiza angelegt. Davon werden 3 auf Grund ihrer besonderen Zusammensetzung und Standortwahl dauerhaft weiter bewirtschaftet und wissenschaftlich erfasst. Diese 3-4 Jahre alten Pflanzungen sind wichtige Untersuchungsobjekte für Beobachtungen zur Entwicklung der applizierten Mykorrhiza im Vergleich zur autochthonen Mykorrhiza (siehe Anlage) und sind auf Grund der Pflanzabstände für Umtriebszeiten größer 10 Jahre ausgelegt.


35% der aufgewendeten 8833 Arbeitsstunden wurden speziell für Untersuchungen zur Bewurzelung der In-vitro-Kulturen vor dem Hintergrund der Anpassung der Kulturparameter an die Kultur- und Entwicklungsbedingungen der Mykorrhiza in vitro verbraucht. Erste positive Resultate des Partners AMYKOR hatten die Aussichten für den Erfolg dieser Arbeiten hoch gehalten. Daher wurde mit insgesamt 25 Klonen Vogelkirsche und 10 Klonen Aspe nach Kulturbedingungen gesucht, die eine Entwicklung der Mykorrhiza an Wurzeln in vitro ermöglichen. Der Erkenntnisstand 2010 führte zur Einstellung dieser Arbeiten ab 2011 zu Gunsten der Suche nach neuen Applikationsformen der AMP. Damit wurden die in-vitro-Arbeiten auf die Erzeugung größerer Mengen pikierfähiger Pflanzen konzentriert, um nachfolgend verschiedene Applikationsformen zu untersuchen. Weitere 40% der Arbeiten dienten der Pflanzenanzucht, wobei anfangs neben Pikierarbeiten die Gefäßanzucht im Vordergrund stand. Entsprechend dominierten im Materialverbrauch zu dieser Zeit Container und Erden. 8. Nutzen und Verwertbarkeit der Arbeiten Grundlegende Zielstellung war und bleibt die Erhöhung der Leistungsfähigkeit von Gehölzpflanzungen auf geringwertigen Standorten. Der Fortschritt der Projekt-arbeiten und die bisher gewonnenen Ergebnisse unterstützen nachhaltig die These, dass mit mykorrhiziertem Pflanzgut eine nachhaltige Verbesserung der Leistungs-fähigkeit wertvoller schnellwachsender Klone unter ungünstigen Bedingungen gegeben ist. Darüber hinaus zeigt Mykorrhizierung bei Gehölzen generell eine Erhöhung des Biomassezuwachses, dessen Umfang jedoch unterschiedlich stark ausfallen kann. Voraussetzung dafür ist in jedem Fall eine frühzeitige Mykorrhizierung des Pflanzgutes. Dies ist über die Applikation in vitro erzeugter AMP-Sporen als Suspension in Bewurzelungstrays ex vitro gegeben. Dieses Applikationssystem stellt gleichzeitig ein einfach zu standardisierendes Verfahren für die Testung der Wirksamkeit unterschiedlicher – auch neu zu selektierender – AMP-Stammlinien dar. Dies hätte für das Auffinden artspezifischer AMP-Stämme und daraus zu entwickelnder neuer Mykorrhiza-Präparate große Bedeutung. Unabhängig davon sind die 3 etablierten Versuchsflächen in Nordwestthüringen wertvolle Untersuchungsobjekte für die Entwicklung von mykorrhizierten Gehölzen auf geringwertigen Standorten einerseits und der Dynamik der Mykorrhiza-Flora auf den Flächen andererseits. 9. Sind inzwischen von dritter Seite Ergebnisse bekannt geworden, die für die

Durchführung des Vorhabens relevant sind? Während zur Wirkung von AMP keine weiteren grundlegenden Arbeiten bekannt geworden sind (siehe Hutter et al. 2008), zeigen längerfristige Ergebnisse aus anderen Inokulationsversuchen (AMYKOR 2009) die grundsätzliche Richtigkeit der Strategie, eine hohe Ausbeute des nachwachsenden Rohstoffs Holz auf gering-wertigen Standorten durch eine Mykorrhizierung zu erreichen. Zudem wird aus Ergebnissen anderer Projekte zur Gewinnung von Holz auf landwirtschaftlichen Nutzflächen die Bedeutung der Nutzung geringwertiger Standorte für diese Zwecke immer vordringlicher, um den sich abzeichnenden Bedarf an Holz in den nächsten 2 Dekaden unter der Prämisse vereinbarter Klimaschutzziele zu erreichen (Froese 2012). 10. Veröffentlichungen


Die Kernaussagen und ausgewählte Ergebnisse sind in Form eines Posters bei der Fachtagung „Züchtung und Ertragsleistung schnellwachsender Baumarten im Kurzumtrieb“ 21./22.10.2011 in Hann.Münden veröffentlicht worden. Wichtige Erkenntnisse zur Pflanzung von Laubgehölzen auf geringwertigen Standorten wurden auch in einem Vortrag „Bäume pflanzen – Holz ernten, ganz einfach??“, Fachgespräch Energieholzanbau, 30.01.2012, TLL Jena 11. Literatur Bender, B., Chalmin, A., Reeg, T., Konold, W., Mastel, K., Spieker, H. (2009): Moderne Agroforstsysteme mit Werthölzern, www.agroforst.uni-freiburg.de Große, W. (2010): Marktperspektiven für Holzhackschnitzel vom Acker. Vortrag „Feldtag zur Energieholzernte und –verwertung“, LLH Bad Hersfeld, 02.03.2010. Landgraf, D. (2010): 10.000 Hektar Kurzumtriebsplantage für RWE-Deutschland – erste Beispielflächen. KoNaRo-Fachgespräch „Klimaschutz und regionale Wertschöpfung durch Diversifizierung“. Bernburg-Strenzfeld, 02.02.2010. Froese, H.J. (2012): Rahmenbedingungen und Perspektiven für Agroforstsystem und Kurzumtriebsplantagen in Deutschland. 3. Forum Agroforstsysteme, 6./7.06.2012 BTU Cottbus Feldmann F: Mycorrhiza for plant vitality: mycorrhizal fungi as factors of integrated horticultural plant production. In: Feldmann F, Kapulnik Y, Baar J: (2008): Mycorrhiza Works, ISBN 978-3-941261-01-3; 8-16. © Deutsche Phytomedizinische Gesellschaft, Braunschweig, Germany Hutter, I., Schneider, C., Gillessen, M., Meier-Dinkel, A., 2008: Effect of mycorrhiza application on vitality of in vitro propagated Prunus avium clones during acclimatization. In: Mycorrhiza Works, Proceedings of the International Symposium “Mycorrhiza for the Plant Vitality” and the Joint Meeting of Workings Groups 1-4 of COST Action 870, 03-05 Oct. 2007, Hannover, Germany, S. 145 – 156. 12. Anlage 1 Untersuchungen zum Nachweis der Mykorrhizierung an Versuchsbäumen auf den 3 Versuchsstandorten Urbach, Kalteneber und Bockelnhagen durchgeführt vom Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Gatersleben


Zwischenbericht zum FuE-Vorhaben

ZE: Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und FKZ 22011008

Kulturpflanzenforschung (IPK)

Corrensstr. 3

D-06466 Gatersleben

Vorhabenbezeichnung:

Erhöhung der Pflanzenausbeute und des Biomasseertrags

schnellwachsender Gehölze für geringwertige Standorte durch den Einsatz

in-vitro vermehrter arbuskulärer Mykorrhizapilze

Laufzeit des Vorhabens: 01.06.2008 – 31.03.2012

Berichtszeitraum: 01.11.2011 – 31.03.2012

Gatersleben, den 26.04.2012

Prof. Dr. Gotthard Kunze/ 039482-5247

Name und Telefonnummer des Projektleiters

Firmenstempel


1 Aufgabenstellung

Ziel des geplanten Forschungsvorhabens ist die Senkung der Mortalitätsrate von in vitro

vermehrten Gehölzen bei der Ausbringung an den jeweiligen Standort bei gleichzeitiger

Steigerung deren Biomasseproduktion durch Zusatz von in vitro vermehrten arbuskulären

Mykorrhizapilzen. Die produzierte Biomasse soll abschließend als nachwachsender Rohstoff

einer energetischen Nutzung (Erzeugung von Biogas) zugeführt werden.

Dazu sollte die in vitro-Kultivierung von Pappeln und Vogelkirschen in Gegenwart von in

vitro vermehrten Sporen arbuskulärer Mykorrhizapilze (AMP) erfolgen. Die dabei erhaltenen

mykorrhizierten Pflanzen waren an unterschiedlichen Standorten, einschließlich sog. extremer

Standorte, einzeln und in Kombination auszubringen und bezüglich Mortalitätsrate,

Biomassezuwachs und Mykorrhizierungsgrad zu untersuchen. Als Kontrolle dienten die

entsprechenden nicht-mykorrhizierten in vitro vermehrten Pflanzen.

Für die Schaffung optimaler Anwuchsbedingungen bei der in vitro-Kultivierung war im

Rahmen des Projektes erstmals die gezielte Zugabe von AMP´s zu derartigen

Pflanzenkulturen vorgesehen. Um bereits bei der in vitro-Kultivierung von Vogelkirschen und

Pappeln optimal entwickelte Pflanzen zu erhalten, sollten die dazu notwendigen Medien so

modifiziert werden, dass sie zusätzlich in vitro-vermehrte sterile AMP-Sporen enthalten, die

auskeimen können, Hyphen bilden und mit der Pflanze in einem ganz frühen

Entwicklungsstadium eine Symbiose eingehen. Auf diese Weise sollten voll entwickelte

mykorrhizierte Pflanze direkt von der in vitro-Kultur auf extreme Standorte ausgebracht

werden. Auf Grund ihrer Mykorrhizierung sind sie besser an derartige Standorte angepasst,

was sich positiv auf den Biomasseertrag pro Zeiteinheit auswirkt. Durch Unverträglichkeit

des Pflanzenkulturmediums für die in vitro Sporen sind im Großversuch parallel auch in vivo

produzierte Sporen eingesetzt worden.

Zum Erreichen des Projektzieles waren umfassende Untersuchungen bezüglich der Wirkung

von AMP´s auf die Biomasseproduktion von Pappeln und Vogelkirschen über „Labor-,

Gewächshaus- und Freilandversuche“ notwendig, die Voraussetzung für ein optimiertes

Begrünungskonzept von extremen Standorten auf Basis von Mischkulturen sind. Die dabei

erhaltenen Ergebnisse und entwickelten Methoden sollten nach Projektende auf andere

devastierte Flächen unter den klimatischen Bedingungen der gemäßigten Breiten übertragen

werden.

2 Aufzählung der wichtigsten wissenschaftlich-technischen Ergebnisse und anderer wesentlicher Ereignisse im

Berichtszeitraum

Die Aufgaben des Projektpartners IPK im Berichtszeitraum waren folgende:

(1) Überprüfung der Pappel- und Vogelkirschen-Pflanzungen bezüglich AMP-Mykorrhizierung.

(2) Etablierung neuer Einzelsporlinien zur Mykorrhizierung von Bäumen - Tests zur Eignung.

Im Großversuch an mehreren geringwertigen Standorten zwischen Harz und Thüringer Wald,

die nicht mehr landwirtschaftlich genutzt werden, wurden 2009 und 2010 mykorrhizierte und

nicht-mykorrhizierte schnell wachsende Gehölze (Vogelkirschen und Pappeln) als

nachwachsende Rohstoffe gepflanzt. Es war nun nachzuweisen, ob durch den Einsatz von

AMPs eine Erhöhung der Pflanzenausbeute und des Biomasseertrags erreicht werden kann.


2.1.1 Arbeitspaket 1 - Überprüfung der Pappel- und Vogelkirschen-Pflanzungen bezüglich AMP-Mykorrhizierung

2.1.1.1 Mikroskopische Analyse der AMPs

2.1.1.1.1 Ausgangsmaterial

Ausgangsmaterial für die Mykorrhizierung von Pappeln und Vogelkirschen waren in vivo

produzierte G. intraradices Sporen der INOQ GmbH (Schnega) und in vitro produzierte G.

intraradices Sporen der AMykor GmbH (Wolfen-Bitterfeld). Bereits in der mikroskopischen

Analyse zweigten sich Unterschiede zwischen beiden Chargen (Fig. 1).

G. intraradices INOQ G. intraradices Amykorin-vivo-vermehrte AMPs in-vivo-vermehrte AMPs

Vergrößerung: 20x

Fig. 1: AMP-Ausgangsmaterial zur Mykorrhizierung von Vogelkirschen und Pappeln.

Im November 2011 bzw. im Juli 2011 wurden Bodenproben aus den Wurzelbereichen

ausgewählter Bäume der Standorte Bokelnhagen, Urbach und Kalteneber (Standorte B, K, U)

entnommen und dem IPK zum Nachweis der Mykorrhizierung an den Wurzeln übergeben.

2.1.1.1.2 Mykorrhizierung von Pappel- und Vogelkirschen-Wurzeln

Der Mykorrhizierungsnachweis von Pappel- und Vogelkirschenwurzeln mit G. intraradices

der Firmen INOQ GmbH und AMykor GmbH erfolgte sowohl mikroskopisch als auch

molekularbiologisch per Plattenassay und PCR.

Für den mikroskopischen Nachweis wurde das beim Waschen der Wurzeln für die DNA-

Isolation angefallene Wasser durch ein 35µm Sieb filtriert und damit die an den Wurzeln

anhaftenden Mykorrhizastrukturen, wie Hyphen, Sporen oder durch Glomalin zusammen

gehaltene Erdklümpchen angereichert. In der sich anschließenden mikroskopischen Analyse

konnten erste Aussagen zum Mykorrhizierungsgrad bei den zu analysierten Pflanzen

getroffen werden.

Folgende Ergebnisse wurden dazu erreicht:

Die Pappel- und Vogelkirschen-Proben von Juli 2011 enthielten nicht genügend

Wurzelmaterial, um molekularbiologische Untersuchungen zum Mykorrhizierungsgrad

durchführen zu können.

Nur die Juliproben des Standortes Bockelnhagen wurden bezüglich Mykorrhizierung

analysiert. Dabei konnte festgestellt werden, dass

in Reihe 6 (Vogelkirsche - INOQ - Herbst 2010) im Juli kaum AMP detektierbar war,


in Reihe 7 (Pappel - AMykor) dagegen sehr viele Hyphen auftraten, was auf einen hohen Mykorrhizierungsgrad schließen lässt. Neue Sporen wurden nicht gefunden.

Deshalb wurden die Juliproben der anderen beiden Standorte nicht näher untersucht.

Die Novemberproben aller drei Standorte (Bockelnhagen, Kalteneber, Urbach) ließen sich im

Detail per Mikroskopie analysieren (Tab. 1-3, Fig. 2-4).

Tab 1: Analyse der Proben von Standort Bockelnhagen (November 2011).

Proben November 2011 Bockelnhagen B =Bockelnhagen R =Reihe B =Baum

Nummer Name Variante

Bewertung Hyphen + Sporen

(0 – 4 = Beste)

Bemerkungen

B1 BR1B3 Pappel Ektomykorrhiza

Reihe 1

1 0 Wurzel minimal, Hyphen vorh. (Glomalin) keine frischen Sporen

B2 BR1B7 2 0 Wurzel gut, Hyphen vorh. (Glomalin) keine frischen Sporen

B3 BR1B17 2 0 Wurzeln gut, Hyphen vorh. (Glomalin) keine frischen Sporen

B4 BR2B6 Vogelkirsche Kontrolle Reihe 2

1 0 Wurzeln gut, Hyphen minimal, keine frischen Sporen

B5 BR2B14 3 3 Wurzeln gut, viele Hyphen,


Vogelkirsche – Kontrolle Pappel – Kontrolle Vogelkirsche - INOQ - 2010- Reihe 2 - - Reihe 3 - - Reihe 4 -

Pappel – INOQ Vogelkirsche – INOQ - 2009 Pappel - Amykor- Reihe 5 - - Reihe 6 - - Reihe 7 -

Fig. 2: AMP-Material von Standort Bockelnhagen (November 2011).

Tab 2: Analyse der Proben von Standort Kalteneber (November 2011).

Proben November 2011 Kalteneber K =Kalteneber R =Reihe B =Baum

Nummer Name Probe

Variante Bewertung Hyphen +

Sporen (0 – 4 = Beste

Waschwasser der separierten Wurzeln wurde durchgesiebt und nach Hyphen oder Sporen überprüft

K1 KR1B5 Pappel Ektomykorrhiza

Reihe 1

3 2 Wurzeln gut, Glomalin, viel Hyphen, wenige große gelbe + braune Sporen

K2 KR1B11 2 2 Wurzeln gut, Glomalin, Hyphen vorh., Sporen Mix, große gelbe

K3 KR1B21 2 1 Wurzeln gut, Glomalin, Hyphen vorh., kaum frische Sporen

K4 KR2B11 VK Kontrolle

Reihe 2

2 1 Wurzeln gut, Glomalin, Hyphen vorh., wenige dunkele Sporen

K5 KR2B17 2 1 Wurzeln gut, Glomalin, Hyphen vorh., wenig Sporen Mix

K6 KR2B22 1 0 kaum Wurzeln (Gras?), Glomalin, kaum Hyphen

K7 KR3B8 Pappel Kontrolle Reihe 3

4 2 Wu gut, Glomalin, viel Hyphen, wenige schöne große gelbe wie G. m.

K8 KR3B12 2 2 Wurzeln gut, Hyphen vorh., Sporen Mix G. m.+ dunkelbraune

K9 KR3B20 2 1 Wurzeln gut, Glomalin, Hyphen vorh., wenige dunkele Sporen

K10 KR4B3 VK INOQ, Herbst 2009

Reihe 4

2 1 Wurzeln gut, Glomalin, Hyphen vorh., wenige Sporen G. m. Optik

K11 KR4B16 2 1 Wurzeln = Gras?, Glomalin, Hyphen vorh., wenige Sporen wie G. m.

K12 KR4B44 1 0 Wurzeln gut, Glomalin, kaum Hyphen, keine Sporen

K13 KR5B6 Pappel INOQ

Reihe 5

2 1 Wurzeln gut, Glomalin, Hyphen vorh., wenige Sporen, G. m. Optik+

dunkelbraune

K14 KR5B13 2 1 Wurzeln gut, Glomalin, Hyphen vorh., nur wenige dunkelbraune Sporen

K15 KR5B19 2 1 Wurzeln gut, Glomalin, Hyphen gut, Filz, 2 Sporen wie G. i.

K16 KR6B5 VK INOQ, Herbst 2010

Reihe 6

2 3 Wurzeln gut, Glomalin, Hyphen vorh., bunter Sporen Mix, mehr große gelbe

K17 KR6B12 1 0 Wurzeln gut, Glomalin, Hyphen minimal, keine frischen Sporen

K18 KR6B16 1 1 Wurzeln gut, Hyphen minimal, nur wenige dunkelbraune Sporen

K19 KR7B13 Pappel AMykor

Reihe 7

2 1 Wurzeln gut, Glomalin, Hyphen gut, Filz, wenige dunkelbraune Sporen

K20 KR7B18 2 1 Wurzeln gut, Glomalin, Hyphen gut, wenige dunkelbraune Sporen

K21 KR7B23 2 0 Wurzeln gut, Glomalin Hyphen gut, Filz, keine frischen Sporen

K22 KR8B7 VK Kontrolle, Herbst 2010

2 1 Wurzeln knapp, Glomalin, Hyphen vorh., wenige Sporen, Mix

K23 KR8B12 2 1 Wurzeln knapp, Glomalin, Hyphen vorh., wenige Sporen, Mix


K24 KR8B22 Reihe 8 2 1 Wurzeln knapp, Glomalin, Hyphen vorh., wenige Sporen, Mix

K25 KR9B5 VK INOQ b, Herbst 2010

Reihe 9

1 1 Wurzeln gut, Glomalin, rel. wenig Hyphen einige Sporen Mix

K26 KR9B10 1 2 Wurzeln gut, Glomalin, sehr wenig Hyphen, einige verschiedene Sporen

K27 KR9B13 1 1 Wurzeln gut, Glomalin, kaum Hyphen, 1 Ei und 3 Mumien

Pappel – Ektomykorrhiza Vogelkirsche – Kontrolle Pappel - Kontrolle- Reihe 1 - - Reihe 2 - - Reihe 3 -

Vogelkirsche – INOQ - 2010 Pappel – INOQ Vogelkirsche – INOQ - 2010- Reihe 4 - - Reihe 5 - - Reihe 6 -

Pappel – INOQ Vogelkirsche – Kontrolle - Reihe 7 - - Reihe 8 -

Fig. 3: AMP-Material von Standort Kalteneber (November 2011).

Tab 3: Analyse der Proben von Standort Urbach (November 2011).

Proben November 2011 Urbach U =Urbach R =Reihe B =Baum

Nummer Name Variante Bewertung Hyphen +

Sporen (0 – 4 = Beste

bei Wurzelseparation Waschwasser gesiebt und mikroskopisch betrachtet

U1 UR1B5 Pappel Ektomykorrhiza

Reihe 1

3 1 Wurzeln gut, viel Hyphen, Glomalin wenige Sporen, Mix

U2 UR1B10 2 0 Wurzel gut, Hyphen vorhanden, Glomalin, keine frischen Sporen

U3 UR1B15 1 0 Wurzeln gut, Hyphen minimal, keine frischen Sporen

U4 UR2B5 Vogelkirsche Kontrolle Reihe 2

1 1 Wurzeln gut, kaum Hyphen, wenige kleine helle graubraune Sporen

U5 UR2B12 1 0 Wurzeln gut, kaum Hyphen, wenig Glomalin, keine frischen Sporen

U6 UR2B16 2 2 Wurzeln gut, Hyphen vorhanden, Glomalin, bunter Sporenmix

U7 UR3B6 Pappel Kontrolle

2 1 Wurzeln gut, Hyphen vorhanden (z. T. Filz), Glomalin,


U9 UR3B15 Reihe 3 2 1 Wurzeln knapp (Gras) Hyphen vorh., Glomalin, wenig Sporen, bunt klein

U10 UR4B3 VK INOQ, Herbst 2009

Reihe 4

2 2 Wurzeln knapp (Gras) Hyphen vorhanden, Glomalin, Sporen klein

U11 UR4B12 1 1 Wurzeln knapp (Gras), wenig Hyphen, Glomalin, wenig bunter Sporenmix

U12 UR4B25 1 1 Wurzeln knapp, wenig Hyphen, Glomalin, bunter Sporenmix, wenig

U13 UR5B9 Pappel INOQ

Reihe 5

2 2 Wurzeln knapp, Hyphen vorhanden, Glomalin, bunter Sporenmix

U14 UR5B13 2 1 Wurzeln gut, Hyphen vorhanden, Glomalin, wenige bunte Sporen

U15 UR5B18 2 1 Wurzeln gut, Hyphen vorhanden, Glomalin, wenige bunte Sporen

U16 UR6B5 VK INOQ, Herbst 2010

Reihe 6

2 2 Wurzeln gut, Hyphen vorh., Glomalin, orange Nichtglomus, bunte Sporen

U17 UR6B10 2 2 Wurzeln knapp (Gras), Hyphen vorh., Glomalin, bunter Mix Sporen, kein G. m.

U18 UR6B15 2 2 Wurzeln knapp Hyphen vorhanden, Glomalin, bunter Sporenmix

U19 UR7B8 Pappel AMykor

Reihe 7

2 2 Wurzeln gut, Hyphen vorh., Glomalin, Sporenmix, wenig, viel dunkelbraune

U20 UR7B22 1 1 Wurzeln gut, wenig Hyphen, Glomalin, wenig frische Sporen,

U21 UR7B27 2 1 Wurzeln gut, Hyphen vorh. Glomalin, Sporenmix, wenig

U22 UR8B5 VK Kontrolle, Herbst 2010

Reihe 8

2 1 Wurzeln knapp (Gras), Hyphen vorh., Glomalin, wenig bunter Mix Sporen

U23 UR8B10 1 1 Wurzeln knapp, sehr wenig Hyphen, Glomalin, fast keine Sporen

U24 UR8B15 1 1 Wurzeln gut, kaum Hyphen, Glomalin, minimal Sporen

U25 UR9B6 VK INOQ b, Herbst 2010

Reihe 9

1 1 Wurzeln gut, sehr wenig Hyphen, Glomalin, wenig Sporenmix

U26 UR9B12 2 1 Wurzel gut, Hyphen vorh., Glomalin, wenige mittelbraune Sporen

U27 UR9B18 2 3 Wurzeln knapp (Gras), Hyphen vorh., Glomalin, relativ viel bunte Sporen

Pappel - Ektomykorrhiza Vogelkirsche – Kontrolle Pappel – Kontrolle- Reihe 1 - - Reihe 2 - - Reihe 3 -

Vogelkirsche – INOQ - 2009 Pappel – INOQ Vogelkirsche – INOQe- Reihe 4 - - Reihe 5 - - Reihe 6 -

Pappel – AMykor Vogelkirsche – Kontrolle Vogelkirsche – INOQe- Reihe 7 - - Reihe 8 - - Reihe 9 -

Fig. 4: AMP-Material von Standort Urbach (November 2011).


2.1.1.1.3 Sporenisolation aus Erde von Wurzelproben – Zusammenfassung

(1) Das beim Waschen der Wurzeln angefallene Wasser wurde über ein 35µm Sieb gegeben und nach dem Vorhandensein von AMP-Hyphen und AMP-Sporen überprüft.

(2) Alle Proben enthielten AMP-Material. Erdklümpchen, zusammengehalten durch Glomalin, wurden ebenfalls in fast allen Proben nachgewiesen.

(3) Alle Proben mit AMP-Inokulation enthalten mehr Sporen als die entsprechenden Negativkontrollen. Am Standort Bockelnhagen ließen sich die AMP-Sporen von

INOQ und AMykor visuell von den autochthonen AMP-Sporen unterscheiden.

2.1.1.2 Molekularbiologischer Nachweis - AMP-Detektionsassay (Plattentest)

Beide, im Rahmen der Projektarbeiten zum Einsatz gekommenen Mykorrhizaprodukte (INOQ

Agri, AMYKOR®-Wurzel-Vitalgranulat) enthalten vor allem die AMP-Art G. intraradices.

Deren Detektion war Ziel des molekularbiologischen Nachweises.

Mit Hilfe eines AMP spezifischen Primers (FR – AMP DNA) mit Teilen der Sequenz des

Fumeratreduktase-Gens von G. intraradices (Synonym Glomus irregulare) kann mittels

AMP-Detektionsassay auf Mikrotiterplattenbasis die AMP-Art G. intraradices in DNA-

Fraktionen von Wurzeln aus Vogelkirschen und Pappeln nachgewiesen werden. Damit lässt

sich dieser Assay zum Nachweis der Mycorrhizierung von Vogelkirschen- und Pappel-

Wurzeln mit den G. intraradices Produkten von INOQ und AMykor einsetzen.

2.1.1.2.1 AMP-Detektionsassay - Probenvorbereitung

Um den Mykorrhizierungsgrad der Wurzel-Proben zu bestimmen, waren die folgenden

Arbeitsschritte notwendig:

Pro mykorrhizierter bzw. nicht-mykorrhizierter Wurzel-Probe (Vogelkirschen und Pappeln - November 2011) der Standorte Bockelnhagen, Kalteneber und Urbach

wurden 100 mg (teils weniger) Wurzelmaterial ausgelesen, gewaschen und mittels

DNeasy-Kit (QIAGEN) deren DNA isoliert.

Pro Messung wurden 3 ng Gesamt-DNA aus Wurzelmaterial eingesetzt.

Jede Probe wurde als Doppelbestimmungen bezüglich Mykorrhizierung vermessen und die erhaltenen Messwerte als Mittelwert angegeben.

2.1.1.2.2 AMP-Detektionsassay – Funktionsweise

Der zur Messung des Mykorrhizierungsgrades eingesetzte AMP-Detektionsassay basiert auf

einem spezifischen AMP-Primer mit einer sog. „Stem-Loop“ Struktur. Die „Loop“ Struktur

resultiert aus der AMP-Primersequenz, mit dessen Hilfe AMP-DNA aus der Probe detektiert

wird und an beiden Enden zueinander komplementären DNA-Sequenzen, die bei

Nichtvorhandensein von AMP-DNA miteinander über H-Bücken verbunden sind und damit

diese typische Struktur ausbilden. Befindet sich nun in der Messprobe AMP-DNA, die zur

entsprechenden Loop-Sequenz eine komplementäre DNA-Sequenz aufweist, so wird diese

geöffnet und nach Hybridisierung der AMP-DNA an die zu ihr komplementären Sequenzen

eine „Stem“-Struktur ausgebildet.


+

p-Nitrophenylphosphat

Nitrophenol

+DIG

MikrotiterplatteMikrotiterplatte

DIG

Fig. 5: Übersicht zur Funktionsweise des auf Mikrotiterplatten basierenden AMP-Detektionsassays.

Der im Rahmen dieser Arbeiten genutzte „Loop“ mit DNA-Sequenzen aus dem

Fumaratreduktase-Gen von G. intraradices ist sowohl am 3`- als auch am 5’–Ende

modifiziert, was seine Immobilisierung an eine Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte über

die am 5´-Ende enthaltene Biotinmodifizierung bewirkt. Die am 3´-Ende enthaltene DIG-

Markierung ermöglicht ausschließlich bei Vorliegen der AMP-DNA durch die Überführung

der „Loop“ Struktur in eine „Stem“ Struktur das Anbinden des anti-DIG Antikörpers mit

Phosphatase-Einheit, was über die p-Nitrophenylphosphat-Reaktion photometrische messbar

ist (Fig. 5).

2.1.1.2.3 AMP-Detektionsassay - Messparameter Kalibrierkurve (Hybridisierung AMP spezifischer Primer (FR – AMP DNA)

y = -0,0778x2 + 0,2884x + 0,09R² = 0,9984

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 1 2 3 4 5

Mess

sig

na

l[A

40

5n

m]

100 200 300 400 500AMP-DNA [ng]


Fig. 6: Korrelation der AMP-Konzentration zum Messsignal bei Nutzung des AMP-Detektionsassays.

Hybridisiert wurde AMP-DNA zum FR-Primer.

Mit Hilfe des AMP-Detektionsassays lässt sich bei Nutzung des FR-Primers mit Sequenzen

aus dem Fumaratreduktase-Gen eine Nachweisgrenze von 7 ng AMP (G. intraradices) -DNA

erreichen. Der Messbereich liegt zwischen 11 und 150 ng AMP-DNA und die Messzeit bei

150 Minuten (Fig. 6).

2.1.1.2.4 AMP-Detektionsassay – Nachweis des Mykorrhizierungsgrades

Mittels FR-Primer konnte der Mykorrhizierungsgrad in den Wurzelproben von Vogelkirsche

und Pappel ermittelt werden. Dazu wurden 750 ng Gesamt-DNA (bestehend aus pflanzlicher

DNA und in Gegenwart von AMPs deren DNA) für die in Mikrotiterplatten ablaufenden

Hybridisierungsreaktionen eingesetzt. Nach einer 150minütiger Hybridisierungsreaktion ließ

sich der Hybridisierungsgrad über die p-Nitrophenylphosphat-Reaktion ermitteln. Da der

Umsatz von p-Nitrophenylphosphat zu p-Nitrophenol direkt mit der hybridisierten AMP-

DNA korreliert, kann der Mykorrhizierungsgrad ebenfalls direkt berechnet werden (Fig. 7).

AM

P-D

NA

-Ko

nze

ntr

ati

on

[n

g]

2

19

8

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

22 2 11 28

5

10

15

20

Fig. 7: Nachweis des Mykorrhizierungsgrades mittels AMP-Detektionsassay. Dazu wurde aus Wurzelmaterial

mit und ohne AMPs die DNA isoliert und deren AMP-Gehalt über die Hybridisierung mit dem FR-Primer

detektiert. Probe 22 zeigt eine Wurzelprobe ohne AMPs (Negativkontrolle) bzw. die Proben 11 und 28 Proben

mit AMPs. Lediglich bei Probe 2 konnte zum Vorhandensein von AMPs keine klaren Aussagen getroffen

werden.

2.1.1.2.5 Ergebnisse zur Mykorrhizierung nach Standorten

Eine Übersicht über die mit dem AMP-Detektionsassay gemessene AMP-DNA Konzentration

zur Gesamt-DNA Konzentration in den Wurzelproben der Standorte Bockelnhagen,

Kalteneber und Urbach ist in den Tabellen 4 -6 dargestellt. Die gemessenen Proben enthalten:


ihrer Gesamt-DNA als AMP-DNA.

Tab. 4: AMP-Detektionsassay – Ergebnisse der Proben vom Standort Bockelnhagen.

Ergebnis Plattentest Standort Bockelnhagen

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21

Plattentest n n y y n y y n y y y y y n n n y y y y y

1. Wiederholung y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y

2. Wiederholung y y n n n

Mikroskop y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y

Juliproben n y

Variante Pappel

Ektomykorrhiza Reihe 1

VK Kontrolle Reihe 2

Pappel Kontrolle Reihe 3

VK/INOQ Pflanzung

Herbst 2009 Reihe 4

Pappel INOQ Reihe 5

VK/INOQ Pflanzung

Herbst 2010 Reihe 6

Pappel AMykor Reihe 7

Tab. 5 AMP-Detektionsassay – Ergebnisse der Proben vom Standort Kalteneber.

Ergebnis Plattentest Standort Kalteneber

K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 K11 K12 K13 K14 K15

Plattentest n n y y y y n y n n n y y y y

1. Wiederholung y y y y y y n n n y y y y y y

2. Wiederholung n n y n

Sieb y y y y y y y y y y y y y y y

Pappel


VK Kontrolle Reihe 2


VK/INOQ Pflanzung

Herbst 2009 Reihe 4

Pappel INOQ Reihe 5

K16 K17 K18 K19 K20 K21 K22 K23 K24 K25 K26 K27

Plattentest n n n y n n n n n n n n

1. Wiederholung y y y y y n n y y n n y

2. Wiederholung n n n n n n n

Sieb y y y y y y y y y y y y

VK/INOQ Pflanzung

Herbst 2010 Reihe 6


VK Kontrolle Pflanzung

Herbst 2010 Reihe 8

VK/INOQ Pflanzung

Herbst 2010 Reihe 9

Tab. 6: AMP-Detektionsassay – Ergebnisse der Proben vom Standort Urbach.

2,3 x 10-6

– 7,5 x 10-4

% < 2,3 x 10

-6 %

7,4 x 10-4

– 8,5 x 10-4

%

8,6 x 10-4

– 3,5 x 10-3

%


Ergebnis Plattentest Urbach

U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 U9 U10 U11 U12 U13 U14 U15

Plattentest n y n n n n n y n n n n n n n

1. Wiederholung y n y y y y y y n n n n n n y

2. Wiederholung n n y n n y n n

Sieb y y y y y y y y y y y y y y y

Variante Pappel


VK. Kontrolle Reihe 2


VK/INOQ Pflanzung Herbst

2009 Reihe 4

Pappel INOQ Reihe 5

U16 U17 U18 U19 U20 U21 U22 U23 U24 U25 U26 U27

Plattentest y y y y y y y n y y y y

1. Wiederholung y n y n n n n n y n n n

2. Wiederholung (n) y y y y (y) y n n

Sieb y y y y y y y y y y y y

Variante VK/INOQ

Pflanzung Herbst 2010 Reihe 6


VK Kontrolle Pflanzung Herbst

2010 Reihe 8

VK/INOQ Pflanzung Herbst

2010 Reihe 9

2.1.1.2.6 AMP-Detektionsassay – Zusammenfassung

Basierend auf den Ergebnissen des AMP-Detektionsassays lassen sich folgende

Schlussfolgerungen ziehen:

(1) Standort Bockelnhagen - 17 von 21 Proben enthalten AMP-DNA; höchste AMP-Konzentrationen bei Pappel - AMykor bzw. Vogelkirsche - INOQ – 2009.

(2) Standort Kalteneber – bei mehr als die Hälfte aller Proben kein eindeutiger AMP-Nachweis möglich; höchste AMP-Konzentration bei Pappel – INOQ.

(3) Standort Urbach – bei mehr als die Hälfte aller Proben kein eindeutiger AMP-Nachweis möglich; 7 Proben mit unzureichenden Wurzelmengen bzw. Verunreinigungen mit

Graswurzeln; höchste AMP-Konzentration bei Pappel - AMykor und Vogelkirsche -

INOQ – 2010.

2.1.1.3 PCR – Bestätigungsverfahren für den Nachweis des Mykorrhizierungsgrades

Es ist bekannt, dass sich in den Produkten zur Inokulation mit hoher Wahrscheinlichkeit

überwiegend Sporen von G. intraradices befanden. Mittels PCR war nun zu bestätigen, dass

an den Wurzeln der Novemberproben aller Standorte tatsächlich DNA von G. intraradices

detektiert wurde. Dazu wurden Sporen aus den Proben Bockelnhagen – Vogelkirsche -

2010/INOQ - Reihe 4 und Bockelnhagen - Vogelkirsche - 2009/INOQ - Reihe 6, sowie von

INOQ- und AMykor-Sporen (Kontrollen) PCRs durchgeführt.

2.1.1.3.1 Vorgehensweise

Die Sporen als auch extra- und intraradikale AMP-Strukturen wurden in 10μl Wasser

aufgenommen und zerdrückt, sodass eine homogene Suspension entsteht. Dazu gibt man 1

Volumen Chelex-Resin-Lösung und erhitzt die Suspension 1 Minute auf 95°C. Im Anschluss

daran erfolgte eine 5-minütige Inkubation auf Eis. In der oberen Flüssigkeitsphase befindet


sich nun das DNA-Gemisch, welches mit Hilfe einer Pipette zur weiteren Verwendung

abgenommen werden kann.

ITS1 ITS25,8 S18S rDNA 28S rDNA

ITS 4

ITS 4i

NS 5

Amplifikationsprodukt 1. PCR

Amplifikationsprodukt 2. PCR

Glom 1310i

Abb. 8: Schema der Vorgehensweise zum Nachweis von AMP-DNA über die Nested-PCR mit anschließender

zweiten PCR.

Die PCR ermöglicht es, definierte DNA-Bereiche in-vitro zu amplifizieren. Der zu

amplifizierende Bereich (Amplifikationsprodukt) wird durch zwei Primermoleküle festgelegt.

Als PCR-Primer werden kurze, gegenläufige Oligonukleotide mit Homologie zum 5´- bzw.

3´-Ende der Zielsequenz bezeichnet.

Da die meisten DNA-Proben eine große Vielfalt an DNA verschiedener AMP´s enthalten und

die DNA in der Regel in nur geringen Konzentrationen vorliegt, wurde die Nested-PCR

eingesetzt. Mit ihr lässt sich die extrahierte DNA unabhängig von der AMP-Art amplifizieren.

Außerdem sind damit auch noch geringste Mengen an AMP-DNA nachweisbar. Bei der

Nested-PCR wird eine erste PCR durchgeführt. Das hierbei erhaltene Amplifikationsprodukt,

was in der Regel Teil der rDNA ist, wird anschließend als Template in einer zweiten PCR

genutzt. Hierbei befinden sich die zum Primerpaar komplementären Sequenzen zwischen

denen, an die die beiden Primer der ersten Reaktion hybridisiert sind. Dadurch lassen sich

sog. falschpositive Amplifikationsprodukte weitestgehend eliminieren (Fig. 8).

Zur ersten PCR (Nachweis AMP) wurden die Primer NS5 (Forward Primer) und ITS4

(Reverse Primer) mit folgenden Sequenzen verwendet:

NS5: 5´-AACTTAAAGGAATTGACGGAA-3´,

ITS4: 5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´.

In einer zweiten PCR wurde das Amplifikationsprodukt der ersten PCR mittels der

spezifischen Glomus-Primer Glom 1310i (Forward Primer) und ITS4i (Reverse Primer)

spezifiziert.

Glom 1310i: 5´-AGCTAGGCCTAACATTGTTA-3´,

ITS4i: 5´-TTGATATGCTTAAGTTCAGCG-3´.

2.1.1.3.2 Ergebnisse

Sporen bzw. extra- und intraradikale Strukturen einer Auswahl an Proben von nach dem

AMP-Detektionsassay mykorrhizierten Vogelkirschen und Pappeln vom Standort

Bokelnhagen wurden per PCR bezüglich AMP-Mykorrhizierung geprüft. Hierbei konnten die

mit dem AMP-Detektionsassay erhaltenen Ergebnisse bestätigt werden. Da hier G.


intraradices spezifische Primer in der 2. PCR genutzt wurden, ließen sich die AMPs der Art

G. intraradices zuordnen (Fig. 9).

1 2 3 4 5 6 7 8 Kbp

- 1,0

- 1,0

(A)

Vogelkirsche

(B)

Pappel

(A) 1 - 4 INOQ - 2010 – Reihe 4

5 – 8 INOQ – 2009 – Reihe 6

(B) 1 – 4 INOQ - Reihe 5

5 - 8 Amykor - Reihe 7

Abb. 9: Analyse der PCR-Produkte, die mit der DNA jeweils einer AMP-Spore erhalten wurden. Dazu wurde

die Sporen-DNA zusammen mit den Primern NS5 und ITS4i für eine erste PCR eingesetzt und das dabei

erhaltene Amplifikationsprodukt für eine zweite PCR mit der Primerkombination GLOM1310 –ITS4i genutzt.

Die PCR-Produkte wurden anschließend auf einem 1,5%igem Agarosegel nach ihrem Molekulargewicht

getrennt.

2.1.2 Arbeitspaket 2 - Etablierung neuer Einzelsporlinien zur Mykorrhizierung von Bäumen - Tests zur Eignung

Im IPK existieren bereits 2 in vitro Einzelsporlinien (ESL) von G. intraradices (AMykor),

sowie 2 weitere in Strenzfeld selektierte autochthone G. intraradices ESL.

G. intraradices P7 G. intraradices P33 G. etunicatum P29

Abb. 10: Lichtmikroskopische Analyse der Sporen, die nach ersten Untersuchen als G. intraradices P7, G.

intraradices P33 und G. etunikatum P29 klassifiziert wurden (50fache Vergrößerung).

Zusätzlich konnten von den autochthonen Sporen aus dem Gebiet zwischen Harz und

Thüringer Wald drei weitere ESL selektiert und anschließend in vitro kultiviert werden. Nach

ersten taxonomischen Untersuchungen konnten diese AMP aufgrund ihrer

Sporenmorphologie und ihres Wuchsverhalten als

G. intraradices P7,


G. intraradices P33,

G. etunicatum P29

klassifiziert werden (Fig. 10). Genaue Untersuchungen per molekularbiologischer Methoden

sind noch im Gange.

Außerdem sind weitere bereits vollständig taxonomisch klassifizierte ESL z. B. von G.

mosseae, G. geosporum und G. coronatum in der in vitro Kultivierung. Hier bedarf es jedoch

weiterer Optimierungen hinsichtlich Kulturbedingungen (z. B. Wirt, Medium, pH-Wert im

Medium, Mikroelemente), um diese als kommerzielle in vitro Kulturen verfügbar zu haben.

Von autochthonen Sporen aus Kontrollproben der Standorten Bockelnhagen, Kalteneber und

Urbach wurden ebenfalls Kulturen angelegt, um neue in vitro ESL in Kultur zu bringen, die

den Standorten angepasst sind. Diese Versuche laufen ebenfalls noch.

2.2 Zusammenfassung der Ergebnisse im Berichtszeitraum

2.2.1 Arbeitspaket 1

Autochthone Mykorrhiza mit unterschiedlicher Konzentration war unabhängig vom Standort

in allen Proben vorhanden. Besonders gut visuell detektierbar waren inokulierte AMP Sporen

in Bockelnhagen.

Mit Hilfe des AMP-Detektionsassays konnte am Standort Bockelnhagen die größte G.

intraradices Population nachgewiesen werden. Hierbei waren die höchsten AMP

Konzentrationen bei Pappel - AMykor - Reihe 7 bzw. Vogelkirsche - INOQ 2010 und 2009

(Reihe 4 und Reihe 6) festzustellen. Mittels PCR wurde das Vorhandensein von G.

intraradices für Bockelnhagen Reihe 4 und Reihe 6 bestätigt.

Für die Standorte Kalteneber und Urbach waren bei ca. ein Drittel der Proben die

Wurzelmengen in den Proben sehr knapp bzw. nicht ausreichend. Auch enthielt dieses

Wurzelmaterial vielmals noch zusätzlich Gras. Die Analyse der Proben beider Strandorte

zeigte, dass hier die autochthone AMP-Population an stärksten vertreten war. Dies konnte mit

dem AMP-Detektionsassay bestätigt werden. Viele der selektierten autochthonen AMPs

ließen sich nicht mit dem speziell für G. intraradices entwickelten FR Primer detektieren.

Am Standort Kalteneber konnten autochthone G. intraradices besonders gut in Reihe 5

Pappel - INOQ nachgewiesen werden. Die Kontrollwerte Vogelkirsche - Reihe 2 lassen

jedoch darauf schließen, dass auch hier autochthone G. intraradices Sporen in relativ hoher

Konzentration vorhanden sind.

Am Standort Urbach war die höchste AMP-Konzentration bei Pappel - AMykor und

Vogelkirsche - INOQ - 2010 nachzuweisen.

2.2.2 Arbeitspaket 2

Vom Projektpartner IPK konnten erste in vitro ESL (Einzelsporlinien) etabliert werden.

Zusätzlich sind weitere ESL in der in vitro Kultivierung. Ihr Potential zur Steigerung des

pflanzlichen Ertrages ist in den zukünftig geplanten Arbeiten zu prüfen.

Zwischenbericht zum FuE-Vorhaben · 2014. 3. 27. · Ansatz der Nutzung in vitro produzierter...

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