Über den Einbau Purin-analoger Verbindungen in die Bakterien-Nukleinsäure
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J. Mol. Biol. (1960) 2. 241-242 LETTER S TO THE EDIT OR Uber den Einbau Purm-analoger Verbindungen in die Bakterlen-Nukleinsaure 2- Aminop ur in e is transfor med by E. coli B intoade nine a nd guanine .Bo th meta- bo lites are used for nucleic acid synthesis, while only a small q uantity of un- changed 2. aminopurine is in corporated into DNAa nd RNA. Adenine or guanine di mi nish the upt ake of 2-aminopurine. E. coli B converts purine to aden ine and gu anin e. Unchanged purine could not be dete cted in the bacte rial nucleic acids. In Fortfiihrung der Arbeiten tiber den Einbau Pyrimidin-analoger Verbindungen in die Bakterien-Desoxyribonuklcinsiiure (Weygand, Wacker & Dellweg, 1952; Wacker, Kir schf eld & Weinblum, 1960; Wacker, Kirschfeld, H artmann & Weinblum, 1960) untersu chten wir auch die Aufnahme und den Stoffwe chsel Purin-analoger Verbindun- gen bei B akteri en. Irn Nachfolgenden berichten wir tiber Untersuchungen mit 2-Aminopurin.[T] und Puri n-[T] bei E . coli B. Die Markierung von 2-Aminopurin (AP) und Purin erfolgte mit Tritiumgas nach der Methode von Wilzbach (Wilzbac h, 1957). Spezifische Akti vitiit: 2-Aminopurin·l T] 150 mcJmMol; Purin-[T] 1 mcJmMol. Es wird angenommen, daB Tritium im Amino- purin -Molekiil gleichmaf dg auf die Stellungen 6 und 8 ve rteilt ist , im Purin-Molekiil gleichmaliig auf die Ste llungen 2, 6 und 8 (genaue Untersuchungen sind im Gange). E. coli B wurde in einem halbsyn thetischen Nahrmedium (Wacker, Ebert & K olm , 1958) kultiviert , jedoch ohne Adenin und Guanin. Die Ribotide wurden nach Be- ha ndlung der gesamten Bakt erien mit 1 N-K OH und anschliefender Dialyse aus dem Au Bendialysat isoliert , die Desoxyri boside wie bereits friiher beschr ieben (Wacker, Kirs chf eld & Trager, 1959). Die Purin- und Pyrimid inbasen wurden nach Perchlor- siiure -Spa ltung der gesamten Bakterien bzw. der Ribotide oder Desoxyriboside papierchr omatogr aphisch isoliert .-Die Bestimmung der Radioaktivit iit erfolgte in einem MethandurchfluBziihler (FH 51). Zur quantita tiven Bestimmung der R adi o- akt ivitiit wurden die Subs ta nzen von den Papierchromat ogrammen eluiert, ihre U.V.-Absorption gemessen und dann in unendlich d unner Schicht auf Aluminium- pliittchen aufgedampft (Ziihlausb eute 15 bis 20 %).-Losungsmittelsysteme: 1. n-ButanoIJH 2 0 , 86:14; II. n-ButanoIJH 2 0 JNH a , 86:13:1 ; III. H 20, pH 10. Wiichst E. coli B 36 Stdn. in Anwesenheit von 5 fLg, 20 fLg oder 500 JLg AP-[T], so nehrnen 100 mg getrocknete Bakterien 10 fLg, 33 fLg bzw. 230 JLg AP-[T] auf. Spaltet man die mit AP-[T] gewachsenen Bak terien mit Perchlorsaur e und trennt papier- chroma tog ra phisch die P urin basen in den Uis ungsmittelsy stemen I-III, so sind diedem AP entsprechenden Stellen nur sehr wenig radi oaktiv. Dagegen zeigen die Flecke des Adenins eine hohe Ak tivitiit, die des Guanins eine noch hOhere. -Wie die Unte rsu - chungen zeigt en, wird AP-[T] sowohl in die Ribonukleinsiiure (RNS) als auch in die Desoxyribonukleinsaure (DNS) aufgenommen. Nach Angebot von 5 JLg AP-[T] pro m!. Nahrmedium enthal ten 100 mg RNS 0,13 fLg AP-[T] und 100 mg DNS 0,03 pg AP-[T]. Die spezifische Aktivitiit des Adenins betragt in der RNS 0,2 X 10 6 ImpJmin JJLMol, in der DNS O,6 X 10 6 ImpJminJ fLMol. Das Gu anin hat in der RNS cine spezifische Akti vitiit von I X 10 6 ImpJmin JfLMol, in der DNS von 1,4 X 10 6 241
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J. Mol . Biol. (1960) 2. 241-242
LETTER S TO THE EDITOR
Uber den Einbau Purm-analoger Verbindungen in dieBakterlen-Nukleinsaure
2-Aminopurin e is transformed by E. coli B in t o adenine and guanine. Both m etabolites are used for nucleic ac id synthesis, whi le only a small quantity of unchanged 2.aminopurine is incorporated in t o DNA and RNA. Adenine or guaninediminish t he uptake of 2-aminopurine.
E . coli B converts purine to adenine an d gu anine. Unchanged purine could n otbe detected in the bacterial nucleic ac ids.
I n Fortfiihrung der Arbeiten tiber den Einbau Pyrimidin-analoger Verbindungen indie Bakterien-Desoxyribonuklcinsiiure (Weygand, Wacker & Dellweg, 1952; Wacker ,Kirschfeld & Weinblum, 1960; Wacker, Kirschfeld, Hartmann & Weinblum, 1960)untersuchten wir auch die Aufnahme und den Stoffwechsel Purin-analoger Verbindungen bei Bakterien. Irn Nachfolgenden berichten wir tiber Untersuchungen mit2-Aminopurin.[T] und Purin-[T] bei E . coli B.
Die Markierung von 2-Aminopurin (AP) und Purin erfolgte mit Tritiumgas nachder Methode von Wilzbach (Wilzbac h, 1957). Spezifische Aktivit iit: 2-Aminopurin·l T]150 mcJmMol ; Purin-[T] 1 mcJmMol. E s wird angenommen, daB Tritium im Aminopurin -Molekiil gleichmaf dg auf die Stellungen 6 und 8 verteilt ist, im Purin-Molekiilgleichmaliig auf die Stellunge n 2, 6 und 8 (genau e Untersuchungen sind im Gange ).E. coli B wurde in einem halbsyn thetischen Nahrmedium (Wacker , Ebert & Kolm ,1958) kult iviert, jedoch ohne Adenin und Guanin. Die R ibotide wurden nach Behandlung der gesamten Bakterien mit 1 N-K OH und anschliefender Dialyse aus demAu Bendialysat isoliert , die Desoxyriboside wie berei ts fr iiher beschrieben (Wacker ,Ki rschfeld & Trager , 1959). Die Purin- und Pyrimidinbasen wurden nach Perchlorsiiure -Spaltung der gesamte n Bakterien bzw. der Ribot ide oder Desoxyribosidepapierchromatographisch isoliert.-Die Bestimmung der Radioaktivitiit erfolgte ineinem MethandurchfluBziihler (FH 51). Zur quantitativen Bestimmung der Radioaktivitiit wurden die Subs tanzen von den Papierchromatogrammen eluiert, ihreU.V.-Absorption gemessen und dann in unendlich dunner Schicht auf Aluminiumpliit t chen aufgedampft (Ziihlausbeute 15 bis 20%).-Losungsmittelsysteme :1. n-ButanoIJH 20 , 86:14; II. n-ButanoIJH 20 JNH a, 86:13:1 ; III. H 20, pH 10.
Wiichst E. coli B 36 Stdn. in Anwesenheit von 5 fLg, 20 fLg oder 500 JLg AP-[T], sonehrnen 100 mg getrocknete Bak terien 10 fLg, 33 fLg bzw. 230 JLg AP-[T] auf. Spaltetman die mit AP-[T] gewachsenen Bakterien mit Perchlorsaure und trennt papierchromatog raphisch die P urin basen in den Uisungsmittelsystemen I-III,so sind die demAP entsprechenden Stell en nur sehr wenig radioaktiv. Dagegen zeigen die Flecke desAdenins eine hohe Aktivitiit , die des Guanins eine noch hOhere.-Wie die Untersu chungen zeigten, wird AP-[T] sowohl in die Ribonukleinsiiure (RNS) als au ch in dieDesoxyr ibonukleinsa ure (DNS) aufgenommen. Nach Angebot von 5 JLg AP-[T] prom!. Nahrmedium enthalten 100 mg RNS 0,13 fLg AP-[T] und 100 mg DNS 0,03 pgAP-[T] . Die spezifische Aktivitiit des Adenins betragt in der RNS 0,2 X 10 6
ImpJminJJLMol, in der DNS O,6 X 106 ImpJminJfLMol. Das Guanin hat in der R NScine spezifische Akti vit iit von I X 106 ImpJminJfLMol, in der DNS von 1,4 X 106
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Imp/min/ttMol.-InAnwesenheitvon 100 ttg Guanin oder 100 JLg Adeninpro ml. Nahrmedium verringert sich die Aufnahme von AP-[T] bei allen Konzentrationen (5 JLg,20 JLg und 500 JLg) um etwa 20%. In Ubereinstimmung mit Befunden bei Lactobacilluseasei (Elion & Hitchings, 1950) hemmen 500 JLg AP das Wachstum von E. coli B.(Mit einem 14C-markierten AP von der vergleichsweise geringen spezifischen Aktivitatvon 1 mc/mMol gestaltet sich der Nachweis des Einbaus von unverandertem AP indie RNS und DNS wesentlich schwieriger.)
Wachst E. coli mit 20 JLg Purin-[T] pro ml, Nahrmedium, so nehmen 100 mggetrocknete Bakterien ungefahr 350 JLg Purin auf. Nach Perchlorsaure-Spaltung dergesamten Bakterien und papierchromatographischer Trennung der Purinbasen indem Losungsmittelsystem I sind auf dem Papierchromatogramm nur zwei Fleckeradioaktiv, namlich Adenin und Guanin. Die spezifische Aktivitat, des Guanins betrug7 X 105 Imp/min/JLMol und war doppelt so hoch wie die des Adenins. RadioaktivesPurin konnten wir bisher auf den Papierchromatogrammen nicht nachweisen.
In einer vorhergehenden Mitteilung berichteten wir tiber den Einbau Pyrimidin-analoger Basen in die DNS von E. coli B (Wacker, Kirschfeld & Weinblum, 1960). Dabeifanden wir, daB 100 mg DNS etwa 600 JLg 5-Bromuracil aufnehmen, Im Vergleichdazu ist die Aufnahme von 0,03 JLg AP auBerst gering.-Wie die vorliegenden Ergebnisse zeigen, wird AP bei der Aufnahme von Adenin und auch Guanin verdrangt;beide Purine sind dabei etwa gleich wirksam. Dieser Befund erganzt und bestatigtdie Aufhebung der 2-Aminopurin-Hemmung mit Adenin oder Guanin (Elion &Hitchings, 1950). Da weiterhin AP sowohl in Adenin als auch Guanin umgewandeltwird, kann man annehmen, daf AP in der Bakterienzelle die Rezeptoren des Adeninsund auch Guanins besetzt.-Die Aufnahme von Purin weist insofern keine Besonderheit auf, da die Verbindung nicht als unnattirlicher Baustein in die Nukleinsaureeingebaut wird, sondern in Adenin und Guanin umgewandelt wird.
Wie diese und die ktirzlich mitgeteilten Befunde zeigen (Wacker, Kirschfeld &Weinblum, 1960; Wacker, Kirschfeld, Hartmann & Weinblum, 1960), ist die Spezifitatder Basenbausteine der Bakterien-DNS sehr groB (Zamenhof, Reiner, de Giovanni& Rich, 1956). Mit Ausnahme des Ersatzes der Methylgruppe im Thymin durch Brom,Chlor oder J od konnte bisher noch keine Verbindung gefunden werden, die in groBeremUmfange spezifisch nur in die DNS eingebaut wird.
Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem Verband der ChemischenIndustrie-Fonds der Chemie-ffu die Unterstiitzung dieser Arbeit,
Institut ffu Therapeutische Bioehemieder Universitat Frankfurt am Main,Germany
Received 24 May 1960
REFERENCES
ADOLF WACKER
SIGRID KIRSCHFELD
LOTHAR TRAGER
Elion, G. B. & Hitchings, G. H. (1950). J. Biol. Ohern, 187, 511.Wacker, A., Ebert, M. & Kolm, H. (1958). Z. Naturf. 13b, 141.Wacker, A., Kirschfeld, S. & Trager, L. (1959). Z. Naturf. 14b, 145.Wacker, A., Kirschfeld, S., Hartmann, D. & Weinblum, D. (1960). J. Mol. Biol. 2, 69.Wacker, A., Kirschfeld, S. & Weinblum, D. (1960). J. Mol. Biol. 2, 72.Weygand, F., Wacker, A. & Dellweg, H. (1952). Z. Naturj. 7b, 19.Wilzbach, K. E. (1957). J. Amer. Ohem. Soc. 79, 1013.Zamenhof, S., Reiner, B., de Giovanni, R. & Rich, B. (1956). J. Biol. Ohern; 219, 165.
