Universität Hohenheim · 12 der Blütenentwicklung befinden, mit MeJA wieder rückgängig gemacht...

Universität Hohenheim

Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen

Prof. Dr. Andreas Schaller

Die Oxophytodiensäure-Reduktase (OPR3) aus Tomate � molekulare und phänotypische Charakterisierung einer

RNAi-Pflanze

Diplomarbeit vorgelegt von Andreas Klemm

Hohenheim, Januar 2006 betreut von Dr. Annick Stintzi

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis.............................................................................................................................I

Zusammenfassung.........................................................................................................................IV

1. Einleitung ....................................................................................................................................1

1.1 Der Oktadekanoidweg...........................................................................................................3

1.2 Der Wundsignalweg � die Wundsignaltransduktion.............................................................7

1.3 Der Oktadekanoidweg während der Blütenentwicklung ....................................................10

1.4 Die Erkennung der Jasmonsäure .........................................................................................12

1.5 Durch Verwundung induzierbare Gene...............................................................................14

1.6 Idee und Ziel der Arbeit ......................................................................................................16

2 Material und Methoden ..............................................................................................................17

2.1 Organismen .........................................................................................................................17

2.1.1 Pflanzliches Material....................................................................................................17

2.2 Oligonukleotide...................................................................................................................17

2.3 Puffer und Lösungen ...........................................................................................................17

DNA-Extraktion ....................................................................................................................17

Gelelektrophorese..................................................................................................................18

Proteinextraktion ...................................................................................................................18

Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE) und Western-Blot ......19

RNA-Extraktion ....................................................................................................................21

Northern Blot.........................................................................................................................22

2.4 Sonstige Puffer, Lösungen, Materialien..............................................................................23

2.5 Medien und Stammlösungen...............................................................................................24

2.5.1 Stammlösungen Antibiotika.........................................................................................24

2.5.2 Medien..........................................................................................................................24

2.6 Enzyme................................................................................................................................25

2.7. Methoden............................................................................................................................25

2.7.1 DNA-Isolation aus Pflanzenmaterial ...........................................................................25

2.7.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR) ...............................................................................25

2.7.3 Auftrennung und Sichtbarmachung der DNA..............................................................26

Zusammenfassung

II

2.7.4 Isolierung von Proteinen aus Blattmaterial von Tomaten............................................26

2.7.5 Entfernung sämtlicher Kontaminationen des Proteinextrakts......................................26

2.7.6 Antikörperaufreinigung aus Serum ..............................................................................27

2.7.7 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE) und Western-Blot

...............................................................................................................................................27

2.7.8 RNA-Extraktion aus Blattmaterial ...............................................................................28

2.7.9 Northern Blot................................................................................................................30

2.7.10 Sterilisation der Samen und Anzucht der Keimlinge .................................................31

2.7.11 Emaskulation von Tomatenblüten..............................................................................31

2.7.12 Sammeln von Pollen und Bestäubung von emaskulierten Pflanzen ..........................32

2.7.13 In vitro-Pollenkeimung ..............................................................................................32

2.7.14 Ernte der Tomaten und Gewinnung der Samen .........................................................32

2.7.15 Präparation der Embryonen........................................................................................33

2.7.16 Fixierung und Einbettung von Samen in TechnoVit 7100.........................................33

2.7.17 Färbemethoden der Schnitte.......................................................................................34

2.7.18 Statistische Analysen..................................................................................................34

3. Ergebnisse .................................................................................................................................35

3.1 Phänotypische Charakterisierung der LeOPR3-RNAi-Tomaten-pflanzen .........................35

3.1.1 Das OPR3-RNAi-Konstrukt.........................................................................................35

3.1.2 Tragen die Pflanzen das RNAi-Konstrukt?..................................................................36

3.1.3 Ist die Expression von OPR3 unterdrückt? ..................................................................37

3.1.4 Phänotyp der opr3-Pflanzen.........................................................................................38

3.1.5 Pollenanalyse................................................................................................................39

3.1.6 Generierung von Früchten und Samen.........................................................................40

3.1.7 Rückgewinnung der Fertilität durch Jasmonsäure .......................................................47

3.1.8 Fruchtbildung ohne Befruchtung (Parthenocarpie)......................................................48

3.1.9 Luftwurzelähnliche Strukturen.....................................................................................49

3.2 Molekulare Charakterisierung der opr3-RNAi-Tomatenpflanzen......................................50

3.2.1 Akkumulieren Proteinaseinhibitoren nach Verwundung? ...........................................50

3.2.2 Ist OPDA oder Jasmonsäure das transportierte Signal.................................................52

4. Diskussion .................................................................................................................................57

4.1 Ist OPDA ein Wundsignal? .................................................................................................58

4.2 Einfluss von OPDA und JA auf die Entwicklung ...............................................................60

Zusammenfassung

III

4.3 Ausblick ..............................................................................................................................63

5 Verzeichnisse .............................................................................................................................64

5.1 Literatur...............................................................................................................................64

5.2 Abbildungen und Tabellen ..................................................................................................71

Abbildungen ..........................................................................................................................71

Tabellen.................................................................................................................................76

5.3 Erläuterungen und Abkürzungen ........................................................................................76

Erläuterungen ........................................................................................................................77

Abkürzungen .........................................................................................................................77

Eidesstattliche Erklärung...............................................................................................................81

Danksagung...................................................................................................................................82

Zusammenfassung

IV

Zusammenfassung

Mit Hilfe von RNA-Interferenz (RNAi) wurde in Tomatenpflanzen das Gen, welches für die 12-

Oxophytodiensäurereduktase (OPR3) kodiert ausgeschalten. Dieses Gen kodiert für ein Enzym

des Oktadekanoidwegs, welcher in Pflanzen zur Bildung von Jasmonaten führt. Zu den Jasmo-

naten werden Jasmonsäure (JA), Methyljasmonsäure (MeJA) und deren zyklische Vorstufen �

also auch OPDA � gezählt. OPR3 katalysiert unter Beteiligung von NADPH als Reduktionsmit-

tel die Umsetzung von (9S, 13S)-12-Oxophytodiensäure (OPDA) zu 3-oxo2(2�[Z]-Pentenyl)-

Cyclopentan-1-Oktansäure (OPC8:0). Für diese Arbeit standen 31 unabhängig transformierte

transgene Linien in der T1 Generation zur Verfügung. Keine der 31 transgenen Pflanzen bildeten

innerhalb von sechs Monaten Früchte. Westernblots von Proteinextrakten aus sechs zufällig aus-

gewählten Linien zeigten, dass das OPR3-Protein nicht nachzuweisen war, und auch nach Ver-

wundung nicht induziert wurde. Es wurde geschlossen, dass die Herabregulierung von OPR3

einen Einfluss auf die Fruchtentwicklung hat. Mit Hilfe von in vitro Pollenkeimungsversuchen

konnte gezeigt werden, dass das Herabregulieren von OPR3 in Tomate, wie auch in Arabidopsis

thaliana, zu einer männlichen Sterilität führt. Durch Rückkreuzungen mit Pollen, welcher von

Wildtyppflanzen auf opr3-Blüten und Pollen welcher von opr3-Pflanzen auf Wildtypblüten

übertragen wurde, konnte gezeigt werden, dass das Transgen einen Effekt auf die Entwicklung

des Embryos hat. In beiden Fällen zeigte ein Teil der Samen einen Entwicklungsdefekt, und

einen Arrest der Embryonalentwicklung im globulären Stadium. Über PCR konnte gezeigt

werden, dass diese Embryonen das Transgen enthielten, nicht jedoch die Kotyledonen normal

entwickelter Samen. Aus diesem Ergebnis wurde geschlossen, dass Jasmonsäure nicht nur auf

die Reifung und Freisetzung des Pollens, sondern auch auf die Entwicklung des Samens und

Embryos einen Einfluss ausübt. Acht Monate nach dem die opr3-Pflanzen in das Gewächshaus

gebracht wurden, bildeten einige parthenocarpische Früchte und Adventivwurzeln. Ein Grund

für diese Entwicklungen könnte eine virale Infektion der Pflanzen sein, die Einfluss auf den

Hormonhaushalt der Pflanzen nahm.

Verwundungen aktivieren den Oktadekanoidweg, dieser löst sowohl lokal als auch systemisch

die Bildung von Abwehrgenen aus. Obwohl bereits bekannt ist, dass Jasmonsäure ein Signalmo-

lekül der Wundreaktion darstellt, ist die opr3-Mutante in Tomate ein sehr gut geeignetes Werk-

zeug, um zu testen, ob OPDA � wie in Arabidopsis � die Bildung und Akkumulation von Ab-

wehrproteinen auslösen kann. Hierzu wurden Pfropfungen zwischen Wildtyppflanzen, opr3- und

aos-Pflanzen hergestellt. Diese Untersuchungen führten zu keinem klaren Ergebnis. Eine mögli-

Zusammenfassung

V

che Ursache dafür liegt in einer im Versuchszeitraum aufgetretenen viralen Infektion, die zu ei-

ner Beeinträchtigung der Wundreaktion geführt haben könnte.

1 Einleitung

1

1. Einleitung

Seit dem es auf diesem Planeten Lebewesen gibt, müssen sich diese an ihre Umwelt anpassen.

Jeder Organismus versucht sich seiner Umgebung so anzugleichen, dass er an die sich ihm bie-

tenden Umweltbedingungen optimal angepasst ist. Diese Anpassungen bedeuten Stress.

Hieraus ist zu erkennen, dass jeder Organismus, egal ob Mensch, Tier oder Pflanze verschiede-

nen Stressoren ausgesetzt ist. Stress ist also ein sehr weit gefasstes Phänomen, Menschen und

viele andere Tiere sind in der Lage den Stressoren physisch auszuweichen und flüchten, um ei-

nen anderen Standort zu wählen, an welchen sie ein Feind nicht verfolgen kann. Pflanzen sind �

von einigen Algen abgesehen � nicht in der Lage ihren Standort aktiv zu verändern, um zum

Beispiel an einen sonnigeren oder schattigeren Platz zu gelangen. Hat ein Same gekeimt, so

muss der Keimling mit den vor Ort vorhandenen Bedingungen zurecht kommen.

Aus diesem Grund haben Pflanzen im Laufe ihrer Entwicklung andere Strategien entwickeln

müssen, um sich zum Beispiel gegen Fraßfeinde zu wehren. Hierzu gehören zum einen morpho-

logische Anpassungen, wie z. B. die Brennhaare der Brennnessel, kein Kaninchen wird jemals

mehr Brennnesseln verzehren wollen, nachdem es von ihr genesselt wurde. Im Gegenzug wird es

auch keine Buntnesseln mehr fressen wollen, die in ihrer Gestalt der Brennnesseln ähnlich sind,

jedoch nicht nesseln.

Nicht nur in ihrer Gestalt sondern auch in ihrer molekularen Zusammensetzung sind Pflanzen in

der Lage sich gegen Fraßfeinde zu wehren. Zu diesen molekularen Zusammensetzungen zählt

die Jasmonsäure (JA Jasmonic acid) (Abb. 1).

Dieses Molekül reguliert vielerlei Abläufe und Prozesse in Pflanzen. Hierzu gehören eine Viel-

zahl von Regulationen im Wachstum und anderen Entwicklungsvorgängen. Darüber hinaus dient

Jasmonsäure als Signalmolekül bei verschiedensten Stressoren [Berger, 2002].

Nicht nur in Arabidopsis thaliana, einer allgemeinen Modellpflanze, aber auch in weiteren

Pflanzen ist das Vorkommen von Jasmonsäure belegt, in welchen sie die verschiedensten Pro-

Abb. 1: 3R,7S-Jasmonsäure (JA)

37

COOH

O

1 Einleitung

2

zesse reguliert [Creelman und Mullet, 1997]. So wirkt in hohen Dosen Jasmonsäure auf das

Wurzelwachstum, sowie auf das Wachstum der Pflanzen hemmend, des weiteren steuern sie

Fruchtbildung [Hause, et al., 2000; Devoto und Turner, 2003]. Außerdem haben Jasmonate eine

ausgesprochene Seneszenzwirkung auf Pflanzen [Koda, 1997].

Abbildung 2 zeigt die Wirkungen von Jasmonaten auf Stressoren (linker Teil des Bildes) und auf

die Entwicklung (rechter Teil des Bildes) der Pflanzen. Auf alle kann jedoch nicht näher einge-

gangen werden kann.

Am meisten ist von den Funktionen der Jasmonsäure über Mutanten in Arabidopsis bekannt,

welche über sogenannte loss-of-function Mutationen nicht mehr in der Lage sind Jasmonsäure zu

bilden oder zu erkennen.

In dieser Pflanze bewirkt Jasmonsäure die Entwicklung des männlichen Gametophyten. Dies

beinhaltet die Verlängerung der Filamente der Antheren, das Öffnen des Stomiums, so dass die

Pollen, welche ebenfalls mit Hilfe von Jasmonsäure zu ihrer trinuklearen reifen Form heranrei-

fen, auf den Stempel des weiblichen Gametophyten gelangen können. Wird dennoch Pollen frei-

gesetzt, so besitzt dieser eine stark verminderte Keimfähigkeit [McConn und Browse 1996; San-

ders et al., 2000; Stintzi und Browse 2000; Ishiguro et al., 2001; Park et al., 2002; von Malek et

Abb. 2: Die Wirkungen von Jasmonaten auf Stres-soren, und ihre Beteiligung an der pflanzlichen Ent-wicklung [aus Wasternack, 2005].

1 Einleitung

3

al., 2002]. Der Effekt der Sterilität kann durch Besprühen der Pflanzen, welche sich im Stadium

12 der Blütenentwicklung befinden, mit MeJA wieder rückgängig gemacht werden [Sanders et

al., 2000; Stintzi und Browse 2000].

Jasmonsäure reguliert die weiteren molekularen Abläufe nach Verwundung und abiotischen

Stress (Abb. 2), indem sie in die Genexpressionen eingreift, welche der Pathogen- und Insekten-

abwehr dienen.

1.1 Der Oktadekanoidweg

Die Synthese von Jasmonsäure wird über den Oktadekanoidweg bewerkstelligt. Die biologische

Funktion der einzelnen Enzyme des Oktadekanoidwegs konnte durch Mutationen der jeweiligen

Gene gezeigt werden. An der Bildung von JA sind die Enzyme LOX, AOS1, AOC, OPR3 sowie

Enzyme der β-Oxidation beteiligt.

Über den Oktadekanoidweg (Abb. 3) wird zunächst über das LOX-Enzym eine Peroxygruppe an

Position 13 gebildet, es entsteht 13-Hydroperoxylinolensäure. Diese wird mittels AOS zu einer

Epoxylgruppe umgewandelt, wobei Allenoxid entsteht. Dieses Allenoxid dient als Substrat für

AOC. AOC bildet den Pentanonring zwischen der Position 9 und 13 aus, wobei 12-

Oxophytodiensäure (OPDA) synthetisiert wird. OPR3 reduziert in einer NADPH-abhängigen

Reaktion die Doppelbindung an der Stelle 10 und 11.

Für die 12-Oxophytodiensäurereduktase gibt es je nach Pflanze unterschiedliche Anzahl der Iso-

formen, bislang sind im Reis dreizehn, in Arabidopsis fünf und in Tomate drei Typen bekannt

[Review: Schaller et al., 2005].

Die OPRs aus Tomate und OPR1,2,3 aus Arabidopsis thaliana katalysieren die Reduktion von

α,β-ungesättigten Kohlenstoffverbindungen [Schaller et al., 2000; Straßner et al., 1999]. Zu die-

ser Gruppe gehört auch die OPDA, welche das Substrat für die OPR3 ist, denn nur diese ist in

der Lage in vivo OPDA zu OPC8:0 umzusetzen [Stintzi and Browse., 2000]. Keine der anderen

Isoformen kann diese Reaktion im Oktadekanoidweg ersetzen.

Die Bedeutung der weiteren Isoformen der OPRs bleiben bislang unklar. OPR1 aus Tomate hin-

gegen ist in der Lage cis(-)-OPDA und verwandte Oxylipine umzusetzen [Strassner et al., 1999;

Breithaupt et al., 2001; Review: Schaller et al., 2005], jedoch scheint OPR3 besser in der Lage

zu sein, diese Aufgabe zu übernehmen, da sie eine breitere Öffnung zum aktiven Zentrum hat als

OPR1, so dass OPDA besser an dieses gelang. Dies würde auch erklären, warum LeOPR3 nicht

so wählerisch erscheint, was die beiden Enantiomere von OPDA angeht (cis(+) und cis(-)-

1 Einleitung

4

OPDA) [Review: Schaller et al., 2005]. Wird LeOPR3 auskristallisiert, so bildet sich ein soge-

nanntes Homodimer, wobei das Dimer als inaktive Form gilt, wobei jede das aktive Zentrum der

anderen blockiert [Breithaupt C, Clausen T, Macheroux P and Schaller A, unveröffentlicht]. Ob

diese Regulation der OPR3 jedoch

auch in der Natur (in vivo) Anwen-

dung findet bleibt indes unbekannt

[Review: Schaller et al., 2005].

Durch diese Reaktion wird OPC8:0

gebildet. Über drei Zyklen der der β-

Oxidation wird schließlich (+)-7-iso-

Jasmonsäure produziert. Diese fällt

in (-)-Jasmonsäure, welche chemisch

stabiler ist. Diese Form scheint aber

keine biologische Aktivität zu besit-

zen[Review: Schaller et al., 2005].

Die Synthese von Jasmonsäure fin-

det in verschiedenen Zellorg-anellen

statt. Bis zur Bildung von OPDA

verläuft der Oktadekanoid-weg in

den Plastiden ab (Abb. 4).

COOH

COOH

HOO

COOH

O

O

COOH

O

COOH

O

COOH

O

COOH

AOC

OPR3

AOS

LOX

3 Zyklen b-Oxidation

α-Linolensäure

13-Hydroperoxylinolensäure

(9S,13S)-12-Oxophytodiensäure (OPDA)

3-oxo-2(2'(Z)-Pentenyl)cyclopentenyl Oktansäure (OPC 8:0)

(+)-7-iso-Jasmonsäure (-)-Jasmonsäure

12,13-Epoxyoktatriensäure (Allenoxid)

3 Zyklen β-Oxidation

Abb. 3: Oktadekanoidweg nach Schaller et al., 2005

1 Einleitung

5

In Arabidopsis sind die Membranen mit Galakto-, Sulfo- und Phospholipiden besetzt. Aus ihnen

werden die primären Ausgangsstoffe Linolensäure und ihre verwandte Hexadecatriensäure

(16:3) durch Lipasen freigesetzt (Abb. 4). Somit dient als Vorstufe auch die Hexadecatriensäure

der LOX als Substrat. Bei dieser Reaktion entsteht 11-Hydroperoxy-Hexatriensäure. Die weite-

ren Schritte sind denen der zuvor beschrieben ähnlich, nur mit dem Unterschied, dass die Seiten-

kette zwei Kohlenstoffatome weniger besitzt. Aus diesem Weg entsteht dinor-OPDA (dnOPDA),

bei welcher nur noch zweimal die Seitenkettenverkürzung über die β-Oxidation ablaufen muss,

um Jasmonsäure zu bilden.

Abb. 4: Biosynthese der Jasmonsäure in ihren Zellorganellen, Farben, welche kräftig gedruckt sind experimentell nachgewiesene Daten, während die transpa-rente Hypothesen präsentieren. Die gepunkteten Pfeile weisen auf Hypotheti-schen Transporte weg hin. [aus Schaller, et al., 2005]

1 Einleitung

6

Wie auch aus Abb. 5 ersichtlich gibt es noch eine weitere Quelle von OPDA. So kann OPDA

auch aus dem, sich in den Membranen der Chloroplasten von Arabidopsis, befindlichen Mole-

küls Monogalaktosyldiacylglycerol (MGDG-O) (Abb. 5) abgespalten werden. MGDG-O ist an

der sn1-Stelle mit OPDA verestert, welche bei Bedarf ebenfalls freigesetzt werden kann. Stel-

mach et al. (2001) zeigten, dass durch eine sn1-spezifische Lipase, welche von einem pathoge-

nen Pilz stammt, OPDA direkt abgetrennt werden kann. Diese Lipase könnte somit ein Reporter

für Pilzbefall sein.

Über 18O-markiertes OPDA konnten Vick und Zimmermann 1983 zeigen [Review: Schaller et

al., 2005], dass die Bildung von Jasmonsäure über drei β-Oxidationsschritte laufen muss. Denn

sie fanden zwei markierte Zwischenstufen, diese bestanden aus 16 bzw. 14 Kohlenstoffatomen,

sie waren jeweils an der Acylkette um zwei bzw. vier Kohlenstoffatome verkürzt. An der β-

Oxidation in Peroxysomen sind drei Enzyme beteiligt: Acyl-CoA-Oxidase (ACX), das multi-

funktionale Protein (MFP) � dieses beinhaltet die l-3-Hydroxyacyl-CoA Hydrolyase, l-3-

Hydroxyacyl-dehydrogenase, d-3-Hydroxyacyl-CoA-Epimerase und die Delta(3), Delta(2)-

enoyl-CoA-Isomerase [Richmond und Bleecker 1999] � und das L-3-Ketoacyl-CoA-Thiolase

(KAT). Alle diese Enzyme katalysieren das Abschneiden von Acetatuntereinheiten von Acyl-

CoA-Gruppen. Alle Untereinheiten sind in Arabidopsis nachgewiesen [Review: Schaller et al.,

2005]. MFPs haben keine besondere Substratspezifität, im Gegensatz zu den vier in Arabidopsis

bekannten ACX-Untertypen.

Abb. 5: MGDG-O und OPDA

OH

OH

OH

OH

O

OH

CH2

CH

CH2 O C

O C

O

O

O COOH

O

OPDA

1 Einleitung

7

1.2 Der Wundsignalweg – die Wundsignaltransduktion

Bis heute sind mehr als hundert verschiedene Pflanzenarten bekannt, welche auf Verwundung

mit systemischen Signalen reagieren. Diese Signale sind von chemischer Natur. Sie werden als

Reaktion auf Verwundung in Blättern produziert und über den das pflanzliche System in den

gesamten Organismus transportiert [Karban und Baldwin, 1997]. Zu den Verwundungen zählen

nicht nur mechanische sondern vielmehr auch die, welche von herbivoren Insekten und manchen

Pathogenen ausgehen [Pautot et al., 1993; Staswick et al., 1999].

Mit am besten ist die Signalkaskade, welche sich nach einer Verwundung anschließt, in Solana-

ceen untersucht.

Wird eine Pflanze von Insekten attakiert und angefressen, so kommt es in Tomate zur Bildung

von Systemin, einem 18 Aminosäure langen Oligopeptid [Pearce et al., 1991]. Dieses wird von

seinem aus etwa 200 Aminosäuren bestehenden Vorläuferprotein �Prosystemin� abgespalten

[McGurl et al., 1992; Ryan 2000].

Systemin geht nach seiner Freisetzung eine Bindung mit seinem Membranrezeptor SR160

[Meindl et al., 1998; Scheer et al., 1999] ein und aktiviert somit in einem bis jetzt unbekannten

Prozess eine Lipase, welche zur Entlassung von α-Linolensäure aus der Zellmembran führt.

Abb. 6: Signalkaskade nach (herbivorer) Verwundung zur Bildung von Jasmonsäure und schließlich auch von Ab-wehrgenen. Mit Oktadekanoidweg, welcher zur Bildung von Jasmonsäure führt.

1 Einleitung

8

Durch den Oktadekanoidweg wird dann Jasmonsäure gebildet (Abb. 3 & 6), JA löst schließlich

die Induktion von Abwehrgenen aus (Abb. 6).

Die Tatsache, dass Systemin im Signalweg einer Verwundung eine Rolle spielt, wurde mit Hilfe

einer Pflanze gezeigt, bei welcher Prosystemin über einen Antisense-Ansatz ausgeschalten wur-

de. Diese Pflanzen waren nicht in der Lage, systemische Wundreaktionen auszulösen [McGurl et

al., 1992; Narvaez-Vasquez et al., 1994]. Wird aber die Regulation von Systemin unter einen

konstitutiven Promotor (z. B. der 35S-CaMV-Promotor) gestellt, so bilden diese Pflanzen stän-

dig PIs [McGurl et al., 1994].

Mittels Pfropfungsuntersuchungen wurde festgestellt, dass ein durch Verwundung induziertes

Signal sich über die gesamte Pflanze erstreckt und dieses zusätzlich durch die Pfropfungsstelle

hindurch geleitet wird. Bewiesen wurde dies durch die Feststellung, dass sich PIs, Polyphenol-

oxidasen (PPOs) und andere Oxidasegene im Pfröpfling bildeten [Ryan und Moura, 2002]

Interessant ist, dass Systemin ein transportiertes Signal sein könnte, denn wurde Systemin wel-

ches radioaktiv markiert wurde auf die Wunde aufgetragen, so fand man es kurze Zeit später im

Phloem wieder [Pearce et al., 1991; McGurl et al., 1992].

Systemin könnte aber auch nur an der Bildung eines mobilen Signals beteiligt sein, dies schließt

diesen Pfropfungsversuch nicht aus, bei welchem die Überexpression von Prosystemin im Wur-

zelstock lokalisiert war und der Wildtyppfröpfling eine erhöhte Menge an PIs zeigte, ohne dass

hier eine Verwundung stattgefunden hatte [McGurl et al., 1994].

Je nach Lage der Mutation im Oktadekanoidweg haben die sind die Pflanzen gegen Pathogene

und Insekten resistent. Zu diesen Mutanten gehören die Arabidopsis Triplemutante fad3, fad7

und fad8 (fad378) [McConn and Browse, 1996] und aus Tabak, Nicotiana atenuata, NaLOX

[Halitschke und Baldwin, 2003], und die Arabidopsis aos-Mutante [Stintzi, unveröffentlicht].

Die fad378-Mutante zeigt einen Defekt in der Bildung von Desaturasen. Diese sind nötig, um die

ungesättigten Fettsäuren 16:3 und 18:3 aus 16:2 und 18:2 zu produzieren. Diese gelten als Vor-

stufe in der Erzeugung von Jasmonsäure. Diese Mutante zeigt eine Anfälligkeit gegen Insekten-

fraß [McConn et al., 1997] sowie gegen Pilzbefall durch Pythium mastophorum [Vijayan et al.,

1998].

In Tomate ist lediglich eine Mutante (spr2) charakterisiert, welche mit der Triplemutante fad378

verwandt ist. Sie kodiert für die Fettsäuredesaturase LeFad7. Sie gehört zu den ω3-Fettsäurende-

saturasen, welche die Umsetzung von Dien- (zweifach ungesättigt) zu Trienfettsäuren (dreifach

ungesättigt) in Chloroplasten über den sogenannten prokaryotischen und den eukaryotischen

Weg katalysieren; [Browse und Somerville, 1991; Wallis und Browse, 2002; Li et al., 2003],

somit fehlt den Pflanzen ein wichtiger Ausgangsstoff für Jasmonate � nämlich die Fettsäuren

1 Einleitung

9

16:3 und 18:3. Wie die Dreifachmutante in Arabidopsis zeigt auch die LeFad7 eine Anfälligkeit

gegenüber Fraßfeinden (Manduca sexta). Im Vergleich zum Wildtyp war sie nicht in der Lage,

Proteinaseinhibitoren zu bilden [Li et al., 2003].

Die NaLox-Mutante war gegen den Fraß von Raupen des Tabakschwärmers (Manduca sexta)

anfällig und zeigte somit eine verminderte Resistenz [Halitschke und Baldwin, 2003].

Die aos-Mutante in Arabidopsis ist nicht in der Lage OPDA und Jasmonsäure nach Verwundung

zu bilden [Park et al., 2002]. Sie besitzt eine verminderte Resistenz gegen Insekten [A. Stintzi,

unveröffentlicht], AOS scheint darüber hinaus einen Einfluss auf die Induktion von Jasmonsäu-

re-abhängigen Genen zu haben [Park et al., 2002].

In Tomatenpflanzen wird Allenoxidcyclase (AOC) in Leitbündeln gebildet [Hause et al., 2003b;

Stenzel et al., 2003], wie AOS ist es ebenfalls wundinduzierbar. Nach exogener Gabe von JA

wird die Produktion von AOC � wie AOS � hochreguliert, dies bestätigt die Rückkopplung der

Jasmonsäure und ihre eigene Expression durch sich selbst. Dies dient der Pflanze der erhöhten

Bildung von Abwehrgenen [Ryan und Moura, 2002; Stenzel et al., 2003].

Die opr3-Mutante, welche in der Lage ist OPDA, jedoch nicht JA zu bilden, ist gegen die Larven

der Trauermücke (Bradysia impatiens) und dem Pilz Alternaria brassicicola resistent [Stintzi et

al., 2001]. Dies würde bedeuten, dass OPDA Jasmonsäure zu einem gewissen Maß in der Wund-

antwort/Pathogenabwehr ersetzen kann. So wurde herausgefunden, dass OPDA in der Lage ist

Gene zu aktivieren, welche für die JA-Antwort von Wichtigkeit sind [Stintzi et al., 2001; Mithö-

fer et al., 2005].

Eine mögliche Aufgabe von OPR1 und OPR2 könnte die Detoxifikation von Reaktiven Sauer-

stoffarten sein, so wurden eine Induktion der Bildung dieser beiden Untertypen nach entspre-

chender Behandlung in Arabidopsis nachgewiesen [Review: Schaller et al., 2005].

Die acx1-Mutante in Tomaten sind anfällig gegen Herbivorie. Diese Mutante synthetisiert den

ersten Schritt der β-Oxidation des Oktadekanoidwegs.

1 Einleitung

10

1.3 Der Oktadekanoidweg während der Blütenentwicklung

Die fad378-Mutante in Arabidopsis weist eine Infertilität auf, diese kann durch zuführen von α-

Linolensäure wieder hergestellt werden [McConn und Browse, 1996].

Wie bereits erwähnt hat der Oktadekanoidweg und JA einen Einfluss auf die Blütenentwicklung.

So konnte über AOS::uidA (uidA ist ein Reportergen, welches zur Lokalisation der Genexpressi-

on verwendet wird, indem man es mit dem entsprechenden Promotor (in diesem Fall für AOS),

fusioniert.) gezeigt werden, dass eine GUS-Expression von AOS in frühen Stadien der Karpelle-

nentwicklung, an der Basis der elongierten Antherenfilamente und im reifenden Pollen [Ku-

bigsteltig et al., 1999] zu finden war. Diese Expression zeigt auch, dass Jasmonsäure in der Blü-

tenentwicklung [Hause et al., 2000] benötigt wird.

In Tomaten ist AOS im Stroma der nach innen gefalteten Chloroplastenmembran lokalisiert

[Fröhlich et al., 2001]. AOS ist in vielen Pflanzen wundinduzierbar, des weiteren kann es durch

exogene Gabe von Jasmonsäure und OPDA hochreguliert werden. Dies bestätigt das Vorhanden-

sein einer positiven Rückmeldeschleife, welche die Bildung von Jasmonsäure nach Verwundung

steigert [Harms et al., 1998; Laudert und Weiler 1998; Maucher et al., 2000; Strassner et al.,

2002; Review: Schaller et al., 2005].

In Blüten konnte nicht die selbe Menge an JA bestimmt werden wie in anderen Geweben, daraus

wird geschlossen, dass Jasmonsäure in verschiedenen pflanzlichen Organen unterschiedlich re-

guliert wird [Review: Schaller et al., 2005].

wild type opr3wild typewild type opr3opr3

Abb. 7: Blüte von Arabidopsis im Stadium 13 der Blü-tenentwicklung (oben) und Pollenkeimung (unten), imVergleich von Wildtyp (links) zu opr3-Mutante (rechts).(Bilder freundlicher Weise von Annick Stintzi zur Ver-fügung gestellt)

1 Einleitung

11

Auf Jasmonsäure sprechen nur die Blütenknospen der opr3-Mutanten an, welche sich nicht wei-

ter als Stadium 12 entwickeln, bzw. in diesem arretiert sind. Die in situ-Analysen sowie die

Transkriptanalyse von OPR3 zeigte, dass das Gen im Stempel, den Kelchblättern und an der Ba-

sis der Filamente von Antheren zu finden war. Das Gen fand sich wesentlich früher als das für

die Filamentverlängerung notwendige Entwicklungsprogramm angeschalten wurde [Sanders et

al., 2000] (Abb. 7).

In Tomate hingegen zeigt sich kein Einfluss der Fertilität, bei einer Mutation in acx1. Jedoch

wurde beobachtet, dass die Keimfähigkeit der Samen sehr variabel war. Es wird vermutet, dass

acx1-Pflanzen in der Lage sind Jasmonsäure zu produzieren, so dass die Fertilität nicht beein-

trächtigt ist, dies würde bedeuteten, dass die anderen Isoformen von acx die Biosynthese von

Jasmonaten übernehmen können, so dass das Ausreifen der reproduktiven Gewebe stattfinden

kann [Li et al., 2005].

In Arabidopsis bewirkt Jasmonsäure die Entwicklung des männlichen Gametophyten. Dies be-

deutet, dass die Filamente der Antheren verlängert werden und das Stomium sich öffnet, so dass

die Pollen, welche ebenfalls mit Hilfe von Jasmonsäure zu ihrer trinuklearen reifen Form heran-

reifen, auf den Stempel gelangen können. Wird dennoch Pollen freigesetzt, so besitzt dieser eine

stark verminderte Keimfähigkeit [McConn und Browse 1996; Sanders et al., 2000; Stintzi und

Browse 2000; Ishiguro et al., 2001; Park et al., 2002; von Malek et al., 2002] (Abb. 7).

1 Einleitung

12

1.4 Die Erkennung der Jasmonsäure

In der JA-Signaltransduktionskaskade ist COI1 involviert.

Die coi1-Mutante in Arabidopsis ist nicht in der Lage auf Pathogenbefall zu reagieren, außerdem

lässt sich dieser Effekt durch exogene Gabe von Jasmonsäure bzw. Methyljasmonsäure nicht

rückgängig machen, da die coi1-Mutante gegen Jasmonsäure und � wie der Name sagt � Corona-

tin insensitiv ist. Coronatin ist ein Toxin aus Pseudomonas syringae und ein Strukturanalogon

von Jasmonsäure. Das Toxin hat eine chlorosesinduzierende Wirkung und hat zur Folge, dass

Anthocyane in der Pflanze akkumuliert werden. Wie opr3 zeigt auch coi1 in Arabidopsis eine

starke Beeinflussung der Antheren- und Pollenentwicklung [Feys et al., 1994].

Die Mutanten jin und jar1 (in Arabidopsis) sind ebenfalls Mutanten, welche wie coi1

downstream von Jasmonsäure ihren Defekt haben und zeigen bei einer erhöhten Gabe von MeJA

kein auffällig vermindertes Wachstum der Wurzeln im Vergleich zum Wildtyp [Berger et al.,

1996]. Dies bedeutet, dass die Perzeption von Jasmonsäure gehemmt ist. Interessant ist, dass

diese Mutanten keine Probleme mit der Fertilität haben. Dies bedeutet, dass der Signalweg von

Jasmonsäure in zwei verschiedene Wege aufgespalten sein muss, ein Weg führt zur Expression

von Stressgenen und ein weiterer in die der Fertilität [Xiao et al., 2004] (Abb. 8).

COI1 ist in Arabidopsis ein Protein, welches aus 592 Aminosäuren besteht, und am N-Terminus

eine F-Box und eine 16 Leucin-reiche-Region (LRR) hat. In Pflanzen bilden diese mit Cullin,

RBX1, den Skp1-like Proteinen ASK1 oder ASK2 (eine E3-Ubiquitinligase) einen Komplex,

welcher in seiner Gesamtheit SCFCOI1-Komplex genannt wird [Turner et al., 2002; Xu et al.,

2002, Xiao et al., 2004]. Der Komplex ist ein �Hilfsmittel� welches ermöglicht spezifisch be-

stimmte Substrate, z. B. negative Regulatoren zu ubiquitinylieren und schließlich über das 26S-

Abb. 8: Signaltransduktionskaskade von Jasmonsäure, im Wt (links) und coi1(rechts). Die beiden Substratgruppen (S1 und S2) werden durch das JA-Signal,welches den SCFCOI-Komplex aktiviert, ubiquitinyliert und schließlich über das26S-Proteasom abgebaut. Die beiden Antwortgene (G1 und G2) bilden schließlichdie entsprechenden Antworten (Response I und II) (aus Xiao et al., 2004)

1 Einleitung

13

Proteasom abzubauen. [Xu et al., 2002]. Coi1 ist nicht mehr in der Lage diesen Komplex zu bil-

den, dies hat zur Folge, dass negative Regulatoren über das 26S-Proteasom nicht mehr abgebaut

werden können. Im Modell der in Abbildung 8 gezeigten Signalkaskade könnten die Substrate

S1 und S2 die negativen Regulatoren darstellen. Dies hätte zur Folge, dass die Antwort auf Jas-

monsäure ausfällt [Turner et al., 2002; Xu et al., 2002]. Es wird angenommen, dass diese

Signaltransduktion einmal in Richtung der Fertilität, nämlich der Entwicklung des männlichen

Gametophyten und das zweite Mal die Antwort in Richtung der Wundantwort aufgespalten wird.

Die Annahme, es könnte zwei Substrate für COI1 geben, rührt daher, da über EMS-Mutation

eine Mutante gefunden wurde, welche ein Suppressor für coi1 (COS1) darstellt. Diese Mutante

reagiert auf exogene Gabe von Jasmonsäure oder Coronatin mit einem vermindertem Wurzel-

wachstum, was wiederum dem Wildtyp entspricht, jedoch männlich steril bleibt [Xiao et al.,

2004].

Das für Arabidopsis beschriebene Modell kann wohl auch � wenn auch nur zum Teil � auf To-

mate übertragen werden. So beschrieben Li et al., 2004 eine Mutante, welche Jasmonsäure in-

sensitiv (jai1) war. Diese Mutante wird als Homolog zur Arabidopsis-coi1-Mutante angesehen.

Die beschriebene Mutante zeigte, wie aus deren Namen bereits hervorgeht, genau wie coi1 in

Arabidopsis, keine Reaktion auf exogene Jasmonsäure. Ihr Wurzelwachstum entsprach dem des

Wildtyps ohne MeJA. Im Gegensatz zu Arabidopsis weist die jai1 Mutante in Tomate keine

männliche Sterilität auf, der Pollen keimt zwar etwas schlechter als im Wildtyp, doch trotz einer

verminderten Entwicklungsfähigkeit des Pollens, ist jai1 nicht männlich steril, der Defekt lag

vielmehr im weiblichen Gametophyten. Die reifen Früchte enthielten kleine Samen, welche un-

entwickelt waren und ein geringeres Gewicht als Wildtypsamen hatten. Dass der weibliche Ga-

metophyt einen Defekt zu haben scheint, wurde damit gezeigt, dass in den Blüten von jai1, im

Gegensatz zu Wildtypblüten, welche in einem ähnlichen Entwicklungsstand waren, keine Protei-

naseinhibitorbildung nachzuweisen waren. Mit Spinnmilben unternommene Versuche, bei wel-

chen sich die Tiere zwischen Blättern von Wildtyp und Mutantenpflanzen entscheiden mussten

zeigten, dass diese Tiere sich lieber auf die Blätter der mutierten Pflanze setzten.

Außerdem konnte in der jai1-Mutante keine Bildung von Monoterpenen in unreifen Früchten

nachgewiesen werden. Dies bestätigte die zuvor gemachte Beobachtung, dass Trichome, welche

im Wildtyp diese Terpene bilden, nicht vorhanden waren. Jai1 zeigt auch keine Induktion von

Genen, welche nach der Produktion von Jasmonsäure eine Rolle spielen (s. später) [Li et al.,

2004].

Das LeCOI-Protein wies wie das aus Arabidopsis und Reis eine N-Terminale F-Box und eine

LRR (Leucin Rich Repeat) auf, welche sich ebenfalls 16 mal wiederholte. Ein durch EMS krei-

ertes Allel von jai1 (jai1-2) wurde als Suppressor von jai1-1 erkannt. Es ist ebenfalls nicht in der

1 Einleitung

14

Lage auf JA zu reagieren, jedoch zeigt diese Mutante die Möglichkeit der Akkumulation von

Proteinaseinhibitoren [Li et al., 2004].

1.5 Durch Verwundung induzierbare Gene Strassner et al. zeigten 2002, mittels cDNA-Microarray-Analyse (Abb. 9) , welche Gene in To-

mate nach einer Verwundung angeschalten werden.

Nach Verwundung kommt es in den verwundeten Blättern zur Bildung und Akkumulation der

Transkripte, welche am Oktadekanoidweg beteiligt sind (LOXD, AOS1, AOC und OPR3) (Abb.

9 linke Seite). Werden systemische und verwundete Blätter einer Pflanze miteinander verglichen,

wird eine höhere Konzentration dieser Transkripte in den lokalen Blättern gefunden. Die

Konzentrationen der Abwehrgene ist jedoch in den systemischen und verwundeten Blättern

annähernd die Gleiche. Die Bildung von Jasmonsäure war lokal höher, als systemisch.

Hieraus wird geschlossen, dass Jasmonsäure ein transportiertes Signal der Wundreaktion ist.

Aromatische Aminosäuren spielen in der Stressreaktion ebenfalls eine Rolle, somit wurden auch

diese ebenfalls auf ihren Gehalt untersucht. Nach Verwundung zeigten diese jedoch sowohl im

Vergleich Verwundet/Kontrolle als auch im Vergleich Systemisch/Verwundet keine signifikante

Expressionsänderung.

1 Einleitung

15

Abb. 9: Microarray-Analyse. Links, Vergleich von verwundeten (W) und unverwunde-ten (C=Controle) Blättern (! W/C). Rechts, das Verhältnis von Systemischen (S) zuVerwundeten (W) Blättern. Der obere Teil zeigt das die Gene des Oxilipinstoffwechsels,der mittlere, die der Wundantwort und die der Pathogenabhänhigen Gene, im unterenTeil sind die Gene, welche an der Bildung von aromatischen Aminosäuren benötigtwerden gezeigt [aus Strassner et al., 2002].

1 Einleitung

16

1.6 Idee und Ziel der Arbeit

Von Arabidopsis wissen wir, dass alle Mutanten, welche am Biosyntheseweg der Jasmonsäure

beteiligt sind, männlich steril sind. Fehlt ihnen dazu noch OPDA, so sind sie gegen Insekten-

und Pathogenangriffe anfällig. OPDA ist somit ein Signalmolekül, welches Jasmonsäure in der

Wundantwort ersetzen kann, um Abwehrgene zu bilden.

Des weiteren ist bekannt, dass COI1 ein wichtiges Zwischenprodukt in der Signalkaskade für die

Entwicklung des männlichen Gametophyten, die Ausbildung von Wundantworten sowie für die

Zellelongation während des Wurzelwachstums ist.

Von Tomate wissen wir, dass eine Überexpression von Prosystemin zu einer erhöhten Resistenz

gegen Manduca sexta und zu einer konstitutiven Bildung von Abwehrgenen wie Proteinaseinhi-

bitoren führt.

Es wurde bereits nach Mutanten gesucht, welche nicht mehr in der Lage waren PIs als Folge

einer Verwundung zu bilden. Zu diesen Mutanten gehören die spr2-, acx- und die jai1-Mutante

[Li et al, 2002; Li et al., 2004; Li et al., 2005]. Alle drei Mutanten, einschließlich acx, welche ein

Defekt in der β-Oxidation hat, scheinen gegen Insektenattacken anfällig zu sein. Bezüglich des

Phänotyps sieht es in der Blütenentwicklung in Tomate etwas anders aus als in Arabidopsis tha-

liana, denn die acx-Mutante hat ihren Defekt in der Entwicklung des weiblichen Gametophyten;

und die jai1-Mutante, welche ein Ortholog zur coi1-Mutante in Arabidopsis darstellt ist im Ge-

gensatz zu dieser weiblich steril, und hat einen Defekt in der Trichomentwicklung. Und zu guter

letzt ist die spr2-Mutante fertil.

Eventuell gibt es in Tomate Isoformen dieser Gene, so dass die Jasmonsäuresynthese/-

Erkennung von diesen übernommen werden kann, was das Verständnis dieses Phänomens

schwierig gestaltet. Da bekannt ist, dass keine andere der Isoformen von OPR � außer der OPR3

� an der Bildung von Jasmonsäure beteiligt sind, wäre eine opr3-Mutante in Tomate sehr gut

geeignet, um die Wirkungen von OPDA, bzw. Jasmonsäure in Tomate zu charakterisieren. Der

Schritt von OPDA zu OPC8:0 kann eine opr3-RNAi-Pflanze nicht bewältigen, was zur Folge

hat, dass ihr schließlich Jasmonsäure fehlt.

Das Ziel der Arbeit ist somit die molekulare und phänotypische Charakterisierung einer Toma-

tenpflanze, welcher mittels RNA-Interferenz die 12-Oxophytodiensäurereduktase 3 (OPR3) still-

gelegt wurde.

2 Material und Methoden

17


2.1 Organismen

2.1.1 Pflanzliches Material

Lycopersicon esculentum cv. UC82B ROYAL SLUIS (Holland)

Lycopersicon esculentum cv. UC82B mit einem OPR3-RNAi-Konstrukt transformiert

2.2 Oligonukleotide

OPR3-Primer (69) cccgggggatccgaattctaatgcctgatggaactcatggg

FAD2.fw ctctcttgaatcgttaccac

FAD2.rev ggagtataagcagatctatc

2.3 Puffer und Lösungen

DNA-Extraktion

DEX-Puffer (Stammlösung) 0,14 M Sorbit

0,22 M Tris-HCl, pH 8,0

(Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan)

0,222 M EDTA

(Ethylendiamintetraessigsäure)

0,8 M NaCl

0,8 % CTAB

(Cetyltrimethylammoniumbromid)

1 % Sarcosine

zur Stammlösung werden 20µl β−Μercaptoethanol pro Milliliter DEX hinzugegeben (kurz vor

der Extraktion)

Phenol Roti®�Phenol (Redestilliertes, in TE-Puffer


18

äquilibriertes Phenol; Roth, Karlsruhe)

Chloroform/ Isoamylalkohol 24:1 (v/v)

PCR-Puffer (5 x) 15 mM MgCl2

100 mM (NH4)2SO4

0,08 % Triton

20 % DMSO

250 mM KCl

50 mM Tris/HCl pH 8,3

0,4 % Tween 20

mit H2 O auf 100 ml auffüllen

Gelelektrophorese

50 x TAE-Puffer 2M Tris HCl

57,1 ml Essigsäure

100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0

mit H2O auf 1 l aufgefüllt

Nach dem verdünnen der 50x Lösung wurden 14µg/l

EtBr (Ethidiumbromid) hinzugegeben.

10 x Ladepuffer 50 % Glycerin

1 mM EDTA

1 Spatelspitze Bromphenolblau

autoklavieren (20 min), bei RT aufbewahren

1 % Agarosegel 2g Agarose in 200 ml 1 x TAE- Puffer

1 kB DNA Leiter : 0.5 µg/µl, 3-5 µl (Fermentas)

Proteinextraktion

Protein-Extraktionspuffer (5 x) 500 mM NaCl

250 mM Tris/HCl pH 7,5


19

2,5 % (v/v) Triton X-100

50 mM β-Mercaptoethanol

10 µl/ml Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma-

Aldrich, Steinheim), frisch zugesetzt

Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE) und Wes-tern-Blot

Trenngelpuffer (4 x) 1,5 M Tris/HCl pH 8,8

0,4 % (w/v) SDS (Sodiumdodecylsulfat)

Sammelgelpuffer (4 x) 0,5 M Tris/ HCl pH 6,8

0,4 % (w/v) SDS

APS 10 % 10 % (w/v) Ammoniumperoxidisulfat in H2O

Trenngel 12 %ig, für 2 Gele (1,5 mm) 5,4 ml Acrylamid-Stammlösung (rotiphorese®

Gel 40, Roth (Acrylamid : Bisacrylamid = 19 : 1))

4,5 ml Trenngelpuffer

8,1 ml H2O

60 µl APS 10 %

13,5 µl TEMED (Tetramethyläthylendiamin)

Komponenten mischen, ca. 2/3 hoch in

Gelkassetten gießen, mit H2O überschichten,

polymerisieren lassen (ca. 30 min)

Sammelgel 4,5 %ig, für 2 Gele (1,5 mm) 0,75 ml Acrylamid-Stammlösung

1,7 ml Sammelgelpuffer

4,25 ml H2O

20 µl APS 10 %

12 µl TEMED

Wasser von festem Trenngel entfernen,


20

Sammelgel auf Trenngel gießen, Taschenkamm

(10 oder 15 Taschen) einschieben,

polymerisieren lassen (ca. 30 min)

SDS PAGE-Puffer (Laufpuffer) 50 mM Tris/HCl pH 8,3

384 mM Glycin

0,1 % (w/v) SDS

SDS Probenpuffer (4 x) 200 mM Tris/HCl pH 6,8

400 mM Dithiothreit

8 % (w/v) SDS

0,4 % (w/v) Bromphenolblau

40 % (v/v) Glycerin

aufbewahrt bei -22°C

Kathodenlösung 40 mM 6-Aminohexansäure

20 % (v/v) Methanol

Anodenlösung 1 0,3 M Tris/HCl pH 10,4

20 % (v/v) Methanol

Anodenlösung 2 25 mM Tris/HCl pH 10,4

20 % (v/v) Methanol

TBS (Tris-Buffered Saline, 25 mM Tris) 137 mM NaCl

2,68 mM KCl

3 g Tris

in 800 ml H2O lösen, pH auf 7,4 einstellen,

mit H2 O auf 1 l auffüllen

(20x konzentriert hergestellt)

TBS/Tween 0,1 % (v/v) Tween® 20 in TBS

Blockierungslösung 6 % (w/v) Magermilchpulver in TBS Tween

Primärer Antikörper Anti-LeOPR3 Rabbit Polyklonaler Antikörper


21

sekundärer Antikörper Anti-Rabbit IgG, Heavy and Light Chain (Goat),

Peroxidase Conjugate (Calbiochem, Darmstadt)

ECL-Lösung SuperSignal® West Dura Extended Duration Sub-

strate (Pierce, Rockford)

RNA-Extraktion

Extraktionspuffer (Stammlösung) 5 M NaCl

1 M Tris-HCl pH 8.0

0,5 M EDTA

pro 25ml Stammlösung wird vor Extraktion 1,8 ml β-Mercaptoethanol

2,5 ml 10 % (w/v) SDS hinzugefügt

PCIphenol 50 ml Phenol

24 ml Chloroform

1 ml Isoamylalkohol

Spatelspitze 8-Hydroxychinolin

PCI 50 ml Phenol

48 ml Chloroform

2 ml Isoamylalkohol

Spatelspitze 8-Hydroxychinolin

außerdem 10 M LiCl

3 M Natriumacetat pH 4.8


22

Northern Blot

Gelpuffer

10x MOPS (500 ml) 0,4 M MOPS

(4-Morpholinpropansulfonsäure) 100 mM Natriumacetat

10 mM EDTA

mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt

autoklaviert

Ladepuffer (1 ml) 50 % Glycerin

1 mM EDTA

0,03 % Bromphenolblau

autoklaviert

20x SSC 3 M NaCl

(Salt-Sodium-Citrat) 0,3 M NaCitrat-Dihydtrat

800 ml ddH2O

mit 10M NaOH auf pH 7,0 eingestellt

Formaldehydgel 1,56 g Agarose (1,2 %)

93,6 ml ddH2O

erhitzt

13 ml 10x Gelpuffer

23,4 ml Formaldehyd

RNA-Proben 5,5 µl RNA + steriles ddH2O

1 µl 10x Gelpuffer

3,5 µl Formaldehyd

10 µl Formamid

für 15 min auf 65 °C erhitzt,

auf Eis abgeschreckt, zentrifugiert

2 µl Ladepuffer

0,2 µl EtBr


23

50 x Denhardt�s 5 g Ficoll

5 g Polyvinylpyrrolidon

5 g Rinderserumalbumin (BSA)

mit ddH20 auf 500 ml

Hybridisierungslösung 50 % Formamid

5x SSC

50 mM KPP pH 7.0

2x Denhardt�s

sss DNA 100 µg/ml

0,5 % SDS

Lösung 1 1x SSC

0,2 % SDS

Lösung 2 0,2 SSC

0,5 % SDS

2.4 Sonstige Puffer, Lösungen, Materialien

TechnoVit 7100 Firma Heraeus Kulzer GmbH & Co KG

2:1 Ethanol/TechnoVit 7100 (v/v)



Fuchsin-Safranin-Astrablaufärbung

(FSA-Verfahren) nach Etzold

Stammlösung 1: 1 g Astrablau in 50 ml ddH2O

Stammlösung 2: 1 g Safranin in 50 ml ddH2O

Stammlösung 3: 1 g basisches Fuchsin in 50 ml ddH2O

Endgültige gebrauchsfertige Lösung: 2 ml Eisessig in 100 ml ddH2O


24

5-10 ml der Stammlösungen 1-3 hinzugeben. in ei-

nem verschlossenen Gefäß ist diese Lösung mehrere

Jahre haltbar.

2.5 Medien und Stammlösungen

2.5.1 Stammlösungen Antibiotika

Kanamycin (Duchefa) 35/50/75/100 mg/ml in H2O, sterilfiltriert,

Lagerung -22°C

2.5.2 Medien

Antibiotika-Konzentrationen Kanamycin 50 µg/ml (LB-Medium)

35/50/100 µg/ml (Selektionsmed.)

75 µg/ml (NoverKan 3 % Sac)

MS-Medium 2,2 g/l MS (Murashige & Skoog Medium incl. Vitamins, Duchefa)

pH mit KOH auf 5,7 einstellen

3 % Saccharose

0,8 % Agar

autoklavieren (20 min)

Pollenkeimungsmedium 10 % Sacherose

100 mg/l Borsäure

300 mg/l Calciumnitrat

200 mg/l Magnesiumsulfat

100 mg/l Kaliumchlorid

0,6 % Agar

pH: 5.5


25

2.6 Enzyme

Taq-DNA-Polymerase peqlab, Erlangen

2.7. Methoden

2.7.1 DNA-Isolation aus Pflanzenmaterial

Etwa 10 mg Blattmaterial wird in einem beschrifteten Eppendorfgefäß in flüssigem Stickstoff

schockgefroren. Das gefrorene Material wird mit Hilfe eines zuvor kurz in Stickstoff gehaltenen

Plastikpistills zu einem feinen Puder zerkleinert. 100µl DEX+ 0,02µl β−Mercaptoethanol wer-

den dem Pulver hinzugeben und bis zum Tauen weitergemörsert. Anschließend wird 100µl

Chloroform hinzupipettiert und 10 Sekunden gemischt. Die Probe wird auf Eis gestellt, bis wei-

tere Proben hinzugekommen sind. Diese werden für 30 min bei 65°C inkubiert. Im Anschluss

wird abzentrifugiert und die obere wässrige Phase in ein frisches Eppendorfgefäß pipettiert. Die

DNA wird mit 100µl Isopropanol bei Raumtemperatur gefällt und wieder bei 15000 g für 5 min

zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das erhaltene Pellet mit 70 % Ethanol gewa-

schen. Der Alkohol wird abgenommen., das Pellet wird entweder im SpeedVac oder bei Raum-

temperatur getrocknet und anschließend in 30µl sterilem Wasser oder TE gelöst.

2.7.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Die PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 25µl durchgeführt, die Template DNA wurde in

unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt, die Ansätze enthielten 1µl der gelösten DNA, 5µl

5X PCR-Puffer, 0,5µl dNTPs (10 mM), je 0,5µl forward und reverse Primer (10µM), 0,5 µl Taq-

DNA-Polymerase (5U/µl) und 16,5 µl sterilfiltriertem doppelt destillierten H2O. Die Zyklen des

PCR-Programms: zunächst 95°C für 5 min, anschließend 29 Zyklen mit 95°C für 30 s, 58°C für

50 s und 72°C für 1:30 min. Abschließend 72°C für 10 min und Abkühlung auf 10°C.


26

2.7.3 Auftrennung und Sichtbarmachung der DNA

Die DNA wurde mit einem 1 %igen TAE-Agarosegel, mit einem µl 1 % Ethidiumbromidlösung,

bei 80 bis 120V (je nach Größe des Gels) in TAE-Pufferlösung aufgetrennt.

Die Proben wurden vor dem Auftragen mit 10 % (v/v) 10x Ladepuffer versetzt. Als Größenstan-

dard wurden 2µg 1 kb DNA-Ladder (GeneRuler� DNA ladder, Fermentas) aufgetragen. Die

RNA wurde nach dem Auftrennen unter UV-Licht sichtbargemacht und durch Fotos dokumen-

tiert.

2.7.4 Isolierung von Proteinen aus Blattmaterial von Tomaten

Frisches oder in flüssigem Stickstoff schockgefrorenes Material wird in einem 1,5 ml Eppen-

dorfgefäß mit einem gekühlten Plastikpistill zu einem feinen Puder gemörsert. 300µl des kalten

Extraktionspuffers hinzugegeben. Zelluläre Bestandteile wurden durch Zentrifugation (15 000 g

bei 4°C 5 min) entfernt.

Für die Messung der Konzentration wurden 2µl des gewonnen Rohextrakts auf 800µl mit steril-

filtriertem ddH2O aufgefüllt und 200µl Protein Assay (Bradford Reagenz, Bio-Rad) versetzt und

15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proteinkonzentration wurde bei 595 nm gegen BSA

(Rinderserumalbumin Fraktion V, Roth Karlsruhe) als Standard ermittelt.

2.7.5 Entfernung sämtlicher Kontaminationen des Proteinextrakts

Diese Methode entfernt alle Kontaminationen im Proteinextrakt, wie Lipide der Membranen,

Detergenzien, etc. Nach der Behandlung verlieren die Proteine ihre Aktivität, können aber durch

diese Methode aufkonzentriert werden. Proteinextrakte, welche zuvor auf eine einheitliche Kon-

zentration eingestellt wurden, werden auf das gleiche Volumen aufgefüllt. Im Falle eines 200µl

Volumens wurden 480µl Methanol und 160µl Chloroform zu dieser Probe hinzugeben. Dieses

Gemisch wurde gründlich gemischt. Als nächstes wurde 640µl H2O dazupipettiert, wieder ver-

mischt abzentrifugiert und die obere Phase in ein neues Eppendorfgefäß überführt, danach wur-

den 480µl Methanol dazugegeben und abermals gemixt und 5 min abzentrifugiert. Das Pellet

wurde in 100µl 1x Proteinpuffer gelöst (Aufkonzentrierung)


27

2.7.6 Antikörperaufreinigung aus Serum

Um ein spezifisches Signal für OPR3 zu bekommen wurde der Serum mit Hilfe His6-tagged

OPR3 gereinigt. Hierzu wurde Nitrocellulose (WESTRAN CLEAR SIGNAL) in Methanol auf

eine Größe von 0,5 x 2 cm zugeschnitten und in Methanol angefeuchtet. Auf die Membran wur-

de im Überkopfschüttler bei 4°C 2,5 h, 2 ml OPR3 Protein-Lösung übertragen. Danach wurde

für eine Stunde mit Blockierungspuffer (6 % Milchpulver in TBS Tween) bei Raumtemperatur

blockiert. Nach dem Blockieren wurde die Membran 3 mal für 5 min mit TBS Tween bei Raum-

temperatur gewaschen. Im Anschluss wurde 200 µl Serum und 20 µl 1 M Tris/HCl pH 7.5 hin-

zugegeben und bei Raumtemperatur im Überkopfschüttler für 1,5 h inkubiert. Danach wurde

dreimal für drei Minuten mit TBS Tween gewaschen, anschließend noch einmal mit Wasser.

Nach dem Waschen folgte die Elution der gebundenen Antikörper mit 2 x 200 µl 100 mM Gly-

cin HCl pH 2.8 für jeweils eine Minute. Sofort im Anschluss wurde mit 1/10 Volumen 1M Tris-

HCl pH 9.0, welches in einen neuen Reaktionsgefäß vorgelegt wurde, neutralisiert. Danach wur-

de noch einmal eluiert. Die beiden Elutionen wurden vereinigt. Die aufgereinigten Antikörper

wurden in 1 mg/ml BSA (Rinderserumalbumin) und 0,02 Timerosal, das Serum mit 0,1 % NaN3

stabilisiert.

2.7.7 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE) und Western-Blot

Die auf eine gleiche Konzentration eingestellten Proteinextrakte wurden 3:1 mit SDS Probenpuf-

fer versetzt und 10 min denaturiert. Die so behandelten Extrakte wurden mit Hilfe von Acryla-

midgelen (10 % bzw. 12 %) in SDS-PAGE-Puffer bei 100 V aufgetrennt. Als Größenstandard

wurden 3 µl �Pageruler� Prestained Protein Ladder� (Fermentas) aufgetragen.

Da dieser Ansatz zweimal angesetzt wurde, wurde ein Gel auf Blotting Membranen (Westran ®

Clear Signal, Schleicher & Schuell, Dassel Rellihausen), welche auf die Größe des Gels (9 x 5,5

cm) zugeschnitten wurden, übertragen.

Das ebenfalls auf 9 x 5,5 cm zugeschnittene Blotting-Papier (NOVABLOT Elektroden-Papier,

Amersham) wurde für 10 min in den entsprechenden Puffern eingeweicht (sechs Papiere in Ka-

thodenlösung, 3 Papiere in Anodenlösung I und sechs Papiere in Anodenlösung II). Die Graphit-

elektroden wurden etwa eine Stunde in deionisiertem Wasser gewässert und abgetrocknet. Die


28

Membran wurde in Methanol getaucht und schließlich in Anodenlösung I gewässert. Die Blot-

tingapparatur wurde wie in Abb. 10 gezeigt luftblasenfrei aufgebaut.

Der elektrophoretische Transfer wurde 1,5 Stunden bei 100 mA/Blot durchgeführt. Nach diesem

Transfer wurden die Membranen für mindestens eine Stunde in Blockierungspuffer (6 % Ma-

germilchpulver in TBS/Tween) unter Schütteln abgesättigt. Anschließend wurde mit dem aufge-

reinigten primären Antikörper (anti-LeOPR3 1:800 in Blockierungspuffer) über Nacht bei 4°C

auf dem Schüttler inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Membranen dreimal für 5 min mit

TBS-Tween gewaschen.

Im Anschluss folgte die Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit dem sekundären Anti-

körper (Anti-Rabbit IgG, Heavy and Light Chain (Goat) Peroxidase Conjugate (Calbiochem,

Darmstadt), welcher 1:10 000 in Blockierungspuffer verdünnt wurde. Nach dieser Stunde wurde

wieder dreimal 5 min mit TBS/Tween gewaschen und der Blot durch SuperSignal® West Dura

Extended Duration Substrate (Pierce, Rockford) entwickelt. Hierzu wurden die beiden Kompo-

nenten 1:1 (Endvolumen 700µl) miteinander vermischt und der Blot für 5 min damit inkubiert.

Der abgetropfte Blot wird in Folie eingewickelt und in der Dunkelkammer auf Röntgenfilme

(Hyperfilm�, Amersham) belichtet.

2.7.8 RNA-Extraktion aus Blattmaterial

Etwa 400 mg Blattmaterial wird in Aluminiumfolie eingewickelt und sofort in flüssigem Stick-

stoff gefroren und bis zur Verarbeitung bei -80°C gelagert. Das Blattmaterial wird in einen mit

Abb. 10: Schematischer Aufbau der Westernblotapparatur. Aus Diplomarbeit vonDirk Zimmermann


29

flüssigem Stickstoff gefüllten Mörser gegeben und mit einem gekühlten Pistill zu einem feinen

Pulver zerrieben. Dieses Verreiben wurde nach verdampfen des Stickstoffes zweimal wiederholt.

Das durch mörsern gewonnene Pulver wurde in 750µl Extraktionspuffer (plus 1,8 ml β-

Mercaptoethanol und 2,5 ml 10 % (w/v) SDS pro 25 ml Stammlösung) aufgetaut und gemischt.

Daraufhin wird das gleiche Volumen PCIphenol hinzugegeben und gemischt. Bis zur weiter

Verarbeitung kann die Probe auf Eis aufbewahrt werden. War dies der Fall, so wurde vor der

Zentrifugation bei 10.000g, 15 min noch einmal gleichmäßig vermischt. Nach der Zentrifugation

wurde die obere wässrige Phase in ein in der Zwischenzeit mit 750µl PCI vorbereitetes 2,0 ml

Eppendorfgefäß pipettiert und im Anschluss 10 min geschüttelt. Danach wurde abermals bei

10.000g 15 min zentrifugiert. In dieser Zeit wurden wieder 2 ml Eppendorfgefäße mit 750µl PCI

vorbereitet. In diese wurde die obere wässrige Phase überführt. Nach nochmaligen 10 Minuten

schütteln wurde ein weiteres Mal bei 10.000g für 15 min zentrifugiert. Als nächstes wurde die

wässrige Phase in mit 750µl Chloroform vorbereitetes Eppendorfgefäße überführt, wieder ge-

schüttelt und zentrifugiert. In dieser Zeit wurden 1,5 ml Eppendorfgefäße beschriftet. Das Volu-

men der wässrigen Phase wurde genau bestimmt und die RNA über Nacht bei 0°C nach Zugabe

¼ des bestimmten Volumens mit LiCl gefällt.

Die Proben wurden am nächsten Morgen bei 10.000g 20 min abzentrifugiert, das erhaltene Pellet

wurde in 70 % Ethanol gewaschen. Der Alkohol wurde vorsichtig abgetropft oder pipettiert und

die RNA in 400µl sterilem doppelt destilliertem Wasser resuspendiert. Nach dem lösen der RNA

wurde diese erneut mit Hilfe von 40µl 3M NaAc und 880µl absoluten Ethanols bei -20°C für 2-3

Stunden gefällt. Die RNA wurde bei 10.000g 10 min abzentrifugiert und das Pellet mit 70 %

Ethanol gewaschen. Der Alkohol wurde wieder vorsichtig abgekippt oder pipettiert und die RNA

entweder 30 min auf Eis oder im SpeedVac getrocknet und schließlich mit 30-50µl sterilem

ddH2O gelöst. Von der gelösten RNA wurden 2µl entnommen und zu 798µl sterilem ddH2O

hinzugegeben und am Eppendorf-Photometer (Biophotometer 6131) die Konzentration be-

stimmt. Ausgehend von der am geringsten konzentrierten RNA wurde überall die gleiche Kon-

zentration eingestellt.

Zur Auftrennung der RNA wurden Platte, Kamm und Kammer in Seifenwasser eingeweicht und

gründlich gereinigt. In einem sterilen Kolben mit Rührfisch wurde für ein 1 % (w/v) Agarosegel

Agarose abgewogen. 20 ml 50x TAE wurde in 980 ml sterilem ddH2O vermischt und darin unter

aufkochen die Agarose gelöst. 5µg RNA wurden mit sterilem ddH2O auf 18µl ergänzt und 2µl

Ladepuffer hinzugegeben, danach wurden die Proben für 15 min bei 65°C denaturiert, auf Eis

abgeschreckt und auf das Gel aufgetragen, um zu überprüfen ob die RNA degradiert war.


30

2.7.9 Northern Blot

Mit Hilfe des Northern Blots wurde Akkumulation von Proteinase-Inhibitor-II-Transkript unter-

sucht.

Die auf eine gleiche Konzentration eingestellt RNA-Proben wurden auf ein 1 % TAE-

Agarosegel aufgetragen, um zu überprüfen, ob die RNA degradiert war und ob die Konzentration

die in jedem Eppendorfgefäß die Gleiche ist. Dies wurde unter UV-Licht fotografiert. Alle benö-

tigten Materialien wurden autoklaviert beziehungsweise gereinigt. Die aufgetragene RNA wurde

über 5h bei 60 V in 1x Gelpuffer aufgetrennt. Nach dem Lauf wurde das Gel zweimal für 15 min

in sterilem ddH2O und danach für die gleiche Zeit in 10x SSC gewaschen.

Der Blot wird wie folgt aufgebaut: In eine Glasschale (Auflaufform) wird 10x SSC als Transfer-

puffer gegeben. Mit einer Glasplatte wird diese Schale zum Teil abgedeckt. Über diese Abde-

ckung werden zwei Lagen Whatman 3MM gelegt die in den Transferpuffer reichen. Auf diese

Brücke wird das Gel gelegt und ringsum mit Parafilm abgedichtet. Darauf folgt die Nitrocellulo-

semembran (Schleicher), welche zuvor in Wasser und dann in 10x SSC angefeuchtet wurde. Drei

Lagen Whatman 3MM Papier wurden in der Größe des Gels und der Nitrocellulose auf die Nit-

rocellulose gelegt und mit einer Vollpipette die Luftblasen �ausgewellt�. Auf diesen Aufbau

wurde noch ein Stapel Papiertücher (ebenfalls in der Größe des Gels) aufgelegt und mit einem

Gewicht von etwa 200 g beschwert. Der Transfer fand über Nacht statt.

Nach der Übertragung wurde der Blot in 2x SSC gewaschen und auf ein zuvor vorbereitetes

�Kuvert� aus Whatman 3MM gelegt. Die Nitrocellulose wurde leicht getrocknet und die RNA

mittels UV-Autocrosslink (Stratalinker) bei 1200J kovalent an die Membran gebunden.

Radioaktive Markierung der PI-II Sonde

Die Proteinase-Inhibitor-II (PI-II) -Sonde (25 ng) wurde mit [α32P]-dCTP radioaktiv markiert.

Zum Labeling wurde das RadPrime DNA Labeling System (Invitrogen-Kit) verwendet. Hierbei

lagern sich zufällige Primer (Oktamere) an eine denaturierte DNA-Vorlage und wird mit Hilfe

des Klenow-Fragments elongiert. Bei der Elongation wird [α32P]-dCTP eingebaut, was zu einer

hochspezifischen aktiven DNA führt, welche zur Detektion von RNA und DNA eingesetzt wer-

den kann. Der Einbau des [α32P]-dCTP wurde mit einem Bench-Count (DuPont) überprüft.


31

Hybridisierung

Die zu hybridisierende Membran wurde in Wasser angefeuchtet und schließlich kurz in 5x SSC

geschwenkt. Anschließend wurde die Membran zwischen Gazenetze gelegt und diese in Hybri-

disierungsröhren mindestens 2h bei 42°C in der Hybridisierungslösung vorinkubiert. Die Sonde

wurde anschließend im Heizblock bei 100°C 10 min aufgekocht und anschließend auf Eis abge-

schreckt und anschließend dazugegeben. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 42° C, 80

rpm im Hybridisierungsofen. Anschließend wurde der Blot mit steigender Stringenz in 1x SSC

mit 0,2 %SDS, im Anschluss daran mit 0,2x SSC + 0,5 % SDS, jeweils bei 60°C für 30 min ge-

waschen um die unspezifisch gebundene Sonde zu entfernen. Mit Hilfe eines Röntgenfilms der

auf den in Frischhaltefolie eingewickelten Blot gelegt wurde erfolgte eine Autoradiografie.

2.7.10 Sterilisation der Samen und Anzucht der Keimlinge

Tomatensamen (Lycopersicon esculentum cv. UC82B, LeOPR3 x UC82B und UC82B x Le-

OPR3) wurden in 2 ml-Reaktionsgefäßen 3 min mit 70 % EtOH behandelt und anschließend für

10 min mit 1,5 % Hypochlorid und 5 Tropfen Tween ® 20/100 ml sterilisiert. Nach viermaligem

Waschen mit sterilem Wasser wurden die Samen in Weckgläsern mit Keimungsmedium ausge-

legt und angezogen.

2.7.11 Emaskulation von Tomatenblüten

Zur Kreuzung von Tomaten wurde Pollen von Wildtyppflanzen auf opr3-Stigmen und opr3-

Pollen auf Wildtyp-Stigmen gebracht. Hierzu musste den jeweiligen Blüten die Antheren ent-

fernt werden (Emaskulation). Die Emaskulation wurde in einem Stadium vorgenommen, in wel-

chem die Kelchblätter sich leicht geöffnet aber die Kronblätter noch geschlossen waren. Die

Krone hat in diesem Stadium eine leicht gelbe Färbung. Um die Antheren zu entfernen wurden

zuvor die Kelchblätter abgeschnitten, der Antherenkegel wurde mit einer sehr spitzen zuvor in

70 % Ethanol sterilisierten Pinzette aufgeschlitzt. Die Antheren wurden vorsichtig mit der Pin-

zette entfernt ohne den weiblichen Gametophyt zu beschädigen.


32

2.7.12 Sammeln von Pollen und Bestäubung von emaskulierten Pflanzen

Zwei Tage nach der Emaskulation wurden �reife� Antheren von nicht emaskulierten Blüten ent-

nommen, der Pollen mit Hilfe einer Pinzette in ein Eppendorfgefäß geschüttelt und für 1,5 h bei

28°C im Heizblock getrocknet. Der Pollen wurde durch einführen der entmannten Blüte in das

Eppendorfgefäß auf das Stigma gebracht. Die bestäubten Blüten wurden mit Etiketten versehen

auf denen Datum und Herkunft des Pollens (z.B. wt oder die entsprechende Linie) notiert war.

Des weiteren wurde noch versucht Früchte durch pressen des Antherenkonus zu gewinnen.

2.7.13 In vitro-Pollenkeimung

Pollen von drei Wildtypblüten und von sechs opr3-Blüten wurde jeweils in einem Eppendorfge-

fäß gesammelt und auf mit Platten zur Pollenkeimung mit einem feinen Pinsel ausplattiert und

über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die prozentuale Pollenkeimungsrate wurde mikro-

skopisch bestimmt.

2.7.14 Ernte der Tomaten und Gewinnung der Samen

Die aus Kreuzungen oder Pressen des Antherenkonus gewonnenen Früchte wurden geerntet und

am Stielansatz aufgeschnitten, um eine Verletzung von Samen zu verhindern. Danach wurden

Schnitte geführt, welche das Kernhaus nicht beschädigten (Schutz der Samen). Das Kernhaus

wurde in ein Baumwolltuch überführt. Mit einem kleinen Löffel etwas verrieben, um sie vom

Kernhaus und der gallertartigen Schutzschicht zu befreien. Mit einer feinen Pinzette wurden die

Samen auf Whatman 3MM überführt über Nacht getrocknet und in einzelne Samentütchen, wel-

che mit der jeweiligen Kreuzungsrichtung versehen wurde überführt. In diesen wurden sie bis zu

weiteren Untersuchungen aufbewahrt.


33

2.7.15 Präparation der Embryonen

Embryonen wurden aus Tomatensamen herauspräpariert. Zur Präparation bot es sich an die Sa-

men auf ein mit destilliertem Wasser getränktes Filterpapier zu legen. Mit einer spitzen Skalpell-

klinge wurde der Same festgehalten und mit einer anderen ebenfalls spitzen Klinge der Embryo

unter dem Stereomikroskop (Zeiss, Oberkochen) freipräpariert. Pro Kreuzungsrichtung wurden

jeweils 15 auf diese Art gewonnenen Embryonen in einem 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und

in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Bis zur weiteren Analyse wurden diese -80° C aufbe-

wahrt.

2.7.16 Fixierung und Einbettung von Samen in TechnoVit 7100

Die Samen wurden zunächst kurz in Wasser vorgequollen und zweimal für 30 min in AFE (80 %

Ethanol/Formaldehyd/Eisessig 90:5:5 (v:v:v)) im Vakuum bei etwa 200 mbar fixiert. Danach

wurde die Fixierlösung erneuert, und ebenfalls bei etwa 200 mbar infiltriert, um sicher zu gehen,

dass keine Lufteinschlüsse mehr vorhanden waren und entweder über Nacht im bei Raumtempe-

ratur im Überkopfschüttler oder über das Wochenende inkubiert. Nach der Fixierung in AFE

wurde dreimal mit 75 % Ethanol für 20 min gewaschen. Das zweite und dritte Mal wurde zusätz-

lich für 10 min bei etwa 200 mbar infiltriert. Nach der dritten Waschung wurde mit einer aufstei-

genden Alkoholreihe das Präparat entwässert. Zunächst mit 90 % Ethanol, dann mit 95 % Etha-

nol und schließlich absolutes Ethanol. Die ersten beiden Entwässerungsstufen wurden jeweils 6

Stunden durchgeführt und die letzte dreimal 2 Stunden. Um sicher zu sein, dass die Präparate

entwässert sind wurde noch ein weiterer Schritt mit absolutem Ethanol über Nacht gemacht. Im

Anschluss wurde unter Vakuum bei etwa 100-150 mbar für jeweils 3 Stunden das Ethanol durch

TechnoVit 7100 schrittweise ersetzt (Ethanol:TechnoVit 7100 2:1 (v/v), Ethanol:TechnoVit

7100 1:1 (v:v), Ethanol:TechnoVit 7100 1:2 (v/v)). Im Anschluss wurde TechnoVit Grundansatz

(TechnoVit 7100 + Härter I) unverdünnt infiltriert und über Nacht inkubiert. Am nächsten Mor-

gen wurde dieser Grundansatz ausgewechselt und noch einmal für drei Stunden bei 100 mbar

infiltriert. Daraufhin wurde TechnoVit 7100 Grundansatz + Härter II in Eppendorfhütchen pipet-

tiert, die Samen wurden entsprechend der Schnittführung (längs) darin ausgerichtet, bei 100

mbar infiltriert und im Kühlschrank auspolymerisieren gelassen. Im Anschluss daran folgte das

Aufblocken der Präparate auf Histoblöcke (Heraeus Kulzer GmbH & Co KG Germany). Nach


34

etwa einer Woche nach der Polymerisation wurden Schnitte mit einer Stärke von 4µm an einem

Rotationsmikrotom (Jung Germany) gefertigt. Auf einem 60°C warmen Wasserbad wurden die

Schnitte gestreckt und schließlich auf einen Objektträger aufgezogen.

2.7.17 Färbemethoden der Schnitte

Toluidinblau Färbung

Die Schnitte wurden für etwa 5 Minuten in Toluidinblaulösung (0,03 g Toluidinblau in 100 ml

Wasser pH 7.0) gefärbt für etwa 5 min und schließlich mit Wasser die nicht gebundene Farbe

ausgewaschen. Verkorkte und verholzte Zellwände erscheinen bei dieser Färbung grünblau,

während mit Cellulose imprägnierte Wandschichten sich kräftig rötlich färben.

�Etzold�-Färbung

Andere Schnitte, welche nicht mit Toluidinblaulösung gefärbt wurden, wurden nach Etzold ge-

färbt. Hierzu wurden die Schnitte mit dem Färbereagenz überschichtet, kurz aufgekocht und bei

Raumtemperatur 2-5 min einwirken gelassen. Danach wurden die restliche ungebundene Farbe

mit Wasser ausgespült und unter dem Mikroskop (Axioskop, Zeiss Oberkochen) betrachtet.

2.7.18 Statistische Analysen

Die Statistischen Analysen wurden mit Hilfe von Microsoft Excel 2000 ausgewertet. Verschie-

dene Grafiken wurden mit SigmaPlot2000 bearbeitet.

3 Ergebnisse

35

3. Ergebnisse

3.1 Phänotypische Charakterisierung der LeOPR3-RNAi-Tomaten-pflanzen

3.1.1 Das OPR3-RNAi-Konstrukt

Für die funktionelle Charakterisierung der OPR3 in Tomatenpflanzen standen transgene Pflan-

zen zur Verfügung, in denen die Expression der OPR3 durch RNA-Interferenz unterdrückt sein

sollte. Das OPR3-RNAi-Konstrukt, mit welchem die Pflanzen transformiert worden waren, be-

inhaltet ein 408 bp Fragement der OPR3

cDNA, das sich von Position 411-819 vom

Startcodon erstreckt. Dieser Teil hat auf

Ebene der Nukleotide eine 57 %ige Über-

einstimmung mit OPR1, welches mit OPR3

am nächsten verwandt ist. Diese Region

wurde in Sense und Antisense Orientierung

in den pRTL2-FAD2-Intron Vektor einge-

führt (Abb. 11). Dieses Konstrukt ist in der

Lage eine Haarnadelstruktur zu bilden. Es

steht unter Kontrolle des 35S-Promotor, der

eine stetige Expression des Konstruktes erlaubt.

Lycopersicon esculentum cv. UC82B ist im Vorfeld mit diesem Konstrukt mittels A. tumefaciens

transformiert. Für diese Arbeit wurden 30 möglicherweise transformierte Pflanzen im Alter von

7 Wochen zur Verfügung gestellt. Diese Pflanzen befanden sich in der T1-Generation. Der erste

Schritt in der Charakterisierung war also zu testen, ob die Pflanzen dieses Konstrukt auch tat-

sächlich enthielten.

Abb. 11: pRTL2-FAD2-Intron-Vektor mit OPR3 in Sense-und Antisense-Orientierung. Die Restriktionsschnittstellensind angegeben, wie auch die Left- und Right-Border (LBund RB) der T-DNA, die Position des 35S Promotors unddes Terminators (Term)

RB LB

3 Ergebnisse

36

3.1.2 Tragen die Pflanzen das RNAi-Konstrukt?

Um die Pflanzen auf Anwesenheit des RNAi-Konstruktes zu testen, wurde von Blättern 25 mög-

licher transgener Linien DNA extrahiert und je eine PCR mit der Primerkombination Primer 68

+ fad2fw sowie Primer 68 + fad2rev (Abb. 12 & 13) durchgeführt. Der Primer 68 bindet im Be-

reich der OPR-cDNA an Position 411-438, die

beiden fad2-Primer binden im Bereich des FAD-

Introns (s. Abb. 12). Wenn nun nach der PCR für

beide Primerkombinationen eine Bande von 510

bp zu erkennen ist, kann daraus geschlossen wer-

den, dass die Pflanzen das Konstrukt beinhalten.

In Abb. 13 wird gezeigt, dass alle

mir zur Verfügung gestellten und

im Laufe der Arbeit verwendeten

OPR3-RNAi-Linien das Konstrukt

tragen, außer Linie P20, welche nur

den Senseteil (fad2rev + 68) bein-

haltete. Die Linien P4, P4/2, sowie

J7, 7/2, 7/3 P8 und P8/2 stammen

jeweils von einem Kallus, stellen

also vermutlich keine unabhängi-

gen Transformationsereignisse dar.

Für die weiteren Untersuchungen

wurden aus diesen Serien nur die

Pflanzen 4/2, J7/2 und P8/2 einge-

setzt. Da alle anderen entstandenen

Linien von unterschiedlichen Kalli

abstammen, muss es sich auch um

unterschiedliche Transformationser-

eignisse handeln, weshalb auf einen

zur Bestimmung der Unabhängigkeit

sonst nötigen Southern Blot verzichtet wurde. Nachdem gezeigt wurde, dass die Pflanzen das

68 68fad2rev fad2fw

FAD2-Intron

Abb. 12: Primerkarte des RNAi-Konstrukts. Pfei-le deuten die Bindungsstellen der Primer an

Abb. 13: Nachweis des RNAi-Konstrukts in den transgenenPflanzen. 1 % Agarosegele, welche mit EtBr gefärbt wurden.Die jeweilige opr3-Linie, ist angegeben, ebenso sind dieSpuren mit gleichbehandelter wt DNA (wt), der Negativkon-trolle (Mastermix ohne DNA, MM), und der Positivkontrolle(+), wie auch die eingesetzten Primerkombinationen angege-ben.

3 Ergebnisse

37

Konstrukt tragen ist nun wichtig zu wissen, ob auch die Expression des OPR3 Gens in diesen

Pflanzen unterdrückt ist.

3.1.3 Ist die Expression von OPR3 unterdrückt?

Da OPR3 in verwundeten Pflanzen akkumuliert [Strassner et al., 2002] und ein Antikörper gegen

OPR3 vorhanden ist, wurde mittels DISK-PAGE und Western-Blot überprüft, ob OPR3 in den

opr3-RNAi-Linien ebenfalls nach verwundung akkumuliert oder nicht.

Bei LeOPR3 handelt es sich um ein

369 Aminosäuren langes Peptid,

welches eine molekulare Masse von

40,5 kDa besitzt.

Von jeder der untersuchten Linien

wurde vor wie auch zwei Stunden

nach der ersten Verwundung Protein

extrahiert und jeweils 15 µg wurden

analysiert

Um zu überprüfen, ob in jede Tasche

des Polyacrylamidgels die gleiche

Menge Protein aufgetragen wurde,

wurde ein dem Blot entsprechendes

Proteingel mit Coomassie Brilliant

Blau gefärbt. Abb. 14 zeigt, dass eine

gleichmässige Beladung nicht voll-

ständig gelungen ist. Alternativ wurde

die Nitrocellulosemembran nach Wes-

tern-Transfer der Proteine mit Pon-

ceau gefärbt. Hier zeigte sich eine

Bande gleicher Intensität in allen Spu-

ren. Bei dem gefärbten Protein handelt

es sich um die grosse Untereinheit der

RubisCO (Abb. 15). Die dazugehörigen Western-Blots (Abb. 14 & 15) zeigen eine Akkumulati-

on an OPR3 im Wildtyp nach Verwundung, es ist jedoch keine Akkumulation von OPR3 in den

a

b

Abb. 14: Westernblot (a) mit dazugehörigen Coomassie-gefärbten (b) Gel. Aufgetragen wurden Proteinextraktedreier verschiedener opr3-RNAi-Linien (Lines) und desWildtyps jeweils unverwundet (-) und verwundet (+) (15µg) sowie aufgereinigtes OPR3 (10 ng); Grössenstandard.

Abb. 15: Westernblot (a) mit dazugehörigen Ponceaugefärbten-Blot (b). Aufgetragen wurden Proteinextrakte dreier verschiede-ner opr3-RNAi-Linien (Lines), und des Wildtyps, jeweils un-verwundet (-) und verwundet (+) (15 µg) sowie aufgereinigte OPR3 (10 ng) und ein Grössenstandard.

a

b

3 Ergebnisse

38

Wildtyp opr3-Mutante

Abb. 16: Phänotyp der LeOPR3-RNAi-Pflanzen. Die Blüten von opr3-Pflanzen trocknen aus und fallen ab, während der Wildtyp Früchte bildet.

RNAi-Linien zu erkennen. Dass der Antikörper spezifisch ist, zeigt das aufgereinigte und zur

Kontrolle aufgetragene His6-OPR3-Protein und die Tatsache, dass nur eine Bande im Gesamt-

proteinextrakt mit dem Antikörper reagierte. Aus diesen beiden Abbildungen kann geschlossen

werden, dass in den ausgewählten LeOPR3-RNAi-Pflanzen die Expression des OPR3 Gens un-

terdrückt ist. Diese Linien werden im folgenden der Einfachheit halber als opr3-Pflanzen be-

zeichnet.

3.1.4 Phänotyp der opr3-Pflanzen

In der Wuchsform zeigten die opr3-Pflanzen keine Auffälligkeit im Vergleich zum Wildtyp.

Wurde jedoch die Blüten angesehen, so konnte festgestellt werden, dass diese austrockneten

(Abb. 16) und schließlich abfielen ohne Früchte zu bilden.

Das Fertilitätsproblem der Pflanzen könnte auf männlicher, weiblicher oder gar beider Sterilität

beruhen. Da man aber von der Arabidopsis opr3 Mutante weiß, dass diese männlich steril sind

[Stintzi und Browse, 2000], entschlossen wir uns zunächst die Pollenkeimungsrate zu bestim-

men.

3 Ergebnisse

39

3.1.5 Pollenanalyse

Sowohl die Arabidopsis thaliana opr3-Mutante [Stintzi und Browse, 2000], als auch die anderen

in der Biosynthese von Jasmonsäure beteiligten Mutanten (fad3/7/8 triple mutante, aos)

[McConn und Browse, 1996; Sanders et al., 2000; Stintzi und Browse 2000] und die downstream

von JA liegende coi1-Mutante sind männlich steril [Turner et al., 2002; Xu et al., 2002]. In To-

mate wurde bis jetzt lediglich die jai1 Mutante, die einen Defekt in dem zu COI1 orthologen

Jai1 Gen hat, charakterisiert [Li et al. 2004], welche keine männliche Sterilität zeigte. Dafür

wird aber das Jai1 Gen für die Kontrolle der Samenreifung durch den weiblichen Gametophyten

verantwortlich gemacht.

In den opr3-Pflanzen wurde eine

im Vergleich zum Wildtyp 20-fach

verminderte Pollenfreisetzung be-

obachtet, was vermutlich auf ein

nicht geöffnetes Stomium zurück

zuführen ist (Daten aus mangeln-

der statistischer Aussagekraft nicht

gezeigt). Durch die verminderte

Pollenfreisetzung allein lässt sich

aber die beobachtete Sterilität

nicht erklären. Daher wurde Pol-

len von sechs opr3-Blüten vier

verschiedener unabhängiger Li-

nien und dreier Wildtypblüten

gesammelt und auf Pollenkei-

Abb. 17: Pollenkeimungsrate von wt und vier verschiedenen opr3-Linien (J3, P10, J30 und J18). n(wt) = 1403, n(J3) = 406, n(P10) = 544, n(J30) = 1743, n(J18) = 1717

Pollenkeimung

Linien

wt J3 P10 J30 J18

% g

ekei

mte

Pol

len

024

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Abb. 18: Pollenkeimung in vitro: links oben, ist die Pollenkeimung von Wildtyp, in der Mitte und im rech-ten Bild die Pollenkeimung von zwei opr3-Mutanten (J3 und J30) zu sehen.

3 Ergebnisse

40

mungsmedium ausplattiert um die Keimungsfähigkeit des Pollens zu testen (Abb. 18). Das Er-

gebnis des Pollenkeimungsversuchs ist graphisch in Abbildung 17 dargestellt. Es ist ersichtlich,

dass die Pollenkeimungsrate im Wildtyp bei 48 % lag, während für die opr3-Mutanten nur zwi-

schen 0,5 % und 1,1 % des Pollens keimten. Vom Wildtyp wurden insgesamt 1403, von den Li-

nien J3 406, P10 544, J30 1743 und J18 1717 Pollenkörner ausgezählt. Aus diesem Ergebnis

kann auf eine männliche Sterilität, oder zumindest eine enorme Reduktion der männlichen Ferti-

lität, geschlossen werden. Die verminderte männliche Fertilität muss auf einen sporophytischen

Defekt zurückzuführen sein, da nicht nur 50 % sondern der gesamte Pollen der opr3-Pflanzen

betroffen war. Da sich die opr3-Pflanzen in der T1-Generation befinden, sind sie hemizygot für

das RNAi-Konstrukt. Solange jede der opr3-Linien nur eine Kopie des Konstruktes tragen (was

durch Southern Blot zu überprüfen wäre) erhalten während der Meiose 50 % der gebildeten

Sporen und damit auch der daraus entstehenden Gametophyten und Gameten das Konstrukt. Al-

so ist die OPR3 Expression in nur 50 % des gebildeten Pollens unterdrückt. Da aber die Kei-

mung des gesamten Pollens beeinträchtigt ist, muss die Elternpflanze (der Sporophyt) für den

Defekt verantwortlich sein.

Die transgenen RNAi-Linien bildeten über einen Zeitraum von sechs Monaten keinerlei Früchte.

Dies deutet darauf hin, dass die Keimung des Pollens nicht nur in vitro, sondern auch in vivo

beeinträchtigt war. Mit dem Ziel in die nächste Generation zu gelangen wurden reziproke Kreu-

zungen der �silencing�-Linien mit dem Wildtyp durchgeführt.

3.1.6 Generierung von Früchten und Samen

Für die Bestäubung von opr3-Pflanzen mit Wildtyppollen, wurde der Pollen in Eppendorfgefä-

ßen gesammelt, und im richtigen Stadium der Blütenentwicklung wurde der opr3-Stempel in den

Pollen eingetaucht. Im Falle der umgekehrten Kreuzung wurde die Wildtypblüte emaskuliert und

der gesammelte opr3 Pollen auf dieselbe aufgebracht.

Fruchtansatz und Samenbildung nach reziproker Kreuzung

Wurden opr3-Pflanzen wie oben beschrieben reziprok gekreuzt, kam es tatsächlich zum

Fruchtansatz und etwa drei Monate nach der Bestäubung waren die Früchte ausgereift und

konnten geerntet werden. Schon nach der Analyse weniger geernteter Früchte wurde eine

Verteilung der Samen in große, normal entwickelte sowie kleine Samen festgestellt (s. Abb. 19).

Die großen Samen hatten eine Länge von etwa 5 mm und eine Dicke von 1 mm (was der

normalen Samengrösse dieser Tomatensorte entspricht), während die kleinen Samen eine Länge

3 Ergebnisse

41

grösse dieser Tomatensorte entspricht),

während die kleinen Samen eine Länge von

lediglich 1-2 mm hatten und auch dement-

sprechend dünner waren.

Die Hälfte der Samenanlagen hatte sich also

nicht normal entwickelt, vermutlich auf-

grund des �silencing� von OPR3. Um fest-

zustellen, ob es sich bei den �kleinen Sa-

men� um unbefruchtete Samenanlagen han-

delt, oder aber ob es zur Befruchtung ge-

kommen ist und der Defekt in der Samen-

reifung und/oder Embryonalentwicklung zu

suchen ist, wurden die Samen mikrosko-

pisch untersucht.

Phänotyp der „kleinen“ Samen

Der reife Same von Capsicum annum (http://www.seedbiology.de/structure.asp), der sehr ähn-

lich wie der Tomatensamen gebaut ist, ist in

Abb. 20 zu sehen. Man erkennt den einge-

rollten Embryo mit den Kotyledonen (grün),

das Endosperm (grau) und die Testa (braun).

Vier opr3-Linien (J3, J18, J18, J5) wurden

mit Wildtyppollen bestäubt. Die entstande-

nen �kleinen Samen� wurden in TechnoVit

eingebettet und längs geschnitten. Die Sa-

men aller vier Linien zeigten ein sehr ähnli-

ches Erscheinungsbild. Klar waren Testa,

Endosperm und der Embryo zu erkennen,

doch war dieser im globulären Stadium arre-

tiert. (Abb. 21). Da dieser Phänotyp bei

beiden Kreuzungen zu beobachten war, ist

die Wirkung des �silencing�-Konstruktes

Abb. 19: Samenverteilung. Nach dem Ernten der Samen beider reziproker Kreuzungen wurde eine Verteilung der Samen in große, normal entwickelte und �kleine� Samen festgestellt

Abb. 20: Zeichnung basierend auf einer Elektronenmikro-skopischen Aufnahme eines reifen Samens von Capsicum annum. Die Struktur stimmt mit der des Tomatensamens überein. Quelle: http://www.seedbiology.de/structure.asp

3 Ergebnisse

42

offenbar nicht auf den Pollen beschränkt. �Kleine Samen� sind auch bei Bestäubung mit Wildtyp

Pollen zu beobachten. Das mag auf einen Defekt im weiblichen Gametophyten hindeuten. Es

wäre aber auch ein Einfluss des Sporophyten denkbar. Ein Teil des reifen Samens, die Testa,

stammt von sporophytischem Gewebe ab, das damit durchaus einem Einfluss auf die Samen-

und Embryonalentwicklung nimmt. Um hier weitere Hinweise zu erhalten war es zunächst wich-

tig festzustellen, ob das �silencing� Konstrukt sowohl in den normalen, als auch in den kleinen

Samen nachzuweisen ist.

J3xwt J30xwt

J5xwt

Abb. 21: Embryostruktur der kleinen Samen, welche durch Kreuzung mit Wildtyppollen generiert wurden. Die beiden linken Bilder zeigen gebleichte kleine Samen, die rechten Bilder 4µm dicke Längsschnitte. Das obere rechte Bild wurde mit Toluidinblau, das untere rechte Bild nach �Etzold� gefärbt. Die Größe der Embryonen betrug etwa 200 µm.

J18xwt

3 Ergebnisse

43

Welche Samen enthalten das Konstrukt?

Um diese Frage zu beantworten wurden normale Samen auf MS Medium gekeimt, DNA wurde

aus den Kotyledonen isoliert. Im Falle der kleinen Samen war eine Keimung nicht möglich.

DNA-Isolierung aus den Samen selbst würde es nicht erlauben, zwischen sporophytischem Ge-

webe und dem weiblichen Gametophyten zu unterscheiden. Die Testa nämlich ist stets materna-

les Gewebe, und enthält somit das Konstrukt im Falle einer Kreuzung bei der die opr3-

Tomatenpflanze als weiblicher Elter eingesetzt wird. Aus technischen Gründen wurden 15 Emb-

ryonen je Kreuzungsrichtung freipräpariert und aufgearbeitet.

Unabhängig von der Kreuzungsrichtung konnte das RNAi-Konstrukt nur in den Embryonen

nachgewiesen werden (Abb. 22) . Der Defekt in der Embryonalentwicklung ist also wahrschein-

lich auf die Gegenwart des �silencing�-Konstrukts im weiblichen Gametophyten, oder nach der

Befruchtung in der Zygote und im sich entwickelnden Embryo zurückzuführen. Weitere Auf-

schlüsse über die Relevanz der OPR3 im männlichen und weiblichen Gametophyten erhoffte

man sich aus einer Analyse der relativen Häufigkeit der �grossen� und �kleinen� Samen nach

reziproken Kreuzungen.

Abb. 22: Nachweis des RNAi-Konstrukts in den Embryonen (E) und Kotyledo-nen (K). 1 % Agarosegel, welches mit EtBr gefärbt wurde. Die jeweilige Kreu-zungsrichtung (♀ x ♂) ist angegeben, ebenso wie die Herkunft der DNA aus Embryonen (E) oder Kotyledonen (K), eine Positivkontrolle (+), die Negativkon-trolle (Mastermix ohne DNA, MM) und die jeweilige Primerkombination

3 Ergebnisse

44

Samenverteilung nach Bestäubung von opr3 mit Wildtyppollen (opr3 (♀) ! wt (♂))

Pflanzen, welche sich in der T1-Generation befinden sind, wie bereits erwähnt, hemizygot. Wei-

terhin wurde davon ausgegangen, dass das Transgen in nur einer Kopie vorliegt. Damit lässt sich

die Segregation des RNAi-Konstruktes nach den Mendel�schen Regeln wie in Tabelle 1 gezeigt

vorhersagen. Demzufolge sollte die Hälfte der gebildeten Samen das Transgen vom weiblichen

Gemetophyten erhalten. Sollte die Unterdrückung der OPR3-Expression in diesem Gewebe für

den Phänotyp �kleine Samen� verantwortlich sein, dann

sollten sie mit einer Häufigkeit von 50 Prozent auftreten.

Wenn andernfalls die OPR3-Expression im Sporophyt,

also dem Gewebe des weiblichen Elternteils entscheidend

sein, dann sollten alle Samen betroffen sein. Wie in

Abbildung 23 zu erkennen wurden 801 normal

entwickelte Samen und 808 kleine Samen ausgezählt. Mit

dem aus dem Kreuzungsschema (Tab. 1) stimmen diese

Zahlen soweit überein, dass es sich um eine 1:1

Verteilung handeln könnte. Um eine gewisse Sicherheit

in diese Analyse zu bekommen, berechneten wir die

Wahrscheinlichkeit dass die Verteilung tatsächlich 1:1

beträgt mit Hilfe der Pearson�schen relativen Verteilung. Pearson�schen relativen Verteilung. Wir berechneten eine Wahrscheinlichkeit von p > 90 %.

(χ2=((801-804,5)2/804,5)+((808-804,5)2/804,5) = 0,01523 ! p > 0,90) . Somit kann gesagt wer-

den, dass in mehr als 90 Prozent der Fälle sich das Konstrukt auf die kleinen Samen verteilt und

in mehr als 90 Prozent der Fälle, die Verteilung der Samen in �groß� und �klein� eintritt.

Wildtyp Wildtyp

Mutante Mutante Wildtyp

Mutante Wildtyp

Wildtyp Wildtyp Wildtyp

Wildtyp Wildtyp

Tab. 1: Kreuzungsschema opr3 weiblich (rot: weiblich; blau: männlich)

Samenverteilung

801 808

0

100

200

300

400

500

600

700

800

große Samen kleine Samen

Anz

ahl

Abb. 23: Samenverteilung in �groß� und �klein� nach Kreuzen von opr3-Pflanzen mit Wildtyppollen

3 Ergebnisse

45

Samenverteilung nach Bestäubung des Wildtyps mit opr3 Pollen (wt (♀) ! opr3 (♂))

Obwohl der opr3 Pollen in vitro eine geringe Keimungsrate zeigte wurde er gesammelt und auf

den Stempel zuvor emaskulierter Wildtypblüten aufgebracht. Abermals drei Monate nach Be-

stäubung waren die sich entwickelnden Früchte reif und konnten geerntet werden. Wieder fiel

eine Verteilung von �kleinen� und normal entwickelten Samen auf. Das vom Pollen in die Zygo-

te eingebrachte RNAi-Konstrukt hat also einen Einfluss auf die Embryonal- und Samenentwick-

lung, wobei nicht unterschieden werden kann, ob es das �silencing� von OPR3 im Endosperm

oder im Embryo ist, was diesen Effekt verursacht (dopplete Befruchtung).

Nach Mendel tragen 50 % des Pollens das RNAi-Konstrukt und bei gleicher Fertilität beider

Pollentypen wäre auch eine 50 % Häufigkeit der �kleinen� Samen zu erwarten (Tabelle 2). Statt-

dessen wurde bei dieser Kreuzung eine Verteilung von nahezu 2:1 erhalten. 112 der geernteten

Samen waren normal entwickelt, 49 Samen waren �klein� und arretiert in der Embryonalent-

wicklung. Die χ2 Berechnung zeigt, dass diese Vertei-

lung mit einer Wahrscheinlichkeit von p < 0,05 %

(χ2=((112-80,5)2/80,5) + ((49-80,5)2/80,5) = 24,6 ! p

< 0,05) verschieden von 1:1 ist. Offenbar hat der Wild-

typ- im Vergleich zu opr3 Pollen eine etwa doppelt so

hohe Erfolgsrate, die Samenanlagen zu befruchten. Zu-

sätzlich zu dem zuvor beobachteten Einfluss des Spo-

rophyten auf die Pollenkeimung in vitro (Abb. 17 & 18)

hat das �silencing� von OPR3 offenbar also auch eine

direkte Auswirkung im männlichen Gametophy-

ten, die sich in einer verminderten Fertilität des

Pollens äußert.

Wildtyp Wildtyp

Mutante Mutante Wildtyp

Mutante Wildtyp

Wildtyp Wildtyp Wildtyp

Wildtyp Wildtyp

Tab. 2: Kreuzungsschema opr3 männlich (rot: weiblich, blau männlich)

Samenverteilung

112

49

0

20

40

60

80

100

120


Anz

ahl

Abb. 24: Samenverteilung in �groß� und �klein� nach Kreuzen von Wildtyppflanzen mit opr3-Pollen

3 Ergebnisse

46

Mutante Wildtyp Wildtyp

Mutante Mutante Mutante

Mutante Wildtyp

Mutante Wildtyp

Wildtyp Wildtyp Mutante

Wildtyp Wildtyp

Wildtyp Wildtyp

3.1.6.3 Homozygote Linien durch pressen des Antherenkonus

Wie bereits bei der phänotypische Analyse beobachtet, hatte opr3 ein Problem beim Öffnen des

Stomiums, was sich in einer verminderten Freisetzung des Pollens äußerte. Durch leichtes Pres-

sen des Antherenkegels wurde versucht, die Pollenkörner zu befreien, um eine Bestäubung zu

ermöglichen. Nach dem Pressen der Kegel bildeten sich Früchte. Diese enthielten ebenfalls Sa-

men, welche in �groß� und �klein� verteilt waren. Wie in Abb. 25 gezeigt, wurden 311 große

und 432 kleine Samen ausgezählt. Dies entspricht nahezu einem Verhältnis von 2:3. Vermutlich

ist diese Verteilung das Resultat einer

Kombination der im Zusammenhang der

mit den reziproken Kreuzungen beobachte-

ten Phänomene. Wie das in Tabelle 3 ge-

zeigte Kreuzungsschema zeigt, wäre eine

2:3 Verteilung zu erwarten, wenn man für

die homozygot das �silencing�-Konstrukt

tragende Zygote Lethalität annimmt. Dies

bleibt aber zu diesem Zeitpunkt noch sehr

spekulativ und muss durch die Analyse ei-

ner grösseren Anzahl von Samen bestätigt

werden.

Tab. 3: Kreuzungsschema für opr3 ! opr3 durch pressen der Antheren (rot = weiblich, blau = männlich)

Samenverteilung

311

432

050

100150200

250300350

400450


Anz

ahl

Abb. 25: Samenverteilung in �groß� und �klein� nach pressen von opr3-Pflanzen.

3 Ergebnisse

47

3.1.7 Rückgewinnung der Fertilität durch Jasmonsäure

Von der Arabidopsis opr3-Mutante weiß man, dass die Ferti-

lität durch 0,03 % Jasmonsäure regeneriert werden kann

[Stintzi and Browse, 2000]. Aus diesem Grund wurde begon-

nen, die gesamten opr3-Tomatenpflanzen jeden zweiten Tag

mit dieser Konzentration zu besprühen. Jedoch zeigten die

Pflanzen keine Reaktion auf diese Behandlung, weshalb die

Konzentration auf 0,3 % Methyljasmonsäure erhöht wurde.

Bei dieser Konzentration trockneten die Blüten sogar noch

schneller aus als ohne Behandlung (Abb. 27), dieses

Phänomen könnte auf die Seneszenzwirkung von

MeJA zurückzuführen sein [Westernack, 2005].

Aus diesem Grund wurden die Pflanzen anschlies-

send mit nur 0,003 % Jasmonsäure besprüht. Nach

etwa vier Wochen Besprühung mit dieser Konzent-

ration bildeten die Pflanzen Früchte. Die Samen in

den Früchten waren flach, durchscheinend, und

hatten ein bräunliches, punktförmiges Gewebe im

Innern welches noch nicht näher identifiziert wer-

den konnte. Die Lage dieses Gewebes könnte dem

Abb. 27: Austrocknen der Blüten nach Besprü-hung mit 0,3 % MeJA. Die Blüten trockneten im Vergleich zu unbehandelten Pflanzen schneller ab

Abb. 26: Austrocknen der Blüten ohne MeJA-Behandlung.

Abb. 28: Samen nach Besprühen mit MeJA(0,003 %). Der Pfeil kennzeichnet das im Texterwähnte bräunliche Gewebe.

Abb. 29: Samen nach andauernder Behand-lung mit MeJA (0,003 %). Die Samen sind normal entwickelt und keimfähig.

3 Ergebnisse

48

Embryo entsprechen, was aber noch nicht verifiziert wurde (Abb. 28). Es scheint als wäre durch

exogene Behandlung mit MeJA nur eine partielle Aufhebung der in den opr3-Pflanzen beobach-

teten Defekte möglich geworden. Dies mag an einer beschränkten Zugänglichkeit der betroffe-

nen Gewebe für das von Aussen applizierte MeJA liegen. Darüber hinaus mag das Zeitfenster

der Behandlung mit MeJA nicht optimal gewesen sein. Für diese Möglichkeit spricht, dass nach

MeJA Behandlung über einen längeren Zeitraum die Entwicklung normaler, keimfähiger Samen

zu beobachten war (Abb. 29).

Da die Pflanzen über längere Zeit keine keimfähigen Samen bildeten wurden sie, um weitere

Untersuchungen zu ermöglichen, über Kopfstecklinge vermehrt.

3.1.8 Fruchtbildung ohne Befruchtung (Parthenocarpie)

Nachdem die opr3-Pflanzen etwa 10 Monate lang keinerlei Früchte ohne künstlicher Bestäubung

gebildet hatten, setzten plötzlich acht verschiedene Linien (P4.2, J5, P17, J30, J34, J36, J46 J50)

insgesamt 64 Früchte an, welche wie kleine Cocktailtomaten aussahen (Abb. 30). Beim Ernten

der Früchte stellte sich heraus, dass sie keinerlei Samen enthielten (Abb. 31). Anscheinend kam

es hier zur parthenocarpischen Fruchtbildung (Fruchtbildung ohne Befruchtung). Es ist bekannt,

dass Phytohormone, insbesondere Auxine und Gibberelline, als Auslöser der parthenocarpischen

Fruchtbildung wirken können [Review: Gorguet et al., 2005]. Für die Jasmonsäure ist noch keine

Funktion in diesem Zusammenhang beschrieben worden. Die parthenocarpische Fruchtbildung

in OPR3-defizienten Pflanzen deutet auf einen Antagonismus von JA auf der einen, und Auxinen

und Gibberellinen auf der anderen Seite. Das Fehlen von JA würde somit die parthenocarpische

Fruchtbildung befördern.

Abb. 30: Fruchtbildung nach 10 Monaten inopr3 (links). Die Größe der opr3-Tomatenwar mit Cherry- bzw. Cocktailtomaten ver-gleichbar. Rechts ist eine Wildtyptomate zusehen.

Abb. 31: Aufgeschnittene opr3-Tomate (links), wel-che keinerlei Samen enthielt und eine aufgeschnittene Wildtyptomate (rechts) in welcher deutlich die Samen zu erkennen sind.

3 Ergebnisse

49

3.1.9 Luftwurzelähnliche Strukturen

Etwa zur gleichen Zeit, wie die Tomaten diese kleinen Früchte ohne Samen bildeten, wurde die

Bildung von Luftwurzel-ähnlichen Strukturen an zehn Pflanzen beobachtet (Abb. 32). Diese ent-

standen nicht nur knapp oberhalb des Erdbodens, sondern auch an Ästen, welche etwa einen hal-

ben Meter über der gegossenen Erde waren. Eine Wurzelbildung aufgrund Wasserüberschusses

kann daher ausgeschlossen werden. Aus welchem Grund die Pflanzen plötzlich wurzelähnliche

Strukturen bildet, welche mikroskopisch näher auf ihre Identität hin untersucht werden sollten,

ist unbekannt. Die Bildung von Adventivwurzeln als Folge der Seneszenz ist in Tomaten nicht

unbekannt. Sollte die hier beobachtete Wurzelbildung ein Seneszenzphänomen sein, würden

opr3-Pflanzen schneller altern als Wildtyp. Dies scheint angesichts der seneszenzfördenden Wir-

kung von JA unwahrscheinlich. Andererseits ist bekannt, dass JA das Wurzelwachstum hemmt

[Koda et al., 1997; Devoto und Turner, 2003]. Eine verminderte JA-Konzentration in den opr3-

Pflanzen könnte sich damit fördernd auf die Wurzelentwicklung auswirken.

Abb. 32: Luftwurzelbildung in 10 Monate alten Pflanzen. Links: Wildtyp, Mitte: opr3-Pflanze am Boden sind Luftwurzeln zu erkennen. Rechts: Luftwurzelbildung an opr3-Mutante an einem Zweig, welcher etwa 50 cm über dem Boden war.

3 Ergebnisse

50

3.2 Molekulare Charakterisierung der opr3-RNAi-Tomatenpflanzen

3.2.1 Akkumulieren Proteinaseinhibitoren nach Verwundung?

Jasmonate stellen wichtige Signalmoleküle in der Wundreaktion von Pflanzen dar. Sie akkumu-

lieren transient nach Verwundung und induzieren die Expression von Abwehrgenen. In Solana-

ceen handelt es sich dabei vorwiegend um Gene für Proteinaseinhibitoren, die sich gegen die

Verdauungsenzyme der herbivoren Insekten richten. In opr3-Pflanzen ist die Expression der 12-

Oxophytodiensäurereduktase, eines zentralen Enzymes des Oktadecanoidweges für die Bi-

synthese von JA, unterdrückt. Die Pflanzen können also keine JA mehr herstellen, wohl aber die

Vorstufe OPDA. Durch die Analyse der Wundreaktion in opr3-Pflanzen wurden Aufschlüsse

über die jeweilige Rolle von OPDA und JA als Signalmoleküle der Wundreaktion erwartet.

Die Fiederblättchen eines Tomatenblattes wurden mit einem Hämostaten quer über die Mittel-

rippe gequetscht. Eine Stunde nach der ersten Verwundung wurde ein zweites Mal, mehr adaxial

verwundet, und neun Stunden nach der ersten Verwundung wurde sowohl lokal (verwundete

Stelle) als auch systemisch (oberhalb der Verwundung) Blattmaterial von etwa 400 mg zur RNA

Extraktion geerntet (Abb. 33). Mittels Northern Blots wurde die Expression des Proteinaseinhibi-

tors II (PI-II), eines Markerproteins der Wundantwort in Tomatenpflanzen, untersucht. Aus Ab-

bildung 34 geht hervor, dass in den systemi-

schen Blättern der opr3-Pflanzen nach Ver-

wundung der Pflanzen die Expression des

PI-II nicht induziert wurde. Das legt den

Schluss nahe, dass diese Pflanzen nicht

mehr zur Bildung des systemischen Wund-

signals in der Lage sind.

Leider ist diese Schlussfolgerung nicht ge-

rechtfertigt, denn auch der verwundete

Wildtyp zeigt keine Akkumulation von PI-II

mRNA. Dieses Experiment ist also miss-

lungen, was aber keine technischen Ursa-

chen hat: in den Kontrollspuren ist durchaus

ein Signal für PI-II erhalten worden (Abb.

34). Als Kontrolle wurden Pfropfungen ver-

wendet, welche auf einem anderen (nicht

Abb. 33: schematische Tomatenpflanze. Dunkelblaue Striche zeigen die Verwundung zum Zeitpunkt null, hellblaue Striche Verwundung zum Zeitpunkt +1, und Kreise markieren die Blättchen aus denen RNA extra-hiert wurde.

3 Ergebnisse

51

gezeigten) Blot bereits Signale auf PI-II gezeigt hatten. Die lokale Wundantwort ist in diesem

Experiment nicht untersucht worden. Bei Wiederholung des Experimentes wird sie mit einzube-

ziehen sein.

a

b

Abb. 34: Northern Blot (b) für die systemische Antwort, ob PI-II akkumuliert mit zugehö-rigem EtBr gefärbten 1 % Agarose Gel (a), Die untersuchten Linien, sowie ob Verwundet wurde oder nicht. Verwundet (+) unverwundet (-). Sowie Kontroll-RNA aus Pfropfungen.

3 Ergebnisse

52

3.2.2 Ist OPDA oder Jasmonsäure das transportierte Signal

Durch Pfropfungen lässt sich die Frage untersuchen, welches Signalmolekül für die systemische

Reaktion nach Verwundung verantwortlich ist. So konnten Li et al. [2002] durch reziproke

Pfropfungen von JA-Synthese- und JA-Perzeptions-Mutanten zeigen, dass die Synthese von JA

in der verwundeten Pfropfunterlage notwendig für die systemische Reaktion ist. Im unverwunde-

ten Pfropfreis dagegen ist keine JA-Synthese, wohl aber die Perzeption von JA erforderlich, um

die Expression der Abwehrgene zu induzieren. Dies legt den Schluß nahe, dass es sich beim sys-

temischen Signal um JA selbst, oder um eine seiner biosynthetischen Vorstufen handelt. Zur

gleichen Schlussfolgerung kamen auch Strassner et al. [2002] die zeigten, dass die JA in den

verwundeten Blättern von Tomatenpflanzen transient akkumuliert, nicht aber in den unverwun-

deten, systemischen Blättern. Für eine Rolle der biosynthetischen Vorstufe OPDA spricht der

Befund, dass die opr3 Mutante in Arabidopsis eine im Vergleich zum Wildtyp uneingeschränkte

Resistenz gegenüber Bradysia-Larven aufweist [Stintzi und Browse, 2000] Zudem konnte mit

Hilfe der Arabidopsis opr3 Mutante gezeigt werden, dass OPDA eine Abwehrgen-induzierende

Wirkung hat [Stintzi et al., 2001]. Gegen eine Rolle von OPDA als das systemische Wundsignal

sprechen Befunde von Li et al. [2005] die zeigten, dass die β-Oxidation zur Verkürzung der Ok-

tansäure-Seitenkette der OPDA notwendig für die systemische Wundantwort ist. Um in dieser

Abb. 35: Bilder einer gepfropften Pflanze. Das linke Bild zeigt die gesamte Pflanze, das rechte Bild die Pfrop-fung. Der Pfeil deutet auf die Pfropfstelle. In diesem Fall ist die Wildtyppflanze die Unterlage, welche später verwundet wurde, und der Spross einer opr3-Pflanze wurde als Pfropfreis eingesetzt.

3 Ergebnisse

53

noch offenen Frage, ob es sich nämlich bei dem systemischen Signal um JA oder um OPDA

handelt, Klarheit zu schaffen wurden hier Pfropfungen von Tomatenpflanzen des Wildtyps mit

opr3- und aos-RNAi-Linien hergestellt und auf ihre Fähigkeit zur systemischen Induktion der

PI-II Expression untersucht.

3.2.2.1 Pfropfungen Wildtyp mit opr3

Es wurden wie bei Li et al. (2002) beschrieben Pfropfungen von Wildtyppflanzen als Unterlage

und opr3-Pflanzen als Pfropfreis durchgeführt (Abb. 35). Die Pfropfunterlage wurde wie oben

beschrieben verwundet (Abb. 33) und neun Stunden nach der ersten Verwundung wurde Blatt-

material von etwa 400 mg jeweils von der Stockpflanze als auch vom Pfröpfling geerntet und

mittels Northern Blots auf die Expression von PI-II hin untersucht.

Für den Fall, dass OPDA das transportierte Signal ist, im systemischen Gewebe aber die Um-

wandlung zu JA erforderlich ist, um die Expression von Proteinaseinhibitoren zu induzieren,

dann sollte nach einer Verwundung der Wildtyp-Unterlage die Bildung des PI-II Transkriptes

lediglich im unteren � dem Wildtypteil � nachweisbar sein. Wenn jedoch OPDA ausreichend

sein sollte, dann müsste im opr3-Pfropfreis ebenfalls die mRNA des PI-II nachgewiesen werden

können. Im Falle der reziproken Pfropfung mit opr3 als Unterlage und dem Wildtyp als Pfropf-

reis wäre eine Induktion der PI-II mRNA im Pfropfreis nur dann zu erwarten, wenn OPDA als

systemisches Signal ausreicht. Ein Ausbleiben der systemischen Antwort würde in diesem Fall

auf die JA selbst, oder zumindest auf einen Stoff downstream von OPR3 als systemisches Signal

hindeuten.

Eine Pfropfung (dargestellt als �Unterlage/Pfropfreis�=wt/J6, bzw. J6/wt) wurde zunächst im

unverwundeten Zustand auf die Expression des PI-II getestet, um sicherzustellen, das der durch

die Pfropfung ausgeübte Wundstress abgeklungen war. In den unverwundeten Kontrollen J6/wt

und wt/J6 liess sich das Transkript des PI-II nicht nachweisen. Hieraus kann geschlossen werden,

dass die nach der Pfropfung erfolgte Wundreaktion bereits abgeklungen war, und dass diese

Pflanzen auch durch andere Umstände nicht verwundet waren (Abb. 36)

3 Ergebnisse

54

Bei Pfropfung der Linie J33 auf eine Wildtypunterlage (wt/J33) wurde nach Verwundung der

Unterlage eine lokale wie auch die systemische Akkumulation des PI-II Transkriptes beobachtet.

Offensichtlich ist in der Unterlage das systemische Signal gebildet worden, und im Pfropfreis ist

die OPR3 nicht erforderlich, um auf dieses Signal zu reagieren. In der reziproken Pfropfung

Abb. 36: Northern Blots (c) zum Nachweis von PI-II in Pfropfungen von Wildtyp (wt) mit ver-schiednen opr3-Linien. Es wurde jeweils die Pfropfunterlage verwundet, der fett dargestellte Teilder gepfropften Pflanze wurde in der jeweiligen Spur des Gels analysiert. (b): 1 % Agarosegelmit EtBr gefärbt wurde. Die Pfropfungen J6 mit wt wurden als unverwundete Kontrolle verwen-det.

J6 J6 wt wt J7 J7 wt wt J33 J33 wt wt

wt wt J6 J6 wt wt J7 J7 wt wt J33 J33

unverwundet

a

b

c

wt P2 P2 wt

P2 P2 wt wt a

b

c

Abb. 37: Northern Blots (c) zum Nachweis von PI-II in Pfropfungen von Wildtyp (wt) mit verschiednen opr3-Linien. Es wurde jeweils die Pfropfunterlage verwundet, der fett dargestellte Teil der gepfropften Pflanze wurde in der jeweiligen Spur des Gels analy-siert. (b): 1 % Agarosegel mit EtBr gefärbt wurde. Die Pfropfungen J6 mit wt wurden als unverwundete Kontrolle verwendet.

3 Ergebnisse

55

(J33/wt) war die lokale Wundreaktion der Unterlage sehr eingeschränkt, und eine systemische

Reaktion im Wildtyp Pfropfreis war nicht nachweisbar (Abb. 36). OPR3 ist also lokal für die

Bildung des systemischen Signals erforderlich. Ein ähnliches Ergebnis wurde für die Pfropfun-

gen wt/P2 und P2/wt erhalten, wenn auch hier die Wundreaktion in P2/wt nicht ganz so stark

unterdrückt war wie in J33/wt (Abb. 36). Ein abweichendes Bild ergaben die Pfropfungen mit

der Linie J7 hier erfolgte auch in der verwundeten Wildtyp-Unterlage keine Wundreaktion.

Da das beschrieben Pfropfexperiment kein einheitliches Ergebnis lieferte, wurde es mit neuen

Pfropfungen wiederholt. Das Ergebnis ist widersprüchlich und in Abb. 37 gezeigt. In einigen

Fällen war auch nach Verwundung der Wildtyp-Unterlage keine Induktion des PI-II Transkriptes

festzustellen. Offenbar war die Wundreaktion in diesen Pflanzen kompromittiert, weswegen aus

diesem Experiment keine weiteren Schlüsse auf die Natur des systemischen Wundsignals gezo-

gen werden sollten.

3.2.2.1 Pfropfungen Wildtyp mit aos

Auf die gleiche Weise wie zuvor wurden

auch Pfropfungen zwischen wt und aos-

RNAi-Tomatenpflanzen angefertigt, wel-

che ebenfalls am Institut vorhanden waren

und für diese Versuche zur Verfügung

gestellt wurden. Aus dieser Pfropfung

erhofften wir uns, herauszufinden, ob

OPDA das Signal zur Induktion von PI-II

ausreicht, denn bei dieser Mutante fehlt

bekanntlich das OPDA, somit ist dies eine

sehr gute Methode dies herauszufinden.

Abb. 38 zeigt den Northern Blot, auf wel-

chen RNA aufgetragen wurde, welche von

Pfropfungen zwischen wt und aos-RNAi-

Tomatenpflanzen stammte. Die unver-

wundete Kontrolle zeigt keine Bildung

von PI-II, weder im Unterteil noch im

Oberteil, egal ob diese Wildtyp oder aos

war. Allerdings blieb auch in verwundeten

Abb. 38: Northernblot (b) von Pfropfungen von wt und aos-Tomatenpflanzen. Unterstrichene und dickgedruckte Bezeichnungen geben die Herkunft der RNA an, der Strich stellt die Pfropfung dar. Auf dem linken Blot ist die RNA von unverwundeten Kontrollen und im rechten Blot die der verwundeten Pflanzen zu sehen. Verwundet wurde der untere Teil der Pfropfung. Auf das Gel wurde 2,5 µg RNA aufgetragen. (a) stellt die mit EtBr gefärbte Ladungskontrolle dar.

unverwundet

wt aos wt

wtaos wt

aos

aos

wt aos wt

wt aos wt

aos

aos

a

b

3 Ergebnisse

56

Wildtyp-Unterlagen die Induktion des PI-II Transkriptes aus. Offenbar war auch in diesen Pflan-

zen die Wundreaktion kompromittiert. Die Ergebnisse sind also nicht interpretierbar. Eine mög-

liche Ursache mag in einer Infektion der Pflanzen durch den Tomaten Mosaikvirus (ToMV) lie-

gen (s. Diskussion).

4 Diskussion

57

4. Diskussion

Ein zentrales Gen der JA-Biosynthese ist die OPR3. Sie katalysiert die Umsetzung von OPDA zu

OPC8:0 unter Verwendung von NADPH. Um nun zu überprüfen, welche Funktion OPR3 in

Tomate hat, beziehungsweise was geschieht, wenn keine Jasmonsäure gebildet werden kann,

wurden im Vorfeld dieser Arbeit Pflanzen mittels RNA-Interferenz generiert, bei welchen die

OPR3 herunterreguliert sein sollte.

Obwohl die Folgen des Funktionsverlustes von OPR3 in Arabidopsis detailliert untersucht wor-

den sind, müssen die Arbeiten auf Tomate ausgedehnt werden, da die Ergebnisse nicht unbedingt

auf Tomate übertragen werden können.Dies wird schon daran deutlich, dass die Mutanten in

Arabidopsis welche einen Defkt in entweder der Bildung oder der Erkennung von Jasmonaten

eine männliche Sterilität zeigen [Feys et al., 1994; McConn und Browse; 1996; Sanders et al.,

2000; Stintzi und Browse, 2000; Ishiguro et al., 2001; Park et al., 2002; von Malek et al., 2002].

In Tomate wurde kürzlich auch eine Mutante charakterisiert, welche nicht in der Lage war Jas-

monsäure (jai1 für JASMONATE INSENSITIVE), zu erkennen. Sie war im Gegensatz zu den

erwähnten Arabidopsis-Mutanten nicht männlich steril, sondern zeigte vielmehr ein Defekt an

der Kontrolle der Entwicklung des weiblichen Gametophyten [Li et al., 2004].

Des weiteren ist bekannt, dass Mutanten, welche an der Bildung und Erkennung von Jasmonaten

beteiligt sind, ein Defizit in der Pathogenantwort aufweisen. Mit einer bisher bekannten Aus-

nahme: die opr3-Mutante in Arabidopsis zeigt sich nicht beeinträchtigt in der Resistenz gegen

die Larven der Bradysia-Mücke und den pathogenen Pilz Alternaria brassicicola. Hierfür wird

OPDA als Signalmolekül verantwortlich gemacht, welches diese Resistenz hervorruft [Stintzi et

al., 2001]. In Tomate wurde bis jetzt nur gezeigt, dass eine Mutante, welche downstream von

OPR3 liegt (acx) keine derartige Möglichkeit der Reaktion auf Insektenlarven hat � sie ist anfäl-

lig gegen Larven des Tabakschwärmers (Manduca sexta) [Li et al., 2005]. Dies könnte ein Hin-

weis darauf sein, dass OPDA nicht in der Lage ist Jasmonsäure in Tomatenpflanzen zu ersetzen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Versuche unternommen, diese Hypothese zu bekräftigen oder

zu widerlegen.

4 Diskussion

58

4.1 Ist OPDA ein Wundsignal?

Viele Pflanzen reagieren auf Insektenfraß und mechanische Verwundung mit der Expression von

Genen, welche an der Wundheilung und Abwehr beteiligt sind. Sowohl an der Verwundungsstel-

le als auch im gesamten Organismus entfalten sie nach der Verwundung ihre Wirksamkeit

[Green und Ryan, 1972]. Von hier ab, entbrannte eine bis heute andauernde Diskussion über

das/die Signal/e, welche diese �Immunantwort� auslöst/en.

Pfropfungsexperimente zwischen spr2/LeFad7 und jai1-2 zeigten ganz klar, dass Jasmonate eine

Signalrolle in der Wundreaktion der Tomate spielen [Li et al., 2002] Spr2 ist nicht in der Lage

Fettsäuren, welche zweifach ungesättigt sind, in dreifach ungesättigte umzuwandeln. Dies hat

zur Folge, dass für die Bildung von Jasmonaten die mehrfach ungesättigten Fettsäuren Linolen-

säure und Hexatriensäure fehlen. Jai1-2 dagegn ist wie die Arabidopsis coi1-Mutante JA insensi-

tiv. Die gepfropften Pflanzen zeigten nach Verwundung keinerlei Reaktion in Bezug auf die

Bildung von Proteinaseinhibitoren, weder systemisch noch lokal. Proteinaseinhibitoren wurden

jedoch gebildet, wenn die Pflanzen mit Methyljasmonsäure besprüht wurden.

Weitere Pfropfungsexperimente zwischen der JA defizienten def1- und der JA-insensitiven jai1-

Mutante zeigten, dass für eine erfolgreiche Wundreaktion lokal die Synthese von Jasmonaten

erforderlich ist. In systemischen Geweben dagegen ist nicht die Synthese sondern die Perzeption

von Jasmonaten für die Induktion der Abwehrgene notwendig [Li et al., 2002]. Damit in Ein-

klang stehen auch die Befunde von Strassner et al. (2002), die zeigten, dass es nach Verwundung

von Tomatenpflanzen lokal aber nicht systemisch zu einem transienten Anstieg im JA Gehalt

kommt. Diese Arbeiten liefern keinen Aufschluss darüber, ob JA oder die biosynthetische Vor-

stufe OPDA als Signalmolekül in Frage kommen. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf

hin, dass OPDA nicht als systemisches Signal für eine Wundreaktion ausreichend ist, wohl aber

lokal.

Zu diesem Schluß gelangten auch Li et al., [2005], die ihre Ergebnisse veröffentlichten während

diese Arbeit erstellt wurde. Dort wurde eine Mutante vorgestellt, welche ihren Defekt

�downstream� von opr3 hatte. Dieser Defekt lag im ersten Schritt der β-Oxidation. Die Ergeb-

nisse von Pfropfungsexperimenten zeigten, dass für die systemische Wundreaktion die Verkür-

zung der Seitenkette von OPC8:0 notwendig ist. Die Fragestellung, ob Jasmonsäure oder OPDA

die transportierten Signale sind wurde im Rahmen dieser Arbeit erneut aufgegriffen, konnte aber

mit Hilfe der hier durchgeführten Pfropfungsexperimente zwischen Wildtyp, opr3 und aos nicht

abschließend geklärt werden. So wurden PIs nach Verwundung von opr3-Unterlagen in diesen

4 Diskussion

59

jedoch nicht im Wildtyp Pfropfreis gebildet. Dies würde darauf hin deuten, dass OPDA kein

transportiertes Signal ist. Vielmehr hat es den Anschein, dass JA ein transportiertes Signal dar-

stellt. Denn in der reziproken Pfropfung wurden sowohl in der Wildtyp-Unterlage als auch im

oberen opr3-Teil PIs nachgewiesen. Was allerdings etwas zu denken gab, war der Befund dass in

einigen Experimenten nach Verwundung der Wildtypunterlage keine Bildung von PIs im oberen

opr3-Teil zu finden war. Dies würde bedeuten, dass weder JA noch OPDA transportiert wird.

Dieses Ergebnis ist jedoch mit den zuvor gemachten Untersuchungen in keinen Konsens zu brin-

gen. Deshalb muss hier davon ausgegangen werden, dass die herbivorspezifische Wundabwehr

herunterreguliert sein muss. Dies kann zum Beispiel durch eine Virusinfektion geschehen.

Durch einen Zufall wurde das ToMV im Gewächshaus festgestellt. Die ToMV Infektion hat

eine sehr große Auswirkung auf die Pfropfungen und Wundantworten. Eine Infektion von Viren

führt bei Pflanzen zur Bildung von Salicylsäure. Preston und andere hatten 1999 gezeigt, dass

mit TMV (Tabakmosaikvirus) infizierte Tabakpflanzen, welche Salicylsäure bildeten und somit

auch die Systemisch Erworbene Resistenz (SAR = Systemic-acquired resistance) nicht in der

Lage waren, JA-abhängige Abwehrgene zu exprimieren. Dies ist auf die zur Jasmonsäure anta-

gonistische Wirkung der Salicylsäure zurückzuführen, welche über das regulatorische Protein

NPR1 vermittelt wird [Dong, 2001; Pieterse und van Loon, 2004]. Allem Anschein zur Folge,

muss NPR1 nicht in den Kern transportiert werden, um die Jasmonsäureantwort herunterzudros-

seln. Vielmehr scheint NPR1 im Cytosol dies zu bewerkstelligen. Die genaue Wirkung von

NPR1 auf die Expression von Jasmonsäure-abhängigen Genen ist unbekannt. Eine mögliche

Rolle könnte, der als negativer Regulator der Jasmonsäure-abhängigen Abwehrgenexpression

dienende SCFCOI1-Ubiquitin-Ligase-Komplex [Devoto et al., 2002; Xu et al., 2002] spielen. Über

eine gezielte Ubiquitinylierung und anschließenden Abbau der auf diese Weise markierten Prote-

ine durch das Proteasom, werden so die auf die Jasmonsäure folgenden Abwehrantworten ge-

steuert [Review: Pozo et al. 2005].

Abb. 39: Wechselwirkung verschiedener Signalmoleküle in pflanzlichen Abwehrreaktionen [Kunkel und Brooks,2002]

4 Diskussion

60

Abb. 39 zeigt die Wechselwirkungen verschiedener Signalmoleküle nach Pathogenbefall in

Pflanzen. In dieser Grafik sind drei Möglichkeiten der Pathogenerkennung herausgearbeitet, der

Ethylen-, der Salicylsäure- und der Jasmonsäureweg. Nach einer Verwundung durch Bakterien

wird der Ethylenstoffwechsel aktiviert, welcher zur Bildung von Ethylen und schließlich zur

Bildung von ROS (Reactive-Oxygen-Species) führt. Der Ethylenstoffwechsel kann durch den

Jasmonsäurestoffwechsel ebenfalls aktiviert werden und umgekehrt. Virale und andere bakteriel-

le Pathogene lösen hingegen eine Reaktion aus, welche in Richtung Salicylsäure wirkt. Eine

ToMV-Infektion der Versuchspflanzen könnte also zur Bildung von Salizylsäure geführt haben,

welche sich dann negativ auf die Induktion der JA-abhängigen Abwehrgene ausgewirkt haben

mag. Mit Hilfe eines polyklonalen, gegen das Hüllprotein des ToMV gerichteten Antikörpers,

(Geschenk von Prof. A. Pfitzner, Allgemeine Virologie, Uni Hohenheim) wurden die Versuchs-

pflanzen auf ein mögliche ToMV Infektion hin untersucht. Eine Dot-Blot Analyse zeigte, dass

viele opr3-Pflanzen, darunter auch die gepfropften Versuchspflanzen, mit ToMV infiziert waren

(Abb. 40).

4.2 Einfluss von OPDA und JA auf die Entwicklung

Wie bereits erwähnt, haben Jasmonate � als Phytohormone � einen Einfluss auf die Entwicklung

von Pflanzen [Wasternack, 2005]. So konnte gezeigt werden, dass Arabidopsis-Pflanzen, welche

ein Defizit in der Bildung und Erkennung von Jasmonaten haben, einen Defekt in der Ausbil-

Abb. 40: Dotblot-Analyse zum Test auf Tomatenmosaikvirusbefall (durchgeführt von Jutta Ba-bo).In der oberen Hälfte wurden Proteinextrakte von aos-Tomatenpflanzen, in der unteren von opr3-Tomatenpflanzen aufgetragen.

aosopr3

4 Diskussion

61

dung des männlichen Gametophyten haben [Feys et al., 1994; McConn und Browse; 1996; San-

ders et al., 2000; Stintzi und Browse, 2000; Ishiguro et al., 2001; Park et al., 2002; von Malek et

al., 2002]. Hause et al., [2000] zeigten indes, dass in Tomatenpflanzen die Bildung von Jasmona-

ten hauptsächlich in Blütenknospen, -stängeln und Wurzeln stattfindet. Dies deckt sich mit der

Erkenntnis, dass Jasmonate die Entwicklung des weiblichen Gametophyten regulieren [Li et al.,

2004], sie zeigten, dass jai1-Pflanzen nicht in der Lage waren auf Jasmonate zu reagieren und

auf die Entwicklung des weiblichen Gametophyten Einfluss nimmt. In Tomatenpflanzen dage-

gen führt JA-Insensitivität nach Li et al. (2004) zu einem Defekt in der Entwicklung des weibli-

chen Gametophyten. Der Phänotyp der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten opr3-Pflanzen

deutet dagegen auf eine Rolle von Jasmonsäure in der Embryonalentwicklung. So kam es bei

Bestäubung emaskulierter opr3-Pflanzen mit Wildtyppollen zur Bildung von �kleinen� Samen,

welche einen im globulären Stadium arretierten Embryo besaßen. Dieses Ergebnis wäre noch mit

einem Defekt im weiblichen Gametophyten oder sogar durch einen Einfluss des Sporophyten

erklärbar. Das gleiche Ergebnis wurde aber auch bei der reziproken Bestäubung von Wildtyp-

pflanzen mit mutantem Pollen gewonnen. Der Phänotyp wird also durch die Anwesenheit des

�silencing�-Konstruktes im sich entwickelnden Samen verursacht. Da bei der doppelten Befruch-

tung jeweils ein Spermakern mit dem Endospermkern und der Eizelle verschmilzt, kann nicht

unterschieden werden, ob es der OPR3 Funktionsverlust im Endosperm oder im Embryo ist, der

für den Phänotyp verantwortlich ist. Weiterhin wurde in opr3-Tomatenpflanzen beobachtet, dass

die Blüten austrockneten und von den Pflanzen abfielen, da es nicht zu einer Bestäubung kam.

Die Fertilität konnte wie in Arabidopsis durch die Gabe von MeJA wieder hergestellt werden.

Offenbar ermöglicht MeJA sowohl die Bestäubung, als auch die Komplementierung des defektes

in der Embryonalentwicklung. Das Zeitfenster der Wirksamkeit von MeJA scheint in opr3-

Tomaten wie auch in Arabidopsis eine wichtige Rolle zu spielen. Anfangs war nur eine partielle

Aufhebung der Defekte in opr3-Pflanzen zu beobachten: Es kam nach MeJA-Behandlung zur

Bildung von Früchten mit durchscheinenden, nicht keimfähigen Samen. das für MeJA gabe

kritische Stadium der Blütenentwicklung konnte in opr3-Tomaten noch nicht exakt bestimmt

werden. Es hat jedoch den Anschein, als würde Jasmonsäure in der frühen Blütenentwicklung

benötigt. Übereinstimmend konnten Hause et al., (2000) zeigen, dass es in gerade diesem Sta-

dium zur verstärkten Expression von AOC und zur Bildung von Oxylipinen kommt.

Letztlich wurden in opr3-Pflanzen noch zwei Veränderungen beobachtet, die traditionell eher

mit Auxinen als mit Jasmonaten in Verbindung gebracht werden: die parthenocarpische Frucht-

bildung und die Entwicklung von Adventivwurzeln. Es bleibt letztlich ungeklärt, ob diese Phä-

nomene auf das �silencing� von OPR3 zurückzuführen sind. Alternativ wäre denkbar, dass die

ToMV-Infektion indirekt zur Aktivierung Auxin-abhängiger Gene und damit zur Auslösung die-

4 Diskussion

62

ser Auxin-abhängigen Reaktionen geführt hat. Auxinabhängige Gene besitzen in ihren Promo-

toomren ein Element, welches sich AS1 (Activating Sequence) nennt [Niggeweg et al., 2000].

Das gleiche Element findet sich im 35S-Promotor des Blumenkohl Mosaikvirus (CaMV) und in

Promotoren, welche durch Salicylsäure aktiviert werden [Niggeweg et al., 2000]. Wenn infolge

der ToMV-Infektion die Konzentration an Salicylsäure steigt, hätte dies die Aktivierung aller

Gene zur Folge, die durch das AS1-Element reguliert werden, einschließlich der Gene der Au-

xin-Antwort [Niggeweg et al., 2000]. Das ToMV würde also indirekt eine Auxinreaktion auslö-

sen, hier die Bildung von Adventivwurzeln und die Parthenocarpie (Abb. 30-32)

Somit könnte das Modell der Wechselwirkung der verschiedenen Phytohormone wie folgt aus-

sehen: Unterschiedliche Umwelteinflüsse führen zur Bildung von Jasmonaten oder Auxinen.

Jasmonate führen zu der spezifischen Abwehrreaktion. Coi1 bzw. sein ortholog jai1 führen zur

Hemmung der Wurzelbildung. Da nun aber keine Jasmonsäure gebildet werden kann, welche

über COI1 oder JAI1 erkannt werden kann, wird das Wurzelwachstum auch nicht gehemmt. Da

nun noch zusätzlich eine virale Infektion auftrat, welche schließlich zur Bildung von Salicylsäure

führte, und diese die Auxinreaktion zusätzlich fördern könnte, führt dies zu einer erhöhten Wur-

zelbildung und zur Bildung samenloser Früchte (Abb. 41).

Abb. 41: Modell der Wechselwirkungen zwischen Jasmonaten, Auxinen und Salicyl-säure. Pfeile zeigen eine Stimulanz, Linien mit Querbalken eine Hemmung. Verän-dert nach Devoto und Turner, 2003

V ersch. Umwel teinflüsse

JA Auxine

Virus

Salicylsäure

Coi1/jai1

Abwehrreaktion Abwehrreaktionen Wurzelwachstum Parthenocarpie

4 Diskussion

63

4.3 Ausblick

Die Arbeiten an opr3 sind keines Falls abgeschlossen. Am interessantesten wäre zu wissen, ob

OPDA ein transportiertes Signal zur systemischen Wundreaktion ist oder nicht, da wegen der

Virusinfektion dies nicht eindeutig belegt werden, gibt es dennoch Hinweise hierauf.

In Bezug auf die phänotypische Charakterisierung ist noch wichtig zu überprüfen, ob der Pollen

tatsächlich wegen eines nicht geöffneten Stomiums freigesetzt wird. Um dies zu überprüfen

würden sich Querschnitte durch den Antherenkonus anbieten. Der Pollen sollte nicht nur auf

Keimfähigkeit sondern auch auf Vitalität in Bezug auf die Pollenkerne untersucht werden.

Die Virusinfektion � so schlecht sie für die Überprüfung von Wundreaktionen ist, könnte aber

auch ein interessantes �Hilfsmittel� sein, um noch mehr über das komplexe Zusammenspiel zwi-

schen den verschiedenen Phytohormonen bes. Auxinen zu erfahren.

Da in Cocktailtomaten stets sehr viele Samen enthalten sind, könnte die Parthenocarpie auch für

die Züchtung neuer Nutzarten ein gewisses Interesse beinhalten.

Die Regeneration durch Besprühen mit MeJA sollte eventuell etwas verfeinert werden, eventuell

entspricht die verwendete Konzentration nicht der gebrauchten Konzentration überein und man

könnte noch schneller in eine weitere Generation kommen, außerdem könnte versucht werden

zusätzlich zur Besprühung MeJA zu injizieren, denn es wurden Ergebnisse veröffentlicht wo-

nach Jasmonsäure hauptsächlich in Siebelementen gebildet wird [Hause et al., 2003a]. Durch

Injektion könnte man dieses Gewebe leichter erreichen.

Auch sollte der Gehalt an Jasmonaten in opr3-Pflanzen im Gegensatz zu Wildtyppflanzen getes-

tet werden für diese Untersuchungen würden sich Gaschromatographische Untersuchungen am

besten eignen.

Pfropfungen zwischen Wildtyp und opr3 könnten ebenfalls einen Aufschluss über die Fähigkeit

der Reaktion auf Herbivorie (z. B. durch Manduca sexta-Larven) ergeben. Außerdem wären

Versuche bezüglich des Unterschieds der Nahrungsaufnahme zwischen opr3 und wt-Pflanzen

sehr interessant, da diese Aufschluss über die Nahrungsverwertung geben könnte, wenn Protei-

naseinhibitoren durch das Ausschalten von OPR3 fehlen.

Die Überexpression von OPR3 könnte eine erhöhte Resistenz von Pflanzen gegen Insektenfraß

darstellen, und sollte ebenfalls getestet werden.

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5.2 Abbildungen und Tabellen

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Abb. 2: Die Wirkungen von Jasmonaten auf Stressoren, und ihre Beteiligung an der

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Abb. 3: Oktadekanoidweg nach Schaller et al., 2005

Abb. 4: Biosynthese der Jasmonsäure in ihren Zellorganellen, Farben, welche kräftig

gedruckt sind experimentell nachgewiesene Daten, während die transparente

Hypothesen präsentieren. Die gepunkteten Pfeile weisen auf Hypothetischen

Transporte weg hin. [aus Schaller, et al., 2005]

Abb. 5: MGDG-O und OPDA

Abb. 6: Signalkaskade nach (herbivorer) Verwundung zur Bildung von Jasmonsäure

und schließlich auch von Abwehrgenen. Mit Oktadekanoidweg, welcher zur

Bildung von Jasmonsäure führt.

Abb. 7: Blüte von Arabidopsis im Stadium 13 der Blütenentwicklung (oben) und Pol-

lenkeimung (unten), im Vergleich von Wildtyp (links) zu opr3-Mutante

(rechts). (Bilder freundlicher Weise von Annick Stintzi zur Verfügung ge-

stellt)

Abb. 8: Signaltransduktionskaskade von Jasmonsäure, im Wt (links) und coi1 (rechts).

Die beiden Substratgruppen (S1 und S2) werden durch das JA-Signal, welches

den SCFCOI-Komplex aktiviert, ubiquitinyliert und schließlich über das 26S-

Proteasom abgebaut. Die beiden Antwortgene (G1 und G2) bilden schließlich

die entsprechenden Antworten (Response I und II) (aus Xiao et al., 2004)

Abb. 9: Microarray-Analyse. Links, Vergleich von verwundeten (W) und unverwun-

deten (C=Controle) Blättern (! W/C). Rechts, das Verhältnis von Systemi-

schen (S) zu Verwundeten (W) Blättern. Der obere Teil zeigt das die Gene des

Oxilipinstoffwechsels, der mittlere, die der Wundantwort und die der Patho-

genabhänhigen Gene, im unteren Teil sind die Gene, welche an der Bildung

von aromatischen Aminosäuren benötigt werden gezeigt [aus Strassner et al.,

2002].

Abb. 10: Schematischer Aufbau der Westernblotapparatur. Aus Diplomarbeit von Dirk

Zimmermann

5 Verzeichnisse

73

Abb. 11: pRTL2-FAD2-Intron-Vektor mit OPR3 in Sense- und Antisense-Orientierung.

Die Restriktionsschnittstellen sind angegeben, wie auch die Left- und Right-

Border (LB und RB) der T-DNA, die Position des 35S Promotors und des

Terminators (Term)

Abb. 12: Primerkarte des RNAi-Konstrukts. Pfeile deuten die Bindungsstellen der Pri-

mer an

Abb. 13: Nachweis des RNAi-Konstrukts in den transgenen Pflanzen. 1 % Agarosege-

le, welche mit EtBr gefärbt wurden. Die jeweilige opr3-Linie, ist angegeben,

ebsenso sind die Spuren mit gleichbehandelter wt DNA (wt), der Negativkon-

trolle (Mastermix ohne DNA, MM), und der Positivkontrolle (+), wie auch die

einegsetzten Primerkombinationen angegeben.

Abb. 14: Westernblot (a) mit dazugehörigen Coomassie-gefärbten (b) Gel. Aufgetragen

wurden Proteinextrakte dreier verschiedener opr3-RNAi-Linien (Lines) und

des Wildtyps jeweils unverwundet (-) und verwundet (+) (15 µg) sowie aufge-

reinigtes OPR3 (10 ng); Grössenstandard.

Abb. 15: Westernblot (a) mit dazugehörigen Ponceaugefärbten-Blot (b). Aufgetragen

wurden Proteinextrakte dreier verschiedener opr3-RNAi-Linien (Lines), und

des Wildtyps, jeweils unverwundet (-) und verwundet (+) (15 µg) sowie auf-

gereinigte OPR3 (10 ng) und ein Grössenstandard.

Abb. 16: Phänotyp der LeOPR3-RNAi-Pflanzen. Die Blüten von opr3-Pflanzen trock-

nen aus und fallen ab, während der Wildtyp Früchte bildet.

Abb. 17: Pollenkeimungsrate von wt und vier verschiedenen opr3-Linien (J3, P10, J30

und J18). n(wt) = 1403, n(J3) = 406, n(P10) = 544, n(J30) = 1743, n(J18) =

1717

Abb. 19: Samenverteilung. Nach dem Ernten der Samen beider reziproker Kreuzungen

wurde eine Verteilung der Samen in große, normal entwickelte und �kleine�

Samen festgestellt

5 Verzeichnisse

74

Abb. 20: Zeichnung basierend auf einer Elektronenmikroskopischen Aufnahme eines

reifen Samens von Capsicum annum. Die Struktur stimmt mit der des Toma-

tensamens überein. Quelle: http://www.seedbiology.de/structure.asp

Abb. 21: Embryostruktur der kleinen Samen, welche durch Kreuzung mit Wildtyppol-

len generiert wurden. Die beiden linken Bilder zeigen gebleichte kleine Sa-

men, die rechten Bilder 4µm dicke Längsschnitte. Das obere rechte Bild wur-

de mit Toluidinblau, das untere rechte Bild nach �Etzold� gefärbt. Die Größe

der Embryonen betrug etwa 200 µm.

Abb. 22: Nachweis des RNAi-Konstrukts in den Embryonen (E) und Kotyledonen (K).

1 % Agarosegel, welches mit EtBr gefärbt wurde. Die jeweilige Kreuzungs-

richtung (♀ x ♂) ist angegeben, ebenso wie die Herkunft der DNA aus Emb-

ryonen (E) oder Kotyledonen (K), eine Positivkontrolle (+), die Negativkon-

trolle (Mastermix ohne DNA, MM) und die jeweilige Primerkombination

Abb. 23: Samenverteilung in �groß� und �klein� nach Kreuzen von opr3-Pflanzen mit

Wildtyppollen

Abb. 24: Samenverteilung in �groß� und �klein� nach Kreuzen von Wildtyppflanzen

mit opr3-Pollen

Abb. 25: Samenverteilung in �groß� und �klein� nach pressen von opr3-Pflanzen.

Abb. 26: Austrocknen der Blüten ohne MeJA-Behandlung.

Abb. 27: Austrocknen der Blüten nach Besprühung mit 0,3 % MeJA. Die Blüten trock-

neten im Vergleich zu unbehandelten Pflanzen schneller ab

Abb. 28: Samen nach Besprühen mit MeJA (0,003 %). Der Pfeil kennzeichnet das im

Text erwähnte bräunliche Gewebe.

Abb. 29: Samen nach andauernder Behandlung mit MeJA (0,003 %). Die Samen sind

normal entwickelt und keimfähig.

5 Verzeichnisse

75

Abb. 30: Fruchtbildung nach 10 Monaten in opr3 (links). Die Größe der opr3-Tomaten

war mit Cherry- bzw. Cocktailtomaten vergleichbar. Rechts ist eine Wildtyp-

tomate zu sehen.

Abb. 31: Aufgeschnittene opr3-Tomate (links), welche keinerlei Samen enthielt und

eine aufgeschnittene Wildtyptomate (rechts) in welcher deutlich die Samen zu

erkennen sind.

Abb. 32: Luftwurzelbildung in 10 Monate alten Pflanzen. Links: Wildtyp, Mitte: opr3-

Pflanze am Boden sind Luftwurzeln zu erkennen. Rechts: Luftwurzelbildung

an opr3-Mutante an einem Zweig, welcher etwa 50 cm über dem Boden war.

Abb. 33: schematische Tomatenpflanze. Dunkelblaue Striche zeigen die Verwundung

zum Zeitpunkt null, hellblaue Striche Verwundung zum Zeitpunkt +1, und

Kreise markieren die Blättchen aus denen RNA extrahiert wurde.

Abb. 34: Northern Blot (b) für die systemische Antwort, ob PI-II akkumuliert mit zu-

gehörigem EtBr gefärbten 1 % Agarose Gel (a), Die untersuchten Linien, so-

wie ob Verwundet wurde oder nicht. Verwundet (+) unverwundet (-). Sowie

Kontroll-RNA aus Pfropfungen.

Abb. 35: Bilder einer gepfropften Pflanze. Das linke Bild zeigt die gesamte Pflanze, das

rechte Bild die Pfropfung. Der Pfeil deutet auf die Pfropfstelle. In diesem Fall

ist die Wildtyppflanze die Unterlage, welche später verwundet wurde, und der

Spross einer opr3-Pflanze wurde als Pfropfreis eingesetzt.

Abb. 36: Northern Blots (c) zum Nachweis von PI-II in Pfropfungen von Wildtyp (wt)

mit verschiednen opr3-Linien. Es wurde jeweils die Pfropfunterlage verwun-

det, der fett dargestellte Teil der gepfropften Pflanze wurde in der jeweiligen

Spur des Gels analysiert. (b): 1 % Agarosegel mit EtBr gefärbt wurde. Die

Pfropfungen J6 mit wt wurden als unverwundete Kontrolle verwendet.

Abb. 37: Northern Blots (c) zum Nachweis von PI-II in Pfropfungen von Wildtyp (wt)

mit verschiednen opr3-Linien. Es wurde jeweils die Pfropfunterlage verwun-

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det, der fett dargestellte Teil der gepfropften Pflanze wurde in der jeweiligen

Spur des Gels analysiert. (b): 1 % Agarosegel mit EtBr gefärbt wurde. Die

Pfropfungen J6 mit wt wurden als unverwundete Kontrolle verwendet.

Abb. 38: Northernblot (b) von Pfropfungen von wt und aos-Tomatenpflanzen. Unter-

strichene und dickgedruckte Bezeichnungen geben die Herkunft der RNA an,

der Strich stellt die Pfropfung dar. Auf dem linken Blot ist die RNA von un-

verwundeten Kontrollen und im rechten Blot die der verwundeten Pflanzen zu

sehen. Verwundet wurde der untere Teil der Pfropfung. Auf das Gel wurde

2,5 µg RNA aufgetragen. (a) stellt die mit EtBr gefärbte Ladungskontrolle

dar.

Abb. 39: Wechselwirkung verschiedener Pathogene im Pflanzenreich [Kunkel und

Brooks, 2002]

Abb. 40: Dotblot zum Test gegen Tomatenmosaikvirusbefall, von Jutta Babo durchge-

führt, in der oberen Hälfte wurden Proteine von aos-Tomatenpflanzen in der

unteren von opr3-Tomatenpflanzen aufgetragen. Jeder Punkt entspricht einer

mit ToMV infizierter Pflanze.

Abb. 41: Modell der Wechselwirkungen zwischen Jasmonaten, Auxinen und Salicyl-

säure. Pfeile zeigen eine Stimulanz, Linien mit Querbalken eine Hemmung.

Verändert nach Devoto und Turner, 2003

Tabellen

Tab. 1: Kreuzungsschema opr3 weiblich (rot: weiblich; blau: männlich)

Tab. 2: Kreuzungsschema opr3 männlich (rot: weiblich, blau männlich)

Tab. 3: Kreuzungsschema für opr3 ! opr3 durch pressen der Antheren (rot = weib-

lich, blau = männlich)

5.3 Erläuterungen und Abkürzungen

5 Verzeichnisse

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Erläuterungen

Gemäß der Arabidopsis-Nomenklatur, wurden in dieser Arbeit Gene in Großbuchstaben und

kursiv gedruckt, kleine kursive Buchstaben bezeichnen das entsprechende mutierte Gen.

Großbuchstaben normal gedruckt deuten auf das � dem gedruckten Gen � entsprechende Protein

hin.

Abkürzungen

16:2 Hexadecadiensäure

16:3 Hexadecatriensäure

18:2 Oktadekadiensäure (Linolsäure)

18:3 Oktadekatriensäure (α-Linolensäure)

°C Grad Celsius

Abb. Abbildung(en)

ABC ATP-binding-Cassette

ACX Acyl-CoA-Oxidase

AOC Allenoxidcyklase

AOS Allenoxidsynthase

AS1 Activating Sequence

BSA Bovine-Serum-Albumin (Rinderserumalbumin)

CaMV Cauliflowermosaikvirus (Blumenkohlmosaikvirus)

c-DNA complementary DNA

Coi Coroantin insensitiv

CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid

CTS COMATOSE

Da Dalton

dd doppelt destilliert

DEX DNA-Extraktionspuffer

DISK-PAGE Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese

DNA Desoxyribonuclenic acid = DNS

dnOPDA dinor-Oxophytodiensäure

DNS Desoxyribonukleinsäure = DNA

E Embryo

5 Verzeichnisse

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EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EMS Ethylmethansulfonat

et al. unter anderen

EtBr Ethidiumbromid

EtOH Ethanol

fad Fatty-acid-desaturase (Fettsäuredesaturase)

fw forward

g Gramm/Gravitationskraft

GUS β-Glucorinodase

h Stunde(n)

IgG Immunglobulin G

JA Jasmonate, Jasmonsäure

jai Jamonat Insensitiv

jar Jasmonate insensitive root growth mutant

k kilo (103)

K Kotyledonen

KAT L-3-Ketoacyl-CoA-Thiolase

l Liter

LB Leftborder

Le Lycopersicon esculentum

LOX Lipoxygenase

LRR Leucin-rich-repeat

µ Mikro (10-6)

m Milli (10-3)

M Molar

MeJA Methyljasmonsäure

MFP multifunktionale Protein

MGDG-O Monogalaktosyldiacylglycerol-12-Oxophytodiensäure

min Minute(n)

ml Milliliter

MM Mastermix

mm Millimeter

mRNA messanger-RNA

MS Murashige & Skoog Medium

n nano (10-9)

5 Verzeichnisse

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Na Nictiana atenuata

NADH Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat

OPC4:0 3-oxo2(2�[Z]-Pentenyl)-Cyclopentan-1-Butansäure

OPC6:0 3-oxo2(2�[Z]-Pentenyl)-Cyclopentan-1-Hexansäure

OPC8:0 3-oxo2(2�[Z]-Pentenyl)-Cyclopentan-1-Oktansäure

OPDA 12-Oxophytodienicacid = (9S, 13S)-12-Oxophytodiensäure

OPR3 12-Oxophytodiensäurereduktase3 (Enzym)

OPR3 12-Oxophytodiensäurereduktase3 (Gen)

opr3 12-Oxophytodiensäurereduktase3 (mutiertes Gen)

PCR Polymerase-Chain-Reaction

PI(s) Proteinaseinhibitor(en)

PI-I Proteinaseinhibitor-I

PI-II Proteinaseinhibitor-II

PPOs Polyphenoloxidasen

RB Right border

rev Reverse

RNA Ribonucleinic acid = RNS

RNAi RNA-Interferenz

RNS Ribonukleinsäure

ROS Reactive-Oxygene-Species

S Swedberg

SAR Systemic-acquired resistance

SCF Skp1p-cullin-F-box protein

SDS Sodiumdodecylsulfat

spr suppressor of prosystemin-mediated responses

Tab. Tabelle

TAE Triacetat-EDTA

TBS Tris-buffered-Saline

TMV Tabakmosaikvirus

ToMV Tomatenmosaikvirus

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

Tween20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat

U Units (Einheiten)

uidA GUS

UV Ultraviolett

5 Verzeichnisse

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v/v Volumen/Volumen

Versch. Verschieden/e

w/v weight/volume

wt Wildtyp

x mal/fach

81

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und unter ausschließlicher Verwen-

dung der angegebenen Hilfsmittel verfasst habe.

Diese Arbeit wurde bisher in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde

vorgelegt und auch noch nicht veröffentlicht. Wörtlich oder inhaltlich übernommene Stellen wurden

von mir als solche gekennzeichnet.

_____________________________Hohenheim, 02. Februar 2006

Andreas Klemm

82

Danksagung

Ich danke:

Allen bedrohten Tier- und Pflanzenarten dieser Welt,

Allen, die sich für den Erhalt dieser Geschöpfe einsetzen,

Orion, Volvox, Ceratium, Leptodora und allen Fossilien, die mein Interesse an der Biologie geweckt haben,

Meinen Eltern, die dieses Interesse entdeckt und gefördert haben,

Herrn Prof. Dr. Schaller dass er mich schwäbeln ließ und die Vergabe der Diplomarbeit,

Herrn Prof. Dr. Spring für die Zweitkorrektur,

Fr. Dr. Annick Stintzi, für die Anleitung und Betreuung,

Fr. Jutta Babo, für das zur Verfügung stellen ihrer �Kinder� und ihre Hilfestellungen,

Allen anderen Technischen Assistenten für die netten Kaffeepausen,

Allen Doktoranden und Mitdiplomanten, für die Gespräche innerhalb und außerhalb des Instituts,

Herrn Dirk Zimmermann für seine Amerikareise,

dem dynamischen König Klaus, für seinen Überblick über alle Chemikalienstandorte,

Den �Mädels� aus den Gewächshäusern, ohne die die Pflanzen nie so gut gediehen wären,

Herrn Thomas Colpan für die Unterstützung beim Pfropfen,

Fr. Annette Reif, für den Tomatenschnaps,

Den Sekretärinnen Monika Schneider und Silke Scholz für die Umsorgung Kuniberts,

Kurz allen 260ern, für das tolle Arbeitsklima,

Albert Einstein dessen Erkenntnis, �alles ist Relativ�, mir während des Studiums sehr geholfen hat,

Bob Marley, für �I Shot The Sheriff�,

Karl May und Winnetou, die mit dieser Arbeit überhaupt nichts zu tun haben,

Wolfgang Amadeus Mozart, für seine Musik, die zu Höchstleistungen treibt,

Riesenschnauzer Momo, die mich zwang meinen Kopf auszulüften,

Meiner Freundin für ihren sehr dicken Geduldsfaden,

Meinen Freunden, die ich in der Zeit des Schreibens leider etwas zu sehr vernachlässigt habe � gelobe Besserung!

Und allen anderen, die ich nicht genannt habe, aber hätte nennen müssen.

Um klar zu sehen, genügt oft ein Wechsel der Blickrichtung. Antoine de Saint-Exupery

Universität Hohenheim · 12 der Blütenentwicklung befinden, mit MeJA wieder rückgängig gemacht...

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