Unsere zweite Aufgabe

Molekularbiologisches Problem

Unsere zweite Aufgabe

Phosphate transporter

Molekularbiologisches Problem

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= RESTRIKTIONSENZYM

Molekularbiologie Einleitung

Welche Methoden lernen wir in diesem Molekularbiologiekurs?

• VL I: DNA Struktur, Fähigkeiten, Isolierung• VL II: DNA Schneiden: Restriktionsenzymen• VL III: DNA Ligation: Klonierung in Vektoren• VL IV: Herstellung von DNA Bibliotheken und Screening• VL V: Teil 1: Bioinformatische Tools

Teil 2: SequenzierungsmethodenTeil 3: Genomesequenzierung

• VL VI: Teil 1: RNA Struktur, Expression analyse: Northern blot, RT-PCRTeil 2: Expression analyse: Real time, cDNA Bibliothek, Microarrays

• VL VII: Teil 1: Rekombinante Proteine• VL VII: Teil 2: Western blot, Affinity chromatography• VL VIII: Mutagenese, Transformation

KIT – University of the State of Baden-Wuerttemberg and National Research Center of the Helmholtz Association

Prof. Dr. Natalia Requena, Molecular Phytopathology, Botanical Institute

www.kit.edu

Molekularbiologie Vorlesung II

DNA Schneiden: Restriktionsenzymen

how could I break this down into pieces?

1970 – Der Beginn einer Revolution: Entdeckung einesRestrictionsenzyms im Bakterium Haemophilus influenzae

Die Entdeckung der Restriktionsenzyme

1978 erhielten • der Mikrobiologe und Genetiker Werner Arber, • der Mikrobiologe und Biochemiker Daniel Nathans, • und der Biochemiker Hamilton Othanel Smith für die Entdeckung der Restriktionsenzyme und deren Anwendung in der Molekulargenetik den Nobelpreis für Physiologie der Medizin.

“The tale of the king and his servants”“When I come to the laboratory of my father, I usually see some plates lying on the tables. These plates contain colonies of bacteria. These colonies remind me of a city with many inhabitants. In each bacterium there is a king. He is very long, but skinny. The king has many servants. These are thick and short, almost like balls. My father calls the king DNA, and the servants enzymes. The king is like a book, in which everything is noted on the work to be done by the servants. For us human beings these instructions of the king are a mystery.

My father has discovered a servant who serves as a pair of scissors. If a foreign king invades a bacterium, this servant can cut him in small fragments, but he does not do any harm to his own king.

Clever people use the servant with the scissors to find out the secrets of the kings. To do so, they collect many servants with scissors and put them onto a king, so that the king is cut into pieces. With the resulting little pieces it is much easier to investigate the secrets. For this reason my father received the Nobel Prize for the discovery of the servant with the scissors".

Silvia Arber (10 years old)

Der Weg der Entdeckung

1952 beobachteten Salvador Luria und Mary Human, sowie Bertani und Weigleein eigenartiges Wachstumsverhalten

von Bakteriophagen."host controlled restriction of

bacteriophages"

Anfang der 60er gelang es Werner Arber und seinen Mitarbeitern, nach zu weisen, dass wirtsspezifischeModifikationen auf der Phagen-DNA zu finden sind und dass die Restriktion der Phagen-DNA mit deren Abbauverknüpft ist. https://slideplayer.com/slide/13126642/


• 1965 sagte Arber voraus, dass „site-specific restrictionenzymes“ existieren würden und dass die Modifikationen durch wirtsspezifische DNA-Methylasen hervorgerufen werden könnten.

• Auch wenn die Existenz dieser Enzyme als gesichert galt, dauerte es bis 1968, bis Linn und Arber ein Enzym mit solchen Eigenschaften in E. coli B fanden (Typ I)

• Zur selben Zeit, berichteten Meselson und Yuan von einem Restriktionsenzym, dass sie bei ihren Experimenten in

E. coli K fanden.• Durch eine „sucrose gradient centrifugation“ zeigten sie, dass

ihr Enzym unbehandelte DNA in große Teile zerschnitt, währenddesen modifizierte DNA unverändert blieb.


• Später zeigten sie noch, dass das Restriktionsenzym aus Haemophilus site-specific ist, und, dass das Enzym fremde DNA an einer sechsstelligen in sich symmetrischen Basenpaarsequenz schneidet.

5'AAGCTT3'3'TTCGAA5'

5'---A AGCTT---3'3'---TTCGA A---5'


HindIII

• 1969 hat Nathans zusammen mit ein paar Kollegen Restriktionsenzyme zur Untersuchung des SV40 Tumor Virus Genoms verwendet.

• Durch diese Forschungen demonstrierte er, dass man mit den Restriktionsenzymen sehr wichtige und wertvolle „Instrumente“ für DNA-Analysen gefunden hatte.


• Außerdem führte er die Gelelektrophorese zur Analyse von DNA-Fragmenten ein.

• Nachdem dann auch noch Ethidium Bromid, ein Fluoreszenz Farbstoff für DNA, von Sharp der Wissenschaft offen gelegt wurde, dauerte es nicht lang bis Laboratorien aus der ganzen Welt neue Restriktionsenzyme nachwiesen.


Hamilton Othanel Smith:

„The observations leading to the discovery of restictionenzymes span a period of nearly two decades and constitute a prime example of how basic research on an apparentlyinsignificant bacteriological phenomenon has had unexpectedlyfar-reaching implications.“


Restriktionsenzyme

• Bakterielle Enzyme• Erkennen spezifisch 4-8 Basenpaarsequenzen der DNA und

schneiden an dieser Stelle• Auch Restriktionsendonucleasen genannt, da sie die DNA

innerhalb des Moleküls schneiden und nicht außerhalb, wie DNA-Exonukleasen

• Spezifische Basensequenzen kommen oft als Palindrom vor:

EcoRI 5‘ – GAATTC – 3‘3‘ – CTTAAG – 5‘

ATAGGTCCTCAGGTAGGCCTCAGGTAGGCGGTAGGC ATAGGTCCTCAGGTAGGCCTCAGGTAGGCGGTAGGC

• Nucleasen= Nucleinsäuren hydrolysierende Enzyme• Restriktionsendonucleasen= Enzyme, die die Hydrolyse des

Phosphodiesterrückgrats der DNA katalysieren

RE

Restriktionsenzyme

Warum werden diese Enzyme„Restriktionsenzyme“ genannt?

• They „restrict“ the entrance of foreign DNA by cleaving it atall restriction sites.

• Restringere (lat.), restrict (engl.) = Einschränken

• Bsp.: Bakteriophagen DNA oder DNA, die durch eine Transformation aufgenommen wurde.

• Restriktionsenzyme schneiden Fremd-DNA an den spezifischen Basenpaarsequenzen,

• Aber wie wird die eigene DNA geschützt, die ebenfalls die spezifischen Basenpaarsequenzen enthält?

• → „Modifizierende Enzyme“

Modifizierende Enzyme (Methylasen)

• Schützen die DNA durch Modifikation in der Nähe der Restriktionsschnittstellen

→ Methylierung an bestimmten Basen→ Restriktionsenzyme spalten diese DNA nicht mehr

Für jede Restriktionsendonuclease erzeugt die Wirtszelle eine entsprechende Methylase für den eigenen Schutz.

Restriktionsendonucleasen und Methylasen bilden zusammen das

Restriktions-Modifikations-System

→ Wirts-DNA wird geschützt,Fremd-DNA wird abgebaut

NamensgebungDer Name eines Restriktionsenzyms leitet sich von dem ersten Buchstaben der Gattung und den ersten beiden Buchstaben der Spezies ab, aus der das Enzym isoliert wurde. Dieser Teil des Namens wird kursiv geschrieben. Dazu kommt eine Zahl und/oder ein Buchstabe, die nicht kursiv sind• EcoRI - Escherichia coli• BamHI - Bacillus amyloliquefaciens• HindIII - Haemophilus influenzae• PstI - Providencia stuartii• Sau3AI - Staphylococcus aureus• AvaI - Anabaena variabilis

RestriktionsenzymeDie DNA eines Organismus hat eine spezifische Sequenz: Restiktionsanalyse der DNA ergibt ein spezifisches und reproduzierbares Fragmentmuster: Restriktionsfragmente oderRestriktionsmuster: Restriktionskarte

5’- GAATTC -3’3’- CTTAAG -5’

GAATTCCTTAAG

10 kbEcoRI

4 kb3.5 kb2.5 kb

• Restriktionsenzyme schneiden nur spezifische Basenpaarsequenzen

• Verschiedene Restriktionsenzyme verschieden lange Fragmentmuster eines Basenabschnitts

Was passiert wenn 2 Enzyme schneiden?

Auftrennen der einzelnen Restriktionsfragmente mit Hilfe der Gel Elektrophorese

BasenpaarsequenzänderungRestriktionsenzym schneidet nicht mehr verändertes Bild der Gel Elektrophorese

Restriktionskarte eines linearen DNA Moleküls

3 Schnittstellen = 4 Fragmente

Restriktionskarte eines zirkulären DNA Moleküls

3 Schnittstellen = 3 Fragmente

DNA Enden nach einem Restriktionsverdau

Blunt endsSticky ends

Sticky bzw. cohesive ends(Klebrige Enden)

Manche Restriktionsenzyme schneiden DNA-Doppelstränge im „Zick-Zack“ durch und erzeugen

Einzelstrangüberhänge:


5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

5’-G-OH P -AATTC-3’3’-CTTAA- P HO-G-5’

Cohesive or Sticky Ends (Klebrige Enden)EcoRI


Blunt ends(Glatte bzw. stumpfe Enden)

Manche Restriktionsenzyme schneiden DNA-Doppelstränge vertikal durch:


Blunt ends (Glatte Enden)

EcoRV

5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

5’-GAT-OH P -ATC-3’3’-CTA- P HO-TAG-5’


Sticky bzw. cohesive ends

Blunt-ending cohesive ends

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

5’-G-OH P -AATTC-3’3’-CTTAA- P HO-G-5’

EcoRI

5’-G-OH

3’-CTTAA- P

Filling (polymerase) 5’-G

3’-CTTAA- P

5’-G-OH

3’-C- PCutting (exonuclease)

AATT-OH


Filling: DNA polymerase

DNA-Polymerasen füllen DNA-Stränge auf, indem sie Nukleotide an das überhängende 3´ Ende anhängenà Filling

Die Polymerisation findet immer vom 5´ zum 3´ Ende statt!

DNA Polymerasen

DNA-Polymerasen können zusätzlich Exonukleaseaktivität in eine oder beide Richtungen haben

Exzision von Nukleotiden

Polymerase mit Exonukleaseaktivität

• Korrekturlesen: 3´-5´ Exonuklease-

aktivität, Erkennung von fehlerhaft eingebauten Nukleotiden und deren Entfernung (proof-reading)

• Strang-Austausch: 5´-3´ Exonuklease-

aktivität, Abbau eines DNA-Strangs bei gleicher Bildung eines neuen Strangs

+ nucleotides+ Mg

5’-GAATT-OH

3’-CTTAA- P

5’-G-OH

3’-C- P

-nucleotides+Mg

5’-G-OH

3’-CTTAA- P

EcoRI site


E. coli DNA polymerase I

(EXO 5'-3')

(POL 5'-3')

+ nucleotides+ Mg

5’-G-OH

3’-C- P

- nucleotides+ Mg

5’-GGTAC-OH

3’-C - P

5’-GGTAC-OH

3’-C - P

KpnI site(EXO 3'-5')

Blunt-ending cohesive endsE. coli DNA polymerase I


• Klenow-fragment:Teilfragment der DNA-Polymerase I von E.coli àkeine 5´-3´Exonukleaseaktivität

• T4 DNA-Polymerase: ebenfalls keine 5´-3´ Exonukleaseaktivität, aber starke 3´-5´ Exonukleaseaktivität

DNA polymerase IKlenow fragment

109 KDa5’-3’ polymerase activity3’-5’ exonuclease activity5’-3’ exonuclease activity

68 KDa5’-3’ polymerase activity3’-5’ exonuclease activity


Klassen von Restriktionsendonucleasen

Typ ISpezifische Erkennung, schneiden Einzelstränge weit entfernt von

der Erkennungssequenz. Benötigen Mg2+, ATP, S-Adenosylmethionine

Typ IISpezifische Erkennung, schneiden Doppelstrang DNA in der Näheoder innerhalb der Erkennungssequenz, benötigen üblicher Weise

Mg2+

Typ IIISchneiden beide Stränge außerhalb der Erkennungssequenz.

Benötigen Mg2+ und ATPTyp IV

Erkennen modifizierte, normalerweise methylierte DNA z.B. McrBCund Mrr Systeme aus E. coli

Verschiedene Restiktionsenzymtypen

Typ II

Typ II Classical: Hind III, Not I, EcoRI etccleave DNA within their recognition sequences. Most recognize

DNA sequences that are symmetric, because they bind to DNA as homodimers.

Type IIS are those like FokI and AlwI that cleave outside of their recognition sequence to one side. They are thought to bind to

DNA as monomers for the most part, but to cleave DNA cooperatively

Type IIG restriction enzymes, large enzymes

Verschiedene Restiktionsenzymtypen

Restriktionsmuster

Die Länge der Erkennungssequenz ist variabel. Einige Enzyme erkennen 4 bp (höhere Schneidefrequenz in einem Genom,

kleinere Fragmente). Andere erkennen 8 bp (geringereSchneidefrequenz, größere Fragmente)

Selten schneidende Enzyme werdenRARE CUTTERS

genannt.

4 cutter1 Schnittstelle alle 256 Basen (44)

8 cutter1 alle 65,500 Basen (48)

HincII schneidet 4 verschiedene Sequenzen.

5'-G T C GA C-3' 5'-G T T G A C-3' 5'-G T C A A C-3' 5'-G T T A A C-3’3'-C A G C T G-5' 3'-C A A C T G-5' 3'-C A G T T G-5' 3'-C A A T T G-5’

Die Konsensus Sequenz von HincII lautet:

5'-G T Y R A C-3’

RestriktionsmusterEinige Enzyme erlauben eine gewisse Variabilität und erkennen

mehr als eine Sequenz

C AT G

Restriktionsmuster

EIN SELTENES und variabel schneidendes Enzym, das häufig in der Molekularbiologie verwendet wird, ist SfiI

(aus Streptomyces fimbriatus)

5'-GGCCNNNNNGGCC-3’

Es werden zwei Erkennungssequenzen benötigt. Die beiden Sequenzen können sich auf dem gleichen oder auf

verschiedenen DNA Molekülen befinden.

Star activity

Die Restriktionsenzyme schneiden in anderen Sequenzen

• Jedes Enzym hat besondere Anforderungen

• Die Spezifität kann verloren gehen bei zum Beispiel:- falsch eingestellten Puffern- zu hoher Konzentration an Enzymen- verlängerter Inkubationszeit

Jedes Enzym hat besondere Anforderungen

How do we really do it?

How do we really do it?

H2OBufferDNAEnzyme

4 kb

3 kb2 kb

1 kb

0.5 kb

2. Molecular biology problem

You got a lineal DNA fragment of 7 Kb. You did a restriction analysis with EcoRI andHindIII and got this pattern. Can you deduce from it a possible restriction map?

M E H E+H

EcoRI: 1, 2 and 4 kb bandsHindIII: 1.5, 2.5 und 3 kb bandsE+H: 3, 1.5, 2x 1, 0.5 kb bands

Check yourself:Erstellen Sie einer Restriktionskarte

auf einer zirkulären DNA

1. Sie haben ein genomisches DNA-Fragment von 10 kb in einen Vektor kloniert. Bei der Restriktionsanalyse mit EcoRI und XhoI erhalten Sie das unten angegebene Muster. Zeichnen Sie die Restriktionsschnittstellen und die entsprechenden Abstände in eine zirkuläre Plasmidkarte ein. (3 Punkte)

Klausurfrage 2018-2019

XhoI EcoRI Eco+Xho

8

2

2x 4

2

2x1

2x 2

4

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https://pixels.com/featured/1-yeast-saccharomyces-cerevisiae-power-and-syred.html

https://antisensescienceblog.wordpress.com/2013/12/04/a-cornerstone-of-molecular-biology-the-pcr-reaction/

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