und Moleküle - mehrke.de molekuele.pdf · Mikroorganismen und Moleküle 1 Verfasser dieser Einheit...

Mikroorganismenund Moleküle

1

Verfasser dieser EinheitEckhard R. Lucius (Koodinator der Einheit)

Catherine Adley, Jan Frings, Cecily Leonard, Dean Madden, Markus Müller, Uta

Nellen, Patricia Nevers, John Schollar, Marleen van Strydonck, Paul Wymer.

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European Initiative for Biotechnology Education

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2 EINHEIT 1: MIKROORGANISMEN UND MOLEKÜLE EIBE European Initiative for Biotechnology Education 1998

Die Europäische Initiative für den Unterricht (EIBE) hat sichdie Aufgabe gestellt, durch einen neuartigen Unterricht inSchule und Lehrerbildung das Verständnis der Biotechnik zufördern sowie Beiträge zu einer fundierten öffentlichenDebatte über dieses Gebiet zu liefern.

EIBE KoordinatorHorst Bayrhuber, Institut für die Pädagogik der Naturwissenschaften an der Universität Kiel, Olshausenstraße 62,D-24098 KIEL, Germany. Telefone: + 49 431 880 3166 (EIBE Secretary: Regina Rojek). Facsimile: + 49 431 880 3132.

EIBEBELGIEN❙ Vic Damen / Marleen Van Strydonck, R&D Groep VEO, Afdeling Didactiek en Kritiek, Universiteit Antwerpen,Universiteitsplein 1, B-2610 WILRIJK.

DÄNEMARK❙ Dorte Hammelev, Biotechnology Education Group, Foreningen af Danske Biologer, Sønderengen 20, DK-2860 SØBORG.❙ Lisbet Marcussen, Biotechnology Education Group, Foreningen af Danske Biologer, Lindevej 21, DK-5800 NYBORG.

DEUTSCHLAND❙ Horst Bayrhuber / Eckhard R. Lucius / Regina Rojek / Ute Harms / Angela Kroß, Institut für die Pädagogik derNaturwissenschaften an der Universität Kiel, Olshausenstraße 62, D-24098 KIEL.❙ Ognian Serafimov, UNESCO-INCS, c/o Jörg-Zürn-Gewerbeschule, Rauensteinstraße 17, D-88662 ÜBERLINGEN.❙ Eberhard Todt, Fachbereich Psychologie, Universität Gießen, Otto-Behaghel-Straße 10, D-35394 GIEßEN.

FRANKREICH❙ Gérard Coutouly, LEGTP Jean Rostand, 18 Boulevard de la Victoire, F-67084 STRASBOURG Cedex.❙ Laurence Simonneaux / Jean-Baptiste Puel, Ecole Nationale de Formation Agronomique, Toulouse-Auzeville,Boîte Postale 87,F-31326 CASTANET TOLOSAN Cedex.

IRLAND❙ Catherine Adley / Cecily Leonard, University of Limerick, LIMERICK.

ITALIEN❙ Antonio Bargellesi-Severi / Alessandra Corda Mannino / Stefania Uccelli, Centro di Biotecnologie Avanzate,Largo Rosanna Benzi 10 , I-16132 GENOVA.

LUXEMBURG❙ John Watson, Ecole Européenne de Luxembourg, Département de Biologie, 23 Boulevard Konrad Adenauer,L-1115 LUXEMBOURG.

NIEDERLANDE❙ David Bennett, Cambridge Biomedical Consultants, Schuytstraat 12, NL-2517 XE DEN HAAG.❙ Fred Brinkman, Hogeschool Holland, Academy for Communication, Postbus 261, NL-1110 AG DIEMEN.❙ Liesbeth van de Grint / Jan Frings, Hogeschool van Utrecht, Educatie Centrum voor Biotechnologie, FEO,Afdeling Exacte Vakken, Biologie, Postbus 14007, NL-3508 SB UTRECHT.

ÖSTERREICH❙ Rainhart Berner, Höhere Bundeslehr- und Versuchsanstalt für Chemische Industrie Wien, Abt. für Biochemie,Biotechnologie und Gentechnik, Rosensteingasse 79, A-1170 WIEN.

SPANIEN❙ María Sáez Brezmes / Angela Gómez-Niño, Rosa Villamañán, Facultad de Educación, Universidad de Valladolid,Geologo Hernández Pacheco 1, ES-47014 VALLADOLID.

SCHWEDEN❙ Margareta Johansson, Föreningen Gensyn, PO Box 37, S-26881 SVALÖV.❙ Elisabeth Strömberg, Östrabo Gymnasiet, S-45181 UDDEVALLA.

VEREINIGTES KÖNIGREICH❙ Wilbert Garvin, Northern Ireland Centre for School Biosciences, NIESU, School of Education, The Queen’s University ofBelfast, BELFAST, BT7 1NN.❙ John Grainger / John Schollar / Caroline Shearer, National Centre for Biotechnology Education, The University of Reading,PO Box 228, Whiteknights, READING, RG6 6AJ.❙ Jill Turner, Department of Science and Technology Studies, University College London, Gower Street, LONDON, WC1 6BT.❙ Paul Wymer, Society for General Microbiology, Marlborough House, Basingstoke Road, READING RG7 1AE.

3EIBE European Initiative for Biotechnology Education 1998 EINHEIT 1: MIKROORGANISMEN UND MOLEKÜLE

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Mikroorganismenund moleküle

World Wide Web★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Sicherheitsbestimmungen,Urheberrecht und Dank- sagungen 4

Über diese UnitEinleitung 5

Herstellen von ModellenAusschneidemodell einer DNA 6Modelle von Mikroorganismen 8

Extraktion von DNAIsolation von DNA aus Bakterien 10Isolation von DNA aus Zwiebeln 12

Produktive MikroorganismenAmylase-Produktion 14Zellulase-Produktion 16Antibiotika-Produktion 18

Darstellung mikrobiellerLeistungen Brotteig herstellen 22 Mikrobielle Energiezelle 25

Gentransfer Bakterielle Konjugation 27Gentransfer durchAgrobacterium tumefaciens 32

Anhang 1Rezepte für mikrobiologischeMedien 34

Anhang 2Grundlagen mikrobiologischerArbeitstechniken 35

Anhang 3Öffnen einer Ampulle 35

Inhalt★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

INH

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Wenige Gebiete entwickeln sich so schnell wie dieBiotechnologie. Damit sie ständig überarbeitet und aufdem neuesten Stand gehalten und dann möglichstpreiswert verbreitet werden können, werden die EIBE- Unterrichtseinheiten mit Hilfe elektronischer Medienverbreitet.

Die vorliegenden Seiten (und auch alle anderen EIBE-Unterrichtseinheiten) stehen in ganz Europa undweltweit im World Wide Web zur Verfügung. Sie sindzu finden unter:

http://www.reading.ac.uk:8001/

Alle EIBE Unterrichtseinheiten im World Wide Websind Portable Document Format (PDF) - Dateien.Das bedeutet, daß die hohe Qualität der Abbildungen,der farblichen Darstellung, des Schriftbildes und desLayouts der Materialien unabhängig von derVerwendung des Systems erhalten bleibt (Macintosh -einschließlich Power PC, Windows, DOS oder Unix).

PDF-Dateien sind ebenfalls kleiner als ihreUrsprungsdateien, so daß Sie sie schneller ladenkönnen. Damit Sie sich die EIBE Unterrichtseinheitenansehen können, benötigen Sie jedoch eine geeigneteKopie des Adobe Acrobat‚ Leseprogramms.

Das Adobe Acrobat‚ Leseprogramm ist kostenlos inmehreren Sprachen (Holländisch, Britisches Englisch,Französisch, Deutsch, Spanisch, Schwedisch undItalienisch) erhältlich. Es kann geladen werden von:

http://www.adobe.com/

Mit Hilfe dieser Software können Sie sich die EIBEUnterrichtseinheiten ansehen oder ausdrucken.Außerdem können Sie damit "surfen" und dieMaterialien leicht finden.

ZUR BEACHTUNG:Adobe und Acrobat sindeingetragene Warenzeichen der Adobe SystemsIncorporated und sind urheberrechtlichgeschützt. Macintosh ist als Warenzeichen derApple Computer Incorporated registriert.

1EINHEIT

Unit 1DE 11/98

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Sicherheits-bestimmungenIn allen EIBE-Units haben wir uns bemüht,alle möglicherweise vorkommenden Risiken zuidentifizieren und entsprechendeSicherheitsvorkehrungen vorgeschlagen.

Soweit als möglich stehen die vorgeschlagenenVersuche mit allgemeingültigenSicherheitsempfehlungen der EU inÜbereinstimmung. Bei besonderen Risikenwurden diese berücksichtigt. Anhang 2 dieserUnit liefert zusätzliche Sicherheitsrichtlinien.

Benutzer sollten sich bewußt sein, daß Irrtümerund Auslassungen vorkommen können. Zudemhaben verschiedene Arbeitgeber undAusbildungsinstitutionen verschiedene Standards.Daher sollten Benutzer vor der Durchführungeines Versuchs immer ihren eigenenSicherheitsempfehlungen folgen. Das bedeutet,daß jede vom Arbeitgeber oder einer Institutionder Bildungsverwaltung geforderte Regel Folgegeleistet werden MUSS, unabhängig von denVorschlägen der EIBE-Unit.

Sollten die Anleitungen nichts anderesvorgeben,wird vorausgesetzt, daß● Versuche in einem entsprechend

ausgerüsteten und gewartetennaturwissenschaftlichen Arbeitsraumdurchgeführt werden;

● alle Arbeitsgeräte sorgfältig gewartet werden;normale Laborarbeiten (wie das Erhitzen vonFlüssigkeiten) mit Vorsicht ausgeführt werden;

● auf genaue Arbeitsausführung geachtetwird, wenn Chemikalien oder lebendeOrganismen benutzt werden;

● bei erkennbaren Risiken für die Augenmüssen Schutzbrillen getragen werden;

● Schüler und / oder Studenten mit dersicheren Handhabung von Chemikalienund Mikroorganismen in Versuchenvertraut gemacht werden.

© CopyrightDie EIBE-Units unterliegen dem Copyright,sind aber für den nicht-kommerziellen Einsatzdurch Ausbildungsinstitutionen frei verfügbar.

Sollten Sie dieses Material teilweise oder ganzfür kommerzielle Zwecke nutzen oder es inbeliebiger Form weiterveröffentlichen wollen,kontaktieren Sie:

Regina RojekInstitut für die Pädagogik derNaturwissenschaften an der Universität KielOlshausenstr. 62D- 24098 KIELDeutschlandTelefon: + 49 (0) 431 880 3166Telefax: + 49 (0) 431 880 3132E-Mail: [email protected]

Kerngruppe● Catherine Adley

The University of Limerick, Irland● Jan Frings

Hogeschool van Gelderland, Niederlande● Cecily Leonard

The University of Limerick, Irland● Eckhard R. Lucius (Koordinator) IPN

an der Universität Kiel, Deutschland● Marleen van Strydonck

The University of Antwerp, Belgien● Paul E.O. Wymer

The Wellcome Trust for Medical ScienceLondon, Großbritannien

Design, Illustration, Schriftbild, ergänzende

Texte und Druck: Dean Madden, CarolineShearer, NCBE, The University of Reading,GroßbritannienIllustrations Copyright © Dean Madden 1997Übersetzung: Ursula Goertz.

DanksagungenEIBE ist den nachfolgenden Personen für ihre Hilfe bei der Erstellung dieses Materials besonders dankbar: Liesbeth vande Grint (Hogeschool van Utrecht, Niederlande) und John Schollar (National Centre for Biotechnology Education, TheUniversity of Reading, Großbritannien) arrangierten und führten einen multinationalen Workshop durch, in dem dieMaterialien dieser Unit getestet wurden. Folgende Lehrer nahmen teil und gaben hilfreiche Kommentare zumRohentwurf: E. Vergants, L. Daniels, L. Neels (Belgien); Dorte Hammelev (Dänemark), Lucienne Diemer, GerardCoutouly (Frankreich); Thomas Jeß, Dr. U.Schnack, Dr. E. Lipkow (Deutschland); A. de Graaf, Guus Smid, J. Gradener(Niederlande); Rebecca Weston, Jane Gent, Derek Mackie, Sarah Whitethread, Maggie Parson (Großbritannien).


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Über diese UnitDiese Unit faßt eine Sammlung von praktischenArbeiten zusammen, die unabhängig voneinanderoder aufeinanderfolgend als Teil einer Unterrichts-einheit eingesetzt werden könne. Sie sind durchLehrer und Ausbilder verschiedener europäischerLänder erstellt und unter der Schirmherrschaft vonEIBE (European Initiative for Biotechnology Education)

mit Unterstützung des DGXII der EuropäischenKommission zusammengetragen worden.

Alle Übungen sind unter Einbeziehung von Lehrernaus verschiedenen Teilen Europas extensiv inpraktischen Workshops getestet worden.

Die Übungen dieser Einheit bestehen aus:

1. Modellen eines DNA-Moleküls undverschiedener Mikroorganismen. Sie sollen diewesentlichen Merkmale dieser Lebensformenaufzeigen und den Schülern die Möglichheitgeben, die relative Größe vonMikroorganismen zu erkennen.

2. einfachen, sicheren und kostenfreien Methodenzur Extraktion der DNA, um die Schüler mitden dazu benötigten Grund- techniken vertrautzu machen und ihnen zu ermöglichen, dasgenetische Material zu betrachten.

3. einer Vielzahl von Versuchen zur Veran-schaulichunga) der Präsenz von Mikroorganismen in derUmwelt und der Auswahl nützlicher Stämmeb) einiger von Mikroorganismen hergestellterProdukte (Enzyme und Antibiotika). ZweiUntersuchungen sind qualitativ ausgerichtet,eine erlaubt die quantitative Bestimmung derEnzymproduktion.

4. verschiedenene Untersuchungen zurAuswirkung mikrobiellen Wachstums,beginnend bei der einfachen Arbeit mitBrotteig, über die Arbeit zur Fermentationund schließlich der direkten Messung derStoffwechseltätigkeit in Hefe. Jeder dieserVersuche bietet die Möglichkeit für weitere,ausgedehntere Untersuchungen. ZurMotivation der Schüler wurde Arbeitsweisenmit biotechnischer Bedeutung der Vorrang voreher theoretischen Prinzipien gegeben.

5. zwei Demonstrationsversuchen, die natürlicheMethoden des Gentransfers zeigen, um einepraktische Einführung in die Grundlagengenetischer Modifikation zu geben.

Da zwei der praktischen Versuche die Produktionund Wirkungsweise von Antibiotika, sowie den

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★E

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Transfer antibiotischer Resistenz beinhalten, sinddiesen Anleitungen Zusatzinformationen beigefügt.

Die Autoren haben versucht, eine Kombination auseinfachen und anspruchsvolleren Übungen zuerstellen und hoffen, daß Biologielehrer darinInteressantes und Einsetzbares finden. ZweiAnhänge enthalten einige grundlegendeInformationen zum Einsatz mikrobiologischerArbeitstechniken in Schularbeitsräumen.

In nächster Zukunft werden ergänzendeAnleitungen verfügbar sein: Curriculum-Verknüpfungen, Sicherheitsbestimmungen,Materialbeschaffung und andere relevanteInformationen für die verschiedenen Teile derEuropäischen Union.

Anmerkungen zu den vorliegenden Materialien sindsehr willkommen, besonders von Lehrern, auf diesie hauptsächlich ausgerichtet sind. Kommentareund Fragen oder dringende Nachrichten bezüglichder Sicherheitsempfehlungen dieser Unterlagensollten gerichtet werden an:

Dr. Eckhard R. LuciusInstitut für die Pädagogik derNaturwissenschaften an der Universität KielOlshausenstr. 62D- 24098 KIELDeutschlandTelefon: + 49 431 880 3137Telefax: + 49 431 880 1521E-Mail: [email protected]

National Centre for Biotechnology EducationThe University of ReadingThe United Kingdom

Telefon: + 44 1734 873743Telefax: + 44 1734 750140E-Mail: D.R. [email protected]

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Ausschneidemodelleiner DNA★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Ziel● Aufzeigen der wesentlichen Merkmale der

DNA-Struktur (Desoxyribonukleinsäure)

ZeitbedarfDie Anfertigung des Modells dauert etwa 30Minuten. Sollen die (entgegengesetzten )Ausschnitte koloriert werden, muß mehr Zeitangesetzt werden.

Geräte und MaterialienBedarf für jeden Schüler oder jede Arbeitsgruppe

● Scheren● starker Papierkleber, Klebestreifen oder ein

kleiner Hefter● Faden ( um die Elemente des Modells

aufzuhängen oder um das fertiggestellteModell aufzuhängen)

Anmerkung: Um ein stabileres Modell zu erhalten, können je zweiSätze des Zucker-Phosphorsäure-Gerüsts aneinandergeklebt werden.

Bauanleitung1. Die Zucker- /Phosphorsäuregerüste A und

B werden ausgeschnitten.2. Die Basenpaar- ‘Sprossen’ werden

ausgeschnitten.3. Die Anhänge der Sprossen werden wie

gezeigt gefaltet.4. Die Anhänge werden an einem Ende jeder

Sprosse auf die numerierten Abschnittedes Gerüsts A geklebt. Die Sprossenkönnen in beliebiger Reihenfolge befestigtwerden.

5. Die Anhänge werden am anderenSprossenende an den entsprechendenNummern des Gerüsts B befestigt.

6. Die Schilder werden mit Fäden amDoppelhelix-Modell befestigt. DasDiagramm unten kann benutzt werden, umdas Modell zu beschriften.

DanksagungDieses Modell wurde übernommen von derRegierungsforschungsorganisation CSIRO,Australien, die es für ihren ‘Double Helix’Science Club erarbeitete. EIBE dankt CSIROfür die Idee und die Erlaubnis, das Modellverwenden zu dürfen.

Der genetische CodeJede Sequenz aus drei Basen auf der DNA-Doppelhelix codiert eine der zwanzigAminosäuren, hier in der Mitte dargestelltdurch eine Abkürzung aus drei Buchstaben.

Erste Zweite DrittePosition Position Position

Die DNA-StrukturKetten aus Zucker- und Phosphorsäure-Molekülenbilden die beiden ‘Gerüste’ der DNA. Zwischenihnen die vier Basen: Thymin (T), Cytosin (C),Adenin (A) und Guanin (G), die überWasserstoffverbindungen verbunden sind.

PHE

LEU

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STOP

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PHE

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TYR

STOP

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Zucker

PhosphorsäureBasen

Nukleotid

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......

.

Thymin

CytosinGuanin

Adenin

(S) Zucker

(P) Phosphorsäure

European Initiative forBiotechnology Education

DNA-MODELL

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Modelle vonMikroorganismen★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Für Schüler ist es oft schwierig, die Größe

von Mikroorganismen einzuschätzen.

Zudem fällt es ihnen schwer, die

dreidimensionale Struktur eines

Mikroorganismus nach dem

zweidimensionalen Betrachten durch ein

Mikroskop zu begreifen.

Das Herstellen von Modellen erleichtert

Schülern den Zugang zu den wesentlichen

Kennzeichen und der relativen Größe von

Mikroorganismen.

Dieser Arbeitsauftrag ist dann besonders

erfolgreich, wenn den Schülern freigestellt

wird, ihre eigenen Modelle zu entwickeln,

und sie nicht genauen Vorgaben folgen

müssen. Daraus ergibt sich, daß dieser

Arbeitsauftrag am besten Zuhause

vervollständigt wird ( wo eine größere

Materialauswahl und mehr Zeit zur

Verfügung stehen).

Anmerkung: Für jene Lernende, die glauben, daß dasBauen von Modellen unter ihrer Würde ist, mag es nötigsein, auf die herausragende Geschichte des Modellbausin der Molekularbiologie hinzuweisen, obwohlheutzutage räumliche Modelle weitestgehend durchComputerdarstellungen ersetzt worden sind.

Ziel● Aufzeigen der wichtigsten Merkmale eines

Lambda-Bakteriophagen und einerAuswahl von Bakterien

● Hilfestellung zur Einschätzung derrelativen Größe von Viren und Bakterien

ZeitbedarfEs dauert ca. 30 Minuten, ein Bakteriophagen-Modell anzufertigen. Soll das Schema koloriertwerden, muß mehr Zeit eingeplant werden. Jenach Sorgfalt kann der Bau eines Bakterien-modells eine Stunde oder länger dauern.Anmerkung: Diese Aufgabe könnte sinnvoll alsHausaufgabe eingesetzt werden.


● Bücher mit Abbildungen des Viren- undBakterienaufbaus

● diverse Materialien zum Modellbau, z.B.Karton, aussortiertes Verpackungsmaterial,Tischtennisbälle, Perlen u.ä.

● Scheren● Klebstoff, Klebestreifen oder ein kleiner

Hefter● Farbstifte

ArbeitsanleitungenVirus

Aus dem vorgelegten Ausschneideplan wird dasModell eines Lambda-Bakteriophagen gebaut.

Bakterium

Aus den bereitgestellten Arbeitsmaterialien wirdein Bakterienmodell (Stäbchen und Kokken)entwichelt.

Für jedes Modell:

1. Die aufgezeigten Hauptmerkmale, z.B.Zellmembran und genetisches Material sollenidentifiziert werden.2. Die Größe des dargestellten Organismus sollermittelt werden.3. Einfache Möglichkeiten, jüngeren Schülerndie Modellgröße zu erklären, sollen erläutertwerden, z.B. ‘Hätte ein Bakterium diese Größe,würde es vergleichbar so groß wie ein Haussein.’

Erläuterungen und HinweiseSchüler könnten ebenfalls aufgefordert werden,Modelle von Tier- oder Pflanzenzellen zubauen. Diese Modelle könnten die Unterschiedezwischen Prokaryonten und Eukaryontenstärker verdeutlichen und die immer wiederherangezogene Endosymbiontenhypothese (dieden stammesgeschichtlichen Ursprung derEukaryonten erklärt) nachdrücklichhervorheben.

ZusatzinformationAnleitungen zum Bauen von Modellen sindauch in folgender Veröffentlichungbeschrieben:

Nicholl, L. and Nicholl, D. (1987) Modelling theeukaryotic chromosome: a stepped approach.Journal of Biological Education 21 (2) 99 - 104.

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Gitternetz für des K

opf des Bakteriophagen λ

Das S

chema w

ird auf Karton oder beschichtetes P

apier (OH

P F

olie)kopiert.

Es w

ird an den Außenlinien ausgeschnitten, an allen Linien eingeritzt

und gefaltet. Die A

nhänge werden m

it einem starken,

Der D

NA

-Strang kann durch einen starken

Faden oder D

raht dargestellt werden.

Ein T

rinkhalm w

ird als Schw

anz benutzt(bew

egliche, ausziehbare Halm

em

achen das Modell realistischer).

Kopf,

enthältD

NA

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...


cytoplasm

Eine typische Bakterienzelle mit denNukleinsäuren und den Wirkorten desLysozyms und des Haushaltsreinigers(auf die Zellwand und -membran).

Zellmembran

Zellwand

Ribosomen,Orte derProteinsynthese

Plasmide,kleine DNA-Ringe

Chromosom

ISO

LA

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N v

on

DN

AIsolation von DNAaus Bakterien

Minuten bebrütet.4. Der Bakteriensuspension wird 0,5 ml des

Spülmittels zugefügt.5. Die Mischung wird in einem Becherglas

mit Wasser bei 60 ºC für 2 Minutenbebrütet.

6. Die Mischung wird einige Minuten inkaltem Wasser heruntergekühlt.

7. Die Oberfläche der Mischung wirdsorgfältig und langsam mit eiskaltemEthanol überschichtet.

8. Die Nukleinsäuren (DNA und RNA)werden in die obere (Ethanol-)Schichtausfällen.

Erläuterungen und Hinweise1. Die DNA kann durch fuchsinschwefelige

Säure oder Methylenblaulösung gefärbtwerden.

SicherheitsvorkehrungenDie allgemein gültigen Sicherheitsmaßnahmenfür mikrobiologisches Arbeiten sollten bei derHandhabung von Kulturen eingehalten werden.Vorsicht beim Benutzen des heißen Wassers(Arbeitsschritt 5)

DanksagungDieser Versuch basiert auf einem von Hertel etal. und Süßmuth et al. erarbeiteten Versuch, dieDNA aus Bacillus subtilis zu isolieren. Wirdanken Professor Joseph Lengeler, Osnabrück,für den Vorschlag, Spülmittel im Versucheinzusetzen.

In diesem Versuch wird Lysozym ( ein

Enzym) zum Abbau der Zellwände des

Bakteriums benutzt und Spülmittel zum

Aufbrechen der inneren Zellmembranen,

die dann Nukleinsäuren freisetzen (DNA

und RNA).

Ziel● Isolierung von DNA aus dem Bakterium

Escherichia coli K-12.

VorbereitungBakterienkulturen müssen wenigstens 4 Tagezuvor in Nährbouillon angesetzt werden (nurvoll entwickelte Kulturen erzeugen signifikanteNukleinsäuremengen).

ZeitbedarfDieser Versuch dauert 50 Minuten(einschließlich der 30 Minuten, in denen dieBakterien mit dem Enzym bebrütet werden).


● Voll entwickelte Kultur Escherichia coli K-12(vgl. Vorbereitung, oben)

● Lysozym-Pulver (eine kleine Spatelspitzeist ausreichend

● 6 ml Ethanol (eisgekühlt) vergällterEthanol oder Brennspiritus sindausreichend

● 0,5 ml Spülmittel, z.B. Pril (Henkel)● Impföse● 2 Reagenzgläser● Pipette oder 1 ml-Einwegspritze zur

Dispension von Wasser und Lysozymlösung● Wasserbad, eingestellt auf 60 ºC● Brutschrank, eingestellt auf 37 ºC

Durchführung1. Wenigstens 4 Tage vor Versuchsbeginn

wird eine Kultur von Escherichia coli K-12angesetzt.

2. Eine kleine Menge Lysozym wird dem 5 mlder Bakteriensuspension beigefügt undsorgfältig gemischt.

3. Die Mischung wird bei 37 ºC für 30

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......

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Ethanol (eisgekühlt)

Lysozym

5 ml Bakterien-suspension

Spülmittel

Schüttele dasGlas zurDurchmischungdes Inhalts

kaltes Wasser

DNAundRNA

60ºC

1. Bereite eineKultur von E.coliK-12 inNährbouillon vor.Bebrüte sie 3-7Tage bei 37 °C.

2. Gib eine geringeMenge Lysozymzu 5 ml derBakteriensuspensionund mischesorgfältig.

3. Bebrüte dieMischung 30min bei 37 °C.

4. Gib 0,5 mlSpülmittel in dieBakteriensuspension.

5. Bebrüte dieMischung 2 minbei 60 °C ineinemBecherglas mitWasser.

6. Laß dieMischung einigeMinuten inkaltem Wasserabkühlen.

7. Überschichte dieOberflächelangsam undsehr vorsichtigmit eiskaltemEthanol.

8. DieNukleinsäuren(feine, weißeStränge) werdenin die obere(Ethanol-)Schichtausfällen.

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ISO

LA

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DN

AIsolation von DNAaus Zwiebeln★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Dies ist eine Methode, um DNA und RNA aus

pflanzlichem Gewebe zu isolieren. Das Gewebe

wird zunächst mechanisch aufgelöst. Ein

Haushaltsreiniger zerstört sowohl die

Zellmembranen als auch die Kernmembranen.

Die Zellreste werden herausgefiltert; die

Nukleinsäuren und lösliche Proteine bleiben

zurück. Ein Enzym greift die Proteine an, und

dann fällt die Nukleinsäure in eiskaltem Ethanol

aus.

Ziel ● Isolierung der Nukleinsäuren aus

Zwiebelgewebe.Anmerkung: Auf diesem Wege präparierteNukleinsäuren sind nicht rein. Die eigentliche Absicht derbeschriebenen Methode ist die Demonstration derGrundprinzipien zur Extraktion von DNA aus Gewebe.

VorbereitungDer Ethanol muß eiskalt sein. Er solltewenigstens 24 Stunden vor Versuchsbeginn ineiner Kunststofflasche in einen Gefrierergestellt worden sein.

ZeitbedarfDer Versuch dauert 35 Minuten (einschließlichder Bebrütungszeit von 15 Minuten).

Geräte und MaterialienBedarf für jeden Schüler oder jede Arbeitsgruppe● Mixer (Haushaltsmixer)● scharfes Kartoffelschälmesser, Schneide-

unterlage● Wasserbad, eingestellt auf 60 ºC● Krug mit Eis● 2 Bechergläser, 250 ml● Kaffeefilterpapier (kein Laborfilterpapier)● mittelgroße Zwiebel● Geschirrspülmittel, 10 ml (kein

Konzentrat)● Kochsalz, 3 g● destilliertes Wasser, 100 ml● 10 ml-Einwegspritze zum Abmessen der

Flüssigkeiten● Reagenzglas● Glasstab● Protease-Enzyme, z.B. Neutrase (Novo

Nordisk) 2-3 Tropfen● eiskaltes Ethanol, ca. 6 ml (vergälltes

Ethanol bzw. Brennspiritus sind geeignet)

Durchführung

1. Dem Spülmittel wird das Kochsalzzugefügt.

2. Die Zwiebel wird kleingewürfelt, abernicht kleiner als 10 mm x 10 mm

3. Die zerkleinerte Zwiebel wird in die Salz-Spülmittel-Lösung gegeben.

4. Das Becherglas wird für 15 Minuten in dasWasserbad ( 60 ºC) gestellt.

5. Das Becherglas wird zum Abkühlen inEiswasser gestellt und darin für 5 Minutenständig umgerührt.

6. Die Mischung wird in den Mixer gegossenund nicht länger als 5 Sekunden durchgemixt.

7. Die Mischung wird in ein zweitesBecherglas gefiltert. Es muß gewährleistetsein, daß der Schaum an der Oberflächeder Flüssigkeit das Filtrat nichtkontaminiert.

8. 2-3 Tropfen Protease werden zu 6 ml desZwiebelgewebeextrakts in ein Reagenzglasgegeben und sorgfältig gemischt.

9. Eiskalter Ethanol wird sorgfältig amReagenzglas entlang gegossen, um denZwiebelextrakt zu überschichten. DasReagenzglas bleibt einige Minutenungestört stehen.

10. Nukleinsäuren werden in die obere(Ethanol-) Schicht ausfällen.

Erläuterungen und Hinweise1. Die DNA kann mit fuchsinschwefeliger

Säure oder Methylenblaulösung gefärbtwerden.

2. DNA kann ebenfalls aus tierischem Gewebegewonnen werden (z.B. Dorschrogen, Leber,Pankreas von Kalb oder Lamm). Dabeiwerden sanftere Methoden zum Aufbrechendes Gewebes in Form von Mörser undStößel (mit Seesand) eingesetzt, um die DNAnicht zu verkürzen.

SicherheitsvorkehrungenDer Versuch enthält keine besonderen Sicherheitsrisiken,aber das Zwiebelschneiden und die Benutzung des Mixerssollten mit Vorsicht durchgeführt werden.

DanksagungDieser Versuch wurde übernommen aus ASourcebook of Biotechnology Activities von AlisonRasmussen und Robert Matheson (1990), NationalAssociation of Biology Teachers / North CarolinaBiotechnology Center. ISBN: 0 94121209Die vollständige Veröffentlichung ist erhältlich über:NABT, 11250 Roger Bacon Drive # 19, Reston,Virginia 22090, USA


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9

DNA-Fäden in deroberen (Alkohol-)Schicht

DNA löst sich nicht inAlkohol . Deshalb fällt sieaus der Lösungin die obere Schicht aus.

Gieße die gleiche MengeNicht länger als Filtriere die gesamte Gib 2-3 Tropfen des eiskaltes Ethanol vor-5 Sekunden mixen. Mischung. Protease-Enzyms zu sichtig auf die Ober-

6 ml des Zwiebel- fläche des Zwiebel-extrakts. extrakts.

Der Mixer hilft beim Dies trennt das Zell- Die Protease zerstört Das Ethanol* MUSS eis-Öffnen der Zwiebel- wandmaterial von Proteine in der kalt sein. Er sollte überzellen - zu langes der DNA und den Pro- Lösung. Eine kleine Nacht im GefrierschrankMixen beschädigt teinen, die jetzt in Menge ist aus- stehen.die DNA. Lösung vorliegen. reichend. * Der Einsatz von

Brennspiritus ist möglich.

10 ml Geschirrspülmittel Gib die zerkleinerte Stelle das Becher- Kühle die Mischung für3 g Kochsalz Zwiebel in die salzige glas 15 min bei einige Minuten durch100 ml Wasser Spülmittellösung. 60 °C in heißes Stelle das Becherglas1 mittelgr. Zwiebel Wasser. in ein Gefäß mit Eis-

wasser.Gib Kochsalz in das Die Spülmittellösung Hitze beschleunigtSpülmittel. Fülle mit löst die Zellmem- den Prozeß ... ...aber zu lange Hitzeein-Wasser auf 100 ml branen auf und ent- läßt die DNAsen un- wirkung zerstört auch dieauf. Rühre gut um, läßt DNA aus dem wirksam werden, DNA .. deshalb ist ein Eis-damit sich das Salz Nukleus jeder Zelle. die die DNA zer- bad nötig.auflöst. stören könnten.

Isolation vonDNAaus Zwiebeln

DNA+RNA

KOCH

SALZ

Geschirrspül-mittel

EIS

eiskaltesEthanol

Kaffeefilter

Protease

sorgfältigmischen

....

...


Amylaseproduktiondurch Boden-mikroorganismen

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ISM

EN

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Stärke wird aus Glucosebausteinen gebildet, die

entweder ein lineares Polymer namens Amylase

oder ein verzweigtes Polymer namens Amylo-

pektin bilden. Das Aufbrechen dieser Polymere

gelingt durch zellfremde Amylasen, die von

vielen Organismen, einschließlich der Bakterien

und Pilze, gebildet werden. Zahlreiche

Mikroorganismen wurden untersucht, um

diejenigen zu finden, die für die kommerzielle

Enzymproduktion geeignet sind. In dem

vorliegenden Versuch wurden bodenlebende

Mikro-organismen auf ihre Enzymproduktion

außerhalb der Zelle untersucht.

Stellen derEnzymtätigkeitauf Amylopektin

Glucose-Bausteine in Amylase und Amylopektinwerden durch α-1,4- Bindungen geschaffen,Verzweigungen sind diesen Ketten durch α-1,6-Verbindungen angefügt. Die wichtigstenkommerziell erhältlichen Amylasen sind:

α-Amylase - hydrolisiert α-1,4- Verbindungenausschließlich in den Ketten, so daß kürzereKetten (Dextrine) entstehen. Kommerziellgewonnen aus Bakterien (z.B. Bacillus spp.).β-Amylase - hydrolisiert α-1,4- Verbindungen inGlucose-Polymeren, die die nachfolgendenMaltose-Bausteine von den Enden der Kettenabspalten. Sie können die α-1,6- Verbindungennicht überwinden. Kommerziell gewonnen ausGerste und Malz.Amyloglucosidase - bricht α-1,4- Verbindungenauf, spaltet dabei Glucose-Bausteine von denKettenenden und hydrolisiert ebenfalls α-1,6-Verbindungen, allerdings nur langsam.Kommerziell gewonnen aus den PilzenAspergillus spp. und Rhizopus oryzae.Pullulanase - hydrolisiert α-1,6- Verbindungen.Kommerziell gewonnen aus den BakterienBacillus acidopullulyticus und Klebsiell.

Ziel● Screenen natürlich auftretender

Mikroorganismen zur Amylaseproduktion.

Erforderliche VorkenntnisseDie Schüler sollten Grundkenntnissemikrobiologischer Arbeitsweisen, einschließlichsteriler Arbeitstechniken haben. Die Kenntnisder Stärke-Jod-Reaktion ist wünschenswert.

VorbereitungJod-Kalium-Jodid-(JKJ)-Lösung nach Lugolsollte Spätestens am Vortag vorbereitet werden,wenn keine gebrauchsfertige Lösung vorhanderist. Die Jodhristalle benötigen einige zeit biszur Auflösung.Stärke-Nähragar und Flaschen mit sterilemWasser sollten vor der Unterrichtsstunde vor-bereitet werden. Im Idealfall sollten die Boden-proben vor dem Gebrauch luftgetrocknet werden.Sterile Wattestäbchen. Die Kunststoffstielegekaufter Wattestäbchen schmelzen beim Auto-klavieren. Einige kommerzielle Wattestäbchenkönnten zudem antimikrobiell behandelt sein.Für diesen Versuch wird eine kleine MengeStäbchen selbst angefertigt, indem ein Baum-wollfaden um die Spitze eines Zahnstochersgewickelt wird. Sie werden in einer McCartney-Flasche oder lose in Alufolie eingeschlagen für15 Minuten be 121 ºC autoklaviert.

ZeitbedarfPräparation und Bebrüten der Petrischalen: 45 MinutenErkundung der Ergebnisse, 2-3 Tage später: 15 Minuten

Geräte und MaterialienBedarf für jeden Schüler oder jede Arbeitsgruppe(Eine normale Arbeitsraumausstattung wirdvorausgesetzt)● Sterile Petrischalen mit 15- 20 ml sterilem

Stärke-Nähragar, aus kommerziellemNähragar unter Zugabe von 0,2 %igerlöslicher Stärke hergestellt

● 1 g trockener Boden, 10 cm unter derOberfläche entnommen

● Jod-Kalium-Jodid-Lösung, durch Auflösenvon 1 g Jod und 2 g Kaliumjodid in 300 mldestilliertem Wasser hergestellt

● 15 ml steriles destilliertes Wasser in einerMcCartney-Flasche

● sterile, selbsthergestellte Wattestäbchen(vgl.Vorbereitung, oben)

● wasserfester Filzstift (zum Beschriften derPetrischalen)

Pullulanase

α-Amylase

β-AmylaseAmyloglucosidase(Glucoamylase)

α-1,4-Bindung

α-1,6-Bindung


......

.

den Innenbereich der Glucose-Molekülketten der Stärke ein). HellbrauneBereich (Farbe der Jod-kalium-jodid-lösung)entstehen entlang der Kolonienränder, wenndie Mikroorganismen Stärke abgebaut haben.

SicherheitsvorkehrungenWICHTIG: In Deutschland ist es nicht erlaubt,diesen Versuch so durchzuführen, weil die mitunbestimmten Organismen beimpften Platten nachdem Bebrüten geöffnet werden. Daber solltenKolonien von Bacillus subtilis DSM 402 statt derBodenorganismen benutzt werden. Dieallgemeingültigen Sicherheitsvorkehrungen solltenwährend dieses Versuchs und bei der Entsorgung derKulturen befolgt werden. Es ist nicht ratsam, vonden beimpften Platten Eigenisolate anzufertigen. Jodist giftig und muß mit Vorsicht behandelt werden.

Durchführung1. 1 g trockener Boden wird in 15 ml steriles,

destilliertes Wasser gegeben und zumDurchmischen gut durchgeschüttelt.

2. Beimpfen der Stärke-Nähragar-Platte: Einsteriles Wattestäbchen dient zumAusstreichen der Bodensuspension auf derAgaroberfläche.

3. Die Petrischale wird mit den Initialen, demDatum und der Quelle des Impfgutesbeschriftet.

4. Die umgedrehte, beimpfte Platte wird für 2-3Tage bei 30 ºC bebrütet.

5. Jodlösung wird vorsichtig auf die bebrütetePlatte gegossen, bis die gesamte Oberflächeca. 1 mm hoch bedeckt ist. Die Stellen, andenen noch Stärke vorhanden ist, sindblauschwarz gefärbt (Jodmoleküle dringen in

Amylaseproduktion durchBodenmikroorganismenStärke/

Nähragar

Trockene Erde

SterilesWasser

Bereite eine Petrischale mitsterilem Stärke/ Nähragar vor

Suspendiere 1 g Erdein 15 ml sterilemWasser (verwendean deutschen Schuleneine Flüssigkultur vonBacillus subtilis)

Streiche die Erdsuspension oder eineReinkultur von Bacillus subtilis mit einemsterilen Wattestäbchen auf das Nährmedium

Bebrüte die Platte bei30 ºC für 2- 3 Tage

Überschichte die Platte mitJodlösung um aufzuzeigen,wo Stärke abgebaut wurde

Bebrüte dieumgedrehtenPlatten

Helle Bereicheohne Stärke

....

...


Zellulase-produktion★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Es besteht ein großes Interesse, Zelluloseabfälle

aus der Papierherstellung als Nahrungsvorräte

für Fermentationsprozesse zu nutzen; hierbei

werden preiswerte Starterkulturen in sehr

wertvolle Produkte umgewandelt. Die meisten

kommerziell hergestellten Zellulosen werden

durch die Fermentation flüssiger Zellulosen

durch den Pilz Trichoderma reesei produziert.

Das Bakterium Cellulomonas wächst jedoch

schneller in Petrischalen und seine Produktion

extrazellulärer Zellulasen ist leicht meßbar.

Ziel● Herstellung einer quantitativen

Zellulaseprobe durch Cellulomonas.

VorbereitungFür den Gebrauch im Klassenzimmer solltenKulturen von Cellulomonas uda (DSM 20107) inNährbouillon (z.B. in McCartney-Flaschen)vorbereitet werden. Das sollte zwei oder dreiTage vor Versuchsdurchführung erfolgen. DieKulturen werden bei 25 - 30 ºC bebrütet.CMC-Medium enthält:0,5 g Carboxymethylcellulose (eine löslicheForm der Zellulose); 0,1 g NaNO

3; 0,1 g

K2HPO; 0,1 g KCl; 0,05 g MgSO

4; 0,05 g

Hefeextrakt und 0,1 g Glucose in 100 mlWasser. Das Medium sollte mit 1,7 % Agarangedickt werden.

ZeitbedarfVorbereitung und Bebrüten der Petrischalen:

45 MinutenErkundung der Ergebnisse, 2-3 Tage später:

15 Minuten

Geräte und MaterialienBedarf für jeden Schüler oder jede Arbeitsgruppe(Der Zugang zu einer normalenArbeitsraumausstattung wird vorausgesetzt)

● Schrägkultur von Cellulomonas uda (DSM20107)

● Sterile Petrischalen mit 15 ml des sterilenCMC Mediums (vgl. Vorbereitung, oben)

● Steriles Wasser (in einer McCartney-Flasche)

● Sterile 1 ml-Einwegspritze (ohne Nadel)oder eine Pipettierhilfe und 2 sterile,verschlossene Pipetten

● Becherglas mit 5 % igerHypochloritlösung, z.B. Domestos (Lever)

● Kongo Rot Lösung (aus 1 mg pro mlWasser)

● 1 M Natriumchloridlösung● Ethanol (zum Abflammen des

Korkbohrers)● Korkbohrer, 5 mm Durchmesser● Brutschrank, eingestellt auf 25- 30 ºC● Filzstift zum Beschriften der Petrischalen

Durchführung1. Der Korkbohrer (5 mm Durchmesser)

wird in Alkohol getaucht und der Alkoholabgebrannt.ACHTUNG: Der Bohrer muß währenddieses Vorganges waagerecht gehaltenwerden, damit die Flammen nicht über dieBohrermitte nach oben laufen und dieHand verbrennen kann.

2. Der Deckel einer CMC-Platte wird an einerSeite leicht angehoben und dann mit demBohrer ein Loch in den Agar gestanzt. DerAgarpfropfen wird vom Bohrer entfernt,falls nötig mit einer gebogenen Nadel.

3. Die Arbeitsschritte 1 und 2 werdenwiederholt, um zwei Löcher im Agar zuerhalten.

4. Jeder Ausschnitt wird genau auf derUnterseite der Petrischale beschriftet. Einegeeignete Abkürzung wäre: C (Cellulomonas),W (steriles Wasser, Kontrolle)

5. In das entsprechende Loch werdenentweder 0,2 ml der mikrobiellen Kulturoder des sterilen Wassers gegeben. Es mußjeweils eine sterile Einwegspritze oderPipette benutzt werden. Die benutztenGeräte kommen in ein Becherglas mitDesinfektionsmittel.

6. Die Platten werden bei 25- 30 ºC biszueiner Woche bebrütet. Cellulomonas

produziert bei 30 ºC nach 48 Stunden helleHöfe bis zu einem Durchmesser von 16 mm.

Nach dem Bebrüten ...

7. Die Platten werden mit Kongo-Rot-Lösung für 15 Minuten überschichtet undfür 10-15 Minuten durch die Salzlösungentfärbt. Ungefärbte Bereiche zeigen auf,wo das CMC-Medium zu β-(1,4)-Glucanabgebaut wurde, das sieben oder wenigerGlucose-Reste enthält. Der Durchmesserder hellen Höfe kann gemessen werden,um einen quantitativen Vergleich derzelluloseabbauenden Aktivität zu erhalten.

PR

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E M

IKR

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ISM

EN


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Gib steriles Wasser in das zweite Loch

1. SterilisiereeinenKorkbohrerdurchAbflammenmit Ethanol

ACHTUNG!Ethanol istleicht entflammbar

Baumwollstopfen2. Schneide zwei Pfropfen

aus der Agarplatte(“Bohrlöcher”) und entfernesie3. Beimpfe die

“Bohrlöcher” mitCellulomonasKulturen

4. Bebrüte die Platte 48 hbei 30 ºC

5. Färbe die Platte

Miß den Durchmesser indem Bereich, in demZellulose abgebaut wurde

Sichere die Schaleetwas mit Klebeband

Erläuterungen und Hinweise1. Bodensuspensionen können in die Ausschnitte

der Platten pipettiert werden, um ihremikrobielle Flora bei der Zelluloseherstellungaufzuzeigen.

2. Die gleiche Verfahrensweise kann eingesetztwerden, um die Aktivität kommerziellerZellulosepräparate zu untersuchen.

3. Der Vorgang des Zelluloseabbaus kann übermehrere Tage durch das Ansetzen vonZweitplatten verfolgt werden.

SicherheitsvorkehrungenGrundlegende mikrobiologischeSicherheitsvorkehrungen (Entsorgung derPlatten am Ende des Versuchs) einschließlichkeimfreier Arbeitstechniken müssen währenddes Versuchs beachtet werden.

WICHTIG: Beim Einsatz von Bodenproben alsZellulasehersteller (Erläuterungen und Hinweise,Arbeitsschritt 1) ist in Deutschland das erneuteÖffnen der Platten verboten.

....

...


Antibiotika-produktion★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Viele Mikroorganismen produzieren

Antibiotika - Substanzen, die das Wachstum

ihrer bakteriellen Konkurrenten hemmen

oder sie abtöten. Seit der Entwicklung des

Penicillins in den 40er Jahren (produziert

durch den Pilz Penicillium) waren diese

Substanzen hochgradig erfolgreich in der

Krankheitsbekämpfung. Heutzutage werden

die wichtigsten Antibiotika vom Bakterium

Streptomyces gebildet. Weitere Informationen

über die Wirkungsweise von Antibiotika und

dem Phänomen der Bakterienresistenz sind

dem Begleitmaterial zu entnehmen.

Ziel● Herstellung des Antibiotikums

Streptomycin durch Streptomyces griseus undAufzeigen seiner Wirkungsweise auf dasWachstum einer Vielzahl vonMikroorganismen.

VorkenntnisseUrsprung und Wirkung von Antibiotika, dieEntwicklung und Verbreitung der Resistenzgegen Antibiotika ( vgl. Begleittext).

Unten: Eine drei Tage alte Kultur vonStreptomyces griseus (links). DieTestorganismen sind (von oben nachunten): Candida utilis, Micrococcusluteus, Pseudomonas fluorescens,Bacillus mycoides, Escherichia coli.

VorbereitungLebende Kulturen von Streptomyces griseus werdenbenötigt. Sie müssen 2 - 3 Tage auf Platten mit 15- 20 ml Standardagar gezüchtet werden.

Eine Kultur, mit der diese Platten beimpft werdensollen, muß vorbereitet werden. Dazu wird eineÖse voll Streptomyces aus einer Schrägkultur gelöstund erneut in 1 ml sterilen Nährbouillonsuspendiert, danach i ein Reagenzglas mit 5 mlsteriler Nährbouillon gegeben. Diese Kultur wirdfür 24 Stunden bei 30 ºC bebrütet.

Die Petrischalen werden mit der Übernachtkulturvon Streptomyces griseus durch Ausstreichen auf derPlatte mit einem einzigen vertikalen Strich so weitlinks als möglich auf der Platte beimpft, daß derrechte Teil des Nährmediums steril bleibt.

Die Platten werden bei 30 ºC für 3 -4 Tage bebrütet.

Zusätzlich werden Übernachtkulturen vonTestorganismen (Bacillus mycoides, Candida utilis,Escherichia coli K-12, Micrococcus luteus, Pseu-domonas fluorescens) angelegt.

ZeitbedarfVorbereitung der Medien und Bebrütung:

60 Minuten +Erstbebrütung der Streptomyces Kultur:

24 Stunden, dann weitere 72 - 96 StundenBeimpfen der Platten: 20 MinutenBebrüten: 24 - 72 Stunden

Geräte und MaterialienBedarf für jeden Schüler oder jedeArbeitsgruppe (Der Zugang zur normalenArbeitsraumausstattung wird vorausgesetzt).

● Zugang zu einem Brutschrank, eingestelltauf 30 ºC

● Impföse● sterile Petrischalen mit 15-20 ml Standardagar,

auf die Streptomyces griseus (DSM 40236)ausgestrichen wurde und 48-72 Stundengewachsen ist (vgl. Vorbereitung, oben)

● eine Auswahl Testorganismen* aufSchrägkulturen, wie-Candida utilis (eine Hefe), DSM 02361-Micrococcus luteus (ein Bakterium), DSM 20030-Pseudomonas fluorescens (ein Bakterium),

DSM 50090-Bacillus mycoides (ein Bakterium), DSM 2048-Escherichia coli K-12 (ein Bakterium) DSM 498

* Es muß den regionalen Bestimmungen in Bezug auf denEinsatz dieser Organismen in der Schule Folge geleistet werden.( in Deutschland ist der Einsatz erlaubt).

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......

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Durchführung1. Jeder vorbereitete Streptomyces Nährboden

wird wie folgt mit den Testorganismenbeimpft:a) Eine Impföse wird durch die Flammeeines Bunsenbrenners gezogen und kurzabgekühlt.b) Kulturen der Testorganismen werdenmit der sterilen Impföse entnommen undjeweils einmal horizontal auf dem hellenTeil des Nährmediums ausgestrichen(rechts von Streptomyces). Die Ausstrichemüssen immer im rechten Winkel zu denStreptomyces-Kulturen ausgebracht werdenund bis dicht an sie heranreichen.WICHTIG! Die Streptomyces-Kulturen

dürfen nicht mit der Öse berührt

werden.

c) Die Impföse wird erneut abgeflammt.Die Schritte a) - c) werden für jedeTestkultur wiederholt.

2. Die Platten werden 2 Tage bei 30 ºC für 2Tage bebrütet.

3. Untersuchung der Platten

SicherheitsvorkehrungenDiese Arbeit muß in einem Arbeitsraumdurchgeführt werden. Grundlegendemikrobiologische Sicherheitsvorkehrungensollten während der Arbeit und bei derEntsorgung der Kulturen befolgt werden. Diewährend des Versuchs erzeugteAntibiotikamenge stellt kein Sicherheitsrisikodar.

AnmerkungenStreptomyces griseus erzeugt das Antibiotikum Strepto-mycin, das in das Kulturmedium diffundiert. Strepto-mycin und verwandte Antibiotika stören dieProteinsynthese durch ihre Anbindung an die 30SKomponente der bakteriellen Ribosomen. EinigeOrganismen (Bacillus mycoides, Escherichia coli, Micrococcusluteus) reagieren sensitiv, andere (Pseudomonas fluorescens) sindresistent. Hefen (Candida utilis) werden durch Strepto-mycin nicht angegriffen, da sie Eukaryonten mit eineranderen Ribosomenstruktur sind. Für weitereInformationen steht der begleitende Text zurVerfügung, der die Antibiotikaproduktion undWirkungsweise detailliert beschreibt.

Ein einziger Strichlinks auf der Platte

Nicht dieStreptomycesberühren

Testkulturen

Vorbereitung einerPetrischale mit Streptomycesgriseus 3--4 Tage im voraus.

Sterilisationeiner Impfnadel.

Ausstrich einer derTestkulturen auf derStreptomyces Platte.

Abdichten derPlatte mitKlebeband Beschriften des

Plattenbodens

Wiederholung mit jeder der Testkulturen.Sterilisation der Öse zwischen denAusstrichen.

Bebrüten der umgedrehtenPlatte bei 30 ºC für 2-3 Tage.

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Brotteigherstellen

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Berichte über Brot aus Sauerteig, die bis ins

antike Ägypten ( 4.000 v. Chr.) zurückgehen,

zeigen, daß die Brotherstellung eines der

ältesten biotechnologischen Beispiele

überhaupt ist. Traditionell wird Brot in

Großbritannien aus Weizenmehl, Wasser, Salz

und möglicherweise Fett - abhängig vom

Rezept - hergestellt. Diese Zutaten bilden

einen Teig, in dem Hefe gebunden ist.

Amylasen im feuchten Mehl bilden Stärke zu

Glucose um, die die immobilisierten

Hefezellen ernährt.

Zusätzlich benötigt Hefe eine

Stickstoffquelle. Peptone und Aminosäuren

werden durch eine partielle Hydrolyse der

Mehlproteine (Gluten) zur Verfügung gestellt.

Die anaerobe Atmung der Hefe erzeugt

Kohlenstoffdioxid und Alkohol.

Gluten trägt zur Elastizität und Formbarkeit

des Teiges bei und sichert den Einschluß des

Kohlenstoffdioxids, der die Luftblasen im

Teig vergrößert, damit der Teig “gehen”

kann.

Ziel● Die vorgeschlagene Verfahrensweise bietet

die Möglichkeit, die Wirkungsweiseunterschiedlicher Rezeptvarianten zuuntersuchen, die entweder die Mehlproteineoder die Enzymtätigkeit modifizieren.

ZeitbedarfAbhängig von den Bedingungen (Wärme etc.) kannder Versuch in 50 Minuten abgeschlossen werden.

Geräte und MaterialienFür jedes Brot

● Trockenhefe, 1 g● Weizenmehl (Type 405), 75 g● Wasser, 50 ml● weitere Zutaten nach Wunsch, z.B.

Ascorbinsäure, α-Amylase, Kaliumbromat(vgl. Erläuterungen und Hinweise, unten)

● kleine Bechergläser zum Teigmischen● kräftige Glasstäbe zum Umrühren● 2 Meßzylinder, 100 ml● Stoppuhr

Durchführung1. Die Trockenhefe wird in Wasser aktiviert,

Mehl zugefügt und gut durchgemischt.2. Der Teig wird wurstförmig gerollt und in

einen Meßzylinder gegeben.3. Die Teighöhe wird alle 10 Minuten über

einen Zeitraum von 1 Stunde gemessen.

Erläuterungen und Hinweise1. Welchen Effekt zeigen unterschiedliche

Formen von Trockenhefe auf das Ausmaßdes “Gehens” (z.B. gewöhnlicheTrockenhefe im Vergleich zu der neueren‘Einrührhefe’).

2. Welche Unterschiede beim “Gehen” desTeiges ergeben sich aus unterschiedlichenMehlsorten (z.B. Roggen-, Weizen- undVollkornmehl). Weizenmehlsortenenthalten viel Gluten, aber wenig α-Amylase. Vollkornmehl weist viel α-Amylase auf.

3. Welchen Effekt hat der MehlverbessererAscorbinsäure (Vitamin C) auf den Graddes “Gehens”? Ascorbinsäure reagiert mitEnzymen im Teig und begrenzt dieSchwefelwasserstoffbrückenbildungzwischen den Glutenproteinen. (1 g kanndem Brotteigrezept beigefügt werden ).

4. Welchen Effekt hat die Beigabe von α-Amylase auf den Grad des “Gehens”? Wiekönnen beobachtete Unterschiede erklärtwerden?

5. Der Mehlverbesserer Kaliumbromatermöglicht die Schwefelwasser-stoffbrückenbildung angrenzenderGlutenproteine, so daß elastischere, besser“gehende” Teige entstehen. Allerdingswürde ein zu starkes Aufgehen den Teigschwächen. Teige, die mit bzw. ohne dieseZutat hergestellt wurden, könnenverglichen werden.

6. Salz hemmt die Wirkung von Proteasenund verhindert so die Veränderung vonGluten zu einer klebrigen Masse, die keinKohlenstoffdioxid speichern kann. EinÜbermaß an Salz erzeugt starkeIonenbindungen mit den seitlichen Kettender Proteinmoleküle, die sie wenigerdehnbar machen und zu festem Teigführen. Zuviel Salz hemmt zudem das“Gehen” der Hefe. Die optimaleSalzmenge für den Teig könnte bestimmtwerden.


......

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GRUNDREZEPT BROTTEIG

1. 1 g Trockenhefe in 50 ml Wassergeben

2. Hefe quellen lassen und 75 gMehl zufügen

3. Gut mischen

4. Teig in einen Meßbecher geben5. Teigvolumen in 10-Minuten-

Abständen messen.

FragenInwiefern gibt das Teigvolumen dieWachstumsrate der Hefe wieder? Wiekönnten die Überlegungen überprüftwerden?

Welche anderen Faktoren (neben derHefetätigkeit) könnten dasTeigvolumen beeinflussen?

Literaturangabe

On food and cooking. The science and lore of the

kitchen von Harold McGee (1991) HarperCollins Publishers. ISBN: 0 00412657 2

Pritchard, P.E. (1992) Studies on the bread-improving mechanism of fungal alpha-amylaseJournal of Biological Education 26, (1) 12-18

Trockenhefe

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EN Immobilisierte

Hefezellen★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★

Photograph courtesy D

r Duncan C

asson

Gewöhnliche Backhefe, Saccharomyces

cerevisiae ist nicht in der Lage, den Zucker

Lactose zu fermentieren. Das Enzym β-

Galactosidase spaltet Lactose zu Glucose

und Galactose. Hefe, die mit diesem

Enzym immobilisiert ist, kann in einem

Medium, das Lactose enthält, gedeihen.

Von den beiden Zuckern, die durch die

Enzymtätigkeit entstehen, wird bevorzugt

Glucose benutzt. Wenn die Vorräte dieses

Zuckers verbraucht sind, verändert die

Hefe ihren Stoffwechsel und verwendet das

andere Spaltungsprodukt der Lactose,

Galactose. Die Hefetätigkeit läßt sich

schnell durch das Messen der bei der

Fermentation gebildeteten

Kohlenstoffdioxidmenge überprüfen.

Ziel● Einführung in die quantitative

Untersuchung einer Fermentation.

VorbereitungNatriumalginat ist schwer wasserlöslich. Eswird in heißem Wasser unter Umrührenaufgelöst. Daher muß Natriumalginat im voraushergestellt werden. Natriumalginat sollte vorlängerer Aufbewahrung autoklaviert werden.Wichtig: Destilliertes oder deionisiertes Wasser sollte füralle Lösungen verwendet werden, da Calciumionen inLeitungswasser das Alginat zum Absetzen bringen.

ZeitbedarfImmobilisierte Hefezellen können in 10-15Minuten präpariert werden. Die Fermentationkann bis zu einer Woche dauern.


● 4%ige Natriumalginatlösung, 10-15 ml● 1,5%ige Calciumchloridlösung, 100 ml● 10 ml Einwegspritze ohne Nadel● Teesieb● 2 Bechergläser, 200 ml● 2 Erlenmeyerkolben, 250 ml● 2 doppelt durchbohrte Stopfen● 2 große Bechergläser, z.B. 500 ml● 2 Meßbecher, 100 ml

● chemische Sterilisationslösung, z.B.Domestos oder Sagrotan

● 13%ige Natriumchloridlösung, ca. 1 l(normale Kochsalzlösung ist ausreichend)

● 100 ml Medium, mit 2 g Glucose, 1 gHefeextrakt und 1 g Pepton

● 100 ml Medium mit 2 g Lactose, 1 gHefeextrakt und 1 g Pepton

● β-Galactosidase-Enzym, z.B. Lactozym

(Novo Nordisk), 2 ml● Bäckerhefe oder Trockenhefe

DurchführungDie immobilisierten Enzyme und Hefepellets

werden wie folgt präpariert:

1. Die Trockenhefe wird mit 25 mldestilliertem Wasser in einem kleinenBecherglas aufgelöst und für 10 Minutenbei Raumtemperatur quellen gelassen

2. Im anderen Becherglas werdenNatriumalginat und β-Galactosidasegemischt und in 10 ml der Hefelösungeingerührt.

3. Die Hefe-Enzym-Alginat-Mischung wirdin der Einwegspritze aufgezogen undtropfenweise der Calciumchloridlösung imzweiten großen Becherglas zugefügt.

Immobilisierte Hefezellen in einer Matrixaus Calciumalginat


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Ca2+

4. Die immobilisierten Enzym-Hefe-Kugelnbleiben zum Erhärten für 10 Minuten inder Calciumchloridlösung.

5. Die Kugeln werden mit einem Teesieb ausder Lösung gefiltert und sorgfältig mitLeitungswasser abgespült.

Die Kugeln können in sterilem Wasser bis zu 3Tage vor Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrtwerden

Einrichtung des Fermatationsgefäßes:

1. Die Kolben werden mit Sagrotan oderDomestos sterilisiert und danach mit mitWasser ausgespült.

2. Steriles Nährmedium wird in die Kolbengefüllt. Das Glucosemedium wird in deneinen (als Kontrolle) und das Lactose-medium in den anderen gefüllt.

3. Die gleiche Anzahl Kugeln wird in jedenKolben gegeben.

4. Die Kolben werden mit dem doppeltdurchbohrten Stopfen verschlossen.

5. Die Kolben werden auf 21-25 ºC gehalten.

Das Gas, das sich über der 13%igenNatriumchloridlösung bildet, wirdaufgefangen ( Kohlenstoffdioxid ist nichtin dieser Lösung nicht löslich) und inregelmäßigen Abständen gemessen.

6. Es wird eine Grafik erstellt, die dieGasmenge im Verhältnis zur Zeit darstellt.

Erläuterungen und Hinweise1. Verschiedene Hefearten, z.B. Bäckerhefe

oder “Weinhefe” können eingesetztwerden.

2. Die Konzentration der β-Galactosidase,die Bebrütungszeit oder andere Variablenkönnen verändert werden.

SicherheitsvorkehrungenDie Bildung von Gas in Glasgefäßen könntegefährlich sein. Es sollte sichergestellt werden,daß die Fermentationsgefäße entsprechendgeöffnet sind. Chemische Wirkstoffe zurSterilisation sollten vorsichtig eingesetztwerden, und alle Gebrauchsanweisungen seitensder Hersteller müssen befolgt werden.

Die üblichste Technik zum Immobilisieren vonZellen ist der Einschluß in Calciumalginat. Sieist aufgrund ihrer sanften Bedingungenbesonders für lebende Zellen geeignet. Diesevielseitige Methode wird angewandt zurImmobilisierung lebender oder toter Zellen inBioreaktoren, zum Verschmelzen vonpflanzlichen Protoplasten und Pflanzenembryonen(‘künstliche Samen’), zur Mikrovermehrung, zurImmobilisierung von Hybridzellen für dieProduktion monoklonaler Antikörper und zumEinschluß von Enzymen und Arzneimitteln.(siehe Auflistung, nächste Seite).

Die zu verschmelzenden Zellen oder Enzymewerden zunächst mit einer Natriumalginatlösungvermischt. Diese Mischung wird dann in eineLösung mit mehrwertigen Kationen (üblicherweise Ca2+ ) getropft. Die Tröpfchen bilden beimHineinfallen automatisch Kügelchen, die dieZellen in einem dreidimensionalen Gitter ausionisch kreuzweise verbundenem Alginateinbinden (siehe Darstellung, oben).

Weitere Informationen in Smidrod, O. undSkjak-Brak, G. (1990) Alginate as an immobili-zation matrix for cells. Trends in Biotechnology 8(3) 71-78.

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BakterienErwinia rhapontice IsomaltulosePseudomonas denitrificans TrinkwasserreinigungZymomonas mobilis Ethanol

CyanobakterienAnabena sp. Ammoniak

PilzeKluyveromyces bulgaricus Hydrolyse von LactoseSaccharomyces cerevisiae EthanolSaccharomyces bajanus Champagnerherstellung

®

The University of Reading, United Kingdom

NATIONAL CENTRE FOR BIOTECHNOLOGY EDUCATIO

N

Enzymes for Schools and Colleges

Novo Nordisk Lactozymβ-galactosidase from Kluyveromyces lactis

100 ml

Store at 4°C. Do not freeze.

Saccharomyces cerevisiaeFermentation results

Trockenhefe

Kohlendioxid

13%igeNatrium-chloridlosung

Lactoselösung,unter Zusatz vonPepton undHefeextrakt

Hefe, Lactaseenzym undNatriumalginatlösung

GrafischeDarstellung(Gasvolumen imVerhältnis zur Zeit)

TropfenweisesHinzufügen

Abspülen mitWasser

Enzyme in den Tropfenspalten Lactose in Glucoseund Galactose

Hefezellen wachsen mit Hilfe dervon Enzymen gebildeten Zuckerunter Bildung von Kohlenstoffdioxidund Alkohol.

Beispiele für den Einsatz alginatimmobilisierter Zellen (nach Smidsrød und Skjak-Bræk, 1990)

AlgenBotryococcus braunii Kohlenwasserstoffe

PflanzenzellenChatharanthus roseus Alkaloide zur KrebstherapieDiverse Pflanzen Künstliche SamenPflanzl. Protoplasten Handhabung von Zellen,

MikroskopieSäugetierzellen

Hybride Monoklonale AntikörperLangerhans’sche Inseln Insulin /ImplantationFibroblasten oder Lymphzellen Interferone (α oder β)

Zellen Produkte/ Einsatzorte Zellen Produkte/ Einsatzorte


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Die mikrobielleEnergiezelle

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Stromerzeugende Mikroorganismen waren

jahrzehntelang eine biologische Kuriosität.

Heutzutage sehen Forscher ihren Einsatz in

Uhren und Kameras, als Energiequelle in der

3. Welt und in Bioreaktoren zur Umwandlung

von Industrieabfällen in Elektrizität voraus.

Die hier beschriebene mikrobielle Energie-

zelle erzeugt elektrischen Strom in geringer

Menge durch die Elektronenabgabe aus der

Atmungskette von Hefe. Sie kann zur

Untersuchung der Atmung auf neuartige und

anregende Weise dienen. Weitere

Informationen finden sich in BIO/technology

Education, B and 1, Nummer 4, Seite 163-168.

Ziel● Motivierende Einführung in die

Untersuchung der Atmung● Mögliche Untersuchung einiger

Einflußfaktoren auf die mikrobielleAtmung

● Bedeutung des Einsatzes von organischemAbfall zur Elektrizitätserzeugung

VorbereitungLösungen aus Reagenzien sollten vorbereitetwerden. Vor Gebrauch der Kationenaustausch-membran sollte sie 24 Stunden in destilliertemWasser eingeweicht werden. Die Trockenhefeist zu aktivieren, wenn die Energiezellezusammengebaut ist.

ZeitbedarfDer Aufbau (bis zur Stromerzeugung) dauertca. 30 Minuten.

Geräte und MaterialienBedarf für jeden Schüler oder jede Arbeitsgruppe● Perspex (ICI) Energiezelle, aus 4 mm

dickem Material ausgeschnitten● Neoprendichtungen, 2● Kationenaustauschmembran, passend auf

den Zwischenraum der Kammernzugeschnitten

● Elektroden aus Kohlefaser, passendzugeschnitten

● Haushaltstuch (Gewebetuch), zugeschnittenauf das Innenmaß der Zelle, 2 Stück

● 10 ml Einwegspritze, 2, zum Verteilen derFlüssigkeiten

● Petrischalenboden oder-deckel alsUnterlage der Energiezelle

● Elektrische Anschlüsse mitKrokodilklemmen, 2

Zusammenbau einermikrobiellen Energiezelle(die genauen Maße sindunwichtig: diese ist ca.55 mm x 55 mm)

Loch durch dasdie Kammergefüllt wird

Neopren-dichtung

Endstück derKohlefaserelektrode

Kationenaustausch-membran

Kammer, mitAquariumkitt (Silikon) andie Endplatte geklebt

Gewebetücher schützt dieElektrode vor Berühren derMembran

Die Energiezelle isterhaltich beimNCBEThe University of ReadingPOBox 228Reading RG6 6AJ, UK

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● 0-5 V Voltmeter oder Spannungsmesserund / oder Schwachstrommotor

● Scheren

Alle nachfolgenden Lösungen sollten nicht in Wasser,sondern in 0.1 M Phosphatpuffer hergestellt werden● Trockenhefe, mit 0.1 M Phosphatpuffer

angedickt (kein Zufügen vonGlucoselösung ohne vorheriges Aktivierender Hefe in der Pufferlösung)

● 10 mM Methylenblaulösung, 5 ml 1 MGlucoselösung, 5 ml

● 0.02 Kaliumhexacyanoferrat III- Lösung,10 ml (auch rotes Blutlaugensalz genannt)

Herstellung von 0.1 M Phosphatpuffer, pH 7.0Auflösen von 4.08 g Na2HPO4 und 3.29 gNaH2PO4 in 500 ml destilliertem Wasser.

Durchführung1. Zwei Kohlefaserelektroden werden

entsprechend der Abbildungzugeschnitten.

2. Zwei in die Energiezelle passendeGewebetücher werden zugeschnitten.

3. Die Energiezelle wird entsprechend derAbbildung zusammengebaut.

4. Die Energiezelle wird in einenPetrischalenboden oderdeckel gestellt, umevtl. heraustropfende Flüssigkeitaufzufangen.

5. Die Hefeverbindung, Glucose- undMethylenblaulösung werden gemischt undin eine Kammer der Energiezelle pipettiert(Einwegspritze).

6. Kaliumhexcyanoferrat (III)-Lösung wirdin die andere Kammer pipettiert.

7. Über die Krokodilklemmen wird einVoltmeter oder Spannungsmesser an dieElektrodenendstücke angeschlossen.Energiezellen dieser Bauart erzeugen

V

4 H+

4 4

Fe(CN)64-

3-Fe(CN)6

Wie dieEnergiezellefunktioniert

Anode Kathode

ZeigtElektronen

GlucoseMethylenblau

(reduziert) Kaliumhexa-cyanoferrat

Methylenblau(oxidiert)Kohlendioxid

ZusammengebauteEnergiezelleHefezellen Atmungsketze

gewöhnlich zwischen 0,4-0,6 V. Stromflußsollte sofort meßbar sein. Zeigt das Meßgerät 0,müssen die Anschlüsse überprüft und sichergestelltwerden, daß die Kohlefaserelektroden dieKationenaustauschmembrane nicht berühren.

Erläuterungen und Hinweise1. Mehrere Energiezellen können

aneinandergeschlossen werden, um einehöhere Spannung zu erzeugen. EineVergrößerung der Zelle (oder desElektrodenbereichs) erhöht dieStrommenge (nicht aber die Spannung).

2. Unterschiedliche Mittler und / oderHefearten wie Bäckerhefe oder Weinhefekönnen eingesetzt werden. Anmerkung: AusSicherheits gründen wird der Einsatz andererMikroorganismen nicht empfohlen.

3. Die Wirkung von Wärme auf dieWirkungsweise der Energiezelle kannuntersucht werden. (Es wird an dieentsprechenden ‘Kontrollen’ erinnert, diebei derartigen Vergleichen notwendigwerden).

SicherheitsvorkehrungenKaliumhexacyanoferrat (III) istgiftig. Bei seiner Benutzungsollte eine Schutzbrille getragenwerden. Bei Kontakt mit denAugen müssen die Augen

ausgespült und ein Arzt aufgesucht werden.Wenn Kaliumhexacyanoferrat verschlucktwurde, muß viel Wasser getrunken und ein Arztaufgesucht werden. Die regionalenBestimmungen zur Entsorgung benutzterLösungen sollten befolgt werden.

DanksagungDie mikrobielle Energiezelle wurde von Dr. Peter Bennettoam King’s College, London, entwickelt.Bestellanschrift s. Abbildung s. 25


......

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Es gibt viele natürliche Methoden des

Gentransfers zwischen Bakterien. Sie

wurden wahrscheinlich entwickelt, um den

Organismen zu ermöglichen, sich den

schnell wechselnden Umweltbedingungen

anzupassen. In der Regel sind Gene mit der

größten Mobilität auf den Plasmiden

lokalisiert. Plasmide sind zusätzliche

DNA-Ringe, die sich unabhängig vom

Bakterienchromosom verdoppeln. Sie

enthalten eine kleine Anzahl von Genen,

die auf ihren Träger u.a. die Fähigkeit

übertragen, schädliche Substanzen aus der

Umwelt - wie Schwermetalle oder

Antibiotika - abzubauen.

NatürlicherGentransferdurch bakterielleKonjugation

Drei verschiedene Arten des natürlichen

Gentransfers sind bekannt:

Transformation ist die Aufnahme freier

DNA aus der Zellumgebung.

Transduktion ist das Wandern der DNA

unter Mithilfe eines Bakteriophagen von

einer Zelle zur anderen.

Konjugation ist der Transfer spezialisierter

‘F-Plasmide’ durch einen engen

Verbindungsschlauch (Sex pilus), der zwei

Bakterienzellen verbindet. (s. Abb. 1)

Alle diese Mechanismen (besonders die

Transformation) werden von Gentechnikern

zur Einschleusung ausgewählter Gene in

Bakterien benutzt. Der folgende Versuch

untersucht die Konjugation zwischen zwei

natürlich auftretenden Bakterienstämmen.

Anmerkung: Der Versuch beruht auf natürlichvorkommenden Bakterien, Plasmiden und Vorgängen undist deshalb keine ‘Gentechnik’.

Abbildung 1: Konjugation und Transfer von F-Plasmiden zwischen

Spender

1. Intakte und nachgebildeteF-Plasmide

Plasmideenthalten Genedie Proteinedes Sex pilus

Sexpilus

Bakterien-chromosom

2. Ein DNA-Einzelstrangwandert durch denSex pilus in denEmpfänger

F-Plasmid

Empfänger

3. Synthetisierte,komplementäre DNA

....

...


F-PlasmideDie sogenannten ‘F-Plasmide’ (F steht für

fruchtbar, fertil) enthalten Gene, die den

Transfer einer Plasmidkopie zwischen einer

Spender- und einer Empfängerzelle

ermöglichen (anders ausgedrückt:

bakterielle Konjugation).

F-Plasmide können ebenfalls andere Gene

beinhalten. In dem hier beschriebenen

Versuch enthält der Spender z.B. ein

Plasmid namens F Lac. Es heißt so, weil es

seinen bakteriellen Wirt befähigt, Lactose

umzuwandeln. (Das Bakterium gehört

deshalb zu einem Lac+ Stamm . Im

Gegensatz dazu ist der Empfängerstamm

(ohne Plasmid) nicht in der Lage, Lactose

umzuwandeln. (ein Lac- Stamm).

Auf Nährböden mit MacConkey-Agar

können diese verschiedenen Stämme am

Erscheinungsbild unterschieden werden:

der Spenderstamm bildet rote Kolonien,

der Empfängerstamm weiße (s. Abb. 2).

Beim Mischen von Spender und

Empfängerstamm werden F-Lac-Plasmide

vom Spender zum Empfänger übertragen.

Auf diese Weise erwirbt der Empfänger die

Fähigkeit zur Umwandlung von Lactose.

Ein genetischer ‘Trick’ befähigt den

Abbildung 2: Erscheinungsbild der Spender-und Empfängerstämme auf MacConkey-Agar

SpenderEscherichia coli

Lac+ StammEmpfänger

Escherichia coliLac- Stamm

Lac+GeneaufPlasmid

kleine weißeKolonien

roteKolonien

Spender, den Empfänger und

transkonjugante Stämme zu erkennen. Es

wird ein Empfängerstamm mit einem

Chromosomen-Gen ausgewählt, das seine

Unempfindlichkeit gegenüber dem

Antibiotikum Streptomycin abgibt. Der

Spenderstamm besitzt dieses Gen nicht,

beinhaltet aber Streptomycin. Daher

können der Empfängerstamm und Trans-

konjuganten an ihrer Fähigkeit identifiziert

werden, auf einem streptomycinhaltigen

Medium zu wachsen (Abb. 3).

EmpfängerEscherichia coliK-12 CSH 36

SpenderEscherichia coli

K-12 L17Lac+Gene auf

Plasmid

StreptomycinresistentesGen auf dem Chromosom

Lac+Gene aufPlasmid

StreptomycinresistentesGen auf dem Chromosom

Kleine weißeKolonien

KeineKolonien

RoteKolonien

Transkonjugant

Abbildung 3:Unterscheidung vonSpender-, Empfänger-und Transkonjugant-enstämmen aufMacConkey-Agar, derstreptomycinhaltig ist


......

.

Ziel● Motivierende Einführung in bakterielle

Genetik● Diskussion von Fragen, die sich aus dem

Gentransfer (z.B. Ausbreitung derAntibiotikaresistenz) und der ‘Risiko-einschätzung’ in Bezug auf die Gen-technologie ergeben.

VorbereitungFolgende Materialien sollten vorbereitet undsterilisiert werden:● 3 kleine (z.B. 100 ml) Erlenmeyerkolben

mit jeweils 10 ml sterilem Nährbouillon● steriler MacConkey-Agar unter Zusatz von

Streptomycinsulfat (200 mg pro ml). Nachdem Abkühlen des Agars auf 50 ºC (Hand-rückentest!) sollte er auf sterilePetrischalen verteilt werden (ca. 15-20 mlpro Schale).

● Die benutzten Kulturen sind:Spenderstamm: Escherichia coli K-12CSH36 (DSM Nummer 6253)Empfängerstamm: Escherichia coli K-12L17 (DSM Nummer 6254)

Diese natürlich vorkommenden Stämme werden vonder DSMZ (Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH inBraunschweig) bezogen. Beide Stämme werdengefriergetrocknet in Ampullen geliefert. DieAmpullen müssen auf richtige Weise geöffnetwerden um sicherzustellen, daß ihre Inhalte nichtkontaminiert sind und der Benutzer keinen unnötigenRisiken ausgesetzt wird. (vgl. begleitendeAnleitungen). Der Spenderstamm läßt sich schwerauf einer Schrägkultur halten; daher sollte eine frischaufbereitete Kultur verwendet werden.

Übernachtkulturen des Spenders solltenfolgendermaßen vorbereitet werden:1. Ein Kolben mit sterilem Nährbouillon

wird mit dem Spenderstamm ( beschriftetmit ‘Spender’), ein anderer mit

dem Empfängerstamm(beschriftet mit ‘Empfänger’)beimpft.

2. Beide Kolbenwerden über Nachtbei 37 ºC bebrütet -vorzugsweise ineinem Wasserbadmit Laborrührer.

“Paarung” beider Kulturen:

1. Mit einer sterilen Pipette werden 0,8 ml desSpenderstamms steril einem dritten Erlen-meyerkolben mit 10 ml des sterilen Nähr-bouillon beigefügt.

2. Mit einer sterilen Pipette werden 0,2 mldes Empfängerstamms steril demselbenErlenmeyerkolben beigefügt.

3. Der Kolben wird entsprechend beschriftetund bei 30 ºC für 16- 24 Stunden bebrütet.Anmerkung: Der Kolben muß nicht unbedingtaber darf auch während der Inkubation nurSEHR SANFT geschüttelt werden - heftigeBewegungen zerstören den Pilus, der dieKonjuganten verbindet.

Sterile Wattestäbchen werden vorbereitet,indem etwas Baumwolle um die Spitze einesZahnstochers gewickelt wird. Sie werden ineiner McCartney-Flasche oder leicht in Alufoliegewickelt bei 121 ºC für 15 Minutenautoklaviert.

ZeitbedarfVorbereitung der Medien: 60 MinutenErstinkubation: 48 StundenBeimpfen der Nährböden: 15 MinutenInkubation: 24 StundenBetrachten der Ergebnisse: 20 Minuten

Geräte und MaterialienBedarf für jeden Schüler oder jede Arbeitsgruppe(Der Zugang zu einer normalenArbeitsraumausstattung wird vorausgesetzt)

● Zugang zu einem Brutschrank, eingestelltauf 30 ºC

● sterile Petrischalen mit 15-20 mlMacConkeyAgar und beigefügtemStreptomycin

● Folgende Kulturen, die sich zuvor inNährbouillon gebildet haben:- Spenderstamm- Empfängerstamm- Gemisch der sich “paarenden” Spender-und Empfängerstämme

● 3 sterile, selbstangefertigte Wattestäbchen● kleine Bechergläser mit

Desinfektionslösung, z.B. 3% Domestos

(Lever) für die Ablage benutzterWattestäbchen

● Wasserfester Filzstift (zur Beschriftung derPetrischalen)

Spender

Empfänger

....

...


Durchführung1. Eine Streptomycin-MacConkey-Agarplatte

wird auf der Unterseite mit dem Filzstift indrei gleiche Abschnitte eingeteilt

2. In die Mitte eines jeden Abschnittes wirdein Kreis gezeichnet (ca. 10 mm Durch-messer) und beschriftet: S (Spender), E(Empfänger) und M (Mischung).

3. Jeder gekennzeichnete Bereich wird mitdem entsprechenden Bakterienstammbeimpft. Es muß unbedingt jeweils einneues Wattestäbchen für jeden Stammbenutzt werden. Die Stäbchen werden inder Desinfektionslösung entsorgt.

4. Die Platten bleiben einige Minuten stehen,bis keine Flüssigkeit mehr auf dem Nähr-boden zu sehen ist. Die umgedrehtenPlatten werden bei 30 ºC für ein bis zweiTage bebrütet.

Erläuterungen und HinweiseVerschiedene quantitative Abwandlungen diesesVersuchs sind durchführbar, z.B.:1. Durch Verdünnung der Spender- und

Empfängerkulturen mit steriler Ringer-oder 0,001 mol MgSO

4 -Lösung kann das

optimale Verhältnis von Spender undEmpfänger bestimmt werden.

2. Es kann die optimale “Paarungszeit” fürdie Konjuganten ermittelt werden.

SicherheitsvorkehrungenDer Versuch muß in einem Arbeitsraumdurchgeführt werden. Die grundlegendenSicherheitsvorkehrungen (einschließlich sterilerArbeitstechniken) beider Versuchsdurch-führung und Entsorgung der Kulturen sollteneingehalten werden.

DanksagungDieser Versuch ist die vereinfachte Versioneines Versuchs von Professor Patricia Neversder Universität Hamburg. Professor NeversProtokoll basiert auf einem von E. Härle undR. Hausmann der Universität Freiburg.

Mischung

Abfall

S

E

M


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Pflanzliche Tumore sind ein ernstzu-

nehmendes Ärgernis in Landwirtschaft,

Gartenbau und Forstwirtschaft. Häufig

entwickeln sie sich nach winzigen

Verletzungen, die durch die Bodenbe-

arbeitung, Frostschäden oder beim

Verpflanzen entstehen.

Um die Jahrhundertwende wurde beobachtet,

daß bestimmte Tumore immer in Verbindung

mit bakteriellen Infektionen standen. Die

involvierten Bakterien wurden Agrobacterium

tumefaciens (latein: agar = Boden, tumor =

Anschwellung, facere = machen) genannt.

Erst gegen Ende der 1970er Jahre wurde

endlich Licht auf die komplexe gegenseitige

Wechselbeziehung zwischen Pflanzen und

Agrobacterium geworfen.

Die infektiösen Bakterien führen ein kleines

Stück ihrer genetischen Information (ein

Plasmid) in den Chromosomensatz der

Pflanzenzelle ein und zwingen die infizierten

Zellen damit, einem bakterienfreundlichen

Programm zu folgen. Jede angegriffene

Pflanzenzelle teilt sich daraufhin. Ein Tumor

entwickelt sich, der als Lebensraum dient

und ungewöhnliche Aminosäuren liefert, die

von den unerwünschten bakteriellen Gästen

benötigt werden.

Die Methoden von Agrobacterium zum

Gentransfer wurden von Pflanzenzüchtern

adaptiert und werden zum gewollten

Gentransfer statt des zeitaufwendigen

Kreuzens eingesetzt. Aus diesem Grund sind

modifizierte Formen von Agrobacterium ein

wichtiges Werkzeug in der Gentechnologie

geworden.

Agrobacterium ist stäbchenförmig und hat

etwa die Größe wie E. coli ( 1 - 3 mm lang).

Agrobacterium speichert seine Giftigkeit im

Boden, wo es aerobisch in den oberen

Schichten lebt. Es ist ein Saphrophyt, obwohl

es anorganischen Stickstoff nutzen kann.

Agrobacterium greift nur Dikotyledonae an

und kann nur dann eindringen und die

Pflanze infizieren, wenn Wunden vorhanden

sind. Dieses ist so, weil das Bakterium

unfähig ist, eine intakte pflanzliche Zellwand

zu durchdringen. Der Saft beschädigter

Zellen “lockt” Bakterien aus näherer

Umgebung an und aktiviert den Gentransfer.

Die Bakterien vermehren sich um das

Wundgebiet herum und durchdringen den

interzellulären Bereich, indem sie sich an der

pflanzlichen Zellwand anheften.

Agrobacteriums Plasmid wird übertragen und

schließlich in das pflanzliche Chromosom

integriert, von wo aus es die Produktion von

Opinen steuert, die das Agrobacterium als

Kohlenstoff- und Stickstoffquelle nutzt.

Ziel ● Infektion von Bryophyllum = Calanchoe sp. (die

schnell gezogen und vermehrt werden kann)durch die natürlich vorkommende Form vonAgrobacterium unter verschiedenenBedingungen. Innerhalb von 4 Wochen kanndas Tumorwachstum beobachtet werden.Folgende Variationen der Arbeitsanleitungkönnen untersucht werden:

A. Infektionsmodus

- Ein Kratzer wird angebracht und sofortmit Agrobacterium infiziert.

- Ein Kratzer wird angebracht und amfolgenden Tag mit Agrobacterium infiziert.

- Ein Kratzer wird angebracht, mitAgrobacterium infiziert und mit einemfeuchten Papiertuch abgedeckt.

- Ein Kratzer wird angebracht und NICHTmit dem Bakterium infiziert.

- Agrobacterium wird auf intaktePflanzenteile aufgebracht.

B. Stellen der Infektion:

- Stiel- Blattoberfläche- Sproßspitze

Vorbereitung1. Vermehrung der Wirtspflanze (kann von

Schülern evtl. Zuhause durchgeführt werden).2. Vorbereitung des Nährmediums und der

Agrobacterium Kultur. Neue Kulturenmüssen wenigstens 2 Wochen vorGebrauch vorbereitet worden sein.

ZeitbedarfAufzucht der Wirtpflanzen /falls nötig): 4 MonateVorbereitung Agrobacterium Kultur: 2 WochenInfizieren mit Agrobacterium: 20 MinutenBeobachtung des Tumorwachstums: 3-4 Wochen

NatürlicherGentransfer durchAgrobacteriumtumefaciens

....

...


Geräte und MaterialienBedarf für jeden Schüler oder jedeArbeitsgruppe (Der Zugang zu einer normalenArbeitsraumausstattung wird vorausgesetzt)

● Steriles Wasser (in McCartney-Flasche)● Impfnadel● Impföse● Binokulare● Schere● Aufklebeetiketten und wasserfester Filzstift● Papiertaschentücher● Klebeband● Ethanol zum Abflammen der Instrumente● Agrobacterium tumefaciens Kultur auf

Nähragar● Kalanchoe (Bryophyllum) Pflanzen, etwa 3-4

Monate alt

DurchführungDie Versuchspflanzen werden auf verschiedeneWeisen behandelt (vgl. Einleitung und nachfolgendeAnleitung).1. Jede Pflanze wird mit dem Datum und der

erhaltenen Behandlung beschriftet. Falls nötig,werden die infizierten Teile gekennzeichnet,z.B. mit Aufklebern.

2. Die behandelten Pflanzen werden an einemgut beleuchteten Ort aufgestellt und feuchtgehalten (nicht überwässern).

3. Während der folgenden 4-6 Wochen wird dieTumorbildung beobachtet und schriftlich fest-gehalten. Ein Stück des Tumorgewebes wirdmittels Binokular untersucht und mit einemStück normalen Blattgewebes verglichen.

Infektion der Pflanzen mit Agrobacterium:

Methode 1 (Sofortige Infektion der Wunden)1. Die Impfnadel wird in Alkohol getaucht und

der Alkohol abgebrannt. Die Oberfläche derPflanze wird einmal oder mehrere Maleeingeritzt.

2. Die Wunde wird mit Agrobacterium direkt ausder Kultur infiziert. Dazu wird die Impföseabgeflammt und kurz abgekühlt. Von derweißlichen Bakterienkultur wird eine kleineMenge mit der Impföse entnommen und überder Wunde ausgestrichen. Die Öse wird erneutabgeflammt.

Methode 2 (Infektion der Pflanze 24 Stunden nach ihrerVerletzung)1. Verletzung der Pflanze (s. Methode 1)2. Am darauffolgenden Tag wird die Wunde mit

Agrobacterium infiziert.

Methode 3 (Infektion der Wunden und an-schließendesAbdecken mit feuchtem Papiertuch)1. Verletzung und Infektion der Pflanze (s.

Methode 1).2. Aus einem Papiertuch werden Stücke

herausgeschnitten und mit sterilemLeitungswasser befeuchtet. Diese Stückewerden auf die Verletzungen gelegt und mitKlebestreifen befestigt. Die Papierstückesollten feucht gehalten werden.

Methode 4 (keine Wundinfektion)1. Die Pflanze wird an der Oberfläche (s.

Methode 1) verletzt. Eine zweite Verletzungwird an ähnlicher Stelle angebracht und mitfeuchtem Papier abgedeckt. Die Verletzungenwerden nicht mit Agrobacterium behandelt.

Methode 5 (Infektion ohne Verletzung)1. Die Pflanze wird nicht verletzt.2. Mit der Impföse wird steril Agrobacterium an

einer oder mehreren Stellen derunbeschädigten Oberfläche ausgestrichen.

SterilisiereneinergebogenenNadel

ACHTUNG!Ethanol istleichtentflammbar

Einritzen derPflanze mit einersterilen Nadel

Ausstrich vonBakterien auf denKratzer

Abflammender Nadelvor undnach demGebrauch

Kultur vonAgrobacteriumtumefaciens


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SicherheitsvorkehrungenDie Versuche müssen in einem Arbeitsraumdurchgeführt werden. Grundlegende mikro-biologische Sicherheitsvorkehrungen,einschließlich aseptischer Techniken solltenbeim Umgang mit Mikroorganismen befolgtwerden.

WICHTIG. A. tumefaciens ist ein ernstzu-nehmender Pflanzenschädling. Sein Einsatzwird in einigen Ländern und Landesteilen

streng überwacht. Bei der Durchführung dieserVersuche muß gewährleistet sein, daß sie mitden gültigen Sicherheitsbestimmungenübereinstimmen.

DanksagungUta Nellen am Zentrum für Schulbiologie undUmwelterziehung, Hamburg, hat dieseVersuchsreihe erstellt. EIBE dankt für dieGenehmigung, sie verwenden zu dürfen.

TeilungsenzymeDNA LigaseergänztDNA Fragmente

Teilungsenzymspaltet DNA anspeziellen Stellen

Gewünschte Gene, vomSpender isoliert

Unerwünschte Gene,aus dem Plasmid entfernt

Neues Plasmid, inAgrobacteriumtumefaciens eingebaut

PlasmidBakterienchromosom

Bakterien treten an derSchnittstelle in die Zelle undführen nein neues Plasmid ein

Blattscheiben, miteiner Suspension aus

Agrobacterium

Blattscheiben auf einemausgewählten Nährboden

- nur transformierte Zellengedeihen.

Pflanzen, die daseingeführte Genenthalten, sindregeneriert.

Einsatz von modifizierten Formen vonAgrobacterium tumefaciens in der Gentechnologie.

....

...


Anhang 1Mikrobiologische Medien


Nähragarmedien und Nährbouillon sollten aus handelsüblichen Präparaten hergestellt werden,wobei den Herstelleranleitungen zu folgen ist. Vor Gebrauch sollten sie bei 121 0C für 15Minuten autoklaviert werden. Vorbereitete Medien können in der Regel einige Monate bei ca.4 0C gelagert werden.

StärkeagarmediumNähragar 20,7 gLösliche Stärke 2,0 g

Mit destilliertem Wasser auf 1 l ergänzen und 15 Minuten bei 121 0C autoklavieren.

MacConkey-Agar mit StreptomycinMacConkey-Agar 50,0 gDestilliertes Wasser 990 ml

Nach dem Autoklavieren für 15 Minuten bei 121 0C auf 50 0C abkühlen, dann hinzufügen:

Streptomycinsulfatlösung 200 mg/10 ml

Diese Platten müssen frisch zubereitet werden. Sie können nicht länger als einige Tage imKühlschrank bei ca. 40 0C gelagert werden.

1EINHEIT


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Anhang 2Mikrobiologische Techniken


AerosoleAerosole sind kleine, mit Mikroorganismenbeladene Tröpfchen, die ungewollt in die Luftgelangen, für eine halbe Stunde oder längerBestand haben und eingeatmet werden können.Sie sind vor allem die potentielle Ursache fürInfektionen im Arbeitsraum. Aerosole ausverschütteten Kulturen können Haut- undAugeninfektionen verursachen. DasHerunterschlucken von Mikroorganismen istschnell möglich, wenn Kulturen mit dem Mundpipettiert werden.

Grundsätzliche LaborarbeitenFolgende Vorkehrungen sollten getroffenwerden:

Es sollten keine Tätigkeiten von Hand zuMund ausgeführt werden (z.B. Kauen vonBleistiften, Anlecken von Etiketten,Mundpipettieren). Essen, Trinken und Rauchensind im Arbeitsraum nicht erlaubt.

Es wird empfohlen, daß alle SchülerArbeitskittel tragen. Alle äußeren Schnitte undAbschürfungen sollten vor Beginn derpraktischen Arbeit durch wasserfesteWundverschlüsse (Pflaster) geschützt werden.

Vor und nach jeder praktischen Arbeit solltendie Arbeitsplätze mit einem Desinfektionsmittelabgewischt werden. GeeigneteDesinfektionsmittel sind im Lehrmittelhandelerhältlich.

Lehrer und Schüler sollten nach der praktischenArbeit ihre Hände waschen.

Verschüttungen und BrücheNach Unfällen mit Kulturen (Verschütten etc.)sollte folgendermaßen vorgegangen werden:Einweghandschuhe sollten getragen werden.Der zerbrochene Behälter und / oder dieverschüttete Kultur sollten mit einemdesinfektionsgetränkten Tuch abgedecktwerden. Nach nicht weniger als 10 Minutenmüssen sie weggeräumt werden, indemPapiertücher oder eine Abfallschaufeleingesetzt werden. Das kontaminierte Materialmuß in einen Müllbehälter für infiziertesMaterial oder eine entsprechende Mülltütegegeben werden. Beides muß vor derEntsorgung autoklaviert werden. DieAbfallschaufel sollte ebenfalls autoklaviert oderfür 24 Stunden in ein Desinfektionsmittel gelegtwerden.

Versehentliche Kontamination von Haut und Kleidung

Jeder, der Spritzer abbekommen hat, sollte sichso schnell es geht waschen. Stark kontaminierteKleidung sollte vor der Wäsche mitDesinfektionsmittel behandelt werden.Kontaminierte Reinigungstücher solltenautoklaviert werden.

Ursprung der MikroorganismenAlle Mikroorganismen sollten als potentiellschädlich angesehen werden. Die in denVersuchen dieser Unit eingesetzten Organismenstellen bei sorgfältiger Behandlungkein Risiko dar. Sie solltennur von anerkanntenVertreibern (z.B. von derDSMZ, s. Anhang 3)bezogen werden.

1EINHEIT

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...


Die Ziele steriler Arbeitstechniken sind:

a) Gewinnung und Aufrechterhaltung vonReinkulturen der Mikroorganismen

b) Sicheres Arbeiten mit Mikroorganismen

Eine Reinkultur besteht aus einem einzigenStamm einer Art von Mikroorganismen,während eine Mischkultur zwei oder mehrStämme enthält.

Die Kontamination von Kulturen ist eineallgegenwärtige Gefahr, da Mikroorganismenüberall vorkommen: auf der Haut, in der Luftund auf leblosen Objekten. Um eine Reinkulturrein zu halten, müssen sterile Nährmedien undsterile Arbeitsgeräte benutzt und Verunreiniger(Kontaminanten) ausgeschaltet werden. Diessind die grundlegenden Prinzipien sterilerArbeitstechniken.

Es ist unrealistisch anzunehmen, daß jüngereSchüler sterile Arbeitstechniken einwandfreiausführen. Dennoch setzen einige Versuchedieser Unit voraus, daß Schüler Kulturen steriltransferieren können. In diesen Fällen solltendie folgende Verfahrensweisen übernommenwerden.

Nährmedien sollten vor dem Gebrauch durchAutoklavieren sterilisiert werden. Es müssensterile Gefäße (Kolben, Petrischalen etc.)benutzt werden. Die Deckel müssen auf denBehältern belassen werden, um einerKontamination entgegenzuwirken.

Die Arbeiten sollten in der Nähe einesBunsenbrenners ausgeführt werden. Durch dieFlamme steigen Luftströme auf und tragenMikroorganismen, die das Nährmedium oderdie Reinkulturen kontaminieren könnten, fort.

Beim Transfer von Kulturen sollten dieVerschlüsse und Deckel nicht länger alsunbedingt nötig geöffnet werden. Wird einFlaschenverschluß geöffnet, sollte er bis zumWiederverschließen in der Hand gehaltenwerden. Das schützt vor einer Kontaminationdes Arbeitsplatzes und der Kultur. Nach demEntfernen des Verschlusses sollte der Hals derKulturflasche für 1-2 Sekunden ausgeglühtwerden. Dadurch werden dort vorhandene

Sterile Arbeitstechniken

Mikroorganismen abgetötet undKonvektionsströme erzeugt, die eineKontamination durch zufällig in der Luftvorhandene Kulturen verhindern.

Mit Übung ist es möglich, die Flasche in dereinen und ihren Metallverschluß in der anderenHand zu halten, indem der kleine Finger denVerschluß gegen die Handfläche drückt. (Beidieser Vorgehensweise ist es wichtig, daß derFlaschenverschluß leicht gelöst wurde, bevordie Impföse aufgenommen wird). Nötigenfallskönnen zwei Schüler zusammenarbeiten, umdiesen Arbeitsschritt durchzuführen.

Impfösen sollten erhitzt werden, bis das ganzeMetallstück glühend rot ist. Das muß vor undnach dem Transfer von Kulturen erfolgen. DieÖsen sollten langsam in die Flamme desBunsenbrenners hineingeführt werden, umSpritzer und damit die Aerosolbildung zuvermeiden.

Bei Nichtgebrauch sollte der Bunsenbrennerauf gelber Flamme gehalten werden, so daß ernicht zu übersehen ist. Eine ca. 5 cm hohe blaueFlamme sollte zur Sterilisation von Ösen undzum Ausglühen von Flaschenhälsen benutztwerden.

Die Kontamination des Arbeitsplatzes solltevermieden werden. Arbeitsgeräte sollten sofortnach Gebrauch sterilisiert und benutzt Pipettenunverzüglich in ein Gefäß mit Desinfektionslö-sung gegeben werden.

Verschluß,von einem

Fingergehalten


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Vor dem Bebrüten werden die Petrischalen aufder Unterseite beschriftet. Name, Datum undder Name der Kultur oder ihr Ursprung helfen,den Nährboden und seinen Inhalt zuidentifizieren.

Wenn es angebracht ist (Bebrütung un -bekannter Kulturen), werden die Petrischalenwie unten gezeigt verschlossen:

Die Abdichtung stellt sicher, daß die Nährbödennicht versehentlich geöffnet oder unbefugtbehandelt werden. Anmerkung: Die Platten werdennicht vollständig abgedichtet, da sonst anaerobeWachstumsbedingungen entstehen könnten.

Bakterien

Bakterienkulturen in Petrischalen solltennormalerweise umgedreht bebrütet werden, sodaß jede möglicherweise entstehendeKondensation in den Deckel und nicht in dieKultur gelangt (Sollte vor der Beimpfung einestarke Konden- sation in der Petrischaleentstanden sein, muß sie zunächst getrocknetwerden).

Nach einer Inkubation von 2-3 Tagen bei 25-30ºC werden Bakterienkolonien sichtbar.

Pilze

Petrischalen mit Pilzen werden nicht umgedreht.Pilzkulturen sollten für ca. 7 Tage o.ä. bebrütetwerden. Eine Raumtemperatur von ca. 21 ºCermöglicht ihr Wachstum, aber ein Brutschrankerlaubt eine genauere Kontrolle.

Bebrüten von Kulturen

LeichterVerschluß mitdem Boden

Beschriftung aufKlebeband

Entsorgung und SterilisationEs ist wichtig, alle im Versuch eingesetztenArbeitsgeräte sorgfältig zu entsorgen,um dieKontamination von Arbeitsplätzen und Personenzu vermeiden. Alle Behältnisse, die zurAufbewahrung und zum Wachstum von Kulturenbenutzt wurden, müssen vor erneutem Gebrauchautoklaviert, dann in Desinfektionsmittelabgewaschen und ausgespült werden.

Zwei Tüten zum Autoklavieren sollten imArbeitsraum vorhanden sein: eine fürwiederverwendbare Glasgeräte, eine fürEntsorgungsmaterial. Es sollte ein großer und einkleiner Abfallbehälter für Pipetten undObjektträger an jedem Arbeitsplatz stehen. ZurEntsorgung zerbrochener Glasgeräte sollte einMetalleimer zur Verfügung stehen. EntsorgbarePlastikpipetten, Objektträger und alleFlüssigkeiten aus Kulturen sollten in das kleineGefäß mit Desinfektionslösung gegeben werden.

Kunststoffpipetten werden autoklaviert undentsorgt; Objektträger werden für 24 Stunden inDesinfektionslösung gelegt und vorWiedergebrauch abgewaschen und abgespült.

Glaspipetten sollten in das größere Gefäßgegeben werden. Der Pipettenkolben sollte erstherausgezogen werden, wenn sich die Spitze imDesinfektionsmittel befindet, da sich sonstAerosole bilden können. Verschmutzte Pipettensollten vor Wiedergebrauch autoklaviert,abgewaschen und abgespült werden.

Kontaminierte Papiertücher, Kleidungsstücke undPetrischalen werden in die Tüte für Abfällegegeben, die autoklaviert werden müssen.

Alle kontaminierten Glasgeräte (einschließlichbenutzter Petrischalen) sollten in die Tüte fürautoklavierbare Glasgeräte kommen.

Nichtkontaminierte Glasgeräte können normalausgewaschen werden. Zerbrochene Glasgerätesollten in einen extra dafür bereitgestelltenAbfalleimer gegeben werden. Sollten dieGlasgeräte kontaminiert sein, müssen sie vor derEntsorgung autoklaviert werden. Nicht-kontaminierte zerbrochene Glasgeräte könnenohne besondere Maßnahmen entsorgt werden.

....

...


Schon eine kleine Temperaturabweichung kanneine große Veränderung in der Sterilsationszeitbedeuten. Es ist ebenfalls wichtig, daß alleGeräte die Temperaturen für den angegebenenZeitraum erreichen, z.B. Nährbouillon genau inder Mitte des Fermentationsgefäßes.

Demnach tragen drei Faktoren zur Dauer desAutoklavierprozesses bei:

● Aufwärmphase: die Zeit, die benötigtwird, damit die zentralen Bereiche desAutoklavierinhaltes die erfordericheTemperatur erreichen

● Sterilisierphase: die Mindestzeit, in derbei vorgegebener Temperatur alle lebendenOrganismen abgetötet werden

● Sicherheitsphase: Sicherheitsspielraum;meist die Hälfte der Sterilisierzeit

Dampfdrucktöpfe arbeiten bei einerTemperatur von 121ºC. Daraus ergibt sich fürdie Gesamtzeit der Sterilisation :Aufwärmphase (z.B. 5 Minuten)+ Sterilisierphase (z.B. 15 Minuten) + Sicher-heitsphase ( 5 Minuten o.ä.) = 25 Minuten.

Gefäß Volumen Sterilisierzeit

Reagenzglas 20 ml 12-14 MinutenKolben 50 ml 12-14 MinutenKolben 200 ml 12-15 MinutenFermenter 1 Liter 20-25 Minuten

KaramelisationZweckgebunden gebaute Autoklaven arbeitenmanchmal bei höheren Temperaturen als121ºC. Während einerseits die damitverbundene Zeitersparnis lohnend erscheint,sollte zum anderen bedacht werden, daß höhereTemperaturen sich schädlich auf bestimmteMedien auswirken. Glucoselösung z.B.karamelisiert bei hohen Temperaturen, indemsie Verbindungen bildet, die aufMikroorganismen toxische Wirkung habenkönnen. Im Falle der Glucose kann dieseReaktion durch die Einstellung des Mediumsauf pH 4 vermieden werden. Nach der Sterilisa-tion kann der pH-Wert wieder wie erforderlicheingestellt werden.

Sterilisation bedeutet das vollständige Abtöten vonMikroorganismen und ihrer Sporen.

Alle Arbeitsmaterialien sollten vor Beginn derpraktischen Arbeiten sterilisiert werden, umKontaminationen zu vermeiden. Kulturen undkontaminiertes Material sollten ebenfalls vor derEntsorgung sterilisiert werden.

Autoklavieren ist die bevorzugte Methode zurSterilisation von Kulturmedien, wässrigen Lösungenund eingesetzten Kulturen. In dieser Verfahrensweisewird Dampfdruck bei 121 ºC benutzt (z.B. imSchnellkochtopf). Mikroorganismen werden leichterdurch feuchte als durch trockene Hitze abgetötet, dader Dampf ihr Protein zerstört. Das Autoklavierenkann in einem Haushaltsdrucktopf oder in einem zudiesem Zweck gebauten Autoklaven durchgeführtwerden. Drucktöpfe können in Schularbeitsräumeneingesetzt werden, aber ihr geringesFassungsvermögen kann sich nachteilig beim Einsatzvon Materialien im Klassensatz auswirken.

Prinzipien des AutoklavierensZwei Faktoren können die Effektivität ungünstigbeeinflussen. Erstens muß die Luft aus demAutoklaven entfernt werden. Dadurch wirdsichergestellt, daß Dampf mit hoher Temperatur diezu sterilisierenden Oberflächen erreicht: bei nochvorhandener Luft verringert sich die Temperatur beigleichem Dampfdruck. Die zu sterilisierende Gerätesollten nicht zu eng eingeräumt werden, damit dieLuft verdunsten kann. Bei Flaschen und Gefäßen mitSchraubverschlüssen sollten die Deckel leicht gelöstsein, damit Luft entweichen kann und sich imInnenraum kein gefährlicher Druck aufbaut.Zweitens muß ausreichend Zeit angesetzt werden,damit die Hitze ( durch Konduktion) in die Mediender Petrischalen oder anderer Behältnisse eindringenkann. Die verschiedenen Zeiten, für die die Medienoder Geräte bei unterschiedlichen Temperaturen zurSterilisation zu autoklavieren sind, können derAbbildung unten entnommen werden.Sterilisierzeit (Minuten)

130120110100

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Autoklavieren

Temperatur Sterilisierzeit

100 ºC 20 Stunden110 ºC 2,5 Stunden115 ºC 50 Minuten121 ºC 15 Minuten125 ºC 6,5 Minuten130 ºC 2,5 Minuten

Temperatur (ºC)


......

.

Maillard ReaktionenEine bräunende Reaktion ( die MaillardReaktion) kann durch die Interaktion derStickstoffverbindungen und Kohlehydrate imMedium bei höheren Temperaturen einsetzen.Die hier entstehenden Verbindungen sindebenfalls toxisch für einige Mikroorganismen,so daß es unter bestimmten Bedingungen nötigsein wird, die Kohlenhydrate und Rückständedes Mediums getrennt voneinander zuautoklavieren (Beispiel: bei der Präparation vonMilchagar).

Gebrauch und sichereHandhabung des AutoklavenDie Bedienungsanleitungen der Herstellersollten bei Gebrauch eines Drucktopfes oderAutoklaven befolgt werden. Insbesondere istdarauf zu achten, daß eine ausreichendeWassermenge im Autoklaven enthalten ist,damit er während des Autoklavierens nichttrockenkocht. Ein Drucktopf erfordert 250 mlWasser - größere Autoklaven brauchen einevergleichsweise größere Menge. Der Gebrauchvon destilliertem oder deionisiertem Wasser imAutoklaven verhindert den Aufbau vonKesselstein. Vor dem Wegräumen sollte derAutoklav sorgfältig getrocknet werden. Wirddies nicht gemacht, können sich Ablagerungenauf dem Autoklavboden bilden, die das Geräternsthaft schädigen und unter Druck dasAuswölben nach außen hervorrufen können.

Bei Benutzung eines Autoklaven sollte Dampffür ungefähr eine Minute frei entweichenkönnen, um die Luft aus dem Innenraum zuentfernen, bevor das Austrittsventil geschlossen

wird. Nach Abschluß des Autoklavierprozessesmuß ausreichend Zeit für die Abkühlung desInhalts und das Wiedererreichen einesnormalen atmosphärischen Drucks gegebenwerden. Die Gefäße oder Ventile sollten nichtunter Druck stehend geöffnet werden, da sonstVerbrühungen möglich sind. Das vorzeitigeÖffnen des Deckels und die sich darausergebende Drucksenkung bringt jedeFlüssigkeit im Inneren des Autoklaven zumKochen. Die Nährböden oder -bouillon könnenaufschäumen und überlaufen.

Chemische SterilisationViele verschiedene Chemikalien können für dieSterilisation eingesetzt werden. Die amhäufigsten für Labortätigkeiten verwendetenDesinfektionsmittel sind reine phenol- undhypochloridhaltige Lösungen.

Reine phenolhaltige Lösungen wirken gegenBakterien und Pilze, nicht aber gegen Sporenund einige Virenarten. Bis zu einembestimmten Grad werden sie durch denKontakt mit Holz, Gummi und Kunststoffinaktiviert. Die Benutzung in Arbeitsräumenschließt den Einsatz auf Abfallbehälter und dieDesinfektion von Oberflächen ein.

Hypchlorithaltige Lösungen (z.B. Bleicher) sindfür die Sterilisation von Petrischalen usw. nichtgut geeignet, da sie durch Protein undKunststoffmaterialien inaktiviert werdenkönnen. Dennoch ist eine 5%ige Domestos- oderSagrotan-Lösung für den Gebrauch inAbfallbehältern geeignet.

....

...


1. Die Ampullenspitze wird in derFlamme eines Bunsenbrenners erhitzt.

2. Mit einer Pipette werden höchstenszwei oder drei Tropfen kaltes Wasserauf die erhitzte Spitze aufgetropft. DasGlas müßte jetzt brechen.

3. Der gesprungene Ampullenteil wirdfest, aber vorsichtig mit einer Pinzetteabgeklopft und die Glassplitter in einerPetrischale aufgefangen. DieGlasstücke müssen entsprechendentsorgt werden.

4. Der innere Glaswollstopfen, der dasinnere Röhrchen in der Ampulle hält,wird vorsichtig mit einer Pinzetteentfernt.

5. Das innere Röhrchen wird vorsichtig ineine sterile Petrischale gegeben und diePetrischale wieder verschlossen.

Öffnen einer Ampulle

ACHTUNG!Eine Schutzbrille mußgetragen werden, da beimÖffnen einer AmpulleSplitter streuen können.

Anhang 3Öffnen einer Ampulle


1EINHEIT

Bestellung der Kulturen bei:

DSMZ - Deutsche Sammlung von

Mikroorganismen und Zellkulturen

GmbH

Dr Barbara Lehnberg

Mascheroder Weg 1B

D-38124 Braunschweig

Aufbereitung einergefriergetrockneten Kultur

1. Der Baumwollstopfen wird mit einerPinzette entfernt und die Öffnung desinneren Röhrchens abgeflammt.

2. Dem Inhalt des inneren Röhrchenswird ca. 1 ml der sterilen Nährbouillonzugefügt.

3. Die Öffnung des inneren Röhrchenswird erneut abgeflammt und derBaumwollstopfen wieder aufgesetzt.Das Röhrchen bleibt 20 Minuten zurAufbereitung der Kultur stehen.

4. Mit einer abgeflammten Öse wird derInhalt des inneren Röhrchens gutdurchgemischt und in ein sterilesReagenzglas mit ca. 5 ml Nährbouillonübertragen.

5. Die Kultur wird bei 30 ºC über Nachtberütet.

Am nächsten Tag ...

6. Ein Tropfen der vorbereiteten Lösungwird mit einer abgeflammten Impföseauf die Oberfläche einerNähragarplatte ausgestrichen. Diesesdient der Überprüfung einer möglichenKontamination der Platte nur eine derKulturen sollte sich entwickelt haben.


......

.

Openingan ampoule

Öffnen einerAmpulle

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