Untersuchung der zeit- und druckabhängigen Expression ... Dr... · Aus dem Veterinär-Anatomischen...

Aus dem Veterinär-Anatomischen Institut

der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Untersuchung der zeit- und druckabhängigen Expression verschiedener Komponenten

der extrazellulären Matrix durch Chondrozyten in vitro

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Grades eines

Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)

durch die Veterinärmedizinische Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von

Juliane Schneevoigt

aus Wernigerode

Leipzig, 2015

Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Dekan: Prof. Dr. Manfred Coenen

Betreuer: PD Dr. Mahtab Bahramsoltani

Gutachter: PD Dr. Mahtab Bahramsoltani

Veterinär-Anatomisches Institut, Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig

Prof. Dr. Johanna Plendl

Institut für Veterinär-Anatomie, Fachbereich Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin

Tag der Verteidigung: 22.09.2015

Für meine Familie

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Liste der Abkürzungen ................................................................................................................................. VI

1 Einleitung ...............................................................................................................................................1

2 Literaturübersicht ..................................................................................................................................2

2.1 Entwicklung des Knorpelgewebes..................................................................................................2

2.1.1 Kondensation mesenchymaler Stammzellen .........................................................................2

2.1.2 Proliferation und Differenzierung von Chondroprogenitorzellen ..........................................3

2.1.3 Terminale Differenzierung zu Chondrozyten .........................................................................3

2.2 Aufbau und Zusammensetzung des Knorpelgewebes ...................................................................4

2.2.1 Die Komponenten des Knorpelgewebes ................................................................................4

2.2.1.1 Die Zellen des Knorpelgewebes .........................................................................................4

2.2.1.2 Die extrazelluläre Matrix des Knorpelgewebes .................................................................5

2.2.1.2.1 Die amorphe Grundsubstanz des Knorpelgewebes ....................................................5

2.2.1.2.2 Die Fasern des Knorpelgewebes..................................................................................6

2.2.1.2.2.1 Die kollagenen Fasern des Knorpelgewebes ........................................................6

2.2.1.2.2.2 Die elastischen Fasern des Knorpelgewebes ........................................................8

2.2.2 Der hyaline Gelenkknorpel .....................................................................................................8

2.2.3 Der Faserknorpel ................................................................................................................. 11

2.2.4 Der elastische Knorpel ......................................................................................................... 12

2.3 Dynamik des hyalinen Gelenkknorpels ....................................................................................... 12

2.3.1 Dynamik des hyalinen Gelenkknorpels unter mechanischen Einflüssen ............................ 12

2.3.2 Dynamik des hyalinen Gelenkknorpels unter chemischen Einflüssen ................................ 14

2.3.3 Seneszenz als Einflussfaktor auf die Dynamik des hyalinen Gelenkknorpels ..................... 14

2.4 Defekte und Regeneration des Knorpelgewebes ....................................................................... 15

2.4.1 Defekte und Regeneration des hyalinen Gelenkknorpels ................................................... 15

2.4.2 Defekte und Regeneration des Faserknorpels .................................................................... 18

2.4.3 Defekte und Regeneration des elastischen Knorpels .......................................................... 18

2.5 Strategien zur Behandlung von Knorpeldefekten ....................................................................... 18

2.5.1 Knochenmarkstimulierende Verfahren ............................................................................... 19

2.5.2 Autologe Knorpelknochentransplantation .......................................................................... 19

2.5.3 Autologe Knorpeltransplantation ........................................................................................ 20

2.6 In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten ..................................................................................... 21

2.6.1 Einfluss der In-vitro-Kultivierung auf Chondrozyten ........................................................... 21

Inhaltsverzeichnis

II

2.6.2 Einsatz von Druck bei der In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten .................................... 22

3 Zellen, Materialien, Methoden ........................................................................................................... 24

3.1 Zellen und für deren Kultivierung verwendete Lösungen .......................................................... 24

3.1.1 Chemikalien und Lösungen für die Zellkultur ...................................................................... 24

3.1.2 Zusammensetzung des Kulturmediums .............................................................................. 24

3.1.3 Zusammensetzung des Einfriermediums ............................................................................ 25

3.1.4 Zusammensetzung des Spezialgasgemisches für die Kultivierung der Chondrozyten

unter Druck .......................................................................................................................... 25

3.2 Materialien .................................................................................................................................. 25

3.2.1 Chemikalien und Reagenzien .............................................................................................. 25

3.2.2 In der Proteinanalytik verwendete Antikörper, Kontrollseren und Marker ....................... 26

3.2.2.1 Primärantikörper ............................................................................................................ 26

3.2.2.2 Sekundärantikörper ........................................................................................................ 26

3.2.2.3 Kontrollserum ................................................................................................................. 26

3.2.2.4 Marker für SDS-PAGE und Western Blot ........................................................................ 26

3.2.3 In der PCR eingesetzte Nukleotide und Enzyme, sowie für die Klonierung und Plasmid-

Präparation verwendete Materialien .................................................................................. 27

3.2.3.1 Nukleotide ...................................................................................................................... 27

3.2.3.2 Enzyme............................................................................................................................ 27

3.2.3.3 Materialien für die Klonierung und Plasmid-Präparation .............................................. 28

3.2.4 Zusammensetzung von Gebrauchslösungen für die Immunzytochemie ............................ 28

3.2.5 Zusammensetzung von Gebrauchslösungen für die PCR .................................................... 29

3.2.6 Zusammensetzung von Gebrauchslösungen für die Proteinanalytik .................................. 29

3.2.7 Verbrauchsmaterialien ........................................................................................................ 31

3.2.8 Geräte .................................................................................................................................. 32

3.2.8.1 Laborgeräte .................................................................................................................... 32

3.2.8.2 Bioreaktor ....................................................................................................................... 33

3.3 Methoden ................................................................................................................................... 34

3.3.1 Zellkultur .............................................................................................................................. 34

3.3.1.1 Auftauen der Chondrozyten ........................................................................................... 34

3.3.1.2 Kultivierung der Chondrozyten unter Normaldruck ....................................................... 34

3.3.1.3 Kultivierung der Chondrozyten unter erhöhtem Druck ................................................. 34

3.3.1.4 Subkultivierung der Chondrozyten ................................................................................. 35

Inhaltsverzeichnis

III

3.3.1.5 Kryokonservierung der Chondrozyten ............................................................................ 35

3.3.2 Immunzytochemische Untersuchungen ............................................................................. 35

3.3.3 RNA- und Proteinisolierung ................................................................................................. 36

3.3.3.1 Probengewinnung .......................................................................................................... 36

3.3.3.2 Isolierung der RNA .......................................................................................................... 36

3.3.3.2.1 Qualitätskontrolle der RNA mittels Spektralphotometrie........................................ 37

3.3.3.2.2 Qualitätskontrolle der RNA mittels Gelelektrophorese ........................................... 37

3.3.3.3 Isolierung der Proteine ................................................................................................... 38

3.3.4 Transkriptanalyse ................................................................................................................ 39

3.3.4.1 DNase-Verdau ................................................................................................................. 39

3.3.4.2 Reverse Transkription (RT) ............................................................................................. 39

3.3.4.3 Qualitative PCR ............................................................................................................... 40

3.3.4.4 Quantitative PCR............................................................................................................. 41

3.3.4.4.1 Herstellung der Standards ........................................................................................ 41

3.3.4.4.1.1 Herstellung der Medien und Nährböden .......................................................... 41

3.3.4.4.1.2 Hinzufügen eines Adenosin(A)-Überhangs ....................................................... 41

3.3.4.4.1.3 cDNA-Aufreinigung ............................................................................................ 42

3.3.4.4.1.4 Klonierung ......................................................................................................... 42

3.3.4.4.1.5 Plasmid-Präparation .......................................................................................... 43

3.3.4.5 Quantitative Real Time-PCR ........................................................................................... 44

3.3.5 Proteinanalyse ..................................................................................................................... 45

3.3.5.1 SDS-PAGE ........................................................................................................................ 45

3.3.5.2 Western Blot ................................................................................................................... 46

3.3.5.3 Detektion ........................................................................................................................ 48

3.3.5.4 Stripping der Antikörper und erneute Inkubation .......................................................... 48

3.3.5.5 Semiquantitative Analyse des Western Blot .................................................................. 49

3.3.6 Graphische Darstellung und statistische Methoden ........................................................... 49

4 Ergebnisse ........................................................................................................................................... 50

4.1 In-vitro-Kultivierung der Chondrozyten unter Normaldruck ...................................................... 50

4.1.1 Morphologie in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter Normaldruck ................................. 50

4.1.2 Immunzytochemischer Nachweis der Expression von Kollagen Typ I und II in-vitro-

kultivierter Chondrozyten unter Normaldruck ................................................................... 51

Inhaltsverzeichnis

IV

4.1.3 Nachweis der Aggrekan-, Kollagen Typ I-, und Kollagen Typ II-mRNA-Expression in-

vitro-kultivierter Chondrozyten unter Normaldruck ........................................................... 53

4.1.4 Nachweis der Aggrekan-, Kollagen Typ I- und Kollagen Typ II-Proteinexpression in-vitro-

kultivierter Chondrozyten unter Normaldruck ................................................................... 57

4.2 In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten unter erhöhtem Druck ................................................ 59

4.2.1 Einfluss der Frequenz des Mediumwechsels auf die Vitalität in-vitro-kultivierter

Chondrozyten ...................................................................................................................... 60

4.2.2 Versuchsaufbau für die Untersuchung in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter

erhöhtem Druck .................................................................................................................. 61

4.2.3 Morphologie in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck ........................... 63

4.2.4 Nachweis der Aggrekan-, Kollagen Typ I- und Kollagen Typ II-mRNA-Expression in-vitro-

kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck .............................................................. 65

4.2.4.1 Effekte der Höhe des hydrostatischen Drucks auf die Aggrekan-, Kollagen Typ I- und

Kollagen Typ II-mRNA-Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten ........................... 66

4.2.4.2 Effekte der Dauer des hydrostatischen Drucks auf die Aggrekan-, Kollagen Typ I- und

Kollagen Typ II-mRNA-Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten ........................... 68

4.2.4.3 Effekte der Zelldichte auf die Aggrekan-, Kollagen Typ I- und Kollagen Typ II-mRNA-

Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck .......................... 71


kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck .............................................................. 73


Kollagen Typ II-Proteinexpression in-vitro-kultivierter Chondrozyten .......................... 73


Kollagen Typ II-Proteinexpression in-vitro-kultivierter Chondrozyten .......................... 75

5 Diskussion ........................................................................................................................................... 78

5.1 Diskussion der Untersuchungsmethoden ................................................................................... 78

5.1.1 Varianz der Ergebnisse der PCR........................................................................................... 78

5.1.2 Einsatz spezifischer Antikörper für den Nachweis großer Strukturproteine ...................... 79

5.1.2.1 Einsatz spezifischer Antikörper für den Nachweis großer Strukturproteine in der

Immunzytochemie.......................................................................................................... 79

5.1.2.2 Einsatz spezifischer Antikörper für den Nachweis großer Strukturproteine im

Western Blot .................................................................................................................. 80

5.1.3 Einsatz statistischer Methoden in einer Pilotstudie mit geringem Stichprobenumfang .... 82

5.2 Diskussion der Ergebnisse ........................................................................................................... 83

5.2.1 Einfluss der Kultivierungszeit auf in-vitro-kultivierte Chondrozyten .................................. 83

Inhaltsverzeichnis

V

5.2.1.1 Einfluss der Kultivierungszeit auf die Morphologie in-vitro-kultivierter Chondrozyten 83

5.2.1.2 Einfluss der Kultivierungszeit auf die Aggrekan-, Kollagen Typ I- und Kollagen Typ II-

Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten ............................................................... 83

5.2.2 Einfluss nutritiver Faktoren auf die Vitalität in-vitro-kultivierter Chondrozyten ................ 86

5.2.3 Einfluss hydrostatischen Drucks auf in-vitro-kultivierte Chondrozyten .............................. 87

5.2.3.1 Einfluss hydrostatischen Drucks auf die Morphologie in-vitro-kultivierter

Chondrozyten ................................................................................................................. 87

5.2.3.2 Einfluss hydrostatischen Drucks auf die Aggrekan-, Kollagen Typ I- und Kollagen Typ

II-Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten ............................................................ 88

5.2.4 Kontinuierliche versus diskontinuierliche Druckbedingungen ............................................ 90

5.2.5 Dedifferenzierung in-vitro-kultivierter Chondrozyten - Anwendbarkeit und Limitation

genutzter Strategien ............................................................................................................ 91

5.3 Empfehlungen für die In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten unter erhöhtem

hydrostatischen Druck ................................................................................................................ 92

5.4 Möglichkeiten der Analyse druckbehandelter Chondrozyten und deren Nutzung in der

klinischen Anwendung- ein Ausblick ........................................................................................... 94

6 Zusammenfassung .............................................................................................................................. 95

7 Summary ............................................................................................................................................. 97

8 Literaturverzeichnis ............................................................................................................................ 99

9 Danksagung ...................................................................................................................................... 108

Liste der Abkürzungen

VI


A Adenosinrest

ACAN Aggrekan

ACT autologe Knorpeltransplantation

ANOVA One Way Analysis of Variance

APS Ammoniumpersulfat

bar Einheit des Drucks

BMP Bone Morphogenetic Protein

BMP-2 Bone Morphogenetic Protein-2

BMP-7 Bone Morphogenetic Protein-7

bp Basenpaare

BSA Bovines Serum Albumin

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CBM Chondrozyten Basal Medium

CBM+ Chondrozytenwachstumsmedium

CD44 Cluster of Differenciation 44

cDNA complementäre DNA

CO2 Kohlenstoffdioxid

COL1A1 Kollagen Typ I, α1-Kette

COL1A2 Kollagen Typ I, α2-Kette

COL2A1 Kollagen Typ II, α1-Kette

CT Anzahl der PCR-Cyclen, die zu dem Zeitpunkt erreicht sind, an dem sich das

Fluoreszenzsignal gerade deutlich vom Hintergrund abhebt

d Tage

DAB Diaminobenzidin

dATP Desoxyadenosintriphosphat

dCTP Desoxycytidintriphosphat

DEPC Diethylpyrocarbonat

dGTP Desoxyguanosintriphosphat

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTPs Nukleotide (dATP, dTTP, dCTP und dGTP)

DPBS Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x

DTT Dithiothreitol

dTTP Desoxythymidintriphosphat

ECM Extrazelluläre Matrix

E.coli Escherichia coli, Bakterium

EDTA Ethylendiamintetraacetat

FACIT Fibril-Associated Collagens with Interrupted Triple helices


VII

FBS Fetales Bovines Serum

FGF-2 Fibroblast-Growth-Factor-2

GAG Glykosaminglykan

ggf. Gegebenenfalls

h Stunden

HBSS Hank's Salzlösung

HBV Hepatitis-B-Virus

HCl Salzsäure

HCV Hepatitis-C-Virus

HIF-α Hypoxia-inducible Factor-α

HIV Humanes Immundefizienz-Virus

HRP Meerrettichperoxidase

Hz Hertz, Einheit der Frequenz

IGF-1 Insulin-like Growth Factor-1

IL-1 Interleukin-1

IL-6 Interleukin-6

IL-7 Interleukin-7

IL-8 Interleukin-8

Inkl. Inklusive

kDA Kilo-Dalton

KNS Kaninchen Normalserum

LB Luria Broth

LI Lumineszenz-Intensität

M arithmetisches Mittel MACT Matrix assozierte autologe Knorpeltransplantation

MMP Matrixmetalloproteinasen

MMP-13 Matrixmetalloproteinase 13

mRNA messenger RNA

MSZ Most Superficial Zone

MRT Magnetresonanztomograph

MSC Mesenchymale Stammzelle

n Stichprobenumfang

OA Osteoarthritis

OCT autologe Knorpelknochentransplantation

Oligo(dT)18 Oligonukleotid aus 18 dTTP

P statistische Power (Teststärke)

PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PCR Polymerasekettenreaktion

pDNA Plasmid DNA

Pextern externer auf den Knorpel einwirkender Druck

PHydr hydrostatischer Druck

PKollagen Spannungsdruck der kollagenen Fasern


VIII

POsm osmotischer Druck

PSchwell Schwelldruck

PG Proteoglykan

PTHrP Parathormon-related-Peptide

PTHrP-R Parathormon-related-Peptide-Rezeptor

PVDF Polyvinylidenfluorid

qPCR quantitative PCR

RLI relative Lumineszenz-Intensität

RNA Ribonukleinsäure

RT Reverse Transkription

RT-qPCR Reverse Transkription-quantitative PCR

s Sekunden

SASP Senescense-Associated Secretory Phenotype

SDS Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorese

sog. sogenannte

TAE-Puffer Tris, Essigsäure, EDTA-Puffer

TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung

TE-Puffer Tris-EDTA (TE)-Puffer

TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin

TGF-β1 Transforming Growth Factor-β1

TNF-α Tumor Necrosis Faktor-α

TNS Trypsin Neutralisationslösung

Tris-Base Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

Tris-HCl Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid

UV Ultraviolett

1 Einleitung

1

1 Einleitung

Der hyaline Knorpel bildet als schmaler Überzug der Gelenkflächen eine wichtige Grundlage für die

Bewegung des Organismus. Die Wahrnehmung seiner Funktion - der primären Druckübertragung auf den

subchondralen Knochen (Stoßdämpfungsfunktion) - erfolgt im Wesentlichen durch seine spezielle

extrazelluläre Matrix, die aus einem zonal organisierten Maschenwerk kollagener Fasern, in welches ein

hoher Anteil von Proteoglykanen mit assoziiertem Wasser eingelagert ist, besteht (BUCKWALTER

et al. 2005, MANSFIELD et al. 2008, SALOMON et al. 2005, POOLE 1997, SCHULZ und BADER 2007). Die

Integrität dieser extrazellulären Matrix erfordert in vivo eine stetige dynamische Anpassung entsprechend

der einwirkenden Druckbelastungen, welche durch die Chondrozyten, die Zellen des hyalinen Knorpels,

organisiert wird (ALFORD 2005, IKENOUE et al. 2003, LUPPA 2000, SCHULZ und BADER 2007).

Da es sich bei den Chondrozyten um postmitotische Zellen handelt und dem hyalinen Knorpel eine

Vaskularisation fehlt, unterbleibt bei einem Verlust der Integrität der extrazellulären Matrix in Folge eines

Traumas eine Defektregeneration. Im weiteren Verlauf kommt es zu einer biomechanischen Überbelastung

des umliegenden Knorpels, zum fortschreitenden Funktionsverlust des Gewebes und als Langzeitfolge zur

Osteoarthrose. Da diese Defekte des hyalinen Knorpels einen Großteil der Erkrankungen des

Bewegungsapparats darstellen und trotz intensiver Bemühungen die heute vorhandenen operativen

Möglichkeiten der Therapie von Knorpeldefekten noch keine befriedigenden funktionellen

Langzeitergebnisse bieten, besteht ein hohes medizinisches Interesse an der Entwicklung und

Weiterentwicklung innovativer Therapieansätze. Einen solchen Therapieansatz stellt dabei die Autologe

Chondrozyten Transplantation (ACT) dar, bei der in-vitro-kultivierte Chondrozyten in einen Knorpeldefekt

eingebracht werden mit dem Ziel, neuen hyalinen Knorpel zu bilden (BUCKWALTER und MANKIN 1998,

FRITSCH et al. 1999, MARCACCI et al., 2013, WONG und CARTER 2003). In den letzten Jahrzehnten zeigte

sich jedoch, dass die Entwicklung solcher Therapieansätze ein detaillierteres Verständnis des hyalinen

Knorpelgewebes und speziell dessen Biodynamik erfordert (BRUNS und STEINHAGEN 2000).

Ziel dieser Arbeit war es, im Rahmen einer Pilotstudie ein Zellkultursystem zu entwickeln, welches die

Untersuchung der Biodynamik von Chondrozyten in vitro ermöglicht. Im Fokus stand dabei der Einfluss der

Kultivierungszeit und des hydrostatischen Drucks auf die Morphologie der Chondrozyten sowie deren

Expression von Aggrekan, Kollagen Typ I und II als knorpelspezifische Komponenten der extrazellulären

Matrix. Die durch diese Untersuchungen gewonnenen Erkenntnisse sollen der Weiterentwicklung

zellbasierter Therapieansätze von Knorpeldefekten, wie der ACT, dienen bzw. dazu genutzt werden, um die

bei der ACT transplantierten Chondrozyten in Richtung der Expression einer chondrozytenspezifischen

extrazellulären Matrix zu modifizieren, welche das Potenzial besitzt, den Druckbedingungen des Gelenks

standzuhalten (MARTINEK und IMHOFF 2003).

2 Literaturübersicht

2


2.1 Entwicklung des Knorpelgewebes

Während der Entwicklung des Bewegungsapparates entstehen die Chondrozyten aus mesenchymalen

Progenitorzellen. Die Chondrozyten sind einerseits die für die Synthese des Knorpels zuständigen Zellen.

Andererseits liefern sie die für die spätere Knochenentwicklung essentiellen Knorpelanlagen. Embryonal

kommt dem Knorpelgewebe eine Platzhalterfunktion in der enchondralen Ossifikation des Knochens zu,

sodass dessen erste Entwicklungsabschnitte mit der Entwicklung des Knorpelgewebes identisch sind. Die

Entwicklung des Knorpelgewebes wird schematisch in die Phasen der Kondensation mesenchymaler

Stammzellen, Proliferation von Chondroprogenitorzellen und deren terminale Differenzierung zu

Chondrozyten unterteilt. An diesem Prozess sind unterschiedliche Wachstumsfaktoren beteiligt (Abb. 1)

(GOLDRING et al. 2006).

Abb. 1: Schematische Darstellung der Entwicklung des Knorpelgewebes. Die wichtigsten Wachstums- und Differenzierungsfaktoren sind oberhalb, die Bestandteile der extrazellulären Matrix unterhalb der Pfeile dargestellt; adaptiert nach SINGH und SCHWARZBAUER (2012), GOLDRING et al. (2006).

2.1.1 Kondensation mesenchymaler Stammzellen

Die mesenchymalen Stammzellen (MSCs) initiieren den Entwicklungsprozess des Knorpelgewebes. Im

Bereich des Kopfes entstammen diese der Neuralleiste, wohingegen für die Bildung des Achsenskeletts die

MSCs aus den Sklerotomen des paraxialen Mesoderms zuständig sind. Das Knorpelgewebe der Gliedmaßen

geht aus den MSCs der Somatopleura des lateralen Mesoderms hervor (GOLDRING et al. 2006). Die MSCs

synthetisieren zunächst Hyaluronsäure, Fibronektin und nicht knorpelspezifische Kollagene (Kollagen

Typ I, III, V). In den Bereichen der Knorpel- und Knochenentwicklung kommt es zu einem Anstieg der

Hyaluronidaseaktivität und somit einer Verringerung der Hyaluronsäure-Konzentration in der

extrazellulären Matrix (ECM). In den sich auf diese Weise einander annähernden Zellen steigt die

Expression von Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1), welches die Bildung von Zelladhäsionsmolekülen

induziert, wodurch die Anzahl der Zell-Zellkontakte zunimmt (DELISE et al. 2000, FORTIER et al. 2011). Als

weiterer Effekt des TGF-β1 auf die MSC sinkt deren Synthese und Sekretion von Kollagen Typ I in den

Zellen. Die beschriebenen Veränderungen führen zu einer erhöhten Zelldichte pro Volumeneinheit ohne

Proliferation der Zellen. Dieser als Kondensation bezeichnete Vorgang bedingt die Ausbildung der

skelettalen Blasteme (COLE 2011, DELISE et al. 2000, GOLDRING et al. 2006, GOLDRING 2012).


3

2.1.2 Proliferation und Differenzierung von Chondroprogenitorzellen

Aus dem Kondensationsprozess gehen Osteochondroprogenitorzellen hervor. Die zentralen Zellen der

skelettalen Blasteme bilden eine chondrogene Zelllinie, deren Zellen als Chondroprogenitorzellen

bezeichnet werden. Die peripher liegenden Zellen differenzieren zu Osteoprogenitorzellen (SINGH und

SCHWARZBAUER 2012).

Die Chondroprogenitorzellen sind gekennzeichnet durch eine verminderte Expression von TGF-β1 und der

autokrinen Stimulation durch Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), Bone Morphogenic Proteins (BMPs),

insbesondere BMP-2, und Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2), welche den proliferativen Status dieser

Zellen erhalten und für eine Veränderung der Synthese der Komponenten der ECM verantwortlich sind. So

führen IGF-1 und BMP-2 zur vermehrten Bildung und Abgabe der immaturen Splicing-Variante des Kollagen

Typ II (Kollagen Typ IIA) sowie Kollagen Typ IX und XI, während durch FGF-2 die Produktion von Aggrekan

stimuliert wird (GOLDRING et al. 2006, GOLDRING 2012). Das so entstehende Gewebe wird als Vorknorpel

bezeichnet, dessen Zellen als charakteristisches Merkmal das Parathormon-related-Peptide (PTHrP) bilden

(GOLDRING 2012, MABVUURE et al. 2012, SINGH und SCHWARZBAUER 2012). Diese sich noch im

teilungsfähigen Entwicklungsstadium zwischen Chondroprogenitorzellen und Chondrozyten befindenden

Zellen werden im deutschsprachigen Raum als Chondroblasten bezeichnet (MABVUURE et al. 2012). In

Anlehnung an die internationale Literatur, in der sich diese Einteilung kaum wieder findet und die Begriffe

sogar synonym verwendet werden (COLE 2011, MABVUURE et al. 2012, SINGH und SCHWARZBAUER 2012),

wird in dieser Arbeit für Knorpelzellen, die das Chondroprogenitor-Stadium verlassen haben, einheitlich der

Begriff Chondrozyt genutzt.

2.1.3 Terminale Differenzierung zu Chondrozyten

Die terminalen Differenzierungsprozesse im Knorpel werden insbesondere durch eine Verschiebung der

Expression der BMPs zugunsten von BMP-7 hervorgerufen. Diese beinhalten die Hemmung der

Proliferationsfähigkeit der Chondrozyten, eine verminderte Synthese von Fibronektin und den Isotyp-

Switch auf die mature Splicing-Variante Kollagen Typ IIB. Dieses wird im Allgemeinen als Kollagen Typ II

bezeichnet (DELISE et al. 2000, FORTIER et al. 2011). Insgesamt kommt es zu einer Zunahme der ECM,

welche sich in dem nun differenzierten Knorpel hauptsächlich aus den Komponenten Aggrekan, Kollagen

Typ II, IX und XI zusammensetzt. Hierbei rücken die Chondrozyten immer weiter auseinander, runden sich

ab und verkürzen ihre Fortsätze. Dies führt zu der typischen Morphologie des adulten Knorpels, in dem die

Chondrozyten, deren Zellfortsätze nur wenig in die ECM hineinreichen, einzeln oder in Gruppen vorliegen

(DELISE et al. 2000, KNUDSON und KNUDSON 2001). Während die Anzahl der Zell-Zell-Kontakte in diesem

Prozess sinkt, werden verstärkt Zellkontakte zur ECM ausgebildet. Insbesondere durch die Bindung an

Aggrekan über den Hyaluronsäure-Rezeptor CD44 wird die Organisation der perizellulären Matrix gesteuert

(DELISE et al. 2000).

Durch die Bildung von Kavitäten innerhalb des Vorknorpels entstehen die Gelenkspalten. Die an diese

Gelenkspalten grenzenden Chondrozyten exprimieren den PTHrP-Rezeptor (PTHrP-R), wodurch unter der

Wirkung von PTHrP die Teilungsfähigkeit dieser als artikulär bezeichneten Chondrozyten erhalten bleibt

(GOLDRING 2012, MABVUURE et al. 2012). Durch die weitere Proliferation der artikulären Chondrozyten

und die Sekretion der knorpelspezifischen ECM kommt es zum appositionellen Dickenwachstum des

Knorpels. Mit dem Einsprossen der Blutgefäße und den damit einwandernden Chondroklasten und

Osteoblasten in den Vorknorpel entstehen Ossifikationszentren. Das primäre Ossifikationszentrum befindet


4

sich diaphysär, während die sekundären im Bereich der Epiphysen auftreten und den artikulären Knorpel in

einen gelenkspaltnahen Gelenkknorpel und eine epiphysäre Wachstumsfuge teilen (DELISE et al. 2000,

KNUDSON und KNUDSON 2001, MABVUURE et al. 2012).

Während die PTHrP-Synthese und damit die Proliferationsfähigkeit der Chondrozyten im Bereich der

Wachstumsfuge erhalten bleibt, wird die PTHrP-Synthese im Gelenkknorpel durch den im Rahmen des

Wachstums zunehmenden mechanischen Druck gehemmt und damit die Proliferationsfähigkeit der

Chondrozyten allmählich verringert (DONKELAAR und HUISKES 2007, HOLLANDER et al. 2010). So sind im

juvenilen Gelenkknorpel eine verbleibende Population von proliferativen Chondrozyten in der

oberflächlichen Zone des hyalinen Gelenkknorpels nachweisbar, deren Anzahl mit zunehmendem Alter

abnimmt und in geringer Konzentration auch im adulten Organismus erhalten bleibt (DOWTHWAITE et al.

2004, LOTZ und LOESER 2012).

2.2 Aufbau und Zusammensetzung des Knorpelgewebes

2.2.1 Die Komponenten des Knorpelgewebes

Das Knorpelgewebe gehört wie auch das Knochengewebe zu den Binde- und Stützgeweben, welche sich

stets aus Zellen und ECM zusammensetzen.

Embryonales Bindegewebe Bindegewebe Retikuläres Lymphoretikuläres Bindegewebe Bindegewebe Hämoretikuläres Bindegewebe Fettgewebe Faseriges Lockeres Bindegewebe Bindegewebe Straffes Straffes geflechtartiges Bindegewebe Bindegewebe Straffes parallelfaseriges Bindegewebe Binde- und Stützgewebe Knorpelgewebe Stützgewebe Knochengewebe

Der Knorpel gilt als zellarmes Gewebe, da der Anteil der ECM überwiegt (LUPPA 2000). Der Knorpel grenzt

sich von den Bindegeweben durch seine höhere Festigkeit und vom Knochengewebe durch die geringere

Mineralisation ab (SALOMON et al. 2005). Er besitzt durch seinen hohen Gehalt an Wasser und

Glykosaminoglykanen (GAGs) eine gewisse elastische Verformbarkeit, die es ermöglicht Druck- und

Scherkräfte abzufedern (KATTA et al. 2008, KNUDSON und KNUDSON 2001).

2.2.1.1 Die Zellen des Knorpelgewebes

Die spezifischen Zellen des Knorpelgewebes sind die Chondrozyten, die aus den MSCs hervorgegangen sind.

Durch sie werden sowohl die Fasern als auch die amorphe Grundsubstanz synthetisiert und in die

Umgebung abgegeben. Da der Anteil der Chondrozyten im Knorpelgewebe gering ist (2-8% in Abhängigkeit


5

vom Alter), bringt jede einzelne Zelle in diesem Gewebe eine enorme Syntheseleistung auf (ALFORD 2005,

LUPPA 2000).

Einmal differenzierte Chondrozyten stellen ortständige Zellen dar, die wenige Zell-Zell- jedoch zahlreiche

Zell-Matrix-Kontakte aufweisen und nicht in der Lage sind, sich in der ECM zu bewegen (MARLOVITS und

VÉCSEI 2000). Zusätzlich besitzen Chondrozyten Mechanorezeptoren, so genannte „connexin

hemichannels“, welche eine zelluläre Transduktion der Druckbelastung ermöglichen. Diese fungieren als

solche auch in der Membran einer primären Stereozilie, welche an der Zelloberfläche der Chondrozyten zu

finden ist. Diese Rezeptoren induzieren intrazelluläre Signalwege, welche eine Modifikation der

metabolischen Aktivität und somit eine Veränderung der Expression der Komponenten der ECM

entsprechend des hyalinen Knorpels (siehe 2.2.2) hervorrufen (BUCKWALTER et al. 2005, GARCIA und

KNIGHT 2010, KNIGHT et al. 2009, WHITFIELD 2008).

2.2.1.2 Die extrazelluläre Matrix des Knorpelgewebes

Die von den Chondrozyten gebildete ECM setzt sich zusammen aus der amorphen Grundsubstanz sowie

den kollagenen und elastischen Fasern.

2.2.1.2.1 Die amorphe Grundsubstanz des Knorpelgewebes

Die amorphe Grundsubstanz des Knorpelgewebes besteht im Wesentlichen aus Proteoglykanen (PGs) und

freier Hyaluronsäure sowie an diese gebundenes Wasser. Die PGs enthalten ein Kernprotein, an das über so

genannte Linker-Proteine aus repetitiven Disaccharideinheiten aufgebaute GAGs kovalent gebunden sind.

Die Namensgebung der PGs erfolgt einerseits auf der Basis des Kernproteins (z.B. Perlekan, Syndekan,

Aggrekan) und andererseits anhand des am meisten enthaltenen GAGs (z.B. Dermatansulfat-,

Heparansulfat-, Keratansulfat-, Chondroitinsulfat-PG). Dabei sind die Kernproteine unspezifisch für die an

sie bindenden GAGs (ASPERG 2012, SCHULZ und BADER 2007). Die Disacharideinheiten binden an eine

zentrale Kohlenstoffkette und bilden so riesige Moleküle. PGs können membrangebunden vorkommen

(z.B. Syndekan, Glypikan) oder aufgrund des Fehlens einer Membrandomäne nach ihrer Synthese sezerniert

werden (z.B. Perlekan, Aggrekan) (KNUDSON und KNUDSON 2001). Hyaluronsäure ist ein GAG, welches

auch ohne Bindung an ein Kernprotein vorliegen kann. Es verlässt die Zelle im Gegensatz zu allen anderen

GAGs ohne Passage des Golgi-Apparates und kann sowohl als membrangebundenes als auch als lösliches

Molekül vorkommen (COUCHMAN und PATAKI 2012).

Die PGs des Knorpelgewebes bestehen überwiegend aus den GAGs Keratansulfat und Chondroitinsulfat,

wobei Aggrekan das häufigste Kernprotein darstellt. Das Aggrekan als Kernprotein besteht aus drei

Globulin-Domänen (G1, G2, G3), einer interglobulinen Domäne, die G1 und G2 verbindet, sowie zwei

Bindungsdomänen für GAGs zwischen G2 und G3. Durch die N-terminale Vernetzung (G1) der Aggrekane

untereinander über Tenascin lagern sich diese zu einer Struktur aus etwa 50 Monomeren zusammen,

sodass sich das im Knorpel reichlich vorhandene Aggrekan zu einer Struktur aus etwa 50 Monomeren

zusammenlagert. Das so gebildete Polymer bindet C-terminal an ein Hyaluronsäurefilament. Die Vorgänge

der Vernetzung untereinander und der Bindung an Hyaluronsäure werden als Aggregation bezeichnet. Die

Chondrozyten sezernieren die Komponenten der PGs und steuern deren Auf- und Abbau. Bei intakter

Knorpeloberfläche werden die beim Abbau anfallenden GAGs für die Resynthese der PGs verwendet. Wird

jedoch die Knorpeloberfläche beschädigt, diffundieren die GAGs in die Synovia und gehen für den erneuten

Aufbau von PGs verloren (ASPBERG 2012, HABENHAUER et al. 2003, LUPPA 2000, KNUDSON und KNUDSON

2001, SCHULZ und BADER 2007).


6

Die GAG-Seitenketten besitzen viele negativ geladene Gruppen, die im Gesamtmolekül zu einer starken

Polarität und damit zu einer hohen Wasserbindungsfähigkeit führen. In Abhängigkeit von Länge und Typ

der GAG-Seitenketten wird das Gesamtmolekül somit von einer mehr oder weniger starken Hydrathülle

umgeben (KNUDSON und KNUDSON 2001).

2.2.1.2.2 Die Fasern des Knorpelgewebes

Im Knorpelgewebe unterscheidet man die durch besondere Zugfestigkeit gekennzeichneten kollagenen und

die für Dehnungsbelastungen wichtigen elastischen Fasern. Dabei sind kollagene Fasern sowohl im Knorpel

als auch in anderen Geweben strukturgebend und stabilisierend (GELSE et al. 2003). Elastische Fasern

dagegen kommen relativ selten vor. Sie spielen im elastischen Knorpel und anderen Geweben, die eine

gewisse elastische Verformbarkeit benötigen, wie beispielsweise dem elastischen Nackenband, eine Rolle

(KIELTY et al. 2002).

2.2.1.2.2.1 Die kollagenen Fasern des Knorpelgewebes

Die kollagenen Fasern dienen den PGs einerseits als Gerüst. Auf der anderen Seite schützen die PGs durch

ihre Anlagerung an die kollagenen Fasern diese vor dem Abbau durch Kollagenasen. Die den kollagenen

Fasern zugrunde liegenden Kollagene sind eine heterogene Gruppe von Molekülen, denen ein

tripelhelikaler Molekülbereich gemein ist, wobei sie sich in Funktion und Gewebeverteilung erheblich

unterscheiden (GELSE et al. 2003).

Die Synthese von Kollagen beginnt mit der Bildung einzelner Ketten von jeweils ca. 1000 Aminosäuren, von

denen jede dritte Glycin ist. Entsprechend dieser Gesetzmäßigkeit wird das Kollagen mit der Formel

(Gly-X-Y)n beschrieben, wobei X und Y sehr häufig Prolin und Lysin darstellen (Primärstruktur). Im

endoplasmatischen Retikulum kommt es zur Ascorbinsäure-abhängigen Hydroxylierung von Prolin- und

Lysinresten sowie der Glykosylierung einiger Hydroxylysinreste. Nach der Ausbildung der Sekundärstruktur

wird diese als -Kollagenkette bezeichnet. Anschließend entsteht im Golgi-Apparat aus jeweils drei dieser

-Ketten durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Hydroxyprolinresten eine rechtsdrehende

Tripelhelix, wobei Glycin in Richtung des Zentrums der Tripelhelix orientiert ist. Dieses als Prokollagen

(Tertiärstruktur) bezeichnete Molekül wird in den Extrazellularraum abgegeben (GELSE et al. 2003). Als

Kollagen klassifiziert, weist jedes Prokollagen-Molekül zumindest eine tripelhelikale Kollagendomäne sowie

weitere helikale und nicht helikale Bereiche auf. Die dabei vorhandenen N-terminalen 7S-Domänen und

C-terminalen, nicht kollagenen Domänen (NC1) beeinflussen wesentlich die Bildung der Tripelhelix und

werden erst nach deren Formation entfernt. So sind die NC1-Domänen dafür verantwortlich, welche

-Ketten sich miteinander verbinden und wie die fibrillären Anteile des Kollagens organisiert werden

(EYRE 2003, MACDONALD et al. 2006, PARSONS et al. 2006).

Extrazellulär lagern sich fünf tripelhelikale Prokollagene versetzt zu Mikrofibrillen (Kollagenfibrillen) und

letztlich zu kollagenen Fasern (Suprastruktur) zusammen (Abb.2). Die Bildung der Fibrillen erfolgt durch die

Ausbildung von kovalenten Bindungen zwischen Hydroxylysinresten sowie Wasserstoffbrückenbindungen

zwischen Hydroxyprolinresten verschiedener Ketten (Quervernetzungen) (Abb. 2).


7

Abb. 2: Die molekulare Modellstruktur einer Kollagenfibrille. Dargestellt sind die Quervernetzungen (cross-links) des Kollagen Typ II die durch Kollagen Typen IX und XI ausgebildet werden; aus: EYRE (2002).

Bei der Zusammenlagerung der Kollagenketten können Homotrimere aus identischen Ketten (z.B. Kollagen

Typ II) und Heterotrimere aus unterschiedlichen Ketten (z.B. Kollagen TypI, IX, XI) entstehen (Tab. 1)

(GELSE et al. 2003, YAMAUCHI und SRICHOLPECH 2012).

Tab. 1: Kollagentypen, ihre Genlokalisation und molekulare Zusammensetzung, adaptiert nach: GELSE et al. (2003) Kollagen-Typ Gene (Lokalisation) Molekulare Zusammensetzung

Fibrillen-bildende Kollagene

I COL1A1 (17q21.31–q22) (α1(I))2 α2(I)

II COL2A1 (12q13.11–q13.2) (α1(II))3

XI COL11A1 (1p21) α1(XI) α2(XI) α3(XI)

Fibril-Associated Collagens with Interrupted Triple helices (FACIT)

IX COL9A1 (6q13) COL9A2 (1p33–p32.2)

α1(IX) α2(IX) α3(IX)

Die bekannten 27 Kollagen Typen werden in verschiedenen Gruppen zusammengefasst. Trotz ihres

ähnlichen Aufbaus haben sie spezifische Aufgaben in verschiedenen Geweben. So unterscheiden sie sich in

ihren immunologischen Eigenschaften und ihrem Verhalten in der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktion

(MARK 2006). Für die Struktur und Funktion des Knorpels sind die Fibrillen-bildenden Kollagen Typen I, II

und XI sowie das zu den Fibrillen-assoziierten Kollagenen mit unterbrochenen Tripelhelices (Fibril-

Associated Collagens with Interrupted Triple helices, FACIT) gehörende Kollagen Typ IX bedeutend (GELSE

et al. 2003). Der im Körper am häufigsten vorkommende Kollagen Typ I besteht als Heterotrimer aus zwei

α1(I)- Ketten und einer α2(I)- Kette. Er erreicht durch seine Faserstärke von 25-400 nm eine starke

Zugfestigkeit und tritt daher neben dem Knorpel v.a. in Sehnen, Bändern und Knochen auf (GELSE et al.

2003).

Im Knorpelgewebe stellt Kollagen Typ II einen weiteren Vertreter der Fibrillen-bildenden Kollagene dar.

Hierbei handelt es sich um ein Homotrimer aus drei identischen α1(II)-Ketten, wobei die jeweiligen

α1-Ketten der Kollagen Typen I ((α1(I)) und II (α1(II)) keine Splicingvarianten darstellen, sondern

unterschiedlichen Chromosomen entstammen. Ergänzend finden posttranslationale Modifikationen des


8

Kollagen Typ II in Form von Hydroxylierungen des Lysins sowie anschließende Glykosylierungen verglichen

mit Kollagen Typ I in deutlich größerem Umfang statt, sodass dessen Interaktion mit den PGs erleichtert

wird. Diesem Umstand geschuldet ist auch sein Vorkommen im Glaskörper und Corneaepithel außerhalb

des Knorpels (GELSE et al. 2003).

Auch bei Kollagen Typ XI handelt es sich um ein Fibrillen-bildendes Kollagen, das in geringer Menge im

Knorpel vorhanden ist und eine starke Ähnlichkeit zu Kollagen II aufweist, da beide Splicingvarianten

desselben Gens darstellen. Es lagert sich zwischen Kollagen Typ II-Moleküle ein und bindet mit seinem

abknickenden Ende ein weiteres Kollagen Typ II-Molekül, sodass Quervernetzungen entstehen, deren

Gesamtheit der Kollagenfaser ihre Stabilität verleiht (Abb.2) (GELSE et al. 2003, FERNANDES et al. 2007,

MARK 2006, MATYAS et al. 1997).

Daneben ist das zur Gruppe der FACIT gehörende Kollagen Typ IX für die Verbindung des äußeren Bereichs

der Fibrillen verantwortlich. Kollagen Typ IX-Moleküle lagern sich periodisch an Kollagen Typ II an und

bilden untereinander mit Hilfe ihrer nicht-helikalen Anteile kovalente Bindungen aus und tragen dadurch

zur Quervernetzung bei (EYRE 2003, GELSE et al. 2003). Des Weiteren zeigen andere nicht-helikale Bereiche

des Moleküls starke Interaktionen mit den PGs, insbesondere Aggrekan, sodass die weitere Anlagerung von

Fibrillen und damit der Faserdurchmesser auf 15-100 nm begrenzt wird (CHANGOOR et al. 2011, EYRE

1995).

2.2.1.2.2.2 Die elastischen Fasern des Knorpelgewebes

Die elastischen Fasern zeichnen sich durch eine stark reversible Verformbarkeit aus, die dem Gewebe, in

dem sie enthalten sind, eine hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber Zugkräften ermöglicht. Die Rückkehr in

den Ausgangszustand erfolgt dabei energieunabhängig durch passive Rückstellkräfte (KIELTY et al. 2002).

Im Verlauf der Entwicklung elastischer Fasern erfolgt eine Einlagerung von Tropoelastin, der löslichen

Vorstufe des Elastins, in ein vorgeformtes Netzwerk aus Fibrillin-haltigen Mikrofibrillen. Die

Tropoelastinmonomere zeigen nach ihrer Sekretion eine Tendenz zur Aggregation. Sie bilden einen Kern

aus stark vernetztem Elastin, der von einem außen liegenden Mantel aus Mikrofibrillen umschlossen wird

(WAGENSEIL und MECHAM 2007). Die zentralen Tropoelastinmonomere werden über Desmosine sowie

Isodesmosine und die peripheren Mikrofibrillen durch Quervernetzungen zusammengehalten. Die intra-

und intermolekularen Faltungen der Mikrofibrillen stellen die Rückstellkräfte für die Elastizität der Fasern

zur Verfügung (KIELTY et al. 2002).

2.2.2 Der hyaline Gelenkknorpel

Frischer hyaliner Knorpel hat eine milchig-bläuliche Farbe und erscheint im Gegenlicht „durchscheinend“,

woher sich der Begriff hyalin ableitet. In Form des Gelenkknorpels kommt dieses vollständig avaskuläre und

nicht sensibel innervierte Gewebe in allen großen Gelenken des Körpers und während des Wachstums in

den Epiphysenfugen der langen Röhrenknochen vor. Daneben tritt hyaliner Knorpel auch im Bereich der

Nase in Form der Cartilagines nasi externi, Cartilagines nasi laterales dorsales et ventrales sowie der

Cartilago septi nasi sowie beim Pferd auch in der Cartilago alaris auf. Die Cartilagines tracheales und

bronchiales, sowie die Kehlkopfknorpel - mit Ausnahme der Cartilago epiglottica - sind einige weitere

Beispiele für das Vorkommen des hyalinen Knorpels im Bereich des Atmungsapparats. Sein Vorkommen im

Bewegungsapparat beschränkt sich nicht nur auf die synovialen Gelenke, sondern schafft auch eine

kontinuierliche Verbindung zwischen Knochen in Form der Synchondrosen, z.B. die Synchondroses

sternales und die Synchondrosis intermandibularis (SALOMON et al. 2005, SCHULZ und BADER 2007).


9

Abb. 3: Schematische Darstellung des Faserverlaufs (links) und der Zellmorphologie (rechts) in den Zonen des hyalinen Gelenkknorpels; adaptiert aus MANSFIELD et al. (2008).

Der Gelenkknorpel gliedert sich in verschiedene Zonen (Abb. 3). Die Mineralisationszone bildet den

Übergang zum subchondralen Knochen. Durch ein fingerförmiges Ineinandergreifen der

Mineralisationszone und des subchondralen Knochens entsteht eine besonders feste Verbindung, sodass

eine optimale Druck- und Kraftübertragung auf den Knochen gewährleistet wird. Gleichzeitig schützt diese

Form der Verzahnung der beiden Gewebe vor dem Abriss des Gelenkknorpels bei der Einwirkung von

Scherkräften. Die Mineralisationszone enthält nur wenige Knorpelzellen. Durch die Einlagerung von

Kalziumphosphatkristallen wird eine zusätzliche mechanische Stabilität gewährleistet. Sie behält zeitlebens

ihre Fähigkeit zur Knochenbildung bei, sodass von ihr die Versteifung von Gelenken ausgeht, wenn die

Erhaltungsreize des Knorpels entfallen, wie beispielsweise durch die Immobilisation eines Gelenks

(BOETSCH 2007, BUCKWALTER et al. 2005, MARLOVITS und VÉCSEI 2000).

Zur folgenden Radiärzone, die durch senkrecht zur Knorpeloberfläche verlaufende kollagene Fasern

gekennzeichnet ist, ist die Mineralisationszone durch die so genannte Tidemark, welche als Grenze

zwischen Knochen und Knorpel betrachtet wird, abgesetzt. Die Radiärzone stellt in der Regel mit einem

Anteil von 63-74% an der Gesamtdicke die prominenteste Zone des Gelenkknorpels dar. Die dicken

Kollagenfasern dieser Zone, entlang derer sich die Chondrozyten in Form von Säulen anordnen, sind parallel

zueinander und senkrecht zur Knorpeloberfläche angeordnet. Sie bilden Bündel feiner Röhrchen und

erreichen innerhalb des Knorpels die stärksten Faserdurchmesser (100 nm) (BUCKWALTER et al. 2005,

CHANGOOR et al. 2011, GWYNN et al. 2000). Ein Teil der Kollagenfasern jedoch verläuft quer und schräg

dazu, sodass durch das Vorkommen von Quervernetzungen ein dreidimensionales Maschenwerk entsteht

(GWYNN et al. 2000, HUGHES et al. 2005). In dieses Maschenwerk ist ein hoher Anteil von PGs und an diese

assoziiertes Wasser eingelagert. Mit Hilfe des dadurch erzeugten hydrostatischen Drucks kommt diesem

Bereich des hyalinen Knorpels die primäre Stoßdämpfungsfunktion zu. Biomechanisch findet in der

Radiärzone die Druckübertragung auf den subchondralen Knochen statt (BUCKWALTER et al. 2005,

POOLE 1997).

Zum Gelenkspalt hin folgt eine Übergangszone (19-26% der Gesamtknorpeldicke) mit sich flach kreuzenden

Kollagenfasern zur abschließenden Tangentialzone. In letzterer verlaufen die sehr dünnen Kollagenfasern

(50 nm) annähernd parallel zur Gelenkoberfläche, um dann bogenförmig in die darunterliegenden

Schichten in die Tiefe zu ziehen (GWYNN et al. 2000). Bei der Tangentialzone handelt es sich um die

dünnste (7-9% der Gesamtknorpeldicke) und zugleich zelldichteste Schicht, die eine hohe Zugfestigkeit und

Belastbarkeit gegenüber Scherkräften ermöglicht. Die Zellen dieser Schicht sind abgeflacht und in den


10

oberflächenparallelen Kollagenfaserverlauf eingelagert (ALFORD 2005, CHANGOOR et al. 2011, EYRE 2002,

SICZKOWSK und WATT 1990). Im Gegensatz zu den dicht gepackten Kollagenfibrillen ist der Gehalt an PGs

hier vergleichsweise gering (POOLE 1997). An der Oberfläche der Tangentialzone schließt sich eine dünne

(10 µm), zellfreie Schicht aus oberflächenparallelen Kollagenfasern an, die auch als Lamina splendens

bezeichnet wird. Neben Kollagen Typ II wurden in diesem Bereich Kollagen Typ I und III sowie elastische

Fasern nachgewiesen (FUJIOKA et al. 2013, HE et al. 2013). Die Grenze zum Gelenkspalt besteht aus einer

Schicht von Phospholipiden, Hyaluronsäure und dem Glykoprotein Lubrizin, welche sowohl von den

Synovialozyten als auch von den oberflächlichen Chondrozyten produziert werden (LOTZ und

LOESER 2012). Durch die hohe Konzentration an Phospholipiden, die als Schmierstoffe wirken, wird die

Reibung zwischen den Gelenkoberflächen reduziert (KATTA et al. 2008). Das Vorhandensein dieser Schicht

ist bedingt durch das Fehlen eines vaskularisierten Perichondriums - eine Besonderheit, die den

Gelenkknorpel von den anderen Knorpeltypen unterschiedet (SCHULZ und BADER 2007). Von einigen

Autoren wird diese Schicht mit der Lamina splendens als „Most Superficial Zone“ (MSZ) zusammengefasst.

Die Tangentialzone und die MSZ stellen eine Barriere gegenüber der Synovia dar, die den Austausch kleiner

Moleküle zulässt und den größerer Moleküle verhindert. Somit erfolgt kein Efflux von PGs, gleichzeitig

können beispielsweise Antikörper nicht in den Gelenkknorpel eindringen, wodurch dieser vor dem

Immunsystem abgeschirmt wird (BUCKWALTER et al. 2005).

Der Gehalt an PGs ist in der Tangentialzone am geringsten und nimmt in Richtung Radiärzone zu,

wohingegen in der Mineralisationszone kaum noch PGs vorhanden sind (HUGHES et al. 2005). Die

hydrodynamischen Belastungsmerkmale des Gelenkknorpels werden durch die Balance zwischen der

Hydratation der PGs und dem Widerstand, den das kollagene Netzwerk ihrer Ausdehnung entgegensetzt,

bedingt (POOLE 1997).

Im hyalinen Knorpel liegen die Chondrozyten, deren Anteil am Gesamtvolumen 2% beträgt, einzeln oder in

kleinen Gruppen, welche als Chondrone bezeichnet werden und die primäre strukturelle, funktionelle und

metabolische Einheit des Knorpels darstellen (ALFORD 2005). Diese und die sie umgebende perizelluläre

Matrix bilden ein Territorium. Lediglich in der Tangentialzone bilden die Chondrozyten keine Chondrone

und weisen keine spezifische perizelluläre Matrix auf (BUCKWALTER et al. 2005, BRUCKNER und VAN DER

REST 1994, POOLE 1997).

Der Gelenkknorpel ist nicht vaskularisiert, sodass die Ernährung der Chondrozyten hauptsächlich durch

Diffusion aus der Synovia erfolgen muss und entsprechend langsam vonstatten geht. Dadurch wird ein

hypoxisches Milieu geschaffen, in dem die anaerobe Energiegewinnung dominiert. Nur in den knochennah

gelegenen Bereichen erfolgt eine Ernährung des Gelenkknorpels auch durch die Blutgefäße des

subchondralen Knochens (ALFORD 2005).

Hyaliner Knorpel weist unter allen Knorpelarten den geringsten Anteil an Fasern und einen hohen Anteil

amorpher Grundsubstanz auf. Dabei sind Kollagen Typ II, IX, und XI die wichtigsten Kollagentypen im

hyalinen Knorpel und machen zwei Drittel der Trockensubstanz aus (EYRE 2002). Bei einem Wassergehalt

von 60-85% entfallen somit auf die kollagenen Fasern etwa 10-30% des Nassgewichts. Dabei stellt Kollagen

Typ II, welcher die grundsätzlichen Faserverläufe bestimmt, 90-95% des im hyalinen Knorpel vorhandenen

Kollagens (BUCKWALTER et al. 2005). Daneben liegen in geringeren Anteilen Kollagen Typ IX und XI vor, die

durch Quervernetzungen in Form von kovalenten Bindungen und molekularen Wechselwirkungen die

Vielzahl der Kollagen Typ II-Fibrillen stabilisieren (EYRE 2002). Die PGs, welche hauptsächlich

Chondroitinsulfat- und Keratansulfat-Seitenketten enthalten, und nicht-kollagene Proteine nehmen einen


11

Anteil von 3-10% am Nassgewicht ein. Die PGs liegen zu 90% in aggregierter Form vor, wohingegen nur

geringe Anteile auf nicht aggregierte (7%) und kleine PGs (3%) entfallen (BUCKWALTER et al. 2005, SCHULZ

und BADER 2007). Dieses Ausmaß der Aggregation der PGs im Gelenkknorpel ist maßgeblich dafür

verantwortlich, dass dieser zu etwa 70% aus Wasser besteht, wodurch dessen einzigartige

Druckaufnahmefunktion gewährleistet wird (ASPBERG 2012, KIANI et al. 2002, STÄRKE 2008).

Die perizellulären Territorien des Gelenkknorpels enthalten hohe Gehalte an PGs, die auf Aggrekan als

Kernprotein basieren, sowie Hyaluronsäure und kleinere Link-Proteine. Das hier häufiger als in den

Interterritorien vorkommende GAG Chondroitinsulfat ist größer, besitzt mehr Ladungen als Keratansulfat

und bedingt dadurch eine höhere Wasserbindungsfähigkeit der Territorien (LUPPA 2000). In diesem Bereich

entsteht ein Netz feiner Kollagen Typ II-Fasern unter Mitwirkung von Kollagen Typ IX, dessen Präsenz eine

weitere Anlagerung von Kollagen Typ II-Fibrillen inhibiert. Durch diese Begrenzung des Faserdurchmessers

des Kollagen Typ II entstehen dicht gelagerte Einfassungen um die Chondrozyten (BRUCKNER und VAN DER

REST 1994, MARK 2006). Von den Territorien weg laufen dickere Bündel kollagener Fasern in radiärer

Orientierung, um schließlich sehr kompakte Fasern zu bilden, die in den Interterritorien zu finden sind. In

diesen Bereichen liegt eine höhere Konzentration von keratansulfatreichen PGs vor (BONNEMANN et

al. 2000, MARK 2006, OLSEN 1997).

2.2.3 Der Faserknorpel

Der Faserknorpel kommt physiologisch im Bereich des Bewegungsapparats als Menisci articulares des

Kniegelenks zur Kontaktflächenvergrößerung inkongruenter Gelenkoberflächen vor. Zusätzlich dient er in

diesen und den Anuli fibrosi der Zwischenwirbelscheiben sowie den Disci articulares der Kiefergelenke der

Kompensation von Scherkräften und starken mechanischen Zugbelastungen. Das Vorkommen des

Faserknorpels beschränkt sich jedoch nicht auf die Gelenke. Er ist auch als Einlagerung in stark

beanspruchte Sehnen und Bänder nachweisbar und unterstützt neben dem ohnehin hohen Gehalt an

Kollagen Typ I in diesen Geweben deren Zugfestigkeit (BENJAMIN und RALPHS 1998, STÄRKE 2008).

Im Faserknorpel sind die kollagenen Fasern im Gegensatz zur amorphen Grundsubstanz stark

überrepräsentiert und in Richtung der Zugbelastung ausgerichtet. Aufgrund der morphologischen Nähe

zum straffen, kollagenfaserreichen Bindegewebe wird dieser auch als Bindegewebsknorpel bezeichnet

(MAKRIS et al. 2011).

Die Fähigkeit des Gewebes zur Druckaufnahme ist aufgrund des geringeren PG-Gehalts wesentlich geringer

als die des hyalinen Knorpels. Durch die spezielle Anordnung der Kollagenfaserbündel und den

Gesamtquerschnitt des jeweiligen Faserknorpels werden jedoch bei diesen Gelenken punktuell einwirkende

Druckkräfte in Zugspannungen umgewandelt, welche auf die Gesamtfläche des Faserknorpels verteilt

werden können. Diese Umwandlung ermöglicht die Stoßdämpfungsfunktion des Faserknorpels

(MAKRIS et al. 2011, STÄRKE 2008).

Die wenigen Chondrozyten des Faserknorpels sind entsprechend der Zugrichtung der Kollagenfasern

zwischen diese eingebettet. Daher liegen sie hintereinander angeordnet, einzeln oder in Gruppen von zwei

Zellen und bilden keine Chondrone. In den äußeren Bereichen der Disci, Menisci und Anuli fibrosi

erscheinen sie gestreckt und spindelförmig, während sie in den tieferen Regionen eine ovoide Morphologie

aufweisen. Die Chondrozyten des in Sehnen und Bänder eingelagerten Faserknorpels erscheinen groß und

oval. Für die Zellen des Faserknorpels werden entsprechend der Zellmorphologie mit steigender

Konzentration der sie umgebenden ECM die Begriffe Chondrozyten, intermediäre Zellen,


12

Fibrochondrozyten oder Fibrozyten verwendet (BENJAMIN und RALPHS 1998, DETAMORE et al. 2006,

MAKRIS et al. 2011).

Faserknorpel weist unter den Knorpelarten den höchsten Anteil an Fasern und die geringste Konzentration

an amorper Grundsubstanz auf. Die kollagenen Fasern stellen mit 60-80% einen mit dem hyalinen Knorpel

vergleichbaren Anteil an der Trockensubstanz dar, wobei sich jedoch die Zusammensetzung unterscheidet.

Innerhalb der Kollagenfraktionen bildet Kollagen Typ I, welches dicke Faserbündel bildet, mit 80% den

Hauptanteil, wohingegen Kollagen II nur in geringer Konzentration gefunden wird. Die als dicke Bündel

vorliegenden Kollagen Typ I-Fasern sind für die Zugfestigkeit dieses Gewebes verantwortlich (CHEUNG

1987, SCHULZ und BADER 2007). Die PGs bilden mit 2-8 % der Trockensubstanz in der ECM nur eine kleine

Fraktion (MAKRIS et al. 2011). Trotz des im Vergleich zum hyalinen Knorpel deutlich geringeren PG-Gehalts

erreicht der Faserknorpel einen Wassergehalt von 70-75%. Dies liegt darin begründet, dass die auf

Aggrekan als Kernprotein basierenden PGs einen hohen Anteil Chondroitinsulfat (50-80%) aufweisen

(BENJAMIN und RALPHS 1998, SCHULZ und BADER 2007). Allerdings kann die Verteilung der kollagenen

Fasern und PGs des in Sehnen und Bändern eingelagerten Faserknorpels hiervon abweichen. In denen, die

neben der Zugbelastung gleichzeitig auch starken Druckkräften ausgesetzt sind, werden höhere Anteile an

Kollagen Typ II und Aggrekan nachgewiesen (BENJAMIN und RALPHS 1998).

Das Vorkommen von Mechanorezeptoren und Nozizeptoren sowie von Blutgefäßen unterscheidet den

Faserknorpel vom hyalinen Knorpel. Allerdings nimmt die zu Beginn der Entwicklung vollständige

Vaskularisierung im Rahmen des Alterungsprozesses kontinuierlich ab (MAKRIS et al. 2011, STÄRKE 2008).

2.2.4 Der elastische Knorpel

Der elastische Knorpel bildet das Stützgewebe der Ohrmuscheln, der Epiglottis und der kleinen Bronchien

sowie von Teilen der Cartilago arytaenoidea der Larynx. Er ist von einem Perichondrium umgeben. Die

Chondrozyten, deren Anteil am Gesamtvolumen 2% beträgt, liegen einzeln oder in Zweiergruppen vor und

bilden mit der sie umgebenden ECM Chondrone. Die PGs liegen in geringer Konzentration vor und sind in

ein feines Netzwerk aus Kollagen Typ II-Fasern eingelagert. Die Hauptkomponente des elastischen Knorpels

bilden die elastischen Fasern, wobei die Menge an elastischen Fasern, die in das kollagene Grundgerüst

eingewoben sind, die Flexibilität des Gewebes bestimmt. Die elastischen Fasern, welche sich bei

Zugbelastungen auf das doppelte ihrer Ausgangslänge dehnen lassen und mit Hilfe der Rückstellkräfte

energieunabhängig in diese zurückgeführt werden können, bedingen die besonderen Eigenschaften dieses

Gewebes. (KIELTY et al. 2002, SCHULZ und BADER 2007).

2.3 Dynamik des hyalinen Gelenkknorpels

Der hyaline Gelenkknorpel darf nicht als statisches Konstrukt verstanden werden. Vielmehr ist dieses

Gewebe in vivo verschiedenen biophysikalischen Einflüssen ausgesetzt, die eine dynamische Anpassung

erfordern. Dabei werden mechanische von chemischen Faktoren unterschieden. (SCHULZ und BADER 2007)

2.3.1 Dynamik des hyalinen Gelenkknorpels unter mechanischen Einflüssen

Auf den Gelenkknorpel wirkt ein hydrostatischer Druck, der je nach Belastung zwischen 1 und 200 bar

variiert. Die bei dessen mechanischer Belastung hervorgerufene Kompression des Gewebes ist essentiell für

seine Struktur und Integrität (IKENOUE et al. 2003).

Die viskoelastischen Eigenschaften des Gelenkknorpels werden mit Hilfe des biphasischen Modells

beschrieben. Eine Phase bilden die kollagenen Fasern der ECM, welche für den Spannungsdruck PKollagen


13

verantwortlich sind. Die andere Phase setzt sich zusammen aus den PGs und dem durch sie gebundenen

Wasser, welche den hydrostatischen Druck hervorrufen (PHydr) sowie den nicht-kollagenen Proteinen und

die an diese assoziierten Ionen, welche den osmotischen Druck (POsm) aufbauen. Im Gelenkknorpel bauen

der hydrostatische Druck und der osmotische Druck abzüglich des Spannungsdrucks der kollagenen Fasern

den Schwelldruck des Gelenkknorpels auf. Daraus ergibt sich folgende Gleichung:

PSchwell = PHydr + POsm - PKollagen

Dem Schwelldruck steht der von extern auf den Gelenkknorpel wirkende mechanische Druck (PExtern)

entgegen. Sobald dieser zunimmt, kommt es zu einer vermehrten Umverteilung von Wasser in weniger

belastete Bereiche des Knorpelgewebes. Dadurch wird die externe Druckbelastung initial durch den

hydrostatischen Druck kompensiert bzw. erfolgt eine Flüssigkeitsverschiebung innerhalb des Knorpels.

Dabei kommt es auch zu einer Wasserumverteilung zwischen PG-gebundenem und nicht PG-gebundenem

Wasser innerhalb des Gelenkknorpels, sodass sich zwischen hydrostatischem und osmotischem Druck ein

Gleichgewicht eingestellt. Dauert die Belastung länger, kommt es zum langsamen Flüssigkeitsausstrom aus

der ECM, welcher solange aufrechterhalten bleibt bis der hydrostatische Druck null erreicht und der

gesamte externe Druck von den PGs und kollagenen Fasern übernommen wird (LUPPA 2000, SCHULZ und

BADER 2007). Durch diesen Vorgang kommt es zur Abnahme des Knorpelvolumens innerhalb von 3-12

Minuten (ECKSTEIN et al. 2001). Bei nachlassender Belastung erfährt das Wasser eine erneute

Umverteilung, sobald der externe mechanische Druck den Schwelldruck unterschreitet (LUPPA 2000,

SCHULZ und BADER 2007). Der Ausgangszustand wird aufgrund der langsamen Rückflussrate durch die

Gelenkoberfläche nach ca. 90 Minuten wieder erreicht. Bei hoher kontinuierlicher hydrostatischer

Druckbelastung nimmt die Knorpeldicke nach 1 Minute um 3%, nach 8 Minuten um 11% und nach

4 Stunden um 57% ab (HERBERHOLD et al. 1999). Den Verschiebungen sowohl des freien als auch des

gebundenen Wassers folgen gleichsam die darin gelösten Stoffe (z.B. Glukose, Lactat, Sauerstoff), sodass

die Versorgung mit Nährstoffen und die Entsorgung von Stoffwechselendprodukten an die

biomechanischen Belastungen gekoppelt sind (LUPPA 2000, MARLOVITS und VÉCSEI 2000, POOLE 1997).

Der zonale Aufbau des Knorpels ist für die Bewältigung der im Gelenk wirkenden Kräfte essentiell. Da die

Tangentialzone bei Belastung Flüssigkeit abgibt und sich dadurch ihre parallel zur Oberfläche

ausgerichteten Kollagenfasern verdichten, bildet sie eine effektive Abdichtung der Knorpeloberfläche.

Damit wird der Flüssigkeitsausstrom in der Radiärzone bei zyklischer Belastung vernachlässigbar gering, da

dieser auch subchondral durch das Knochengewebe eingeschränkt wird. Durch die gleichmäßige Verteilung

des hydrostatischen und osmotischen Drucks kommt es unter dem Kontaktbereich zu einer uniformen

Kraftübertragung auf den gesamten Gelenkknorpel und in der Folge auf die vollständige subchondrale

Knochenfläche (ECKSTEIN et al. 2001, LUPPA 2000).

Neben den vertikal wirkenden Kompressionskräften, die hauptsächlich durch den hydrostatischen und

osmotischen Druck kompensiert werden, ist der Gelenkknorpel auch horizontal wirkenden Scherkräften

ausgesetzt. Diesen sich in Form von Zugkräften im Gewebe manifestierenden Kräften wirkt hauptsächlich

der Spannungsdruck der kollagenen Fasern entgegen (WONG und CARTER 2003). Für die

Widerstandsfähigkeit gegenüber den Scherkräften sorgen sowohl die dicht gelagerten und

oberflächenparallel ausgerichteten kollagenen Fasern der Tangentialzone als auch die Verzahnung der

Mineralisationszone mit dem subchondralen Knochen. Zudem tragen die Abgabe von Flüssigkeit aus der

Tangentialzone sowie die Phospholipide, das Lubricin und die Hyaluronsäure der MSZ zur Reduktion der

Reibungskräfte bei und vermindern somit die auf die Gelenkfläche einwirkenden Scherkräfte. Aufgrund des


14

wesentlich geringeren Anteils an zugfestem Kollagen Typ I zeigt der hyaline Knorpel eine höhere

Empfindlichkeit gegenüber Scherkräften als der Faserknorpel (BUCKWALTER et al. 2005, LOTZ und LOESER

2012, KATTA et al. 2008).

2.3.2 Dynamik des hyalinen Gelenkknorpels unter chemischen Einflüssen

Die Dynamik des Gelenkknorpels wird auch durch die An- oder Abwesenheit von Sauerstoff sowie dessen

Konzentrationsgradienten beeinflusst. Die hierbei über verschiedene Zytokine vermittelten Effekte führen

zu Veränderungen in der Menge und Zusammensetzung der ECM (FORTIER et al. 2011).

Durch die Limitierung der Ernährung des Gelenkknorpels über die Synovia weist dieser eine langsame

Stoffwechselrate auf. Da hiervon auch der Sauerstofftransport betroffen ist, liegt ein vorwiegend anaerober

Metabolismus vor. Die mit Hilfe von Mikroelektroden messbare Sauerstoffspannung des Gewebes liegt in

der Tangentialzone bei 7,5% und sinkt auf bis zu 1% nahe der Tidemark ab (SCHULZ und BADER 2007). Die

hypoxischen Bedingungen bewirken die Bildung von Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α), welcher eine

hemmende Wirkung auf die Chondrozytenproliferation hat und die Expression verschiedener Zytokine

induziert. Unter diesen spielen TGF-β1, BMP-2, BMP-7, IGF-1 und FGF-2 die wichtigste Rolle. Die additiven

Effekte dieser Zytokine steigern die synthetische Aktivität der Chondrozyten und führen somit bei

moderater Belastung zu einer physiologischen Dickenzunahme des Gelenkknorpels (ALFORD 2005,

DANIŠOVIČ et al. 2012, HANSEN et al. 2001, MABVUURE et al. 2012, SCHULZ und BADER 2007).

Die Zytokine TGF-β1, BMP-7 und IGF-1 führen zur verstärkten Synthese aller Komponenten der ECM des

Knorpelgewebes, wobei IGF-1 den stärksten Effekt hat. Gleichzeitig wird die ECM vor dem Abbau geschützt,

indem BMP-7 die Aktivität der Matrixmetalloproteinase 13 (MMP-13) vermindert. BMP-2 hingegen hat eine

selektive Wirkung auf die Syntheseaktivität der Chondrozyten. Es bewirkt eine gesteigerte Expression von

Kollagen Typ II und beschleunigt die Umsatzrate von Aggrekan (COUCHMAN und PATAKI 2012,

EKENSTEDT et al. 2006). FGF-2 entfaltet im Gelenkknorpel eine dosisabhängige Wirkung. So nimmt seine

auf die PG-Synthese stimulierende Wirkung mit steigender Konzentration ab (FORTIER et al. 2011).

2.3.3 Seneszenz als Einflussfaktor auf die Dynamik des hyalinen Gelenkknorpels

Der Gelenkknorpel unterliegt altersabhängigen charakteristischen Veränderungen, die sowohl die Zellen,

die kollagenen Fasern als auch die PGs betreffen (DEGROOT et al. 1999, LOTZ und LOESER 2012, LUPPA

2000, MALLINGER und STOCKINGER 1987).

Da im Knorpel das Verhältnis von Proliferation und Apoptose physiologisch auf Seiten der Apoptose liegt,

nimmt im Zuge des Alterungsprozesses die Anzahl der Chondrozyten ab. So sinkt diese im humanen

Kniegelenk vom 20. bis zum 90. Lebensjahr um etwa 50%, wobei der größte Anteil des Zellverlusts auf die

Zellen der Tangentialzone entfällt. In Abwesenheit phagozytierender Zellen verbleiben die Reste der

Chondrozyten als apoptotische Körperchen in den Territorien. Die in diesen enthaltene alkalische

Phosphatase spaltet extrazelluläres Pyrophosphat, wodurch verstärkt freies Orthophosphat für die Bildung

von Hydroxylapatit zur Verfügung steht. Dies hat die Mineralisierung des Knorpels zur Folge und vermindert

somit nicht nur dessen Vitalität sondern trägt auch zum Fortschreiten des Umbaus und der Degradierung

bei (JOHNSON und TERKELTAUB 2005).

Die herabgesetzte Sensitivität der Rezeptoren alternder Chondrozyten gegenüber den Zytokinen IGF-1 und

FGF-2 sowie die verminderte Expression von TGF-β1 führen zu einer verringerten Synthese der ECM und

somit zur Minderung der Knorpeldicke. Da hierbei die Quervernetzungen zwischen den Fasern des Kollagen

Typ II erhalten bleiben, steigt deren Konzentration, wodurch eine höhere Steifigkeit des Gewebes


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hervorgerufen wird (LOTZ und LOESER 2012). Diese Veränderungen haben zur Folge, dass es bereits bei

geringen Belastungen zum Zerreißen der Kollagenfasern kommen kann (LUPPA 2000). Im Gegensatz dazu

bleibt die Empfindlichkeit der BMP-7-Rezeptoren auch in alternden Chondrozyten erhalten, sodass vor

allem der hemmender Effekt des BMP-7 auf die MMP-13 der Degeneration des Knorpels Grenzen setzt

(FORTIER et al. 2011).

Im Rahmen des Alterungsprozesses kommt es auch zu Veränderungen des Aufbaus und der Konzentration

der PGs. Einerseits nimmt die Gesamtkonzentration der PGs und die Größe der Kernproteine ab.

Andererseits verändert sich das Verhältnis der GAG-Seitenketten von längeren, stärker geladenen

Chondroitinsulfat-Resten zu kürzeren und weniger geladenen Keratansulfat-Resten. Diese Entwicklung setzt

bereits nach der Geburt ein und vollzieht sich insbesondere in der ersten Lebenshälfte

(DEGROOT et al. 1999, LUPPA 2000, MALLINGER und STOCKINGER 1987, ROUGHLEY und WHITE 1980). Der

mit diesem Prozess einhergehende Verlust des hydrostatischen Drucks im Gelenkknorpel wird im mittleren

Lebensabschnitt durch eine Zunahme an permeablen Teilchen, die den osmotischen Druck bestimmen,

kompensiert. Im hohen Alter nimmt jedoch auch deren Bildung ab, während gleichzeitig die Permeabilität

der Grenzflächen, insbesondere der Tangentialzone, ansteigt. Dadurch wird der Anteil des hydrostatischen

und osmotischen Druckes zur Kompensation des externen Drucks verringert (LUPPA 2000). Da es im

Vergleich zu den PGs in stärkerem Maß zur Verminderung der Anzahl kollagener Fasern kommt, sinkt der

Spannungsdruck, welcher dem hydrostatischen Druck des an die PGs gebunden Wassers entgegenwirkt. In

der Folge quellen die PGs weiter auf, wodurch die Härte und Elastizität des Knorpels verloren gehen. Der

stark gequollene Zustand der PGs hat einen negativen Effekt auf die Integrität der ECM, sodass die

Knorpeloberfläche aufraut, wodurch der Reibungswiderstand und der Abrieb des Gelenkknorpels ansteigen

(KATTA et al. 2008, LOTZ und LOESER 2012). Die Gesamtheit dieser Seneszenz bedingten Dynamik führt

dazu, dass bereits geringe mechanische Belastungen Schäden des Gelenkknorpels hervorrufen

(LUPPA 2000).

2.4 Defekte und Regeneration des Knorpelgewebes

Entsprechend der Morphologie und Funktion der verschiedenen Knorpeltypen unterscheiden sich sowohl

die Art und Ausprägung der Defekte als auch die Regeneration dieser (LOTZ und LOESER 2012).

2.4.1 Defekte und Regeneration des hyalinen Gelenkknorpels

Defekte des Knorpels werden nach Outerbridge in verschiedene Grade, welche erstmals für das Knie

entwickelt wurden, eingeteilt. Neben dem Grad 0 (Normalbefund), existieren 4 weitere Grade, deren

arthroskopisches Erscheinungsbild mit der Histologie der Defekte korreliert (Tab. 2) (OUTERBRIDGE 1961,

MADRY 2008).

Bei Gelenkknorpelläsionen wird generell zwischen partiellen Gelenkknorpeldefekten (Grad 1-3) und

subchondralen, vollständigen Defekten (Grad 4) unterschieden, da sie sowohl hinsichtlich der Regeneration

als auch hinsichtlich der Therapieempfehlungen differieren. Seit Hunters Feststellung 1743 (HUNTER 1743),

dass ulzerierter Knorpel „sich nicht wieder reparieren lässt, wenn er einmal zerstört ist“, wurde die

begrenzte Kapazität des Gelenkknorpels zur Regeneration vielfach beschrieben (MARLOVITS und VÉCSEI

2000).


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Tab. 2: Outerbridge Klassifikation von Knorpeldefekten, nach Outerbridge (1961), MADRY (2008). Grad Befund

Grad 0 Normalbefund, intakter Knorpel

Grad 1 Oberflächliche Erweichung des Knorpels, bei glatter Oberfläche

Grad 2 Aufgefaserte Oberfläche mit Einrissen <50% der Knorpeldicke

Grad 3 Tiefe Fissuren, Ulcus mit instabilen Rändern >50% der Knorpeldicke

Grad 4 Knorpelverlust bis zum subchondralen Knochen

Bedingt durch die Abwesenheit von Blutgefäßen fehlt die in allen anderen Geweben des Körpers

stattfindende Wundheilung, die durch Nekrose, Entzündung und Reparatur gekennzeichnet ist, so dass die

Regeneration des hyalinen Knorpels einen anderen Verlauf nimmt (MARLOVITS und VÉCSEI 2000).

Bei Mikroverletzungen (Grad 1) kommt es zur Schädigung der Lamina splendens und den Chondrozyten der

Tangentialzone. Durch den daraus resultierenden Verlust der Integrität der Kollagenultrastruktur und damit

der kollagenen Fasern kommt es zum Quellen der PGs und somit zur verstärkten Wassereinlagerung, die

den Knorpel aufweicht. Zudem sind nun die darunter liegenden Strukturen angreifbar für Kollagenasen und

Aggrekanasen. Da durch diese Prozesse die abdichtende Funktion der Tangentialzone gegenüber der

Radiärzone verloren geht, ist die Biodynamik des Gelenkknorpels einschränkt. In der Folge wird der

punktuell auf den Gelenkknorpel wirkende Druck nicht mehr gleichmäßig in diesem und dem

subchondralen Knochen verteilt, wodurch es zur Verdickung der subchondralen Knochenplatte im Bereich

unterhalb der Läsion kommt. Wird die Ursache nicht behoben, schreitet der Prozess in die Tiefe fort und

führt zur Ausbildung von Fissuren oder Ulzera (Grad 2-4) und somit zum Verlust der biomechanischen

Eigenschaften des Gelenkknorpels (ALFORD 2005, BRUNS und STEINHAGEN 2000, MARLOVITS und VÉCSEI

2000).

Im Rahmen von partiellen Gelenkknorpeldefekten (Grad 2-3) kommt es innerhalb der ersten 48-72 Stunden

zu einer Nekrose der Chondrozyten. Anschließend zeigen überlebende Chondrozyten nur für kurze Zeit eine

vermehrte metabolische Aktivität, welche die Bildung von Kollagen Typ II und anderen Bestandteilen der

ECM bedingt, um anschließend wieder auf Normalniveau zurückzukehren. Einige Autoren berichten vom

Auftreten eines fibrösen Narbengewebes im Sinne der Reparatur. Allerdings findet sowohl im Rahmen

dieses Prozesses als auch in der Folge keine Defektregeneration statt, wodurch eine Wiederherstellung der

Integrität des Gelenkknorpels unterbleibt (MEACHIM und ROBERTS 1971, MARLOVITS und VÉCSEI 2000).

Die subchondralen, vollständigen Defekte (Grad 4) überschreiten die Tidemark bis in den subchondralen

Knochen und schaffen dadurch Voraussetzungen für die physiologische Reparatur. Durch die Eröffnung des

subchondralen Knochens kommt es zu einer Einblutung und Bildung eines Fibringerinnsels, welches sich gut

am Knochen anhaftet, jedoch keine Adhärenz zum benachbarten Knorpelgewebe zeigt. In den folgenden

Tagen wandern MSCs aus dem subchondralen Knochen in den Defekt ein (MARLOVITS und VÉCSEI 2000,

SHAPIRO et al. 1993). Da durch die Eröffnung des subchondralen Knochens die Sauerstoffspannung

innerhalb des Defekts ansteigt, entfällt der hemmende Einfluss von HIF-1α auf die Proliferation

(DAS et al. 2010). Dadurch sind die sich aus den MSCs differenzierenden Chondroprogenitorzellen in der

Lage, den Defekt innerhalb der nächsten Tage vollständig aufzufüllen und das Fibringerinnsel zu

resorbieren. Im weiteren Verlauf differenzieren diese zu Chondrozyten, die sich stellenweise in

Chondrozytenclustern konzentrieren, andere Bereiche jedoch völlig azellulär lassen. Die Chondrozyten

produzieren PGs sowie Kollagen Typ I und II. Der daraus resultierende Knorpel wird als „hyaline-like“

bezeichnet und füllt nach ca. einem halben Jahr den gesamten Defekt aus (MARLOVITS und VÉCSEI 2000,


17

SHAPIRO et al. 1993). Dieser aus der Orthopädie stammende Begriff ist nicht einheitlich definiert (MADRY

und PAPE 2008). Einige Autoren beschreiben damit arthroskopisch und funktionell festen Gelenkknorpel,

der jedoch histologisch die Kriterien des Faserknorpels erfüllt; andere nutzen den gleichen Begriff für

Knorpel, der histologisch dem hyalinen Knorpel sehr ähnlich ist. Vom hyalinen Knorpel unterscheidet ihn

der höhere Anteil an Kollagen Typ I-Fasern sowie der zonale histologische Aufbau (GOYMAN 1999,

KRASNICI et al. 2000). An Stelle einer Integration des neu gebildeten Knorpels in den bestehenden Knorpel

wurde das „Cartilage-flow-Phänomen“ beobachtet, bei dem sich die Defektränder abrunden und gleichsam

in den Defekt „fließen“ (BRUNS und STEINHAGEN 2000). Zwischen neu gebildetem und vorhandenem

Knorpel verbleibt immer ein elektronenmikroskopisch nachweisbarer Spalt, sodass keine Druckverteilung

im Rahmen der Biodynamik des Gelenkknorpels mehr stattfinden kann (MARLOVITS und VÉCSEI 2000,

SHAPIRO et al. 1993). Aus diesem Grund entsteht eine Überlastung, sodass der neu gebildete Knorpel

bereits nach einigen Monaten erste Zeichen der Degeneration erfährt. Die Oberfläche sinkt ein und

splittert; es kommt zur Freilegung der Fasern (Fibrillierung). Nachfolgend erfolgt der Umbau des Gewebes,

welches schließlich der Zusammensetzung und Qualität des Faserknorpels entspricht. Allerdings ist dieser

biomechanisch auf die Kompensation von Zugkräften ausgelegt und weist in Bezug auf

Druckkraftübertragung und Haltbarkeit gegenüber Scherkräften erhebliche Defizite gegenüber dem

hyalinen Knorpel auf. Die Belastung dieses Ersatzgewebes hat wiederum die Entstehung neuer Läsionen zur

Folge (BRUNS und STEINHAGEN 2000, MARLOVITS und VÉCSEI 2000, SHAPIRO et al. 1993).

Im juvenilen Organismus ist ein anderer Verlauf der Defektheilung zu beobachten. Oberflächliche Defekte

zeigen hier eine spontane Heilung. Eine Erklärung hierfür liefern die bei juvenilen Tieren vorhandenen

Chondroprogenitorzellen in der Tangentialzone. Im Gegensatz zu Chondrozyten besitzen diese Zellen die

Fähigkeit zur Proliferation und zur Neochondrogenese (FRITSCH et al. 1999, HOLLANDER et al. 2010). WEI

und MESSNER (1998) zeigten in einem Kaninchenmodell mit tiefen Knorpeldefekten, dass die Konzentration

von TGF-β1 in der Synovia juvenil höher ist als adult. Die Wirkung von TGF-β1 auf Chondroprogenitorzellen

der Tangentialzone bewirkt eine schnelle Auffüllung des Defekts mit „hyaline-like“ Knorpel. Zusätzlich

zeigten juvenile Tiere immer eine vollständige Integrität zum umliegenden Knorpel. Der Einfluss des TGF-β1

auf die Chondrozyten des an den Defekt angrenzenden Knorpelgewebes führt jedoch langfristig in diesem

Bereich zu einer starke Fibrillierung und Osteophytenbildung (WEI et al. 1997).

Das Langzeitresultat aus Knorpeltraumata sowie aus Überbelastung und Gelenksentzündungen stellt die

Osteoarthrose (OA) dar. Diese tritt häufig in Kombination mit weiteren prädisponierenden Faktoren wie der

Seneszenz des Gelenkknorpels oder Diabetes auf (LOTZ und LOESER 2012).

Der Prozess der OA im Gelenkknorpel beginnt mit dem Abbau der aggregierten PGs, wodurch der

hydrostatische Druck sinkt und der osmotische Druck steigt. Da im Rahmen der Überbelastung des Knorpels

zusätzlich die Integrität der Tangentialzone verloren geht, fehlt ihre abdichtende Funktion zur Radiärzone.

Dadurch diffundieren bei Belastung des Knorpels die nicht aggregierten PGs in die Synovia und gehen für

eine erneute Aggregation verloren. Somit wird die ursprüngliche Knorpelhöhe nach Entlastung und

Rückdiffusion des Wassers nicht mehr erreicht. Folgen erneute Überbelastungen schnell aufeinander,

nimmt die Knorpeldicke kontinuierlich ab und der Prozess schreitet bis zum subchondralen Knochen fort

(ASPBERG 2012, LUPPA 2000).

Die aus diesem Vorgang resultierende Verringerung der PG-Konzentration im Gelenkknorpel führt zur

Minderung der Hydrathülle der kollagenen Fasern. Auf diese Weise freigelegtes Kollagen wird für

Kollagenasen, hauptsächlich MMP-13, angreifbar. Da hierbei vorrangig Kollagen Typ IX und XI abgebaut


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werden, nimmt der Grad der Quervernetzung ab und es entsteht eine zusätzliche Destabilisierung des

Kollagenfasernetzes. Dadurch sinkt der Spannungsdruck der kollagenen Fasern ab, wodurch die PGs

aufquellen und zur Aufweichung des Knorpels führen. Schreitet der Abbau des Knorpels durch Kollagenasen

und Aggrekanasen fort, verändern sich die Chondrozyten zu so genannten OA-Chondrozyten, welche

gemäß ihres Funktionszustands als „senescense-associated secretory phenotype“ (SASP) bezeichnet

werden (TROEBERG und NAGASE 2012, VERMA und DALAL 2011). Diese Zellen geben nun pro-

inflammatorische Zytokine (SASP-Faktoren) ab, wie beispielsweise IL-1, IL-6, IL-7, IL-8 und TNF-α, welche

einen Entzündungsprozess hervorrufen und aufrechterhalten (COUCHMAN und PATAKI 2012, FORTIER et

al. 2011). Das Ausmaß der daraus resultierenden Synovitis gilt als Maß für die Schwere und die Progression

der OA (COUCHMAN und PATAKI 2012).

Erreicht der Prozess den subchondralen Knochen, reagiert dieser mit einem belastungsassoziierten

Knochenumbau, der zur Sklerose des subchondralen Knochens und zur Bildung von Osteophyten führt. Der

fehlenden Innervation des hyalinen Knorpels ist der Umstand geschuldet, dass die pathologischen

Veränderungen erst zu diesem Zeitpunkt klinisch evident werden, da sie nun Schmerzen verursachen

(GOLDRING 2012, LOTZ und LOESER 2012, MARTIN und BUCKWALTER 2002, TROEBERG und NAGASE 2012).

2.4.2 Defekte und Regeneration des Faserknorpels

Defekte des Faserknorpels, zumeist Risse entlang des Faserverlaufs der Kollagenfasern, entstehen in der

Regel durch hohe Krafteinwirkungen, die nicht in der Hauptbelastungsrichtung auftreten. Da der

Faserknorpel im Gegensatz zum hyalinen Knorpel sensibel innerviert ist, werden Defekte des Faserknorpels,

wie beispielsweise Meniskusrisse, sofort wahrgenommen. Die Vaskularisierung des Faserknorpels ist direkt

korreliert mit seiner Heilungskapazität (MAKRIS et al. 2011). Dabei sind gut vaskularisierte Bereiche in der

Lage eine normale Wundheilung (Nekrose, Entzündung und Reparatur) zu durchlaufen und ein

funktionsfähiges Gewebe in Form von Faserknorpel zu bilden. In avaskulären Bereichen ist die

Regenerationskapazität eingeschränkt. Das hier entstehende Ersatzgewebe weist für den Faserknorpel eine

zu hohe Konzentration der kollagenen Fasern auf (MAKRIS et al. 2011, STÄRKE 2008).

2.4.3 Defekte und Regeneration des elastischen Knorpels

Im Gegensatz zu den Defekten der bisher genannten Knorpelarten, die in der Regel durch Überlastung

entstehen, handelt es sich bei solchen des elastischen Knorpels um neoplastische Prozesse oder

angeborene Anomalien (Anotie, Mikrotie).

Die wenigen, hoch differenzierten Chondrozyten, der langsame Umsatz der ECM und die kaum

vorhandenen Progenitorzellen schränken die intrinsische Regenerationsfähigkeit des elastischen Knorpels

ein. Das Fehlen einer Vaskularisierung ist wie im hyalinen Knorpel für das Ausbleiben der Wundheilung

verantwortlich, so dass die Regeneration des elastischen Knorpels mit der Bildung von Faserknorpel

einhergeht (CIORBA und MARTINI 2006, MARLOVITS und VÉCSEI 2000, STERODIMAS et al. 2009).

2.5 Strategien zur Behandlung von Knorpeldefekten

Bereits 1941 wurde von P.B. Magnuson das chirurgische Debridement („Shaving“) klinisch angewendet, bei

dem die Glättung der Knorpeloberflächen am Rand der Läsion im Vordergrund steht, wodurch die

mechanische Irritation und folglich die Entzündung reduziert, jedoch keine Reparatur erreicht wird (HORAS

et al. 2000). Seither sind viele konservative und chirurgische Therapieansätze mit unterschiedlichen

Resultaten verfolgt worden (HORAS et al. 2000). Allein deren Vielzahl lässt Rückschlüsse auf die


19

sozialmedizinische Bedeutung der Knorpelläsionen und der mit ihnen einhergehenden Arthrose zu. Das

Statistische Bundesamtes ermittelte für das Jahr 2002, dass 2% aller Krankenhausaufenthalte des

Menschen durch die Diagnose Arthrose, davon etwa 50% Gonarthrose und 40% Coxarthrose, verursacht

worden (MERX et al. 2007). Auch etwa 20% aller adulten Hunde werden mit dieser Diagnose auffällig. Bei

alten Hunden (>8 Jahren) wird sie sogar zu 90% gestellt, wobei der Anteil klinisch kranker Hunde weit

darunter liegt (DYCUS et al. 2013). Epidemiologische Daten zeigen für das Auftreten der Osteochondrose,

einer Erkrankung, die mit Knorpeldefekten einhergeht, beim Pferd eine Inzidenz von 10-25% (JEFFCOTT

1996). Bislang gibt es kein Verfahren, das sich aufgrund des Therapieerfolgs durchsetzen konnte. Daher

beschränken sich die Therapieverfahren zur Behandlung von Knorpeldefekten, von denen die wichtigsten

im Folgenden vorgestellt werden, derzeit auf die Verbesserung der Schmerzsymptomatik und die Erhaltung

der physiologische Bewegungsfreiheit (FRITSCH et al. 1999).

2.5.1 Knochenmarkstimulierende Verfahren

Ziel dieser Gruppe von Verfahren ist die Eröffnung der subchondralen Knochenplatte, um das Einwandern

von MSCs zu ermöglichen. Man unterscheidet Bohrung, Abrasion und Mikrofrakturierung, wobei letztere

arthroskopisch durchgeführt werden kann. Die durch die gesetzten Defekte eingewanderten MSCs bilden

ein den Defekt füllendes Ersatzgewebe, welches die für den Faserknorpel typischen Eigenschaften der

Zugfestigkeit besitzt, jedoch nicht die für den Gelenkknorpel typische Widerstandsfähigkeit gegenüber

Druck und Scherkräften aufweist. Da sich jedoch durch die mechanischen und funktionellen Defizite des

Faserknorpels nur kurzzeitig eine Linderung der Symptome einstellt, werden diese Verfahren kontrovers

diskutiert. Zur Optimierung und Weiterentwicklung dieser Verfahren erfolgen derzeit Untersuchungen über

den Effekt einer Kollagenmembran, welche, über dem Defekt aufgebracht, das Abschwimmen der MSCs

nach dem Eingriff verhindern soll (MARTINEK und IMHOFF 2003).

2.5.2 Autologe Knorpelknochentransplantation

Bei der autologen Knorpelknochentransplantation (OCT) wird der geschädigte Knorpel bis tief in die

subchondrale Knochenplatte entfernt. Anschließend werden aus einer nicht gewichttragenden Stelle

desselben Gelenks oder eines anderen Gelenks ein oder mehrere zylindrische Transplantate mit ihrer

knöchernen Grundlage entnommen und in die Defektstelle eingesetzt. Aufgrund der Defekte an der

Spenderstelle bleiben solche Transplantate auf kleine Flächen von 2-3 cm2 beschränkt (WINDHAGER et al.

2004). Die Transplantate sollten die gleiche Größe und Oberflächenneigung wie die Defektstelle aufweisen.

In der Regel unterbleibt auch ein Vernähen, um störende Oberflächen zu vermeiden. In der ersten Phase,

in der die Transplantate am subchondralen Knochengewebe anwachsen, weist das in den Transplantaten

enthaltene Knorpelgewebe eine vollständige Funktionalität auf (HORAS et al. 2000). Allerdings werden im

weiteren Verlauf Wachstums- und Differenzierungsfaktoren in zu geringem Maße exprimiert, so dass die

Chondrozyten der Transplantate inaktiv bleiben. Eine Vermehrung der Chondrozyten unterbleibt,

verhindert somit die vollständige Integration der Knorpel-Knochen-Stanze in die umgebende Knorpelmatrix

und erschwert deren Nährstoffversorgung (FRITSCH et al. 1999). Stattdessen werden die Zwischenräume

durch Faserknorpel aufgefüllt, der die Integration in die Biodynamik des Gelenkknorpels verhindert. Den

biomechanischen Anforderungen ist die Stanze langfristig nicht gewachsen, sodass es zur Transformation

des Transplantats zu Faserknorpel kommt. Da dieser in seinen biomechanischen Eigenschaften den

Kompressionskräften nicht gewachsen ist, kommt es zur arthrotischen Veränderung des Gelenks

(BUCKWALTER und MANKIN 1998, FRITSCH et al. 1999).


20

Die Probleme dieses Verfahrens entstehen durch die Langzeitfolgen, die durch den Entnahmedefekt

verursacht werden, sowie durch die Schwierigkeit, das Transplantat ohne Kantenbildung in die Umgebung

einzupassen. Zudem verhindert die Inaktivität der transplantierten Chondrozyten die Langzeitstabilität der

Transplantate (MARTINEK und IMHOFF 2003).

2.5.3 Autologe Knorpeltransplantation

Die autologe Knorpeltransplantation (ACT) wurde 1994 in Schweden entwickelt (BRITTBERG et al. 1994).

Die ACT verläuft in 3 Schritten. In einer ersten Operation wird eine Knorpelbiopsie an einer nicht Gewicht

tragenden Stelle des Gelenkknorpels entnommen. Aus der Knorpelbiopsie werden die Chondrozyten isoliert

und 11-21 Tage in Monokultur bis zur zehnfachen Konzentration expandiert. Anschließend werden die

Zellen durch Trypsinierung gelöst und in Suspension überführt. In einer zweiten Operation wird im Bereich

der Knorpelläsion das Defektmaterial entfernt. Es wird ein Stück Periost entnommen und als autologer

Periostlappen über dem Defekt fest vernäht und dicht verklebt. Mit Hilfe einer Nadel wird die

Zellsuspension (2,6x106 - 5x106 Zellen) unter den Periostlappen injiziert. Die Chondrozyten setzen sich

innerhalb von 24-48 Stunden am Grund des Defekts ab, dedifferenzieren und bilden in dieser biologischen

Kammer ein Knorpelregenerat (BRITTBERG et al. 1994, ERGGELET 2003). Nach der Adhärenz der

transplantierten Chondrozyten proliferieren und redifferenzieren diese unter dem Einfluss der aus dem

Periostlappen stammenden Wachstums- und Differenzierungsfaktoren. Diese Faktoren sorgen für die

Synthese, Sekretion und Organisation der ECM des neu gebildeten Knorpels bis zur Auffüllung des Defekts

(FRITSCH et al. 1999). Dieses aufwändige Verfahren ist bislang die Methode, welche die stärkste Linderung

der Symptomatik zur Folge hat. Allerdings entspricht die Qualität des Regenerats nur in 50% der Fälle den

Anforderungen an einen hyalinen Knorpel (MARTINEK und IMHOFF 2003). Das Verfahren wird mittlerweile

kommerziell angeboten und aufgrund seines vielversprechenden Ansatzes stetig weiterentwickelt.

Die Matrix assoziierte autologe Knorpeltransplantation (MACT) stellt eine dieser Modifikationen dar.

Hierbei werden mit Hilfe des Tissue Engineering Biomaterialien als Träger und Matrizen verwendet, die in

den Defekt eingenäht werden können (MARLOVITS et al. 2004). Die verschiedenen Materialien liefern hier

auch unterschiedliche Ergebnisse. Fibrin-Kleber, der gute Bedingungen für die Matrixsynthese der

Chondrozyten in den ersten Wochen schafft, bleibt später nicht lange genug stabil (VANSUSANTE et al.

1998). Hydroxyapatit als fest einnähbares Trägermaterial führte initial zur Bildung von „hyaline-like“

Knorpel, lockerte sich jedoch im weiteren Verlauf vom knöchernen Untergrund (VANSUSANTE et al. 1998).

Erste Versuche der Nutzung von Biomembranen aus Kollagen Typ I, Hyaluronsäure-Vlies oder Kollagen Typ

I-Gel zeigten dagegen gute Transplantatintegration und Defektauffüllung mit hyalinem Regeneratgewebe

(MARLOVITS et al. 2004). Im Gegensatz zur ACT können bei der MACT nicht unbegrenzt viele Zellen

eingebracht werden, da die Zahl der Chondrozyten, die auf dem Trägermaterial angezüchtet werden

können (106Zellen/cm2), limitiert ist (BENTLEY et al. 2013). Trotzdem zeigten BENTLEY et al. (2013) ähnliche

Heilungsverläufe (bis 1 Jahr) bei kürzerer Operationszeit und geringerer Invasivität, da die verwendeten

porcinen Kollagen-I/III-Membranen den Periostlappen entbehrlich machen. Die Nutzung von Biomaterialien

macht die Verwendung von MACT für große Defekte möglich, wenngleich die Autoren selbst das Fehlen von

Langzeitstudien bemängeln (BENTLEY et al. 2013, ZEIFANG et al. 2010). Die Angaben über die Morphologie

und Stabilität der ACT und MACT variieren je nach Autor. FRITSCH et al. (1999) beschrieben 1999 ein

gebildetes Knorpelregenerat gleicher „Struktur, Zusammensetzung, Druckfestigkeit“ wie der

Gelenkknorpel, eine defektfreie Integration in die Umgebung und eine gute biomechanische Belastbarkeit


21

über Jahre und verweisen auf Studien mit 70-96% Behandlungserfolg. ZEIFANG et al. (2010) dagegen sehen

2 Jahre nach Behandlung keinen Unterschied zwischen dem Verfahren der Mikrofrakturierung und ACT

bzw. MACT. In der Analyse von Studien, welche die Qualität von Knorpelreparatur untersuchen, ist deren

hohe Variabilität methodischer Kriterien aufgefallen, sodass JAKOBSEN et al. (2005) zu dem Ergebnis

kommen, dass diese der vorsichtigen Interpretation bedürfen und Vergleiche untereinander schwierig sind,

solange nicht einheitliche Methoden zum Einsatz kommen.

2.6 In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten

Die Häufigkeit des Einsatzes isolierter und in-vitro kultivierter Chondrozyten zeigt seit nunmehr zwei

Jahrzehnten eine steigende Tendenz. Diese werden einerseits für die Untersuchung der molekularen

Mechanismen und der Dynamik der Chondrozyten bzw. des Knorpelgewebes genutzt, da in vitro-Systeme

den Vorteil einer einfachen Standardisierung und Durchführbarkeit bieten. Ein weiteres Einsatzgebiet

in-vitro kultivierter Chondrozyten liegt in ihrer Verwendung zur Transplantation im Rahmen der

regenerativen Therapie von Knorpeldefekten. Für die In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten werden

Systeme mit atmosphärischen und modifizierten Druckbedingungen verwendet, welche die Morphologie

und Funktion der Zellen auf unterschiedliche Weise beeinflussen (GUILAK und MOW 2000, HARDMEIER et

al. 2009, WONG und CARTER 2003).

2.6.1 Einfluss der In-vitro-Kultivierung auf Chondrozyten

Die Isolierung und In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten führt bereits in der ersten Passage der

Primärkultur zu stark miteinander korrelierenden morphologischen und funktionellen Veränderungen der

Zellen, welche einer Dedifferenzierung entsprichen. Dieser Effekt tritt sowohl bei artikulären Chondrozyten,

als auch bei solchen aus Faserknorpel und elastischem Knorpel auf (MABVUURE et al. 2012, SCHULZE-

TANZIL 2009).

In-vitro-kultivierte Chondrozyten bilden nach erfolgter Adhärenz Zell-Zell-Kontakte aus. Im Gegensatz zur in

vivo-Situation, wo diese Kontakte durch die Zunahme der ECM wieder zurückgebildet werden, bleiben

diese in vitro auch bei längerer Kultivierung erhalten. Dies liegt darin begründet, dass ein Großteil der von

den Chondrozyten in vitro produzierten ECM im Rahmen des regelmäßigen Mediumwechsels entfernt wird.

Dadurch kommt es zu einer Veränderung im Aufbau und in der Ausrichtung des Zytoskeletts sowie einer

Zunahme so genannter Stressfasern. In Folge dessen weisen Chondrozyten in vitro nicht die in vivo

charakteristische runde sondern eine lang gestreckte Form auf (SCHULZE-TANZIL 2009).

Die funktionellen Veränderungen der Chondrozyten beziehen sich auf den Grad ihrer Differenzierung,

welche dem des Chondroprogenitor-Stadiums entspricht, und das daraus resultierende Syntheseprofil

(SCHULZE-TANZIL 2009). Die Synthese der ECM der Chondrozyten in vitro ist in Richtung einer deutlich

stärkeren Sekretion des Kollagen Typ I, sowie kleinerer (z.B. Biglycan) oder weniger aggregierter (z.B.

Versikan) PGs verschoben (HARDMEIER et al. 2009, ZEIFANG, 2010). Die Gene für Kollagen Typen II und IX,

sowie solche für PGs, die auf Aggrekan als Kernprotein basieren, sind dagegen herunterreguliert (SCHULZE-

TANZIL 2009, ZEIFANG, 2010). So wird als Index für die Dedifferenzierung in vitro das Verhältnis von

Kollagen Typ I zu Typ II, ebenso wie von Aggrekan zu Versikan herangezogen (BARLIČ et al. 2008).

Bei der In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten werden verschiedene Strategien eingesetzt, um der

zellulären Dedifferenzierung entgegenzuwirken bzw. eine Redifferenzierung zu erreichen (BRITTBERG 1994,

ERGGELET 2003, FRITSCH et al. 1999). Erstere besteht in der Aussaat der Zellen in sehr hoher Dichte,

welche eine niedrige TGF-1-Expression der Chondrozyten und eine daraus resultierende höhere


22

Empfindlichkeit der Zellen gegenüber IGF-1 und FGF-2 zur Folge hat (SCHULZE-TANZIL 2009). Die weitere

Maßnahme besteht in der Zugabe dieser Zytokine zum Kultivierungsmedium. Dadurch werden die

Chondrozyten durch IGF-1 zur Synthese und Sekretion von Kollagen Typ II, IX und XI und durch FGF-2 zur

Expression von Aggrekan stimuliert (GOLDRING et al. 2006, GOLDRING 2012).

2.6.2 Einsatz von Druck bei der In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten

Durch die belastungsbedingte Umverteilung von Wasser innerhalb des Gelenkknorpels erfahren auch die in

ihm enthaltenen Chondrozyten diese einwirkenden mechanischen Kräfte, wodurch ihre

Mechanorezeptoren, die „connexin hemichannels“, stimuliert werden und sich ihre metabolische Aktivität

sowie damit die Zusammensetzung der von ihnen gebildeten ECM verändert (BUCKWALTER et al. 2005,

GARCIA und KNIGHT 2009, KNIGHT et al. 2009, WHITFIELD 2008, WONG und CARTER 2003).

Daher erfolgt die In-vitro-Kultivierung von artikulären Chondrozyten häufig in Bioreaktoren, um

Druckbelastungen zu schaffen und die durch diese ausgelösten Effekte nutzbar zu machen. Analog zu den

Voraussetzungen in vivo werden bei der In-vitro-Kultivierung der Chondrozyten in Bioreaktoren

diskontinuierliche (intermittierende), in Zyklen ablaufende (dynamische) von kontinuierlichen, über einen

gewissen Zeitraum konstant einwirkenden (statischen) Druckbedingungen unterschieden. Grundsätzlich

werden Bioreaktoren in vier Typen unterteilt, welche einerseits Scherkraft, Perfusionsdruck oder

hydrostatischen Druck übertragen oder andererseits eine direkte Druck- bzw. Kraftübertragung auf die

Zellen bewirken (SCHULZ und BADER 2007). Bioreaktoren, die Scherkräfte durch die Flüssigkeitsbewegung

des Mediums erzeugen (Spinner-flask, rotierende Bioreaktoren), finden Anwendung im Bereich des Tissue-

Engineering und der Kultivierung von Knorpelexplantaten (NEBELUNG et al. 2011). Gleiches gilt für das in

der Gewebekultur verwendete Verfahren der direkten Druckübertragung, das für die Untersuchung von

Chondrozyten in 3-D-Kultur (z.B. in Hydrogelen) eingesetzt wird. Hier wird mittels eines Stempels ein

direkter Druck erzeugt (NEBELUNG et al. 2011, SCHULZ und BADER 2007).

Für in-vitro-kultivierte Chondrozyten hat sich die Applikation von hydrostatischem Druck, repräsentativ für

die Druckverhältnisse in der Radiärzone herauskristallisiert. Hierbei wird zwischen zwei Bioreaktor-Typen

unterschieden. In den einen wird der Druck durch Kompression einer Gasphase mit entsprechender

Weiterübertragung in das die Zellen umgebende Medium aufgebaut. Zum anderen besteht die Möglichkeit,

das Medium direkt zu komprimieren. In einem Bioreaktorsystem sind Höhe, Zeitdauer und Frequenz des

einwirkenden Drucks die beeinflussbaren Variablen (SCHULZ und BADER 2007).

In den Studien der gegenwärtigen Literatur variieren die Angaben zu diesen Parametern nicht nur, sondern

widersprechen sich auch in einigen Fällen (ELDER und ATHANASIOU 2009). So zeigten IKENOUE et al. (2003)

bei unter diskontinuierlichem Druck kultivierten Chondrozyten über vier Stunden für vier Tage eine

Steigerung des Aggrekan- und Kollagen Typ II-Gehalts auf der Ebene des Transkripts, während sie bei einem

Tag keinen signifikanten Anstieg feststellten. SUH et al. (1999) dagegen wiesen bei annähend ähnlichen

Bedingungen bereits nach 6 Stunden einen Anstieg von Aggrekan um 40% nach. Einige Untersuchungen

führten zu dem Ergebnis, dass kontinuierlicher hydrostatischer Druck keinen bzw. einen negativen Einfluss

auf die mRNA-Synthese von Aggrekan und Kollagen Typ II hat, wohingegen diskontinuierlicher

hydrostatischer Druck günstige Effekte zeigte (ELDER und ATHANASIOU 2009, SMITH et al. 2000). Dagegen

erzielten TAKAHASHI et al. (1997) bei kontinuierlichem hydrostatischem Druck für 2 Stunden einen Anstieg

der PG-Konzentration. Auch in 3-D-Kulturen aus bovinen Chondrozyten in Agarosegel wurde bei

kontinuierlichem Druck ein Anstieg der Aggrekan- und Kollagen II-mRNA nachgewiesen. Dabei fiel auf, dass


23

Effekte bezüglich der Konzentration der PGs in der Regel deutlich stärker ausfallen und schneller erreicht

werden als solche auf die Expression von Kollagen Typ II (TOYODA et al. 2003).

Unter dem Einfluss verschiedener diskontinuierlicher Druckbedingungen wiesen SMITH et al. (2000) bei

100 bar und 1 Hz sowie einer Einwirkungszeit von bis zu 24 Stunden einen Anstieg der GAG-Konzentration

nach. Eine Erhöhung der Expression der Kollagen Typ II-mRNA wurde allerdings nur bei einer Einwirkzeit

von 4 und 8 Stunden festgestellt. In vergleichenden Studien juveniler und adulter equiner Chondrozyten

wurden diese über einen Zeitraum von 5 Wochen kultiviert. Dabei wurden sie einem Druck von 34,4 oder

68,7 bar und einer Frequenz von 0,25 Hz für 20 Minuten alle 4 Stunden ausgesetzt. Hierbei zeigte sich in

den adulten Kulturen bei beiden Druckhöhen eine Zunahme der Konzentration der GAGs und Kollagen Typ

II. Unter dem Einsatz gleicher Kultivierungsbedingungen wurden bei den juvenilen Chondrozyten nur bei

höherem Druck (68,7 bar) die gleichen Effekte beobachtet. Der niedrigere Druck (34,4 bar) führte dagegen

zu einer singulären Erhöhung der GAG-Konzentration und zeigte keine Effekte auf die Kollagen Typ II-

Produktion der Chondrozyten (CARVER und HEATH 1999a, CARVER und HEATH 1999b).

ELDER et al. (2008) untersuchten die Effekte des diskontinuierlichen und kontinuierlichen Drucks (10, 50

und 100 bar) von täglich einer Stunde auf ein 3-D-Agarosegel-Konstrukt in verschiedenen Zeiträumen.

Dabei stellten sie fest, dass bei allen Bedingungen eine Zunahme der Synthese der GAGs zu verzeichnen

war. Ein Anstieg der Kollagenproduktion und damit der Zugsteifigkeit des Gel-Konstrukts wurde hingegen

nur bei kontinuierlichem Druck von 50 und 100 bar beobachtet (ELDER et al. 2008).

3 Zellen, Materialien und Methoden

24

3 Zellen, Materialien, Methoden

3.1 Zellen und für deren Kultivierung verwendete Lösungen

Bei den in dieser Arbeit verwendeten Zellen handelt es sich um eine Primärkultur von Chondrozyten des

humanen Gelenkknorpels (Lonza, Basel, Schweiz). Diese Zellen wurden aus dem Kniegelenk eines 50 Jahre

alten männlichen Spenders isoliert (Chargennummer: 5F1452). Sie wurden in der Passage 2 mit einer

Zellzahl von 7,85 x105 Zellen/ml geliefert, wobei der Hersteller die maximal nutzbare Passage auf 15

begrenzte. Entsprechend der Analyse des Herstellers zeigen die Zellen eine Effizienz der Aussaat von 91 %,

eine Verdopplungszeit von 30 h und eine Lebensfähigkeit von 86%. Die Primärkultur wurde seitens des

Herstellers auf Sterilität und das Freisein von Mykoplasmen, HIV, HBV, HCV getestet. Als Kriterium zur

Identifikation der isolierten Zellen als Chondrozyten sollte eine an den Zellen durchgeführte Kollagen

Typ II-Färbung und eine Alzianblau-Färbung zu mehr als 60% positiv ausfallen. Dieses Kriterium wurde

durch die isolierten Chondrozyten dieser Charge erfüllt.

3.1.1 Chemikalien und Lösungen für die Zellkultur

Lösung Hersteller

Chondrozyten Basal Medium (CBM) Lonza, Basel, Schweiz

Dimethylsulfoxid (DMSO) AppliChem GmbH, Darmstadt

Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (DPBS) Gibco life technologies, Darmstadt

Fetales Bovines Serum (FBS) Lonza, Basel, Schweiz

Gentamicinsulfat/Amphotericin-B Lonza, Basel, Schweiz

Hank's Salzlösung (HBSS) Lonza, Basel, Schweiz

Insulin Lonza, Basel, Schweiz

Long-R3 Insulin-like Growth Factor 1 (IGF-1) Lonza, Basel, Schweiz

r-human Fibroblast Growth Factor B (FGF-2) Lonza, Basel, Schweiz

Transferrin Lonza, Basel, Schweiz

Trypsin Neutralisationlösung (TNS) Lonza, Basel, Schweiz

Trypsin-EDTA Lonza, Basel, Schweiz

3.1.2 Zusammensetzung des Kulturmediums

Das Basalmedium CBM bildet zusammen mit den Zusätzen (Chondrocyte Growth Medium Single Quots) das

Chondrozytenwachstumsmedium (CBM+). Die Zusätze wurden hierfür aliquotiert, bei -20 °C gelagert und

dem Medium direkt vor dem Gebrauch zugesetzt.

Komponente Menge

CBM 50 ml

FBS 2,5 ml

FGF-2 250 µl

Gentamicinsulfat/Amphotericin-B 50 µl

Insulin 100 µl

IGF-1 100 µl

Transferrin 50 µl


25

3.1.3 Zusammensetzung des Einfriermediums

Komponente Menge

CBM+ 8 ml

DMSO 2 ml

3.1.4 Zusammensetzung des Spezialgasgemisches für die Kultivierung der Chondrozyten unter

Druck

Faktor Menge

Kohlenstoffdioxid (CO2) 5 %

Synthetische Luft ad 100 %

3.2 Materialien

3.2.1 Chemikalien und Reagenzien

Stoff Hersteller

1-Bromo-3-chloropropan Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

Acrylamid Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Agar-Agar Kobe I Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Agarose Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Ammoniumpersulfat (APS) Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

Aquaclean Karl Hecht GmbH & Co. KG, Sondheim

β-Mercaptoethanol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Bicinchoninsäure-Protein Assay Kit Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

Bovines Gamma Globulin Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

Bovines Serum Albumin (BSA), Fraktion V Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Bromphenolblau Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Chloroform Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

Coomassie Brilliant Blau G250 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Coomassie Brilliant Blau R250 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Diethylpyrocarbonat (DEPC) AppliChem GmbH, Darmstadt

Essigsäure Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Ethanol absolut (96 %) RNase/DNase frei AppliChem GmbH, Darmstadt

Ethidiumbromid 1% AppliChem GmbH, Darmstadt

Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Glycerol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Glycin Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Hämatoxylin-Lösung nach Gill II Dr. K. Hollborn & Söhne GmbH & Co. KG, Leipzig

Hefeextrakt Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Histokit Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Isopropylalkohol Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

Kohlenstoffdioxid (CO2) Linde AG, München

Luminol, ECL Crescendo Merck KGaA, Darmstadt

Methanol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Natriumazid Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Natriumchlorid Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Natriumdodecylsulfat (SDS) Merck KGaA, Darmstadt


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Stoff Hersteller

N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

NP-40 Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

Orange G Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

Ponceau S Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

Proteaseinhibitor Cocktail Set Merck KGaA, Darmstadt

Salzsäure (HCl) VWR International GmbH, Darmstadt

Stickstoff Linde AG, München

Strep-ABC-Lösung, Vectastain ABC Kit Vector Laboratories, Burlingame, USA

SybrGreen I Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt

TriFast peqGOLD PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen

Trishydroxymethylaminomethan (Tris) Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

Tris-hydrochlorid (Tris-HCl) Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

Tris-EDTA (TE)-Puffer (1X) pH 8,0 AppliChem GmbH, Darmstadt

Triton X-100 AppliChem GmbH, Darmstadt

Trypton AppliChem GmbH, Darmstadt

Tween 20 VWR International GmbH, Darmstadt

Wasserstoffperoxid Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Xylencyanol Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen

3.2.2 In der Proteinanalytik verwendete Antikörper, Kontrollseren und Marker

3.2.2.1 Primärantikörper

Antikörper Hersteller

Anti-Human, Aggrekan, ACAN, polyklonal, hergestellt im Kaninchen Acris Antibodies GmbH, Herford

Anti-Human, Kollagen 1α2, COL1A2, monoklonal, hergestellt in der Maus Abnova GmbH, Heidelberg

Anti-Human, Kollagen 2α1, COL2A1, monoklonal, hergestellt in der Maus Abnova GmbH, Heidelberg

Anti-Human, β-Aktin, monoklonal, hergestellt in der Maus Cell Signaling Technology,Boston,USA

3.2.2.2 Sekundärantikörper

Antikörper Hersteller

Kaninchen Anti-Maus IgG (H+L) Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiert Southern Biotech, Birmingham, UK

Kaninchen Anti-Maus IgG (H+L) (HRP)-konjugiert Cell Signaling Technology, Boston, USA

Maus Anti-Kaninchen IgG (H+L) (HRP)-konjugiert Santa Cruz Biotechnology, Inc. Dallas, USA

Kaninchen Anti-Maus IgG (H+L) Biotin-konjugiert Southern Biotech, Birmingham, UK

3.2.2.3 Kontrollserum

Kontrollserum Hersteller

Kaninchen Normalserum (KNS) Dianova GmbH, Hamburg

3.2.2.4 Marker für SDS-PAGE und Western Blot

Marker Hersteller

PageRuler Pre-stained Protein Ladder Thermo-Fisher Scientific GmbH, Schwerte


27

3.2.3 In der PCR eingesetzte Nukleotide und Enzyme, sowie für die Klonierung und Plasmid-

Präparation verwendete Materialien

3.2.3.1 Nukleotide

Die folgende Übersicht zeigt die im Rahmen der Transkriptanalyse verwendeten Primer (Herstellung durch

die Fa. Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen).

Primer Primersequenzen Primerdesign

Aggrekan: ACAN, NCBI Zugriffsnr: NM_001135.3

Primer Sense 5’-GCA CCA TGC CTT CTG CTT CCG-3’ Dr. Bianca M. Bußmann, Sven Reiche, TRM Universität Leipzig, Leipzig Primer

Antisense 5’-CTG GCT CGG TGG TGA ACT CTA GG-3’

Kollagen Typ I: COL1A1, NCBI Zugriffsnr: NM_000088.3

Primer Sense 5’-CAA TGT GGT TCG TGA CCG TGA CC-5’ Dr. Bianca M. Bußmann, Sven Reiche,

TRM Universität Leipzig, Leipzig Primer Antisense

3’-GCT CTC CCT TAG CAC CAG TGT CTC C-3’

Kollagen Typ II: COL2A1, NCBI Zugriffsnr: NM_001844.4

Primer Sense 5’-CAA CAT GGA GAC TGG CGA GAC TTG-3’ Dr. Bianca M. Bußmann, Sven Reiche,

TRM Universität Leipzig, Leipzig Primer Antisense

5’-GAC AGC AGG CGT AGG AAG GTC ATC-3’

36B4: NCBI Zugriffsnr: NM_001002.3

Primer Sense 5’-TCG CTT CCT GGA GGG TGT CCG C-3’ Dr. Claire Fabian, Fraunhofer IZI,

Leipzig Primer Antisense

5’-CTC CAC AGA CAA GGC CAG GAC TCG-3’

Daneben wurden weitere Nukleotide in der PCR verwendet. Hierzu zählen die dNTPs (dATP, dTTP, dCTP und

dGTP) und Oligo(dT)18 sowie der in der Agarosegelelektrophorese eingesetzte DNA-Marker.

Weitere Nukleotide Hersteller

dNTPs Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Oligo(dT)18 Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

DNA-Marker Hersteller

GeneRuler DNA Ladder Mix 0,5 µg/µl Thermo-Fisher Scientific GmbH, Schwerte

3.2.3.2 Enzyme

Enzym Hersteller

DNase I Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Platinum taq-Polymerase Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt

Superscript III (Reverse Transkriptase) Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt

SybrGreen Express Master-Mix (taq-Polymerase) Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt

Ribolock RNase-Inhibitor Fermentas GmbH, St. Leon-Rot


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3.2.3.3 Materialien für die Klonierung und Plasmid-Präparation

Material Hersteller

Plasmid Miniprep-Kit MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren

TOPO-TA Cloning Kit (pCRII, pCR2.1) Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt

Gene JET PCR Purification Kit Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Bakterien Hersteller

E.coli XL10-Gold

Stratagen, La Jolla, USA Die Herstellung der chemisch kompetenten Bakterien erfolgte durch Claire Fabian, Fraunhofer IZI, Leipzig

3.2.4 Zusammensetzung von Gebrauchslösungen für die Immunzytochemie

Tab. 3: Diaminobenzidin (DAB)-Lösung

Faktor Menge

Diaminobenzidin (DAB) 5 mg

Wasserstoffperoxid 6 µl

Tris-HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,6) ad 10 ml

Tab. 4: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)

Stammlösung (20x)

Faktor Menge

Dinatriumhydrogenphosphat 29,25 g

Kaliumhydrogenphosphat 4,90 g

Natriumchlorid 160,0 g

deionisiertes Wasser ad 1000 ml

Natronlauge ad pH-Wert 7,4

Gebrauchslösung (1x)

Faktor Menge

PBS-Stammlösung 50 ml

deionisiertes Wasser 950 ml

Tab. 5: Proteinblockierungslösung

Faktor Menge

Kaninchen Normalserum (KNS) 5%

Triton X-100 0,3%

PBS ad 100%

Tab. 6: Tris-HCl-Puffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,6)

Faktor Menge

Tris-Base 1,21 g


HCl ad pH 7,6


29

3.2.5 Zusammensetzung von Gebrauchslösungen für die PCR

Tab. 7: Orange G-Ladepuffer (6x)

Faktor Menge

Tris-HCl, 1M, pH 7,6 100 µl

0.5 M EDTA, pH 8.0 1200 µl

Orange G (15%) 100 µl

Glycerol 6000 µl


Tab. 8: Tris, Essigsäure, EDTA (TAE)-Puffer

Stammlösung (50x)

Faktor Menge

Tris 242,4 g

Essigsäure 57,2 ml

0,5 M EDTA, pH 8.0 100 ml



Faktor Menge

TAE-Stammlösung 20 ml

Wasser 980 ml

3.2.6 Zusammensetzung von Gebrauchslösungen für die Proteinanalytik

Tab. 9: Ammoniumpersulfat (APS)-Lösung (10%)

Faktor Menge

Ammoniumpersulfat (APS) 1g


Tab. 10: Blockierungslösung 5%

Faktor Menge

Bovines Serum Albumin (BSA) 12,5 g

TBS-T-Puffer ad 250 ml, zentrifugiert und filtriert

Tab. 11: Bovines Serum Albumin (BSA)-Lösung (5%/10%)

Faktor Menge

Bovines Serum Albumin (BSA) 12,5 g/25,0 g


Tab. 12: Coomassie Blau-Färbelösung

Faktor Menge

Coomassie Blau R250 0,125 g

Essigsäure 50 ml

Methanol 200 ml


Tab. 13: Coomassie-Entfärbelösung

Faktor Menge

Methanol 150 ml

Glycerol 25 ml



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Tab. 14: Natriumdodecylsulfat (SDS)-Lösungen (4%/10%/20%)

Faktor Menge

Natriumdodecylsulfat (SDS) 4 g/10 g /20 g


Tab. 15: Laufpuffer

Stammlösung (10x)

Faktor Menge

Tris 30,3 g

Glycin 140 g



Faktor Menge

Stammlösung 100 ml


SDS-Lösung (10%) 10 ml

Tab. 16: Ponceau S-Färbelösung

Faktor Menge

Ponceau S 1 g

Essigsäure 50 ml


Tab. 17: Probenpuffer (4x)

Stammlösung

Faktor Menge

Tris 1 M, pH 6,8 2,5 ml

SDS 1 g

Glycerol 4 ml

Bromphenolblau 8 mg


Gebrauchslösung (Probenpuffer (4x))

Faktor Menge

Probenpuffer-Stammlösung 450 µl

β-Mercaptoethanol 50 µl

Tab. 18: Sammelgel-Puffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8)

Faktor Menge

Tris 6,06 g


HCl ad pH 6,8

Tab. 19: TBS-T-Puffer

Faktor Menge

TBS-Stammlösung 100 ml

Tween 20 1ml



31

Tab. 20: Transferpuffer

Faktor Menge

Laufpuffer-Stammlösung (10x) 80 ml


Methanol 200 ml

Tab. 21: Trenngel-Puffer (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8)

Faktor Menge

Tris 18,17 g


HCl ad pH 8,8

Tab. 22: Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)

Stammlösung (10x)

Faktor Menge

Natriumchlorid 292,7 g

Tris 4,24 g

Tris-HCl 26 g


HCl ad pH 7,6

Tab. 23: Zusammensetzung des Proteaseinhibitorcocktails

Faktor Konzentration Ziel Protease

4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoridhydrochlorid (AEBSF) 500 µM Serinproteasen

Aprotinin, bovine Lunge, kristallin 150 nM Serinproteasen und Esterasen

E-64 Proteaseinhibitor 1 µM Cysteinproteasen

EDTA, Dinatrium- 0,5 mM Metalloproteasen

Leupeptinhemisulfat 1 µM Cysteinproteasen und Trypsin-like-Proteasen

3.2.7 Verbrauchsmaterialien

Verbrauchsmaterial Hersteller

6, 24-Loch-Zellkulturplatten TPP, Trasadingen, Schweiz

96-Loch-Zellkulturplatten VWR International GmbH, Darmstadt

96-Lochplatte für PCR Cycler Hard Shell, Low profile, white

Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Deckgläschen, rund, 8 mm Karl Hecht GmbH & Co. KG, Sondheim

Filterpapier VWR International GmbH, Darmstadt

Glasflaschen Duran Group GmbH, Wertheim/Main

Glaspetrischalen Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Kühlakku VWR International GmbH, Darmstadt

Kryoröhrchen 2ml TPP, Trasadingen, Schweiz

Objektträger Karl Hecht GmbH & Co. KG, Sondheim

Parafilm Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda Königshofen

Pasteurpipetten Hirschmann GmbH & Co. KG, Eberstadt

Petrischalen (94x16 mm) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Pinzette Aesculap AG, Tuttlingen

Pipettenspitzen, 10-5000 µl Sarstedt AG &Co., Numbrecht

Pipettenspitzen mit Filter, 10-1000 µl Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Pipettenspitzen für Multipette Plus Eppendorf AG, Hamburg


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Verbrauchsmaterial Hersteller

PCR-Gefäße, 0,2 ml Eppendorf AG, Hamburg

Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran Roche, Basel, Schweiz

Reaktionsgefäße 1,5, 2 ml Eppendorf AG, Hamburg

Serologische Pipetten, 12ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Serologische Pipetten (RNase/DNase frei), 12 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Verschlussfolie Microseal C Optical Series Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Zellkulturschalen, rund, 100mm x11mm VWR International GmbH, Darmstadt

Zellkulturschalen, rund, 40mm x11mm TPP, Trasadingen, Schweiz

Zentrifugenröhrchen 15, 50 ml VWR International GmbH, Darmstadt

3.2.8 Geräte

3.2.8.1 Laborgeräte

Gerät Hersteller

Absaugvorrichtung für Zellkulturen schuett biotec GmbH, Göttingen

Analyseprogramm ImageJ Wayne Rasband (gemeinfrei)

Autoklav Systec DX23 Systec Labortechnik GmbH, Wettenberg

Elektrophorese- und Blotting System Mini-Protean Tetra Cell

Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Folienschweißgerät vacufix Petra electric GmbH, Geislingen

Gefrierschrank Forma -86 °C ULT Freezer Thermo-Fisher Scientific GmbH, Schwerte

Gefrierschrank Liebherr Premium Liebherr GmbH, Ochsenhausen

Gelgießstation Mini-Protean Tetra Cell Casting Module Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Gel-/Membrandetektionssystem Kodak Logic 1500 Imaging

Kodak GmbH, Stuttgart

Gelgießsystem PerfectBlue PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen

Gelsystem PerfectBlue PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen

Hämozytometer Karl Hecht GmbH & Co. KG, Sondheim

Invertmikroskop Nikon Eclipse TE2000-S Nikon GmbH, Düsseldorf

Kamera SPOT INSIGHT 3 Shot QE für Mikroskop Axioskop VISITRON SYSTEMS GmbH, Puchheim

Kamera Nikon Digital Sight DS-Qi1Mc für Invertmikroskop Nikon

Nikon GmbH, Düsseldorf

Kühlschrank Bosch cooler Robert Bosch GmbH, Stuttgart

Kohlendioxid-Begasungsbrutschrank Hera Cell (Heraeus) Kendro Laboratorys & Products GmbH, Hanau

Manometer Linde AG, München

Mehrkanalpipette Transferpette 10-100µl Brand GmbH & Co KG, Wertheim

Messzylinder Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. KG, Eberstadt

Mikroskop Axioskop Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena

Mikrowelle MS-196VUW LG Electronics, Ratingen

PCR-Blockcycler T-Professional Biometra GmbH, Göttingen

PCR-Cycler Opticon 2 Bio-Rad Laboratories GmbH, München

PCR-Werkbank captair bio Erlab, Köln

Plattform-Schüttler Duo Max 1030 Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach

Plattenreader Infinite M1000 Tecan, Männedorf, Schweiz

Pipette 1000-5000µl Eppendorf AG, Hamburg


33

Gerät Hersteller

Pipette 100-1000µl Eppendorf AG, Hamburg

Pipette 20-200μl Eppendorf AG, Hamburg

Pipette 2-20μl Eppendorf AG, Hamburg

Pipette 0,1-2μl Gilson International, Limburg-Offheim

Pipette 2-10μl Gilson International, Limburg-Offheim


Pipette 100-1000µl Gilson International, Limburg-Offheim


Pipet-Boy accu-jet pro Brand GmbH &Co KG, Wertheim

Power Supply EV202 PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen

Reinraumwerkbank Hera Safe (Thermo Scientific) Kendro Laboratorys & Products GmbH, Hanau

Schüttler Vortex VV3 VWR International GmbH, Darmstadt

SDS-PAGE Mini Protean Tetra Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Spektralphotometer Nanodrop 1000 PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen

Statistik Programm Sigma Plot Systat Software GmbH, Erkrath

Stepper-Pipette Multipette Plus Eppendorf AG, Hamburg

Steuerungsprogramm SPOT Advanced zur Kamera SPOT INSIGHT 3 Shot QE

SPOT Imaging Solutions, Burroughs, USA

Steuerungsprogramm NIS Elements zur Kamera Nikon Digital Sight DS-Qi1Mc

Nikon GmbH, Düsseldorf

Steuerungsprogramm Molecular Imaging Software zum Gel-/Membrandetektionssystem Kodak Logic Imaging 1500

Kodak GmbH, Stuttgart

Stickstofftank HC 20 tec-lab GmbH, Idstein

Thermomixer Eppendorf AG, Hamburg

Waage ED2025-CN Sartorius AG, Göttingen

Wärmeschrank Binder GmbH, Tuttlingen

Wasserbad P.-D. Industriegesellschaft, Dresden

Zentrifuge Heraeus Biofuge Pico Kendro Laboratory Products, Osterode

Zentrifuge Heraeus Multifuge 3 S-R Kendro Laboratory Products, Osterode

Zentrifuge Mikro 200 R Hettrich Zentrifugen, Tuttlingen

3.2.8.2 Bioreaktor

Für die Kultivierung der Chondrozyten unter Druck wurde ein Bioreaktorsystem der Firma durakult GmbH,

Berlin eingesetzt (Abb. 4). Der Bioreaktor verfügt über eine zylindrische Druckkammer, in die ein

Metallgestell, welches der Halterung der Zellkulturschalen dient, eingesetzt werden kann. Die aus Edelstahl

bestehende Druckkammer mit einer runden Grundfläche von 176 cm2 und einer Höhe von 15 cm schließt

ein Luftvolumen von 0,45 l ein. Sie wird über einen Deckel verschlossen. Den Zustrom von Gas in die

Druckkammer vermittelt ein im Deckel eingelassenes, regelbares Ventil, dem ein Manometer vorgeschaltet

ist. An das Ventil erfolgt der Anschluss eines Druckschlauchs, der den Bioreaktor mit einer Gasflasche mit

dem Spezialgasgemisch verbindet. Ein zweites vorangeschaltetes Manometer an der Gasflasche ermöglicht

eine Regelung des Drucks im Druckschlauch. Der aufgesetzte Deckel wird über zwei den Deckel und den

Zylinder umfassende Metallbacken zusammengehalten, die ihrerseits über einen kontinuierlichen Ring

mittels einer Schraube fixiert werden. Das Ablassen von Gas aus dem Bioreaktor erfolgt über ein zweites


34

fein justierbares Ventil (Abstromventil). Der maximal zulässige Druck des Reaktors beträgt 50 bar, wobei

das Schlauchsystem nicht mit mehr als 40 bar belastet werden sollte.

Abb. 4: Darstellung des Druckreaktors und seiner Komponenten

3.3 Methoden

3.3.1 Zellkultur

3.3.1.1 Auftauen der Chondrozyten

Vor dem Auftauen der Zellen wurden Zellkulturschalen (rund, 40 mm x 11 mm) bzw. die Vertiefungen einer

6-Loch-Zellkulturplatte mit 1 ml CBM+ Medium/cm2 überschichtet und 30 min im Brutschrank inkubiert. Die

kryokonservierten Chondrozyten wurden aus dem flüssigen Stickstoff entnommen und zügig im Wasserbad

bei 37 °C aufgetaut. Anschließend wurden die Zellen in einer Konzentration von 104 Zellen/cm2 in den

vorbereiteten Zellkulturschalen ausgesät. Nach 24 h erfolgte ein Mediumwechsel.

3.3.1.2 Kultivierung der Chondrozyten unter Normaldruck

Die Zellen wurden bei 37°C, 5% Kohlenstoffdioxid (CO2), 90% Luftfeuchtigkeit und atmosphärischem

Luftdruck (1,013 bar) in Zellkulturschalen oder in den Vertiefungen einer 6-Loch-Zellkulturplatte kultiviert.

Die Erneuerung des CBM+ Mediums erfolgte alternierend nach 3 und 4 Tagen.

3.3.1.3 Kultivierung der Chondrozyten unter erhöhtem Druck

Die Zellen wurden in einem speziellen Bioreaktorsystem, welches die Applikation eines kontinuierlichen

hydrostatischen Drucks ermöglicht, kultiviert. In dem verwendeten Bioreaktorsystem wurde der Druck

durch die Kompression einer Gasphase mit entsprechender Weiterübertragung in das die Zellen

umgebende Medium aufgebaut (Kapitel 2.6.2). Die Kultivierung erfolgte bei 37 °C, 5% CO2, 90%

Luftfeuchtigkeit in Zellkulturschalen. Im Vergleich zur Kultivierung der Chondrozyten unter Normaldruck

wurden nur der Parameter Druck verändert, wohingegen die Parameter Temperatur, Luftfeuchtigkeit,


35

Zusammensetzung der Luft und Erneuerungsfrequenz des Mediums gleich blieben. Für den Druckaufbau

wurde ein Spezialgasgemisch verwendet, welches in seiner Zusammensetzung demjenigen der Luft unter

atmosphärischem Luftdruck (1,013 bar) entspricht (Kap. 3.1.4). Der Luftdruck der Atmosphäre (1,013 bar)

wird im Folgenden gerundet (1 bar) angegeben.

Die in Zellkulturschalen ausgesäten Zellen wurden für die Kultivierung unter erhöhtem Druck in das

Metallgestell des Bioreaktors eingesetzt und mit diesem in die Druckkammer des Bioreaktors verbracht.

Nach Verschluss des Reaktors erfolgte der Zustrom des Spezialgasgemisches über einen Zeitraum von

10 min. Die Zellen verblieben für die jeweils gewünschte Zeitdauer im Bioreaktor. Nach Ende der

gewünschten Druckphase wurde das Abstromventil geöffnet und der Druck über einen Zeitraum von

20 min abgelassen bis das Druckniveau des atmosphärischen Luftdrucks erreicht wurde. Anschließend

wurde der Bioreaktor geöffnet und das Metallgestell mit den Zellkulturschalen entnommen.

3.3.1.4 Subkultivierung der Chondrozyten

Das Medium wurde von der Zellkulturschale abgesaugt und die Zellen mit DPBS gewaschen. Der

anschließenden Zugabe des Trypsin-EDTA (1 ml pro 10 cm2) folgte eine Inkubationszeit von 5 min im

Brutschrank bei 37°C. Nachdem die mikroskopische Kontrolle zeigte, dass sich die Zellen abgelöst hatten,

wurde die Reaktion durch die Zugabe von TNS (1ml pro 10 cm2) gestoppt. Die Zellsuspension wurde in ein

Zentrifugenröhrchen überführt und 5 min bei 1050 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das

Zellpellet mit CBM+ Medium suspendiert. Nach der Zellzählung wurde die Zellsuspension mit einer Dichte

von 104 Zellen/cm2 ausgesät.

3.3.1.5 Kryokonservierung der Chondrozyten

Für die Kryokonservierung wurde die Zellsuspension in einer Konzentration von 106 Zellen/ml verwendet. Je

Kryoröhrchen wurden 500 µl Zellsuspension und 500 µl Einfriermedium pipettiert. Die Zellen wurden in

einer Styroporbox auf -80 °C heruntergekühlt. Nach 24 h wurden die Zellen in flüssigen Stickstoff überführt.

3.3.2 Immunzytochemische Untersuchungen

Für die einzelnen Versuchsbedingungen wurden die Chondrozyten in Zellkulturschalen auf Glasplättchen

ausgesät. Zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt wurde das Medium der Zellkulturschale von den Zellen

entfernt und anschließend zweimal mit 1,5 ml PBS gewaschen. Beim zweiten Waschschritt wurde ein Teil

des PBS belassen, um den folgenden Schritt zu erleichtern. Die Glasplättchen wurden einzeln entnommen,

mit 50 µl eiskaltem Methanol-Aceton (1:1) fixiert und anschließend einzeln in je eine Vertiefung einer 24-

Loch-Zellkulturplatte überführt, in welche zuvor 150 µl PBS vorgelegt wurde. Alle folgenden Waschschritte

wurden mit 150 µl der entsprechenden Lösung durchgeführt. Jedes Glasplättchen in der Vertiefung wurde

zweimal mit PBS gewaschen und anschließend mit 80 µl Proteinblockierungslösung für 20 min bei

Raumtemperatur auf einem Schüttler belassen. Das in der Proteinblockierungslösung enthaltene Triton X-

100 macht die Zellwände permeabel und erlaubt dadurch auch den Nachweis intrazellulären Kollagens. Der

jeweilige Primärantikörper (anti-COL1A2, anti-COL2A1) wurde auf die entsprechende Konzentration

verdünnt.

Tab. 24: Verwendete Primärantikörper (anti-COL1A2, anti-COL2A1) und ihre eingesetzten Konzentrationen bei den immunzytochemischen Untersuchungen in vitro

Primärantikörper Verdünnung

Anti-Human, COL1A2, monoclonal, hergestellt in der Maus 1:100 (10 µg/ml)

Anti-Human, COL2A1, monoclonal, hergestellt in der Maus 1:100 (10 µg/ml)


36

Jeweils 50 µl der jeweiligen Antikörperverdünnung wurden nach der Blockierung ohne vorheriges Waschen

auf die Zellen gegeben und diese über Nacht im Kühlschrank bei 4 °C unter Zuhilfenahme einer feuchten

Kammer im Dunkeln inkubiert. Als Negativkontrolle wurde in eine der Vertiefungen PBS und in eine weitere

Kaninchen Normalserum statt des Antikörpers in der gleichen Menge verwendet.

Alle folgenden Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Der jeweilige Primärantikörper wurde

abgesaugt und jede Vertiefung wurde zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde jeweils 50 µl

Biotin-konjugierter Sekundärantikörper pro Vertiefung hinzugefügt.

Tab. 25: Verwendeter Sekundärantikörper und dessen eingesetzten Konzentration bei den immunzytochemischen Untersuchungen in vitro

Sekundärantikörper Verdünnung

Kaninchen Anti-Mouse IgG (H+L) Biotin-konjugiert 1:250 (4 µg/ml)

Nach 30 min Inkubation wurde erneut zweimal mit PBS gewaschen und die Strep-ABC-Lösung für 30 min

inkubiert. Nach Absaugen des Strep-ABC-Komplexes und zweimaligem Waschen mit PBS erfolgte ein

zusätzlicher Waschschritt mit 0,1 M Tris-HCl (pH=7,5). Anschließend wurden die Zellen mit 65 µl DAB-

Lösung überschichtet und 10 min unter mikroskopischer Kontrolle belassen. Nach anschließendem

Waschen mit destilliertem Wasser erfolgte eine Kernfärbung mit Hämatoxylin. Dazu wurde Hämatoxylin-

Lösung nach Gill II für 4 min auf die Zellen gegeben und die Vertiefung anschließend dreimal mit

destilliertem Wasser gewaschen. Eine Teilmenge des destillierten Wassers wurde im letzten Waschschritt

auf den Zellen belassen, um das Entfernen der Glasplättchen aus den Vertiefungen zu erleichtern. Mit Hilfe

einer gebogenen Kanüle und einer Pinzette wurden die Glasplättchen aus den Vertiefungen der 24-Loch-

Zellkulturplatte entnommen, auf Filterpapier kurz getrocknet und anschließend mit Hilfe von Histokit auf

Objektträgern fixiert. Diese wurden vor dem Mikroskopieren zwei Tage zur Aushärtung des Histokit bei

Raumtemperatur belassen.

Die Dokumentation der immunzytochemischen Markierung erfolgte mit dem Steuerungsprogramm SPOT

Advanced für die Kamera SPOT INSIGHT 3 Shot QE. Das System wurde so vorjustiert, dass alle Aufnahmen

einer Vergrößerungsstufe mit der gleichen Lichtintensität und Kontrastierung angefertigt wurden.

3.3.3 RNA- und Proteinisolierung

3.3.3.1 Probengewinnung

Für alle Versuchsbedingungen wurden Chondrozyten in weitere Zellkulturschalen ausgesät, die zu jedem

Zeitpunkt eines Versuchsabbruchs, wie nachfolgend beschrieben behandelt wurden. Das Zellkulturmedium

wurde vollständig abgesaugt. Anschließend wurde 1 ml Trifast Gold in die Zellkulturschale gegeben, 3 min

bei Raumtemperatur belassen und in ein Reaktionsgefäß (1,5 ml) überführt. Die auf diese Weise

entstandenen Proben wurden bis zur Isolierung der RNA und der Proteine bei -80 °C gelagert.

3.3.3.2 Isolierung der RNA

Nach dem Auftauen der Proben wurden diese im Verhältnis 1:5 mit Chloroform versetzt, was bei einem

Probenvolumen der Trifast-Proben von 1 ml einem Volumen von 200 µl Chloroform entspricht. Um eine

ausreichende Durchmischung zu gewährleisten, wurden die Proben 15 s homogenisiert. Darauf folgend

wurden die Proben bei Raumtemperatur 15 min inkubiert und bei 12.000 g bei Raumtemperatur über

15 min zentrifugiert. Anschließend wurde die klare obere Phase, welche die RNA enthielt, in ein neues


37

Reaktionsgefäß (2 ml) überführt. In dieses Reaktionsgefäß wurden 500 µl Isopropanol hinzugefügt und nach

kurzer Inversion 90 min bei 4 °C inkubiert. Die Zentrifugation erfolgte bei 12.000 g und 4 °C über einen

Zeitraum von 30 min, woraufhin der Überstand restlos verworfen wurde. Das entstandene RNA-Pellet

wurde anschließend zweimal mit 75%igem Ethanol gewaschen und jeweils bei 12.000 g, 4 °C für 10 min

zentrifugiert. Das gewaschene RNA-Pellet wurde daraufhin für 10 min bei Raumtemperatur getrocknet und

anschließend in 50 µl DEPC-Wasser bei 55 °C auf dem Thermomixer bei einer Frequenz von 300 rpm gelöst.

Der RNA-Gehalt der Proben wurde spektralphotometrisch gemessen und die RNA-Proben bis zur weiteren

Verarbeitung bei -80 °C gelagert.

3.3.3.2.1 Qualitätskontrolle der RNA mittels Spektralphotometrie

Die spektralphotometrische Messung ermöglicht eine ungefähre Messung der isolierten RNA-Menge. Die

Messung der RNA-Absorption erfolgt bei 260 nm (DESJARDINS und CONKLIN 2010). Durch die Messung der

Absorption bei 260 und 280 nm wird eine Aussage über die Reinheit der Probe durch die Absorptions-

Verhältnisse A260/A280 und A260/A230 möglich. Dabei ergibt sich ein Wert von 2 für das Verhältnis

A260/A280, wenn keine Kontamination durch Proteine oder DNA vorliegt. Ein Wert von 2,0 -2,2 bei dem

Verhältnis A260/A280 zeigt, dass keine Kontamination durch Phenol, Polysacharide oder Salze vorhanden

ist (DESJARDINS und CONKLIN 2010). Bei Verhältnissen deutlich außerhalb dieser Werte kann nicht von

einer exakten spektralphotometrischen Messung des RNA Gehalts der Probe ausgegangen werden. Mit

Hilfe dieser Methode wurden extreme Ausreißer von der weiteren Analyse ausgeschlossen.

3.3.3.2.2 Qualitätskontrolle der RNA mittels Gelelektrophorese

Für jede Probe wurde eine RNA-Gelelektrophorese durchgeführt, um zu überprüfen, ob RNA degradiert

vorlag. Für die Herstellung des hierfür benötigten Agarosegels wurde die Agarose mit dem TAE-Puffer in

einem Erlenmeyerkolben gemischt und in der Mikrowelle bis zum Siedepunkt erwärmt. Nach kurzer

Abkühlung des flüssigen Gels im Erlenmeyerkolben unter fließendem Wasser wurde Ethidiumbromid

zugesetzt, wodurch ein Verdampfen desselben verhindert wurde. Das flüssige Gel wurde in die planar

ausgerichtete Gießstation gegossen und 30 min zur Aushärtung belassen. Die Zusammensetzung der Gele

ist in der nachfolgenden Tabelle aufgezeigt.

Tab. 26: Zusammensetzung der Agarosegele für die RNA-Auftrennung

Komponente 1% iges Gel 3% iges Gel

Agarose 3 g 9 g

TAE-Puffer 300 ml 300 ml

Ethidiumbromid 15 µl 15 µl

Die Auftrennung der aus den Proben gewonnenen RNA erfolgte in einem 1 %igem Gel. Das Gel wurde in

das Gelsystem eingelegt und bis zur Markierung mit TAE Puffer aufgefüllt. Auf beiden Seiten wurde ein

Marker aufgetragen, um später die Größe der RNA bestimmen zu können. Es wurden jeweils 5 µl RNA-

Probe mit 5 µl 6-fach konzentriertem Orange G-Ladepuffer gemischt und in die Vertiefungen des

Agarosegels geladen. Im Anschluss wurde das System verschlossen und eine Spannung von 80 V für 1-1,5 h

angelegt bis der Farbstoff die obere Hälfte des Gels durchlaufen hatte.

Die Detektion der RNA-Proben wurde mit Hilfe des Gel/Membrandetektionssystems Kodak Logic 1500

Imaging durchgeführt. Hierfür wurden die Gele nach dem Lauf aus dem Gelsystem entfernt und auf die


38

UV-Lichtquelle des Systems gelegt. Die Kameraeinstellungen wurden so gewählt, dass die Bilder bei einer

Belichtungszeit von 0,5 s entstanden.

3.3.3.3 Isolierung der Proteine

Die Isolierung der Proteine erfolgte mit TriFast nach Änderung durch die von Chey et al. (2011)

beschriebenen Ethanol-Bromo-Chloropropan-Wasser-Präzipitation. Nach der Abnahme der wässrigen

Phase für die RNA-Isolierung wurden aus der Phenolphase der Proben die Proteine isoliert. Dafür wurden

der Phenolphase 300 µl Ethanol zur Fällung der DNA hinzugefügt und nach kurzer Inversion und Inkubation

von 5 min bei Raumtemperatur bei 2.000 g und 4 °C für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein

neues Reaktionsgefäß übertragen. Es wurde mit 300 µl dieses Überstands weitergearbeitet. Der

verbleibende Phenol-Rest wurde für weitere Isolierungen bei -80 °C gelagert. Zu 300 µl der nun

proteinreichen Phenol-Phase wurden nacheinander 700 µl absoluter Ethanol und 200 µl 1-Bromo-3-

chloropan gegeben, wobei nach jeder Zugabe zur einheitlichen Durchmischung homogenisiert wurde. Zur

Phasentrennung führte die folgende Zugabe von 600 µl DEPC-Wasser. Nach erneutem Homogenisieren

wurde bei Raumtemperatur und 12.000 g 5 min lang zentrifugiert, wodurch sich die proteinreiche

Interphase zwischen unterer Phenolphase und oberer wässriger Phase bildete. Die obere wässrige Phase

wurde vollständig abgenommen und eine Fällung des Proteins durch Zugabe von 700 µl absolutem Ethanol

bewirkt. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei Raumtemperatur und 12.000 g bildete das Protein am Boden

des Reaktionsgefäßes ein Pellet. Die darüber liegende Phenolphase wurde abgenommen, das entstandene

Pellet 10 min bei Raumtemperatur getrocknet und mit 50-100 µl 4%igem SDS mit Proteaseinhibitorcocktail

(1:100) gelöst. Die Proben wurden zum Lösen der Proteine in einem Thermomixer bei 50 °C und 600 rpm

für 5 min erwärmt. Für die weiteren Schritte wurden diese Proben einmalig bei -80 °C eingefroren und bei

weiterer Bearbeitung wieder aufgetaut.

Zur Quantifizierung des Proteingehalts der Proben wurde eine Proteinbestimmung mit Hilfe des

Bicinchoninsäure-Protein-Assay durchgeführt. Mittels einer Mehrkanalpipette wurden jeweils 200 µl der

BCA-Lösung in die Vertiefungen einer 96-Loch-Zellkulturplatte vorgelegt. Anschließend wurden je

Vertiefung 10 µl der zu messenden Proteinprobe zugegeben. Nach Inkubation bei 37 °C im Wärmeschrank

für 30 min erfolgte die Messung der Absorption bei 562 nm im Plattenreader. Die Bestimmung der

Konzentration der Probe erfolgte mit einer Standardkurve eines BSA-Standards in den Konzentrationen 0,

200, 400, 600, 800, 1000 µg/ml in 4%iger SDS-Lösung in 3-Punktbestimmung (Beispiel siehe Tab. 27). Die

Standardkurve sowie die Koeffizienten der Gleichung wurden bei jeder Messung neu bestimmt (Beispiel

siehe Abb. 5). Die Messungen der Standards und Proben erfolgten in Doppelbestimmung.

Die Proteinmessung wurde zunächst für jede der 3 Proben eines Versuchszeitpunkts einzeln durchgeführt.

Anschließend wurde eine gemischte Sammelprobe aus den Proben eines Versuchsansatzes gebildet,

wodurch die für den Western Blot notwendige Proteinkonzentration von 2 µg/µl erreicht wurde. Proben,

die auch bei der zweiten Isolierung aus dem Phenolrest unter Lösung mit 50 µl 4%iger SDS-Lösung diese

Proteinkonzentration nicht enthielten, wurden in der Sammelprobe nicht berücksichtigt.


39

Tab. 27: Beispiel für die Messung der Absorption der BSA-Standards in 4%iger SDS-Lösung

Standards Absorption der Standards A562nm

Konzentration [µg/ml] Proteinmenge in der Reaktion [µg/Reaktion]

Mittelwert der Absorption(A562nm)

Mittelwert der Absorption korrigiert um A562nm (0 µg/ml)

0 0,0 0,1579 -

200 10,0 0,2588 0,1009

400 20,0 0,3427 0,1847

600 30,0 0,4622 0,3043

800 40,0 0,5222 0,3642

1000 50,0 0,5719 0,4140

Abb. 5: Beispiel einer Standardkurve und deren Gleichung für die BSA-Standards in 4%iger SDS-Lösung unter

Nutzung der in Tab. 27 angegebenen Messwerte

3.3.4 Transkriptanalyse

Die Untersuchung der Expression des Kollagen Typ I und II sowie des Aggrekans auf der Ebene der mRNA

erfolgte quantitativ mit Hilfe der Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR).

3.3.4.1 DNase-Verdau

Um eine Behinderung der folgenden Schritte durch Reste von genomischer DNA (gDNA) zu vermeiden,

wurde die Probe zunächst einem DNase-Verdau unterzogen. Hierfür wurde ein Mastermix aus DNase-

Puffer und DNase I im Verhältnis 1:1 in einem Volumen von 2 µl in PCR-Gefäße vorgelegt. Anschließend

wurden je Ansatz 8 µl RNA-Probe hinzugegeben und bei 37 °C für 30 min inkubiert. Daraufhin wurde jeweils

1 µl EDTA hinzugefügt, um ein Selbstschneiden der RNA zu verhindern. Abschließend wurde die DNAse I bei

65 °C für 10 min inaktiviert.

3.3.4.2 Reverse Transkription (RT)

Um eine Amplifizierung mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) zu ermöglichen wurde nach dem DNase-

Verdau die mRNA zuerst in eine cDNA umgeschrieben. Die Verwendung von Oligo(dT)18 als Primer bewirkte,

dass die gesamte in der Probe enthaltene mRNA umgeschrieben wurde. Für die RT wurde ein linearer

Verlauf im Bereich von 100 ng bis 2 µg nachgewiesen (Arbeitsgruppe Alexandra Stolzing, IZI Fraunhofer,

Leipzig). Die RT geschah in zwei Schritten.

y = 93,662x2 + 76,114x + 0,7595 R² = 0,9913

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45

Pro

tein

[µ

g/R

eak

tio

n]

Absorbtion 562 nm

Standardkurve (BSA verdünnt mit 4% SDS)


40

1. Preannealing: Als Primer fungierte Oligo(dT)18, der zusammen mit dNTPs (jeweils 10 mmol, insgesamt 3

µl) zugegeben wurde und bei 65 °C für 5 min verblieb, um anschließend auf 4 °C abzukühlen. In diesem

Schritt erfolgte die Aufschmelzung der Sekundärstruktur der mRNA und beim Abkühlen die Anlagerung des

Primers.

2. RT-Reaktion: Nach Zugabe des Mastermix aus Puffer, RNase-Inhibitor und Reverser Transkriptase (Tab.

28) erfolgte die RT-Reaktion für 60 min bei 50 °C. Anschließend wurde das Enzym bei 75 °C für 15 min

inaktiviert und der Ansatz abschließend auf 4 °C heruntergekühlt.

Tab. 28: Zusammensetzung des Mastermix für die RT-Reaktion

Komponente Konzentration Volumen (1x)

Puffer 5 x 4 µl

DTT 0,1 M 1 µl

Ribolock RNase-Inhibitor 1x 0,5 µl

Superscript III (Reverse Transkriptase)

200 U/µl 0,5 µl

Gesamtvolumen 6 µl

3.3.4.3 Qualitative PCR

Für die qualitative PCR wurde die cDNA aus der RT zunächst 1:10 mit TE-Puffer verdünnt, um eine Inhibition

der taq-Polymerase durch das DTT aus der RT-Reaktion zu verhindern. Anschließend wurden die Primer,

sowie dNTPs, PCR-Puffer, Magnesiumchlorid und die taq-Polymerase zur cDNA in ein PCR-Gefäß gegeben

(Tab. 29). Der Reaktionsansatz wurde mit DEPC-Wasser auf 25 µl Reaktionsvolumen aufgefüllt. Hierbei

wurden Primer für Kollagen Typ I, Kollagen Typ II und Aggrekan und 36B4 verwendet.

Tab. 29: Zusammensetzung der PCR Reaktion im Blockcycler


Primer Sense 10 pmol/µl 0,5 µl

Primer Anti-sense 10 pmol/µl 0,5 µl

dNTPs jeweils 10 mM 0,5 µl

Puffer 10 x 2,5 µl

Magnesiumchlorid 50 mM 1,4 µl

Platinum taq-Polymerase 5 U/µl 0,2 µl

cDNA 1:10 5 µl

DEPC-Wasser 14,4 µl

Reaktionsvolumen 25 µl

Anschließend wurden die PCR-Gefäße in den PCR-Blockcycler überführt, in dem das Programm gemäß

Tab. 30 ablief. Die verwendete taq-Polymerase besitzt eine Transferaseaktivität, die einen einzelnen

Adenosinrest (A) an das 3‘ Ende des PCR-Produkts anhängt. Dieser geht jedoch 2 h nach Ende der PCR

verloren.

Tab. 30: Programm der qualitativen PCR

Schritt Temperatur Zeit Zyklen

Denaturierung 95 °C 30 s 1

Denaturierung Annealing Elongation

94 °C 55 °C 72 °C

10 s 30 s 30 s

35

Abkühlung 4 °C 1


41

3.3.4.4 Quantitative PCR

3.3.4.4.1 Herstellung der Standards

Für die quantitative PCR wurde zunächst für die Zielgene (Aggrekan, Kollagen Typ I, Kollagen Typ II) und das

Referenzgen (36B4) jeweils ein Standard erstellt. Dieser Plasmidstandard ermöglicht den Einsatz einer

seriellen Verdünnungsreihe an Plasmid-DNA (pDNA) mit bekannter Molekülzahl in der quantitativen PCR

(qPCR) mit deren Hilfe eine Standardkurve zur Berechnung der Molekülzahl der Proben erstellt werden

konnte. Für die Erstellung der Plasmidstandards wurde das PCR-Produkt aus der qualitativen PCR

verwendet.

3.3.4.4.1.1 Herstellung der Medien und Nährböden

Zunächst wurden die in den folgenden Schritten benötigten Medien und Nährböden vorbereitet (Tab. 31,

Tab. 32). Für die Herstellung des Luria Broth (LB)-Ampicillin-Mediums (Tab. 31) wurden Trypton,

Hefeextrakt, Natriumchlorid und Natriumhydroxid-Lösung in destilliertem Wasser gelöst und autoklaviert.

Nach der Abkühlung des so entstandenen LB-Mediums auf 55 °C wurde Ampicillin zugegeben und das LB-

Ampicillin-Medium bis zur Verwendung verschlossen bei 4-7 °C aufbewahrt. Bei der Herstellung der LB-

Ampicillin-Nährböden (Tab. 32) wurde dem LB-Medium hiervon abweichend bereits vor dem Autoklavieren

Agar-Agar zugegeben. Im Anschluss an die Zugabe des Ampicillins wurde der noch flüssige LB-Ampicillin-

Nährboden in die Petrischalen gegossen und dieser nach Aushärtung bis zur weiteren Verwendung bei

4-7 °C gelagert. Das im Rahmen der Transformation genutzte S.O.C. Medium ist Teil des TOPO TA Cloning

Kits und wurde nicht selbst hergestellt.

Tab. 31: Zusammensetzung des LB-Ampicillin-Mediums

Faktor Menge

Trypton 10 g

Hefeextrakt 5 g

Natriumchlorid 8 g

1 M Natriumhydroxid-Lösung 1 ml

Deionisiertes Wasser ad 1000 ml

Ampicillin 10 mg/ml 10 ml

Tab. 32: Zusammensetzung der LB-Ampicillin-Nährböden

Faktor Menge

LB-Medium 500 ml

Agar-Agar 7,5 g,

Ampicillin 10 mg/ml 5 ml

3.3.4.4.1.2 Hinzufügen eines Adenosin(A)-Überhangs

Wenn nicht innerhalb von 2 h mit dem PCR-Produkt weitergearbeitet werden konnte, wurde im ersten

Schritt ein Adenosin(A)-Überhang an die DNA synthetisiert. Hierfür wurden 0,5 µl Platinum taq-Polymerase

und 0,5 µl dNTPs frisch zum Reaktionsansatz aus der PCR hinzugegeben. Der Ansatz wurde erneut in den

Blockcycler überführt, 3 min bei 95 °C und 10 min bei 72 °C belassen sowie abschließend auf 4 °C abgekühlt.

Die verwendete taq-Polymerase hängt durch ihre endogene Transferaseaktivität ein einzelnes A an das

3‘ Ende des PCR-Produkts wieder an.


42

3.3.4.4.1.3 cDNA-Aufreinigung

Die cDNA wurde mit dem Gene JET PCR Purification Kit entsprechend der Vorgabe des Herstellers

aufgereinigt. Hierbei erfolgte die Entfernung der Primer, Nukleotide und dNTPs aus der vorangegangenen

PCR über Säulen mit Silicatmembranen. Die negativ geladene DNA bindet durch Zugabe von Ethanol und

chaotropen Salzen an die positiv geladene Silicatmembran, wodurch andere Substanzen ausgewaschen

werden können. Die aufgereinigte cDNA kann im Anschluss mit Wasser wieder von der Säule eluiert

werden.

3.3.4.4.1.4 Klonierung

Ligation 3.3.4.4.1.4.1

Die sich an die cDNA-Aufreinigung anschließende Klonierungsreaktion, in der das PCR-Produkt in einen

Vektor (Plasmid) eingebracht wurde, erfolgte mit dem TOPO TA Cloning Kit für 5 min bei Raumtemperatur

(Tab. 33). Der hierbei verwendete TOPO Vektor liegt mit einem einzelnen Thymidin (T)-Überhang vor, an

den die genutzte Topoisomerase I nach der Spaltung nach 5‘-CCCTT kovalent gebunden bleibt. Die Ligation

des PCR-Produkts mit dem A-Überhang in das Plasmid kann somit am T-Überhang des Vektors von 3‘ nach

5‘ erfolgen.

Tab. 33: Verwendete Komponenten für die Klonierung

Komponente Volumen (1x)

PCR Produkt 2 µl

Salz Lösung 0,5 µl

TOPO Vektor 0,5 µl

Gesamtvolumen 4 µl

Transformation 3.3.4.4.1.4.2

Das durch die Ligation entstandene Plasmid wurde im folgenden Schritt in Bakterien transformiert. Hierfür

wurden zunächst die Nährböden mit LB-Ampicillin-Medium bei 37 °C im Brutschrank vorgewärmt. In einem

Reaktionsgefäß (1,5 ml) wurden 2 µl des Reaktionsansatzes der Ligation zu frisch aufgetauten chemisch

kompetenten E.coli XL10-Gold (50 µl) hinzugegeben und für 30 min auf einem Kühlakku im Kühlschrank

(4 °C) inkubiert. Danach wurde ein Hitzeschock bei 42 °C für 30 s durchgeführt und das Zentrifugenröhrchen

wieder auf den Kühlakku gestellt. Nach der Zugabe von 250 µl S.O.C. Medium wurde das

Zentrifugenröhrchen verschlossen. Auf dem Thermomixer wurden die Bakterien bei 37 °C und 300 rpm für

30 min wachsen gelassen. Im Anschluss wurde der gesamte Ansatz pro Klonierungsreaktion auf einem LB-

Ampicillin-Nährboden ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C im Brutschrank gelagert.

Die über Nacht gewachsenen Kolonien wurden über Kolonie-PCR darauf kontrolliert, ob das PCR-Produkt

eingebaut wurde. Dafür wurde mit dem in Tab. 29 beschriebenen PCR-Ansatz gearbeitet, wobei anstelle

der cDNA die Bakterien als Template verwendet wurden. Die gewachsenen Kolonien wurden mit der

Pipettenspitze aufgenommen und auf frische LB-Ampicillin-Nährböden ausgestrichen. Anschließend wurde

der an der Pipettenspitze befindliche Rest einer jeden Kolonie in ein PCR-Röhrchen mit dem PCR-Ansatz

(Tab. 29) gegeben und das Gemisch trituiert. Die neu ausgestrichenen Nährböden wurden erneut über

Nacht bei 37 °C im Brutschrank gelagert. Die Kolonie-PCR wurde wie in Kapitel 3.3.4.3 beschrieben

durchgeführt. Dabei wurden für den pCR 2.1 TOPO-Vektor, der für Aggrekan verwendet wurde,


43

M13(-20) forward und M13 reverse als Primer genutzt. Für Kollagen I und II sowie das Referenzgen 36B4

wurde der pCR II TOPO-Vektor und die Primer Sp6 und T7 verwendet.

Tab. 34: Für die Kolonie-PCR verwendete Primer und deren Sequenz in Abhängigkeit von der Auswahl des Vektors

Primer für pCR 2.1-TOPO Vektor (verwendet für Aggrekan)

Primer Sense: M13 (-20) forward 5’-GTA AAA CGA CGG CCA G-3’

Primer Antisense: M13 reverse 5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’

Primer für pCR II-TOPO Vektor (verwendet für Kollagen 1/Kollagen 2/36B4)

Primer Sense: Sp6 5’-ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3’

Primer Antisense: T7 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’

Das PCR-Produkt der Kolonie-PCR wurde anschließend auf ein Agarose-Gel aufgetragen. Hierfür wurden

5 µl PCR-Produkt und 2,5 µl Orange G-Ladepuffer (6x) gemischt, in die Vertiefungen des Agarosegels

geladen und elektrophoretisch aufgetrennt. Die PCR-Produkte der Bakterienkolonien, in denen das

PCR-Produkt in den Vektor eingebaut wurde, konnten so durch die Anzahl der Basenpaare identifiziert

werden.

Tab. 35: Länge des Kolonie-PCR Produkts ohne Einbau des PCR-Produkts und bei erfolgreichem Einbau des PCR-Produkts in Basenpaaren (bp)

Ziel-/Referenzgen Länge des Kolonie-PCR-Produkts ohne Einbau des PCR-Produkts

Länge des Kolonie-PCR-Produkts bei erfolgtem Einbau des PCR-Produkts

Aggrekan (ACAN) 202 408 bp (206 bp+202 bp)

Kollagen 1 (COL1A1) 187 419 bp (232 bp+187 bp)

Kollagen 2 (COL2A1) 187 388 bp (201 bp+187 bp)

36B4 187 312 bp (125 bp+187 bp)

Die Bakterienkolonien, in denen der Einbau des PCR-Produkts nachgewiesen wurde, wurden selektiert, in

ein Zentrifugenröhrchen mit 5 ml vorgewärmtem LB-Ampicillin-Medium gegeben und bei 37 °C über Nacht

inkubiert.

3.3.4.4.1.5 Plasmid-Präparation

Die Plasmid-Präparation wurde mit dem Plasmid Mini Prep-Kit entsprechend der Vorgabe des Herstellers

durchgeführt. Die geernteten Bakterien aus dem LB-Ampicillin-Medium, bei denen mittels Kolonie-PCR der

Einbau des PCR-Produkts nachgewiesen wurde, wurden einer alkalischen Lyse mit SDS unterzogen. Um eine

optimale Bindung der Plasmid-DNA (pDNA) an die Silicatmembran zu erreichen, wurde vor dem Aufgeben

auf die Säule ein neutralisierender Salzpuffer zugegeben. Die an die Säule gebundene pDNA wurde

mehrmals mit Ethanol gewaschen und abschließend durch Zugabe von Elutionspuffer von der

Silicatmembran gelöst. Die erhaltene pDNA wurde spektralphotometrisch gemessen. Die Reinheit der

Plasmidprobe wurde durch die Absorptions-Verhältnisse A260/A280 und A260/A230 bestimmt. Dabei sollte

A260/A280 bei 1,8-2,0 liegen und A260/A230 sich im Bereich 2-2,22 bewegen. Aus den Messwerten wurde

die Molekülzahl pro 1 µl errechnet, wobei sich die Anzahl der Basenpaare (bp) aus den Basenpaaren für

Plasmid (3931 bp für pCR 2.1-TOPO Vektor und 3973 bp für pCR II-TOPO Vektor) und PCR-Produkt

folgendermaßen zusammensetzt:

pDNA gemessen___

Anzahl der Basenpaare Molekülzahl = x Avogadro‘ sche Konstante


44

Tab. 36: Bezeichnungen der Plasmidstandards für Aggrekan, Kollagen Typ I, Kollagen Typ II und 36b4 unter Angabe der für die Berechnung der Molekülzahl notwendigen Anzahl der Basenpaare (bp) des Plasmids und des in dieses Plasmid eingebauten PCR-Produkts

Plasmidstandard Anzahl der Basenpaare (Plasmid+PCR-Produkt)

Aggrekan: pCR 2.1-ACAN 4137 bp (3931 bp+206 bp)

Kollagen Typ I: pCR II-COL1A1 4205 bp (3973 bp+232 bp)

Kollagen Typ II: pCR II-COL2A1 4174 bp (3973 bp+201 bp)

36B4: pCR II-36B4 4098 bp (3973 bp+125 bp)

Die Molekühlzahl wurde auf 1x109 Moleküle/µl mit TE-Puffer eingestellt. Anschließend hergestellte 5 µl

Aliquots wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.

3.3.4.5 Quantitative Real Time-PCR

In die Vertiefungen der 96-Lochplatte für PCR wurde ein Mastermix (Tab. 37) mit einer Stepper-Pipette

vorgelegt und die cDNA hinzugegeben. Diese wurde zuvor 1:10 mit TE-Puffer (pH 8,0) verdünnt, um eine

Inhibition der taq-Polymerase durch das DTT aus der RT-Reaktion zu verhindern. Je Probe wurden drei

technische Replikate angefertigt. An Stelle der cDNA wurden TE-Puffer (pH 8,0) und DEPC-Wasser als

Negativkontrolle pipettiert. In drei Vertiefungen der 96-Lochplatte wurde eine serielle Verdünnungsreihe

der pDNA aus der Plasmid-Präparation mit 1x107, 1x106, 1x105 Molekülen/µl eingesetzt (Plasmidstandard).

Hierfür wurden die auf 1x109 Molekülen/µl eingestellten 5 µl Aliquots verwendet und die

Verdünnungsreihe für jeden Ansatz frisch mit TE-Puffer angesetzt. Anschließend wurde die 96-Loch-Platte

mit der dazugehörigen Verschlussfolie dicht verschlossen und in den PCR-Cycler Opticon 2 gestellt. Die

qPCR erfolgte entsprechend des in Tab. 38 angegebenen Programms.

Tab. 37: Berechnung der Zusammensetzung der Komponenten der qPCR


SybrGreen Express Master-Mix 2x 10 µl

Primer Sense 10 pmol/µl 0,5 µl

Primer Anti-sense 10 pmol/µl 0,5 µl

SybrGreen 10x 1 µl

DEPC-Wasser 3 µl

cDNA 1:10 5 µl

Gesamtvolumen 20 µl

Tab. 38: Programm für die qPCR

Schritt Temperatur Zeit Zyklen

Aufheizen 50 °C 2 min 1

Denaturierung 95 °C 5 min 1

Denaturierung Annealing Elongation Fluoreszensmessung

95 °C 60 °C 72 °C

3 min 30 s 30 s 2 s

40

Aufheizen 95 °C 1 min 1

Abkühlen 40 °C 1 min 1

Schmelzkurvenanalyse 60-90 °C 1

Abkühlung 30 °C 1

Während der Elongationszyklen bindet der Farbstoff SYBR-Green I unspezifisch an doppelsträngige DNA

(dsDNA). Der gebundene Farbstoff kann durch Licht einer spezifischen Wellenlänge (λmax = 494 nm, blau)


45

angeregt werden und emittiert dann Licht der Wellenlänge λmax = 521 nm (grün). Dieses Fluoreszenzsignal

wird am Ende jedes Zyklus gemessen. Es ist proportional zur Menge an der dsDNA im jeweiligen Zyklus.

Zur Quantifizierung wird die Kinetik der PCR-Reaktion genutzt, die durch die Messung der Fluoreszenz

deutlich wird. Bei der qPCR zeigt die PCR-Reaktion und somit das Fluoreszenssignal einen sigmoidalen

Kurvenverlauf. Nach einer flachen Anlaufphase erfolgt die Vermehrung der PCR Produkte exponentiell und

flacht später wieder ab. Der Zeitpunkt während der exponentiellen Phase, an dem sich das

Fluoreszenzsignal gerade deutlich vom Hintergrund abhebt, wurde als Schwellenwert definiert. Die zu

diesem Schwellenwert erreichte Anzahl der Zyklen wird als CT-Wert bezeichnet. Der Schwellenwert wurde

für alle Analysen gleich gesetzt.

Um aus den gemessenen CT-Werten eine absolute Molekülzahl zu erhalten, wurde eine serielle

Verdünnungsreihe mit bekannter Molekülzahl an pDNA mitgeführt. Die zu diesen Verdünnungen 1x107,

1x106, 1x105 Molekülen/µl gemessenen CT-Werte dienten zum einen der Quantifizierung und zum anderen

der Kontrolle der PCR-Reaktion auf Inhibition der Reaktion, da die CT-Werte der Verdünnungsreihe in jedem

qPCR-Ansatz identisch sein mussten.

Um die gemessenen CT-Werte zu normalisieren, wurde das Referenzgen 36B4 für jede Probe mitgeführt.

Das verwendete Referenzgen 36B4 wurde für die chondrogene Differenzierung humaner MSC in der

Arbeitsgruppe Dr. Alexandra Stolzing, IZI Fraunhofer, Leipzig etabliert. Die CT-Werte der Zielgene und des

Referenzgens wurden absolut quantifiziert und anschließend in Relation zueinander gesetzt. Die

Datendarstellung der Zielgene erfolgte im Verhältnis zu 105 Molekülen des Referenzgens.

Nach Abschluss der qPCR wurde die 96-Lochplatte aus dem PCR-Cycler entnommen. Die Verschlussfolie

wurde aufgetrennt, um das Gesamtvolumen des PCR-Produkts (25 µl) vermischt mit 5 µl Orange

G-Ladepuffer (6x) auf ein 3 %iges Agarosegel aufzutragen (Kap. 3.3.3.2.2).

3.3.5 Proteinanalyse

Die Untersuchung der Expression des Kollagen Typ I und II sowie des Aggrekans auf der Ebene des Proteins

erfolgte quantitativ mit Hilfe der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und

anschließendem Western Blot. Nach der Quantifizierung des Proteingehalts der Proben mit Hilfe des

Bicinchoninsäure-Protein-Assays wurden die Proben mit 4%iger SDS-Lösung entsprechend so verdünnt,

dass in allen Ansätzen eine Menge von 40 µg Protein in 20 µl Probenvolumen (Konzentration von 2 µg/µl)

vorhanden war.

3.3.5.1 SDS-PAGE

Die SDS-Gele wurden mit Hilfe der Gelgießstation für Mini-Gele Mini-Protean Tetra Cell Casting Module

gefertigt. Hierfür wurden Spacer-Platten mit 1,5 mm Abstandhaltern verwendet, die zusammen mit den

Glasplatten entsprechend der Gebrauchsanweisung des Herstellers in die Station integriert wurden. Das

System wurde vor dem Gießen der Gele mit deionisiertem Wasser auf Dichtigkeit geprüft. Nach dem

Gießen des Trenngels wurde dieses mit 500 µl Isopropanol überschichtet und 30 min auspolymerisiert.

Nach der Polymerisation des Trenngels wurde das Isopropanol entfernt, das Sammelgel gegossen und ein

Kamm (15 Vertiefungen) in dieses eingesetzt. Nach Polymerisation des Sammelgels wurden die fertigen

Gele zwischen den Glasplatten belassen, mit feuchtem Zellstoff und Aluminiumfolie umwickelt und in einer

verschließbaren Plastikfolie bis zur weiteren Verwendung bei 4-7 °C gelagert. Um während der

Gelherstellung eine Kontrolle der Polymerisation mit Hilfe des Gelrests zu ermöglichen, wurden die exakt

benötigten Mengen um eine Zugabe von 5,5 % überschritten.


46

Tab. 39: Zusammensetzung des Sammel- und Trenngels.

Faktor 2 Gele (exakt) 2 Gele inkl. Zugabe 4 Gele inkl. Zugabe

Trenngel (10%)

Deionisiertes Wasser 6,1 ml 6,44 ml 12,89 ml

Trenngelpuffer 3,8 ml 4,01 ml 8,03 ml

Bis-Acrylamide (30%) 5,0 ml 5,28 ml 10,56 ml

SDS (10%) 150 µl 158 µl 317 µl

APS (10%) 75 µl 79 µl 158 µl

TEMED 20 µl 21 µl 42 µl

Sammelgel (4%)

Deionisiertes Wasser 3,05 ml 3,30 ml 6,60 ml

Sammelgelpuffer 1,25 ml 1,35 ml 2,71 ml

Bis-Acrylamide (30%) 0,67 ml 0,73 ml 1,45 ml

SDS (10%) 50 µl 54 µl 108 µl

APS (10%) 50 µl 54 µl 108 µl

TEMED 10 µl 11 µl 22 µl

Die auf eine Proteinkonzentration von 2 µg/µl eingestellten Proteinsammelproben wurden im Verhältnis

1:4 mit Probenpuffer (4x), der den Farbstoff Bromphenolblau enthielt, versetzt. Um eine Beeinflussung des

gemessenen Proteingehaltes durch den Gefriervorgang auszuschließen, wurde dieser direkt vor der Zugabe

des Probenpuffers nochmals gemessen. Die Proben wurden bei 90 °C für 5 min auf dem Thermomixer

erwärmt. Dabei lagert sich das im Probenpuffer (4x) enthaltene SDS an die Proteine an und bewirkt eine

negative Ladung aller Proteine, welche somit nach Anlegen einer Spannung in Richtung der Anode wandern

und dadurch allein entsprechend ihrer Größe aufgetrennt werden. Hierfür wurde das Gel in die

Elektrophoresekammer eingesetzt, die Kammer mit Laufpuffer gefüllt und der Kamm aus dem Sammelgel

entfernt. Die Proben wurden in die durch den Kamm entstandenen Taschen pipettiert. In 2 Taschen des

Gels wurde ein Größenmarker mitgeführt. Die Sammelproben eines identischen Versuchszeitpunkts

wurden jeweils in gleicher Reihenfolge auf 3 Gele pipettiert. Anschließend wurde für 30 min eine Spannung

von 80 V angelegt und sichergestellt, dass alle Proben das Trenngel erreicht hatten, bevor die Spannung auf

100 V erhöht wurde. Der Gellauf wurde nach 1,5-2 h, wenn der Farbstoff das untere Ende des Gels erreicht

hatte, beendet.

3.3.5.2 Western Blot

Für den Transfer der Proteine auf die PVDF-Membran wurden die das Gel umgebenden Glasplatten

entfernt und das Sammelgel abgetrennt. Nach Zuschnitt der PVDF Membran entsprechend der Gelgröße

wurde diese aktiviert, indem sie 15 s in Methanol, anschließend 2 min in deionisiertem Wasser und

anschließend 5 min in Transferpuffer gelagert wurde. Für das Blotting wurde die Transferkassette

entsprechend der Darstellung in Abb. 6 zusammengesetzt. Alle Schwämme und Filter wurden vorher 5 min

in Transferpuffer getränkt. Abschließend wurde geprüft, dass keine Luftblasen zwischen den einzelnen

Lagen, insbesondere zwischen den beiden Filtern vorhanden waren.


47

Abb. 6: Schematischer Aufbau der Zusammensetzung der Transferkassette; adaptiert nach www.explorer.bio-rad.com)

Die Transferkammer wurde mit Transferpuffer gefüllt und in die Transferkassette eingesetzt. Der Transfer

fand bei Raumtemperatur statt. Um ein Erwärmen zu vermeiden, wurde das System mit Hilfe der

systemeigenen Kühlvorrichtung, die mit Eis befüllt wurde, gekühlt. Somit wurde sichergestellt, dass

während des Transfers eine Temperatur von 30 °C nicht überschritten wurde. Der Transfer der Proteine aus

dem Gel auf die Membran fand bei einer Spannung von 100 Volt für 90 min statt. Der Transfer konnte

anhand der Übertragung des Markers auf die Membran überprüft werden. Um den Erfolg des Transfers

zusätzlich zu prüfen, wurde an dem Gel eine Coomassie-Färbung durchgeführt. Hierfür wurde das Gel für 5

min in der Coomassie Blau-Färbelösung inkubiert. Anschließend wurde das Gel über Nacht in der

Commassie-Entfärbelösung entfärbt und fotografiert.

Im Rahmen der Etablierung dieses Verfahrens wurde die PVDF-Membran direkt nach der Entnahme aus der

Kassette einer Färbung mit Ponceau S unterzogen, um den Proteintransfer zu überprüfen. Hierfür wurde

die Membran 10 min in Ponceau S-Färbelösung inkubiert und anschließend 20 Minuten mit destilliertem

Wasser entfärbt. Die angefärbten Banden auf der PVDF-Membran wurden fotografiert und schließlich mit

PBS entfärbt. Da sich während der Etablierung des Verfahrens ein negativer Einfluss dieser Färbung auf die

anschließende Bindung der Antikörper an die PVDF-Membran zeigte, wurde während der

Versuchsdurchführung von dieser Färbung abgesehen.

Nach Entnahme der PVDF-Membran aus der Kassette wurde diese zur Minderung unspezifischer Bindungen

für 90 min mit 5% BSA-Lösung auf einem Schüttler bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurde die

Membran mit jeweils 5 ml des auf die jeweilige Konzentration mit 5% BSA-Lösung verdünnten

Primärantikörpers inkubiert. Neben den für den Nachweis der Expression des Kollagen Typ I und II sowie

des Aggrekan verwendeten Antikörpern wurde ein anti-β-Aktin-Antikörper zum Nachweis des

Referenzproteins β-Aktin eingesetzt. Für die Inkubation der Antikörper wurde die PVDF-Membran in eine

Plastikfolie überführt, die nach Zugabe des Antikörpers verschweißt wurde. Anschließend erfolgte die

Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.

Anschließend wurde die Membran aus der Folie entfernt und auf einem Schüttler drei Mal 10 min mit

TBS-T-Lösung gewaschen. Die Inkubation mit 5 ml des HRP-konjugiertem Sekundärantikörpers erfolgte

ebenfalls unter Zuhilfenahme einer verschweißbaren Plastikfolie bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.

Nach der Inkubation wurde die Membran aus der Plastikfolie entfernt und erneut drei Mal für 10 min mit

TBS-T-Lösung und 1 Mal mit TBS gewaschen. Im Anschluss wurden 3 ml Luminol mehrfach über die

Membran pipettiert. Nach 2 Minuten wurde die Membran für die Detektion zwischen zwei Klarsichtfolien

gelegt.

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Tab. 40: Verwendete Primärantikörper (anti-COL1A2, anti-COL2A1, anti-β-Aktin, anti-Aggrekan), deren eingesetzte Konzentrationen und Inkubationszeiten im Western Blot

Primärantikörper Konzentration Inkubationszeit

Anti-Human, Aggrekan, ACAN, polyclonal, hergestellt im Kaninchen 1: 500 3 h

Anti-Human, Kollagen 1α2, COL1A2, monoclonal, hergestellt in der Maus

1: 1000 1 h

Anti-Human, Kollagen 2α1, COL2A1, monoclonal, hergestellt in der Maus

1: 600 3 h

Anti-Human, β-actin, monoclonal, hergestellt in der Maus 1: 1000 1 h

Tab. 41: Verwendeter Sekundärantikörper, deren eingesetzte Konzentrationen und Inkubationszeiten im Western Blot

Sekundärantikörper Konzentration Inkubationszeit

Rabbit Anti-Maus IgG (H+L), HRP-konjugiert, Southern Biotech 1: 5000 1 h

Mouse Anti-Kaninchen IgG (H+L), HRP-konjugiert, Southern Biotech 1: 1600 1 h

Rabbit Anti-Maus IgG (H+L), HRP-konjugiert, Cell Signaling Technology (für β-Actin)

1: 1600 1 h

3.3.5.3 Detektion

Die Detektion des Western Blot erfolgte mit Hilfe des Gel/Membrandetektionssystem Kodak Logic 1500

Imaging und dem dazu gehörigen Steuerungsprogramm Kodak Molecular Imaging Software Tutorial. Für die

Detektion wurde die von den beiden Klarsichtfolien umgebene Membran in das Detektionssystem eingelegt

und zügig mit der Detektion begonnen. Die Kameraeinstellungen wurden so gewählt, dass 7 Bilder bei einer

Kamerabelichtungszeit von 30 s entstanden. Aus diesen Bildern wurde mit Hilfe des Steuerungsprogramms

Kodak Molecular Imaging Software Tutorial ein Summationsbild errechnet, welches dann mit Hilfe des

Analyseprogramms ImageJ ausgewertet wurde.

3.3.5.4 Stripping der Antikörper und erneute Inkubation

Nach der Detektion wurde die Membran gestrippt. Dabei wurden die Antikörper von der Membran gelöst,

sodass diese noch einmal für die Detektion des β-Aktin-Antikörpers verwendet werden konnte. Hierfür

wurde die Membran zwei mal 7 min in einem Plastikgefäß mit Stripping-Puffer bei Raumtemperatur

inkubiert. Daraufhin wurde die Membran zweimal für jeweils 10 min mit PBS-Lösung gewaschen. Die

Waschschritte wurden unter den gleichen Bedingungen mit TBS-T-Lösung für jeweils 5 min wiederholt.

Nach dieser Behandlung konnte mit der Blockierung begonnen werden und der β-Aktin-Antikörper zum

Nachweis des Referenzproteins inkubiert werden.

Das Vorliegen von Interferenzen mit Resten der Primärantikörper, die bei ineffizientem Stripping verbleiben

können, wurde in einem Vorversuch ausgeschlossen. Zusätzlich wurde darauf geachtet, dass das

Molekulargewicht der zu detektierenden Proteinbanden der beiden Detektionen so weit auseinander lag,

dass die mit Hilfe der zweiten primären Antikörperinkubation detektierten Signale nicht durch eventuell

ausgebrannte Signale der ersten primären Antikörperinkubation verfälscht wurden. In den Vorversuchen

konnte ebenfalls gezeigt werden, dass das genutzte Stripping-Protokoll Interferenzen von Resten der

Primärantikörper der Erstinkubation mit der Detektion des Referenzproteins wirksam verhindert. Die zu

detektierenden Proteinbanden des Aggrekan bei 45 kDa konnten daher trotz der Nähe zum

Referenzprotein β-Aktin (42 kDa) eindeutig identifiziert werden. In einigen Fällen kam es verfahrensbedingt


49

während der Versuche bei Banden im Randbereich der PVDF-Membran zu schwachen bzw. innerhalb einer

Bande inhomogenen Signalen, welche die semiquantitative Analyse beeinträchtigten.

3.3.5.5 Semiquantitative Analyse des Western Blot

In der Auswertung der optimierten Western Blots zeigten sich mehrere Banden, die durch den jeweiligen

Antikörper spezifisch markiert wurden. Für die Evaluierung der Kollagen Typ I Expression wurden die

Banden des Molekulargewichte 38, 50, 120 kDa, für Kollagen Typ II die Banden bei 65 und 70 kDa und für

Aggrekan bei 45 und 65 kDa ausgewertet. Hingegen wurden die für Kollagen Typ I bei 60 und 170 kDa und

für Kollagen Typ II bei 45 kDa detektierten, unspezifischen Banden nicht berücksichtigt. Die Bande für das

Referenzprotein β-Aktin lag bei einem Molekulargewicht von 42 kDa.

Zur semiquantitativen Analyse der Ergebnisse aus dem Western Blot wurden die Bilder in das

Analyseprogramm ImageJ geladen und der Hintergrund entfernt. Die gemessenen Chemolumineszenz-

Intensitäten der mit Hilfe der Antikörper markierten Zielproteine Kollagen Typ I und II sowie Aggrekan

wurden jeweils im Verhältnis zur Intensität des Referenzproteins β-Aktin gesetzt. Die Ergebnisse, welche

kein Lumineszenz-Signal für β-Aktin lieferten, wurden von der Analyse ausgeschlossen.

3.3.6 Graphische Darstellung und statistische Methoden

Die graphische Darstellung der Ergebnisse der qPCR erfolgt durch Abbildung des arithmetischen Mittels (M)

der biologischen Replikate unter Angabe der Standardabweichung. Aufgrund des geringen

Stichprobenumfangs wird jedoch auch der M der technischen Replikate eines jeden biologischen Replikats

als Punktdarstellung gezeigt.

Ein Ergebnis eines technischen Replikats wurde von der weiteren Analyse ausgeschlossen, wenn es

wesentlich von den beiden anderen technischen Replikaten abwich. Als wesentlich wurde entsprechend

eine Abweichung von >1 CT definiert. Sowohl aufgrund dieser Abweichungen als auch durch den Ausfall

einzelner biologischer Replikate in der qPCR erfolgt die graphische Darstellung unter Angabe der Anzahl (n)

der für deren Erstellung genutzten biologischen Replikate, welche auch in der weiteren Analyse verwendet

wurden.

Für die statistische Analyse der Ergebnisse wurde das Statistik-Programm Sigma Plot verwendet. Es wurden

Berechnungen der M der biologischen Replikate sowie der Standardabweichung durchgeführt. In die

statistische Analyse der Ergebnisse unterschiedlicher Bedingungen wurden die Differenz der Mittelwerte,

die Standardabweichung und der Stichprobenumfang (n) einbezogen, um die statistische Power

(Teststärke, P) der Ergebnisse zu ermitteln (t-Test). Die statistische Analyse kleiner Stichproben (n=2, n=3)

ist fehleranfällig. Daher wurden neben der Analyse der Einzelergebnisse zusätzlich ähnliche

Versuchsbedingungen, bei denen sich kaum Unterschiede zeigten, in Gruppen zusammengefasst und mit

Hilfe der größten aufgetretenen Standardabweichung der Ergebnisse die P berechnet. Zusätzlich wurde mit

Hilfe der Standardabweichung der Ergebnisse der Stichprobenumfang eines Versuchs errechnet, der die P

der Ergebnisse erhöht. Hierbei wurde stets die größtmögliche vorhandene Standardabweichung in die

Analyse einbezogen und eine P von 80 % bei einem Alpha-Fehler von 0,05 angestrebt.

In den Fällen, in denen die P mehr als 80 % bei Gruppierung der Ergebnisse erreichte, erfolgte eine

Untersuchung der Unterschiede auf Signifikanz mit einer „One Way Analysis of Variance“ (ANOVA). Sofern

keine Normalverteilung der Ergebnisse vorlag, wurde die Analyse mit der ANOVA on Ranks (Kruskal-Wallis)

bei einem Signifikanzniveau von <0,05 durchgeführt.

4 Ergebnisse

50

4 Ergebnisse

4.1 In-vitro-Kultivierung der Chondrozyten unter Normaldruck

Im ersten Teil der Studie wurde unter Standard-Zellkulturbedingungen bei Normaldruck (Luftdruck der

Atmosphäre, 1,013 bar) der Einfluss der Zellkulturdauer auf die Morphologie in-vitro-kultivierter

Chondrozyten sowie deren Expression von Aggrekan, Kollagen Typ I und II untersucht. Hierfür wurden diese

über einen Zeitraum von 35 Tagen kultiviert und an den Kulturtagen 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 und 35 nach der

Aussaat phasenkontrastmikroskopisch untersucht. An jedem dieser Untersuchungstage erfolgte zudem der

immunzytochemische Nachweis von Kollagen Typ I und II. Des Weiteren wurden an jedem dieser

Zeitpunkte RNA und Protein zur Analyse der Expression von Kollagen Typ I und II sowie Aggrekan isoliert.

4.1.1 Morphologie in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter Normaldruck

Die Chondrozyten stellten sich in vitro am ersten Tag nach der Aussaat als langgestreckte überwiegend

bipolare Zellen dar, die unregelmäßig verteilt adhärent auf dem Boden der Zellkulturschale vorlagen und

nach 6-7 Tagen einen optisch konfluenten Monolayer bildeten (Abb.7 A, Abb. 7 B).

1 T

ag

2 T

age

3 T

age

4 T

age

Abb. 7 A: Humane Chondrozyten in vitro 1, 2, 3 und 4 Tage nach der Aussaat. Phasenkontrastmikroskop, 100 x,

Skalierung: 250 µm.

Mit Zunahme der Zellkonzentration lagerten sich Chondrozyten ab Kulturtag 4 konzentrisch unter Bildung

von Zellwirbeln zusammen oder formten bei paralleler Ausrichtung zwischen diesen Wirbeln verlaufende

Zellstränge. Bis zum Kulturtag 7 zeigten sich die Chondrozyten in den Wirbeln optisch dichter als solche in

4 Ergebnisse

51

den strangartigen Formationen. Bei der weiteren Kultivierung erhöhte sich die Dichte der Zellen

kontinuierlich bis zum Kulturtag 35, wobei die Chondrozyten die langgestreckte Morphologie beibehielten.

Hierbei glich sich optisch die Konzentration der parallel ausgerichteten Zellen an jene der Wirbel an, wobei

beide Anordnungen weiterhin nebeneinander vorlagen. Während des gesamten Kultivierungszeitraums

traten auch wenige, deutlich größere Chondrozyten mit flächigem Zellkörper auf (Abb.7 B).

7 T

age

14

Tag

e

21

Tag

e

35

Tag

e

Abb. 7 B: Humane Chondrozyten in vitro 7, 14, 21 und 35 Tage nach der Aussaat. In Wirbeln angeordnete

Chondrozyten (Stern), in Strängen angeordnete Chondrozyten (Pfeil). Phasenkontrastmikroskop, 100 x, Skalierung:

250 µm.

4.1.2 Immunzytochemischer Nachweis der Expression von Kollagen Typ I und II in-vitro-

kultivierter Chondrozyten unter Normaldruck

Der immunzytochemische Nachweis der Expression von Kollagen Typ I und II erfolgte an den Kulturtagen 4,

7, 14, 21 und 35 (Abb. 8). Zu früheren Zeitpunkten (Kulturtage 1, 2 und 3) geführte immunzytochemische

Nachweise erbrachten keine Resultate, da sich die Zellen während des Verfahrens von den Glasplättchen

ablösten.

Vom Kulturtag 4 bis zum Tag 21 wurde sowohl für Kollagen Typ I als auch für Kollagen Typ II gleichermaßen

eine immuno-positive Reaktion nachgewiesen. Die Markierung war intrazellulär von den zellkernnahen

Bereichen bis in die polymorphen Zellausläufer, somit im gesamten Zytoplasma, sichtbar. Zu keinem

Zeitpunkt war eine Markierung von Kollagen Typ I oder II in extrazellulären Bereichen darstellbar. Zum

Kulturtag 35 nahm die Intensität der Markierung von Kollagen Typ I deutlich ab; Kollagen Typ II war am Tag

35 nicht mehr nachweisbar. Die mitgeführten Negativkontrollen mit KNS und PBS waren jeweils negativ.

4 Ergebnisse

52

Kollagen Typ I Kollagen Typ II Negativkontrolle

4 T

age

7 T

age

14

Tag

e

21

Tag

e

35

Tag

e

Abb. 8: Humane Chondrozyten in vitro. Immunzytochemischer Nachweis von Kollagen Typ I und II nach 4, 7, 14, 21

und 35 Tagen. Die Darstellung zeigt den Nachweis für Kollagen Typ I (links), den Nachweis für Kollagen Typ II (Mitte)

und die Negativkontrolle mit Kaninchen Normalserum (KNS) (rechts). Kollagen Typ I und Kollagen Typ II sind durch das

DAB braun, die Zellkerne durch die Kernfärbung mit Hämatoxylin blau markiert. Lichtmikroskop, 200 x, Skalierung: 100

µm.

4 Ergebnisse

53

4.1.3 Nachweis der Aggrekan-, Kollagen Typ I-, und Kollagen Typ II-mRNA-Expression in-vitro-


Der Nachweis der mRNA-Expression für Kollagen Typ I und II sowie für Aggrekan durch Chondrozyten in

vitro erfolgte mittels qPCR.

Im ersten Schritt wurde die Funktion der eingesetzten Primer durch die Darstellung des in der qualitativen

PCR erhaltenen PCR-Produkts im Agarosegel gezeigt (Abb. 9 A). Das entstandene PCR-Produkt wurde

anschließend kloniert. Dabei wurden die Kolonie-PCR-Produkte der Bakterienklone, die für den Einbau des

PCR-Produkts positiv waren, im Agarosegel anhand ihrer Größe von 419 bp (Kollagen Typ I) und 388 bp

(Kollagen Typ II) und 408 bp (Aggrekan) identifiziert (Abb. 9 B). Hierauf basierend wurden zur Erstellung des

Plasmidstandards für die qPCR die positiven Bakterienklone (K) COL1A1-K7 für Kollagen Typ I, COL2A1-K8

für Kollagen Typ II und ACAN-K6 für Aggrekan ausgewählt.

Abb. 9: Aufnahme der Agarosegele der qualitativen PCR und der Kolonie-PCR. A: Aufnahme der Agarosegele der

qualitativen PCR. Auf das Agarosegel wurde das PCR-Produkt der qualitativen PCR für Kollagen Typ I (COL1A1),

Kollagen Typ II (COL2A1) und Aggrekan (ACAN) aufgetragen um die verwendeten Primer zu verifizieren (+ PCR mit

cDNA, - PCR bei Abwesenheit der cDNA (Negativkontrolle)). B: Aufnahme der Agarosegele der Kolonie-PCR. Die

Bakterienklone COL1A1-K7 und COL1A1-K8 konnten in der Kolonie-PCR durch ihre Größe von 419 bp als positiv für

den Einbau des PCR-Produkts für Kollagen Typ I identifiziert werden. Die Bakterienklone COL2A1-K9 und COL2A1-K10

wurden als positiv für den Einbau des PCR-Produkts für Kollagen Typ II mit 388 bp identifiziert. Der Einbau des PCR-

Produkts für Aggrekan mit 408 bp konnte nur für den Bakterienklon ACAN-K6 nachgewiesen werden, wohingegen die

Bakterienklone ACAN-K7, ACAN-K8, ACAN-K9 deutlich kürzere PCR-Produkte bei 202 bp aufwiesen und somit negativ

für dessen Einbau waren. Es wurde eine Negativkontrolle (NK) ohne PCR-Produkt sowie ein Marker zur Bestimmung

der Größe des PCR-Produkts in Basenpaaren (bp) mitgeführt.

Für jeden qPCR-Lauf erfolgte eine Qualitätskontrolle. Hierfür wurde zum einen die Fluoreszenzintensität

der dsDNA in Abhängigkeit von der Zahl der PCR-Zyklen untersucht (Abb. 10 A). Weiterhin wurde eine

Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, die das Verhältnis der Änderung der Fluoreszenzintensität über die

Temperaturänderung zeigte (Abb. 10 B). Zusätzlich wurde der Standardgraph für den Plasmidstandard

erstellt (Abb. 10 C) und schließlich das erhaltene PCR-Produkt im Agarosegel aufgetragen (Abb. 11).

B

Mar

ker

Mar

ker

AC

AN

+ -

CO

L2A

1

CO

L1A

1

3000

1000

500

200

Mar

ker

Mar

ker

+ - + -

A

bp

3000 1000

500

200

Mar

ker

Mar

ker

Mar

ker

CO

L1A

1

CO

L2A

1

AC

AN

K7 K8 K9 K10 K6 K7 K8 K9 NK + + + + + - - -

bp

4 Ergebnisse

54

Abb. 10: Darstellung der Kontrollen der qPCR (exemplarisch für Kollagen Typ II). A: Fluoreszenzintensität der dsDNA

in Abhängigkeit von der Zahl der PCR-Zyklen. B: Schmelzkurvenanalyse des PCR-Produkts für Kollagen Typ II (COL2A1)

als Verhältnis der Änderung der Fluoreszenzintensität über die Temperaturänderung. Die farbigen Kurven in Abb. 4

A/B zeigen jeweils die serielle Verdünnungsreihe des Plasmidstandards pCR II-COL2A1 mit 5E7

(grün, rot), 5E6

(gelb,

lila), 5E5

(magenta, blau) Molekülen, mit deren Messwerten der Standardgraph entsteht. C: Standardgraph für den

Plasmidstandard (pCR II-COL2A1).

Abb. 11: Aufnahme des Agarosegels, exemplarisch für das PCR-Produkt für Kollagen Typ II. Aufgetragen sind die

Proben (P1, P2, P3) für verschiedene Kultivierungszeiten (4, 7, 14, 21 und 35 Tage) der Chondrozyten in vitro sowie die

serielle Verdünnungsreihe des Plasmidstandards pCR II-COL2A1 mit 5E7, 5E

6, 5E

5 Molekülen (Mol.) und die

Negativkontrollen (NK) mit TE-Puffer und Wasser. Ein Marker wurde zur Bestimmung der Größe des PCR-Produkts in

Basenpaaren (bp) mitgeführt.

Für die Untersuchung der Effekte der Zellkulturdauer auf das Expressionsmuster in-vitro-kultivierter

Chondrozyten auf der Ebene des Transkriptoms wurden die an den Kulturtagen 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 und 35

nach der Aussaat gewonnenen biologischen Replikate mittels qPCR analysiert.

Die relative mRNA-Expression (RE) für Kollagen Typ I (Abb. 12 A, B), zeigte sich an den ersten 3 Tagen nach

der Aussaat der Chondrozyten in vitro im arithmetischen Mittel (M) nahezu konstant (1. Tag: 9,65E3, 2. Tag:

9,31E3, 3. Tag: 9,69E3 Moleküle). Daher wurde das M der RE der ersten 3 Tage als Ausgangswert definiert.

Im Vergleich zu diesem stieg das M der RE nach 4 Tagen auf das 2,9-fache (2,76E4 Moleküle) an. Zum 7. Tag

sank das M der RE auf das 1,5-fache (1,42E4 Moleküle) des Ausgangswerts, blieb bis zum 14. Tag (1,42E4

Temperature

Log.

Flu

ore

sce

nce

B

Cycle

Log.

Flu

ore

sce

nce

A

Log.

Qu

anti

ty

C(T) Cycle

C

Temperature

Mar

ker

4 T

age

7 T

age

14 T

age

21 T

age

35 T

age

Mar

ker

Mar

ker N

K

NK

5E7 M

ol.

5E6 M

ol.

5E5 M

ol. P

1

P 2

P 3

P 1

P 2

P 3

P 1

P 2

P 3

P 1

P 2

1000 1000

500 500

400 400

200 200

bp bp

P 1

P 2

P 3

4 Ergebnisse

55

Moleküle) nahezu konstant, um bis zum 21. Tag auf das 0,8-fache (8,21E3 Moleküle) des Ausgangswerts

abzusinken. Bei längerer Kultivierungszeit stieg das M der RE zum 35. Tag an und erreichte annährend das

2-fache des Ausgangswerts (2,00E4 Moleküle).

Abb. 12: Relative Expression der mRNA von Kollagen Typ I und II in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit durch

Chondrozyten in vitro. A: Darstellung der Ergebnisse der qPCR für Kollagen Typ I und II als Balkendiagramm mit

Mittelwert und Standardabweichung. B, C: Punktdarstellung der arithmetischen Mittel der technischen Replikate

eines jeden biologischen Replikats für Kollagen Typ I (B) und Kollagen Typ II (C). Hierbei ist die Anzahl der biologischen

Replikate (n) angegeben. Die Darstellung der Molekülzahl des Kollagen Typ I und II erfolgt relativ zu 1E5 Molekülen des

Referenzgens 36B4.

0,0E+0

1,0E+4

2,0E+4

3,0E+4

4,0E+4

1 2 3 4 7 14 21 35

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]

Kultivierungszeit [Tage]

Kollagen Typ I

Kollagen Typ II

0,0E+0

1,0E+4

2,0E+4

3,0E+4

4,0E+4

5,0E+4

1(n=2)

2(n=2)

3(n=2)

4(n=3)

7(n=3)

14(n=3)

21(n=3)

35(n=3)

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]


Kollagen Typ I

0,0E+0

5,0E+3

1,0E+4

1,5E+4

2,0E+4

2,5E+4

3,0E+4

1(n=2)

2(n=2)

3(n=2)

4(n=3)

7(n=3)

14(n=3)

21(n=3)

35(n=3)

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]


Kollagen Typ II

A

B

C

4 Ergebnisse

56

Das M der RE des Kollagen Typ II (Abb. 12 A, C) verhielt sich an den ersten 3 Kulturtagen nach der Aussaat

ebenfalls nahezu konstant mit 1,26E3 am 1. Tag, 1,43E3 am 2. Tag und 1,13E3 Molekülen am 3. Tag, sodass

auch hier das M über die ersten 3 Tage als Ausgangswert diente. Am 4. Tag zeigte sich ein Anstieg auf das

14,2-fache (1,81E3 Moleküle) des M der RE des Ausgangswerts. Am 7. Tag fiel das M der RE auf das 8-fache

(1,07E4 Moleküle) des Ausgangswerts ab. Anschließend blieb das M der RE des Kollagen Typ II bis zum 21.

Tag konstant und stieg bei längerer Kultivierungszeit bis zum 35. Tag auf das 13,8-fache (1,76E4 Moleküle)

des Ausgangswerts an.

Das M der RE des Aggrekan (Abb. 13) erreichte an den ersten 3 Tagen nach der Aussaat Werte von 7,59E0

Molekülen am 1. Tag, 2,62E0 Molekülen am 2. Tag und 6,32E0 Molekülen am 3. Tag. Daher wurde auch hier

das M über die ersten 3 Tage als Ausgangswert definiert. Am 4. Tag stieg das M der RE des Aggrekan auf

das 7,1-fache (4,49E1 Moleküle) des Ausgangswerts, lag am 7. Tag um das 5,3-fache höher (3,34E1

Moleküle) als dieser und blieb bei längerer Kultivierungszeit bis zum Tag 35 annähernd stabil.

Abb. 13: Relative Expression der mRNA von Aggrekan in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit durch Chondrozyten

in vitro. A: Darstellung der Ergebnisse der qPCR für Aggrekan als Balkendiagramm mit Mittelwert und

Standardabweichung. B: Punktdarstellung der arithmetischen Mittel der technischen Replikate eines jeden

biologischen Replikats für Aggrekan. Hierbei ist die Anzahl der biologischen Replikate (n) angegeben. Die Darstellung

der Molekülzahl des Aggrekan erfolgt relativ zu 1E5 Molekülen des Referenzgens 36B4.

In der statistischen Analyse der mRNA-Expression der Chondrozyten in Bezug auf Kollagen Typ I, II und

Aggrekan in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit wurden die ersten 3 Kulturtage aufgrund der

0,0E+0

1,0E+1

2,0E+1

3,0E+1

4,0E+1

5,0E+1

6,0E+1

1 2 3 4 7 14 21 35

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]


Aggrekan

0,0E+0

1,0E+1

2,0E+1

3,0E+1

4,0E+1

5,0E+1

6,0E+1

7,0E+1

1(n=2)

2(n=2)

3(n=2)

4(n=3)

7(n=3)

14(n=3)

21(n=3)

35(n=3)

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]


Aggrekan

A

B

4 Ergebnisse

57

konstanten Expressionen als Gruppe definiert. Hierdurch wurde statistisch der Stichprobenumfang (n)

erhöht. Die Differenz der Mittelwerte der RE des Kollagen Typ I und Typ II dieser Gruppe zu der RE des

7. Kulturtags wird bei der vorliegenden Standardabweichung der Ergebnisse bei n=2 erkannt, sodass durch

die Gruppierung der Ergebnisse (Tag 1-3 n=6, Tag 7 n=3) der Stichprobenumfang ausreicht, um diesen

Unterschied zu erkennen (Power (P) der Ergebnisse 80 %). Die Differenz der Mittelwerte der RE des

Aggrekan ist niedriger, sodass eine Erhöhung des Stichprobenumfangs auf n=9 notwendig wäre, um eine P

der Ergebnisse von 80 % zu erreichen. In einer weiteren Analyse wurden neben der RE der ersten

3 Kulturtage zusätzlich die RE der Kulturtage 4, 7, 14, 21 und 35 zu einer Gruppe zusammengefasst. Hierbei

lässt sich trotz der auftretenden hohen Standardabweichung die Aussage treffen, dass die Expression von

Kollagen Typ II und von Aggrekan auf Transkriptomebene bei längerer Kultivierung (4-35 Tage) höher liegt

als bei kurzer Kultivierungsdauer (1-3 Tage) (P von 97 %). Für Kollagen Typ I ist die Differenz der

Mittelwerte der Gruppen (1-3 Tage und 4- 35Tage) geringer bei gleichzeitig höherer Variabilität der

biologischen Replikate, sodass sich diese Aussage für Kollagen Typ I nicht treffen lässt.

Unter Berücksichtigung der vorangegangenen statistischen Analysen erfolgte eine Untersuchung der

Unterschiede zwischen diesen zusammengefassten Gruppen auf Signifikanz (ANOVA on ranks), d.h.

zwischen den ersten 3 Kulturtage und dem 7. Kulturtag, sowie zwischen der kurzen Kultivierungszeit (1-3

Tage) und der langen Kultivierungszeit (4-35 Tage). Dabei zeigte sich die Expression von Kollagen Typ I und

II sowie von Aggrekan am 7. Kulturtag signifikant (Signifkanzniveau <0,05) höher als an den Kulturtagen 1-3

und bei langer Kultivierungszeit signifikant höher als bei kurzer Kultivierungszeit (Signifkanzniveau <0,05).



Der Nachweis der Proteinexpression des Kollagen Typ I und II sowie des Aggrekan durch Chondrozyten in

vitro erfolgte mittels Western Blot.

In Vorversuchen wurde dieses Verfahren für die dabei genutzten spezifischen Antikörper zunächst

optimiert. Hierbei zeigte sich für jedes der Zielproteine nicht nur eine spezifische Bande, sodass für

Kollagen Typ I die Banden bei einem Molekulargewicht von 38, 50, 120 kDa, für Kollagen Typ II bei 65 und

70 kDa sowie für Aggrekan bei 45 und 65 kDa (Abb. 14 A) ausgewertet wurden.

Das Lumineszenz-Signal dieser festgelegten Banden wurde zur Quantifizierung der Lumineszenz-Intensität

(LI) ins Verhältnis zu der des Referenzproteins β-Aktin (Abb. 14 B) gesetzt und somit die Ergebnisse als

relative Lumineszenz-Intensität (RLI) angegeben. Da sich für den ersten Kulturtag nach der Aussaat kein

Lumineszenz-Signal für β-Aktin detektieren ließ, erfolgte die Quantifizierung der Proteinexpression erst ab

dem 2. Tag.

Die Untersuchung der Effekte der Zellkulturdauer auf die Proteinexpression von Kollagen Typ I und II sowie

Aggrekan durch in-vitro-kultivierte Chondrozyten erfolgte mit Hilfe der an den Kulturtagen 1, 2, 3, 4, 7, 14,

21 und 35 nach der Aussaat gewonnenen Proteinproben.

Dabei zeigte sich am 2. Kulturtag für Kollagen Typ I (Abb. 15 A) bei der Betrachtung der 38 kDa-Bande ein

RLI-Wert von 1,00. Dieser stieg zum 3. Tag leicht an (1,31) und fiel am 4. Tag auf 0,39 ab, um anschließend

bis zum 35. Tag, mit Ausnahme des 21. Tags, an dem die RLI niedriger war als am vorherigen

Untersuchungstag 14, wieder bis zu einer RLI von 1,02 anzusteigen. Die 50 kDa-Bande wies am 2. Tag einen

RLI-Wert von 2,37 auf, welcher am 3. Tag auf 2,14 und am 4. Tag auf 1,07 abfiel. Im Anschluss stieg die RLI

bis zum 35. Tag auf 2,03 an, wobei ebenso wie bei der 38 kDa-Bande am 21. Tag die RLI niedriger lag als am

4 Ergebnisse

58

vorgehenden Untersuchungstag 14. Die 120 kDa-Bande erreichte am 2. Tag eine RLI von 3,05, welche am 3.

Tag auf 2,03, am 4. Tag auf 1,25 und am 7. Tag auf 0,55 abfiel. Der anschließende Anstieg der RLI erreichte

bis zum 35. Tag einen Wert von 1,75, wobei die RLI des 21. Tags ebenfalls hinter der des 14. Tags

zurückblieb.

Abb. 14: Aufnahme der Western Blot-Detektionen exemplarisch für das Zielprotein Aggrekan. A: Auf der PVDF-

Membran wurde Aggrekan unter Nutzung des Anti-ACAN Antikörpers bei 45 und 65 kDa spezifisch markiert.

Aufgetragen sind die Proben verschiedener Kultivierungszeiten (2, 3, 4, 7, 14, 21 und 35 Tage) der Chondrozyten in

vitro. Ein Marker wurde zur Bestimmung der Größe des Proteins in kDa mitgeführt. B: Aufnahme der Western

Blot-Detektion des Referenzproteins. Die gleiche PVDF-Membran wie in Abb. 8 A, bei der das Referenzprotein β-Aktin

im Anschluss an das Stripping des Anti-ACAN-Antikörpers spezifisch markiert wurde.

Für Kollagen Typ II (Abb. 15 B) wies die RLI der detektierten Bande bei 65 kDa am 2. Tag einen Wert von

1,77 auf, welcher am 3. Tag auf 0,58 abfiel und am 4. Tag auf 1,23 anstieg. Bis zum 7. Tag sank die RLI auf

1,10 ab, stieg bis zum 14. Tag auf 2,19 an, um nach einem Abfall am 21. Tag auf 1,43 am 35. Tag wieder das

Niveau der RLI des 2. Tags bei 1,82 zu erreichen. Die RLI der für Kollagen Typ II bei 70 kDa detektierten

Bande lag am 2. Tag bei 2,18, am 3. Tag bei 2,39 und am 4. Tag bei 2,53. Am 7. Tag kam es nach einem

Abfall des RLI-Werts auf 1,38 zu einem Wiederanstieg auf RLI-Werte von 1,84 am 14. Tag, 1,61 am 21. Tag

und 1,76 am 35. Tag.

Die RLI der für Aggrekan bei 65 kDa detektierten Bande (Abb. 15 C) wies mit Werten von 0,52 am 2. Tag,

0,41 am 4. Tag und 0,35 am 7. Tag ähnliche Werte auf. An den Tagen 14 und 21 zeigte die RLI höhere Werte

von 0,67 und 0,58. Hiervon abweichend ließen sich bei den Zeitpunkten 3 und 35 Tage höhere RLI

errechnen, wobei die LI für β-Aktin in diesen Fällen sehr schwach ausgeprägt war. Für die 45 kDa-Bande des

Aggrekan lag am 2. Tag ein RLI-Wert von 0,50 vor, welcher am 3. Tag auf 0,13 abfiel, um am 4. (0,27), 7.

(0,29) und 14. Tag (0,29) stabile Werte zu erreichen. Zum 21. Tag fiel die RLI auf 0,22 ab, um zum 35. Tag

auf 0,50 anzusteigen. Auch für die 45 kDa-Bande des Aggrekan muss das schwache Referenzsignal für β-

Aktin an den Tagen 3 und 35 beachtet werden.

3 T

age

Mar

ker

21

Tag

e

35

Tag

e

4 T

age

7 T

age

14

Tag

e

170

70

40

55

35

2 T

age

130

100

kDa

3 T

age

Mar

ker

21

Tag

e

35

Tag

e

4 T

age

7 T

age

14

Tag

e

170

70

40

55

35

2 T

age

130

100

kDa

A B

4 Ergebnisse

59

Abb. 15: Proteinexpression von Kollagen Typ I und II sowie Aggrekan in-vitro-kultivierter Chondrozyten in

Abhängigkeit von der Kultivierungszeit. A: Darstellung der relativen Lumineszenz-Intensität (RLI) der für

Kollagen Typ I im Western Blot detektierten Banden bei 38, 50, 120 kDa. B: Darstellung der RLI der für Kollagen Typ II

detektierten Banden bei 65 und 70 kDa. C: Darstellung der RLI der für Aggrekan detektierten Banden bei 45 und 65

kDa. Die Darstellung der RLI des Kollagen Typ I und II, sowie des Aggrekan erfolgt relativ zur LI des

Referenzproteins β-Aktin.

4.2 In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten unter erhöhtem Druck

Der Einfluss erhöhten hydrostatischen Drucks auf die Morphologie in-vitro-kultivierter Chondrozyten sowie

deren Expression von Aggrekan, Kollagen Typ I und II wurde durch die Kultivierung in einem Bioreaktor

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

2 3 4 7 14 21 35

rela

tive

Lu

min

esz

en

z-

Inte

nsi

tät


Kollagen Typ I

Bande bei 38 kDa

Bande bei 50 kDa

Bande bei 120 kDa

A

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

2 3 4 7 14 21 35

rela

tive

Lu

min

esz

en

z-

Inte

nsi

tät


Kollagen Typ II

Bande bei 65 kDa

Bande bei 70 kDa

B

0

0,5

1

1,5

2

2 3 4 7 14 21 35

rela

tive

Lu

min

esz

en

z-

Inte

nsi

tät


Aggrekan

Bande bei 45 kDa

Bande bei 65 kDa

C

4 Ergebnisse

60

untersucht. Hierbei wurde der Druck durch den langsamen Zustrom eines Spezialgasgemischs über einen

Zeitraum von 10 Minuten aufgebaut und der erhöhte kontinuierliche hydrostatische Druck am Ende der

Druckphase über ein Ventil über 20 Minuten wieder abgebaut.

Um die Häufigkeit des Druckauf- und abbaus, welcher für den Mediumwechsel notwendig war, im

Versuchsablauf so gering wie möglich zu halten, wurde im Rahmen einer Voruntersuchung der Einfluss der

Frequenz des Mediumwechsels auf die Vitalität der Chondrozyten getestet.

Ein immunzytochemischer Nachweis des Kollagen Typ I und II konnte an den unter modifizierten

Druckbedingungen kultivierten Chondrozyten nicht geführt werden, da diese sich während des Verfahrens

der Immunzytochemie vom Glasplättchen ablösten.

4.2.1 Einfluss der Frequenz des Mediumwechsels auf die Vitalität in-vitro-kultivierter

Chondrozyten

Für die Untersuchung der Vitalität der Chondrozyten wurden diese bei einem Mediumwechsel-Intervall von

2–7 Tagen über einen Zeitraum von 3 Wochen kultiviert. In allen Versuchsansätzen zeigten die

Chondrozyten während des Untersuchungszeitraums keine morphologischen Unterschiede. Nach

3 Wochen wurden die Zellen trypsiniert und einer Vitalitätsfärbung mit Trypanblau unterzogen. Dabei

zeigte sich eine annährend konstante Anzahl der Zellen bis zu einem Intervall des Mediumwechsels von 4

Tagen (Abb. 16 A). Bei einer weiteren Zunahme der Zeit zwischen den Wechseln des Mediums war die

Anzahl der Chondrozyten geringer. Ein Farbumschlag des Mediums war bei einem Mediumwechsel-Intervall

von 7 Tagen zu beobachten.

Der Anteil der toten Zellen an der Gesamtzellzahl blieb bei einem Intervall des Mediumwechsel von 2-4

Tagen konstant, nahm bei 5 Tagen um 2,6 %, und bei 6-7 Tagen um weitere 4-4,5% zu (Abb. 16 B).

Diesen Untersuchungen entsprechend wurde in dieser Arbeit das Medium der Chondrozyten nach 3-4

Tagen gewechselt, da bei diesem Intervall sowohl die Anzahl der Chondrozyten als auch der Anteil toter

Chondrozyten an der Gesamtzellzahl konstant blieb.

Abb. 16: Einfluss der Frequenz des Mediumwechsels auf die Vitalität der Chondrozyten in vitro. Die Chondrozyten

wurden über einen Zeitraum von 3 Wochen kultiviert, wobei das Intervall des Mediumwechsels (2, 3, 4, 5, 6, 7 Tage)

variiert wurde. A: Gesamtzellzahl der Chondrozyten in Abhängigkeit vom Intervall des Mediumwechsels am Ende des

Versuchszeitraums. B: Anteil toter Chondrozyten an der Gesamtzellzahl. Abgebildet ist der Mittelwert der biologischen

Replikate unter Angabe der Standardabweichung.

0

10

20

30

40

50

60

2 3 4 5 6 7

An

zah

l de

r C

ho

nd

rozy

ten

[E

4 Z

elle

n/

ml]

Intervall des Mediumwechsels [Tage]

0%

4%

8%

12%

16%

20%

2 3 4 5 6 7

An

teil

tote

r C

ho

nd

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ten

an

de

r G

esa

mtz

ellz

ahl [

%]

Intervall des Mediumwechsels [Tage]

A B

4 Ergebnisse

61

4.2.2 Versuchsaufbau für die Untersuchung in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem

Druck

Für die Untersuchung des erhöhten Drucks auf die Morphologie in-vitro-kultivierter Chondrozyten sowie

deren Expression von Aggrekan, Kollagen Typ I und II wurden der Zeitpunkt der Einwirkung des Drucks,

dessen Höhe sowie die Dauer der Druckeinwirkung als Parameter variiert. Zusätzlich wurde der Einfluss der

Zelldichte der Chondrozyten auf diese Parameter unter erhöhtem Druck untersucht. Die sich daraus

ergebenden Versuchsansätze sind in Abb. 17, Abb. 18 und Abb. 19 dargestellt.

Für die Untersuchung der Vorkultivierungszeit unter Normaldruck wurden die Chondrozyten direkt nach

der Aussaat (Abb. 17 A und D), nach 1 Tag bei erfolgter Adhärenz (Abb. 17 B und E) und bei Erreichen der

optischen Konfluenz nach 6 Tagen (Abb. 17 C und F) für die Dauer von 24 h in den Bioreaktor überführt. In

diesem wurden die Chondrozyten für 24 h bei einem Druck von 5 bar (Abb. 17 A-D) und 10 bar (Abb. 17 E-F)

kultiviert, um die Effekte der Höhe des hydrostatischen Drucks zu untersuchen.

Abb. 17: Schema des Versuchsaufbaus zur Untersuchung der Vorkultivierungszeit unter Normaldruck und der

Effekte der Höhe des hydrostatischen Drucks auf in-vitro-kultivierte Chondrozyten. Die Darstellung zeigt die hierbei

untersuchten Druckbedingungen A-F. Die in den Versuchen eingesetzten Chondrozyten wurden zunächst unter

Normaldruck (1 bar) 0, 1 oder 6 Tage (d) vorkultiviert. Anschließend wurden die Chondrozyten für 24 h im Bioreaktor

kultiviert, in welchem ein hydrostatischer Druck von 5 bar (schmaler Balken) (A-D) bzw. 10 bar (breiter Balken)(E-F) für

24 Stunden (h) wirkte.

Bei der Betrachtung der Morphologie in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck (Kap. 4.2.3)

zeigte sich bei einer Druckeinwirkung von 5 bar für 24 h bereits in einigen Zellkulturen eine Abrundung und

ein Ablösen der Zellen vom Boden der Zellkulturschale im Verlauf der Druckbehandlung. Solche Kulturen

lieferten keine auswertbaren Resultate in der qPCR. Vor dem Hintergrund, ein stabiles Zellkultursystem zu

entwickeln, mit welchem auswertbare Ergebnisse generiert werden können, wurden die Druckbedingungen

bei 10 bar im folgenden Versuch variiert und der Einfluss der Dauer der Druckphase an bei Normaldruck bis

zur optischen Konfluenz vorkultivierten Chondrozyten bei einem Druck von 10 bar für 1,5 h, 3 h, 6 h, 12 h,

24 h, 48 h und mehr als 72 h untersucht (Abb. 18 G-M).

4 Ergebnisse

62

Abb. 18: Schema des Versuchsaufbaus zur Untersuchung der Effekte der Dauer der hydrostatischen Druckphase auf

die Morphologie in-vitro-kultivierter Chondrozyten. Die Darstellung zeigt die hierbei untersuchten Druckbedingungen

G-M. Die bis zur Konfluenz unter Normaldruck vorkultivierten Chondrozyten wurden für 1,5 h (G), 3 h (H), 6 h (I), 12 h

(J), 24 h (K), 48 h (L) und mehr als 72 h (M) bei einem hydrostatischen Druck von 10 bar im Bioreaktor kultiviert.

Schließlich wurde der Einfluss der Zelldichte der Chondrozyten auf deren Morphologie und Expression

unter hydrostatischem Druck untersucht. Hierfür wurden analog zu den Versuchsansätzen Abb. 18 H und I

neben den in normaler Zelldichte (104 Zellen/cm2) ausgesäten Chondrozyten zusätzlich in doppelter

Zelldichte ausgesäte Chondrozyten bei einem Druck von 10 bar und einer Druckphase von 3 h und 6 h im

Bioreaktor kultiviert (Abb. 19 H, I, N, O).

Abb. 19: Schema des Versuchsaufbaus zur Untersuchung der Effekte der Zelldichte der Chondrozyten auf deren

mRNA-Expression bei der Einwirkung eines erhöhten hydrostatischen Drucks. Die Bezeichnung der jeweiligen

Kultivierungsbedingungen entspricht der in Abb. 18. Die in den Versuchen eingesetzten Chondrozyten wurden in

normaler (H, I) und doppelter Zelldichte (N, O) ausgesät und zunächst unter Normaldruck (1 bar) 6 Tage (d)

vorkultiviert. Anschließend wurden die Chondrozyten für 3 h (H, N) und 6 h (I, O) im Bioreaktor kultiviert, in welchem

ein hydrostatischer Druck von 10 bar wirkte.

Für jeden Versuchsansatz (Abb. 17 A-F, Abb. 18 G-M, Abb. 19 H, I, N, O) wurde jeweils eine Kontrollgruppe

von Chondrozyten mitgeführt, die abgesehen von der Druckeinwirkung identisch behandelt wurde.

4 Ergebnisse

63

4.2.3 Morphologie in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck

Die Chondrozyten wiesen bei hydrostatischer Druckeinwirkung von 5 bar für die Dauer von 24 h je nach

Dauer der Vorkultivierungszeit morphologische Unterschiede auf. Unter dem Einfluss des direkt nach der

Aussaat wirkenden Drucks (Abb. 17 A) zeigten die Chondrozyten keine Adhärenz zum Boden der

Kulturschale. Es fielen sowohl unregelmäßig begrenzte Chondrozyten, denen die bipolare Zellmorphologie

fehlte, auf, als auch solche Zellen mit größerem, flächigen Zellkörper. Bei diesen wurden zum einen eine

Verdichtung des Chromatins (Karyopyknosis) und zum anderen dessen Zerfall (Karyorrhexis) beobachtet

(Abb. 20).

0 Tage vorkultiviert 1 Tag vorkultiviert 6 Tage vorkultiviert

Ko

ntr

olle

(N

orm

ald

ruck

,1b

ar)

Dru

ck: 5

bar

Dru

ck: 1

0 b

ar

Abb. 20: Untersuchung der Vorkultivierungszeit unter Normaldruck und der Effekte der Höhe des hydrostatischen

Drucks auf die Morphologie in-vitro-kultivierter Chondrozyten. Abgerundete Morphologie der Chondrozyten (Pfeile),

Chondrozyten mit wenigen Kontakten zu Nachbarzellen (Pfeilköpfe). Phasenkontrastmikroskop, 200 x, Skalierung:

250 µm. Die in den Versuchen eingesetzten Chondrozyten wurden zunächst unter Normaldruck (1 bar) 0, 1 oder 6

Tage vorkultiviert. Anschließend wurden die Chondrozyten für 24 h im Bioreaktor kultiviert, in welchem ein

hydrostatischer Druck von 5 bar bzw. 10 bar für 24 Stunden (h) wirkte. Zum Vergleich sind zusätzlich die Kontrollen

(Normaldruck, 1 bar) dargestellt.

4 Ergebnisse

64

Solche Chondrozyten, die nach ihrer Adhärenz (Abb. 17 B) eine Druckeinwirkung von 5 bar für 24 h

erfuhren, stellten sich als langgestreckte, bipolare Zellen dar, die von solchen, denen die Druckeinwirkung

fehlte, morphologisch kaum zu unterscheiden waren. Sie zeigten lediglich weniger Zellausläufer zu

Nachbarzellen. In einigen Bereichen der Zellkulturschalen zeigten die Chondrozyten eine abgerundete

Morphologie, wobei sich diese abgerundeten Zellen vom Boden der Kulturschale ablösten (Abb. 20). Eine

ähnlich schnelle Zunahme der Zelldichte der Chondrozyten wie bei solchen, die unter Normaldruck

kultiviert wurden, wurde bei den unter erhöhtem Druck kultivierten Chondrozyten nicht beobachtet.

1,5

Stu

nd

en

3 S

tun

den

6 S

tun

den

12

Stu

nd

en

24

Stu

nd

en

48

Stu

nd

en

Abb. 21: Untersuchung der Wirkung erhöhten Drucks auf die Morphologie in-vitro-kultivierter Chondrozyten.

Phasenkontrastmikroskop, 200 x, Skalierung: 250 µm.

Die in den Versuchen eingesetzten Chondrozyten wurden zunächst unter Normaldruck (1 bar) 6 Tage vorkultiviert.

Anschließend wurden die Chondrozyten für 1,5 h, 3h, 6 h, 12 h, 24 h und 48 Stunden im Bioreaktor kultiviert, in

welchem ein hydrostatischer Druck von 10 bar wirkte.

4 Ergebnisse

65

Für 6 Tage bei Normaldruck vorkultivierte Chondrozyten (Abb. 17 C) waren nach 24 h Kultivierung bei 5 bar

Druck von solchen, denen die Druckeinwirkung fehlte, optisch kaum zu unterscheiden. In einigen Bereichen

der Zellkulturschalen kam es zu einer Abrundung der Chondrozyten, wobei sich diese abgerundeten

Chondrozyten vom Boden der Zellkulturschale ablösten (Abb. 20).

Die Chondrozyten, auf welche direkt nach der Aussaat ein Druck von 10 bar für 24 h (Abb. 17 D) wirkte,

zeigten ebenfalls keine Adhärenz zum Boden der Zellkulturschale und keine Zunahme der Zelldichte. In

diesen Zellkulturen fehlte die bipolare Morphologie der Chondrozyten. Stattdessen wurde, ebenso wie bei

einer Druckeinwirkung von 5 bar, das Auftreten größerer, flächiger Zellen mit Karyopyknosis und

Karyorrhexis beobachtet.

Nach einer Druckeinwirkung von 10 bar für 24 h auf adhärente Zellkulturen der Chondrozyten (Abb. 17. E)

waren die langgestreckten, bipolaren Zellen von solchen, denen die Druckeinwirkung fehlte, morphologisch

kaum zu unterscheiden. Sie zeigten jedoch weniger Zellausläufer zu Nachbarzellen. Den unter diesen

Druckbedingungen kultivierten Chondrozyten fehlte die schnelle Zunahme der Zelldichte, die bei unter

Normaldruck kultivierten Chondrozyten beobachtet wurde. Bei den unter diesen Bedingungen (10 bar,

24 h) kultivierten subkonfluenten, adhärenten Chondrozyten wurde nur in einzelnen Bereichen der

Zellkulturschalen eine abgerundete Morphologie der Zellen sichtbar, wobei ein Ablösen dieser Zellen vom

Boden der Zellkulturschale im Vergleich zu den bei 5 bar kultivierten Zellen nur selten beobachtet wurde.

Konfluente Zellkulturen der Chondrozyten waren nach 24 h, 10 bar (Abb. 17 F) von solchen, denen die

Druckeinwirkung fehlte, morphologisch kaum zu unterscheiden. In einzelnen Bereichen der Kulturschalen

kam es zu einer Abrundung der Chondrozyten (Abb. 20).

Die Chondrozyten der untersuchten konfluenten Zellkulturen (Abb. 21) waren bei Einwirkung kürzerer

Druckphasen von 1,5 h (Abb. 18 G), 3 h (Abb. 18 H), 6 h (Abb. 18 I) und 12 h (Abb. 18 J) von unter

Normaldruck kultivierten Chondrozyten morphologisch kaum zu unterscheiden. Sie waren durch

langgestreckte, bipolare Zellen charakterisiert (Abb. 21). Zellen mit abgerundeter Morphologie waren bei

Einwirkung kürzerer Druckphasen von unter 24 h kaum zu beobachten (Abb. 21).

Bei einer Wirkung des Drucks für 24 h (10 bar) (Abb. 18 K) wiesen Zellen in einzelnen Bereichen der

Zellkulturschalen die o.g. abgerundete Morphologie der Chondrozyten auf (Abb. 21). Bei einer

Verlängerung der Druckphase auf 48 h (Abb. 18 L) zeigten deutlich größere Anteile der Zellen die

abgerundete Zellmorphologie und Zeichen von Karyopyknosis und Karyorrhexis. Wurde die Dauer der

Druckphase weiter verlängert (>72 h), lösten sich die abgerundeten Chondrozyten vom Boden der

Kulturschale und voneinander. Unter den verbliebenen Chondrozyten nahmen gleichzeitig die Zeichen von

Karyopyknosis und Karyorrhexis sowie der Anteil der Zellen mit vermehrtem Zytoplasma zu. Die

beschriebene Ablösung der Chondrozyten betraf bei 10 bar und einer Dauer der Druckeinwirkung von 24-

72 h nur einzelne Zellkulturschalen (Abb. 18 K, L, M) oder nur umschriebene Bereiche in einer solchen. Bei

einer weiteren Verlängerung der Druckphase auf 98 h war die Ablösung der Chondrozyten in allen

Zellkulturschalen vollständig, wobei die Anzahl karyopyknotischer und karyorrhektischer Zellen deutlich

zunahm und die Dichte der Zellen abnahm.

4.2.4 Nachweis der Aggrekan-, Kollagen Typ I- und Kollagen Typ II-mRNA-Expression in-vitro-

kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck

Der Nachweis der Expression der mRNA für Aggrekan, Kollagen Typ I und II durch Chondrozyten in vitro

unter erhöhten Druckbedingungen erfolgte ebenso wie unter Normaldruck (1 bar) (Kap. 4.1.3) mittels

4 Ergebnisse

66

qPCR. Dabei dienten gleich behandelte Chondrozyten unter Normaldruck (1 bar) als Kontrollen.

Chondrozyten, die keine Adhärenz zum Boden der Kulturschale zeigten, lieferten ebenso keine

auswertbaren Ergebnisse in der qPCR wie Zellen, die sich im Laufe der Druckbehandlung vom Boden der

Zellkulturschale ablösten. Sie fanden in dieser Auswertung daher keine Berücksichtigung.


Kollagen Typ II-mRNA-Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten

Für die Untersuchung der Effekte der Höhe des hydrostatischen Drucks auf die mRNA-Expression von

Aggrekan, Kollagen Typ I und II durch Chondrozyten in vitro wurden die Zellen 6 d bis zum Erreichen der

Konfluenz vorkultiviert und anschließend im Bioreaktor bei einem Druck von 5 bar und 10 bar für jeweils

24 h weiterkultiviert (Abb. 22).

Abb. 22: Schema des Versuchsaufbaus zur Untersuchung der Effekte der Höhe des hydrostatischen Drucks auf die

mRNA-Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten. Die Bezeichnung der jeweiligen Kultivierungsbedingungen

entspricht der in Abb. 17. Die in den Versuchen eingesetzten Chondrozyten wurden zunächst unter Normaldruck

(1 bar) 6 Tage (d) vorkultiviert. Anschließend wurden die Chondrozyten für 24 h im Bioreaktor kultiviert, in welchem

ein hydrostatischer Druck von 5 bar (schmaler Balken) (C) bzw. 10 bar (breiter Balken) (F) für 24 Stunden (h) wirkte.

Bei einer Druckhöhe von 5 bar fiel das M der RE des Kollagen Typ I auf das 0,2-fache (3,40E3 Moleküle) und

bei einer Druckhöhe von 10 bar auf das 0,8-fache (1,09E4 Moleküle) gegenüber der unbehandelten

Kontrolle (1,42E4 Moleküle) ab (Abb. 23 A, B).

Einen ähnlichen Verlauf nahm die mRNA-Expression des Kollagen Typ II (Abb. 23 C, D). Dessen M der RE

sank bei einer Druckhöhe von 5 bar auf das 0,2-fache (2,38E3 Moleküle) und bei einer Druckhöhe von

10 bar auf das 0,8-fache (8,64E3 Moleküle) gegenüber der unbehandelten Kontrolle (1,07E4 Moleküle).

Das M der RE für Aggrekan (Abb. 24 A, B) stieg bei einer Druckhöhe von 5 bar auf das 2,2-fache (7,44E1

Moleküle) und bei einer Druckhöhe von 10 bar auf das 1,7 fache (5,82E1 Moleküle) gegenüber der

unbehandelten Kontrolle an (3,34E1 Moleküle).

In der statistischen Analyse wurden zunächst die Ergebnisse der mRNA-Expression für Kollagen Typ I und II

und Aggrekan der bei 5 und 10 bar kultivierten Chondrozyten im Vergleich zur Kontrollgruppe (1 bar)

untersucht. Dabei wiesen die Ergebnisse der RE des Kollagen Typ I und Kollagen Typ II eine hohe Differenz

der Mittelwerte bei 1 und 5 bar auf. Dadurch erreichte die Aussage, dass es durch die Einwirkung von 5 bar

Druck zu einem Absinken der Kollagen Typ I- und II-Expression kommt bei dem Stichprobenumfang (n=3)

eine P von 99 %. Für einen Druck von 10 bar erzielte diese Aussage nur eine P von 27-31 %, sodass n=9

notwendig wäre, um diese mit einer P von 80 % auch für den höheren Druck treffen zu können. Eine hohe

Differenz der Mittelwerte zeigten auch die Ergebnisse der RE für Aggrekan, wobei diese eine hohe

Standardabweichung aufwiesen. Der Anstieg der mRNA-Expression von Aggrekan durch die Einwirkung von

4 Ergebnisse

67

5 bar Druck ließ sich mit einer P von 55 % erkennen, sodass n=5 nötig wäre, um diesen Unterschied zu

detektieren (P 80 %).

Abb. 23: Relative Kollagen Typ I- und Kollagen Typ II-mRNA-Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter

erhöhtem Druck bei Variation der Höhe des einwirkenden hydrostatischen Drucks (5, 10 bar) für 24 Stunden im

Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (Normaldruck, 1 bar). A, C: Darstellung der Ergebnisse der qPCR für Kollagen

Typ I und II als Balkendiagramm mit Mittelwert und Standardabweichung. B, D: Punktdarstellung der arithmetischen

Mittel der technischen Replikate eines jeden biologischen Replikats für Kollagen Typ I (B) und Kollagen Typ II (D).

Hierbei ist die Anzahl der biologischen Replikate (n) angegeben. Die Darstellung der Molekülzahl des Kollagen Typ I

und II erfolgt relativ zu 1E5 Molekülen des Referenzgens 36B4.

Anschließend wurden die Ergebnisse, die bei einer Kultivierung von 5 bar und 10 bar erzielt wurden,

einander gegenübergestellt. Hierbei führte die Kultivierung der Chondrozyten bei einem Druck von 5 bar zu

einem stärkeren Absinken der Kollagen Typ I- und Kollagen Typ II-Expression als bei einem Druck von 10 bar

(P: 84 % für Kollagen Typ I, 98 % für Kollagen Typ II). Für die mRNA-Expression des Aggrekan lag die

Standardabweichung höher als die Differenz der Mittelwerte, sodass eine Aussage über die Unterschiede

der Ergebnisse zwischen 5 und 10 bar eine P von 14 % erreichte.

Unter Berücksichtigung dieser statistischen Analysen wurden die Expression der Chondrozyten bei

normalem Druck denen bei erhöhtem hydrostatischem Druck (5 und 10 bar) gegenübergestellt, indem die

Bedingungen 5 bar und 10 bar als Gruppe zusammengefasst wurden und eine ANOVA on Ranks

durchgeführt wurde. Dabei zeigte sich, dass durch Einwirkung eines hydrostatischen Drucks (5 bar und 10

bar) auf in-vitro-kultivierte Chondrozyten die Kollagenexpression auf der Ebene des Transkriptoms für

0,0E+0

2,0E+3

4,0E+3

6,0E+3

8,0E+3

1,0E+4

1,2E+4

1 bar (n=3) 5 bar (n=3) 10 bar (n=3)

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]

Druck [bar]

Kollagen Typ II

0,0E+0

2,0E+3

4,0E+3

6,0E+3

8,0E+3

1,0E+4

1,2E+4

1,4E+4

1,6E+4

1,8E+4

1 bar (n=3) 5 bar (n=3) 10 bar (n=3)

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]

Druck [bar]

Kollagen Typ I

0,0E+0

2,0E+3

4,0E+3

6,0E+3

8,0E+3

1,0E+4

1,2E+4

1,4E+4

1 bar 5 bar 10 bar

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]

Druck [bar]

Kollagen Typ IIC

0,0E+0

2,0E+3

4,0E+3

6,0E+3

8,0E+3

1,0E+4

1,2E+4

1,4E+4

1,6E+4

1,8E+4

1 bar 5 bar 10 bar

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]

Druck [bar]

Kollagen Typ IA B

D

4 Ergebnisse

68

Kollagen Typ I und II signifikant niedriger (Signifikanzniveau <0,05) war als ohne diese Druckeinwirkung

(Kontrollgruppe) und es gleichzeitig zu einer signifikanten Zunahme (Signifikanzniveau <0,05) der mRNA-

Expression des Aggrekan kam.

Abb. 24: Relative Aggrekan-mRNA-Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck bei

Variation der Höhe des einwirkenden hydrostatischen Drucks (5, 10 bar) für 24 Stunden im Vergleich zur

unbehandelten Kontrolle (Normaldruck, 1 bar). A: Darstellung der Ergebnisse der qPCR für Aggrekan als

Balkendiagramm mit Mittelwert und Standardabweichung. B: Punktdarstellung der arithmetischen Mittel der

technischen Replikate eines jeden biologischen Replikats für Aggrekan. Hierbei ist die Anzahl der biologischen

Replikate (n) angegeben. Die Darstellung der Molekülzahl des Aggrekan erfolgt relativ zu 1E5 Molekülen des

Referenzgens 36B4.


Kollagen Typ II-mRNA-Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten

Zur Untersuchung der Effekte der Dauer des hydrostatischen Drucks auf die mRNA-Expression der

Chondrozyten in vitro wurden für 6 Tage unter Normaldruck vorkultivierte Zellen über unterschiedliche

Zeiten einem erhöhten Druck ausgesetzt. Hierfür wurden die konfluenten Chondrozyten bei einem Druck

von 10 bar für einen Zeitraum von 1,5 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h im Bioreaktor kultiviert (Abb. 25).

Abb. 25: Schema des Versuchsaufbaus zur Untersuchung der Effekte der Dauer des hydrostatischen Drucks auf die

mRNA-Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten. Die Bezeichnung der jeweiligen Kultivierungsbedingungen


(1 bar) 6 Tage (d) vorkultiviert. Anschließend wurden die Chondrozyten für 1,5 h (G), 3 h (H), 6 h (I), 12 h (J) und 24 h

(K) im Bioreaktor kultiviert, in welchem ein hydrostatischer Druck von 10 bar wirkte.

0,0E+0

1,0E+1

2,0E+1

3,0E+1

4,0E+1

5,0E+1

6,0E+1

7,0E+1

8,0E+1

9,0E+1

1 bar 5 bar 10 bar

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]

Druck [bar]

AggrekanA

0,0E+0

1,0E+1

2,0E+1

3,0E+1

4,0E+1

5,0E+1

6,0E+1

7,0E+1

8,0E+1

9,0E+1

1 bar (n=3) 5 bar (n=3) 10 bar (n=3)

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]

Druck [bar]

Aggrekan B

4 Ergebnisse

69

Die so behandelten Chondrozyten wiesen bei einer Dauer der Druckphase von 1,5 h (8,19E3 Moleküle), 3 h

(6,03E3 Moleküle), 6 h (6,65E3 Moleküle) und 12 h (6,95E3 Moleküle) ähnlich hohe M der RE des Kollagen

Typ I auf, die um das 0,8-fache niedriger lagen als die der jeweiligen unbehandelten Kontrolle. Bei einer

Druckphase von 24 h fiel das M der RE des Kollagen Typ I auf das 0,4-fache (3,18E3 Moleküle) ab

(Abb. 26 A, B).

Ebenso wiesen die M der RE des Kollagen Typ II nahezu konstante Ergebnisse auf. Diese blieben mit 3,33E3

Molekülen bei 1,5 h, 3,08E3 Molekülen bei 3 h, 3,59 E3 Molekülen bei 6 h und 3,11 E3 Molekülen bei 12 h

ebenfalls um das 0,8-fache hinter der jeweilige unbehandelten Kontrolle zurück. Bei einer Druckphase von

24 h fiel das M der RE des Kollagen Typ II auf das 0,7-fache (1,29E3 Moleküle) der Kontrolle ab

(Abb. 26 C, D).


erhöhtem Druck bei Variation der Dauer (1,5 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h) des einwirkenden hydrostatischen Drucks (10

bar) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (Normaldruck, 1 bar). A, C: Darstellung der Ergebnisse der qPCR für

Kollagen Typ I und II als Balkendiagramm mit Mittelwert und Standardabweichung. B, D: Punktdarstellung der

arithmetischen Mittel der technischen Replikate eines jeden biologischen Replikats für Kollagen Typ I (B) und Kollagen

Typ II (D). Hierbei ist die Anzahl der biologischen Replikate (n) angegeben. Die Darstellung der Molekülzahl des

Kollagen Typ I und II erfolgt relativ zu 1E5 Molekülen des Referenzgens 36B4

0,0E+0

2,0E+3

4,0E+3

6,0E+3

8,0E+3

1,0E+4

1,2E+4

1,5 h(n=3)

1,5 h(n=3)

3 h(n=3)

3 h(n=3)

6 h(n=3)

6 h(n=3)

12 h(n=2)

12 h(n=3)

24 h(n=3)

24 h(n=3)

Dauer der Druckeinwirkung [h]

Kollagen Typ I

0,0E+0

2,0E+3

4,0E+3

6,0E+3

8,0E+3

1,0E+4

1,2E+4

1,4E+4

1,5 h 3 h 6 h 12 h 24 h

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]


10 bar 1 bar

0,0E+0

1,0E+3

2,0E+3

3,0E+3

4,0E+3

5,0E+3

6,0E+3

1,5 h 3 h 6 h 12 h 24 h

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]


10 bar 1 barKollagen Typ II

0,0E+0

1,0E+3

2,0E+3

3,0E+3

4,0E+3

5,0E+3

6,0E+3

1,5 h(n=3)

1,5 h(n=3)

3 h(n=3)

3 h(n=3)

6 h(n=3)

6 h(n=3)

12 h(n=2)

12 h(n=3)

24 h(n=3)

24 h(n=3)


Kollagen Typ II

B A

Kollagen Typ I

D C

4 Ergebnisse

70

Das M der RE des Aggrekan wies bei einer Dauer der Druckeinwirkung von 1,5 h (4,93E3 Moleküle) und 3 h

(3,89 E3 Moleküle) um das 1,5- bis 2,5-fache höhere Werte auf als bei der Dauer von 6 h (2,76E3 Moleküle),

12 h (2,07E3 Moleküle) und 24 h (1,76E3 Moleküle) (Abb. 27 A, B). Auch gegenüber der unbehandelten

Kontrolle stieg die RE des Aggrekan bei 1,5 h Druck um das 1,6-fache und bei 3 h Druck um das 2,4-fache

an, fiel bei 6 h auf das 0,8-fache der Kontrolle ab und zeigte bei 12 h sowie 24 h annährend gleich hohe

Werte wie die Kontrolle.

Abb. 27: Relative Aggrekan-mRNA-Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck bei

Variation der Dauer (1,5 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h) des einwirkenden hydrostatischen Drucks (10 bar) im Vergleich zur

unbehandelten Kontrolle (Normaldruck, 1 bar). A: Darstellung der Ergebnisse der qPCR für Aggrekan als

Balkendiagramm mit Mittelwert und Standardabweichung. B: Punktdarstellung der arithmetischen Mittel der

technischen Replikate eines jeden biologischen Replikats für Aggrekan. Hierbei ist die Anzahl der biologischen

Replikate (n) angegeben. Die Darstellung der Molekülzahl des Aggrekan erfolgt relativ zu 1E5 Molekülen des

Referenzgens 36B4.

Da das Expressionsmuster der Chondrozyten in Bezug auf Kollagen Typ I und II bei den Bedingungen 1,5 h,

3 h, 6 h, 12 h nur geringe Differenzen der Mittelwerte aufwies, wurde auf die statistische Auswertung

dieser Daten verzichtet. Um die Unterschiede in Bezug auf die Expression des Aggrekan zu analysieren,

wurden den kurzen Druckzeiten (1,5 und 3 h) lange Druckzeiten (6 h, 12 h und 24 h) gegenübergestellt,

wofür die zugehörigen Ergebnisse als Gruppen zusammengefasst wurden. Die vorhandene Differenz der

Mittelwerte in der Expressionen des Aggrekan bei kurzen und langen Druckzeiten wurde bei der

vorliegenden Standardabweichung der Ergebnisse bei n=8 erkannt. Daher war der Stichprobenumfang trotz

der Gruppierung der Ergebnisse (n=6) zu klein, sodass die höhere Expression des Aggrekan bei kurzen

Druckzeiten nur mit einer P von 78 % erkannt wurde. Mit n=8 würde auch der Anstieg der Expression des

Aggrekan bei kurzzeitigen Druckeinwirkung verglichen mit der Kontrolle erkannt. Der notwendige hohe

Stichprobenumfang lag in der besonders hohen Standardabweichung der M der RE des Aggrekan dieses

Versuchs begründet. Da für die hohe Standardabweichung der für Aggrekan sowohl unter Druck als auch

ohne Druck (Kontrollen) erzielten Ergebnisse bei 3 h und 12 h gegenüber 1,5 h und 6 h keine Ursache im

Versuchsaufbau gefunden werden konnte, wurde auf einen direkten Vergleich der unter erhöhtem

hydrostatischem Druck erzielten Ergebnisse mit denen der Kontrollgruppe verzichtet, da dessen

Aussagekraft fraglich bliebe.

0,0E+0

1,0E+1

2,0E+1

3,0E+1

4,0E+1

5,0E+1

6,0E+1

7,0E+1

1,5 h 3 h 6 h 12 h 24 h

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4


10 bar 1 barAggrekan

0,0E+0

1,0E+1

2,0E+1

3,0E+1

4,0E+1

5,0E+1

6,0E+1

7,0E+1

1,5 h(n=3)

1,5 h(n=3)

3 h(n=3)

3 h(n=3)

6 h(n=3)

6 h(n=3)

12 h(n=2)

12 h(n=3)

24 h(n=3)

24 h(n=3)


Aggrekan A B

4 Ergebnisse

71

4.2.4.3 Effekte der Zelldichte auf die Aggrekan-, Kollagen Typ I- und Kollagen Typ II-mRNA-

Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck

Zur Untersuchung des Einflusses der Zelldichte der Chondrozyten auf deren Expression bei der Einwirkung

eines erhöhten hydrostatischen Drucks wurden Chondrozyten in normaler Zelldichte (104 Zellen/ cm2) und

doppelter Zelldichte ausgesät. Diese wurden nach 6 Tagen Vorkultivierung einem Druck von 10 bar für

entweder 3 h oder 6 h ausgesetzt (Abb. 28 H, I, N, O).

Abb. 28: Schema des Versuchsaufbaus zur Untersuchung der Effekte der Zelldichte der Chondrozyten auf deren

mRNA-Expression bei der Einwirkung eines erhöhten hydrostatischen Drucks. Die Bezeichnung der jeweiligen

Kultivierungsbedingungen entspricht der in Abb. 19. Die in den Versuchen eingesetzten Chondrozyten wurden in

normaler (H, I) und doppelter Zelldichte (N, O) ausgesät und zunächst unter Normaldruck (1 bar) 6 Tage (d)

vorkultiviert. Anschließend wurden die Chondrozyten für 3 h (H, N) und 6 h (I, O) im Bioreaktor kultiviert, in welchem

ein hydrostatischer Druck von 10 bar wirkte.

Dabei zeigten die mit doppelter Zelldichte ausgesäten Chondrozyten sowohl bei 3 h (9,26E3 Moleküle) als

auch bei 6 h (9,71E3 Moleküle) andauerndem Druck einen Anstieg des M der RE des Kollagen Typ I auf das

1,5-fache gegenüber solchen mit normaler Zelldichte (6,03E3 Moleküle bei 3h, 6,65E3 Moleküle bei 6h)

(Abb. 29 A, B). Gleichzeitig fiel das M der RE des Kollagen Typ II der Chondrozyten mit doppelter Zelldichte

(1,10E3 Moleküle bei 3h, 1,28E3 Moleküle bei 6h) auf das 0,4-fache des Wertes ab, den die Chondrozyten

mit normaler Zelldichte erreichten (3,08 E3 Moleküle bei 3h, 3,59E3 Moleküle bei 6h) (Abb. 29 C, D).

Bei einer Druckeinwirkung von 3 h fiel das M der RE des Aggrekan bei doppelter Zelldichte (1,76E1

Moleküle) auf das 0,5-fache gegenüber dem M der RE des Aggrekan bei normaler Zelldichte (3,89E1

Molekülen) ab (Abb. 30 A, B). Bei einer Druckeinwirkung von 6 h zeigte sich ein Anstieg um das 1,3-fache

(3,81E1 Moleküle) verglichen mit Chondrozyten in normaler Zelldichte (2,76E1 Moleküle).

Statistisch gesehen zeigt diese Untersuchung nur Tendenzen auf, da es den Ergebnissen mit n=2 und n=3 an

P (P von 22,1% bzw. 29,8% für Kollagen Typ I, P von 41,9% bzw. 72,3% für Kollagen Typ II und P von 0 bzw.

10 % für Aggrekan) fehlt. Ergebnisse mit einer P von 80% würden Untersuchungen ab n=5 liefern.

4 Ergebnisse

72


erhöhtem Druck (3 h und 6 h, 10 bar) bei Variation der Zelldichte. Zur Evaluierung des Einflusses der Zelldichte

wurden die Chondrozyten in normaler Zelldichte (104 Zellen/ cm

2) und doppelter Zelldichte ausgesät und die Wirkung

des Drucks bei einer Einwirkzeit von 3 h und 6 h an den konfluenten Chondrozyten (6 Tage Vorkultivierung unter

Normaldruck) untersucht. A, C: Darstellung der Ergebnisse der qPCR für Kollagen Typ I und II als Balkendiagramm mit

Mittelwert und Standardabweichung. B, D: Punktdarstellung der arithmetischen Mittel der technischen Replikate

eines jeden biologischen Replikats für Kollagen Typ I (B) und Kollagen Typ II (D). Hierbei ist die Anzahl der biologischen

Replikate (n) angegeben. Die Darstellung der Molekülzahl des Kollagen Typ I und II erfolgt relativ zu 1E5 Molekülen des

Referenzgens 36B4.

0,0E+0

1,0E+3

2,0E+3

3,0E+3

4,0E+3

5,0E+3

doppelteZelldichte

(n=2)

normaleZelldichte

(n=3)

doppelteZelldichte

(n=2)

normaleZelldichte

(n=3)

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]


Kollagen Typ II

0,0E+0

2,0E+3

4,0E+3

6,0E+3

8,0E+3

1,0E+4

1,2E+4

doppelteZelldichte

(n=2)

normaleZelldichte

(n=3)

doppelteZelldichte

(n=2)

normaleZelldichte

(n=3)

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]


Kollagen Typ I

3 h 6 h

3 h 6 h

D

B

0,0E+0

2,0E+3

4,0E+3

6,0E+3

8,0E+3

1,0E+4

1,2E+4

3 h 6 h

rela

tive

Exp

ress

ion

[

Mo

lekü

lzah

l / 1

E5 3

6B

4]


Kollagen Typ I

doppelte Zelldichte

normale Zelldichte

A

0,0E+0

1,0E+3

2,0E+3

3,0E+3

4,0E+3

5,0E+3

3 h 6 h

rela

tive

Exp

ress

ion

[

Mo

lekü

lzah

l / 1

E5 3

6B

4]


Kollagen Typ II doppelte Zelldichtenormale Zelldichte

C

4 Ergebnisse

73

Abb. 30: Relative Aggrekan-mRNA-Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck (3 h und 6 h,

10 bar) bei Variation der Zelldichte. Zur Evaluierung des Einflusses der Zelldichte wurden die Chondrozyten in

normaler Zelldichte (104 Zellen/ cm

2) und doppelter Zelldichte ausgesät und die Wirkung des Drucks bei einer

Einwirkzeit von 3 h und 6 h an den konfluenten Chondrozyten (6 Tage Vorkultivierung unter Normaldruck) untersucht.

A: Darstellung der Ergebnisse der qPCR für Aggrekan als Balkendiagramm mit Mittelwert und Standardabweichung. B:

Punktdarstellung der arithmetischen Mittel der technischen Replikate eines jeden biologischen Replikats für Aggrekan.

Hierbei ist die Anzahl der biologischen Replikate (n) angegeben. Die Darstellung der Molekülzahl des Aggrkan erfolgt

relativ zu 1E5 Molekülen des Referenzgens 36B4.


kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck

Der Nachweis der Proteinexpression des Kollagen Typ I und II sowie des Aggrekan durch Chondrozyten in

vitro unter modifizierten Druckbedingungen erfolgte analog zu den Untersuchungen ohne zusätzlichen

Druck mit den im Vorfeld optimierten Western Blot-Bedingungen (Kap. 4.1.4). Chondrozyten, die keine

Adhärenz zum Boden der Kulturschale zeigten, lieferten ebenso keine auswertbaren Proteinmengen wie

Zellen, die sich im Laufe der Druckbehandlung vom Boden der Zellkulturschale ablösten. Sie fanden in

dieser Auswertung daher keine Berücksichtigung.


Kollagen Typ II-Proteinexpression in-vitro-kultivierter Chondrozyten

Die Untersuchung der Wirkung der Höhe des hydrostatischen Drucks auf die Proteinexpression von

Aggrekan, Kollagen Typ I und II durch Chondrozyten in vitro erfolgte mit Hilfe der Proteinproben, die aus

den nach 6 Tagen Vorkultivierung unter Normaldruck für 24 h bei einem Druck von 5 und 10 bar im

Bioreaktor weiterkultivierten Chondrozyten entstanden (Abb. 31).

0,0E+0

1,0E+1

2,0E+1

3,0E+1

4,0E+1

5,0E+1

6,0E+1

doppelteZelldichte

(n=2)

normaleZelldichte

(n=3)

doppelteZelldichte

(n=2)

normaleZelldichte

(n=3)

rela

tive

Exp

ress

ion

[M

ole

külz

ahl /

1E5

36

B4

]


Aggrekan

0,0E+0

1,0E+1

2,0E+1

3,0E+1

4,0E+1

5,0E+1

6,0E+1

3 h 6 h

rela

tive

Exp

ress

ion

[

Mo

lekü

lzah

l / 1

E5 3

6B

4]


Aggrekan

doppelte Zelldichte

normale Zelldichte

A B

3 h 6 h

4 Ergebnisse

74

Abb. 31: Schema des Versuchsaufbaus zur Untersuchung der Effekte der Höhe des hydrostatischen Drucks auf die

Proteinexpression in-vitro-kultivierter Chondrozyten. Die Bezeichnung der jeweiligen Kultivierungsbedingungen


(Normaldruck, 1 bar) 6 Tage (d) vorkultiviert. Anschließend wurden die Chondrozyten für 24 h im Bioreaktor kultiviert,

in welchem ein hydrostatischer Druck von 5 bar (schmaler Balken) (C) bzw. 10 bar (breiter Balken)(F) für

24 Stunden (h) wirkte.

Bei einer Druckhöhe von 5 bar zeigten sich in der RLI des Kollagen Typ I nur geringe Unterschiede

gegenüber der unbehandelten Kontrolle (0,51 bei 38 kDa, 1,22 bei 50 kDa, 0,55 bei 120 kDa). Die Banden

bei 38 und 120 kDa nahmen in der RLI um 0,2 ab, während die Bande bei 50 kDa konstant blieb. Bei einer

Erhöhung des hydrostatischen Drucks auf 10 bar hingegen stiegen die RLI-Werte des Kollagen Typ I an. Die

RLI der für Kollagen Typ I detektierten Banden bei 38 (1,52) und 50 kDa (3,15) nahm um das 2- bzw. 3-

fache, für die Bande bei 120 kDa (3,94) um das 7-fache gegenüber der Kontrolle zu (Abb. 32 A).

Bei einem Druck von 5 bar (0,44 bei 65 kDa, 0,01 bei 70 kDa) zeigte die RLI der Banden des Kollagen Typ II,

insbesondere der 70 kDa-Bande, einen Abfall der Proteinexpression auf das 0,01-fache, bzw. das 0,4-fache

der unbehandelte Kontrolle (1,1 bei 65 kDa, 1,38 bei 70 kDa). Für den höheren Druck von 10 bar lagen die

RLI-Werte für die 65 kDa-Bande um das 1,5-fache (1,50) und für die 70 kDa-Bande um das 2,9 fache (4,00)

höher als die der unbehandelten Kontrolle (Abb. 32 B).

Abb. 32: Proteinexpression in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck bei Variation der Höhe des

einwirkenden hydrostatischen Drucks (5 bar, 10 bar) für 24 h auf eine konfluente Zellkultur (6 Tage Vorkultivierung

unter Normaldruck) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (Normaldruck, 1 bar) basierend auf den Ergebnissen

der Western Blots. A: Darstellung der relativen Lumineszenz-Intensität (RLI) der für Kollagen Typ I detektierten

Banden bei 38, 50 und 120 kDa. B: Darstellung der RLI der für Kollagen Typ II detektierten Banden bei 65 und 70 kDa.

C: Darstellung der RLI der für Aggrekan detektierten Banden bei 45 und 65 kDa. Die Darstellung der RLI des Kollagen

Typ I und II, sowie des Aggrekan erfolgt relativ zur Lumineszenz-Intensität (LI) des Referenzproteins β-Aktin.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 bar 5 bar 10 bar

Druck [bar]

Aggrekan Bande 45 kDa

Bande 65 kDa

C

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

1 bar 5 bar 10 bar

Druck [bar]

Kollagen Typ II Bande 65 kDa

Bande 70 kDa

B

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

1 bar 5 bar 10 bar

rela

tive

Lu

min

esz

en

z-In

ten

sitä

t

Druck [bar]

Kollagen Typ I

Bande 38 kDaBande 50 kDaBande 120 kDa

A

4 Ergebnisse

75

Für Aggrekan lag die RLI bei 5 bar Druckeinwirkung für die 45 (0,23) und 65 kDa-Bande (0,24) auf ähnlich

niedrigem Niveau wie die unbehandelte Kontrolle (0,29 bei 45 kDa, 0,35 bei 65 kDa). Bei 10 bar

Druckeinwirkung stieg die Proteinexpression des Aggrekan gegenüber der unbehandelten Kontrolle an. Die

RLI nahm bei 10 bar Druckeinwirkung auf das 4,8-fache für die 45 kDa-Bande (1,41) bzw. 8,6-fache für die

65 kDa-Bande (3,03) zu (Abb. 32 C).


Kollagen Typ II-Proteinexpression in-vitro-kultivierter Chondrozyten

Für die Untersuchung des Effekts der Dauer der Druckeinwirkung auf die Proteinexpression des Kollagen

Typ I und II sowie des Aggrekan durch die Chondrozyten in vitro wurden die Proteinproben verwendet,

welche aus den nach 6 Tagen Vorkultivierung für 1,5 h, 3 h, 6 h, 12 h und 24 h bei einem Druck von 10 bar

im Bioreaktor weiterkultivierten Chondrozyten gewonnen wurden (Abb. 33).

Abb. 33: Schema des Versuchsaufbaus zur Untersuchung der Effekte der Dauer des hydrostatischen Drucks auf die

Proteinexpression in-vitro-kultivierter Chondrozyten. Die Bezeichnung der jeweiligen Kultivierungsbedingungen

entspricht der in Abb. 18. Die in den Versuchen eingesetzten Chondrozyten wurden zunächst unter Normaldruck (1

bar) 6 Tage (d) vorkultiviert. Anschließend wurden die Chondrozyten für 1,5 h (G), 3 h (H), 6 h (I) und 12 h (J) im

Bioreaktor kultiviert, in welchem ein hydrostatischer Druck von 10 bar wirkte.

Die so behandelten Zellen wiesen bei einer Druckeinwirkung von 1,5 h eine 1,7-fach höhere RLI der für

Kollagen Typ I detektierten Bande bei 37 kDa (0,72) auf als die jeweilige unbehandelte Kontrolle (0,42)

(Abb. 34 A). Die 50 kDa-Bande erreichte mit 0,6 die gleiche RLI wie die Kontrolle, wohingegen für die 120

kDa-Bande (1,53) ähnlich der 37 kDa-Bande eine verglichen mit der Kontrolle (0,95) 1,6-fach höhere RLI

detektiert wurde. Die RLI-Werte der für Kollagen Typ I bei 120 kDa detektierten Bande lag auch verglichen

mit den bei 3 h, 6 h und 12 h erreichten Werten 1,6-fach höher.

Bei längerer Dauer der Druckphase (3 h, 6 h) zeigten sich ähnlich hohe RLI der detektierten Banden des

Kollagen Typ I. Die RLI-Werte lagen bei 3 h Druckphase bei 0,70 für die 37 kDa-, bei 0,96 für die 50 kDa-, bei

1,22 für die 120 kDa-Bande; und bei einer Druckphase von 6 h bei 0,64 für die 37 kDa-, bei 0,79 für die 50

kDa- und bei 1,16 für die 120 kDa-Bande. Somit wurden bei 3 und 6 h für die 37 kDa-Bande verglichen mit

der Kontrolle (0,56 für 3 h, 0,55 für 6 h) 1,2-1,3-fach höhere Werte detektiert. Diese Erhöhung der

RLI-Werte auf das 1,3-fache verglichen mit der Kontrolle (0,76) zeigte auch die 50 kDa-Bande für 3 h (0,96),

wohingegen das Signal bei 6 h Druck mit 0,79 im Vergleich zur Kontrolle (0,82) nahezu konstant blieb. Die

RLI der 120 kDa-Bande bei einer Druckzeit von 3 h und 6 h Kultivierung blieb mit Werten von 1,22 für 3 h

und 1,16 für 6 h ebenfalls nahezu konstant zur unbehandelten Kontrolle (1,27 für 3 h, 1,14 für 6 h).

Während bei 3 h und 6 h Druck verglichen mit der Kontrolle annähernd konstante oder höhere RLI-Werte

der für Kollagen Typ I detektierten Banden vorlagen, wurden bei 12 h für alle Banden der Kontrolle höhere

4 Ergebnisse

76

RLI-Werte als für die unter Druck entstandenen Proben nachgewiesen. Hierbei lagen die RLI der

detektierten Banden für 12 h Druckeinwirkung bei 37 kDa (0,60) und 50 kDa (0,91) um das 0,8-fache tiefer,

bei 120 kDa (1,08) um das 0,7-fache tiefer als die RLI der Kontrollen (0,79 bei 37 kDa, 1,21 bei 50 kDa, 1,52

für 120 kDa).

Abb. 34: Proteinexpression in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter erhöhtem Druck bei Variation der Dauer (1,5 h,

3 h, 6 h, 12 h) des einwirkenden Drucks (10 bar) auf eine konfluente Zellkultur im Vergleich zur unbehandelten

Kontrolle (Normaldruck, 1 bar) basierend auf den Ergebnissen der Western Blots. A: Darstellung der relativen

Lumineszenz-Intensität (RLI) der für Kollagen Typ I detektierten Banden bei 38, 50 und 120 kDa. B: Darstellung der für

Kollagen Typ II detektierten Banden bei 65 und 70 kDa. C: Darstellung der für Aggrekan detektierten Banden bei

45 und 65 kDa. Die Darstellung der RLI des Kollagen Typ I und II, sowie des Aggrekan erfolgt relativ zur Lumineszenz-

Intensität (LI) des Referenzproteins β-Aktin.

0

0,5

1

1,5

2

1,5 h 3 h 6 h 12 hrela

tive

Lu

min

esz

en

z-In

ten

sitä

t


Kollagen Typ I

10 bar, Bande bei 38 kDa






A

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1,5 h 3 h 6 h 12 hrela

tive

Lu

min

esz

en

z-In

ten

sitä

t


Kollagen Typ II





B

0

0,5

1

1,5 h 3 h 6 h 12 hrela

tive

Lu

min

esz

en

z-In

ten

sitä

t


Aggrekan





C

4 Ergebnisse

77

Bezüglich der Expression des Kollagen Typ II ließen sich nur geringe Unterschiede in den detektierten

Banden bei Variation der Dauer der Druckeinwirkung erkennen (Abb. 34 B). Für die beiden detektierten

Banden bei 65 und 70 kDa wurden bei 1,5 h Druck RLI-Werte von 0,86 bzw. 0,63 und für die Kontrolle 0,84

bzw. 0,51 gemessen. Bei 3 h Druck lag die 65 kDa-Bande (0,91) ebenfalls auf dem Niveau der Kontrolle

(0,84), wohingegen für die 70 kDa-Bande ein verglichen mit der Kontrolle (0,51) 1,7-fach stärkeres Signal

(0,85) detektiert wurde. Während die RLI der 65 kDa-Bande (0,83) bei 6 h Druck ebenfalls konstant zur

Kontrolle (0,86) blieb, zeigte sich auch hier bei 70 kDa (0,85) eine 1,2-fach höhere RLI verglichen mit der

Kontrolle (0,73). Bei einer Druckeinwirkung von 12 h blieb die RLI der bei 65 kDa für Kollagen Typ II

detektierten Bande konstant auf Höhe der für 6 h Druck detektierten Bande (0,89 für 12 h, 0,83 für die

Kontrolle). Hingegen zeigte die 70kDa-Bande für 12 h Druck eine RLI von 2,87, welche 4,4-fach höher lag als

die RLI der Kontrolle (0,66). Hierbei ist zu beachten, dass sich das Signal der Bande des Referenzproteins β-

Aktin sehr schwach und inhomogen innerhalb der Bande darstellte.

Bei der Auswertung der Expression des Aggrekan auf Proteinebene unter Berücksichtigung der Banden bei

45 und 65 kDa wurden nur geringe Unterschiede deutlich (Abb. 34 C). Die RLI der 45 kDa-Bande lag bei

1,5 h Druckeinwirkung für die 45 kDa-Bande (0,52) 0,8-fach und für die 65 kDa-Bande (0,68) 0,6-fach

niedriger als die der unbehandelten Kontrolle (0,82 für 45 kDa, 0,86 für 65 kDa). Bei einer Druckeinwirkung

von 3 h wurde jedoch eine verglichen mit der unbehandelten Kontrolle (0,6 bei 45 kDa, 0,61 bei 65 kDa)

1,4-fach höhere RLI für die beiden detektierten Banden gemessen (0,85 für 45 kDa, 0,77 für 65 kDa). Bei

einem für 6 h wirkenden Druck waren die RLI-Werte der 45 kDa Bande (0,82) und der 65 kDa Bande (0,77)

verglichen mit der Kontrolle nahezu konstant (0,86 für 45 kDa, 0,84 für 65 kDa). Ebenso wiesen die bei 12 h

Druck detektierten Signale (0,67 für 45 kDa, 0,62 für 65 kDa) im Vergleich zur Kontrolle (0,77 für 45 kDa,

0,64 für 65 kDa) kaum Unterschiede auf.

5 Diskussion

78

5 Diskussion

Die heute vorhandenen operativen Möglichkeiten der Therapie von Knorpeldefekten führen überwiegend

zu funktionell unbefriedigenden Langzeitergebnissen (ALFORD 2005). Da die Defekte des Knorpels einen

Großteil der Erkrankungen des Bewegungsapparats darstellen und zudem die Arthrose als Langzeitfolge

nach sich ziehen, besteht ein hohes medizinisches Interesse an der Entwicklung und Weiterentwicklung

innovativer Therapieansätze (BENTLEY et al. 2013, FRITSCH et al. 1999, ZEIFANG et al. 2010). Einen

vielversprechenden Therapieansatz stellt dabei die ACT bzw. MACT dar, bei der in-vitro-kultivierte

Chondrozyten in einen Knorpeldefekt eingebracht werden, mit dem Ziel neuen hyalinen Knorpel zu bilden

(BUCKWALTER und MANKIN 1998, MARCACCI et al. 2013, WONG und CARTER 2003). Bisher existieren

keine geeigneten Bedingungen, um die dabei transplantierten Chondrozyten so zu modifizieren, dass sie

hyalinen Knorpel bilden, welcher langfristig den Druckbedingungen des Gelenks standhält (MARTINEK und

IMHOFF 2003).

Inzwischen zeigte sich jedoch, dass die Entwicklung solcher Therapieansätze ein detaillierteres Verständnis

des Knorpelgewebes und speziell dessen Biodynamik erfordert (ALFORD 2005, BRUNS und STEINHAGEN

2000). Da hierbei ein Fokus auf dem Effekt des auf die Zellen und die ECM des Knorpelgewebes

einwirkenden Drucks liegt, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Wirkung verschiedener hydrostatischer

Druckbedingungen auf das Expressionsmuster in-vitro-kultivierter Chondrozyten auf Transkriptom- und

Proteomebene untersucht, um ein Zellkultursystem und Rahmenbedingungen zu etablieren, die gezielt

weitere Untersuchungen ermöglichen. Im Folgenden werden zunächst die dabei genutzten Methoden und

Ergebnisse diskutiert und schließlich daraus resultierende Empfehlungen für die Kultivierung von

Chondrozyten unter erhöhtem hydrostatischem Druck abgeleitet.

5.1 Diskussion der Untersuchungsmethoden

Für die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen der Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten

wurden die Methoden PCR, SDS-PAGE/Western Blot und Immunzytochemie etabliert. Die Interpretation

der mit Hilfe dieser Methoden erzielten Ergebnisse sollte unter Berücksichtigung ihrer

methodenspezifischen Besonderheiten erfolgen. Hierzu zählen zum einen die Varianz der Ergebnisse der

PCR und andererseits die aus der Detektion großer Strukturproteine mittels spezifischer Antikörper in

Western Blot und Immunzytochemie resultierenden Abweichungen. Daneben sollten die Möglichkeiten

und Limitationen der statistischen Analysen bei geringem Stichprobenumfang Beachtung finden.

5.1.1 Varianz der Ergebnisse der PCR

Die Ergebnisse der PCR unterliegen einer biologischen und einer technischen Varianz. Die biologische

Varianz liegt zum einen in der Nutzung einer Primärkultur der Chondrozyten in den durchgeführten

Versuchen und zum anderen in individuellen Fehlern begründet. Der Vorteil in der Nutzung einer

Primärkultur im Vergleich zu den ebenfalls nutzbaren Zelllinien liegt vor allem in den geringen

Veränderungen, welche die Primärkultur erfahren hat. Dadurch kommt die Primärkultur den Bedingungen

im Organismus am nächsten, wobei in vitro niemals die Komplexität der in vivo auf die Chondrozyten

einwirkenden Umgebungsfaktoren erreicht werden kann, sodass grundsätzlich Unterschiede zu den unter

physiologischen Bedingungen wachsenden Zellen verbleiben (SCHMITZ 2011). Einen wesentlichen Nachteil

der genutzten Primärkultur stellen die deutlichen individuellen Unterschiede sowohl zwischen den Zellen

5 Diskussion

79

gleicher als auch verschiedener Passagen dar (SCHMITZ 2011). Diese tragen erheblich zur Varianz der

Ergebnisse der biologischen Replikate bei (BUSTIN 2009). Daneben wird die Varianz biologischer Replikate

durch individuelle Fehler erhöht, die auch Unterschiede im Versuchsablauf miteinbeziehen (BRYANT et al.

2011, HUMMERT 2014). Hierzu zählen beispielsweise geringfügige Abweichungen in der Anzahl ausgesäter

Zellen, sowie der Zeitpunkt des letzten Mediumwechsels vor Beginn des Versuchs (GSTRAUNTHALER und

LINDL 2013, SCHMITZ 2011).

Auf die technische Varianz wirkt sich dagegen vor allem die Methodik von der Probenisolation bis zum

PCR-Ergebnis aus. Hierzu zählen neben der Probenisolation und Lagerung der RNA-Proben auch die Qualität

und Quantität der isolierten RNA (FLEIGE et al. 2006). Daneben haben sowohl geringfügige

Konzentrationsunterschiede, beispielsweise durch Pipettierfehler, als auch Temperaturabweichungen

während der RT-Reaktion oder der qPCR im Opticon II-Cycler Einfluss auf die Effizienz dieser Verfahren. Um

die technischen Fehler zu minimieren, wurde zum einen die RNA-Qualität mit Hilfe des

Absorptionsverhältnisses A 260/A 280 spektralphotometrisch beurteilt. Zum anderen wurde durch den

Einsatz von 3 technischen Replikaten jedes biologischen Replikats und durch die für jede qPCR

durchgeführten Kontrollen die Effizienz der PCR (Darstellung der Fluoreszenzintensität der dsDNA in

Abhängigkeit von der Zahl der PCR-Zyklen, Schmelzkurvenanalyse des PCR-Produkts, Standardgraph für den

Plasmidstandard, siehe Kap. 3.1.2.2 ) überprüft (BUSTIN 2009, HUTH 2012).

5.1.2 Einsatz spezifischer Antikörper für den Nachweis großer Strukturproteine

Für den Nachweis von Proteinen mittels Immunzytochemie oder Western Blot stehen heute viele

spezifische Antikörper zur Verfügung. Die Einführung des Phage Display Verfahrens und die Etablierung von

Antikörper-Bibliotheken machen es möglich, Antikörper für fast jedes Antigen zu kreieren. Dabei sind auch

früher als schwierig betrachtete Zielproteine, wie Proteine an der Oberfläche der Zellen und große

Strukturproteine in den Fokus geraten (WILDT 2000). Die speziell in der Analytik großer Strukturproteine

mit Hilfe der Antikörper erreichte Sensitivität und Qualität unterliegt Schwankungen (WILDT 2000). Dies

trifft auch auf die gegen Kollagen Typ I und II sowie Aggrekan gerichteten Antikörper zu, die im Rahmen

dieser Arbeit verwendet wurden.

5.1.2.1 Einsatz spezifischer Antikörper für den Nachweis großer Strukturproteine in der

Immunzytochemie

Im Bereich der Immunzytochemie zeigten sich unterschiedlich starke immuno-positive Reaktionen bei

Einsatz der anti-Kollagen Typ I- und anti-Kollagen Typ II-Antikörper. Hierfür kommen neben der Detektion

von tatsächlichen Unterschieden in der Konzentration der beiden Kollagentypen weitere Ursachen in

Betracht. Dem Versuchsaufbau entsprechend wurde der immunzytochemische Nachweis der Expression

der Chondrozyten in Abhängigkeit von der Länge der Kultivierungszeit zu verschiedenen Zeitpunkten

durchgeführt. Somit können eine unterschiedliche Kinetik der Antikörperbindung durch unterschiedliche

Umgebungstemperaturen oder Unterschiede in der Qualität der Strep-ABC-Lösung bzw. DAB-Lösung als

Einflussfaktoren auf die Stärke der immuno-positiven Reaktionen nicht ausgeschlossen werden. Mit Hilfe

der für jeden Zeitpunkt mitgeführten Negativkontrollen lässt sich sowohl eine unspezifische Bindung des

Sekundärantikörpers als auch eine Kontamination während des Verfahrens ausschließen (MATZ 2003).

5 Diskussion

80

5.1.2.2 Einsatz spezifischer Antikörper für den Nachweis großer Strukturproteine im Western

Blot

Die Schwankungen der Umgebungstemperaturen oder die Qualität der verwendeten Lösungen spielen bei

der Verwendung der Antikörper im Western Blot keine Rolle, da das Verfahren zum einen mit den beiden

PVDF-Membranen simultan durchgeführt wurde und zum anderen grundsätzlich nur die auf einer

Membran detektierten Signale miteinander verglichen wurden. Dennoch zeigten sich Unterschiede in der

Stärke der einzelnen detektierten Banden, die nicht unbedingt auf die Versuchsbedingungen zurückgeführt

werden können, sondern auch in der Spezifität und Sensitivität der Antikörper begründet liegen (WILDT

2000). Hierbei sind Unterschiede in der Stärke des detektierten Signals insbesondere auf Abweichungen der

eingesetzten Proteinmenge zurückzuführen, die sich auch durch die erneute Messung der

Proteinkonzentration direkt vor der SDS-PAGE nicht vermeiden ließen (TAYLOR et al. 2013, TAYLOR und

POSCH 2014). Aufgrund dessen erfolgte die Betrachtung der jeweiligen Proteinexpression relativ zu der des

Referenzproteins β-Aktin (MAHMOOD und YANG 2012, FERGUSON et al. 2005). Dennoch birgt die

Ungenauigkeit der Messung der im Western Blot eingesetzten Proteinmenge einen Unsicherheitsfaktor,

welcher bei der Evaluierung der erhaltenen Ergebnisse berücksichtigt werden sollte (TAYLOR und POSCH

2014).

Bei der Durchführung des Western Blots für Kollagen Typ I und II sowie Aggrekan wurde β-Aktin als

Referenzprotein verwendet und angenommen, dass dessen Expression durch die Versuchsbedingungen

nicht beeinträchtigt wird. Für dieses kleine Protein war mit dem hierfür genutzten Antikörper eine einzelne

spezifische Bande detektierbar, die abgesehen von den Randbereichen der PVDF-Membran und dem

Ausfall des Signals in einem Fall eine gleichmäßige Lumineszenz-Intensität (LI) innerhalb der Bande aufwies.

In den Anweisungen des Herstellers des anti-β-Aktin Antikörpers wird das Signal bei 42 kDa erwartet und

wurde in den Versuchen dieser Arbeit bei dieser Molekülgröße auch detektiert. Grundsätzlich

unterschiedlich stellt sich das für die großen Strukturproteine Kollagen Typ I und II sowie Aggrekan

detektierte Signal dar. Mit Hilfe der für diese Proteine verwendeten Antikörper waren jeweils mehrere

Banden nachweisbar.

Im Gegensatz zum anti-β-Aktin-Antikörper wurden die Daten über die Spezifität der Banden des anti-

Kollagen Typ I-Antikörpers seitens des Herstellers nicht mit Hilfe eines Zell- oder Gewebelysats sondern mit

Hilfe des aufgereinigten Immunogens erhoben. Somit wird laut Herstellerinformation keine Aussage zu

weiteren Banden und deren Spezifität getroffen. Neben der laut Herstellerinformation erwarteten Bande

bei 38 kDa waren in den Versuchen dieser Arbeit weitere Banden bei 50, 60, 120, 170 kDa detektierbar. Die

erwartete Bande bei 38 kDa stellt das C-terminale Propeptid (NC1) (Immunogen) dar, welches nach der

Formation der Tripelhelix vom Prokollagen I entfernt wird (EYRE 1980, KOIVULA et al. 2012). Seine

Konzentration trifft somit eine Aussage über die momentane Kollagen Typ I Synthese der Chondrozyten.

Daneben wird auch das N-terminale Propeptid (etwa 15-20 kDa) von der prematuren α2(I)-Kette (130 kDa)

abgespalten, sodass für die mature α2(I)-Kette ein Molekulargewicht von 70-90 kDa verbleibt, wobei die

Angaben über die Molekulargewichte der Varianten der α2(I)-Kette in der Literatur schwanken (BORNSTEIN

und SAGE 1980, FESSLER und FESSLER 1978, GOLDBERG et al. 1972, KOIVULA et al. 2012). Daneben weisen

große Proteine, welche wie die α-Kollagenketten posttranslational Hydroxylierungen und Glykosilierungen

erfahren haben, in der SDS-PAGE und im Western Blot eine Diskrepanz zwischen erwartetem und

detektiertem Molekulargewicht auf (GELSE 2003, COSMA 1998). Unter Berücksichtigung dieser

Abweichungen kann die 120 kDa Bande als premature α2(I)-Kette angesehen werden, die auch

5 Diskussion

81

KNEIßEL (2003) als solche identifizieren konnte. Die Bande, welche bei 50 kDa detektiert wurde, stellt am

ehesten ein Abbauprodukt der α2(I) Kette dar, wie von WU et al. (1991) für die α2(IX) Kette beschrieben.

AIMES und QUIGLEY (1995) erhielten wie in dieser Arbeit ein Abbauprodukt, welches nach gezieltem Abbau

des Kollagen Typ I durch MMPs bei etwa 60 kDa nachweisbar war. Eine Begründung für das Auftreten der

Bande bei 170 kDa konnte nicht gefunden werden, sodass diese als unspezifisch betrachtet wurde. Somit

konnte die zum jeweiligen Versuchszeitpunkt vorhandene Kollagen Typ I-Synthese der Chondrozyten durch

das Lumineszenzsignal der bei 38, 50 und 120 kDa detektierten Banden wiedergegeben werden.

Der anti-Kollagen Typ II-Antikörper wurde wie der anti-Kollagen Typ I-Antikörper an der aufgereinigten

α1(II)-Kette getestet, wobei seitens des Herstellers keine Angaben zum Molekulargewicht der zu

erwartenden Bande vorliegen. Die im Rahmen dieser Arbeit für Kollagen Typ II detektierten Banden liegen

bei 65 und 70 kDa. In der Literatur variieren die Angaben bezüglich der Molekulargewichte der von der

prematuren α1(II)-Kette (140 kDa) abzuspaltenden Propeptide von 23-36 kDa (C-terminal) und 13-25 kDa

(N-terminal) (BURGESON und HOLISTER 1979, EYRE et al. 2003, FESSLER und FESSLER 1978, RUSSEAU et al.

2004). Dagegen wiesen FUKUI et al. (2001) für das N-terminale Propeptid der immaturen α1(IIA)-Kette

sogar ein Molekulargewicht von ca. 45 kDa nach. In ihren Untersuchungen wurde auch deutlich, dass die

N-terminalen Propeptide der α1(II)-Kette nach ihrer Abtrennung von dem tripelhelikalen Teil in der Lage

sind, sich zu Polymeren zusammen zu lagern, die als solche im Western Blot nachgewiesen wurden. Auf

diese Weise ist die in den Versuchen detektierte Bande bei 70 kDa durch ein Dimer N-terminaler

Propeptide erklärbar. Das Phänomen der Polymerbildung existiert auch für die abgespaltenen C-terminalen

Propeptide, sodass MIOSGE et al. (2004) die von ihnen detektierten Doppelbanden zwischen 69 und 79 kDa

mit Dimeren und Trimeren C-terminaler Propeptide erklärten, wobei die kleinere Bande bereits bei 65 kDa

detektiert wurde (DODGE und POOLE 1989). Daher kann das Lumineszenzsignal der detektierten Banden

bei 65 und 70 kDa als geeignet angesehen werden, die zum jeweiligen Versuchszeitpunkt vorliegende

Kollagen Typ II-Synthese der Chondrozyten widerzuspiegeln.

Der anti-Aggrekan-Antikörper wurde wie der gegen Kollagen Typ I gerichtete ebenfalls am aufgereinigten

Immunogen getestet. Der Antikörper erkennt eine Aminosäuresequenz der G3-Domäne des Aggrekan und

zeigt laut Herstellerinformation im Western Blot mehrere Banden, wobei Angaben über deren

Molekulargewicht fehlen. Das Molekulargewicht des Gesamtproteins Aggrekan beträgt 350 kDa. Im

Western Blot werden neben der Detektion des Gesamtproteins häufig sowohl die einzelnen Domänen als

auch deren kleinere Fragmente nachgewiesen (HANDLEY et al. 2001, OSHITA et al. 2004, SANDY und

VERSCHAREN 2003). Die im Rahmen dieser Arbeit bei 45 kDa und 65 kDa detektierten Fragmente der

G3-Domäne entstehen durch Proteolyse des Aggrekan (HANDLEY et al. 2001). Hierfür kommen ADAMTS

und MMPs in Frage, jedoch auch Proteasen, die durch die Proteaseinhibitoren während der

Probenbearbeitung unzureichend inhibiert wurden. Weiterhin spielen auch die während der

Probenisolation oder der SDS-PAGE verwendeten Lösungen bei der Entstehung dieser kleineren

detektierten Fragmente eine Rolle (KIANI et al. 2002, OSHITA et al. 2004, SANDY und VERSCHAREN 2003,

STRUGLICS et al. 2006). Somit wird in Anlehnung an die von LEE et al. (2002) isoliert nachgewiesene

G3-Domäne des Aggrekan bei 48 und 72 kDa und unter Berücksichtigung der starken Glykosilierung des

Proteins angenommen, dass die in dieser Arbeit nachgewiesenen Banden bei 45 und 65 kDa die Expression

von Aggrekan wiedergeben.

Die Bedeutung der Methoden SDS-PAGE und Western Blot in der Proteinanalytik und der dabei

verwendeten spezifischen Antikörper hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen. Sie haben sich zu

5 Diskussion

82

einem wichtigen molekularbiologischen Werkzeug weiterentwickelt, welches die Expression der Zellen

nicht nur auf Grundlage des Transkriptoms sondern auch auf Proteinebene zugänglich macht. Auch wenn

diese Methoden empfindlich von der Spezifität und Sensitivität der Antikörper abhängen, die bei der

Auswertung der mit ihnen gewonnenen Ergebnisse beachtet werden sollten, so bieten sich momentan

kaum vergleichbare Alternativen für die Proteinanalytik (TAYLOR et al. 2013, TAYLOR und POSCH 2014,

WILDT 2000).

5.1.3 Einsatz statistischer Methoden in einer Pilotstudie mit geringem Stichprobenumfang

Die statistische Analyse von Untersuchungsergebnissen mit geringem Stichprobenumfang ist kritisch zu

hinterfragen. Eine Überinterpretation der Ergebnisse einer Pilotstudie sollte verhindert werden, wobei

gleichzeitig eine Aussage über den notwendigen Umfang späterer Untersuchungen anzustreben ist.

Daher wurde in dieser Pilotstudie auf die Untersuchung der Unterschiede auf Signifikanz verzichtet.

Stattdessen wurden der Unterschied der Mittelwerte, die Standardabweichung der biologischen Replikate

und der Stichprobenumfang in die statistische Analyse der Ergebnisse unterschiedlicher Bedingungen

einbezogen, um die statistische Power (P) der Ergebnisse zu ermitteln. Neben der Analyse der

Einzelergebnisse wurden diese anschließend in Gruppen mit ähnlichen Versuchsbedingungen, bei denen

auch im Vorfeld kaum Unterschiede zu erwarten waren, zusammengefasst und mit Hilfe der höchsten

aufgetretenen Standardabweichung der Ergebnisse die P berechnet. Anschließend wurde der

Stichprobenumfang eines Versuchs errechnet, welcher in Folgeversuchen zur Erhöhung der statistischen P

bei einem Alpha-Fehler von 0,05 auf 80% führen würde. Nur in den Fällen, in denen die P mehr als 80% bei

Gruppierung der Ergebnisse erreichte, wurde in dieser Arbeit eine Untersuchung der Unterschiede auf

Signifikanz (ANOVA, Signifikanzniveau <0,05) durchgeführt.

Um statistisch auswertbare Daten zu erhalten, wären abhängig von den Versuchsbedingungen 2-9

biologische Replikate ausreichend, um eine P von 80 % zu erreichen und sinnvolle Analysen in Hinblick auf

die Signifikanz der erreichten Unterschiede durchführen zu können. Für die Untersuchungen bei

atmosphärischem Druck, welche die Kollagenexpression betrachten, wären n=2 ausreichend; für solche, die

Aggrekan betrachten, dagegen n=9, da diese einer höheren Standardabweichung unterlagen. Diese

Bedingungen wurden unter Berücksichtigung der Gruppierung der Ergebnisse in dieser Arbeit erfüllt. In

Bezug auf Versuche mit erhöhter Druckbelastung sollte für Untersuchungen der Kollagenexpression n=9

gewählt werden. Hierbei wäre die Betrachtung der Aggrekanexpression ebenfalls ausreichend

berücksichtigt, da für eine P von 80 % n=5-8 ausreichend wären. Diese Kriterien wurden für einige

Ergebnisse dieser Arbeit, auch bei einer Gruppierung der Ergebnisse, nicht erfüllt.

Spätere Versuche sollten zusätzlich berücksichtigen, dass sich Unterschiede in der Höhe der Genexpression

bereits zwischen verschiedenen Proben der gleichen Passage ergeben können. Daher wären

Versuchswiederholungen mit verschiedenen Proben der gleichen Passage empfehlenswert, um die

Vergleichbarkeit der Versuchsergebnisse, die mit verschiedenen Proben der gleichen Passage stattfinden,

zu gewährleisten. Für eine standardisierte Aussage sollten auf diese Arbeit aufbauende Versuche eine

Wiederholung unter gleichen Versuchsbedingungen mit weiteren Primärkulturen beinhalten.

5 Diskussion

83

5.2 Diskussion der Ergebnisse

5.2.1 Einfluss der Kultivierungszeit auf in-vitro-kultivierte Chondrozyten

Im Rahmen der In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten werden neben morphologischen Veränderungen

auch Unterschiede in der Gen- und Proteinexpression dieser Zellen beschrieben. Diese Unterschiede

betreffen zum einen die Expression des COL1A1-Gens, welche bedingt durch die Ausbildung von

Stressfasern in vitro bereits ab der ersten Passage wesentlich höher liegen soll als in vivo (HARDMEIER et al.

2009, TEW et al. 2008, ZEIFANG, 2010). Im Gegenzug wurde ein Absinken der Expression spezifischer Gene

des hyalinen Knorpels, wie beispielsweise jener für Kollagen Typ II und Aggrekan, beobachtet (SCHULZE-

TANZIL 2009, ZEIFANG 2010).

Ein Ziel dieser Arbeit war, zu überprüfen, ob sich der in der Literatur beschriebene progressive Verlust

typischer chondrogener Eigenschaften im Rahmen eines längeren Kultivierungszeitraums relativiert und ob

sich innerhalb dieses Kultivierungszeitraums ein geeigneter Zeitpunkt für die Untersuchungen in-vitro-

kultivierter Chondrozyten unter erhöhten Druckbedingungen finden lässt.

5.2.1.1 Einfluss der Kultivierungszeit auf die Morphologie in-vitro-kultivierter Chondrozyten

Ab dem Zeitpunkt, da frisch isolierte Chondrozyten einer Primärkultur erstmals in Zellkulturgefäßen

anhaften und sich zu teilen beginnen, wird ein Prozess in Gang gesetzt, der die Morphologie und das

Expressionsmuster der Zellen verändert. Der im Rahmen dieser Dedifferenzierung stattfindende

progressive Verlust des chondrogenen Phänotyps verläuft bezüglich des Expressionsmusters über mehrere

Passagen, wohingegen die runde Zellmorphologie nicht über die erste Passage hinaus erhalten bleibt

(TEW 2008). Stattdessen lassen sich in-vitro-kultivierte Chondrozyten morphologisch als bipolare,

spindelförmige Zellen beschreiben, welche nach erfolgter Adhärenz Zell-Zell-Kontakte ausbilden. Bei

längerer Kultivierungszeit (ab 4. Kulturtag) zeigt sich eine optische Zunahme der Zell-Zell-Kontakte zu

benachbarten Zellen (SCHULZE-TANZIL 2009). Da sich in den Versuchen dieser Arbeit bei einer Kultivierung

über den 4. Kulturtag hinaus die von SCHULZE-TANZIL (2009) beschriebene bipolare Zellmorphologie nicht

änderte und abgesehen von einer Verdichtung der Chondrozyten im Monolayer keine phasenkontrast-

mikroskopisch sichtbaren Veränderungen der in-vitro-kultivierten Chondrozyten auftraten, erscheint die

alleinige Betrachtung morphologischer Kriterien ungeeignet, um den Einfluss der Kultivierungszeit auf in-

vitro-kultivierte Chondrozyten zu untersuchen.

5.2.1.2 Einfluss der Kultivierungszeit auf die Aggrekan-, Kollagen Typ I- und Kollagen Typ II-

Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten

Im Rahmen der qualitativen Untersuchungen in-vitro-kultivierter Chondrozyten in Abhängigkeit von deren

Kultivierungszeit konnte deren Expression von Kollagen Typ I- und Kollagen Typ II mittels Immunzytochemie

nachgewiesen werden. Dabei war die durch die Ausbildung von Stressfasern bedingte hohe Expression des

Kollagen Typ I (Hardmeier et al. 2009, TEW et al. 2008) qualitativ analog zu den Ergebnissen von

DOMM et al. (2002) über den gesamten untersuchten Kultivierungszeitraum (4.-35. Kulturtag) nachweisbar.

Im Gegensatz zur vorgenannten Studie (DOMM et al. 2002) zeigten in-vitro-kultivierte Chondrozyten dieser

Arbeit die von SCHULZE-TANZIL (2009) und ZEIFANG (2010) beschriebene Expression knorpelspezifischer

Proteine, wie beispielsweise Kollagen Typ II, vom 4.-21. Kulturtag.

Die quantitativen Untersuchungen dieser Arbeit liefern Aussagen über die Änderung der Aggrekan-,

Kollagen Typ I- und Kollagen Typ II-Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten in Abhängigkeit von deren

5 Diskussion

84

Kultivierungszeit. Analog zu den Ergebnissen von TEW et al. (2008) zeigten auch die in dieser Arbeit

kultivierten Chondrozyten zunächst (1.-3. Kulturtag) eine hohe Expression von COL1A1-Genen, wohingegen

spezifische Gene des hyalinen Knorpels, wie COL2A1 und Aggrekan, herunterreguliert vorlagen. Bei längerer

Kultivierung (ab 4. Kulturtag) lag die Expression knorpelspezifischer Gene signifikant höher als an den

ersten Kulturtagen und blieb auch bei längerer Kultivierung (bis 35. Kulturtag) auf diesem Niveau. Dabei fiel

auf, dass die Expression des Kollagen Typ II nach dem initial niedrigen Ausgangswert der ersten 3 Tage am

Tag 4 einen deutlich stärkeren Anstieg aufwies als Kollagen Typ I und die Reduktion der Expression des

Kollagen Typ II am 7. Tag im Vergleich zu Kollagen Typ I geringer ausfiel. Dieses führte dazu, dass sich die

Expression des Kollagen Typ II an die des Kollagen Typ I anglich, um am Tag 21 sogar höhere Werte als

dieser zu erreichen. Das knorpelspezifische Kernprotein Aggrekan, welches etwa im Verhältnis 1:3 zu den

Kollagen Typ II-Fasern im hyalinen Knorpel vorliegt (BUCKWALTER et al. 2005, SCHULZ und BADER 2007),

blieb in seiner Expression in vitro insgesamt deutlich hinter jener der beiden Kollagentypen zurück. Es

erreichte für keinen der Kultivierungszeitpunkte eine ähnlich hohe Expression wie die beiden untersuchten

Kollagentypen, sodass sich in vitro ein Verhältnis Aggrekan zu Kollagen Typ II von 1:320 (berechnet für

7. Kulturtag, 1 bar) ergab.

Insgesamt kann davon ausgegangen werden, dass die Synthese knorpelspezifischer Bestandteile der ECM

zunächst zeitweilig zu Gunsten der Zellteilung in den Hintergrund tritt (GSTRAUNTHALER und LINDL 2013,

SCHULZE-TANZIL 2009, TEW et al. 2008). Anfänglich stand für die frisch ausgesäten, sich schnell teilenden

Chondrozyten die Anpassung an die Bedingungen der Zellkultur im Vordergrund und somit vornehmlich die

Synthese des Kollagen Typ I, welches am Aufbau und an der Ausrichtung des Zytoskeletts, sowie an der

Bildung von Stressfasern beteiligt ist (HARDMEIER et al. 2009, ZEIFANG, 2010). Durch die Zunahme der

Kontakte der Zellen untereinander herrschen Bedingungen, die dem Stadium der Chondroprogenitorzellen

im Anschluss an den Kondensationsprozess entsprechen (GOLDRING et al. 2006, GOLDRING 2012, SINGH

und SCHWARZBAUER (2012). Dieses liefert eine Erklärung dafür, dass zu diesem Zeitpunkt eine

Hochregulierung der Gene für Kollagen Typ II und Aggrekan stattfand und das dabei erreichte

Expressionslevel auch bei langer Kulturzeit aufrechterhalten wurde. Gleichzeitig unterblieb jedoch die für

dieses Stadium typische Herunterregulierung der Gene des Kollagen Typ I bei der Langzeitkultivierung

(4.-35. Kulturtag). Als Ursache hierfür kommen zum einen die weiterhin stattfindenden Zellteilungen in

Betracht, zum anderen erfordert die stetige Entfernung des extrazellulär abgegebenen Kollagen Typ I mit

jedem Mediumwechsel dessen Neusynthese. Hinzu kommt, dass die Mediumwechsel-bedingte Entfernung

der in den Extrazellularraum abgegebenen ECM ein Auseinanderrücken der Chondrozyten verhindert.

Hierdurch werden die Zell-Zell-Kontakte durch die Synthese einer chondrozytenspezifischen ECM nicht, wie

in vivo im Stadium der Chondroprogenitorzellen wieder zurückgebildet, sondern bleiben in vitro auch bei

längerer Kultivierung erhalten (GOLDRING et al. 2006, GOLDRING 2012, SCHULZE-TANZIL 2009). Durch den

in vivo typischen Abfall der TGF-1-Konzentration der Chondroprogenitorzellen im Kondensationsstadium

entfällt dessen hemmender Einfluss auf die Expression der COL1A1-Gene, sodass die Synthese des Kollagen

Typ I aufrechterhalten wird. Gleichzeitig führt dieses Absinken der TGF-1-Konzentration zu einer höheren

Empfindlichkeit der Zellen gegenüber den Zytokinen IGF-1 und FGF-2, die für den Anstieg der

Genexpression des chondrozytenspezifischen Kollagen Typ II und Aggrekan verantwortlich sind

(SCHULZE-TANZIL 2009).

Die stetige Entfernung neu gebildeter ECM liefert auch eine Erklärung für die Detektion annähernd

einheitlicher Proteinexpressionen des Kollagen Typ I und II sowie des Aggrekan zu den verschiedenen

5 Diskussion

85

Zeitpunkten im Western Blot. Da beide Kollagentypen sowie auch Aggrekan hauptsächlich in den

Extrazellularraum sezerniert vorkommen, wurden die α-Ketten der Kollagene und die G3-Domäne des

Aggrekan in hohem Maße auch dort nachgewiesen (MARLOVITS und VÉCSEI 2000). Der Mediumwechsel

verhindert offenbar die Anreicherung der extrazellulären Proteine, sodass eine deutliche Zunahme

chondrozytenspezifischer ECM über den Zeitverlauf der Kultur nicht nachgewiesen wurde. Stattdessen sind

für die Unterschiede in der Proteinexpression des Kollagen Typ I am ehesten Unterschiede der einzelnen

Proben zwischen letztem Mediumwechsel und Probengewinnung entscheidend (GSTRAUNTHALER und

LINDL 2013) und daneben die in Kap. 5.1.2.2 genannten Abweichungen durch die Sensitivität und Qualität

der Antikörper. Aufgrund der Höhe der Unterschiede in der mRNA-Expression der einzelnen untersuchten

Kulturtage, ein Erreichen eines detektierbaren Unterschieds, für welchen ein Unterschied der

Proteinexpression von 30-40 % erforderlich ist, nicht zu erwarten.

Die Ergebnisse des Western Blots lieferten zusätzliche Hinweise darauf, dass die in-vitro-kultivierten

Chondrozyten nicht in ein Entwicklungsstadium übergehen, welches die Knorpelentwicklung mit der

Knochenbildung verbindet und somit entdifferenzieren. Vielmehr ist anzunehmen, dass es sich bei der im

Rahmen dieser Arbeit für Kollagen Typ II bei 65 kDa detektierten Proteinbande um das von FUKUI et al.

(2001) beschriebene Dimer des N-terminale Propeptids der immaturen α1(IIA)-Kette des Kollagen Typ II bei

60-65 kDa handelt, die von Chondroprogenitorzellen exprimiert wird. Die Chondrozyten vollziehen somit

durch die In-vitro-Kultur in ihrer Entwicklung eher „einen Schritt zurück“ ausgehend von den Chondrozyten

hin zu Zellen mit Merkmalen des Stadiums der Chondroprogenitorzellen. Eine angestrebte

Redifferenzierung der Zellen sollte somit nicht darauf abzielen, ein bereits durchlaufenes

Entwicklungsstadium wieder zu erreichen, sondern Methoden zu entwickeln, die eine gerichtete

Weiterdifferenzierung der Zellen unterstützen, um somit deren Expression in Richtung einer

chondrozytenspezifischen ECM zu lenken, die in der Lage ist, in vivo die Stabilität und Integrität des

hyalinen Knorpels zu garantieren.

Entsprechend der Expressionslevel der in dieser Arbeit kultivierten Chondrozyten sollte das von BARLIČ et

al. (2008) als Index für die Dedifferenzierung in-vitro-kultivierter Chondrozyten etablierte Verhältnis von

Kollagen Typ I zu Typ II sowie von Aggrekan zu Versikan kritisch betrachtet werden, insbesondere da es als

ein für die jeweilige Passage der Zellen fest stehender Parameter angesehen wird. Während der

Dedifferenzierungs-Index für Kollagen Typ I/II der im Rahmen dieser Arbeit kultivierten Chondrozyten

insbesondere an den ersten 3 Kulturtagen deutlich zu Gunsten des Kollagen Typ I ausfiel, glich sich die

Expression der beiden Kollagentypen bei längerer Kultivierung einander an. Da die Zunahme der Expression

des Aggrekan mit der des Kollagen Typ II zusammenfällt, ist ein ähnliches Verhalten des Dedifferenzierungs-

Index für Aggrekan/Versikan zu erwarten. Die von BARLIČ et al. (2008) beschriebene Zunahme der

Dedifferenzierung durch Herunterregulierung der Gene für Kollagen Typ II und Aggrekan bei längerer

Kultivierungszeit steht im Kontrast zu den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen. Hierfür kommen

verschiedene Ursachen in Betracht. Zum einen wurden im Rahmen dieser Arbeit Zytokine wie IGF-1 und

FGF-2, die in vivo für die Synthese und Sekretion von Kollagen Typ II und Aggrekan verantwortlich sind, dem

Kulturmedium zugesetzt, zum anderen ein langes Mediumwechsel-Intervall (3-4 Tage) genutzt

(GOLDRING et al. 2006, GOLDRING 2012). Während ersteres die Synthese der Chondrozyten in Richtung

einer chondrozytenspezifischen ECM lenkt, vermag letzteres diese im Extrazellularraum länger

aufrechtzuerhalten, wodurch Kulturbedingungen geschaffen werden, welche der Situation in vivo näher

kommen.

5 Diskussion

86

Die Abhängigkeit des Expressionsmusters und somit des Ausmaßes der Dedifferenzierung

in-vitro-kultivierter Chondrozyten von der Kultivierungszeit ist bei der Planung von Versuchen zu

berücksichtigen. Folglich ist im Sinne der Optimierung des Zellkultursystems die Nutzung

in-vitro-kultivierter konfluenter Chondrozyten für die Untersuchung der Effekte modifizierter

Druckbedingungen sinnvoll, sodass die in dieser Arbeit geplanten Untersuchungen unter erhöhten

Druckbedingungen an optisch konfluenten Chondrozyten der Passage 6 bei einer Vorkultivierungszeit von

6 Tagen ohne Druck durchgeführt wurden. Hierbei wurde auch die geringere Standardabweichung der

PCR-Ergebnisse bei 7 Tagen verglichen mit der bei 4 Tagen berücksichtigt. Da die Chondrozyten nach

Erreichen der optischen Konfluenz bei weiterer Kultivierung (14, 21, 35 Tage) keine Regelmäßigkeit in der

Expression des Kollagen Typ I, II sowie des Aggrekan bei gleichzeitig vorhandener hoher Varianz erkennen

ließen, kann die Nutzung einer Langzeitkultur der Chondrozyten für weitere Versuche nicht empfohlen

werden.

5.2.2 Einfluss nutritiver Faktoren auf die Vitalität in-vitro-kultivierter Chondrozyten

Der Einfluss des Intervalls des Mediumwechsels auf die Kultur der Chondrozyten wurde untersucht, bevor

diese bei modifizierten Druckbedingungen kultiviert wurden. Dies geschah vor dem Hintergrund, die

Beeinflussung der unter erhöhtem Druck stattfindenden Versuche durch nutritive Faktoren möglichst

gering zu halten.

Durch den Stoffwechsel der Chondrozyten ändern sich die Kulturbedingungen fortwährend. Die

Konzentration der Nährstoffe (Glucose, Aminosäuren) im Medium sinkt stetig ab, wohingegen es zu einer

Anreicherung der Stoffwechselendprodukte (Lactat, Ammoniak) kommt. Dadurch verschieben sich der pH-

Wert des Mediums und der Redoxstatus der Zellen. Diese Veränderungen der Zusammensetzung des

Mediums verlaufen zwischen zwei Mediumwechseln kontinuierlich, wohingegen die Chondrozyten zum

Zeitpunkt des Mediumwechsels eine plötzliche Änderung der Kulturbedingungen erfahren

(GSTRAUNTHALER und LINDL 2013). Da die Abnahme der Nährstoffkonzentration und die Zunahme der

Stoffwechselendprodukte im Medium mit der Proliferation der kultivierten Zellen korreliert, sollte der

Mediumwechsel in schnell wachsenden Zellkulturen, zu denen die Chondrozyten zählen, alle 2 Tage

erfolgen (GSTRAUNTHALER und LINDL 2013, TEW et al. 2008). Um eine längere Kultivierung der

Chondrozyten im Bioreaktor bei konstanten Druckbedingungen zu ermöglichen, wurde das Medium der

Chondrozyten zunächst unter atmosphärischem Druck in längeren Abständen erneuert. Dabei zeigte sich,

dass bei einem Mediumwechsel nach bis zu 4 Tagen die Vitalität der Chondrozyten unverändert war. Erst

bei weiterer Verlängerung des Intervalls zwischen zwei Mediumwechseln wurde die Zellausbeute geringer

und die Mortalität der Zellen nahm zu. Der von GSTRAUNTHALER und LINDL (2013) als Indikator für den

Zeitpunkt des Mediumwechsels angeführte Farbumschlag des Mediums durch dessen pH-Wert-Änderung

lässt sich für das verwendete CBM+ Medium nicht nutzen. Der Farbumschlag dieses Mediums fand erst am

7. Kulturtag und somit zu einem Zeitpunkt statt, an dem bereits deutliche negative Effekte auf die Vitalität

der Chondrozyten nachweisbar waren.

Diesen Untersuchungen entsprechend wurde in dieser Arbeit das Medium der Chondrozyten nach 3-4

Tagen gewechselt, da bei diesem Intervall keine negativen Effekte auf die Vitalität und somit die

Syntheseleistung der Chondrozyten zu erwarten waren.

5 Diskussion

87

5.2.3 Einfluss hydrostatischen Drucks auf in-vitro-kultivierte Chondrozyten

Durch die belastungsbedingte Umverteilung von Wasser innerhalb des Gelenkknorpels erfahren auch die

Chondrozyten den auf den hyalinen Gelenkknorpel einwirkenden Druck (WONG und CARTER 2003). Die

zelluläre Transduktion dieser einwirkenden Druckbelastung wird durch Mechanorezeptoren ermöglicht, die

so genannten „connexin hemichannels“ (KNIGHT et al. 2009). Diese versetzen die Chondrozyten in die Lage,

ihre metabolische Aktivität und somit die Expression der Komponenten der ECM zu modifizieren

(BUCKWALTER et al. 2005, GARCIA und KNIGHT 2010, WHITFIELD 2008). Daher zielen In-vitro-Studien

darauf ab, Druckbelastungen zu simulieren, welche die metabolische Aktivität der Chondrozyten und somit

die Zusammensetzung der durch sie synthetisierten ECM optimieren. Hierbei hat sich die Applikation von

hydrostatischem Druck als repräsentativ für die Druckverhältnisse in der Radiärzone des Gelenkknorpels

herauskristallisiert, wobei Scherkräfte, wie sie in vivo auf die Tangentialzone einwirken, unberücksichtigt

bleiben (ELDER 2009). Entsprechend der einfacheren Standardisierung und Durchführbarkeit entstammt

heute ein Großteil der Informationen über die Auswirkungen hydrostatischer Bedingungen auf

Chondrozyten den Untersuchungen in Zell- und Gewebekulturen in Bioreaktoren (GUILAK und MOW 2000,

HARDMEIER et al. 2009, WONG und CARTER 2003). In dem in dieser Arbeit genutzten Bioreaktor wurde der

Druck durch die Kompression einer Gasphase mit entsprechender Weiterübertragung in das die Zellen

umgebende Medium aufgebaut. In dieser Art der Bioreaktorsysteme sind Zeitpunkt, Höhe, Zeitdauer und

Frequenz des einwirkenden Drucks die beeinflussbaren Parameter (SCHULZ und BADER 2007). Mit Hilfe des

für diese Arbeit verwendeten Bioreaktors wurden die Parameter Zeitpunkt, Höhe und Zeitdauer des

einwirkenden Drucks variiert, mit dem Ziel, die metabolische Aktivität der Chondrozyten und somit die

Zusammensetzung der durch sie synthetisierten ECM zu untersuchen.

5.2.3.1 Einfluss hydrostatischen Drucks auf die Morphologie in-vitro-kultivierter Chondrozyten

Analog zu den Ergebnissen von FIORAVANTI et al. (2003) und SMITH et al. (2000) traten auch in dieser

Untersuchung bei kurzen Druckphasen (bis 24 h) keine Veränderungen der bipolaren Morphologie der

Chondrozyten im Vergleich mit den ohne Einwirkung von Druck kultivierten Kontrollen auf. Bei längerer

Dauer der Druckeinwirkung (> 24 h) rundeten sich die Zellen ab und lösten sich schließlich vom Boden der

Zellkulturschale. Dies deutet darauf hin, dass die Synthese der für die Adhärenz der Chondrozyten am

Boden der Kulturschale verantwortlichen Zelladhäsionsmoleküle, wie beispielsweise N-CAMs und

Fibronectin, offenbar nicht in adäquater Menge stattfand (GSTRAUNTHALER und LINDL 2013, SCHMITZ

2011). Im gleichen Zusammenhang traten Zellen auf, die Zeichen von Karyopyknosis und Karyorrhexis sowie

ein Anschwellen des Zytoplasmas aufwiesen. Diese Veränderungen des Kerns und des Zytoplasmas der

Zellen wurden als zytologische Kriterien bezüglich ihres Auftretens im Rahmen des Zelltods herangezogen,

wobei sie den unterschiedlichen Formen des Zelltods im Rahmen der Apoptose, Onkose und Nekrose

zugeordnet wurden (MAJNO und JORIS 1995).

Bei der Apoptose handelt es sich um einen genetisch kontrollierten Prozess, dessen Eintreten durch die

extrazellulären Bedingungen der Zelle modifiziert wird. Hierzu gehören auch physikalische Bedingungen,

wie beispielsweise der einwirkende Druck. Im Rahmen der Apoptose stehen die Kondensation des

Chromatins (Karyopyknosis) und die Abschnürung pyknotischer Bestandteile der Zelle sowie die

Zellschrumpfung im Vordergrund. Im Gegensatz dazu sind die Veränderungen extrazellulärer Bedingungen

der Auslöser der als Onkose bezeichneten Initiation des Zelltods, dem die genetische Kontrolle fehlt.

Pathogenetisch kommt es hierbei zu einem Funktionsverlust membranständiger Adenosintriphosphat

5 Diskussion

88

(ATP)-abhängiger Ionenpumpen und in der Folge zu einem osmotischen Anschwellen der Zellen. Beide

Formen der Initiation des Zelltods führen zur Nekrose, welche morphologisch neben der Karyopyknosis

durch eine Fragmentierung des Zellkerns (Karyorhexis) und dessen Zerfall (Karyolysis) gekennzeichnet ist,

wodurch es letztlich zum Strukturverlust des Zytoplasmas und dessen Zerfall kommt (MAJNO und JORIS

1995).

Als Ursache des auslösenden Funktionsverlusts der Ionenpumpen im Rahmen der Onkose wurden bisher

zumeist die Ischämie-bedingte Verarmung der Zellen an Adenosintriphosphat (ATP), die Hemmung der

Bildung von ATP durch Toxine sowie die Denaturierung der Ionenpumpe (Protein) durch Hitze betrachtet

(MAJNO und JORIS 1995). Daneben ist jedoch auch das druckabhängige Verhalten der Ionenpumpen

in-vitro-kultivierter Chondrozyten untersucht worden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass eine

Druckeinwirkung von 10-50 bar bereits im Bereich von Sekunden bis Minuten in der Lage ist, eine reversible

Inhibition der Ionenpumpen auszulösen (HALL 1999).

Die im Rahmen dieser Arbeit bei langer Kultivierung der Chondrozyten unter hydrostatischem Druck (>24 h)

festgestellten morphologischen Veränderungen können somit auf eine umgebungsbedingte Zellschädigung

im Sinne einer Onkose mit anschließender Nekrose zurückgeführt werden. Als Ursache für die

Zellschädigung kann die von HALL (1999) beschriebene Inhibition der Ionenpumpen durch den

einwirkenden hydrostatischen Druck angesehen werden, welche initial ein osmotisch bedingtes

Anschwellen des Zytoplasmas der untersuchten Chondrozyten auslöst (MAJNO und JORIS 1995). Da die

Anzahl der auf diese Weise veränderten Zellen mit zunehmender Dauer der Kultivierung unter Druck

anstieg, ist denkbar, dass die Hemmung der Ionenpumpen zu lange aufrechterhalten wurde und somit bei

mehr als 24-stündiger Druckeinwirkung zytotoxisch auf die Chondrozyten wirkte. Die Hemmung der

Ionenpumpen scheint jedoch, analog zu den Ergebnissen von Hall (1999), in den überlebenden

Chondrozyten reversibel zu bleiben, da diese sich bei anschließender Kultivierung unter atmosphärischem

Druck zumindest morphologisch normal weiterentwickelten.

Während HALL (1999) bei niedrigerem Druck im Bereich von 1-10 bar eine geringere Hemmung der

Ionenpumpen nachwies, setzte der zytotoxische Effekt des Drucks in den Untersuchungen dieser Arbeit bei

5 bar zeitlich eher ein als bei 10 bar. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass der Druck von 5 bar

deutlich unter dem in vivo intraartikulär wirkenden Druck liegt (BUCKWALTER et al. 2005), sodass eine

adäquate Reaktion der Zellen auf diesen niedrigen Druck nicht zu erwarten war. Da das morphologisch

instabile Verhalten der bei 5 bar kultivierten Chondrozyten in der Zellkultur auch in einer Wiederholung

erhalten blieb, wurde für die weitere Untersuchung des Expressionsmusters bei Variation der

Druckbedingungen eine Druckhöhe von 10 bar favorisiert.

5.2.3.2 Einfluss hydrostatischen Drucks auf die Aggrekan-, Kollagen Typ I- und Kollagen Typ II-

Expression in-vitro-kultivierter Chondrozyten

Die Untersuchung des Einflusses eines erhöhten Drucks auf die Aggrekan-, Kollagen Typ I- und Kollagen

Typ II-Expression erfolgte mittels qPCR und Western Blot. Sie wurde an Chondrozyten bei einer

Vorkultivierungszeit von 6 Tagen (unter Normaldruck) und einer anschließenden maximalen

Kultivierungszeit von 24 h unter erhöhtem Druck im Bioreaktor durchgeführt. Mit dem Ziel, Bedingungen zu

finden, welche die Komposition einer chondrozytenspezifischen ECM positiv beeinflussen, wurden für die

Untersuchung des Einflusses der Druckhöhe des auf konfluente Chondrozyten einwirkenden

hydrostatischen Drucks Druckbelastungen von 5 und 10 bar gewählt, welche physiologischer Weise

5 Diskussion

89

während der normalen Gelenkbewegung erreicht werden (10 bar) oder diese unterschreiten (5 bar)

(IKENOUE et al. 2003).

Während IKENOUE et al. (2003) durch einen hydrostatischen Druck keine Veränderung der Genexpression

chondrozytenspezifischer ECM nachwiesen, zeigen die Ergebnisse dieser Untersuchung analog zu WONG

und CARTER (2003) eine signifikante Zunahme der Expression des Aggrekan durch den einwirkenden Druck,

wohingegen es zu einer signifikanten Abnahme der Genexpression von Kollagen Typ I und II verglichen mit

den Verhältnissen ohne Druck kam. Entsprechend ist bei der Einwirkung hydrostatischen Drucks von 24 h

auf konfluente Chondrozyten eine Steigerung solcher PGs zu vermuten, die auf Aggrekan als Kernprotein

basieren, da dessen Genexpression unter Druck anstieg. Gleichzeitig sank die Expression der kollagenen

Fasern. Eine solche rückläufige Entwicklung der Expression des in vitro überrepräsentierten Kollagen Typ I

ist vorteilhaft, da Kollagen Typ II 90-95% der Kollagenfasern im hyalinen Knorpels stellt, wohingegen

Kollagen Typ I nur in geringem Anteil vorliegt (BUCKWALTER et al. 2005, GELSE et al. 2003). Die

Verminderung der Expression des Kollagen Typ I deutet somit darauf hin, dass die Konzentration der durch

die Chondrozyten in vitro produzierten Stressfasern durch den in diesem Versuch einwirkenden Druck

abnahm (TEW et al. 2008, ZEIFANG et al. 2010). Überträgt man die Situation während der Entwicklung des

Knorpels auf diese Ergebnisse, so ist denkbar, dass die geringe TGF-1-Konzentration der

Chondroprogenitorzellen in vivo, welche die Expression von Kollagen Typ I vermindert, in deren weiterer

Entwicklung, insbesondere nach der Bildung des Gelenkspalts, durch den Gelenkdruck aufrechterhalten

wird (GOLDRING et al. 2006, GOLDRING 2012, FORTIER 2011). Dieser physiologische Druck (10 bar) scheint

bei Einwirkung auf in-vitro-kultivierte Chondrozyten ebenfalls in der Lage zu sein, die TGF-1-Konzentration

zu senken. Hierdurch wäre die niedrigere Kollagen Typ I-Expression der unter Druck kultivierten

Chondrozyten verglichen mit solchen, denen die Druckeinwirkung fehlte, zu erklären (SCHULZE-TANZIL

2009).

Da in vivo auf die das Grundgerüst des hyalinen Knorpels bildenden Kollagen Typ II-Fasern 10-30% und auf

die PGs, welche hauptsächlich auf Aggrekan als Kernprotein beruhen, 3-10 % seines Nassgewichts entfallen,

liegt das Verhältnis Aggrekan zu Kollagen Typ II im hyalinen Gelenkknorpel bei 1:3 (BUCKWALTER et al.

2005, SCHULZ und BADER 2007). Diesem steht in den hier erfolgten Untersuchungen in vitro ein Verhältnis

Aggrekan zu Kollagen Typ II von 1:320 (berechnet für 7. Kulturtag, 1 bar) und somit eine verglichen mit der

Situation in vivo etwa 100-fach höhere Kollagen Typ II-Expression gegenüber, sodass dessen verminderte

Synthese in vitro nicht zwingend als negativer Effekt des Drucks auf die Komposition der ECM in vitro zu

interpretieren ist.

Diese Veränderungen der Chondrozyten auf der Ebene des Transkriptoms ließen sich im Gegensatz zu den

Ergebnissen von IKENOUE et al. (2003) in den Versuchen dieser Arbeit bei 10 bar nachweisen. Die weitere

Reduktion der Höhe des hydrostatischen Drucks auf 5 bar bewirkte ein weiteres Absinken der mRNA für die

kollagenen Fasern, jedoch auch einen höheren Anstieg der mRNA für Aggrekan. Die gegenüber den bei 10

bar kultivierten Chondrozyten erhöhte Aggrekansynthese bei 5 bar deutet eine Zunahme

chondrozytenspezifischer ECM bei geringerem Druck an. Diese Annahme ist in Frage zu stellen, da sie sich

im Wesentlichen auf den Anstieg der Genexpression des Aggrekan bei 5 bar verglichen mit 10 bar stützt,

wobei die hierfür zugrunde liegenden Daten einer hohen Variabilität unterlagen. Daneben ist insbesondere

der Anstieg der mRNA-Expression des knorpelspezifischen Aggrekan in der Analyse des Proteoms bei 5 bar

nicht nachvollziehbar. Vielmehr zeigt sich auf Proteinebene eine deutlich höhere Expression des Aggrekan

bei 10 bar verglichen mit jener bei 5 bar, welche kaum Unterschiede zur Kontrolle zeigte. Neben dieser

5 Diskussion

90

höheren Proteinexpression des Aggrekan lag auch jene der beiden untersuchten Kollagentypen bei 10 bar

verglichen mit 5 bar höher. Die erhöhte Expression des Aggrekan in dieser Untersuchung könnte ebenfalls

mit dem Entwicklungsstadium der Chondroprogenitorzellen in Verbindung gebracht werden, da deren

geringere TGF-1-Konzentration zu einer höheren Empfindlichkeit der Zellen gegenüber den Zytokinen

IGF-1 und FGF-2 führt, welche für den Anstieg der Genexpression der chondrozytenspezifischen

Bestandteile der ECM, wie beispielsweise Aggrekan, verantwortlich sein könnte (FORTIER 2011,

SCHULZE-TANZIL 2009).

Betrachtet man die bei 5 bar in der qPCR und im Western Blot erzielten Ergebnisse im Zusammenhang mit

den bei 5 bar auftretenden morphologischen Veränderungen (Ablösung der Zellen von der Kulturschale),

wird deutlich, dass bei dem unphysiologisch niedrigen Druck von 5 bar das Einstellen der Syntheseleistung

der Chondrozyten im Zuge der Onkose und Nekrose als wahrscheinliche Ursache der geringeren

Kollagenexpression angesehen werden kann. Da sich die Abrundung der Chondrozyten bei 24 h und 5 bar

auch bei der Wiederholung nicht vermeiden ließ, konnte somit die im Vergleich zu 10 bar verringerte

Expression kollagener Fasern auf eine früher einsetzende Nekrose zurückgeführt werden. Daher wurden

die weiteren Untersuchungen bei einer Druckhöhe von 10 bar durchgeführt. Dies geschah vor dem

Hintergrund, Bedingungen zu finden, welche ähnlich hemmende Effekte auf die Kollagenexpression und

fördernde Einflüsse auf die Expression des Aggrekan erreichen wie bei 5 bar und gleichzeitig die Vitalität

der Chondrozyten erhalten.

5.2.4 Kontinuierliche versus diskontinuierliche Druckbedingungen

Die morphologischen Erkenntnisse über die Zytotoxizität der Langzeitkultivierung der Chondrozyten unter

Druck führten zu der Frage, ob die dabei in den Zellen induzierten Signalwege schon zu einem früheren

Zeitpunkt einen negativen Einfluss auf das Expressionsmuster der Chondrozyten im Hinblick auf die

Zusammensetzung der ECM im hyalinen Knorpel zeigen, oder ob dieses erst bei mehr als 24 h Kultivierung

unter Druck der Fall ist. Daher wurde der Zeitraum, innerhalb dessen die Chondrozyten eine

Druckeinwirkung von 10 bar erfuhren, ausgehend von den bisher genutzten 24 h auf 12 h, 6 h, 3 h und 1,5 h

verkürzt.

Hierbei zeigten die bei 10 bar kultivierten Chondrozyten eine etwas geringere Expression der beiden

Kollagentypen verglichen mit den bei atmosphärischem Druck kultivierten Zellen. Trotz der deutlichen

Unterschiede in der Zeitdauer der Druckeinwirkung, der die Chondrozyten ausgesetzt waren, wichen ihre

Kollagenexpressionen sowohl auf der Ebene des Transkriptoms als auch bei Betrachtung des Proteoms

analog zu den Untersuchungen von IKENOUE et al. (2003) kaum voneinander ab. IKENOUE et al. (2003)

wiesen einen Anstieg der Kollagen Typ II-Expression erst bei einer diskontinuierlichen Druckbelastung von

jeweils 4 h Druck an 4 aufeinanderfolgenden Tagen nach. Daneben schlussfolgerten WONG und CARTER

(2003) aus der Untersuchung von Gewebeexplantaten, dass analog zur Situation in vivo die Abhängigkeit

der Kollagenexpression von der Anwesenheit von Scherkräften stärker ist als vom einwirkenden Druck.

Einzig für die Expression des Kernproteins Aggrekan ließ sich in diesem Versuch eine Abhängigkeit der Höhe

seiner Expression von der Dauer der Druckeinwirkung darstellen. So war die Genexpression des Aggrekan

bei kurzer Kultivierung der Chondrozyten unter erhöhtem Druck (<3 h) höher als bei langer Dauer der

Druckeinwirkung, wobei diese Unterschiede auf Proteinebene im Western Blot nicht bestätigt wurden.

Diesen Zusammenhang stellten auch IKENOUE et al. (2003) bei Nutzung eines höheren Drucks für kurz

einwirkende Druckbelastungen heraus. Die erhöhte Expression des Aggrekan ist auch in Zusammenhang

5 Diskussion

91

mit dem von TAKAHASHI et al. (1997) bei kontinuierlichem Druck für 2 h nachgewiesenen Anstieg der

Gesamt-PG-Konzentration zu sehen.

Zusammenfassend stützen die Ergebnisse dieser Arbeit die Hypothese, dass Effekte bezüglich der

Konzentration der PGs in der Regel deutlich stärker ausfallen und schneller erreicht werden als solche auf

die Expression von Kollagen Typ II (TOYODA et al. 2003). Diese Hypothese wird in der Literatur kontrovers

diskutiert. Zum einen, da es im Rahmen der Biodynamik des Gelenkknorpels bei einwirkendem Druck zu

einem Flüssigkeitsausstrom kommt und frühe In-vivo-Untersuchungen Hinweise lieferten, dass ein

Flüssigkeitsverlust ursächlich für eine Verminderung der PG-Synthese ist (BUSCHMANN et al. 1995, GUILAK

und MOW 2000, LUPPA 2000, TAKAHASHI et al. 1997). Andererseits zeigen neuere Studien, dass die bei

moderater Belastung stattfindende physiologische Dickenzunahme des Gelenkknorpels zum Großteil auf

die verstärkte Synthese der PGs zurückgeht (ALFORD 2005, LUPPA 2000). Diese gesteigerte Synthese der

PGs wird maßgeblich durch das Zytokin FGF-2 gesteuert, dessen stimulierende Wirkung mit steigender

Konzentration abnimmt (FORTIER et al. 2011). Es ist denkbar, dass dessen Syntheserate druckabhängig

gesteuert wird und für die bei 1,5 und 3 h Druck vorliegende hohe Expression des Aggrekan verantwortlich

ist. Mit zunehmender Dauer des einwirkenden Drucks kommt es demnach zu einem weiteren Anstieg der

Konzentration des FGF-2, sodass der positive Effekt des kurzzeitig einwirkenden Drucks auf die Expression

des Aggrekan mit zunehmender Dauer seiner Einwirkung wieder rückläufig ist.

Ein Vergleich mit diskontinuierlichen Druckbedingungen ist nur eingeschränkt möglich, da sich die

Ergebnisse solcher Untersuchungen in den genutzten Zellen, den angewendeten Druckbedingungen sowie

in Bezug auf die gewählte Methodik unterscheiden (JORTIKKA et al. 2000, SMITH et al. 1996, TAKAHASHI et

al. 1997). Daneben ist die Abgrenzung diskontinuierlicher hydrostatischer Druckbedingungen, welche durch

die zusätzliche Variable der Frequenz gekennzeichnet sind, von kontinuierlichen hydrostatischen

Druckbedingungen nicht immer klar definiert, sodass die Übergänge mitunter fließend sein können (IKENOE

et al. 2003, SMITH et al. 2000). Auf diese Art betrachtet, weisen die kurzzeitigen Druckbelastungen dieser

Arbeit (1,5 und 3 h) Ähnlichkeiten mit den von IKENOE et al. (2003) und SMITH et al. (2000) genutzten

Bedingungen (4 h pro Tag, bei 1 Tag Kultivierung unter Druck) auf. Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse lässt

schlussfolgern, dass auch unter kontinuierlichen Druckbedingungen eine adäquate Expression von Kollagen

Typ II und Aggrekan erzielt werden kann. Dies ist insofern von Vorteil, als dass Bioreaktoren zur

Generierung eines diskontinuierlichen Drucks wesentlich komplexer in Bezug auf den apparativen Aufwand

und deutlich schwieriger in der Vermeidung eines Eintrags von Verunreinigungen sind als Bioreaktoren,

welche einen kontinuierlichen Druck erzeugen (SCHULZ und BADER 2007). Selbstverständlich kommt eine

zyklische Belastung der Chondrozyten, wie sie in diskontinuierlichen Bioreaktoren erreicht wird, der

Situation in vivo näher. Wenn mit kontinuierlichen Bioreaktoren jedoch vergleichbare Ergebnisse in Hinblick

auf die Synthese des Aggrekan erreichbar sind, bleibt zu untersuchen, ob die zyklische Belastung für die

Untersuchung der Druckwirkung auf in-vitro-kultivierte Chondrozyten wesentlich ist und den enormen

apparativen Aufwand rechtfertigt.

5.2.5 Dedifferenzierung in-vitro-kultivierter Chondrozyten - Anwendbarkeit und Limitation

genutzter Strategien

Die bei der In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten eingesetzten Strategien, um der zellulären

Dedifferenzierung entgegenzuwirken, fanden auch in dieser Arbeit Anwendung (BRITTBERG 1994,

ERGGELET 2003, FRITSCH et al. 1999). Zum einen wurden dem CBM-Medium Zytokine zugesetzt, um mit

5 Diskussion

92

Hilfe von IGF-1 die Synthese und Sekretion von Kollagen Typ II, und durch FGF-2 die Expression von

Aggrekan zu stimulieren (GOLDRING et al. 2006, GOLDRING 2012). Zum anderen wurden die Chondrozyten

in relativ hoher Zelldichte ausgesät, um die Konzentration des Zytokins TGF-1 gering zu halten und die

daraus resultierende höhere Empfindlichkeit der Zellen gegenüber IGF-1 und FGF-2 auszunutzen (SCHULZE-

TANZIL 2009). Mit einer abschließenden Untersuchung sollte der Einfluss einer weiteren Erhöhung der in

die Kulturschalen ausgesäten Chondrozyten beurteilt werden.

In dieser Untersuchung zeigte sich bei doppelter Zelldichte der Chondrozyten verglichen mit in normaler

Zelldichte ausgesäten Chondrozyten eine 1,5-fach höhere Expression des Kollagen Typ I, bei gleichzeitigem

Rückgang der Expression des Kollagen Typ II auf das 0,4-fache. Somit war durch die Erhöhung der Zelldichte

eine Verschiebung des von BARLIČ et al. (2008) als Index für die Dedifferenzierung in-vitro-kultivierter

Chondrozyten etablierte Verhältnis von Kollagen Typ I zu Typ II in Richtung des Kollagen Typ I nachweisbar.

Der von SCHULZE-TANZIL (2009) beschriebene positive Effekt einer erhöhten Zelldichte auf die

Konzentration des Zytokins TGF-1 und damit auf den Dedifferenzierungs-Index der Chondrozyten konnte

in dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden. Daher kann davon ausgegangen werden, dass die These einer

geringeren Dedifferenzierung der Chondrozyten bei erhöhter Aussaatdichte keine Allgemeingültigkeit für

Zellkultursysteme der Chondrozyten, insbesondere für solche unter erhöhten Druckbedingungen, besitzt

oder der beschriebene Effekt einer höheren Aussaatdichte nach oben limitiert ist (GOLDRING 2012,

SCHULZE-TANZIL 2009). Vielmehr ist die Anpassung der Chondrozyten an die In-vitro-Kultivierung und die

anschließende Proliferation der Zellen wesentlich für das Erreichen des Chondroprogenitorstadiums der

Zellen (GSTRAUNTHALER und LINDL 2013, TEW et al. 2008). Die Entwicklung bis zum Erreichen dieses

Stadiums scheint, entsprechend den Untersuchungen dieser Arbeit, somit hauptsächlich zeitabhängig und

konnte weder durch das Einwirken eines Drucks noch durch die mit einer höheren Dichte ausgesäten Zellen

verbundene geringere Notwendigkeit der Proliferation bis zum Erreichen eines konfluenten Monolayers

wesentlich beeinflusst werden. Die durchgeführten Untersuchungen deuten darauf hin, dass das Erreichen

des Chondroprogenitorstadiums und damit die Synthese einer für den hyalinen Knorpel spezifischen ECM in

vitro nicht allein von dem Kontakt der Zellen untereinander, sondern wie auch im Rahmen der Entwicklung

des Knorpelgewebes von einem bestimmten Maß an Proliferation der Chondrozyten abhängig ist.

5.3 Empfehlungen für die In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten unter erhöhtem

hydrostatischen Druck

Die Untersuchungen zeigten, dass für die In-vitro-Kultivierung von Chondrozyten unter erhöhtem

hydrostatischem Druck Primärkulturen von Chondrozyten aus dem humanen Gelenkknorpel mit dem

dazugehörigen Chondrozytenwachstumsmedium geeignet sind, wobei die Aussaat der Chondrozyten in

einer Zelldichte von 104 Zellen/ cm2 erfolgen sollte.

Bei der Nutzung des in dieser Arbeit etablierten Zellkultursystems zeigte sich ein Mediumwechsel alle 3-4

Tage als ausreichend, um die Mortalität der Chondrozyten durch Nährstoffmangel oder die Anreicherung

von Stoffwechselendprodukten zu minimieren und gleichzeitig die Entfernung der in den Extrazellulärraum

abgegebenen ECM möglichst gering zu halten.

Die Verwendung von Chondrozyten bis zur Passage 6 kann für die Analyse der Expression des Kollagen Typ I

und II sowie des Aggrekan empfohlen werden. Die Chondrozyten sollten nach dem 1. Auftauen zunächst

einmalig passagiert werden, da hierdurch eine Beeinflussung durch das zytotoxisch wirkende

5 Diskussion

93

Kryoprotektivum DMSO minimiert wird und somit eine auf DMSO begründete Ergebnisheterogenität

ausgeschlossen werden kann (ALMANSOORI et al. 2012).

Die Kultivierung von Chondrozyten unter erhöhtem hydrostatischem Druck, repräsentativ für die

Druckverhältnisse der Radiärzone, sollte mittels eines Bioreaktors erfolgen, der sich aufgrund seiner

Materialeigenschaften für die Zellkultur eignet. Hierbei ist insbesondere zu beachten, dass alle Teile aus

hitzesterilisierbarem Edelstahl bestehen, welche mit der Zellkultur in Berührung kommen (SCHULZ und

BADER 2007). In dieser Arbeit erwies sich ein feinregulierbares Ventil für den Aufbau und den Abbau des

hydrostatischen Drucks als vorteilhaft, welches den Druckabbau über einen Zeitraum von 20 Minuten

ermöglicht und somit den Monolayer schont.

Die Untersuchung der Effekte eines kontinuierlichen hydroststischen Drucks sollten an konfluenten

Chondrozyten (6.-7. Kulturtag) erfolgen. Zu einem früheren Zeitpunkt sind nutzbare Effekte des Drucks

unwahrscheinlich, da die Expression einer für den hyalinen Knorpel spezifischen ECM zugunsten der

Proliferation der Chondrozyten in den Hintergrund tritt. Es zeigte sich, dass vor Erreichen der Konfluenz der

Zeitpunkt des Einsetzens der Synthese nicht durch einen einwirkenden Druck modifizierbar ist.

Die zytotoxischen Effekte des Drucks sind bereits früh durch die gezielte morphologische Beurteilung der

Chondrozyten im Phasenkontrastmikroskop erkennbar. Die abgerundete Morphologie der Chondrozyten

weist bereits vor der Ablösung der Zellen von der Kulturschale auf die initiierte Nekrose hin.

Es bedarf einer gezielten Einstellung der mit Hilfe des Bioreaktors variablen Parameter (Höhe und Dauer

des auf die Chondrozyten einwirkenden Drucks), um Effekte auf das Expressionsmuster zu erzielen, welche

sich der Synthese einer für den hyalinen Knorpel spezifischen ECM annähern. Hierbei ist zu berücksichtigen,

dass die Anwendung eines hohen Drucks, wie er physiologischer Weise im Gelenk während der normalen

Bewegung erreicht wird (10 bar), gegenüber einem unphysiologisch niedrigem Druck (5 bar) zu bevorzugen

ist. Die durchgeführten Untersuchungen zeigten, dass eine Druckeinwirkung von >24 h zu morphologischen

Veränderungen führt, die auf eine Zytotoxizität hindeuten. Diese kann auf eine druckabhängige Inhibition

der Protonenpumpen zurückgeführt werden (HALL 1999). Diese Inhibition der Ionenpumpen wird als

reversibel beschrieben (HALL 1999), jedoch scheinen sich die Chondrozyten nach einer bestimmten Zeit von

dem zurückgebliebenen Zellschaden nicht mehr zu erholen. Daher sollten für die Untersuchung der in

vitro-kultivierten Chondroyzten unter erhöhtem Druck die Vorteile des kurzzeitig einwirkenden erhöhten

Drucks bei 1,5-3 h insbesondere in Bezug auf die Expression des Aggrekan genutzt werden.

Die quantitative Analyse des Transkriptoms unter Nutzung o.g. Primer und die semiquantitative Analyse des

Proteoms unter Verwendung der o.g. Antikörper ist zur Auswertung der Proben hinsichtlich der Expression

von Kollagen Typ I und Kollagen Typ II sowie Aggrekan geeignet.

Um statistisch auswertbare Daten zu erhalten sind, abhängig von den Versuchsbedingungen, 2-9

biologische Replikate ausreichend, um eine P von 80 % zu erreichen und valide Analysen in Hinblick auf die

Signifikanz der erreichten Unterschiede durchführen zu können. Für Untersuchungen bei atmosphärischem

Druck, welche die Kollagenexpression betrachten, ist n=2 ausreichend, für solche die Aggrekan betrachten

dagegen n=9. In Bezug auf Versuche mit erhöhter Druckbelastung sollte für Untersuchungen der Kollagen-

bzw. Aggrekanexpression n=9 gewählt werden. Die Aussagekraft der Ergebnisse profitiert zusätzlich von der

Wiederholung der Untersuchungen an einer weiteren Primärkultur.

5 Diskussion

94

5.4 Möglichkeiten der Analyse druckbehandelter Chondrozyten und deren Nutzung in der

klinischen Anwendung- ein Ausblick

Die vorliegenden epidemiologischen Daten für die mit Knorpeldefekten einhergehenden Erkrankungen des

Bewegungssystems bei Menschen und Tieren unterstreichen die Notwendigkeit einer adäquaten

Therapieoption (DYCUS et al. 2013, JEFFCOTT 1996, MERX et al. 2007). Bislang konnte sich kein Verfahren

aufgrund seines Therapieerfolgs durchsetzen, sodass die Therapie von Knorpeldefekten allein auf die

Verbesserung der Schmerzsymptomatik und die Erhaltung der physiologischen Bewegungsfreiheit

beschränkt bleibt (FRITSCH et al. 1999, MARTINEK und IMHOFF 2003, SCHULZ und BADER, 2007). Das

vielversprechendste Verfahren stellt das Zellkultur-gestützte Verfahren der ACT/MACT dar (BRITTBERG et

al. 1994, ERGGELET 2003). Dieses kommerziell angebotene Verfahren wird stetig weiterentwickelt.

Gegenwärtig konzentrieren sich diese Weiterentwicklungen hauptsächlich auf die Trägermaterialien

transplantierter Chondrozyten (BENTLEY et al. 2013, ZEIFANG et al. 2010).

Daneben ist die Nutzung der Erkenntnisse der Untersuchung in-vitro-kultivierter Chondrozyten unter

erhöhten Druckbedingungen denkbar. Da die im Rahmen des Verfahrens transplantierten Chondrozyten in

der Lage sind, den Defekt anfänglich aufzufüllen, das neu gebildete Knorpelgewebe jedoch keine Integrität

zur Umgebung und somit keine gute Langzeitstabilität erreicht, sind grundlegende Untersuchungen des

Verhaltens der Chondrozyten unter Druck erforderlich (BRITTBERG 2010, ZEIFANG et al. 2010). Das im

Rahmen dieser Arbeit entwickelte Zellkultursystem ermöglicht die Durchführung solcher Untersuchungen

in vitro unter hydrostatischem Druck. Darauf aufbauenden Studien bietet es ein System, um die

Zusammensetzung der durch in-vitro-kultivierte Chondrozyten synthetisierten ECM zu optimieren und die

für diese verantwortlichen zellulären Mechanismen zu untersuchen. Hierbei sollte ein Fokus auf der

Untersuchung zellulärer Signal-Transduktionsmechanismen liegen, um zu prüfen, ob sich die Konzentration

der Zytokine in vivo wie in vitro tatsächlich so verhalten, wie häufig aus anderen Geweben abgeleitet

wird (FORTIER et al. 2011, SCHULZE-TANZIL 2009).

Daneben wäre basierend auf den Ergebnissen von CARON et al. (2012) die Nutzung einer 3D-Kultur der

Chondrozyten denkbar, in welcher die stetige Entfernung neusynthetisierter ECM unterbleibt. Hierdurch

wird ein Auseinanderrücken der Chondrozyten möglich und die Anzahl der Zell-Zell-Kontakte in vitro

reduziert, sodass es unter dem Einfluss der Zytokine IGF-1 und FGF-2 zu einer stärkeren Expression von

Kollagen Typ II und Aggrekan kommen kann (FORTIER et al. 2011). Die Kombination der 3D-Kultur mit den

in dieser Arbeit etablierten Druckbedingungen birgt somit die Möglichkeit die Synthese in-vitro-kultivierter

Chondrozyten in Richtung einer chondrozytenspezifischen ECM zu lenken und somit Kulturbedingungen zu

schaffen, welche der Situation in vivo näher kommen.

Hieraus resultierend müssen zukünftig die entsprechenden Zytokine nicht dem Zellkulturmedium zu

transplantierender Chondrozyten zugesetzt werden, sondern könnten in spezifischer Konzentration in das

Trägermaterial eingebracht werden. So könnten zelluläre Mechanismen auch nach der Transplantation

hinsichtlich einer biodynamischen Stabilität des Transplantats beeinflusst werden. Daneben ist auch die

Kultivierung der zu transplantierenden Zellen selbst unter optimierten Druckbedingungen mittels eines

Bioreaktors denkbar. Einschränkend bleibt jedoch der Umstand, dass ein In-vitro-System die Komplexität

der Situation der Chondrozyten in vivo nur unvollständig widerzuspiegeln vermag und z.B. die Wirkung von

Scherkräften in diesem Zellkultursystem unberücksichtigt bleibt.

6 Zusammenfassung

95

6 Zusammenfassung

Juliane Schneevoigt

„Untersuchung der zeit- und druckabhängigen Expression verschiedener Komponenten der extrazellulären

Matrix durch Chondrozyten in vitro“

Veterinär-Anatomisches Institut der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Eingereicht im Juni 2015

98 Seiten, 34 Abbildungen, 41 Tabellen, 153 Literaturangaben

Schlüsselwörter: Knorpel, Chondrozyten, hydrostatischer Druck, Bioreaktor, qPCR

Einleitung

Der hyaline Knorpel gewährleistet die grundlegende Funktion der Druckübertragung innerhalb der

synovialen Gelenke und stellt somit die Grundlage für die Bewegung des Organismus dar. Als schmaler

Überzug der Gelenkflächen ist er in seinem Aufbau an diese Funktion spezifisch angepasst. Dabei bedingt

der hohe Gehalt an Proteoglykanen und das an diese assoziierte Wasser die elastische Verformbarkeit des

hyalinen Knorpels, die es ermöglicht, Druck- und Scherkräfte abzufedern. Die Proteoglykane, die

hauptsächlich auf Aggrekan als Kernprotein basieren, sind in ein Maschenwerk kollagener Fasern

eingelagert, welches im Wesentlichen durch Kollagen Typ II gebildet wird. Diese Zusammensetzung darf

nicht als statisches Konstrukt verstanden werden. Vielmehr ist der hyaline Knorpel in vivo verschiedenen

biophysikalischen Einflüssen ausgesetzt, die eine dynamische Anpassung erfordern. Solche

Anpassungsvorgänge in Form einer Änderung der Zusammensetzung der aus kollagenen Fasern und

Proteoglykanen bestehenden extrazellulären Matrix werden durch die wenigen eingelagerten

Chondrozyten, die Zellen des hyalinen Knorpels, organisiert. Da die reifen Chondrozyten jedoch keine

Zellteilungen aufweisen und dem hyalinen Knorpel eine Vaskularisierung fehlt, ist eine Defektregeneration

kaum möglich, sodass eine Wiederherstellung der Integrität des Gewebes unterbleibt und stattdessen ein

Ersatzknorpel, der Faserknorpel, gebildet wird, welcher den einwirkenden biodynamischen Belastungen

jedoch nicht standhalten kann. Da die Defekte des hyalinen Knorpels einen Großteil der Erkrankungen des

Bewegungsapparats darstellen und zudem die Arthrose als Langzeitfolge nach sich ziehen, besteht ein

hohes medizinisches Interesse an der Entwicklung zellbasierter Therapieansätze, wie der Autologen

Chondrozytentransplantation (ACT). Hierbei werden - bislang mit unterschiedlichen Erfolgen –

in-vitro-kultivierte Chondrozyten mit dem Ziel, neuen hyalinen Knorpel zu bilden, in einen Knorpeldefekt

eingebracht.

Ziele der Untersuchungen

In den letzten Jahrzehnten zeigte sich, dass die Entwicklung von Therapieansätzen zur Behandlung von

Knorpeldefekten ein detaillierteres Verständnis des Knorpelgewebes und speziell dessen Biodynamik

erfordert. Ziel dieser Arbeit war es daher, im Rahmen einer Pilotstudie, ein In-vitro-System zu etablieren,

welches die Untersuchung der Biodynamik der Chondrozyten ermöglicht. Neben der Untersuchung der

Morphologie der Chondrozyten und der durch sie synthetisierten extrazellulären Matrix in Abhängigkeit

von der Kultivierungszeit der Zellen, wurde die Fragestellung bearbeitet, ob durch die Wirkung eines

hydrostatischen Drucks günstige Effekte in Hinblick auf die Expression einer extrazellulären Matrix, wie sie

im hyalinen Knorpel vorliegt, erzielt werden kann.

6 Zusammenfassung

96

Materialien und Methoden

Eine Primärkultur humaner artikulärer Chondrozyten wurde zunächst unter Standardzellkulturbedingungen

und atmosphärischem Druck kultiviert. Die Zellen wurden phasenkontrastmikroskopisch und hinsichtlich

der Verteilung von Kollagen Typ I und II immunzytochemisch untersucht. In den weiteren Versuchen

wurden optisch konfluente Chondrozyten in einen Bioreaktor überführt und weiter unter einem

hydrostatischen Druck von 5 oder 10 bar kultiviert. Dabei wurde die Dauer der Druckeinwirkung auf die

Chondrozyten variiert. Das Expressionsmuster der so kultivierten Chondrozyten wurde quantitativ in

Hinblick auf Kollagen Typ I und II sowie Aggrekan mittels qPCR und Western Blot untersucht. Dabei dienten

jeweils Chondrozyten, die ohne erhöhte Druckbedingungen kultiviert wurden, als Kontrollen. In dieser

Pilotstudie wurden die Proben unter Berechnung der Mittelwerte und Standardabweichung hinsichtlich

ihrer statistischen Power ausgewertet. Neben dieser Analyse der Einzelergebnisse wurden die

Versuchsbedingungen, die kaum Unterschiede in den Ergebnissen aufwiesen, in Gruppen zusammengefasst

und mit Hilfe der größtmöglichen vorhandenen Standardabweichung der Stichprobenumfang eines

Versuchs errechnet, welcher die statistische Power der Ergebnisse bei einem Alpha-Fehler von 0,05 auf 80%

erhöht. In den Fällen, in denen diese Power erreicht wurde, erfolgte eine Untersuchung der Unterschiede

auf Signifikanz („One Way Analysis of Variance“) bei einem Signifikanzniveau < 0,05.

Ergebnisse

Während der In-vitro-Kultivierung der Chondrozyten unter atmosphärischem Druck zeigte die Länge der

Kultivierungszeit weder einen Einfluss auf die phasenkontrastmikroskopisch untersuchte Morphologie der

Zellen noch auf die immunzytochemisch detektierte Verteilung des Kollagen Typ I und II. Die Wirkung eines

erhöhten hydrostatischen Drucks (5 bar, 10 bar) für 24 Stunden führte zu einer Abnahme der Expression

von Kollagen Typ I und Typ II auf das 0,2-0,8-fache bei gleichzeitiger Zunahme der Expression des Aggrekan

auf das 1,7-2,2-fache, verglichen mit der unbehandelten Kontrolle. Dieser Effekt war bei 5 bar ausgeprägter

als bei 10 bar, führte jedoch gleichzeitig zu einer starken Instabilität des Zellkultursystems. Vor diesem

Hintergrund wurde für den höheren Druck (10 bar) die Zeitdauer der Druckeinwirkung verkürzt. Hierbei

konnten bei kurzzeitiger Druckeinwirkung von 10 bar (1,5 und 3 Stunden) bei Erhalt der Zellen ähnliche

Effekte erzielt werden wie für die Bedingung 5 bar, 24 Stunden. Die Expression von Kollagen Typ I und Typ II

sank auf das 0,8-fache, wohingegen ein Anstieg der Aggrekanexpression auf das 1,6-2,4-fache erreicht

wurde. Diese Ergebnisse der qPCR konnten durch die im Western Blot für Kollagen Typ I, II und Aggrekan

detektierte Proteinexpression gestützt werden.

Schlussfolgerungen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein In-vitro-System etabliert, welches einerseits der Untersuchung des

Einflusses von hydrostatischem Druck auf die Expression von Chondrozyten dienen und andererseits für die

Herstellung von Zelltransplantaten weiter modifiziert werden kann. Die Ergebnisse der Untersuchungen

führten zur Definition von Bedingungen für das In-vitro-System, unter denen die Expression der

extrazellulären Matrix durch die Chondrozyten in Richtung der Zusammensetzung im hyalinen Knorpel

stimuliert werden kann. Dies zeigte sich bei einer Aussaat der humanen Chondrozyten in einer

Konzentration von 104 Zellen/cm2 und einer Vorkultivierungszeit von 6 Tagen unter Normaldruck, gefolgt

von der Kultivierung unter hydrostatischem Druck von 10 bar für 1,5 bis 3 Stunden. Mit Hilfe dieser

Pilotstudie wurde somit ein In-vitro-System etabliert, auf dessen Basis Untersuchungen durchgeführt

werden können, die weiterführende Erkenntnisse zur Biodynamik des hyalinen Knorpels liefern und der

zukünftigen Entwicklung zellbasierter Therapieansätze der Knorpeldefekte, wie der ACT, zu Gute kommen.

7 Summary

97

7 Summary

Juliane Schneevoigt

„Investigation of time- and pressure-dependent expression of different components of the extracellular

matrix by chondrocytes in vitro”

Institute of Anatomy, Histology and Embryology of the University of Leipzig

Submitted in June 2015

98 pages, 34 figures, 41 tables, 153 references

keywords: cartilage, chondrocytes, hydrostatic pressure, bioreactor, qPCR

Introduction

Hyaline cartilage maintains the basic function of transmitting articular pressure load within synovial joints

and therefore provides the basis for the movements of an organism. Being a small coverage of the joint

surface, it shows a composition designed to match this function specifically. A high amount of

proteoglycans and its associated water determines the elastic formability of the hyaline cartilage which

allows the absorbance of pressure and shear forces. These proteoglycans, mainly based on aggrecan as

core-protein, are embedded into a meshwork of collagen fibres, primarily formed of collagen type II. This

composition is not to be understood as a static construct; moreover it is exposed to biophysical forces that

permanently require a dynamic adaptation. This adaptation of the extracellular matrix formed by

proteoglycans and collagen type II is organised by a small number of embedded chondrocytes, the cells of

the hyaline cartilage. As chondrocytes are post-mitotic cells and due to the lack of vascularisation within

hyaline cartilage, there is hardly any chance for regeneration of defects in order to maintain the integrity of

the tissue. The resulting replacement is formed as fibrocartilage, which has not the capability to withstand

the biodynamical forces within the joint. As these defects in hyaline cartilage represent a gross of the

diseases of the musculoskeletal system, there is a high medical interest in the development of innovative

cell-based therapies, as autologous chondrocyte transplantation (ACT) is one. With this type of therapy in

vitro cultivated chondrocytes are seeded into a cartilage defect with the aim of producing hyaline cartilage.

Aims of the study

In the last decades the need for a detailed understanding of the biodynamics of cartilage became obvious

for further development of therapies. The aim of this study was therefore to establish a cell culture system

to provide an insight into the biodynamics of chondrocytes. Aside from the examination of the

differentiation of in vitro cultivated chondrocytes and their synthesis of extracellular matrix as a function of

the cultivation time, another aim of this study was to determine whether the application of hydrostatic

pressure might have beneficial influence on the expression of extracellular matrix components by

chondrocytes in vitro, in accordance with the hyaline cartilage.

Material and methods

Human articular chondrocytes were cultivated in vitro without the application of hydrostatic pressure in

the first place. The cells were observed phase contrast microscopically and the distribution of collagen type

I and II was detected immuncytochemically. In further experiments optical confluent chondrocytes were

transferred to a bioreactor system applying a hydrostatic pressure of 5 or 10 bar with variable time periods

of the pressure applied. Subsequently, the expression of collagen type I, collagen type II and aggrecan was

7 Summary

98

investigated and quantified using qPCR and Western Blot. Chondrocytes cultivated exclusively without the

application of hydrostatic pressure served as controls. In this pilot-study the samples were analysed using

arithmetic mean and standard deviation to evaluate the power statistically. In addition, similar test

conditions with marginal differences were pooled and the necessary sample size to meet a power of 80 %

with an alpha error of 0.05 was calculated using the maximum potential standard deviation. In cases where

this statistic power was obtained, an analysis of significance ("One Way Analysis of Variance”) was carried

out meeting a significance level under 0.05.

Results

During the cultivation of chondrocytes in vitro without hydrostatic pressure the length of the cultivation

time did neither show an effect on the phase contrast microscopical morphology nor on the

immuncytochemically detected distribution of collagen typ I and II. The application of increased hydrostatic

pressure for 24 hours results in a 0.2-0.8-fold decrease of the expression of collagen type I and II and a 1.7-

2.2-fold increase of aggrecan expression compared to the unloaded controls. This effect was more distinct

with 5 bar but was accompanied by instabilities in the cell culture. This is why further investigations

concentrated on the use of 10 bar pressure with subsequently shortened time period of the applied

pressure. With short times of loading (1.5 and 3 hours) a pressure load of 10 bar led to a 0.8 fold decrease

of the expression of collagen type I and II and showed a 1.6-2.4 fold increase of aggrecan expression. These

qPCR results were supported by the protein expression of collagen type I, II and aggrecan detected in

Western Blot.

Conclusions

A cell culture system was established to examine the effect of hydrostatic pressure on the expression of

chondrocytes on the one hand, which can further be modified for the assembly of cell transplants on the

other hand. Subsequently the results of this study led to a definition of cell culture conditions, stimulating

the extracellular matrix production of chondrocytes towards the composition of hyaline cartilage. This was

the case using a seeding density of 104 cells/cm2 and a pre-cultivation time of 6 days of normal pressure,

followed by the application of 10 bar hydrostatic pressure for 1.5-3 h. With the help of this pilot-study a cell

culture system was established to gain more information on biodynamics of hyaline cartilage. Moreover it

is possible that this information will provide a basis for further development of cell based therapies of

cartilage defects, such as ACT.

8 Literaturverzeichnis

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11 Danksagung

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9 Danksagung

Im Rahmen meiner Promotion habe ich von sehr vielen Menschen Unterstützung erfahren. Nun, da mein

Projekt in dieser Dissertation seinen Abschluss findet, ist es an der Zeit Danke zu sagen.

Danke, Mondy Bahramsoltani für die freundliche Überlassung des Themas. Angefangen bei der

Einarbeitung in die Zellkultur, insbesondere in die Arbeit mit dem Bioreaktor, über ihre Einführung in das

wissenschaftliche Arbeiten bis hin zu ihrer konstruktiven Kritik bei der Erstellung des Manuskripts. Ihre

Ideen bezüglich des Studiendesigns legten den Grundstein für diese Arbeit, gaben mir jedoch auch die

nötige Freiheit diese Ideen während des gesamten Projekts weiterzuentwickeln. Vor allem aber ihre

intensive und professionelle Unterstützung bei der Erstellung des Manuskripts haben maßgeblich zum

Gelingen dieser Arbeit beigetragen.

Danke, Johannes Seeger für die finanzielle Unterstützung des Projekts und die Bereitstellung des

Arbeitsplatzes am Veterinär-Anatomischen Institut.

Danke an die Mitarbeiter des Veterinär-Anatomischen Instituts- Gabriele Lindner für ihre kompetente Hilfe

bei der Etablierung der Immunzytochemie. Johannes Kacza danke ich für die umfangreiche Einarbeitung in

die mikroskopische Bilddokumentation. Bei meinen Mit-Doktorandinnen Katharina Lübbe, Maria Schober

und Jule Kristin Michler möchte ich mich für die außerordentlich gute Zusammenarbeit, die freundliche

Aufnahme im molekularbiologischen Labor und die vielen hilfreichen Tipps bedanken.

Danke an die Mitarbeiter des Fraunhofer Instituts für Zelltherapie- Alexandra Stolzing für die freundliche

Aufnahme in ihre Arbeitsgruppe. Mein ganz besonderer Dank gilt Claire Fabian- neben ihrer fachlichen

Unterstützung in allen Bereichen der Etablierung der PCR, vor allem auch für ihre warmherzige Art, die

mich immer wieder motivierte. Christiane Leovsky für die unzähligen konstruktiven gemeinsamen Stunden,

ob im Labor oder bei Kaffee und Schokolade, die mir immer in guter Erinnerung bleiben werden. Vielen

Dank auch für ihre hilfreichen Anmerkungen bei der Gestaltung des Manuskripts.

Danke, Christian Barucker und Josephine Böhme für die umfassende Einarbeitung in die Methoden

SDS-PAGE und Western Blot.

Danke, Franziska Richter für die wertvolle Unterstützung in der statistischen Analyse der Ergebnisse dieser

Arbeit.

Danke für die technische Unterstützung an Jens Baumgardt und Claudia Keil-Dieckmann von der

Fa. Durakult GmbH. Sie haben mit ihrer Konzeption eines für die Zellkultur optimierten Bioreaktors eine

wesentliche Voraussetzung für diese Arbeit geschaffen. Dies gilt auch für Wolfgang Schilbach, der mit der

technischen Konstruktion eines feinjustierbaren Abstromventils als Erweiterung für den Bioreaktor die

Fortsetzung der Zellkulturarbeiten mit dem Bioreaktor ermöglichte.

Danke, Hans-Dieter Gerstner. Die häufig umfangreiche Freistellung in der Startphase des Projekts, sowie die

spontane Übernahme meiner Bereitschaftsdienste haben diese Arbeit ohnehin erst ermöglicht.

Danke meiner Familie- meinen Eltern Birgit und Gerd Schneevoigt, die mir zusammen mit meinen

Großeltern Anita und Heinz Riehmer das Studium der Veterinärmedizin ermöglichten und mir auch

während der Anfertigung der Doktorarbeit immer unterstützend und liebevoll zur Seite standen.

Meinem Mann Lutz Schneevoigt danke ich von ganzem Herzen für seine unermüdliche Unterstützung, seine

Liebe und Motivation.

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