Untersuchung des Wirkmechanismus von FTY720 in einem ...

Universitätsklinikum Ulm

Klinik für Neurologie

Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. A. C. Ludolph

Untersuchung des Wirkmechanismus von

FTY720 in einem Mausmodell der Amyotrophen

Lateralsklerose (ALS)

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin

der Medizinischen Fakultät

der Universität Ulm

Vorgelegt von Ingo Wantzen

Ulm, 2016

Amtierender Dekan: Prof. Dr. R. Kilian

1. Berichterstatter: Prof. H. Tumani

2. Berichterstatter: Prof. J. Weiss

Tag der Promotion: 13.07.2017

i

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................................................... ii

1 Einleitung ............................................................................................................................................ 1

1.1 Die antiinflammatorische Wirkung des Immunmodulators FTY720 .............................. 1

1.2 Die vermutete zusätzliche neuroprotektive Wirkung von FTY720 bei MS .................... 3

1.3 Tiermodell der ALS, ein primär neurodegeneratives Krankheitsmodell ............................ 3

1.4 Die Amyotrophe Lateralsklerose und deren Pathomechanismen ...................................... 5

1.5 Neuroprotektion ........................................................................................................................ 10

1.6 Ziel der Arbeit ............................................................................................................................ 10

1.7 Fragestellungen ........................................................................................................................ 11

2 Material und Methoden ................................................................................................................... 12

2.1 Material ...................................................................................................................................... 12

2.2 Methoden ................................................................................................................................... 21

3 Ergebnisse ........................................................................................................................................ 34

3.1 Effekt von FTY720 auf α-Motoneurone von SOD1G93Adl-Tieren ........................................ 34

3.2 Effekt von FTY720 auf proinflammatorische Parameter im ZNS und im Blut von

SOD1G93Adl-Tieren ........................................................................................................................... 40

4 Diskussion ........................................................................................................................................ 71

4.1 Allgemeine Bemerkung zur Diskussion ................................................................................ 71

4.2 Effekt von FTY720 auf α-Motoneurone von SOD1G93Adl-Tieren ........................................ 72

4.3 Effekt von FTY720 auf proinflammatorische Parameter im ZNS und im Blut von

SOD1G93Adl-Tieren ........................................................................................................................... 77

5 Zusammenfassung .......................................................................................................................... 86

6 Literaturverzeichnis ......................................................................................................................... 88

Anhang ................................................................................................................................................. 97

Vortest der Neurofilamente NFH .................................................................................................. 97

Danksagung ................................................................................................................................... 101

Lebenslauf...................................................................................................................................... 103

ii

Abkürzungsverzeichnis

µl Mikroliter

µmol Mikromol

ADL Aktivitäten des täglichen Lebens

ALS Amyotrophe Lateralsklerose

AMPA α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-

Propionsäure

ANOVA Analysis of variance

Apaf-1 Apoptotic Protease activating Factor 1

APC Antigenpräsentierende Zelle

AS Aminosäure

ATP Adenosin-Triphosphat

bcl-2 B-cell lymphoma 2

BNDF Brain derived neurotrophic Faktor

bp Basenpaar

Ca2+ Calcium

CA3 Cornu Ammonis region 3

CCR7 Rezeptor CC-Chemokine receptor 7

CCS co-exprimierendes Kupferchaperon

cm Zentimeter

CNF ciliary neurotrophic Faktor

Cu/Zn Kupfer/Zink

d Tag

d Durchmesser

DAB 3,3'-Diaminobenzidine

DC Dendritische Zellen

DNA Desoxyribonukleinsäure

EAAT2 Excitatory amino-acid transporter 2

EAE Experimentelle Autoimmun Enzephalomyelitis

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGTA Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N′,N′-

tetraessigsäure

iii

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

End Endstadium

ERK Extracellular-signal Regulated Kinases

FACS Fluorescence activated cell sorting oder

Durchflusszytometrie

fALS familiäre Amyotrophe Lateralsklerose

FDA Food Drug Administration

FITC Fluoresceinisothiocyanate

FSC Follicular Stroma cells

FTLD frontotemporal lobar degeneration

FTY720 Fingolimod oder 2-Amino-2-(2-(4-

octylphenyl)ethyl)propan-1,3-diol

FTY720-P FTY720-Phosphat

g Gramm

G37R Glycin 37 Arginin

G59S Glycin 59 Serin

G86R Glycin 86 Arginin

G93A Glycin 93 Alanin

GABA γ-Aminobuttersäure

GFAP Glial fibrillary acidic protein

GLT-1 Glial Glutamate Transporter 1

Glu Glutamat

GLuR2 Glutamate receptor, ionotropic, AMPA

GM1 Monosialotetrahexosylgangliosid

GNDF Glial cell line-derived neurotrophic Faktor

GPCR G-Protein gekoppelter Rezeptor

h Stunde

H2O Wasser

H2O2 Wasserstoffperoxid

HCL Salzsäure

HE Hämatoxylin & Eosin

hSOD humane Superoxiddismutase

Hz Herz

IBA1 ionized calcium-binding adapter molecule 1

iv

IFN Interferon

IGF-1 Insulin-like-growth-factor-1

IL Interleukin

INA α-Internexin

K+ Kalium

KCl Kaliumchlorid

K-EDTA Kalium-EDTA

kg Kilogramm

KG Körpergewicht

KSP lysin-serin-prolin

l Liter

LDH Laktatdehydrogenase

LFA-1 Lymphocyte function-associated antigen 1

LPS Lipopolysacharid

M Molar

MAPK Mitogen-activated protein kinase

mg Milligramm

Mg2+ Magnesium

MgCl2 Magnesiumchlorid

min Minute

ml Milliliter

mm Millimeter

mRNA messenger Ribonukleinsäure

mut mutiert

n Anzahl

NaCl Natriumchlorid

NaOH Natriumhydroxid

NaOH Natriumhydroxid

NFH Neurofilament Heavy Chain

NF-κB der Transkriptionsfaktor: "nuclear factor

'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-

cells"

NFL Neurofilament light chain

NMDA N-methyl-D-Aspartat

v

NFM Neurofilament middle chain

Nrf2 nuclear factor erythroid 2–related factor 2

NT Neurotransmitter

O2 Sauerstoff

PBS phosphate buffered saline

PCR Polymerase Kettenreaktion

PE Propidiumbromid

PFA Paraformaldehyd

pH pH-Wert

pmol Picomol

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

pNPP p-Nitrophenyl Phosphate

prä präsymptomatische Phase

Ptdin-3-K Phosphatidylinositol-3-Kinasen

RANTES Regulated on Activation, Normal T Cell

Expressed and Secreted

Reg.-Nr. Registernummer

ROS Reaktive Sauerstoffspezies

rpm round per minute

RT reverse Transkriptase

S1P Sphingosin-1-phosphat

sALS sporadische Amyotrophe Lateralsklerose

SCID severe combined immunodeficiency

SD Standardabweichung

sec. Sekunde

SOD Superoxid-Dismutase

symp symptomatische Phase

TAE TRIS-Acetat-EDTA-Puffer

Tcm zentrale Gedächtniszellen

TDP-43 TAR DNA‐Binding Protein 43

Tem Effektor Gedächtniszellen

tg transgen

TLR Toll-like Rezeptor

Tn naive T-Zellen

vi

TNF Tumornekrosefaktor

TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

TVA Tierversuchsantrag

Urea Harnstoff

V Volt

VEGF vascular endothelial growth Faktor

1

1 Einleitung

1.1 Die antiinflammatorische Wirkung des Immunmodulators FTY720

FTY720 wird als immunmodulatorische Substanz weltweit zur Behandlung der

Multiplen Sklerose eingesetzt (Scott 2011) und unter dem Namen Gilenya® von der

Firma Novartis vertrieben. Es ist ein Metabolit der Zellmembran, bestehend aus

Sphingomyelin (Kingwell et al. 2010). Es agiert als ein Strukturanalogon für

Sphingosine. Sphingosine und FTY720 werden durch die Sphingosin-Kinasen -1 und

-2 zu Sphingosin-Phosphat (S1P) bzw. zu FTY720-Phosphat in ihre jeweils aktiven

Formen phosphoriliert. Sowohl Spingosin-Phosphat als auch FTY720-Phosphat

binden spezifisch auf Lymphozyten an den Spingosin-1 Phosphat Rezeptor. Durch die

Bindung von phosphoriliertem FTY720 an den S1P 1 -Rezeptor kommt es zu einer

Internalisierung und Degradierung des Rezeptors und zu einer Reduktion des mRNA-

Niveaus (Mehling et al. 2011). Der S1P - Rezeptor ist dadurch nicht mehr länger

verfügbar und der durch den S1P 1 -Rezeptor vermittelte Austritt der Lymphozyten

aus den Lymphknoten in das ZNS wird blockiert. Durch die funktionelle antagonistische

Wirkung von FTY720 wird das Ziel erreicht, die für die Neuronen im Rahmen der

Multiplen Sklerose schädlichen Effekte der T-Zellen vom zentralen Nervensystem

(ZNS) fernzuhalten (Mehling et al. 2011), (Pinschewer et al. 2011).

Es gibt fünf verschiedene S1P-Rezeptor Subtypen. FTY720 bindet an alle Subtypen

(Dev et al. 2008) (Brinkmann et al. 2002). S1P-Rezeptoren gibt es, wie folgt, in

absteigender Menge in verschiedenen Organen: Gehirn > Lunge = Milz > Herz und

Gefäße > Niere. Im ZNS werden S1P-Rezeptoren auf Neuronen, Astrozyten,

Oligodendrozyten und Mikroglia exprimiert. Ihre Funktionen sind sehr vielfältig. In vitro

Studien zeigten, dass S1P-Rezeptoren eine Rolle bei der Migration der Mikroglia und

bei Ausbreitung und Rückzug von Oligodendrozyten spielen. Dem S1P-1-Rezeptor

wird eine Schlüsselrolle bei der Angiogenese und Neurogenese sowie der Regulation

des Transports im Immunsystem zugeschrieben. Studien zeigen, dass eine genetische

Deletion im S1P-1 Rezeptor oder der Sphingosin-Kinasen zu einer Beeinträchtigung

der Neurogenese und des Neuralrohrverschlusses führt (Mizugishi et al. 2005). Es

liegt daher nahe, dass der S1P-1 Rezeptor Zell protektive Effekte ausübt.

2

Der S1P1-Rezeptor wird aber auch in den Lymphknoten exprimiert. Durch funktionelle

Antagonisierung des Rezeptors durch FTY720-Phosphat kommt die, schon in

zahlreichen Studien belegte, antiinflammatorische Wirkung zustande. Das durch den

S1P-1 Rezeptor vermittelte Signal wird über ein G-Protein vermitteltes

Retentionssignal für Lymphozyten, welches durch den CCR7-Rezeptor (CC-

chemokine-receptor 7) erzeugt wird, aufrechterhalten (Pham et al. 2008). FTY720

beeinflusst aber nicht alle Lymphozyten gleichermaßen. Bei den Lymphozyten werden

folgende Typen unterschieden: CCR+ Naive T-Zellen (TN), die noch keinen

Antigenkontakt hatten und CCR+ zentrale T-Gedächtniszellen (TCM), die durch

schwache Antigenstimulation entstehen und keine oder nur wenig Effektorfunktion

haben. TCM zirkulieren zwischen Blut und den sekundären Lymphorganen und warten

dort auf ein spezifisches Antigen. Bei Antigenkontakt wandern die TCM über

hochendotheliale Venulen zurück in den Lymphknoten, um dort das Antigen zu

präsentieren. Daraufhin proliferieren und differenzieren sie sich zu CCR- Effektor T-

Gedächtniszellen (TEM). Dabei geht die Funktion der Expression des CCR7-

Rezeptors und das durch ihn vermittelte Retentionssignal verloren. TEM entstehen

durch hoch intensive Antigenstimulation, rezirkulieren zum Entzündungsherd und

wirken dort als Effektorzelle (Sanna et al. 2006), (Pham et al. 2008).

S1P1-Rezeptoren bewirken vor allem die CCR7 vermittelte Retention von TN und TCM

Zellen, aber nicht von TEM-Zellen. FTY720 wirkt deshalb auch nur auf TN- und TCM-

Zellen.

Alle TCM-Zellsubtypen werden unabhängig von Th1 und Th2-Helfer Zellen von

FTY720 beeinflusst (Mehling et al. 2008). FTY720 hat zwar keinen direkten Einfluss

auf TEM-Zellen im ZNS, aber durch, die Verhinderung des Eintritts von TN und TCM-

Zellen, die sich zu TEM-Zellen differenzieren können, wird auch die Zahl der TEM-

Zellen, die sich im ZNS differenzieren, vermindert (Mehling et al. 2008).

Die antiinflammatorische Wirkung von FTY720 wurde schon in zahlreichen Studien

belegt, eine direkte neuroprotektive Wirkung wird bisher nur vermutet (Soliven et al.

2011).

3

1.2 Die vermutete zusätzliche neuroprotektive Wirkung von FTY720 bei MS

Soliven et al. vermutet, dass der positive Effekt von FTY720 auf die humane MS vor

allem durch die veränderte Lymphozytenzirkulation vermittelt sein muss. Doch nimmt

er an, dass es aufgrund der Anwesenheit von S1P-Rezeptoren im ZNS einen weiteren

möglichen Mechanismus geben könnte. Auf der Basis seiner Ergebnisse in einer MS

Studie, bei der FTY720 und Interferon-β verglichen wurden, vermutet er, dass der

positive Effekt von FTY720 auf die Pathologie bei der MS nur teilweise durch die

antiinflammatorische Wirkung erklärt wird. Er hält einen direkten neuroprotektiven

Effekt für wahrscheinlich (Soliven et al. 2011). Zudem lassen die Ergebnisse anderer

Studien einen direkten neuroprotektiven Effekt von FTY720 vermuten (Di Menna et al.

2013), (Hasegawa et al. 2010), (Wei et al. 2011), (Pardo et al. 2014), (Cipriani et al.

2015), (Norimatsu Y 2012), (Gao et al. 2012). Unter anderem beobachtete Pardo A et

al. in vivo anhand von FTY720 behandelten HD R 6/2 Mäusen (Mausmodell des M.

Huntington) eine verbesserte motorische Funktion und eine verringerte Degeneration

an striatalen Zellen (Pardo et al. 2014).

1.3 Tiermodell der ALS, ein primär neurodegeneratives Krankheitsmodell

Zur Aufklärung von Pathomechanismen und zur Entwicklung von Medikamenten

werden heutzutage Tiermodelle in der biomedizinischen Forschung verwendet. Dabei

handelt sich oft um gentechnisch veränderte Mäuse oder Ratten, die zum Beispiel ein

humanes mutiertes Protein überexprimieren und in Folge Symptome der

entsprechenden humanen Erkrankung entwickeln. Das am häufigsten verwendete und

am besten charakterisierte ALS-Mausmodell ist das transgene SOD1G93A –Maus

modell (Gurney et al. 1994). Diese Art von genetisch definiertem Modellorganismus

ermöglicht es die Pathogenese und eine mögliche Therapie der ALS systematisch zu

untersuchen.

Transgene Mausmodelle der fALS, die das human mutierte SOD1 Gen in sich tragen,

haben zu einem wahren Boom geführt, was die Erforschung der Ursache der ALS

angeht. (Cleveland 1999).

Die Übertragbarkeit der Untersuchungsergebnisse auf den Menschen ist meist nur in

begrenztem Maße möglich (Benatar 2007). Zur wissenschaftlichen Erforschung von

relevanten Pathomechanismen der ALS hat sich das transgene Mausmodell jedoch

4

als sehr nützlich erwiesen (Vargas et al. 2011). Es gibt weitere transgene

Mausmodelle mit anderen Mutationen in der Superoxid-Dismutase 1 wie bspw. G37R,

G86R (Gaudette et al. 2000).

1.3.1 Das transgene SOD1-G93A Mausmodell

Das am häufigsten verwendete und am besten charakterisierte ALS-Mausmodell ist

die transgene high copy SOD1-(G93A)–Maus B6SJL-Tg(SOD1-G93A) 1G/J,

abgekürzt SOD1G93A (Gurney et al. 1994). SOD1G93A-Mäuse entwickeln die

Motoneuronenpathologie und die klinischen Symptome, wie sie bei der ALS üblich sind

(Ripps et al. 1995), (Dal Canto et al. 1994), (Dal Canto et al. 1995), (Dal Canto et al.

1997). In dieser Studie wurde das transgene low copy SOD1 (G93A)-Mausmodell

B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl 1G/J verwendet. Dieses Mausmodell hat einen späteren

Krankheitsbeginn und eine längere Lebensspanne im Vergleich zu den high copy

Tieren. Die Krankheitsprogression entspricht jedoch, der der high copy Tiere. Dies

ermöglicht es, pathologische Veränderungen in Folge über einen längeren Zeitraum

zu studieren. Das Zeitfenster für medikamentöse Interventionen ist größer (Al-

Chalabi et al. 2013). Der Zeitpunkt, an dem die erste ALS-Symptomatik auftritt, ist

direkt abhängig von der Kopienanzahl der transgenen Maus. Diese SOD1G93A low copy

Mäuse zeigten im Alter von ca. 200 Tagen erste Gangveränderungen an den

Hintergliedmaßen. In einem Alter zwischen 230-250 Tagen kommt es zu ein- oder

beidseitigen Lähmungen der Hintergliedmaßen. Im Alter von ca. 265 Tagen erreichen

die Tiere das Endstadium in dem sie aus Tierschutzgründen getötet werden. Das

Endstadium ist wie folgt definiert: Ein Tier hat das Endstadium erreicht wenn es nicht

mehr in der Lage ist sich unverzüglich aufzurichten nachdem man es auf die Seite

gelegt hat.

Mattiazzi et al. demonstrieren in ihrer Studie, dass es sowohl beim Menschen als auch

bei SOD1G93A-Mäusen zu einer oxidativen Schädigung und in Folge zum Absterben

der Motoneurone bei der ALS kommt (Mattiazzi et al. 2002).

Im Gegensatz zur humanen ALS beobachtet man bei den SOD1G93A-Tieren keinen

neuronalen Zelluntergang im Motorkortex. Die Manifestation ist hier primär spinal

lokalisiert (Almer 2003).

Effekte von neuen pharmakologischen Substanzen und Pathomechanismen der ALS

werden anhand des SOD1 G93A-Mausmodells erforscht. Ludolph et al. weisen darauf

5

hin, dass die Reproduzierbarkeit und die Übertragung der Ergebnisse präklinischer

Studien auf den Menschen begrenzt ist (Ludolph et al. 2010).

1.4 Die Amyotrophe Lateralsklerose und deren Pathomechanismen

Die ALS ist seit mehr als 100 Jahren bekannt und wurde das erste Mal von dem

französischen Neurologen Jean Martin Charcot beschrieben. Indem er die Symptome

dokumentierte, histologische Präparate anfertigte und in Ansätzen den

Krankheitsverlauf untersuchte, lieferte er eine bedeutungsvolle Beschreibung der ALS

mit nachhaltiger Wirksamkeit (Ludolph et al. 2000). Die Diagnosestellung erfolgt

heutzutage durch klinische, histologische und elektrophysiologische Untersuchungen.

Validierte Forschungsergebnisse zeigen auf, dass die Kombination zwischen dem

klinischen Verlauf und elektrophysiologischer Untersuchungen unabdingbar sind für

eine genaue Diagnosestellung (Körner et al. 2010).

Bei der Amyotrophen Lateralsklerose handelt es sich um eine neurodegenerative

Erkrankung, die ausschließlich das erste (primärer Kortex) und das zweite Motoneuron

(Hirnstamm und Rückenmark) betrifft. Sie ist mit einer jährlichen Inzidenz von 0,5-

2/100.000 und einer Prävalenz von 2-3/100.000 die häufigste

Motoneuronenerkrankung des Erwachsenenalters (Rowland 1994).

Klinisch manifestiert sich der Untergang der motorischen Nervenzellen auf Grund

unterschiedlicher Degenerationsmuster mit teilweise sehr variabler Symptomatik

(Rowland 1995).

Die spinale Form besteht aus einem dualen System aus schlaffen und spastischen

Lähmungen. Durch die Degeneration des ersten Motoneuron wird die spastische

Lähmung (pseudobulbär) hervorgerufen. Durch die Degeneration des zweiten

Motoneurons zeigt sich meist eine einseitige, an der oberen Extremität beginnende

fortschreitende schlaffe muskuläre Lähmung (Wijesekera et al. 2009).

Bei der bulbären Form ist die Muskulatur, die von den Hirnnerven (V, VII, IX, X, XI,

XII) innerviert wird, betroffen. Das Sprechen, Schlucken und Kauen werden hier

beeinträchtigt. Andere neurologische Fähigkeiten, wie die Sensibilität, kognitive

Fähigkeiten, Hören, Riechen, Schmecken, Sehen und die Blasen- und

Mastdarmfunktion bleiben erhalten. Die Erkrankung endet in 80% der Fälle innerhalb

von 1-5 Jahren durch respiratorisches Versagen tödlich (Almer 2003). Eine

differentialdiagnostische Abgrenzung zu anderen neuromuskulären Erkrankungen

6

erfolgt elektromyographisch, neurographisch, serologisch, histologisch, radiologisch

und klinisch.

1.4.1 Ätiologie

Die Ursache für die ALS ist nur teilweise bekannt. Die Forschung geht mittlerweile von

einer multifaktoriellen Erkrankung aus.

In 90% der Fälle tritt die ALS in der sporadischen Form (sALS) auf. Ungefähr 10%

zeigen eine positive Familienanamnese (fALS). Ein Fünftel davon tragen eine Mutation

(G93A) im Gen der Cu/Zn Superoxiddismutase 1 (Rosen DR 1993).

Bei dieser Mutation kommt es zum Aminosäureaustausch zwischen Glycin und Alanin.

Heute sind über 90 Mutationen im Gen der Superoxid Dismutase 1 bekannt,

beispielsweise G37R, G59S, G86R (Gaudette et al. 2000). Die SOD1 ist ein

ubiquitäres zytoplasmatisches Enzym, das die Konversion des freien

Sauerstoffradikals O2- zu H2O2 katalysiert. Dies wird wiederum mit Hilfe der

Glutathionperoxidase weiter zu H20 umgewandelt. Bei über 80% der fALS-Patienten

bleibt die Mutation unbekannt. Es wird vermutet, dass es zu einem komplexen

Zusammenspiel zwischen Umweltfaktoren und zahlreichen genetischen Loci kommt,

die in ihrer Einzelheit nur einen geringen Einfluss ausüben (Dunkley et al. 2007). Von

Damme hält einen Zusammenhang zwischen Mutationen im SOD1 Gen und der

sporadischen Form für wahrscheinlich (Van Damme et al. 2005).

Weitere Überlegungen zur Ätiopathogenese sind Umweltfaktoren, virale/infektiöse

Genese, Autoimmunerkrankungen, exogene und endogene Neurotoxine; auf

molekularer Ebene unter anderem Apoptose, Beeinträchtigung im axonalen Transport

und die Exzitoxizität.

Es gibt relativ viele epidemiologische Daten, die Hinweise zur Pathogenese der ALS

liefern. Diese können aber nur wenig substantielle Befunde vorweisen.

Zu diesen epidemiologischen Daten gehört unter anderem das Phänomen der

Golfkrieg ALS, bei der ein Anstieg der Inzidenz unter den, in ihr Heimatland

zurückgekehrten Soldaten, zu verzeichnen war. Als Ursache für diese Häufung wurde

in dieser Zeit ein umweltbedingtes oder ein infektiöses Agens vermutet. (Barohn et al.

2002).

Einen großen Fortschritt in der ALS Forschung konnte im Jahre 2006 durch die

Entdeckung des TAR DNA‐Binding Proteins 43 (TDP‐43) gemacht werden

(Neumann et al. 2006), (Arai et al. 2006).

7

1.4.2 Pathomechanismen

„Gain of funtion“ des mutierten SOD1-Proteins

Mit Entdeckung der krankheitsauslösenden humanen SOD1G93A-Mutation bei ALS-

Patienten im Jahr 1993 nahm man an (Rosen et al. 1993), dass die Mutation zu einen

Verlust der enzymatischen Aktivität führt und somit der enzymatische Abbau von

Sauerstoffradikalen gestört ist („Loss of Function-Theorie“), (Bowling et al. 1995),

(Gurney et al. 1994). Bis heute sind über 100 humane SOD1 Mutationen bekannt, die

zum Ausbruch der ALS beim Menschen führen (Conwit 2006), (Al-Chanlabi et al.

2000). Es wurde aber beobachtet, dass in vielen Mutationen die enzymatische Aktivität

der SOD1 unbeeinträchtigt oder sogar erhöht ist. An SOD1 knock-out Mäusen wurde

gezeigt, dass diese keine Motoneuronenerkrankung entwickeln und eine normale

Lebensspanne haben (Gurney et al. 1994), (Wong et al. 1995), (Cleveland et al.

1995). Diese Daten lassen vermuten, dass die verschiedenen Mutationen das Protein

mit einer oder mehreren neuen toxischen Eigenschaften ausstatten, ganz unabhängig

von der enzymatischen SOD1-Aktivität. Dieses Phänomen wird als „Gain of Function“

bezeichnet. Die Art der neugewonnen Eigenschaften des mutierten SOD1-Proteins

bleibt bis heute jedoch unklar (Almer 2003).

Apoptose

Unter Apoptose versteht man den programmierten Zelltod. Sie dient unter anderem

der Beseitigung defekter Zellen, da diese eine Gefahr für den gesamten Organismus

darstellen können (Rassow et al. 2008).

Durch eine Fülle von Daten geht man mittlerweile davon aus, dass am Ende einer

langen Kaskade, die zum SOD1- vermittelten Motoneuronen Untergang führt, die

Apoptose steht (Almer 2003).

Unter anderem konnte in einer Studie dargelegt werden, dass die Überexpression von

bcl-2, einem anti-apoptotischen Protein, zu einer wesentlichen Verzögerung des

Ausbruchs der Erkrankung sowie einer Verlängerung der Lebenszeit der transgenen

Mäuse führt (Kostic et al. 1997). Dies wurde zusätzlich untermauert, als wenig später

die Aktivierung der Kaspasen 1 und 3, zweier wichtiger Schlüsselenzyme, bei der

Auslösung der Apoptosekaskade im Rückenmark von mutierten SOD1G93A-Mäusen

gezeigt werden konnte (Pasinelli et al. 2000).

8

In einer weiteren Studie, die die Apoptosetheorie stützt, wurde der therapeutische

Effekt bei einer intrathekalen Applikation eines Kaspaseninhibitors (zVAD-fmk)

beschrieben (Li et al. 2000). Zudem konnte bei transgenen Mäusen, die eine Mutation

in dem humanen SOD1-Gen überexprimieren, eine vermehrte Expression von

Kaspase 1 schon im präklinischen Stadium nachgewiesen werden (Yoshihara et al.

2002).

Hypothese des oxidativen Stresses

Oxidativer Stress entsteht, wenn die Produktion freier Sauerstoffradikale die Kapazität

der anti-oxidativen Abwehr überschreitet. Äußere Einflüsse (Glutamat oder H2O2),

intrazelluläre Störungen (Gendefekte) und eine verminderte Abbaurate der ROS

können für die Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies verantwortlich sein. Zu

den reaktiven Sauerstoffspezies gehören Radikale wie das Superoxidradikal, das

Hydroxylradikal, das Hydroperoxyradikal, aber auch nicht-Radikale wie H2O2,

singulärer Sauerstoff und Hypochlorid. Nicht radikalische Verbindungen werden meist

durch bestimmte Reaktionen in Radikale umgewandelt.

Radikale sind definitionsgemäß Atome oder Moleküle, die ein oder mehrere

ungepaarte Elektronen tragen (Halliwell et al. 1989).

Bei vielen Hypothesen, die sich auf die mutierte SOD1 (fALS) beziehen, scheint das

Kupfer Ion eine entscheidende Rolle zu spielen.

Eine Studie stützt sich auf die veränderte Struktur des mutierten SOD1 –Proteins.

Durch das weniger gefaltete Protein tritt das Kupfer Ion hervor und vermittelt oxidative

Prozesse. Ein anderer möglicher Mechanismus könnte auf der Instabilität des

mutierten SOD1-Proteins beruhen, bei der sich das Risiko der Proteolyse und der

Freisetzung ins Zytoplasma erhöht. Zudem konnte man bei fALS-Patienten zweifach

erhöhte Kupfermengen nachweisen (Watanabe et al. 1997). Die zentrale Rolle des

Kupfers in der Toxizität der SOD1 Mutation wird von einer Studie gestützt, bei der

Kupferchelatoren neben Kaspaseinhibitoren, bcl-2 und Vitamin E, zu den potentesten

Substanzen gehören, in vitro den Zelltod von mutierten SOD1 PC12 Zellen

abzuwenden.

Mitochondrien spielen im Zusammenhang mit oxidativen Stress eine wichtige Rolle.

Einerseits sind die Mitochondrien die Kraftwerke der Zelle und verantwortlich für den

Elektronentransport. Andererseits sind sie sehr vulnerabel gegenüber oxidativem

Stress (Packer et al. 1996).

9

Bei Verlust der mitochondrialen Integrität könnte die Verbindung zur Apoptose

stattfinden. Kommt es zur Ruptur in der äußeren Membran der Mitochondrien, wird

Cytochrom C freigesetzt, welches in Folge die Aktivierung der Kaspasen und damit die

Apoptose einleitet (Kroemer et al. 1997).

In neuropathologischen Studien konnte in Mäusen mit der SOD1G93A –Mutation gezeigt

werden, dass die ersten sichtbaren morphologischen Veränderungen, Aufblähungen

und Vakuolenbildungen in Mitochondrien zu finden sind (Wong et al. 1995) (Dal

Canto et al. 1994).

Excitoxizität

Eine der wichtigsten Funktionen ist die Regulation der Glutamatkonzentration über den

EAAT2/GLT-1 Glutamat Transporter im synaptischen Spalt. Glutamat ist ein wichtiger

exzitatorischer Neurotransmitter im zentralen Nervensystem (Almer 2003). Sowohl bei

der fALS und der sALS als auch dem transgenen Mausmodell konnte gezeigt werden,

dass es zum Verlust des EAAT2/GLT-1 Glutamat Transporters kommt (Rothstein et al.

1995), (Fray et al. 1998), (Howland et al. 2002). Dieser Rezeptor ist für ca. 90% des

Abtransports des synaptischen Glutamats im Bereich von Motoneuronen

verantwortlich (Rothstein et al. 1996). Es ist deshalb nicht verwunderlich, dass die

Glutamatkonzentration im synaptischen Spalt bei Verlust des Rezeptors sehr stark

ansteigt und einen toxischen Effekt auf Motoneurone ausübt. Man bezeichnet dieses

Phänomen als Exzitoxizität. Durch die abnorme exzitatorische Stimulation des

Glutamats im synaptischen Spalt (Almer 2003) werden die ionotropen Glutamat-

Rezeptoren AMPA und NMDA auf den Motoneuronen überstimuliert. Der dadurch

resultierende exzessive Ca2+ Einstrom hat Einfluss auf die Integrität der

Mitochondrien, die verdauenden Enzyme (Proteasen, Endonucleasen, NO-

Synthetasen…) und die Ionenströme. Durch den Ca2+-Einstrom in die Mitochondrien

kommt es aufgrund der Akkumulation des Ca2+ zur Erniedrigung des

elektrochemischen Gradienten und damit zu einer verminderten ATP-Synthese. Unter

anderem wird Cytochrom C in das Zytoplasma freigesetzt, das über den „Apoptotic

Protease activating Factor 1“ (Apaf-1) die Apoptosekaskade einleitet (Rassow et al.

2008).

Riluzol reduziert unteranderem die Freisetzung von Glutamat aus den Nervenenden

und ist im Moment das einzig zugelassene Medikament zur Behandlung der ALS,

welches die Rolle der Exzitoxizität bei der ALS festigt.

10

1.5 Neuroprotektion

Unter Neuroprotektion versteht man den Versuch Nervenzellen und Nervenfasern

durch pharmakologische Methoden vor dem Absterben zu bewahren.

Ziel der Neuroprotektion ist es, die zugrundeliegende Ätiologie oder Pathogenese einer

Erkrankung günstig zu beeinflussen und dadurch den Erkrankungsbeginn, die

Symptomatik oder den klinischen Verlauf zu verzögern (Schwarz et al. 2005).

1.6 Ziel der Arbeit

Die antiinflammatorische Wirkung des Immunmodulators FTY720 wurde bereits

in zahlreichen klinischen und präklinischen Studien bei Patienten mit Multipler

Sklerose nachgewiesen. Dabei wurde eine zusätzliche neuroprotektive Wirkung von

FTY720 vermutet, allerdings bisher nur unzureichend untersucht (Soliven et al.

2011) .

Daher lag die Frage nahe, ob FTY720 direkte neuroprotektive Eigenschaften

unabhängig von der antiinflammatorischen Wirkung haben könnte. Um dieser Frage

nachgehen zu können, wurde das Tiermodell der ALS, einem primär

neurodegenerativen Krankheitsmodell, herangezogen. Die ALS ist eine

neurodegenerative Motoneuronenerkrankung, bei der es gegenwärtig keinen kurativen

Therapieansatz gibt. Jedoch konnte durch Riluzol (NMDA-Rezeptorantagonist) das

Überleben um 3-6 Monate verlängert werden (Nirmalananthan et al. 2005).

1.6.1 Teilprojekt 1 Die neuroprotektive Wirkung wurde an Hand von folgenden Parametern evaluiert: Wir

führten eine Quantitative Bestimmung der α-Motoneuronenanzahl, Astrozyten und

Mikroglia im lumbalen Rückenmark durch. Zudem führten wir eine quantitative Analyse

der Neurofilamente Heavy Chain im Hirn-Homogenat durch.

11

1.6.2 Teilprojekt 2

In Teilprojekt 2 sollte die Wirkung auf das Ausmaß der Neuroinflammation im SOD

G93A -Mausmodell der ALS bestimmt werden. Um die Wirkung auf die

Neuroinflammation zu untersuchen wurden folgende Parameter ermittelt:

Quantitative Bestimmung der B- und T-Lymphozyten bzw.CD4+- und CD8+-T-

Lymphozyten im Vollblut und der Milz mittels FACS.

Quantitative Bestimmung der proinflammatorischen (IFN-γ, IL-2) und

antiinflammatorischen (IL-4, IL-10) Zytokine mittels ELISA.

1.7 Fragestellungen

1.7.1 Teilprojekt 1

• Hat FTY720 unabhängig von der antiinflammatorischen Wirkung eine direkte

neuroprotektive Wirkung?

• Welchen Einfluss hat die Dosis auf die Wirkung von FTY720?

• Welchen Einfluss hat das Medikament auf das Überleben der G93A SOD1

Mäuse?

1.7.2 Teilprojekt 2

• Welchen Einfluss hat FTY720 auf das Ausmaß der Neuroinflammation im

Rahmen des SOD1 G93A Mausmodells?

• Welchen Einfluss hat die Dosis auf die Wirkung von FTY720 auf die

Neuroinflammation?

12

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Die Versuchstiere

In der Studie wurden B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl 1Gur/J Maus verwendet. Die Zuchttiere

wurden bei Jackson Labratory (600 Main Street Bar Harbor, ME USA 04609) gekauft.

Die Versuchstiere stammen aus einer eigenen Nachzucht am Tierforschungszentrum

Ulm. Diese Tiere tragen die humane hemizygote G93A-Mutation im Gen der Cu/Zn-

Superoxid Dismutase (SOD1). Sie sind zurzeit der einzige validierte

Modellorganismus, mit dessen Hilfe die Wirkung verschiedener Substanzen zur

Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen verlässlich erfasst werden kann.

Die SOD1 G93A low copy Maus überexprimiert die humane Form der SOD1-Mutation

und zeigt einen ähnlichen Phänotyp wie die humane ALS. Sie zeigt unter anderem

Lähmungen an einem oder mehreren Hintergliedmaßen, Motoneuronenverlust vor

allem auf lumbaler Rückenmarksebene, die Akkumulation von aktivierten Mikroglia,

Astrogliose und die krankheitsprogressive Akkumulation von SOD1-Aggregaten. In der

Studie wurden nur männliche Tiere verwendet, um geschlechtsspezifische

Unterschiede zu vermeiden.

2.1.2 Haltung der Tiere

In Teilprojekt 1 wurden die Mäuse in offenen Regalsystemen in Käfigen vom Typ „M2

Long“ gehalten. Es wurden max. 3 Tiere in einem Käfig gehalten, da bei männlichen

Tieren die Gefahr von Unverträglichkeiten bestand. Wasser und Futter standen ad

libidum zur Verfügung. Den Mäusen wurde Weichholzgranulat als Einstreu und

Zellstoff als Nestbaumaterial im Käfig zur Verfügung gestellt.

Das Teilprojekt 2 unterscheidet sich in der Haltung der Mäuse. Weil das Zytokinprofil

und der Immunstatus der Tiere untersucht werden sollte und Entzündungen durch evtl.

Bisswunden die Ergebnisse beeinflussen würden, wurden die Mäuse einzeln gehalten.

13

2.1.3 Studiendesign

Die präklinische Studie wurde in Kooperation mit der Firma Norvatis, Schweiz

durchgeführt. Die Studie umfasste 2 Teilprojekte.

Das Medikament FTY720 wurde ab dem 35. Lebenstag den Tieren in zwei

unterschiedlichen Dosierungen gewichtsspezifisch mittels Schlundsonde appliziert.

Die Tiere der Negativkontrolle erhielten Wasser über eine Schlundsonde. Die Tötung

der Tiere erfolgte in drei verschiedenen Krankheitsstadien. Präsymptomatisch im Alter

von 70 Tagen, Symptomatisch beim ersten Auftreten von Lähmungen und dem

Endstadium der Erkrankung. Als Kontrolle dienten hier altersgleiche unbehandelte

transgene SOD G93A- Tiere. Die Durchführung der präklinischen Studie erfolgte

gemäß des, vom Regierungspräsidium Tübingen am 06.12.2012 genehmigten,

Tierversuchsantrags Reg.-Nr. 1123.

2.1.3.1 Teilprojekt 1

Transgene SOD1G93A Mäuse

1. Behandlungsgruppe (n=5): Tägliche orale Gabe von 1,0 mg/kg Tag FTY720 mittels

Schlundsonde (Volumen 250 µl) ab Tag 35 bis zu einem Alter von 70 Tagen. Die Tiere

wurden in der präsymptomatischen Phase (Tag 70) getötet.


Schlundsonde (Volumen 250μl) ab Tag 35 bis zu einem Alter von 130 Tagen. Die Tiere

wurden mit beginnender symptomatischer Phase (ca. Tag 200) getötet.


Schlundsonde (Volumen 250 µl) ab Tag 35 bis zum Erreichen des Endstadiums. Die

Tiere wurden mit Erreichen des Endstadiums getötet.


Schlundsonde (Volumen 250 µl) ab Tag 35 bis zu einem Alter von 70 Tagen.

Die Tiere wurden in der präsymptomatischen Phase (Tag 70) getötet.


Schlundsonde (Volumen 250 µl) ab Tag 35 bis zu einem Alter von 130 Tagen. Die

Tiere wurden mit beginnender symptomatischen Phase (ca. Tag 200) getötet.

14



Tiere wurden mit Erreichen des Endstadiums getötet.

7. Behandlungsgruppe (n=5): Kontrolltiere. Die Tiere wurden im Alter von 65-70

Tagen (Präsymptomatisch) getötet. Die Tiere haben 250μl H2O mittels Schlundsonde

erhalten.

8. Behandlungsgruppe (n=5): Kontrolltiere. Die Tiere wurden im Alter von ca. 200

Tagen (Symptomatisch) getötet. Die Tiere haben 250μl H2O mittels Schlundsonde

erhalten.

9. Behandlungsgruppe (n=5): Kontrolltiere. Die Tiere wurden im Alter von ca.240

Tagen (Endstadium) getötet. Die Tiere haben 250μl H2O mittels Schlundsonde

erhalten.

2.1.3.2 Teilprojekt 2

Teilprojekt 2: Messung des Immunstatus und des Zytokinprofils in vivo

- Es erfolgten Blutabnahmen mittels Punktion aus der Vena facialis an folgenden

Tagen: 40d; 60d; 80d; 100d; 120d; 170-180d; Symptomatische Phase;

Endstadium

- 2 unterschiedliche Dosierungen: 1mg/kg KG und 3mg/kg KG FTY720

- Tötung der Tiere in Endstadium

1. Gruppe (n=7): Tägliche orale Gabe von Trinkwasser mittels Schlundsonde

(Volumen 250 µl) ab Tag 35 bis zum Erreichen des Endstadiums. Die Tiere wurden im

Endstadium getötet.

2. Gruppe (n=7): Tägliche orale Gabe von 1,0 mg/kg Tag FTY720 mittels


Tiere wurden im Endstadium getötet.

3. Gruppe (n=7): Tägliche orale Gabe von 3,0 mg/kg Tag FTY720 mittels


Tiere wurden im Endstadium getötet.

15

2.1.4 Antikörper

2.1.3.1 ELISA

Zytokine:

MSD® MULTI-SPOT Assay System, Proinflammatory Panel 1 (mouse) Kits

INFγ, IL-2, IL-4, IL-10 von Mesocale

Neurofilamente und Proteinanalyse:

Phosphorylated Neurofilament H (pNF-H) Sandwich ELISA Kit, Chemicon International

(Cat.No. NS170, Lot: 2485687)

2.1.3.2 Immunhistochemie

Rabbit Anti Iba1 Code No. 019-19741 Wako Pure Chemical Industries

Anti-GFAP Antikörper ab 7260 Abcam

goat anti-rabbit IgG-B

(Sekundärantikörper)

sc-2040

SantaCruz Biotechnology, Inc.

Impact Nova Red Kit Cat. No. SK-4800 Vectorlabs

VECTASTAIN ABC KIT Cat. No. PK-4000 Verctorlabs

2.1.3.3 FACS-Analyse

Antikörper Firma

IgG Maus Antikörper Chrom Pure Mouse; FA.

Jackson, no 015-000-003

CD19 PE (B-Zellen) eBioscience #12-0193-81

CD3 FITC (T-Zellen) eBioscience #11-0031-82

CD4 APC (CD4+ T-Zellen) eBioscience #17-0041-82

CD8 PE (CD8+T-Zellen) eBioscience #12-0081-82

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AK- Färbungen (Verdünnungen alle in FACS-Puffer)

B- und T-Zellen: CD19 PE (1:200) und CD3 FITC (1:50)

CD4 und CD8-Zellen: CD4 APC (1:400) und CD8 PE (1:800)

single stainings:

CD3 FITC (1:50)

CD19 PE (1:200)

CD11b APC (1:400)

ungefärbte Kontrolle (Zellen mit Totfarbstoff)

2.1.5 Puffer, Lösungen und Material

2.1.2.1 SOD PCR

10 × TAE- Puffer(pH 8,3)

- TRIS-Base 0,4M, Roth

- Eisessig 0,2M, Normapure

- EDTA 10mM, Sigma

Primer und DNA-Polymerase Kit, Thermo Scientific ,Ulm

• SOD Maus 42: 5‘- cta ggc cac aga att gaa aga tct-3‘

• SOD Maus 43: 5’-cta ggt gga aat tct agc atc atc-3‘

• SOD Maus 113: 5‘-cat cag ccc taa tcc atc tga-3‘

• SOD Maus 114: 5‘-cgc gac taa caa tca aag tga-3‘

• Arbeitskonzentration der Primer 10µM

2.1.2.2 Immunhistochemie

Objektträger: Menzel-Gläser Superfrost Plus Menzel

Objektträgerkisten VWR

Objektträgermappen VWR

Deckgläser Menzel

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Färbetröge mit Deckel und Einsatz Brand

Eppendorf Reaktionsgefäße (1,5 ml,0,5 ml) Sarstedt

Rotilabor®-embedding cassettes, POM mit

Deckel L40 x B28 x H6,8mm

Carl Roth GmbH

Rotilabor®-embedding cassettes, Macro,

weiß, Spezialpolymer, L41 x B27,5 x H12mm

Carl Roth GmbH

Peel-A-Way® Disposable Embedding Molds

(S-22), 22 x 22 x 20mm deep

Polyscience Inc.(Cat# 186446A

LOG# 654361)

Impact Nova Red Kit, Vectorlabs, Cat. No. SK-4800

VECTASTAIN ABC KIT, Verctorlabs, Cat. No. PK-4000

1M NaOH, Fluka

1M HCl, Fluka

1×TRIS-HCl-Tween 20 Puffer (pH 7,6), Sigma-Aldrich

- 0,5M Tris-Base

- 0,5% Tween 20

- 1 M HCl

Citratpuffer (pH 8,0)

- 10mM Zitronensäure, Roth

- 10mM Na2 HPO4 * 2H2O, Roth

Bovine Serum Albumin Lösung

- 5g Albumin Fraktion V, GE Healthcare

- 0,25ml Triton X, Sigma

- 100ml Tris-HCl-Puffer (pH 7,6)

Mayers Hämolaun Lösung, Merck Millipore

Eosin 1%, Roth

99,8% Alkohol vergällt 642, VWR

Xylol, Sigma Aldrich

Liquid Blocker-Super PAP Pen, Dako

EUKITT: Xylol lösliches Eindeckmedium, Sigma Aldrich

Kresylviolett 1%, Merck Millipore

Aqua dest: Avium pro VF, Sartorius stedim Biotech

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2.1.2.3 ELISA

Fa. Sarstedt Biosphere® Filter tips

- 20-300 μl

- 0,5-10 μl

- 0,5-20 μl

- 2,0-20 μl

- 2-100 μl

Quality Pipette tips, 100-1000 μl, Fa Sarstedt

Puffer für Homogenisate

- 10mM TRIS-HCL pH 7,6

- 4M Urea, Sigma-Aldrich

- 1mM EDTA, Sigma

- 1mM EGTA, Sigma-Aldrich

- 0,2 mM PMSF, Sigma-Aldrich

Ampuwa, VWR

2.1.2.4 FACS-Analyse

FCS (Fetales Kälberserum)

- 1×DPBS-CaCl2-MgCl2, Fa. Gibco

FACS-Puffer:

- 1x PBS ohne Ca/Mg, Fa Gibco

- FCS (5%), Fa Gibco

Ammoniumchlorid-Lösung, Fa stemcell technologies, no 07800

EDTA zum Spülen der Kanülen und Spritzen: UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0; Fa. Gibco

no 15575 100ml

Propidiumjodid (PI)-Lösung:

Propidiumjodid, Fa Invitrogen, no P3566

1:2500 Verd. in FACS-Puffer, (UV sensitiv,1-2 Wochen haltbar)

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Blocking Reagenz:

Maus IgG Antikörper (ChromPure Mouse IgG; Fa Jackson Immuno Research),

no 015-000-003

Verdünnung 1:50 in FACS-Puffer

Material:

S-Monovette, Sarstedt,cat no 05.1167.001

Cell strainer (Nylonnetz 40 µm), BD Falcon, cell strainer REF 352340

Cell strainer (5 ml Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap) BD Falcon,

Ref 352235

FACS-Röhrchen: 5ml Polstyrene round bottom tube with cell strainer cap von BD

Falcon, REF 352235

Cell strainer 40µm Nylon von BD Falcon, REF 352340

Lysepuffer: Ammoniumchlorid (NH4Cl) von Fa. Stemcell technologies, no. 07800

Totfarbstoff: Propidiumjodid von Fa. Invitrogen, no. P3566

FACS-Puffer 1×PBS without Ca/Mg + 5% FCS (=Fetales Kälberserum)

2.1.6 Präparation und Lagerung

Forene 100% (V/V) 250ml, Wirkstoff: Isofloran, Abbott

1×PBS, pH=7,4

- 137mM NaCl, Sigma-Aldrich

- 2,7mM KCl, Sigma

- 12mM Na2HPO4 , Roth

Eismaschine, Scotsman AF80

2.1.7 Geräte

Personal Thermocycler, Biometra

Dampfkocher, Braun

Mikrotom RM 2265, Leica

Modulares Einbettsystem mit Kühlplatte, Leica EG1150 C

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Entwässerungsautomat, Leica

Schüttler stuart® SSL4, Biocote

Vortexer, IKA

96-Well Mikroplate reader,

Kühlzentrifuge Fresco 21, Thermo Scientific

Tischzentrifuge (Biofuge pico), Heraeus instruments

FACS-Gerät, BD FACS Calibur 3607, BD Bioscience

ELISA: Berthold Technologies Twinkle LB 970

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2.2 Methoden

2.2.1 DNA-Isolierung aus Schwanzspitzenbiopsiematerial

Zur DNA Isolierung wurde jeweils ein ca. 3mm langes Schwanzstück vom Schwanz

der Maus entnommen und in einen Eppendorf Tube gegeben. Um die DNA aus den

Zellen zu lösen wurde zu jeder Probe 230µl Quick Extrakt Puffer dazugegeben. Jede

Probe wurde daraufhin 15 sec gevortext. Anschließend wurde die Probe bei 65°C für

6 Min. erhitzt, im Folgenden wieder 15 Sekunden gevortext und zu Letzt bei 95°C für

2 Min. erhitzt.

2.2.2 Polymerasekettenreaktion

Die PCR dient der Genotypisierung der transgenen G93A-Mäuse. Es handelt sich

hierbei um eine molekularbiologische Methode. Sie erlaubt es in vitro die DNA nach

Belieben stark zu vervielfältigen, damit sie sehr einfach nachzuweisen ist.

Zur Umsetzung dieser Methode werden folgende Komponenten benötigt:

• die DNA-Polymerase, die die einzelnen DNA-Stränge miteinander verbindet.

• ein sog. Primer, der als Startpunkt gilt und an den die Bausteine der DNA (Nucleotide)

angebaut werden.

• ein sog. Template (DNA-Strang), welches als Kopiervorlage dient.

Der PCR-Zyklus besteht aus drei Teilschritten:

Der erste Schritt umfasst die Denaturierung. Bei 95°C werden hier die DNA-Stränge

aufgetrennt. Im zweiten Schritt folgt das „Annealing“, auch Hybridisierung genannt. In

diesem Schritt heften sich die Primer der einzelsträngigen DNA an. Danach folgt die

Elongation (Verlängerung). Die Temperatur wird auf 72°C erhöht, damit die Taq-

Polymerase optimal arbeiten kann. Die verwendete Taq-Polymerase ist hitzestabil. In

den meisten Organismen werden die DNA-Polymerasen bei 95°C zerstört. Doch durch

die Entdeckung des Mikroorganismus „Thermus aquaticus“, welches in heißen Quellen

bei über 100°C gefunden wurde, konnte eine hitzestabile DNA-Polymerase, isoliert

werden. Die Taq-Polymerase beginnt über die OH—Gruppe am 3’Ende des Primers

die Nucleotide aufzufüllen.

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Tabelle 1: Reagenzien für die SOD-PCR. SOD= Superoxid Dismutase; PCR=

Polymerasekettenreaktion; Master Mix= vorgefertigte gebrauchsbereite Reagenzienmischung; Taq-

Polymerase= thermostabile DNA-Polymerase.

Inhalt Menge Inhalt

DreamTaq Master Mix 50nmol Taq-Polymerase,

dNTP’s, MgCl2, Loading

Buffer

Primer 113 10pmol

Primer 114 10pmol

Primer 42 10pmol

Primer 43 10pmol

Ampuwa 3,5pmol

Tabelle 2: Programm der SOD-PCR. Die Reihenfolge der einzelnen Reaktionsschritte der SOD-PCR

mit Berücksichtigung der Temperatur und Dauer der einzelnen Reaktionsschritte. Diese wird vom

Hersteller Thermoscientific vorgegeben. SOD= Superoxid Dismutase; PCR= Polymerasekettenreaktion.

PCR-Schritte Temperatur Dauer

Initiale Denaturierung 95°C 3min

Denaturierung 95°C 30sec

Annealing 58°C 30sec

Automatisierte Fluoreszenz

Extension

72°C 10min

Finale Extension 72°C 10min

2.2.3 Gelelektrophorese

Aufgrund der negativen elektrischen Ladung der DNA können DNA-Moleküle in einem

konstanten elektrischen Feld aufgetrennt werden. Da die meisten DNA-Moleküle im

Verhältnis zu ihrer Masse annähernd die gleiche Ladung besitzen, verwendet man zur

Auftrennung der DNA Agarose- oder Polyacrylamidgele. Die Gele bestehen aus einem

System von Poren, deren Größe von der jeweiligen Gelkonzentration abhängig ist. Die

Wanderungsgeschwindigkeit der Moleküle verhält sich umgekehrt proportional zu ihrer

Größe. Zur Größenabschätzung der einzelnen DNA-Fragmente trägt man parallel

einen Satz von Restriktionsfragmenten bekannter Größe, einen sogenannten

23

Größenmarker, auf. Über einen Positionsvergleich der Banden kann man die

Fragmentgrößen ermitteln. Dabei ist die Laufstrecke linearer Nukleinsäuren

proportional zum Logarithmus ihres Molekulargewichts.

Durch Zugabe von Ethidiumbromid werden die DNA-Moleküle im Gel sichtbar

gemacht. Ethidiumbromid interkaliert zwischen die einzelnen Basen des DNA-

Doppelstrangs und fluoresziert rot-orange bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht von

254 nm oder 300 nm Wellenlänge. Die Nachweisgrenze von ethidium¬bromid

gefärbten Gelen liegt bei 5 ng je Bande [Mülhardt, 1999].

Zur Bestimmung von DNA-Fragmenten zwischen 800 bp und 5.000 bp wurden 1,0 -

2,0%ige Agarosegele, für Fragmente von 200 bp bis 1.000 bp 2,0 2,5%ige Gele

verwendet. Die Agarose wurde mit 1x-TAE-Puffer, pH 8,0 angesetzt und bis zum

vollständigen Lösen der Agarose erhitzt. Nach Zugabe von 0,5 µg Ethidiumbromid (10

mg/ml) pro 1 ml Gellösung und Abkühlen auf ca. 60°C erfolgte das Gießen der Gele

im Gelschlitten mit einer Dicke von 0,7 mm. Das Probenauftragsvolumen betrug jeweils

10 µl.

Für eine nähere Charakterisierung der aufgetrennten Banden, wurden präparative

Agarosegele verwendet, aus denen die gewünschten Banden mittels eines Skalpells

ausgeschnitten werden. Die Konzentration der präparativen Agarosegele lag bei 0,7%,

die Dicke variierte zwischen 1,0 – 1,5 cm, je nach Probenauftragsvolumen.

Zusammensetzung:

4,0 - 9,0 µl DNA (je nach Konzentration)

1,0 µl 10x-Probenpuffer (pH 7,2)

X µl ddH2O

10,0 µl

Laufbedingungen:

Laufpuffer 1x-TAE, pH 8,0

Spannung 90 V

Zeit 15 - 30 min

24

2.2.4 Gewinnung des zu analysierenden Materials

Die Maus wurde mit Isofloran in Narkose gelegt. Nach ca. 30 sec. wurde durch Kneifen

in die Zehenzwischenräume die Tiefe der Narkose überprüft. Danach erfolgte die

transkardiale Perfusion mittels Herzpunktion.

Für die FACS-Analyse wurden 200µl Vollblut verwendet. Der Rest wurde verwendet

um eine Zytokinanalyse mittels ELISA durchzuführen. Das Blut wurde ab zentrifugiert,

das Zellpellet verworfen und das Plasma bei -80°C schockgefroren.

2.2.5 Präparation, Fixierung und Lagerung des Gewebes

Nach der Blutabnahme wurde die Milz frei präpariert, entnommen und in PBS gelegt.

Eine Hälfte diente der Herstellung eines Homogenats. Sie wurde in einen Kryotube

gegeben und sofort in Trockeneis schockgefroren. Die Lagerung erfolgte bei -80°C.

Die andere Hälfte und der Rest der Maus wurden für 48h in 4% PFA fixiert. Danach

erfolgte die Präparation des Rückenmarks unter Eröffnung des Wirbelkanals. Die

Gehirnhälfte und das Rückenmark wurden in PBS gegeben und in Paraffin eingebettet.

2.2.6 Immunhistochemie

2.2.6.1 Das Prinzip

Die Immunhistologie ermöglicht es in Geweben spezifische Proteine mittels Antikörper

nachzuweisen und anzufärben.

2.2.6.2 Einbetten

Das Einbetten erfolgte in 4 Schritten.

Das Gewebe wurde schrittweise durch Inkubation in Alkohol entwässert. Der Alkohol

wurde dann durch Xylol (Lösungsmittel) ersetzt. Xylol wurde daraufhin durch Paraffin

ersetzt. Das Gewebe wurde in einem Einbettförmchen (Peel-A-Way® Disposable

Embedding Molds) mit flüssigem Paraffin in die gewünschten Position gebracht. Das

Förmchen wurde zum Abkühlen auf eine kalte Platte gestellt.

25

2.2.6.2 Paraffinschnitte

Das in Paraffin eingebettete Gewebe wurde mit dem Mikrotom „EG1150 C“ von Leica

geschnitten. Die Schnittdicke lag bei 7 µm. Bevor mit dem Schneiden begonnen

werden konnte, wurden die Paraffinblöcke für 2 h in die Kühltruhe (-20°C) gelegt.

Um eine gute Anhaftung zu erreichen (Joppien et al. 2011), wurden die Objektträger

mit den aufgezogenen Geweben für 24h in einer Wärmekammer bei 37°C getrocknet.

Die darauffolgende Lagerung erfolgte bei Raumtemperatur.

2.2.7 Nissl-Färbung

Mit der Nissl-Färbung werden sogenannte Nissl-Schollen angefärbt. Dabei handelt es

sich um endoplasmatisches Retikulum (ER) und Zellkerne von Nervenzellen. Das

Prinzip liegt in der elektrostatischen Anlagerung des basischen Farbstoffs

„Kresylviolett“ an die sauren Gruppen der Nucleinsäuren, der Zellkerne und des rauen

ER, die in einem sauren Milieu (PH 4,9) erfolgt.

Das Präparat auf dem Objektträger wurde in Xylol entparaffiniert (Xylol Reihe) und für

je 3min in absteigender Alkoholreihe (100% - 90% - 70%) rehydriert. Im Folgenden

verblieb das Präparat für 5 Min. in destilliertem Wasser. Dann wurde das Präparat 10

Min. in Kresylviolett (1%) wässrig bei Raumtemperatur inkubiert, um danach nochmal

in destilliertem Wasser gespült zu werden. Im folgenden Schritt wurde die Färbung in

96% Ethanol differenziert (ca. 7 Min.). Die Differenzierung wurde durch Gabe des

Präparats in 100% Ethanol unterbrochen und durchlief im Anschluss die Xylol Reihe.

Mit Hilfe eines Deckglases und des Eindeckmediums Eukitt wurde die Färbung und

das Gewebe auf dem Objektträger ausreichend fixiert.

2.2.8 Antikörperfärbungen

2.2.8.1 Prinzip der indirekten Antikörperfärbung

Der Primärantikörper bindet spezifisch an sein Antigen. Um den Primärantikörper

sichtbar zu machen, markiert man ihn mit einem biotinylierten Sekundärantikörper. Bei

der Avidin-Biotin-Komplex Methode reagiert der Avidin-Biotin-Enzymkomplex mit dem

biotinylierten Sekundärantikörper. Hierbei macht man sich die starke Affinität von

26

Avidin gegenüber Biotin zunutze. Aufgrund der vier Bindungsstellen des Avidins ist die

Sensitivität höher als bei der direkten Immunfluoreszenzfärbung, bei der der

Primärantikörper direkt mit einem Enzym markiert wird. Durch Inkubation mit einem

Enzymsubstrat (Impact Nova Red) kommt es dann zur Anfärbung der Antigene

(Joppien et al. 2011).

2.2.8.2 Durchführung

1. Tag

Das Präparat auf dem Objektträger wurde in Xylol entparaffiniert (Xylol Reihe: Xylol 1:

3sec; Xylol 2: 5min; Xylol 3: 5min; Xylol 4: 5min) und in absteigengender Alkoholreihe

(100%: 3sec; 100%: 5min; 96%: 5min; 70%: 5min) rehydriert. Im Folgenden verblieb

das Präparat für 5 Min. in destilliertem Wasser. Je nach Antikörperfärbung erfolgte eine

Vorbehandlung. Die Vorbehandlung dient der Antigendemaskierung. Die Fixierung mit

Formalin führt teilweise zur Entstehung von sog. Cross-links, d.h. zur Quervernetzung

der Proteinstrukturen. Die Erhitzung des Gewebes beim Einbettungsvorgang auf bis

zu 60°C kann zu Konfirmationsänderungen am Epitop des Antigens führen.

Deshalb versucht man durch das Erhitzen in Citratpuffer die Konformation der Epitope

teilweise oder ganz wiederherzustellen (Joppien et al. 2011). Anschließend folgte die

Inkubation in 1% H2O2-Lösung über 20 Minuten. Dies dient der Inaktivierung der

körpereigenen Peroxidasen und vermindert den Background. Nachfolgend wurden die

unspezifischen Bindungsstellen mit ca. 200µl BSA Lösung geblockt. Aufgrund der

Ladungsverteilung und der Konformation anderer Proteine oder der Oberfläche des

Objektträgers kann es zu unspezifischen Bindungen kommen, was wiederum zu einer

störenden Hintergrundfärbung führt (Joppien et al. 2011). Die Inkubation betrug ein

Stunde. Nachdem die Inkubationszeit vorbei war, wurde die BSA Lösung von den

Präparaten abgeklopft und für jeweils 5 Min. in 1×TRIS-HCl Puffer pH (8,0) gelagert

und geschüttelt. Dazwischen wurde der gewechselt. Im nächsten Schritt folgte die

Inkubation mit dem Primärantikörper über Nacht. Bei Raumtemperatur wurde je nach

Antikörperfärbung mit einer unterschiedlicher Verdünnung gearbeitet.

Folgende Verdünnungen wurden verwendet:

- IBA-1: 1:1000 in TRIS-HCl Puffer (pH 8,0)

- GFAP: 1:1000 in TRIS-HCl Puffer (pH 8,0)

27

2. Tag

Am 2. Tag wurde die Antikörperlösung abgeklopft und die Präparate für 3× jeweils 5

Min in 1×TRIS Puffer unter schütteln gewaschen. Anschließend folgte die Inkubation

mit dem Sekundärantikörper in einer 1:200 Verdünnung in 1×TRIS-HCl Puffer (pH 8,0)

über 1h bei Raumtemperatur. Das Präparat wurde danach wieder abgeklopft und für

jeweils 5 Min in TRIS Puffer gewaschen und geschüttelt. Im Folgenden wurde das

Präparat für eine Stunde mit dem ABC-Kit (Avidin+Peroxidase) behandelt. Das

Präparat wurde danach wieder abgeklopft und für jeweils 5min in TRIS Puffer gelagert

und geschüttelt. Dazwischen wurde der TRIS-Puffer gewechselt. Danach folgte die 15-

minütige Inkubation mit Nova Red, dem Substrat der Peroxidase. Das Präparat wurde

dann 5 Min. in destilliertem Wasser gespült. Um den Kontrast zu erhöhen wurde eine

Gegenfärbung mit Hämolaun durchgeführt. Danach wurden die Präparate für 10 Min.

unter fließendem Leitungswasser gespült. Dann erfolgte die Dehydrierung in

aufsteigender Ethanol Reihe (70%: 3 sec; 96%: 5min; 100%: 3sec; 100%: 5min) und

Inkubation in Xylol (Xylol Reihe: Xylol 1: 3sec; Xylol 2: 5min; Xylol 3: 5min; Xylol 4:

5min). Zu guter Letzt wurden die Präparate eingedeckelt. Die Präparate wurden zum

Trocknen 24h in einen Wärmeschrank bei 37°C gegeben.

2.2.9 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen

2.2.9.1 Quantitative Bestimmung der Motoneurone

Die Zellkörper wurden mit einer Nissl-Färbung angefärbt. Es wurden alle Nervenzellen

gezählt, die im anterioren lumbalen Rückenmark liegen, einen Durchmesser d > 20µm

haben und in einem definiertem Feld liegen. Das definierte Feld wurde mit Hilfe eines

rechten Winkels konstruiert. Der rechte Winkel wurde so gelegt, dass sein

Scheitelpunkt im Canalis centralis liegt und einer seiner Strahlen durch die Fissura

mediana anterior verläuft.

Frühere Studien haben diese Methode genutzt, um Motoneurone zu identifizieren (4).

Xiaoxing Ma et al. bestätigten, dass der Durchmesser aller mit NeuN angefärbten

Nervenzellen größer als 20µm ist (Ma et al. 2011).

28

2.2.9.2 Bestimmung des Ausmaßes der Astrogliose

Das „Glial fibrillary acidic Protein“ (kurz: GFAP) ist ein Intermediär Filament, das

hochspezifisch auf Astroglia exprimiert wird (Reeves et al. 1989). Mit Hilfe des Anti-

GFAP Antikörpers (Abcam 7260) wurden die Astrozyten markiert und angefärbt. Somit

war es möglich hyperplastische und proliferative Veränderungen der Astroglia zu

beurteilen.

Es wurden alle GFAP-positiven Zellen gezählt, die in einem klar definierten Bereich, in

der grauen Substanz des anterioren Rückenmarks lagen. Das definierte Feld wurde

mit Hilfe eines rechten Winkels konstruiert. Der rechte Winkel wurde so gelegt dass

sein Scheitelpunkt im Canalis centralis liegt und einer seiner Strahlen durch die Fissura

mediana anterior verläuft.

2.2.9.3 Bestimmung des Ausmaßes der Einwanderung der Mikroglia

IBA1 (= ionizing calcium-binding adaptor molecule 1) ist ein Protein, welches

vorwiegend auf Makrophagen/ Mikroglia exprimiert wird. Je stärker diese Zellen

aktiviert werden, desto stärker exprimieren sie IBA1 auf ihrer Oberfläche. Mit Hilfe des

Anti-Iba1, Rabbit von Wako wurden die Mikroglia markiert und angefärbt. So war es

möglich die proliferativen und morphologischen Veränderungen zu beurteilen.

Es wurden alle Iba1-positiven Zellen, wie schon zuvor beschrieben, gezählt.

2.2.3. ELISA

2.2.3.1 Prinzip des ELISA

ELISA bedeutet Enzyme-linked immunosorbent Assay. Es handelt sich um einen

Immunoassay, mit dem Substanzen wie Zytokine in geringen Konzentrationen auf

Grundlage des Antigen-Antikörperprinzipes nachgewiesen werden können. Zur

Bestimmung von Zytokinen und Neurofilamenten (Antigene) wurde der nicht-

kompetive Immunoassay, die sog. Sandwich-Methode eingesetzt. Bei dieser Methode

wird das Antigen von zwei Antikörpern gebunden und ist dadurch sensitiver als die

kompetive Methode. Wie in Abb. 2 gezeigt, bindet der erste Antikörper

(Primärantikörper) an eine feste Phase, die sog. 96-Well-Mikrotiterplatte.

29

Zur quantitativen Messung der Zytokine im Plasma wurde das MSD® MULTI-SPOT

Assay System, Proinflammatory Panel 1 (mouse) Kit verwendet. Die Durchführung

erfolgte nach Herstellerangaben.

2.2.3.2 Vorbereitung der Plasmaproben

Die Plasmaproben wurden gemeinsam aufgetaut und auf 4 Tubes ( Neurofilamente,

Gelsolin, Zytokine) aliquotiert, zwei Tubes mit 3μl; zwei Tubes mit je 20μl.

2.2.3.3 Phosphorilierte Neurofilamte Heavy Chain ELISA

Herstellung des Homogenatpuffers

10mM TRIS-HCl wurden in VE-Wasser gelöst und mit Hilfe einer 1M NaOH-Lösung

der PH-Wert auf 7,2 eingestellt. Alle weiteren Bestandteile (4M Urea, 1mM EDTA, 1mM

EGTA, 0,2 mM PMSF) des Puffers wurden unter Rühren in dem 10mM TRIS-HCl

Puffer gelöst.

Zur quantitativen Analyse der Neurofilamente wurde das Phosphorylated

Neurofilament H (pNF-H) Sandwich ELISA Kit von Chemicon International. Die

Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben.

2.2.4 Quantitative Proteinanalyse

Die Quantitative Proteinanalyse der Hirn-Homogenate diente dazu, um die Menge der

Neurofilamente NFH ins Verhältnis zum Gesamtprotein des jeweiligen Gehirngewebes

zu setzen. So war es möglich, unabhängig von der Menge des Gehirngewebes, eine

Aussage über die Quantität der Neurofilamente NFH zu machen. Zur Quantitativen

Proteinanalyse wurde das Quant-it Protein Assay Kit verwendet. Die Durchführung und

Auswertung erfolgte nach Herstellerangaben.

2.2.5 Auswertung der Neurofilamente

Die quantitative Bestimmung der Neurofilamente (heavy Chain) in den Plasmaproben

erfolgte mit Hilfe des ELISA Plate Readers bei einer Wellenlänge von 430 nm. Der

30

ELISA Plate Reader maß die Extinktion und berechnete mit Hilfe der Standardkurve

die Konzentration der Neurofilamente (heavy Chain) in den Wells.

Die Konzentrationen wurden mit dem Faktor 100 multipliziert, um die Verdünnung zu

bereinigen. Dann wurden sie zur Gesamtproteinkonzentration in der jeweiligen

Plasmaprobe ins Verhältnis gesetzt. Sie wurden in der Einheit μg/mg angegeben.

Die statistische Auswertung erfolgte mit Excel.

2.2.6 FTY720-Messung im Plasma und Hirn-Homogenat

Die quantitative Analyse von FTY720 und FTY720-Phospaht wurde von der Norvatis

Pharma GmbH durchgeführt.

2.2.7 FACS-Analyse von Maus-Vollblut und Milz

Vorbereitungen

• Totfarbstoff Propidiumjodid (PI): PI-Lösung und FACS-Puffer frisch ansetzen

• NH4Cl-Lösung auftauen

• Kanüle und Spritze für die Herzpunktion mit 0,5 M EDTA durchspülen

• Verwendung von K-EDTA Monovetten zur Herzpunktion

2.2.7.1 Lyse der Erythrozyten

Ca 300 µl Vollbut (EDTA-Vollblut) werden mit der 5-10 fachen Menge an Lysepuffer

(NH4Cl-Lösung) versetz und 10 min auf Eis inkubiert. Dann erfolgt die Zugabe von 1

ml FACS- Puffer damit die Lysereaktion abgestoppt wird. Anschließend wird die Probe

bei 2200 rpm für 3 min bei 4 °C zentrifugiert; der Überstand wird verworfen du das

Zellpellet wird in 1 ml FACS-Puffer resuspendiert. Dieser Waschschritt wird 2x

wiederholt.

2.2.7.2 Vorbereitung der Milz

Die Milz wird mit Hilfe einer Pipettenspitze oder eines Gummistempels (aus einer

Spritze) und unter Zugabe von 1 ml FACS-Puffer durch einen cell strainer (BD Falcon,

cell strainer REF 352340) das ist eine Art Nylonnetz mit einer Porengröße von 40 µm

in ein 50 ml Falconröhrchen gepresst um das Gewebe zu zerteilen und Einzelzellen zu

erhalten. 300 µl der Zellsuspension (ca 1-2 x 106-Zellen) werden abgenommen und in

31

ein 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß überführt und mit FACS-Puffer auf 1 ml

aufgefüllt. Anschließend wird die Probe bei 2200 rpm für 3 min bei 4 °C zentrifugiert;

der Überstand wird verworfen du das Zellpellet wird in 1 ml FACS-Puffer resuspendiert.

Dieser Waschschritt wird 1x wiederholt.

Blocken der Zellen (Blut und Milz)

Nach dem letzten Waschschritt werden die Zellen jeder Probe jeweils in 50 µl Blocking-

Reagenz luftblasenfrei resuspendiert und 15-20 min auf Eis inkubiert. Dieser Schritt

dient der xxx. Anschließend wird die Probe in zwei gleiche Volumina zu je 30 µl

aliquotiert und bei 2200 rpm für 3 min bei 4°c zentrifugiert. Der Überstand wird

verworfen.

2.2.7.3 Antikörper Master-Mix und Antikörper Färbung (Blut und Milz)

Die jeweiligen Antikörper sind mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen konjugiert

und wurden in den unten stehenden Verdünnungen eingesetzt. Dabei wurden zwei

verschiedene Master-Mixe hergestellt; Master-Mix 1 diente der Färbung von B- und T-

Zellen, Master-Mix 2 diente der Färbung von CD4- und CD8-Zellen

Färbung von B-Zellen: CD3 FITC (1:50) in FACS-Puffer

Färbung von T-Zellen: CD19 PE (1:200) in FACS-Puffer

Färbung von CD4-Zellen: CD4 APC (1:400) in FACS-Puffer

Färbung von CD8-Zellen: CD8 PE-Zellen (1:800) in FACS-Puffer

Das Zellpellet wird in jeweils 100 µl Antikörper-Master-Mix (Master-Mix 1 oder 2)

vorsichtig resuspendiert (ohne zu schäumen) und im Kühlschrank für 60 min inkubiert.

Danach erfolgt die Zugabe von 1 ml FACS-Puffer. Anschließend wird die Probe bei

1800 rpm für 3 min bei 4°C zentrifugiert und der Überstand verworfen. Danach wird

das Zellpellet in 300 µl Totfarbstoff-Lösung resuspendiert um xxx. Die Arbeiten

erfolgen im Dunkeln, da die mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugierten Antikörper UV

sensitiv sind.

Kontrollmessungen

Zusätzlich zu den zu messenden Blut- und Milz-Proben wird jeweils die Blutprobe einer

Kontrollmaus (unbehandeltes wildtyp-Tier) gemessen um die Einstellungen des FACS

Gerätes zu überprüfen und gegebenenfalls zu korrigieren. Die Zelllyse und das

Blocken der Zellen erfolgt wie zuvor beschrieben. Im Anschluss an die Zentrifugation

wird die Probe in vier gleiche Volumina zu je 15 µl aliquotiert und bei 2200 rpm für 3

32

min bei 4°c zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Es werden drei verschiedene

Antikörper Master-Mixe angesetzt. Drei (der vier) Zellpellets werden in 100 µl des

jeweiligen Master-Mixes vorsichtig resuspendiert. Das vierte Zellpellet wird in 250 µl

Totfarbstofflösung resuspendiert.

Master-Mix 1 CD3-FITC (1:50) 100 µl FACS-Puffer 2 µl AK

Master Mix 2 CD19-PE (1:200) 200 µl FACS-Puffer 1 µl AK

Master Mix 3 CD11b-APC (1:400) 400 µl FACS-Puffer 1 µl AK

Vor der FACS-Messung werden alle Proben über einen cell strainer (5 ml Polystyrene

Round Bottom Tube with cell strainer cap, BD Falcon, Ref 352235) pipettiert um,

eventuell vorhandene Zellklumpen, zu entfernen.

2.2.8 Bestimmung des Alters bei Beginn der symptomatischen und Endstadium-

Phase

Zur Überprüfung der Wirksamkeit des Medikaments wurde sowohl bei Eintritt in die

symptomatische Phase als auch in die Endstadium-Phase das Alter der Tiere

bestimmt.

Zur Bestimmung des Eintritts in die Symptomatische Phase wurden folgende Kriterien

verwendet:

• Gewichtsverlust von 3g im Vergleich zum max. Gewicht der jeweiligen Maus

• Wenn man die Maus am Schwanz hochhält, sind die Beine im Allgemeinen im

45° Winkel abgespreizt; bei symptomatischen Tieren sind die Beine nicht mehr

abgespreizt. Sie zittern und hängen unter dem Körper

• Gangveränderungen

Das Endstadium ist, wie folgt, definiert:

• Die Tiere haben das Endstadium erreicht, sobald sie nicht mehr in der Lage

sind, sich unverzüglich aufzurichten, nachdem sie auf die Seite gelegt wurden.

Die Tiere entwickeln Symptome, die der humanen ALS sehr ähnlich sind. Daher

würden sie ohne Euthanasie an einer respiratorischen Insuffizienz sterben.

Aus Gründen des Tierschutzes wurden die Tiere daher getötet, sobald sie das

Endstadium der Erkrankung erreicht hatten.

33

Die Ergebnisse wurden mit einfachen Parametern der deskriptiven Statistik wie

Mittelwert, Standardabweichung analysiert. Die visuelle Darstellung der Ergebnisse

erfolgte in einem Kaplan-Maier Plot.

2.2.9 Statistische Analyse

2.2.9.1 Deskriptive Statistik

Mittelwert und Standardabweichung

In unsere Studie haben wir den Mittelwert und Standartabweichung zur besseren

Veranschaulichung unserer Ergebnisse verwendet.

2.2.9.2 Signifikanztestung

Anova one way und Post Hoc Tests

Der „One-way Analysis of Variance“ (abgekürzt one-way ANOVA) ermöglicht es, drei

oder mehr Behandlungsgruppen miteinander zu vergleichen. Mit diesem Test kann

gezeigt werden, ob ein signifikanter Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen

besteht oder nicht. Dabei zeigt dieser Test nicht, zwischen welchen

Behandlungsgruppen ein signifikanter Unterschied besteht. Dafür werden im

Anschluss an den ANOVA sogenannte Post Hoc Tests verwendet.

Post Hoc Tests vergleichen die Unterschiede zwischen den Mittelwerten

verschiedener Behandlungsgruppen, um signifikante Unterschiede zu differenzieren.

In unserer Studie wurden folgende Post Hoc Tests verwendet:

• Least Significant Difference-Test,

• Tukey-Test und

• Scheffé-Test

2.2.10 Spezielle Software

- Word Microsoft Office 2013

- Excel Microsoft Office 2013

- Graph Prism Version 6.07

34

3 Ergebnisse

3.1 Effekt von FTY720 auf α-Motoneurone von SOD1G93Adl-Tieren

Anmerkung für die immunhistochemischen Färbungen:

Unter der Voraussetzung, dass Wildtyptiere keinen altersabhängigen

Motoneuronenverlust sowie Astrogliose und Mikrogliaaktivierung im lumbalen

Rückenmark zeigen, wurden die unbehandelten Wildtyptiere nur zu einem

Alterszeitpunkt (200 Tage) untersucht. Aus Tierschutzgründen waren die transgenen

Tiere der Kontrollgruppe ebenfalls unbehandelt (Verzicht auf eine Applikation von

Wasser mittels Schlundsonde), da nicht davon auszugehen ist, dass eine

Schlundsondenbehandlung Auswirkungen auf die bei der IHC gemessenen Parameter

hat.

3.1.1 Quantitative Bestimmung der α-Motoneurone im lumbalen Rückenmark

Nachgewiesenermaßen zeigen SOD1G93Adl-Tiere im Krankheitsverlauf eine

ausgeprägte Degeneration der α-Motoneurone im lumbalen Rückenmark.

Das Ziel der Nissl-Färbung war es herauszufinden, ob FTY720 im Krankheitsverlauf

des SOD1G93Adl-Mausmodells einen protektiven Effekt auf α-Motoneurone im lumbalen

Rückenmark hat.

Im Vergleich zu Wildtyptieren zeigen unbehandelte SOD1G93Adl- Kontrolltiere bereits in

der präsymptomatischen Phase der Erkrankung, d.h. im Alter von ca. 70 Tagen, einen

Motoneuronenverlust von ca. 20%.

Bei den präsymptomatischen SOD1G93Adl-Tieren, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720

behandelt wurden, sind ca. 21 % mehr α-Motoneurone nachweisbar als bei den

unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren. Dies zeigt, dass bei den

präsymptomatischen SOD1G93Adl-Tieren, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt

wurden, kein Motoneuronenverlust zu beobachten ist.

Dieser Effekt zeigt sich ebenfalls bei den präsymptomatischen SOD1G93Adl-Tieren, die

mit 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden. Im Vergleich zu den unbehandelten

SOD1G93Adl- Kontrolltieren sind bei den 3,0 mg/kg Tag FTY720 dosierten Tieren ca.

28% mehr α-Motoneurone im lumbalen Rückenmark nachweisbar, so dass auch hier

in der präsymptomatischen Phase kein Motoneuronenverlust aufgetreten ist.

35

In der symptomatischen Phase der Erkrankung ist bei den unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltieren im Vergleich zu Wildtyp-Tieren ein Verlust von ca. 57% an α-

Motoneuronen nachweisbar. Im Vergleich zu präsymptomatischen SOD1G93Adl-Tieren

haben symptomatische SOD1G93Adl-Tiere ca. 46 % weniger α-Motoneurone. Die

Behandlung mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 führt zu einem geringeren Verlust an α-

Motoneurone.

SOD1G93Adl-Tiere, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, besitzen in der

symptomatischen Phase 32 % mehr α-Motoneurone als unbehandelte transgene

SOD1G93Adl-Tiere. Die symptomatischen SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag

FTY720 behandelt wurden, haben jedoch ca. 8 % weniger α-Motoneurone als die

unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltiere. Bei den symptomatischen SOD1G93Adl-

Tieren, die mit der Dosierung 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, ist ein

neuroprotektiver Effekt erkennbar. Im Gegensatz dazu zeigt sich bei den höher

dosierten SOD1G93Adl-Tieren kein oder sogar ein neurotoxischer Effekt.

Unbehandelte SOD1G93Adl-Tiere weisen im Vergleich zu Wildtyp-Tieren im Endstadium

der Erkrankung ca. 71% weniger α-Motoneurone auf. Im Gegensatz zu

präsymptomatischen unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren haben unbehandelte

SOD1G93Adl- Kontrolltiere im Endstadium ca. 63 % weniger α-Motoneurone.

Die SOD1G93Adl-Tiere, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, weisen ca. 33

% weniger α-Motoneurone auf als die im Endstadium unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltiere. Die SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY 720 behandelt wurden,

haben im Endstadium ca. 5 % weniger α-Motoneurone als die symptomatischen

unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltiere. Ein neuroprotektiver Effekt von FTY720 ist

hier in keiner Dosierung erkennbar. Die beobachteten neuroprotektiven Effekte der

präsymptomatischen und symptomatischen Tiere, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720

behandelt wurden, sind jedoch nicht signifikant.

36

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Abbildung 1: Quantitative Bestimmung der α-Motoneurone im lumbalen Rückenmark von SOD1G93Adl-

Mäusen. Angegeben sind jeweils der Mittelwert und die Standardabweichung. Jeder Punkt repräsentiert

einen Messwert (α-Motoneurone einer Maus). Das lumbale Rückenmark der SOD1G93Adl-Mäuse wurde

in der präsymptomatischen Phase (ca. 60 Tage), in der symptomatischen Phase (Beginn der

Symptomatik) und im Endstadium (sobald die SOD1G93Adl-Mäuse nicht mehr in der Lage sind, sich

unverzüglich aufzurichten, nachdem sie auf die Seite gelegt wurden) untersucht. Untersuchung des

Wirkmechanismus von FTY720 am Universitätsklinikum Ulm im Jahr 2014. SOD1G93A= Punktmutation

in der Superoxid Dismutase 1, Austausch von Glycin gegen Alanin an der Stelle 93; dl= delay; WT=

unbehandelte Wildtyptiere.

3.1.2 Quantitative Analyse der phosphorilierten Neurofilamente H (pNFH) im

Hirnhomogenat von SOD1G93Adl-Mäusen

Neurofilamente sind axonale Strukurproteine und spielen eine entscheidende Rolle bei

der Aufrechterhaltung der Zellarchitektur von Neuronen. Der Verlust von

Neurofilamenten im Hirnhomogenat stellt ein weiteres pathologisches Merkmal des

SOD1G93Adl-Mausmodells dar. Durch die Degeneration der Neurone erfolgt die

Freisetzung der Neurofilamenten in den Liquor. Der Liquor wird über die Granulationes

arachnoidales im Liquorsystem resorbiert und über das Lymphsystem an den

Blutkreislauf abgegeben. Das bedeutet, je mehr Neurofilamente im Homogenat

detektiert werden, desto wahrscheinlicher ist es, dass die Zellarchitekur der α-

Motoneurone erhalten bleibt und dadurch die Degeneration geringer ausfällt. Die

37

quantitative Analyse der phosphorilierten Neurofilamente H (pNFH) im

Hirnhomogenanat wurde mit Hilfe des Sandwich ELISA durchgeführt. pNFH ist neben

NFM und NFL einer der 3 Hauptuntereinheiten von Neurofilamenten.

Ziel war es, einen Effekt von FTY720 auf die pNFHs im Hirnhomogenat im

Krankheitsverlauf des SOD1G93Adl-Mausmodells zu zeigen.

Eine Abnahme der pNFHs bei den unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltieren gegenüber

den Wildtyp-Tieren ist im Krankheitsverlauf des SOD1G93Adl-Mausmodells nicht zu

beobachten. Damit ist ein Vergleich der mit FTY720 behandelten Therapiegruppen und

den unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren nicht möglich.

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Abbildung 2: Quantitative Analyse der phosphorilierten Neurofilamente H (pNFH) im Hirnhomogenat von

SOD1G93Adl-Mäusen. Angegeben sind jeweils der Mittelwert und die Standardabweichung. Jeder Punkt

repräsentiert einen Messwert (pNFH in μmol/ml einer Maus). Das Hirnhomogenat der SOD1G93Adl-Mäuse

wurde in der präsymptomatischen Phase (ca. 60 Tage), in der symptomatischen Phase (Beginn der

Symptomatik) und im Endstadium (sobald die SOD1G93Adl-Mäuse nicht mehr in der Lage sind, sich

unverzüglich aufzurichten, nachdem sie auf die Seite gelegt wurden) untersucht. Untersuchung des


in der Superoxid Dismutase 1, Austausch von Glycin gegen Alanin an der Stelle 93; dl= delay; pNFH=

phosphorilierte Neurofilamente Heavy Chain; WT= unbehandelte Wildtyptiere.

38

3.1.3 Messung von FTY720 und FTY720-Phosphat im Hirnhomogenat

Die Messung von FTY720 und seinem aktiven Metabolit FTY720-Phosphat diente der

Beurteilung, ob das Medikament über die Blut-Hirnschranke in das ZNS gelangt. Dies

ist Voraussetzung für einen direkten neuroprotektiven Effekt.

Untersucht wurde die Konzentration von FTY720 und FTY720-Phosphat im

Hirnhomogenat der mit FTY720 behandelten SOD1G93Adl-Tiere zu zwei verschiedenen

Zeitpunkten (präsymptomatisch, symptomatisch). FTY720 und FTY720-Phosphat sind

im Hirnhomogenat der behandelten SOD1G93Adl-Tiere nachweisbar. Aufgrund der

geringen Fallzahl im Endstadium wurde auf die Darstellung im Diagramm verzichtet.

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***

Abbildung 3: FTY720 Konzentration im Hirnhomogenat von SOD1G93Adl-Mäusen. Angegeben sind

jeweils Mittelwert und Standardabweichung. Jeder Punkt repräsentiert einen Messwert (FTY720

Konzentration im Hirnhomogenat von einer Maus). Die FTY720 Konzentration der SOD1G93Adl-Mäuse

wurde in der präsymptomatischen Phase (ca. 60 Tage) und in der symptomatischen Phase (Beginn der

Symptomatik) untersucht. Untersuchung des Wirkmechanismus von FTY720 am Universitätsklinikum

Ulm im Jahr 2014. SOD1G93A= Punktmutation in der Superoxid Dismutase 1, Austausch von Glycin

gegen Alanin an der Stelle 93; dl= delay;

39

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***

Abbildung 4: FTY720-Phosphat Konzentration im Hirnhomogenat von SOD1G93Adl-Mäusen. Angegeben

sind jeweils Mittelwert und Standardabweichung. Jeder Punkt repräsentiert einen Messwert (FTY720-

Phosphat Konzentration im Hirnhomogenat von einer Maus). Die FTY720 Konzentration der SOD1G93Adl-

Mäuse wurde in der präsymptomatischen Phase (ca. 60 Tage) und in der symptomatischen Phase

(Beginn der Symptomatik) untersucht. Untersuchung des Wirkmechanismus von FTY720 am

Universitätsklinikum Ulm im Jahr 2014. SOD1G93A= Punktmutation in der Superoxid Dismutase 1,

Austausch von Glycin gegen Alanin an der Stelle 93; dl= delay;

3.1.4 Alter der SOD1G93Adl-Tiere bei Krankheitsbeginn

Kaplan-Meier-Kurven sind Überlebenszeitkurven, die die Zeit zwischen einem

Anfangs- und Endergebnis untersuchen. Es ist aufgezeichnet, in welchem zeitlichen

Abstand ein einmaliges Ereignis – hier der Krankheitsbeginn – in Relation zum

Studienstart eintritt.

Ziel war es zu untersuchen, ob FTY720 zu einer Verzögerung des Krankheitsbeginns

bei transgenen SOD1G93Adl-Tieren führt.

Die Behandlung mit FTY720 hat in keiner Dosierung einen Effekt auf den

Krankheitsbeginn der transgenen SOD1G93Adl-Tiere. Bei der Analyse des

Krankheitsbeginn ergibt sich beim globalen log rank Test (p=0,7999) keine

signifikanten Unterschiede.

40

Abbildung 5: Alter der SOD1G93Adl-Tiere bei Krankheitsbeginn

3.2 Effekt von FTY720 auf proinflammatorische Parameter im ZNS und im

Blut von SOD1G93Adl-Tieren

Es sollte die Wirkung von FTY720 auf die Neuroinflammation SOD1G93Adl-Mausmodell

untersucht werden. Dafür wurde die Anzahl an aktivierten Astrozyten und Mikroglia im

lumbalen Rückenmark analysiert, die T- und B-Zellen bzw. CD4+ und CD8+ T-Zellen

im Vollblut und Milzhomogenat mittels FACS-Analyse bestimmt und ein Zytokinprofil

mittels ELISA erstellt. FTY720 ist ein Immunmodulator, der als funktioneller Antagonist

den S1P 1 -Rezeptor vermittelten Austritt der Lymphozyten aus den Lymphknoten

in das ZNS sowie in das Blut blockiert (Mehling et al. 2011), (Pinschewer et al. 2011).

3.2.1 Quantitative Bestimmung der Astrozyten (GFAP)

Astrogliose beschreibt einen Zustand der Astrozyten, bei dem diese hypertroph und

hyperplastisch werden. Zudem exprimieren sie in diesem Zustand vermehrt das „Glial

A lte r (T a g e n )

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1 ,0 m g /k g T a g F T Y 7 2 0

3 ,0 m g /k g T a g F T Y 7 2 0

41

fibrillary acidic protein“, kurz GFAP genannt. Die Astrogliose stellt ein wichtiges

pathologisches Merkmal des SOD1G93Adl-Mausmodells dar. Im Verlauf nimmt sie stetig

zu und korreliert somit im Krankheitsverlauf des SOD1G93Adl-Mausmodells umgekehrt

proportional zu der Anzahl der α-Motoneurone im lumbalen Rückenmark.

Zweck der immunhistochemischen Antikörperfärbung mit dem Anti-GFAP Antikörper

war es, einen potentiellen Effekt des Medikaments auf die Astrogliose im SOD1G93Adl-

Mausmodell zu untersuchen.

Vergleicht man die präsymptomatischen unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltiere mit

den Wildtyp-Tieren kann in der präsymptomatischen Phase der Erkrankung noch keine

Astrogliose beobachtet werden.

Morphologisch zeigten sich die Astroglia in der präsymptomatischen Phase in allen

Behandlungsgruppen punktförmig und schwach durch den Anti-GFAP Antikörper

angefärbt. Dies spricht auch für einen späteren Beginn der Astrogliose im

Krankheitsverlauf des SOD1G93Adl-Mausmodells.

In der symptomatischen Phase der Erkrankung ist bei den unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltieren im Vergleich zu den unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren der

präsymptomatischen Phase eine Zunahme der GFAP positiven Astrozyten von ca. 115

% zu beobachten. In diesem Fall kann man von Astrogliose sprechen. 1,0 mg/kg und

3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere weisen in der symptomatischen

Phase ca. 3-5 % mehr GFAP positive Astrozyten auf, als die unbehandelten

SOD1G93Adl- Kontrolltiere.

Ein Effekt von FTY720 auf die Astrogliose in der symptomatischen Phase zeigt sich

deshalb in keiner Dosierung.

Die unbehandelten transgenen SOD1G93Adl-Tiere weisen im Endstadium im Vergleich

zu symptomatischen unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren 22 % mehr GFAP

positive Astrozyten auf.

1,0 mg/kg und 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere zeigen gegenüber

den unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren im Endstadium ca. 20 % weniger GFAP

positive Astrozyten. Eine Reduktion der Astrogliose von FTY720 ist sowohl in der

niedrigen als auch in der hohen Dosierung erkennbar. Aufgrund der geringen Fallzahl

von 2-3 Endstadiumtieren ist die Beobachtung einer verminderten Astrogliose bei den

1,0 mg/kg Tag und 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelten Tieren nicht aussagekräftig.

Die beobachtete Verminderung der Astrogliose bei den behandelten Endstadiumtieren

ist nicht signifikant.

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Abbildung 6: Quantitative Analyse der Astrozyten (GFAP) im lumbalen Rückenmark von SOD1G93Adl-

Mäusen. Angegeben sind jeweils der Mittelwert und die Standardabweichung. Jeder Punkt repräsentiert

einen Messwert (Astrozyten einer Maus). Das lumbale Rückenmark der SOD1G93Adl-Mäuse wurde in der

präsymptomatischen Phase (ca. 60 Tage), in der symptomatischen Phase (Beginn der Symptomatik)

und im Endstadium (sobald die SOD1G93Adl-Mäuse nicht mehr in der Lage sind, sich unverzüglich

aufzurichten, nachdem sie auf die Seite gelegt wurden) untersucht. Untersuchung des


in der Superoxid Dismutase 1, Austausch von Glycin gegen Alanin an der Stelle 93; dl= delay; GFAP=

Glial fibrillary acidic protein.

3.2.2 Quantitative Analyse der Mikroglia im lumbalen Rückenmark von

SOD1G93Adl-Mäusen

Mikroglia sind die Makrophagen des ZNS und stellen ein typisches pathologisches

Merkmal im Krankheitsverlauf des SOD1G93Adl-Mausmodells dar. Mikroglia

exprimieren, je stärker sie aktiviert sind, das Oberflächenprotein IBA1. Zweck der

immunhistochemischen Antikörperfärbung im Rückenmark der SOD1G93Adl-Tiere mit

dem Anti-IBA1 Antikörper war es, einen Effekt von FTY720 auf die Mikrogliaaktivierung

im SOD1G93Adl-Mausmodell zu untersuchen.

43

Vergleicht man die präsymptomatischen unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltiere mit

den Wildtyp-Tieren kann in der präsymptomatischen Phase der Erkrankung noch keine

Mikrogliaaktivierung beobachtet werden.

Morphologisch zeigen sich die Mikroglia in der präsymptomatischen Phase in allen

Behandlungsgruppen eher punktförmig und schwach durch den Anti-IBA1 Antikörper

angefärbt, was zusätzlich für einen späteren Beginn der Mikrogliaaktivierung im

Krankheitsverlauf des SOD1G93Adl-Mausmodells spricht.

In der symptomatischen Phase weisen die unbehandelte SOD1G93Adl- Kontrolltiere

gegenüber unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren der präsymptomatischen Phase

ca. 527 % mehr IBA1-positive Mikroglia auf, so dass man hier von Mikrogliaaktivierung

sprechen kann. Zudem sind die Mikroglia in dieser Phase morphologisch stark

verzweigt und deutlich angefärbt.

1,0 mg/kg und 3,0 mg/kg Tag FTY 720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere zeigen sich in der

symptomatischen Phase im Vergleich zu den unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltieren ca. 5-15 % mehr IBA1-positive Mikroglia.

In der symptomatischen Phase ist eine Verminderung der Mikrogliaaktivierung durch

FTY720 in keiner Dosierung zu sehen.

Im Endstadium weisen die unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltiere verglichen mit den

unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren in der symptomatischen Phase ca. 54 %

mehr IBA1 positive Mikroglia auf.

Die SOD1G93Adl-Tiere, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, zeigen

gegenüber unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren im Endstadium ca. 6% weniger

IBA1-positive Mikroglia. Die SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720

behandelt wurden, offenbaren im Endstadium ca. 15 % mehr IBA1-positive Mikroglia

als bei den unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren. Eine geringfügige Reduktion der

Mikrogliaaktivierung ist nur in einer Dosierung von 1,0 mg/kg Tag FTY720 erkennbar.

Aufgrund der geringen Fallzahl von 2-3 Endstadiumtieren ist die Beobachtung einer

Abschwächung der Mikrogliaaktivierung bei den 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelten

Tieren nicht aussagekräftig. Zudem zeigt die Verminderung der Mikrogliaaktivierung

bei den 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelten Tieren im Endstadium keine Signifikanz

auf.

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Abbildung 7: Quantitative Analyse der Mikroglia (IBA1) im lumbalen Rückenmark von SOD1G93Adl-

Mäusen . Angegeben sind jeweils der Mittelwert und die Standardabweichung. Jeder Punkt repräsentiert

einen Messwert (Mikroglia einer Maus). Das lumbale Rückenmark der SOD1G93Adl-Mäuse wurde in der





in der Superoxid Dismutase 1, Austausch von Glycin gegen Alanin an der Stelle 93; dl= delay; IBA1=

ionized calcium binding adapter molecule 1 .

3.2.3 Quantitative Analyse von T- und B-Zellen bzw. CD4+- und CD8+-T-Zellen im

Vollblut von SODG93Adl-Tieren

Anmerkung zur FACS-Analyse:

Alle Wildtyp-Tiere wurden im Alter von 200 Tagen untersucht.

3.2.3.1 B-Zellen im Vollblut

Die B-Zellen sind Lymphozyten, die zur Gruppe der Leukozyten gehören. Sie stellen

zusammen mit den T-Zellen das adaptive Immunsystem dar. Sie können durch T-

Zellen aktiviert werden und differenzieren sich daraufhin zu Plasmazellen oder

Gedächtniszellen.

Die quantitative FACS-Analyse von B-Zellen im Vollblut diente dem Zweck, den

Einfluss von FTY720 auf B-Zellen im SOD1G93Adl-Mausmodell zu zeigen.

45

Im Vergleich zu Wildtyp-Tieren zeigen unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere in der

präsymptomatischen Phase der Erkrankung ca. 14 % weniger B-Zellen.

1,0 mg/kg und 3,0 mg/kg Tag FTY 720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere haben ca. 58 -

64% weniger B-Zellen im Blut als unbehandelte transgene SOD1G93Adl-Tiere. Ein

signifikanter Effekt von FTY720 hinsichtlich einer Reduzierung der B-Zellanzahl im

Vollblut der SOD1G93Adl-Tiere in der präsymptomatischen Phase des SOD1G93Adl-

Mausmodells ist in beiden verwendeten Dosierungen erkennbar (p< 0,001).

In der symptomatischen Phase offenbaren die unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltiere gegenüber präsymptomatischen unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltieren ca. 30 % mehr B-Zellen im Vollblut.

1,0 mg/kg und 3,0 mg/kg Tag FTY 720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere besitzen in der

symptomatischen Phase, verglichen mit den unbehandelten transgenen SOD1G93Adl-

Tieren, ca. 82-90 % weniger B-Zellen im Vollblut.

Ein signifikanter Effekt von FTY720 bezüglich der Reduzierung der B-Zellanzahl im

Vollblut der SOD1G93Adl-Tiere ist in der symptomatischen Phase unabhängig von der

Dosis erkennbar (p< 0,001).

Im Endstadium zeigen die unbehandelten transgenen SOD1G93Adl-Tiere im Vergleich

zu symptomatischen unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren 30% weniger B-Zellen

im Vollblut.

1,0 mg/kg und 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere weisen im

Vergleich zu unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren im Endstadium ca. 90 %

weniger B-Zellen im Vollblut auf. Ein signifikanter Effekt von FTY720 ist hinsichtlich der

Verminderung der B-Zellanzahl im Vollblut von SOD1G93Adl-Tieren in beiden

verwendeten Dosierungen erkennbar (p<0,001). In keinem Krankheitsstadium ist ein

dosisabhängiger Effekt zu sehen.

In der symptomatischen Phase zeigen unbehandelte transgene SOD1G93Adl-Tiere ca.

30% mehr B-Zellen im Vollblut als in der präsymptomatischen Phase sowie im

Endstadium.

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Abbildung 8: Quantitative Analyse der B-Zellen im Vollblut von SOD1G93Adl-Mäusen. Angegeben sind

jeweils Mittelwert und Standardabweichung. Jeder Punkt repräsentiert einen Messwert (B-Zellanzahl

einer Maus). Das Vollblut der SOD1G93Adl-Mäuse wurde in der präsymptomatischen Phase (ca. 60 Tage),

in der symptomatischen Phase (Beginn der Symptomatik) und im Endstadium (sobald die SOD1G93Adl-

Mäuse nicht mehr in der Lage sind, sich unverzüglich aufzurichten, nachdem sie auf die Seite gelegt

wurden) untersucht. Untersuchung des Wirkmechanismus von FTY720 am Universitätsklinikum Ulm im

Jahr 2014. SOD1G93A= Punktmutation in der Superoxid Dismutase 1, Austausch von Glycin gegen

Alanin an der Stelle 93; dl= delay;

3.2.3.2 T-Zellen im Vollblut

T-Zellen sind Lymphozyten, die zur Gruppe der Leukozyten gehören. Zusammen mit

den B-Zellen bilden sie das adaptive Immunsystem.

Die quantitative FACS-Analyse von T-Zellen im Vollblut diente dem Zweck, den

Einfluss von FTY720 auf T-Zellen im SOD1G93Adl-Mausmodells zu zeigen.

In der präsymptomatischen Phase besitzen unbehandelte transgene SOD1G93Adl-

Kontrolltiere gegenüber Wildtyp-Tieren ca. 37 % mehr T-Zellen.

1,0 mg/kg und 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere haben in der

präsymptomatischen Phase ca. 85-92 % weniger T-Zellen als unbehandelte

SOD1G93Adl-Kontrolltiere. Ein signifikanter Effekt von FTY720 bezüglich der

Verminderung der T-Zellanzahl im Vollblut ist unabhängig von der Dosis erkennbar

(p<0,001).

47

In der symptomatischen Phase offenbaren die unbehandelte SOD1G93Adl- Kontrolltiere

gegenüber präsymptomatischen unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren ungefähr

gleich viel T-Zellen.


symptomatischen Phase, verglichen mit den unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren,

ca. 88-91 % weniger T-Zellen im Vollblut. Es zeigt sich in der symptomatischen Phase

dosisunabhängig ein signifikanter Effekt von FTY720 in Bezug auf die Verminderung

der T-Zellen im Vollblut (p<0,001).

Im Endstadium weisen die unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltiere gegenüber den

unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren der symptomatischen Phase ca. 35 %

weniger T-Zellen auf.

1,0 mg/kg und 3,0 mg/kg Tag FTY 720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere haben im

Endstadium, verglichen mit unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren, ca. 91-93 %

weniger T-Zellen im Vollblut. Ein signifikanter Effekt von FTY720 in Bezug auf die

Verminderung der T-Zellanzahl im Vollblut ist unabhängig von der Dosis erkennbar

(p<0,001).

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Abbildung 9: Quantitative Analyse der T-Zellen im Vollblut von SOD1G93Adl-Mäusen. Angegeben sind

jeweils Mittelwert und Standardabweichung. Jeder Punkt repräsentiert einen Messwert (T-Zellanzahl

einer Maus). Das Vollblut der SOD1G93Adl-Mäuse wurde in der präsymptomatischen Phase (ca. 60 Tage),

in der symptomatischen Phase (Beginn der Symptomatik) und im Endstadium (sobald die SOD1G93Adl-

Mäuse nicht mehr in der Lage sind, sich unverzüglich aufzurichten, nachdem sie auf die Seite gelegt

wurden) untersucht. Untersuchung des Wirkmechanismus von FTY720 am Universitätsklinikum Ulm im

Jahr 2014. SOD1G93A= Punktmutation in der Superoxid Dismutase 1, Austausch von Glycin gegen

Alanin an der Stelle 93; dl= delay;

3.2.3.2 CD4+ T-Zellen im Vollblut

CD4 ist ein Glykoprotein auf der Zelloberfläche der T-Zellen. Es handelt sich um einen

Corerezeptor. Er interagiert gemeinsam mit dem T-Zellrezeptor und dem MHC-Klasse-

II Molekül auf Antigen präsentierenden Zellen. Aktivierte CD4+-T-Helferzellen spielen

eine entscheidende Rolle für die Aktivierung (Lizenzierung) reifer,

antigenpräsentierender dendritischer Zellen (Livingstone et al. 2009), und sie spielen

damit eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung einer langanhaltenden

Immunantwort und einer ausgeprägten Inflammation. CD4+ T-Zellen gehören zu den

49

T-Zellen. Die quantitativen FACS-Analyse von CD4+ T-Zellen im Vollblut diente dem

Zweck, den Einfluss von FTY720 auf CD4+ T-Zellen im SOD1G93Adl-Mausmodell zu

zeigen.

In der präsymptomatischen Phase haben unbehandelte SOD1G93Adl- Kontrolltiere

gegenüber Wildtyp-Tieren ca. 60 % mehr CD4+-T-Zellen im Vollblut.

1,0 mg/kg und 3,0 mg/kg Tag FTY 720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere haben in der

präsymptomatischen Phase ca. 94-95 % weniger CD4+-T-Zellen als unbehandelte

SOD1G93Adl-Kontrolltiere. Ein signifikanter Effekt von FTY720 ist bezüglich der

Verminderung der Anzahl an CD4+ T-Zellen im Vollblut, unabhängig von der Dosis,

erkennbar (p<0,001).

In der symptomatischen Phase haben unbehandelte SOD1G93Adl- Kontrolltiere

gegenüber unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren in der präsymptomatischen

Phase ungefähr 57 % weniger CD4+-T-Zellen.

Die 1,0 mg/kg behandelten SOD1G93Adl-Tiere besitzen wie auch die 3,0 mg/kg Tag FTY

720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere, verglichen mit unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltieren in der symptomatischen Phase, ca. 86-98 % weniger CD4+ T-Zellen. Es

lässt sich ein signifikanter Effekt von FTY720 hinsichtlich der Verminderung der Anzahl

der CD4+-T-Zellen im Vollblut beobachten (p<0,001).

Im Endstadium haben unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere gegenüber

unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren der symptomatischen Phase ca. 40 % mehr

CD4+-T-Zellen im Vollblut.

Die SOD1G93Adl-Tiere, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, haben im

Endstadium, verglichen mit den unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren, ca. 97 %

weniger CD4+-T-Zellen. Gleiches gilt auch für SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag

FTY720 behandelt wurden. Ein signifikanter Effekt von FTY720 bezüglich der

Verminderung der Anzahl der CD4+-T-Zellen im Vollblut der behandelten SOD1G93Adl-

Tiere ist unabhängig von der Dosis erkennbar (p<0,001).

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Abbildung 10: Quantitative Analyse der CD4+ T-Zellen im Vollblut von SOD1G93Adl-Mäusen. Angegeben

sind jeweils Mittelwert und Standardabweichung. Jeder Punkt repräsentiert einen Messwert (CD4+-T-

Zellanzahl einer Maus). Das Vollblut der SOD1G93Adl-Mäuse wurde in der präsymptomatischen Phase

(ca. 60 Tage), in der symptomatischen Phase (Beginn der Symptomatik) und im Endstadium (sobald

die SOD1G93Adl-Mäuse nicht mehr in der Lage sind, sich unverzüglich aufzurichten, nachdem sie auf die

Seite gelegt wurden) untersucht. Untersuchung des Wirkmechanismus von FTY720 am



3.2.3.3 CD8+ T-Zellen im Vollblut

CD8 ist ein transmembranes Glykoprotein, das als Co-Rezeptor mit dem T-

Zellrezeptor agiert. Die Aufgabe der CD8+ zytotoxischen T-Zellen ist das Töten von

Krebszellen, von Virus infizierten Zellen oder anderen beschädigten Zellen. Sie

exprimieren den T-Zellrezeptor, der ein spezifisches Antigen erkennen kann. Antigene

werden innerhalb der Zelle durch das MHC-I-Klasse Molekül gebunden und an der

Zelloberfläche präsentiert. Die CD8+ zytotoxischen T-Zellen binden an das MHC-I-

Klasse Molekül, werden aktiviert und üben ihre zytotoxische Wirkung gegenüber der

Zelle aus. Sie stellen eine Subpopulation der T-Zellen dar und werden deshalb durch

FTY720 beeinflusst. Dabei werden nur Lymphozyten beeinflusst, die den CCR7

Retentionsrezeptor tragen.

Die quantitative FACS-Analyse von CD8+-T-Zellen im Vollblut diente dem Zweck, den

Einfluss von FTY720 auf CD8+T-Zellen im SOD1G93Adl-Mausmodell zu zeigen.

51

Unbehandelte SOD1G93Adl- Kontrolltiere haben in der präsymptomatischen Phase

gegenüber Wildtyp-Tieren ca. 10 % mehr CD8+-T-Zellen im Vollblut. 1,0 mg/kg Tag

FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere besitzen wie auch die 3,0 mg/kg Tag FTY 720

behandelten SOD1G93Adl-Tiere ca. 96-97 % weniger CD8+-T-Zellen im Vollblut als

unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere. Unabhängig von der Dosis ist ein signifikanter

Effekt von FTY720 bezüglich der Verminderung der Anzahl der CD8+-T-Zellen im

Vollblut der behandelten SOD1G93Adl-Tiere erkennbar (p<0,001).

Unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere der symptomatischen Phase haben gegenüber

unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren der präsymptomatischen Phase ca. 3 %

mehr CD8+-T-Zellen.


symptomatischen Phase, verglichen mit unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren, ca.

92-93 % weniger CD8+ T-Zellen im Vollblut. Hinsichtlich der Verminderung der CD8+-

T-Zellzahl ist unabhängig von der Dosis ein signifikanter Effekt von FTY720 im Vollblut

der behandelten SOD1G93Adl-Tiere erkennbar (p<0,001).

Im Endstadium weisen unbehandelte SOD1G93Adl- Kontrolltiere gegenüber


weniger CD8+-T-Zellen auf.



weniger CD4+-T-Zellen. Gleiches gilt auch für SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag

FTY720 behandelt wurden. Hinsichtlich der Verminderung der Anzahl der CD4+-T-

Zellen im Vollblut von behandelten SOD1G93Adl-Tieren lässt sich ein signifikanter Effekt

von FTY720, unabhängig von der Dosis, beobachten (p<0,001).

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Abbildung 11: Quantitative Analyse der CD8+ T-Zellen im Vollblut von SOD1G93Adl-Mäusen. Angegeben

sind jeweils Mittelwert und Standardabweichung. Jeder Punkt repräsentiert einen Messwert (CD8+-T-

Zellanzahl einer Maus). Das Vollblut der SOD1G93Adl-Mäuse wurde in der präsymptomatischen Phase

(ca. 60 Tage), in der symptomatischen Phase (Beginn der Symptomatik) und im Endstadium (sobald

die SOD1G93Adl-Mäuse nicht mehr in der Lage sind, sich unverzüglich aufzurichten, nachdem sie auf die

Seite gelegt wurden) untersucht. Untersuchung des Wirkmechanismus von FTY720 am



3.2.4 Quantitative Analyse von T- und B-Zellen bzw. CD4+- und CD8+-T-Zellen im

Homogenat der Milz

3.2.4.1 B-Zellen im Milzhomogenat

Die B-Zellen sind Lymphozyten, die zur Gruppe der Leukozyten gehören. Sie stellen

zusammen mit den T-Zellen das adaptive Immunsystem dar. Sie können durch T-

Zellen aktiviert werden und differenzieren sich daraufhin zu Plasmazellen oder

Gedächtniszellen.

Die Milz ist das größte, sekundäre lymphatische Organ und spielt eine wichtige Rolle

in der Abwehr von hämatogenen Infektionen. Wie schon in der Einleitung beschrieben,

ist der Aufbau und die Organisation der Zellen in der Milz sehr komplex. Unter anderem

war es durch die Entdeckung von FTY720 möglich, die Prozesse in der Milz besser

erklären zu können. In der Milz zirkulieren die B-Zellen S1PR1-abhängig. FTY720

53

blockiert in seiner aktivierten Form, dem FTY720-Phosphat, als funktioneller

Antagonist den S1P-Rezeptor 1 (Mehling et al. 2011), (Pinschewer et al. 2011).

Dadurch bleiben die B-Zellen in der Milz konstant oder nehmen sogar zu (Brinkmann

2015).

Die quantitative FACS-Analyse von B-Zellen im Homogenat der Milz diente dem

Zweck, den Einfluss von FTY720 auf B-Zellen im SOD1G93Adl-Mausmodell zu zeigen.

Im Vergleich zu Wildtyp-Tieren weisen unbehandelte SOD1G93Adl- Kontrolltiere in der

präsymptomatischen Phase der Erkrankung, d.h. im Alter von ca. 70 Tagen, ca. 40 %

mehr B-Zellen auf. Dieser Unterschied weist keine Signifikanz auf.

präsymptomatische SOD1G93Adl-Tiere, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt

wurden, haben ca. 4 % mehr B-Zellen im Milzhomogenat als unbehandelte

SOD1G93Adl-Kontrolltiere. Die SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720

behandelt wurden, besitzen im Vergleich zu unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren

sogar ca. 17 % mehr B-Zellen im Milzhomogenat. Ein dosisabhängiger Effekt von

FTY720 zeigt sich in der präsymptomatischen Phase in Bezug auf den Anstieg der B-

Zellen im Milzhomogenat der SOD1G93Adl-Tiere. Die höhere Dosierung offenbart

hinsichtlich des Anstiegs der B-Zellen im Milzhomogenat der SOD1G93Adl-Tiere einen

stärkeren Effekt.

In der symptomatischen Phase zeigen die unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltiere

gegenüber unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren der präsymptomatischen Phase

ca. 35 % weniger B-Zellen.

1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere, besitzen in der symptomatischen

Phase im Gegensatz zu unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren ca. 27 % mehr B-

Zellen im Milzhomogenat. Die SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720

behandelt wurden, haben im Vergleich zu unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren ca.

15 % mehr B-Zellen im Milzhomogenat.

In Bezug auf den Anstieg der B-Zellen im Milzhomogenat der SOD1G93Adl-Tiere ist ein

Effekt von FTY720 in der symptomatischen Phase dosisabhängig erkennbar. Im

Gegensatz zu der präsymptomatischen Phase zeigen 1,0 mg/kg Tag FTY720

behandelte SOD1G93Adl-Tiere bezüglich des Anstieg der B-Zellen im Milzhomogenat

der SOD1G93Adl-Tiere einen stärkeren Effekt.

54

Im Endstadium zeigen die unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltiere ca. 18 % weniger

B-Zellen im Milzhomogenat, verglichen mit symptomatischen unbehandelten

SOD1G93Adl-Kontrolltieren.

Die 1,0 mg/kg behandelte SOD1G93Adl-Tiere besitzen ebenso wie die 3,0 mg/kg Tag

FTY720 behandelten SOD1G93Adl-Tiere ca. 6-10 % weniger B-Zellen im Milzhomogenat

auf. Ein dosisunabhängiger Effekt von FTY720, hinsichtlich der Verminderung der

Anzahl der B-Zellen im Milzhomogenat der behandelten SOD1G93Adl-Tiere, ist nur

schwach ausgeprägt.

Die beobachteten Effekte von FTY720 in Bezug auf die Erhöhung der B-Zellen in der

präsymptomatischen und symptomatischen Phase sowie der Verminderung der B-

Zellen im Endstadium sind jedoch nicht signifikant.

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Abbildung 12: Quantitative Analyse der B-Zellen im Milzhomogenat von SOD1G93Adl-Mäusen.

Angegeben sind jeweils Mittelwert und Standardabweichung. Jeder Punkt repräsentiert einen Messwert

(B-Zellanzahl einer Maus). Das Milzhomogenat der SOD1G93Adl-Mäuse wurde in der





in der Superoxid Dismutase 1, Austausch von Glycin gegen Alanin an der Stelle 93; dl= delay;

55

3.2.4.2 T-Zellen im Milzhomogenat

T-Zellen sind Lymphozyten, die zur Gruppe der Leukozyten gehören.

Durch Blockade dieses Rezeptors kommt es durch FTY720 zur Reduktion der T-Zellen

in der Milz (Brinkmann 2015). Die quantitative FACS-Analyse von T-Zellen im

Homogenat der Milz diente dem Zweck, den Einfluss von FTY720 auf T-Zellen im

SOD1G93Adl-Mausmodell zu zeigen.

In der präsymptomatischen Phase besitzen die unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltiere gegenüber Wildtyp-Tieren ca. 52 % mehr T-Zellen im Milzhomogenat.

1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere besitzen wie auch die 3,0 mg/kg

Tag FTY720 behandelten SOD1G93Adl-Tiere ca. 45-50 % weniger T-Zellen als

unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere. Ein signifikanter Effekt von FTY720 ist

hinsichtlich der Abnahme der T-Zellanzahl im Milzhomogenat der behandelten

SOD1G93Adl-Tiere, unabhängig von der Dosis, erkennbar (p<0,001).

Unbehandelte SOD1G93Adl- Kontrolltiere offenbaren in der symptomatischen Phase

gegenüber präsymptomatischen unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren ca. 18 %

weniger T-Zellen.

1,0 mg/kg Tag FTY720 und 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere

besitzen in der symptomatischen Phase, verglichen mit den unbehandelten

SOD1G93Adl- Kontrolltieren, ca. 71-75 % weniger T-Zellen im Milzhomogenat.

Hinsichtlich der Verminderung der T-Zellanzahl im Milzhomogenat bei den

behandelten SOD1G93Adl-Tieren lässt sich ein signifikanter Effekt von FTY720

beobachten (p<0,001).

Unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere im Endstadium weisen gegenüber

symptomatischen unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren ca. 23 % weniger T-Zellen

auf.



weniger T-Zellen. Im Vergleich zu unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren haben im

Endstadium SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, ca.

60 % weniger T-Zellen. In Bezug auf die Verminderung der T-Zellzahl im

Milzhomogenat der behandelten SOD1G93Adl-Tiere ist ein signifikanter Effekt von

FTY720 zu erkennen (p<0,001). Die höhere Dosierung von 3,0 mg/kg Tag FTY720

zeigt in diesem Zusammenhang den etwas stärkeren Effekt.

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Abbildung 13: Quantitative Analyse der T-Zellen im Milzhomogenat von SOD1G93Adl-Mäusen.


(T-Zellanzahl einer Maus). Das Milzhomogenat der SOD1G93Adl-Mäuse wurde in der





in der Superoxid Dismutase 1, Austausch von Glycin gegen Alanin an der Stelle 93; dl= delay;

3.2.4.3 CD4+ T-Zellen im Milzhomogenat

Wie schon ausführlich beschrieben, gehören CD4+-Zellen zu den T-Zellen.

Durch Blockade des S1P-Rezeptors 1 durch FTY720-Phosphat kommt es zur

Reduktion von CD4+-T-Zellen in der Milz (Brinkmann 2015).

Die quantitative FACS-Analyse von CD4+-T-Zellen im Homogenat der Milz diente dem

Zweck, den Einfluss von FTY720 auf CD4+ T-Zellen im SOD1G93Adl-Mausmodell zu

zeigen.

In der präsymptomatischen Phase besitzen unbehandelte SOD1G93Adl- Kontrolltiere

gegenüber Wildtyp-Tieren ca. 46 % mehr CD4+-T-Zellen im Milzhomogenat. Dieser

Unterschied weist keine Signifikanz auf.

In der präsymptomatischen Phase sind bei den 1,0 mg/kg Tag FTY 720 und 3,0 mg/kg

Tag FTY720 behandelten SOD1G93Adl-Tieren ca. 42-47 % weniger CD4+-T-Zellen im

57

Milzhomogenat nachweisbar als bei unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren.

Unabhängig von der Dosis zeigt sich ein Effekt von FTY720 bezüglich der

Verminderung der T-Zellanzahl im Milzhomogenat der behandelten SOD1G93Adl-Tiere.



Kontrolltieren ca. 8 % mehr CD4+-T-Zellen.

SOD1G93Adl-Tiere, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, sowie 3,0 mg/kg

Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere besitzen in der symptomatischen Phase,

verglichen mit den unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren, ca. 68-72 % weniger

CD4+-T-Zellen im Milzhomogenat. In der symptomatischen Phase ist ein signifikanter

Effekt von FTY720 hinsichtlich der Verminderung der T-Zellzahl im Milzhomogenat

erkennbar (p<0,001).

Im Endstadium weisen unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere gegenüber


weniger CD4+-T-Zellen im Milzhomogenat auf.


haben im Endstadium verglichen mit unbehandelten SOD1G93Adl- Kontrolltieren, ca. 30-

37 % weniger CD4+ T-Zellen im Milzhomogenat. In Bezug auf die Verminderung der

CD4+ T-Zellanzahl lässt sich ein signifikanter Effekt von FTY720 im Milzhomogenat

von behandelten SOD1G93Adl-Tieren beobachten (p<0,001). Die beobachteten Effekte

in der präsymptomatischen Phase sind jedoch nicht signifikant.

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Abbildung 14: Quantitative Analyse der CD4+ T-Zellen im Milzhomogenat von SOD1G93Adl-Mäusen.


(CD4+T-Zellanzahl einer Maus). Das Milzhomogenat der SOD1G93Adl-Mäuse wurde in der





in der Superoxid Dismutase 1, Austausch von Glycin gegen Alanin an der Stelle 93; dl= delay; CD4=

cluster of differentiation 4.

3.2.4.4 CD8+ T-Zellen im Milzhomogenat

Wie schon ausführlich beschrieben, stellen die CD8+-T-Zellen eine Subpopulation der

T-Zellen dar und werden deshalb durch FTY720 beeinflusst.

Durch Blockade des S1P-Rezeptors 1 durch FTY720-Phosphat kommt es zur

Reduktion von CD8+ T-Zellen in der Milz (Brinkmann 2015). Die quantitative FACS-

Analyse von CD8+-T-Zellen im Homogenat der Milz diente dem Zweck, den Einfluss

von FTY720 auf CD8+T-Zellen im SOD1G93Adl-Mausmodells zu zeigen.

In der präsymptomatischen Phase haben unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere

gegenüber Wildtyp-Tieren ca. 10 % mehr CD8+-T-Zellen im Milzhomogenat.

Bei den SOD1G93Adl-Tieren, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, sind in

der präsymptomatischen Phase ca. 41 % weniger CD8+-T-Zellen nachweisbar als bei

59

unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren. Die SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag

FTY720 behandelt wurden, haben im Vergleich zu unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltieren ca. 66 % weniger CD8+-T-Zellen im Milzhomogenat. Ein signifikanter

Effekt von FTY720 hinsichtlich der Verminderung der CD8+-T-Zellanzahl im

Milzhomogenat der behandelten SOD1G93Adl-Tiere ist zu erkennen (p<0,001). Die

höhere Dosierung von FTY720 zeigt dabei, in Bezug auf die Verminderung der CD8+-

T-Zellanzahl, einen stärker ausgeprägten Effekt. Dieser ist aber nicht signifikant.



Kontrolltieren ca. 3 % mehr CD8+-T-Zellen.

Die SOD1G93Adl-Tiere, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, besitzen in

der symptomatischen Phase, verglichen mit den unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltieren, ca. 49 % weniger CD8+-T-Zellen im Milzhomogenat. Die SOD1G93Adl-

Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, offenbaren im Gegensatz zu

unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren ca. 66 % weniger CD8+-T-Zellen . In der

symptomatischen Phase zeigen hinsichtlich der Verminderung der CD8+-T-Zellen im

Milzhomogenat nur die 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelten SOD1G93Adl-Tiere einen

signifikanten Effekt von FTY720 (p<0,05). Zudem ist ein Effekt von FTY720 bezüglich

der Verminderung der CD8+ T-Zellen im Milzhomogenat der mit 1,0 mg/kg Tag

FTY720 behandelten SOD1G93Adl-Tiere zu erkennen.

Unbehandelte SOD1G93Adl- Kontrolltiere im Endstadium gegenüber unbehandelten

SOD1G93Adl- Kontrolltieren in der symptomatischen Phase weisen ca. 21 % weniger

CD8+ T-Zellen im Milzhomogenat auf.

Im Endstadium haben SOD1G93Adl-Tiere, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt

wurden, verglichen mit unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren, ca. 66 % weniger

CD8+ T-Zellen im Milzhomogenat. Im Vergleich zu unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltieren offenbaren im Endstadium SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag

FTY720 behandelt wurden, ca. 52 % weniger CD8+-T-Zellen im Milzhomogenat. In

Bezug auf die Verminderung der CD8+-T-Zellen ist ein signifikanter Effekt von FTY720

im Milzhomogenat der behandelten SOD1G93Adl-Tiere erkennbar (p<0,001). Die

niedrigere Dosierung weist im Vergleich zur höheren Dosierung diesbezüglich einen

stärkeren Effekt auf. Die beobachteten dosisabhängigen Effekte in allen drei

Krankheitsstadien sowie die 1,0 mg/kg Tag FTY 720 behandelten SOD1G93Adl-Tiere in

der symptomatischen Phase sind nicht signifikant.

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Abbildung 15: Quantitative Analyse der CD8+ T-Zellen im Milzhomogenat von SOD1G93Adl-Mäusen.


(CD8+-T-Zellanzahl einer Maus). Das Milzhomogenat der SOD1G93Adl-Mäuse wurde in der





in der Superoxid Dismutase 1, Austausch von Glycin gegen Alanin an der Stelle 93; dl= delay; CD8=

cluster of differentiation 8.

3.2.5 Quantitative Analyse von Zytokinen im Blutplasma von SOD1G93Adl-

Tieren

3.2.5.1 IFN-γ im Plasma

IFN-γ ist ein proinflammatorisches Zytokin und wird unter anderem von Tem-Zellen

(Sallusto et al. 1999), B-Zellen, NK-Zellen und APCs sezerniert (Schroder et al. 2003).

FTY720 blockiert in seiner aktivierten Form, dem FTY720-Phosphat, als funktioneller

Antagonist den S1P-Rezeptor 1 (Mehling et al. 2011), (Pinschewer et al. 2011). Durch

61

Blockade dieses Rezeptors kommt es durch FTY720 zur Reduktion von T-Zellen und

B-Zellen im Vollblut (Brinkmann 2015).

Die quantitative Analyse von IFN-γ mittels Sandwich ELISA diente dem Zweck, einen

möglichen Einfluss von FTY720 auf die Neuroinflammation im SOD1G93Adl-Mausmodell

zu zeigen. IFN-γ wurde im Plasma zu acht verschiedenen Zeitpunkten gemessen (40d,

60d, 80d, 100d, 120d, 170-180d, Symptomatische Phase, Endstadium).

Im Alter von 40-120 Tagen zeigen unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere relativ

niedrige IFN-γ Blutplasmaspiegel zwischen 0,23-0,4 pg/ml IFN-γ im Plasma. Die IFN-

γ Blutplasmaspiegel der behandelten SOD1G93Adl-Tiere liegen im gleichen

Konzentrationsbereich wie die unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltiere, so dass ein

Einfluss von FTY720 nicht erkennbar ist.

Erst im Alter von 170-180 Tagen kommt es im Vergleich zu den 120 Tage alten

unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren zu einem Anstieg des IFN-γ

Blutplasmaspiegels von ungefähr 330% auf eine Blutplasmakonzentration von 3,35

pg/ml.

In der Gegenüberstellung von unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren mit

SOD1G93Adl-Tieren, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, weisen die

behandelten SOD1G93Adl-Tiere im Alter von 170-180 Tagen ca. 14 % weniger INF-γ im

Plasma auf.

3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere offenbaren im Vergleich zu

unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren in diesem Zeitraum ca. 80 % weniger IFN-γ

im Plasma.

Ein dosisabhängiger Effekt von FTY720 ist hinsichtlich der Senkung der

Blutplasmakonzentration von IFN-γ zum Zeitpunkt von 170-180 Tagen erkennbar. Die

höhere Dosierung von 3,0 mg/kg Tag FTY720 übt dabei einen stärkeren Effekt aus.

Zum Zeitpunkt der symptomatischen Phase kommt es bei den unbehandelten

SOD1G93Adl-Kontrolltieren im Vergleich zu den 170-180 Tagen alten unbehandelten

SOD1G93Adl-Kontrolltieren zu einem Abfall des INF-γ Blutplasmaspiegels um ca. 67%

auf eine Blutplasmakonzentration von 1,11 pg/ml IFN-γ.

SOD1G93Adl-Tiere, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, haben verglichen

mit unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren in der symptomatischen Phase ca. 35 %

weniger IFN-γ im Plasma. SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt

wurden, haben im Gegensatz zu unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren in der

symptomatischen Phase ca. 3 % weniger IFN-γ im Plasma. Bei den 1,0 mg/kg Tag

62

FTY720 behandelten SOD1G93Adl-Tieren zeigt sich ein Einfluss von FTY720 bezüglich

der Abnahme des IFN-γ Blutplasmaspiegels. In der höheren Dosierung ist kein Effekt

erkennbar.

Unbehandelte transgene SOD1G93Adl-Tiere im Endstadium haben gemittelt 1,05 pg/ml

IFN-γ im Plasma und zeigen damit ca. 6 % weniger IFN-γ im Plasma auf als

unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere in der symptomatischen Phase.


SOD1G93Adl-Tieren, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, haben die

behandelten SOD1G93Adl-Tiere im Endstadium ca. 67 % weniger INF-γ im Plasma.

SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, weisen im

Vergleich zu unbehandelten transgenen SOD1G93Adl-Tieren im Endstadium ca. 87 %

weniger IFN-γ im Plasma auf. Im Endstadium lässt sich ein dosisabhängiger Effekt von

FTY720 hinsichtlich der Abnahme des IFN-γ Blutplasmaspiegels beobachten.

Dieser Effekt zeigt sich bei den höher dosierten SOD1G93Adl-Tieren stärker ausgeprägt.

Tabelle 3: IFN-γ wurde im Plasma von SOD1G93Adl-Mäusen zu acht verschiedenen Zeitpunkten

gemessen (40d, 60d, 80d, 100d, 120d, 170-180d, Symptomatische Phase, Endstadium).

Der Mittelwert und die Standardabweichung wurde von allen gemessenen Tieren zu einem Zeitpunkt

bestimmt. Untersuchung des Wirkmechanismus von FTY720 am Universitätsklinikum Ulm im Jahr 2014.

SOD1G93A= Punktmutation in der Superoxid Dismutase 1, Austausch von Glycin gegen Alanin an der

Stelle 93; dl= delay; IFN= Interferon; d= Tag; symptomatischen Phase= Beginn der Symptomatik;

Endstadium= Sobald die SOD1G93Adl-Mäuse nicht mehr in der Lage sind, sich unverzüglich aufzurichten,

nachdem sie auf die Seite gelegt wurden.

Mittelwert Standardabweichung Mittelwert Standardabweichung Mittelwert Standardabweichung

Zeit in Tagen (d)

unbehandelte

Kontrollgruppe

(pg/ml)

unbehandelte

Kontrollgruppe

(pg/ml)

1,0 mg/kg

Tag FTY720

(pg/ml)

1,0 mg/kg Tag FTY720

(pg/ml)

3,0 mg/kg

Tag FTY720

(pg/ml)


(pg/ml)

40d 0.40 0.23 0.42 0.31 0.41 0.23

60d 0.20 0.18 0.54 0.49 0.31 0.17

80d 0.35 0.08 0.26 0.19 0.27 0.19

100d 0.26 0.09 0.48 0.40 0.42 0.28

120d 0.23 0.19 0.30 0.12 0.33 0.08

170-180d 3.35 2.63 2.87 1.68 0.67 0.23

Symptomatische

Phase 1.11 1.11 0.73 0.63 1.08 0.64

Endstadium 1.05 1.03 0.34 0.43 0.13 0.05

63

3.2.5.2 IL-2 im Plasma

IL-2 ist ein proinflammatorisches Zytokin, das unter anderem von Tcm-Zellen

sezerniert wird (Sallusto et al. 1999). FTY720 blockiert in seiner aktivierten Form, dem

FTY720-Phosphat, als funktioneller Antagonist den S1P-Rezeptor 1 (Mehling et al.

2011), (Pinschewer et al. 2011). Durch Blockade dieses Rezeptors kommt es durch

FTY720 zur Reduktion von T-Zellen im Vollblut (Brinkmann 2015).

Die quantitative Analyse von IL-2 im Plasma mittels Sandwich ELISA diente dem

Zweck, einen möglichen Einfluss von FTY720 auf die Neuroinflammation im

SOD1G93Adl-Mausmodell zu zeigen. IL-2 im Plasma wurde zu acht verschiedenen

Zeitpunkten gemessen (40d, 60d, 80d, 100d, 120d, 170-180d, Symptomatische Phase

und Endstadium).

Im Alter von 40-80 Tagen lassen sich bei den unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren

höhere IL-2 Blutplasmaspiegel beobachten als im Alter von 100d bis zum Endstadium.

Im Alter von 40 Tagen haben unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere gemittelt 1,41

pg/ml IL-2 im Blutplasma. Im Vergleich zu SOD1G93Adl-Tieren, die mit 1,0 mg/kg Tag

FTY720 behandelt wurden, besitzen die unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltiere im

Alter von 40 Tagen ca. 27 % weniger IL-2 im Blutplasma. SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0

mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, weisen im Gegensatz zu unbehandelten

SOD1G93Adl-Kontrolltieren im Alter von 40 Tagen 60 % weniger IL-2 im Blutplasma auf.

Zum Zeitpunkt 40 Tage ist ein dosisabhängiger Effekt von FTY720 in Bezug auf die

Abnahme von IL-2 im Blutplasma von SOD1G93Adl-Tieren zu erkennen. Die Dosierung

von 3,0 mg/kg Tag FTY720 übt diesbezüglich einen stärkeren Einfluss aus.

Die unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltiere im Alter von 60 Tagen haben mit 1,46

pg/ml im Vergleich zu 40 Tage alten unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren

ungefähr gleich viel IL-2 im Blutplasma. 60 Tage alte SOD1G93Adl-Tiere, die mit 1,0

mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, weisen, verglichen mit unbehandelten

SOD1G93Adl-Kontrolltieren, ca. 45 % weniger IL-2 im Blutplasma auf. SOD1G93Adl-Tiere,

die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, besitzen gegenüber unbehandelten

SOD1G93Adl-Kontrolltieren im Alter von 60 Tagen ca. 75 % weniger IL-2 im Blutplasma.

Bezüglich der Abnahme von IL-2 im Blutplasma ist ein dosisabhängiger Effekt von

FTY720 erkennbar, bei der die höhere Dosierung den stärkeren Effekt ausübt.

Im Alter von 80 Tagen fällt der IL-2 Blutplasmaspiegel von unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltieren verglichen mit unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren im Alter von 60

64

Tagen um ca. 17 %. Die 80 Tage alten Tiere zeigen eine IL-2 Blutplasmakonzentration

von ca. 1,21 pg/ml.

SOD1G93Adl-Tiere, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, haben verglichen

mit unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren im Alter von 80 Tagen ca. 66 % weniger

IL-2 im Blutplasma. 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere besitzen im

Vergleich zu unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren im Alter von 80 Tagen ca. 91

% weniger IL-2 im Plasma. Es stellt sich ein dosisabhängiger Effekt von FTY720

hinsichtlich der Abnahme der IL-2 Blutplasmakonzentration dar. Auch hier zeigt die

höhere Dosierung den stärker ausgeprägten Effekt.

Im Alter von 100 Tagen fällt der IL-2 Blutplasmaspiegel bei unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltieren im Vergleich zu 80 Tage alten unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren

um bis zu 57 % auf eine IL-2 Blutplasmakonzentration von 0,52 pg/ml.


SOD1G93Adl-Tieren, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, weisen die

behandelten SOD1G93Adl-Tiere ca. 14 % weniger IL-2 im Plasma auf.

SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, offenbaren

verglichen mit unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren, im Alter von 100 Tagen ca.

83 % weniger IL-2 im Blutplasma.

Auch hier lässt sich hinsichtlich der Abnahme der IL-2 Blutplasmakonzentration ein

dosisabhängiger Effekt von FTY720 beobachten. Die höhere Dosierung übt auch hier

den stärkeren Effekt aus.

Zu den Zeitpunkten 120 Tage, 170-180 Tage und dem Zeitpunkt der symptomatischen

Phase bewegen sich die IL-2 Blutplasmakonzentrationen von unbehandelten

SOD1G93Adl-Kontrolltieren auf einem niedrigen Niveau zwischen 0,22 und 0,54 pg/ml.

1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere offenbaren zu diesen Zeitpunkten

generell höhere IL-2 Blutplasmaspiegel im Vergleich zu unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltieren. Ein Effekt von FTY720 in Bezug auf die Abnahme der IL-2

Blutplasmakonzentration ist deshalb nicht erkennbar.

Zu den Zeitpunkten 120 Tage, 170-180 Tage und zum Zeitpunkt der symptomatischen

Phase zeigt sich bei den 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelten SOD1G93Adl-Tieren im

Vergleich zu 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelten SOD1G93Adl-Tieren ein

gegensätzliches Verhalten in Bezug auf die Änderung der IL-2

Blutplasmakonzentration. Die mit der geringen Dosis behandelten SOD1G93Adl-Tiere

65

zeigten zu diesen Zeitpunkten generell höhere Blutplasmaspiegel im Vergleich zu

unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren.

SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, haben im

Gegensatz zu unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren im Alter von 120 Tagen ca. 58

% weniger IL-2 im Plasma.

SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, zeigen verglichen

mit unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren, im Alter von 170-180 Tagen eine

Abnahme von IL-2 im Blutplasma von ca. 32 %. In der symptomatischen Phase haben

SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, im Gegensatz zu

unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren in der symptomatischen Phase ca. 97 %

weniger IL-2 im Blutplasma.

Unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere im Endstadium haben gemittelt 0,58 pg/ml IL-

2 im Plasma. Sie besitzen damit im Vergleich zu unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltieren in der symptomatischen Phase ca. 164 % mehr IL-2 im Blutplasma.

1,0 mg/kg Tag FTY720 und 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere im

Endstadium weisen verglichen mit unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltieren ca. 64-

90% niedrigere IL-2 Blutplasmaspiegel auf.

Ein Effekt von FTY720 ist hinsichtlich der Abnahme der IL-2 Blutplasmakonzentration

bei den behandelten SOD1G93Adl-Tieren im Endstadium zu erkennen.

66

Tabelle 4: IL-2 wurde im Plasma von SOD1G93Adl-Mäusen zu acht verschiedenen Zeitpunkten gemessen

(40d, 60d, 80d, 100d, 120d, 170-180d, Symptomatische Phase, Endstadium).




Stelle 93; dl= delay; IL= Interleukin; d= Tag; symptomatischen Phase= Beginn der Symptomatik;



3.2.5.3 IL-4 im Plasma

IL-4 ist ein antiinflammatorisches Zytokin, welches vor allem von Th2-Zellen sezerniert

wird. Es hemmt Th1-Zellen und Makrophagen sowie die Sekretion von IFN-γ und IL-

12.

Die quantitative Analyse von IL-2 im Plasma mittels Sandwich ELISA diente dem

Zweck, einen möglichen Einfluss von FTY720 auf die Neuroinflammation im

SOD1G93Adl-Mausmodell zu zeigen.

IL-4 wurde im Plasma zu acht verschiedenen Zeitpunkten gemessen (40d, 60d, 80d,

100d, 120d, 170-180d, Symptomatische Phase und Endstadium).

Hinsichtlich der IL-4 Blutplasmakonzentrationen stellen sich im Verlauf der Erkrankung

des SOD1G93Adl-Mausmodells bei den unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren zwei

Konzentrationsgipfel dar. Zum einen zeigen sie sich zu den Zeitpunkten 40d, 60d und

80d, bei dem sich Blutplasmakonzentrationen von 0,41-0,56 pg/ml beobachten lassen

und zum anderen zum Zeitpunkt 170-180 Tage, bei dem eine Blutplasmakonzentration

von 0,79 pg/ml erreicht wird.

Im Alter von 40 Tagen besitzen unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere gemittelt 0,56

pg/ml IL-4 im Blutplasma. SOD1G93Adl-Tiere, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt

wurden, haben im Vergleich zu unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren im Alter von


Zeit in Tagen (d)

unbehandelte

Kontrollgruppe

(pg/ml)

unbehandelte

Kontrollgruppe

(pg/ml)

1,0 mg/kg

Tag FTY720

(pg/ml)


(pg/ml)

3,0 mg/kg

Tag FTY720

(pg/ml)


(pg/ml)

40d 1.41 0.62 1.03 0.70 0.56 0.13

60d 1.46 0.27 0.81 0.62 0.37 0.13

80d 1.21 0.67 0.41 0.51 0.11 0.06

100d 0.52 0.32 0.44 0.33 0.09 0.07

120d 0.48 0.39 0.87 0.55 0.20 0.04

170-180d 0.54 0.39 0.75 0.15 0.37 0.23

Symptomatische

Phase 0.22 0.23 0.82 0.82 0.01 0.01

Endstadium 0.58 0.79 0.06 0.09 0.21 0.15

67

40 Tagen ca. 58 % weniger IL-4 im Plasma. SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag

FTY720 behandelt wurden, weisen zu unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren im

Alter von 40 Tagen ungefähr gleich viel IL-4 im Blutplasma auf. Bezüglich der Abnahme

von IL-4 zeigt sich ein Effekt bei den 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelten SOD1G93Adl-

Tieren. In der höheren Dosierung ist kein Effekt erkennbar.

Im Alter von 60 Tagen haben unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere gemittelt 0,54

pg/ml IL-4 im Blutplasma. 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere wie

auch 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelte SOD1G93Adl-Tiere weisen, verglichen mit

unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren, im Alter von 60 Tagen ca. 38-39 % weniger

IL-4 im Blutplasma auf. Ein Einfluss von FTY720, hinsichtlich der Abnahme von IL-4

im Blutplasma von behandelten SOD1G93Adl-Tieren, lässt sich unabhängig von der

Dosis beobachten.

80 Tage alte unbehandelte SOD1G93Adl-Kontrolltiere zeigen gemittelt 0,41 pg/ml IL-4

im Blutplasma.

Sie offenbaren damit ca. 24 % weniger IL-4 im Blutplasma als im Alter von 60 Tagen.


offenbaren, verglichen mit unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren im Alter von 80

Tagen, ca. 54-61 % weniger IL-4 im Blutplasma. Somit lässt sich ein

dosisunabhängiger Effekt in Bezug auf die Abnahme der IL-4 Konzentration zum

Zeitpunkt 80 Tage darstellen.

Zum Zeitpunkt 100 Tage kommt es bei den unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren

zu einem Abfall der IL-4 Blutplasmakonzentration von 57 % auf einen

Blutplasmaspiegel von 0,18 pg/ml. Im Alter von 120 Tagen fallen die IL-4

Blutplasmakonzentrationen von unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren auf einen

Tiefpunkt von 0,10 pg/ml.

Zu diesen Zeitpunkten ist ein Effekt von FTY720 hinsichtlich der Veränderung des IL-

4 Blutplasmaspiegels aufgrund des sehr niedrigen Niveaus der

Blutplasmakonzentrationen nicht nachvollziehbar.

Der zweite Gipfel der IL-4 Blutplasmakonzentration von unbehandelten SOD1G93Adl-

Kontrolltieren offenbart sich im Alter von 170-180 Tagen mit einem Wert von 0,79 pg/ml

und weist damit einen um ca. 665 % höheren IL-4 Blutplasmaspiegel auf als bei 120

Tage alten unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren.


besitzen im Alter von 170-180 Tagen ca. 51-55 % weniger IL-4 im Blutplasma.

68

Ein dosisunabhängiger Einfluss von FTY720 ist in Bezug auf die Abnahme der IL-4

Blutplasmakonzentration zu beobachten.

Zu den Zeitpunkten der symptomatischen Phase sowie des Endstadiums fällt die IL-4

Blutplasmakonzentration von unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren erneut auf ein

niedriges Niveau von 0,10-0,28 pg/ml. Aufgrund der niedrigen IL-4

Blutplasmakonzentrationen kann ein Effekt von FTY720 hinsichtlich der Veränderung

des IL-4 Blutplasmaspiegels nicht nachvollzogen werden.

Tabelle 5: IL-4 wurde im Plasma von SOD1G93Adl-Mäusen zu acht verschiedenen Zeitpunkten gemessen

(40d, 60d, 80d, 100d, 120d, 170-180d, Symptomatische Phase, Endstadium).




Stelle 93; dl= delay; IL= Interleukin; d= Tag; symptomatischen Phase= Beginn der Symptomatik;




Zeit in Tagen (d)

unbehandelte

Kontrollgruppe

(pg/ml)

unbehandelte

Kontrollgruppe

(pg/ml)

1,0 mg/kg

Tag FTY720

(pg/ml)


(pg/ml)

3,0 mg/kg

Tag FTY720

(pg/ml)


(pg/ml)

40d 0.56 0.21 0.23 0.23 0.58 0.34

60d 0.54 0.41 0.34 0.22 0.33 0.28

80d 0.41 0.26 0.16 0.20 0.19 0.22

100d 0.18 0.21 0.19 0.30 0.00 0.00

120d 0.10 0.17 0.26 0.18 0.07 0.04

170-180d 0.79 0.55 0.39 0.20 0.36 0.50

Symptomatische

Phase 0.10 0.15 0.02 0.02 0.25 0.19

Endstadium 0.28 0.15 0.01 0.03 0.18 0.14

69

3.2.4 Messung von FTY720 und FTY720-Phosphat im Plasma

Die Messung von FTY720 und seinem aktiven Metabolit FTY720-Phosphat diente der

Beurteilung, ob die wirksamen Blutplasmaspiegel erreicht wurden.

Untersucht wurde die Konzentration von FTY720 und FTY720-Phosphat im

Blutplasma der mit FTY720 behandelten SOD1G93Adl-Tiere zu drei verschiedenen

Zeitpunkten (präsymptomatisch, symptomatisch).

3.2.4.1 FTY 720 Konzentration im Blutplasma

Der wirksame Blutplasmaspiegel von FTY720 wurde bei allen behandelten

SOD1G93Adl-Tieren, in der präsymptomatischen Phase und der symptomatischen

Phase erreicht. Die SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt

wurden, haben einen signifikant höheren Blutplasmaspiegel als SOD1G93Adl-Tiere, die

mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden. Aufgrund der geringen Fallzahl im

Endstadium verzichteten wir auf die Darstellung im Diagramm.

0

2 0

4 0

6 0

8 0

FT

Y7

20

Ko

nz

en

tra

tio

n i

m P

las

ma

in

ng

/ml

1 ,0 m g /k g T a g F T Y 7 2 0

3 ,0 m g /k g T a g F T Y 7 2 0





***

***


Abbildung 16: FTY720 Konzentration im Blutplasma von SOD1G93Adl-Mäusen. Angegeben sind jeweils

Mittelwert und Standardabweichung. Jeder Punkt repräsentiert einen Messwert (FTY720 Konzentration

im Blutplasma von einer Maus). Die FTY720 Konzentration der SOD1G93Adl-Mäuse wurde in der

präsymptomatischen Phase (ca. 60 Tage) und in der symptomatischen Phase (Beginn der




70

3.2.4.2 FTY720 – Phosphat im Blutplasma

Der wirksamen Blutplasmaspiegel von FTY720-Phosphat wurde bei allen behandelten

SOD1G93Adl-Tieren in der präsymptomatischen Phase, in der symptomatischen Phase

und im Endstadium erreicht. Die SOD1G93Adl-Tiere, die mit 3,0 mg/kg Tag FTY720

behandelt wurden, haben einen signifikant höheren Blutplasmaspiegel als SOD1G93Adl-

Tiere, die mit 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden. Aufgrund der geringen

Fallzahl im Endstadium verzichteten wir auf die Darstellung im Diagramm.

Abbildung 17: FTY720-Phosphat im Plasma von SOD1G93Adl-Mäusen. Angegeben sind jeweils Mittelwert

und Standardabweichung. Jeder Punkt repräsentiert einen Messwert (FTY720-Phosphat Konzentration

im Blutplasma von einer Maus). Die FTY720-Phosphat Konzentration der SOD1G93Adl-Mäuse wurde in

der präsymptomatischen Phase (ca. 60 Tage) und in der symptomatischen Phase (Beginn der




0

5 0

1 0 0

1 5 0

FT

Y7

20

-Ph

os

pa

ht

Ko

nz

en

tra

tio

n

im P

las

ma

in

ng

/ml

1 ,0 m g /k g T a g F T Y 7 2 0

3 ,0 m g /k g T a g F T Y 7 2 0






******

71

4 Diskussion

4.1 Allgemeine Bemerkung zur Diskussion

Das Präparat FTY720 wird unter dem Handelsnamen Gilenya® weltweit zur

verlaufsmodifizierenden Langzeitbehandlung der Multiplen Sklerose eingesetzt (Scott

2011).

Die anti-inflammatorische Wirkung des Immunmodulators FTY720 wurde bereits in

zahlreichen Publikationen belegt. Eine direkte neuroprotektive Wirkung von FTY720

wird vermutet, ist allerdings bisher nur unzureichend untersucht worden (Soliven et al.

2011).

Aus diesem Grund wurde das primär neurodegenerative ALS-SOD1G93Adl

Mausmodell zur Aufklärung des angenommenen neuroprotektiven Wirkmechanismus

von FTY720 herangezogen.

Die SOD1G93Adl-Maus stellt derzeit das am besten etablierte und erforschte

Mausmodell dar (Gurney et al. 1994). Die experimentellen Voraussetzungen und

Bedingungen stimmen mit der humanen ALS soweit als derzeit möglich überein

(Stieber et al. 2000). Es gibt gegenwärtig keinen kurativen Therapieansatz im Rahmen

der ALS. Durch das Präparat Riluzol (NMDA-Rezeptorantagonist) kann das Überleben

der betroffenen Patienten lediglich um 3-6 Monate verlängert werden

(Nirmalananthan et al. 2005), so dass wirksamere Neuroprotektiva dringend benötigt

werden.

In unserer Studie setzten wir FTY720 in den Dosierungen 1,0 mg/kg Tag und 3,0 mg/kg

Tag ein.

Unsere Studie befasste sich mit folgenden Fragestellungen:

• Hat FTY720, unabhängig von der antiinflammatorischen Wirkung, eine direkte

neuroprotektive Wirkung?

• Welchen Einfluss hat die Dosis auf die Wirkung von FTY720?

• Welchen Einfluss hat das Medikament auf den Eintritt in die symptomatische Phase

der SOD1 G93A Mäuse?

• Welchen Einfluss hat FTY720 auf die Neuroinflammation im Rahmen der ALS?

72

4.2 Effekt von FTY720 auf α-Motoneurone von SOD1G93Adl-Tieren

4.2.1 FTY720 hat einen gering ausgeprägten direkten neuroprotektiven Effekt auf

die α-Motoneurone von SOD1G93Adl-Tieren.

In der vorliegenden Studie ist ein gering ausgeprägter neuroprotektiver Effekt von

FTY720 auf die alpha-Motoneurone der SOD1G93Adl-Tiere feststellbar. Dieser zeigt sich

in der präsymptomatischen Phase sowohl in der niedrigen als auch in der höheren

Dosierung (1,0 mg/kg Tag und 3,0 mg/kg Tag FTY720) mit einer positiven Dosis-

Wirkungs-Beziehung. In der symptomatischen Phase der Erkrankung ist der gering

ausgeprägte neuroprotektive Effekt von FTY720 lediglich in der niedrigen Dosierung

von 1,0 mg/kg Tag FTY720 zu erkennen. Bei symptomatischen Tieren, die mit 3,0

mg/kg Tag FTY720 behandelt wurden, ist die Anzahl der Motoneurone vergleichbar

mit der Motoneuronenanzahl bei unbehandelten SOD1G93Adl-Tieren. Dies könnte

eventuell ein Hinweis auf einen neurotoxischen Effekt der höheren Dosierung sein.

Im Endstadium ist ein neuroprotektiver Effekt von FTY720 in keiner Dosis erkennbar.

Die beobachteten neuroprotektiven Effekte sind allerdings sowohl in der

präsymptomatischen Phase (beide Dosierungen) als auch in der symptomatischen

(niedrige Dosis) nicht signifikant.

Die Ergebnisse im Endstadium haben aufgrund der niedrigen Fallzahl von 2-3 Tieren

nur beschränkte Aussagekraft. Die beschriebene Degeneration der α-Motoneurone im

SOD1G93Adl-Mausmodell kann auch in unserer Studie anhand der in den drei Stadien

(präsymptomatisch, symptomatisch, Endstadium) untersuchten unbehandelten

SOD1G93Adl-Kontrolltiere klar nachvollzogen werden.

In einigen früheren Studien gibt es ebenfalls Hinweise auf eine direkte neuroprotektive

Wirkung von FTY720.

Doi Y et al. beobachteten in vitro anhand von kortikalen NeuN-positiven Neuronen aus

Mausembryonen vom Typ C57BL/6J, die mit dem neurotoxischen Amyloid β stimuliert

wurden, dass FTY720-Phosphat über eine Erhöhung der Expression des BNDF eine

Reduzierung der A-β induzierten Neurotoxizität erreicht. Die A-β Neurotoxizität ist ein

pathologisches Merkmal des M. Alzheimer.

73

Auch der M. Alzheimer ist eine neurodegenerative Erkrankung und zeigt unter

anderem mit der Degeneration von Neuronen und einer eher gering ausgeprägten

Neuroinflammation einige Parallelen zur ALS und dem SOD1G93Adl-Mausmodell.

Zudem stellten Doi Y et al. fest, dass durch Bindung des BNDF (Brain derived

neutrophic factor) an den TrKB Rezeptor die sogenannte ERK ½ (extracellular-signal-

regulated kinases) Signalkaskade aktiviert wird und damit eine FTY720-Phosphat

vermittelte Neuroprotektivität bezüglich einer Verminderung der Aβ induzierten

Neurotoxizität vermittelt wird. Der BNDF und sein Rezeptor TrkB werden im ZNS weit

verbreitet exprimiert (Conner et al. 1997), (Yan et al. 1997), (Yan et al. 1997).

Sie zeigten in ihrer Studie auch, dass alle Neurone im ZNS S1P Rezeptoren

exprimieren. Dies macht einen direkten Einfluss von FTY720-Phosphat auf Neurone

wahrscheinlich (Doi et al. 2012).

Pardo A et al. konnten einen neuroprotektiven Effekt von FTY720 in vitro und in vivo

in einem Mausmodell des Morbus Huntingtons darstellen. Die Huntington Erkrankung

gehört, wie auch die ALS, zu den neurodegenerativen Erkrankungen. Sie zeigten in

vitro, dass FTY720 die Apoptose in Zelllinien des M. Huntington signifikant reduziert.

In vivo beobachteten sie die FTY720 induzierte Phosphorylierung von AKT und ERK.

Phosphoryliertes AKT und ERK fördern die Aktivierung von Signalwegen die das

Überleben der Zellen vermitteln.

Zudem offenbarte sich in vivo anhand von FTY720 behandelten HD R 6/2 Mäusen

(Mausmodell des M. Huntington) eine verbesserte motorische Funktion und eine

verringerte Degeneration an striatalen Zellen.

Wie auch schon Doi Y et al in ihrem Versuchsmodell einen Anstieg des BNDF Spiegels

durch FTY720 zeigen konnten, beobachtete dies auch Pardo A et al. bei HD R 6/2

Mäusen. In Kombination mit den beobachteten Effekten in vivo vermuten sie, dass der

neuroprotektive Effekt durch das Neutrophin BNDF vermittelt wird (Pardo et al. 2014).

Wie schon in der Einleitung beschrieben, gibt es einige Hypothesen zur Entstehung

der ALS. Dabei nimmt die Excitoxizität einen wichtigen Stellenwert ein. Das liegt vor

allem daran, dass Riluzol das erste Medikament ist, das gegen die ALS eingesetzt

wird. Es stellt sich die Frage, ob auch FTY720 Einfluss auf die Excitoxizität hat.

Menna L et al. zeigten in vitro, dass FTY720 und sein aktiver Metabolit (FTY 720-

Phosphat) kortikale Nervenzellen gegen den Tod durch die Excitoxizität schützen.

Genauso wie Pardo A et al. beobachteten sie, dass FTY720 die neuroprotektiven

74

Signalwege durch die Phosphorylierung von AKT und ERK aktiviert (Di Menna et al.

2013).

Capriani et al. konnten sowohl in vitro als auch in vivo einen neuroprotektiven Effekt

von FTY720 hinsichtlich der Reduktion von Excitoxizität durch FTY720 aufzeigen. Dies

konnte bei niedrigen Dosierungen von 10nM und 100nM beobachtet werden. Bei der

höheren Dosierung von 1000nM offenbarte sich ein leichter toxischer Effekt

(Cipriani et al. 2015).

Das SOD1G93Adl-Mausmodell ist wie auch die ALS vorwiegend eine neurodegenerative

Erkrankung, weist aber auch eine gering ausgeprägte Neuroinflammation auf. Deshalb

ist es möglich, dass die geringe Neuroprotektivität die FTY720 in unserer Studie zu

vermitteln scheint, durch die antiinflammatorische Wirkung des Medikaments zustande

kommt (Gao et al. 2012).

Die Vergleichbarkeit unterschiedlicher Mausmodelle bezüglich der direkten

Neuroprotektivität ist nur eingeschränkt möglich. Es handelt sich zum einen um andere

Pathomechanismen und zum anderen spielt die Neuroinflammation eine

unterschiedlich ausgeprägte Rolle.

In der vorliegenden Studie beschreiben wir einen gering ausgeprägten direkten

neuroprotektiven Effekt von FTY720 anhand von SOD1G93Adl-Tieren insbesondere in

der präsymptomatischen Phase. In der Vergangenheit konnte ein neuroprotektiver

Effekt von FTY720 in anderen Mausmodellen aufgezeigt werden.

4.2.2 FTY720 geht über die Bluthirnschranke

Die wirksamen Blutplasmaspiegel von FTY720 wurden bei den behandelten

SOD1G93Adl-Tieren in allen drei Krankheitsstadien erreicht. Zudem stellten wir fest,

dass FTY720 dosisabhängig über die Bluthirnschranke gelangt. Schon Meno-Tetang

G et al. beobachteten in ihrer Studie anhand von Ratten, dass FTY720 leicht über die

Bluthirnschranke diffundiert (Meno-Tetang et al. 2006). Bei der Anfertigung des

Hirnhomogenats war eine Trennung von Hirnparenchym und Hirngefäßen aufgrund

der sehr kleinen Strukturen nicht möglich. Dies hat zur Folge, dass sich zu den Zellen

des ZNS auch Endothelzellen im Hirnhomogenat befanden. Da FTY720-Phosphat

auch an S1P-Rezeptoren auf dem Endothel von Gefäßen bindet, muss man sich

vergewissern, dass die FTY720-Phosphat Konzentration im Hirnhomogenat nicht

ganz derjenigen im ZNS der SOD1G93Adl-Tiere entspricht.

75

Im Hinblick auf den Nachweis von FTY720 und FTY720-Phosphat im Hirnhomogenat

der SOD1G93Adl-Tiere ist es möglich, dass FTY720 direkte neuroprotektive Effekte an

α-Motoneuronen ausübt.

4.2.3 FTY720 hat keinen Einfluss auf den Krankheitsbeginn von SOD1G93Adl-

Tieren

FTY720 hat in der vorliegenden Studie keinen Einfluss auf den Krankheitsbeginn von

SOD1G93Adl-Tieren.

Mit dem high copy SOD1G93A-Mausmodell untersuchten wir in einer unserer früheren

nicht publizierten Studien (TVA-Reg 865) den Einfluss von FTY720 hinsichtlich des

Krankheitsbeginns und des Überlebens der SOD1G93A-Tiere.

Auch hier wurden die folgenden Dosierungen 1,0 und 3,0 mg/kg Tag an FTY720 oral,

über den gesamten Applikationszeitraum, mittels Schlundsonde verabreicht. In beiden

Dosierungen wurden die wirksamen Blutplasmaspiegel erreicht. Es konnte dennoch

kein signifikanter lebensverlängernder Effekt der Substanz nachgewiesen werden.

Jedoch konnte bei einer Dosis von 1,0 mg/kg Tag FTY720 in der weiblichen

Untergruppe ein verzögerter Krankheitsbeginn von 5 Tagen im Vergleich zur

unbehandelten Kontrollgruppe festgestellt werden. Dieser positive Effekt blieb im

weiteren Krankheitsverlauf bestehen. Eine um 50% verminderte maximale Aktivität im

Laufrad zeigten diese Tiere erst im Alter von 110 Tagen und damit 4 Tage später als

die unbehandelten Kontrolltiere.

In der Literatur gibt es keine Anhaltspunkte für Effekte von FTY720 hinsichtlich der

Verzögerung des Krankheitsbeginns. Jedoch gibt es eine Studie, die den Einfluss von

FTY720 auf das Überleben untersuchte.

Anhand von HD R 6/2 Mäusen beobachtete Pardo A et al. bei den 1,0 mg/kg Tag

FTY720 behandelten Tieren einen Überlebensvorteil (Pardo et al. 2014).

Die hier vorliegende Studie wurde nicht dafür ausgelegt den Effekt von FTY720

bezüglich einer Verzögerung des Krankheitsbeginns zu untersuchen. Für dieses

Vorhaben hätte man mit anderen Fallzahlen planen müssen.

76

4.2.4 Der Einfluss von FTY720 auf den Abbau des axonalen Zytoskeletts

In der vorliegenden Studie konnte bei den unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltieren im

Vergleich zu den Wildtyp-Tieren kein Abfall der phosphorylierten Neurofilamente H

(pNFH) im Hirnhomogenat festgestellt werden. Deshalb ist eine Beurteilung des

Effekts von FTY720 bezüglich einer Reduktion der Abnahme an pNFH im

Hirnhomogenat von behandelten SOD1G93Adl-Tieren nicht möglich. Es gibt jedoch

Hinweise, dass FTY720 Einfluss auf die pNFH hat.

Jin S et al. beobachteten anhand eines Mausmodells der Experimentellen

Autoimmunen Encephalomyelitis (EAE), dass 1,0 mg/kg Tag FTY720 den axonalen

Schaden vermindert und damit die Konzentration an pNFH im lumbosakralen

Rückenmark im Vergleich zur Kontrollgruppe steigert (Jin et al. 2014).

Wie bei dem Mausmodell der Multiplen Sklerose kommt es auch beim SOD1G93dl-

Mausmodell aufgrund der Degeneration der Neurone und des axonalen Schadens zur

Freisetzung von pNFH in den Liquor. Über diesen gelangen die pNFH anschließend

ins Plasma.

Zur Feststellung eines Effekts von FTY720 hinsichtlich einer Reduktion der Abnahme

an pNFH im Hirnhomogenat der SOD1G93Adl-Tiere scheint die quantitative Analyse der

pNFH mittels ELISA ungeeignet zu sein.

4.2.5 Schlussfolgerung

Unsere Ergebnisse sprechen eher dafür, dass FTY720 keinen direkten

neuroprotektiven Effekt auf α-Motoneurone im SOD1G93Adl-Mausmodell hat. Soliven et

al. vermuten einen direkten neuroprotektiven Effekt von FTY720 bei der schubförmigen

Multiplen Sklerose (Soliven et al. 2011). Dieser Effekt ist basierend auf unseren

Ergebnissen, eher durch die antiinflammatorische Wirkung des Medikaments

verursacht. Doch es besteht die Möglichkeit, dass FTY720 bei der schubförmigen

Multiplen Sklerose und dem Mausmodell der ALS jeweils unterschiedliche Signalwege

beeinflusst. So wäre es möglich, dass es einen direkten neuroprotektiven Effekt von

FTY720 bei der schubförmigen MS gibt, aber nicht in dem hier untersuchten

Mausmodell der ALS.

In einigen Mausmodellen korreliert die Neuroprotektion von FTY720 mit einer

Erhöhung des BDNF-Spiegels und der Aktivierung der dazu gehörigen Signalkaskade.

Dies hat zur Folge, dass FTY720 im SOD1G93Adl-Mausmodell eventuell gar nicht über

77

diese Signalkaskade wirkt, so dass es auch nicht zu einer Erhöhung des BDNF-

Spiegels kommt.

4.3 Effekt von FTY720 auf proinflammatorische Parameter im ZNS und im

Blut von SOD1G93Adl-Tieren

4.3.1 FTY720 hat keinen Einfluss auf die Astrogliose bei SOD1G93Adl-Tieren

In der präsymptomatischen und symptomatischen Phase der SOD1G93Adl-Tiere im

lumbalen Rückenmark ist kein Effekt von FTY720 in den Dosierungen von 1,0 mg/kg

Tag und 3,0 mg/kg hinsichtlich einer Abnahme der Astrogliose erkennbar.

Bei den Endstadiumtieren ist lediglich ein minimaler Effekt von FTY720 festzustellen.

Dieser hat hier jedoch aufgrund der niedrigeren Fallzahl von 2-3 Endstadiumstieren

nur geringe Aussagekraft.

In der vorliegenden Studie konnte kein Einfluss von FTY720 auf die Astrogliose

gezeigt werden. In Studien aus der Vergangenheit gab es im Rahmen von anderen

Mausmodellen aber Hinweise, dass Effekte von FTY720 hinsichtlich der Reduktion der

Astrogliose beobachtet wurden.

Norimatsu Y et al. stellten anhand von SCID Mäusen, denen eine

Rückenmarkskontusion zugefügt worden war, fest, dass FTY720 in einer Dosierung

von 3,0 mg/kg Tag eine Abnahme der Astrogliose zeigte.

SCID Mäuse besitzen keine T- und B-Zellen. Dadurch fehlt ihnen die Ausbildung eines

adaptiven Immunsystems. Aufgrund dessen vermuteten Norimatsu Y et al., dass

FTY720 die Lymphozytenfunktion nicht mehr beeinflussen konnte und somit

immunsystemunabhängige Effekte des Medikaments zum Vorschein kamen. Somit

nahmen sie an, dass FTY720 nicht immunologische bzw. direkte Effekte auf die Zellen

des ZNS ausübt und damit auch die Astrogliose vermindert (Norimatsu Y 2012).

Im Rahmen einer Studie zu einem Mausmodell der Multiplen Sklerose wurde kürzlich

berichtet, dass phosphoriliertes FTY720 den Verlust von S1P-Rezeptoren auf

Astrozyten zu induzieren scheint. Choi J W et al. gingen davon aus, dass durch den

Funktionsverlust der S1P1 Rezeptoren auf der Oberfläche der Astrozyten die

Wirksamkeit des Medikaments hinsichtlich der Abnahme der Astrogliose erst

zustandekommt (Norimatsu et al. 2012).

78

Anhand von Ratten, an denen ein Status epilepticus mit Hilfe von Lithium/ Pilocarpin

ausgelöst wurde, stellten Gao et al. einen Effekt von FTY720 bezüglich einer Abnahme

der Astrogliose im Hippocampus im Vergleich zu Kontrolltieren fest.

Zudem kam es hierbei auch zu einer verminderten hippocampalen Expression von

proinflammatorischen Zytokinen wie TNFα und IFN-β.

Bei der Epilepsie nimmt anders als bei der ALS die Neuroinflammation eine

Schlüsselrolle ein, so dass eventuell davon auszugehen ist, dass FTY720 seinen

Effekt hinsichtlich der Abnahme der Astrogliose durch eine Verminderung der

proinflammatorischen Zytokine induziert.

Philips T et al. beobachteten in vitro anhand von mutierten SOD1G93A Astrozyten eine

vermehrte Expression von proinflammatorischen Zytokinen (Philips et al. 2011).

Es liegt deshalb nahe, dass FTY720 die proinflammatorischen Zytokine im SOD1G93Adl-

Mausmodell senkt und damit zu einer Abnahme der Astrogliose führt. Dies konnten wir

aber in unserer Studie nicht zeigen.

In der vorliegenden Studie ist zu keinem Zeitpunkt der Erkrankung von SOD1G93Adl-

Tieren ein Effekt von FTY720 auf Astrozyten festzustellen. In anderen Mausmodellen

gab es jedoch Hinweise auf eine FTY720 vermittelte Reduktion der Astrogliose.

4.3.2 FTY720 hat keinen Einfluss auf die Mikrogliaaktivierung im SOD1G93Adl-

Mausmodell

Ein Effekt von FTY720 ist bezüglich der Abnahme der Mikrogliaaktivierung im lumbalen

Rückenmark von SOD1G93Adl-Tieren zu keinem Zeitpunkt feststellbar.

Trotz unserer Ergebnisse gibt es Hinweise, dass FTY720 die Mikrogliaaktivierung

hinsichtlich einer Abnahme beeinflusst. Unter der Behandlung mit 1,0 mg/kg/d FTY720

beobachtete Gao et al. in einem Epilepsiemausmodell eine Verminderung der

Mikrogliaaktivierung im Hippocampus (Gao et al. 2012).

Wir stellten in unserer Studie zwar fest, dass FTY720 keinen Einfluss auf die Abnahme

der Mikrogliaaktivierung hat, doch könnte es durch FTY720 in der vorliegenden Studie

zu einer Mikroglia vermittelten Neuroprotektion der α-Motoneurone gekommen sein.

Anhaltspunkte hierfür zeigte Noda H in vitro im Rahmen des EAE Mausmodells.

FTY720 behandelte Mikroglia übten dabei neuroprotektive Effekte aus, indem sie die

Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen (TNFα, IL-1β und IL-6) senkten und

die Ausschüttung von neurotrophen Faktoren erhöhten. Schon frühere Studien

79

konnten zeigen, dass Mikroglia neurotrophe Faktoren wie den BNDF und GNDF

freisetzen, welche das neuronale Überleben unterstützen (Mizuno et al. 2004),

(Liang et al. 2010).

FTY720 hat in der vorliegenden Studie keinen Effekt in Bezug auf die Abnahme der

Mikrogliaaktivierung, nimmt aber eventuell Einfluss auf die Mikroglia vermittelte

Ausschüttung von neurotrophen Faktoren und damit auf die Neuroprotektion.

4.3.3 Überprüfung des antiinflammatorischen Effekts von FTY720 im SOD1G93Adl-

Mausmodell

In allen drei Krankheitsstadien senkt FTY720 signifikant und dosisunabhängig die T-

und B-Zellen, sowie CD4+ und CD8+ T-Zellen im Vollblut von SOD1G93Adl-Tieren.

Die antiinflammatorische Wirkung von FTY720 wurde schon in zahlreichen Studien

belegt. Über den S1P1 Rezeptor vermittelt FTY720 ein Retentionssignal, dass die T-

Lymphozyten im Lymphknoten verweilen lässt („LN Homing“) (Pham et al. 2008). Es

kommt zur Lymphopenie (Brinkmann et al. 2002), (Mandala et al. 2002). Betroffen von

diesem Signal sind nur naive T-Zellen (Tn) und zentrale T-Gedächtniszellen, die durch

schwache Antigenstimulation entstehen. Aufrechterhalten wird das Retentionsignal

durch den sogenannten CCR7-Rezeptor. Effektor T-Gedächtniszellen (Tem)

exprimieren diesen Rezeptor nicht und können deshalb auch nicht direkt durch

FTY720 beeinflusst werden.

Mehling et al. beobachteten unter anderem bei FTY-behandelten MS-Patienten eine

Senkung aller Lymphozyten um 61% im Vergleich zum Referenzwert. Die CD8+ T-

Zellen wurden auch reduziert, jedoch nicht im gleichen Ausmaß wie die CD4+ T-

Lymphozyten. Der beschriebene Effekt von FTY720 bezüglich der stärkeren Reduktion

der CD4+ T-Zellen im Vergleich zu CD8+ T-Zellen ist in der vorliegenden Studie nicht

zu erkennen.

Grützke B et al. konnten, wie schon in früheren Studien beschrieben, eine signifikante

Reduktion von B-Zellen im Blut zeigen. In ihrer Studie beschrieben sie die

verschiedenen Subpopulationen der B-Zellen. Sie konnten beobachten, dass FTY720

den Anteil regulatorischer B-Zellen bei FTY-behandelten MS-Patienten signifikant

ansteigen ließ. Im Gegensatz dazu sank der Anteil an naiven (Tn) und zentralen

Gedächtnis T-Zellen (Tcm) leicht.

80

Zudem stellten Grützke B et al. fest, dass Tn- und Tcm-Zellen mehr „lymph node

homing triad“ Moleküle (L-Selectin, CCR7 und LFA-1) als regulatorische B-Zellen

exprimieren (Grützke et al. 2015). Deshalb werden regulatorische B-Zellen durch

FTY720 weniger beeinflusst. Dies könnte in der vorliegenden Studie im Vergleich zu

T-Zellen die geringer ausgeprägte Reduktion der B-Zellanzahl im Vollblut von

SOD1G93Adl-Tieren erklären. Mit unseren Beobachtungen im Vollblut von SOD1G93Adl-

Tieren bestätigen wir die bekannte antiinflammatorische Wirkung von FTY720

hinsichtlich der signifikanten Reduktion von T- und B-Zellen sowie der CD4+ und CD8+

T-Zellen im Vollblut.

4.3.4 Überprüfung des Effekts von FTY720 auf T- und B-Zellen sowie CD4+ und

CD8+ T-Zellen im Milzhomogenat von SOD1G93Adl-Tieren

4.3.4.1 B-Zellen im Milzhomogenat

FTY720 hat in der präsymptomatischen und symptomatischen Phase einen gering

ausgeprägten, dosisabhängigen Effekt hinsichtlich der Zunahme der B-Zellen im

Milzhomogenat von SOD1G93Adl-Tieren. In der präsymptomatischen Phase ist der

beschriebene Effekt bei 3,0 mg/kg Tag FTY720 behandelten SOD1G93Adl-Tieren stärker

ausgeprägt. Im Gegensatz dazu zeigt sich der stärkere Effekt in der symptomatischen

Phase bei den 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelten SOD1G93Adl-Tieren. Im Endstadium

stellen wir in beiden verwendeten Dosierungen von FTY720 eine sehr gering

ausgeprägte Reduktion der B-Zellanzahl im Milzhomogenat der SOD1G93Adl-Tiere fest.

Die beschriebenen Effekte wiesen keine Signifikanz auf.

Mit den follikulären und den MZ B-Zellen beobachteten Arnon und Cyster die

Subpopulationen der B-Zellen in der Milz.

Mit Hilfe der Zwei-Photonen Mikroskopie zeigten sie einen S1P-Rezeptor 1 (S1PR1)

abhängigen Signalweg auf, der die Auswanderung von follikulären B-Zellen aus der

weißen Pulpa steuert. Durch Blockade dieses Signalweges durch FTY720 wurde die

Abgabe der follikulären B-Zellen aus der weißen Pulpa an den venösen Sinus

unterbrochen. Damit wurden keine follikulären B-Zellen an das Blut abgegeben.

Sie stellten sogar fest, dass die B-Zellanzahl in der Milz leicht zunahm. Abhängig vom

S1PR1 pendeln die MZ B-Zellen zwischen der MZ (Marginalzone) und den Follikeln.

Dies wird als „MZ B-Zell Shuttling“ bezeichnet. Die MZ B-Zellen werden bei diesem

81

Mechanismus nicht ans Blut abgegeben. Durch Blockade des S1PR1 durch FTY720

wird deshalb nur dieser Kreislauf unterbrochen. Die MZ B-Zellen verlassen die Milz

deshalb nicht (Arnon et al. 2014). Dieser Mechanismus könnte erklären, weshalb sich

die Zahl der B-Zellen im Milzhomogenat nicht ändert.

In der präsymptomatischen und symptomatischen Phase lässt sich eine leichte

Zunahme der B-Zellen im Milzhomogenat der SOD1G93Adl-Tiere feststellen. Damit

bestätigen wir die Beobachtungen von Arnon und Cyster (Arnon et al. 2014).

Im Endstadium lässt sich das Verhalten hinsichtlich einer leichten Zunahme der B-

Zellen im Milzhomogenat der SOD1G93Adl-Tiere nicht mehr nachvollziehen. Im

Gegenteil, es kommt im Endstadium sogar zu einer leichten Abnahme der B-Zellzahl.

4.3.4.2 T-Zellen sowie CD4+ und CD8+ T-Zellen im Milzhomogenat

In der vorliegenden Studie senkt FTY720 die T-Zellen sowie die CD4+ und CD8+ T-

Zellen im Milzhomogenat von SOD1G93Adl-Tieren signifikant (p<0,001).

Die beobachteten Effekte von FTY720 auf die T-Zellen sowie den CD4+ und CD8+ T-

Zellen sind aus früheren Studien bekannt.

Bei der Reduktion der T-Zellen in der Milz spielt der CCR7 Rezeptor eine

Schlüsselrolle. Er vermittelt über ein G-Protein (Cyster et al. 1995) die Einwanderung

der T-Zellen in die T-Zell Zone der Milz. Der CCR7 ist S1P-Rezeptor 1 abhängig

(Pham et al. 2008). Dabei dient das CCR7 abhängige Chemokin CCL21 als Lockstoff

für T-Zellen. CCL21 wird von FRC exprimiert (Bajenoff et al. 2008). Durch Blockade

des S1P-Rezeptors 1 durch FTY720 wird das Einwanderungssignal des CCR7

Rezeptors aufgehoben. Das hat zur Folge, dass die Zahl der T-Zellen sowie die Zahl

der CD4+ und CD8+ T-Zellen in der Milz abnehmen.

Wir bestätigen damit die Effekte von FTY720 hinsichtlich des beschriebenen

Verhaltens von T-Zellen sowie den CD4+ und CD8+ T-Zellen im Homogenat der Milz

für das SOD1G93Adl-Mausmodell.

82

4.3.5 FTY720 senkt die Freisetzung der proinflammatorischen und

antiinflammatorischen Zytokine

4.3.5.1 IFN-γ im Blutplasma

FTY720 zeigt hinsichtlich der Abnahme des proinflammatorischen Zytokins IFN-γ im

Blutplasma von SOD1G93Adl-Tieren zu den Zeitpunkten 170-180 Tage, in der

symptomatischen Phase und im Endstadium einen dosisabhängigen Effekt. Dabei übt

die höhere Dosierung des Medikaments bei Tieren im Alter von 170-180 Tagen und

bei Tieren im Endstadium den stärkeren Effekt aus. Die niedrigere Dosierung vermittelt

hingegen den stärkeren Effekt in der symptomatischen Phase.

Ein Einfluss von FTY720 zu den Zeitpunkten 40-120 Tage ist nicht festzustellen. Die

erhöhte IFN-γ Blutplasmakonzentration von SOD1G93Adl-Kontrolltieren im Alter von

170-180 Tage bis zum Endstadium interpretieren wir als eine reaktive Inflammation auf

die schon abgelaufene Neurodegeneration bei den α-Motoneuronen.

Tem-Zellen sezernieren unter anderem IFN-γ (Sallusto et al. 1999). Sie werden durch

FTY720 nicht beeinflusst und damit auch nicht die Sekretion von IFN-γ im Blutplasma.

Das Medikament hat zwar keinen direkten Einfluss auf Tem-Zellen im ZNS, aber durch

Verhinderung des Eintritts von Tn- und Tcm-Zellen, die sich zu Tem-Zellen

differenzieren können, wird auch die Zahl der Tem-Zellen vermindert (Mehling et al.

2008). Eine Abnahme der Tem-Zellen könnte eine mögliche Erklärung für die

Verminderung von IFN-γ Blutplasmaspiegel bei FTY720 behandelten SOD1G93Adl-

Tieren sein.

B-Zellen sezernieren ebenfalls IFN-y. Man kann vermuten, dass die in der

vorliegenden Studie beobachtete FTY720 vermittelte Reduktion der B-Zellen eine

Abnahme des IFN-γ Blutplasmaspiegels bewirkt. In der symptomatischen Phase

stellen wir zudem bei SOD1G93Adl-Kontrolltieren eine Zunahme der B-Zellen im Vollblut

fest. Wir nehmen an, dass dies zu dem starken Anstieg der IFN-γ Blutplasmaspiegel

im Alter von 170-180 Tagen führt.

In zwei unabhängigen Studien wurden protektive Effekte von FTY720 in einem

Mausmodell der Arteriosklerose gezeigt. Dabei zeigten sich unter anderem bei den

FTY-behandelten Tieren niedrigere Plasmakonzentrationen für das

proinflammatorische Zytokin IFN-γ (Pinschewer et al. 2000), (Brinkmann et al. 2004).

83

4.3.5.2 IL-2 im Blutplasma

FTY720 senkt das proinflammatorische Zytokin IL-2 im Blutplasma von SOD1G93Adl-

Tieren dosisabhängig zu allen gemessenen Zeitpunkten. Im Blutplasma von

SOD1G93Adl-Kontrolltieren beobachten wir zu den Zeitpunkten 40-80 Tage und im

Endstadium erhöhte IL-2 Blutplasmakonzentrationen. Hinsichtlich der Abnahme der IL-

2 Blutplasmakonzentration bei SOD1G93Adl-Tieren üben beide Dosierungen von

FTY720 zu den Zeitpunkten 40-80 Tage einen Effekt aus. Die höhere Dosierung

vermittelt diesbezüglich den stärkeren Effekt.

Im Zeitraum 100 Tage bis zur symptomatischen Phase ist bei den 1,0 mg/kg Tag

FTY720 behandelten SOD1G93Adl-Tieren hinsichtlich einer Abnahme der IL-2

Blutplasmakonzentration ein Effekt von FTY720 nicht erkennbar. Nur in der Dosierung

von 3,0 mg/kg Tag FTY720 kommt es in diesem Zeitraum bei SOD1G93Adl-Tieren zu

einer Abnahme der IL-2 Blutplasmakonzentration bei SOD1G93Adl-Tieren. Zum

Zeitpunkt Endstadium beobachten wir einen dosisunabhängigen Effekt von FTY720

bezüglich der Abnahme der IL-2 Blutplasmakonzentration.

Tcm-Zellen sezernieren IL-2 (Sallusto et al. 1999). Sie werden wie die Tn-Zellen von

FTY720 beeinflusst, da sie den CCR 7 Rezeptor auf ihrer Zelloberfläche tragen. Dockt

FTY720 an den S1P Rezeptor 1 an, vermittelt der CCR7 Rezeptor über ein G-Protein

(Cyster et al. 1995) die Retention der T-Zellen im Lymphknoten. Somit können Tcm-

Zellen auch kein IL-2 mehr ins Blutplasma freisetzen.

Mehling et al. analysierten die Blutproben von FTY720 behandelten MS Patienten und

stellten fest, dass die Tcm-Zellen die Produktion des Proliferationsfaktors IL-2

vermindern und damit die Proliferationsrate reduzieren. Jedoch beobachteten sie eine

reaktive Produktion von IFN-γ, welche vergleichbar ist mit der der Kontrollgruppen

(unbehandelte MS-Patienten und gesunde Patienten). Es wurde eine Dosierung von

1,25 mg/kg KG FTY720 verwendet (Mehling et al. 2011). Eine reaktive Zunahme der

IFN-γ Blutplasmakonzentration ist, wie sie bei der Multiplen Sklerose beobachtet

wurde, in der vorliegenden Studie nicht erkennbar. Im Gegenteil, es kommt

größtenteils zu einer Abnahme der IFN-γ Blutplasmakonzentration bei behandelten

SOD1G93Adl-Tieren.

Auch Brinkmann et al. beobachteten in vitro anhand von isolierten T-Zellen aus dem

Blut von FTY720-behandelten Transplantations- und MS-Patienten, die dem Tem

Phänotyp entsprachen, eine Reduktion der Sekretion an IL-2 und deren

Proliferationsaktivität. Hier konnte wie in der vorliegenden Studie kein Einfluss von

84

FTY720 hinsichtlich einer Zunahme der IFN-γ Blutplasmakonzentration beobachtet

werden (Brinkmann et al. 2001).

4.3.5.3 IL-4 im Blutplasma

Zudem stellen wir einen dosisabhängigen Effekt von FTY720 hinsichtlich der Abnahme

des antiinflammatorischen Zytokin IL-4 im Blutplasma von behandelten SOD1G93Adl-

Tieren zu den Zeitpunkten 40d, 60d, 80d und 170-180 Tage fest. Die höhere Dosierung

von FTY720 übt diesbezüglich einen stärkeren Effekt aus. Zu den übrigen

gemessenen Zeitpunkten zeigen die SOD1G93Adl-Kontrolltiere sowie die behandelten

SOD1G93Adl-Tiere sehr niedrige IL-2 Blutplasmaspiegel, so dass ein Effekt von FTY720

schwer zu beurteilen ist.

Im Anfangsstadium von SOD1G93A-Tieren findet man vor allem CD4+ T-Zellen und

davon hauptsächlich Th2-Helferzellen, die IL-4 produzieren (Beers et al. 2011),

(Fiala et al. 2010). Dies kann anhand der höheren IL-4 Blutplasmakonzentrationen zu

den Zeitpunkten 40 Tage, 60 Tage und 80 Tage in der vorliegenden Studie

nachvollzogen werden. Inwieweit FTY720 IL-4 im Blutplasma beeinflusst, ist noch nicht

beschrieben worden. Hinsichtlich der Abnahme der naiven CD4+ T-Zellen im Blut von

SOD1G93Adl-Tieren nehmen wir an, dass sich weniger naive CD4+ T-Zellen zu Th2-

Helferzellen differenzieren können. Aufgrund der verminderten Anzahl an Th2-Zellen

könnte auch weniger IL-4 ins Blutplasma freigesetzt werden.

Im Rahmen des SOD1G93Adl-Mausmodells stellen wir fest, dass FTY720 die

proinflammatorischen Zytokine IL-2 und IFN-γ und das antiinflammatorische Zytokin

IL-4 dosisabhängig senkt. Dieser Effekt ist nicht zu allen Zeitpunkten erkennbar, da die

Blutplasmakonzentrationen der untersuchten Interleukine sowohl bei SOD1G93Adl-

Kontrolltieren als auch bei den behandelten SOD1G93Adl-Tieren sehr gering ausgeprägt

ist.

Die Übertragung unserer Ergebnisse auf den Menschen ist nur bedingt möglich und

sinnvoll, da die Reproduzierbarkeit und die Übertragung der Ergebnisse präklinischer

Studien auf den Menschen begrenzt sind.

Zudem ist die Vergleichbarkeit unterschiedlicher Mausmodelle nur eingeschränkt

möglich, da es sich teilweise um andere Pathomechanismen handelt. Diese sind oft

nicht ausreichend erforscht. Auch ist die Gegenüberstellung von in vivo und in vitro

85

Studien nur bedingt möglich. In vitro Studien können systemische, organspezifische

und pharmakologische Aspekte nicht erfassen (Spielmann H 1994).

In Zukunft ist es sicherlich sinnvoll den möglichen direkten neuroprotektiven Effekt von

FTY720 noch einmal im SOD1G93Adl-Mausmodell zu überprüfen. Ob FTY720

insbesondere in der präsymptomatischen Phase mit beiden Dosierungen und in der

symptomatischen Phase nur in einer Dosierung von 1,0 mg/kg Tag neuroprotektiv

wirkt, wie in unserer Studie beschrieben, muss ebenfalls noch genauer erforscht

werden. Dabei stellt sich unter anderem die Frage, in welcher Dosierung sich die

neuroprotektiven und neurotoxischen Effekte die Waage halten.

Durch Messung des BDNF könnte die Frage beantwortet werden, ob FTY720 im

SOD1G93Adl-Mausmodell überlebensfördernde Signalwege beeinflusst.

Um weitere Erkenntnisse über die Neuroprotektivität von FTY720 zu gewinnen, bietet

es sich an, einen möglichen Effekt auf phosphorylierten Neurofilamente H mit einer

suffizienten Methode zu wiederholen.

Im Rahmen der Zytokinmessung sollte in einer neu aufgelegten Studie die Fallzahl der

verschiedenen Behandlungsgruppen angepasst werden, um aussagekräftigere

Ergebnisse zu erhalten.

Es ist außerdem empfehlenswert den Einfluss von FTY720 im Rahmen eines anderen

ALS-Mausmodells zu prüfen.

In Zukunft sollte der Frage nachgegangen werden, auf welche weiteren pathologischen

Prozesse FTY720 im SOD1G93Adl-Mausmodell Einfluss hat. Dafür ist eine

immunhistochemische Färbung der abgelagerten und abnorm gefalteten SOD1

Proteine im Rückenmark sowie eine Messung von Gelsolin, einem proapoptotischen

Protein, im Plasma und Hirn-Homogenat geplant.

86

5 Zusammenfassung

Das Präparat FTY720 wird weltweit zur verlaufsmodifizierenden Langzeitbehandlung

der schubförmigen Multiplen Sklerose eingesetzt und wird unter dem Namen Gilenya®

von der Firma Novartis vertrieben.

Die antiinflammatorische Wirkung des Immunmodulators FTY720 wurde bereits in

zahlreichen Publikationen belegt. Eine direkte neuroprotektive Wirkung von FTY720

wird vermutet, wurde bisher allerdings nur unzureichend untersucht.

Zur Untersuchung dieses Sachverhaltes wurde das primär neurodegenerative

SOD1G93Adl-Mausmodell der Amyotrophen Lateral Sklerose gewählt.

Bei der ALS handelt es sich um eine primär neurodegenerative Erkrankung, die

innerhalb von 3-5 Jahren unweigerlich zum Tode führt. Riluzol ist zurzeit das einzige

zugelassene Medikament zur Behandlung dieser Motoneuron-Krankheit.

In der vorliegenden Studie wurde FTY720 in den Dosierungen 1,0 mg/kg Tag und 3,0

mg/kg Tag verwendet.

Diese Dissertationsarbeit beschäftigte sich mit zwei Fragestellungen. Zum einen sollte

ein möglicher neuroprotektiver Effekt von FTY720 auf die α-Motoneurone erforscht

werden.

Um diesen Sachverhalt zu untersuchen, wurden folgende Methoden verwendet:

• Quantitative Bestimmung der α-Motoneurone im Rückenmark mittels Nissl-Färbung

• FTY720-Messung im Homogenat von SOD1G93Adl-Tieren durch die Firma Norvatis

• Quantitative Analyse von phosphorilierten Neurofilamenten H im Hirnhomogenat von

SOD1G93Adl-Tieren mittels ELISA

• Untersuchung des Effekts von FTY720 in Bezug auf den Krankheitsbeginn von

SOD1G93Adl-Tieren

Die quantitative Analyse der α-Motoneurone im lumbalen Rückenmark von FTY720

behandelten SOD1G93Adl-Tieren ergab einen gering ausgeprägten neuroprotektiven

Effekt. Dieser trat sowohl in der präsymptomatischen als auch in der symptomatischen

Phase auf. In der präsymptomatischen Phase konnte der Effekt in der niedrigen und

hohen Dosierung dosisabhängig beobachtet werden. In der symptomatischen Phase

hingegen zeigte sich dieser nur bei den 1,0 mg/kg Tag FTY720 behandelten

SOD1G93Adl-Tieren. Die beschriebenen Effekte waren nicht signifikant.

Konzentationen von FTY720 und FTY720-Phosphat wurden außerdem im

Hirnhomogenat gemessen, und wir konnten damit zeigen, dass FTY720 über die

87

Bluthirnschranke diffundiert. Ein direkter neuroprotektiver Effekt ist damit zumindest

möglich.

Mit Hilfe der quantitativen Analyse der phosphorylierten Neurofilamente H (pNFH) im

Hirnhomogenat von SOD1G93Adl-Tieren konnte der Krankheitsverlauf der

unbehandelten SOD1G93Adl-Kontrolltiere nicht nachvollzogen werden, so dass eine

abschließende Beurteilung des Effekts von FTY720 hinsichtlich einer Reduktion von

pNFH-Werten bei behandelten SOD1G93Adl-Tieren nicht möglich war.

Einen Einfluss von FTY720 auf den Krankheitsbeginn von SOD1G93Adl-Tieren wurde

nicht beobachtet.

In einigen früheren Studien konnte ein neuroprotektiver Effekt von FTY720 wie

beispielsweise in einem Mausmodell des M. Huntington aufgezeigt werden. Aufgrund

unserer negativen Ergebnisse im ALS-Tiermodell gehen wir aber eher davon aus, dass

FTY720 allgemein seine postulierte neuroprotektive Wirkung bei der multiplen

Sklerose über den antiinflammatorischen Wirkmechanismus vermittelt.

Es stellt sich die Frage, ob FTY720, wie schon in anderen Mausmodellen gezeigt, im

SOD1G93Adl-Mausmodell neuroprotektive Signalwege überhaupt beeinflusst.

Des Weiteren sollte der Effekt von FTY720 auf die inflammatorischen Parameter im

SOD1G93Adl-Mausmodell untersucht werden. Um dieser Fragestellung nachzugehen,

wählten wir folgende Methoden aus:

• Quantitative Bestimmung von Astrozyten im Rückenmark mittels IHC

• Quantitative Bestimmung von Mikroglia im Rückenmark mittels IHC

• Quantitative Analyse der T-und B-Zellen im Blut und Milzhomogenat mittels FACS

• Zytokinmessung im Blutplasma mittels ELISA

• FTY720-Messung im Plasma durch die Firma Norvatis

In der vorliegenden Studie stellten wir keinen Effekt von FTY720 bezüglich einer

Abnahme der Astrogliose und der Mikrogliaaktivierung bei behandelten SOD1G93Adl-

Tieren fest.

Hinsichtlich der Wirkung auf B-und T-Zellen sowie den CD4+ und CD8+ T-Zellen

bestätigten wir die bekannte antiinflammatorische Wirkung von FTY720 im Vollblut und

Milzhomogenat von SOD1G93Adl-Tieren.

Sowohl die proinflammatorischen Zytokine IFN-γ und IL-2 als auch das

antiinflammatorische Zytokin IL-4 im Blutplasma von SOD1G93Adl-Tieren wurden durch

FTY720 dosisabhängig gesenkt.

88

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97

Anhang

Vortest der Neurofilamente NFH

„Spike-and-Recovery“ und „Linearity of Dilution“ Experimente sind wichtige Methoden

zur Validierung und Beurteilung der Genauigkeit von ELISAs (Thermoscientific 2007).

„Spike and Recovery“

Das Spike und Recovery wird gewöhnlich bestimmt, um festzustellen, ob ein

Unterschied durch die Detektion des zu analysierenden Materials zwischen dem

Verdünnungsmittel (Diluent) der Standardkurve und der biologischen „sample matrix“

(biologische Probe +Verdünnungsmittel) besteht.

Dabei wird ein bekannter Betrag an Analyt (Spike) zu dem zu analysierenden Material

hinzugefügt und im Assay gemessen. Verglichen wird der gemessene Wert mit dem

identischen Spike in der Standardkurve. Als Kontrolle dient das zu analysierende

Material + Diluent (Thermoscientific 2007).

„Linearity of Dilution“

Das Linearity of Dilution Experiment sagt etwas über die Genauigkeit der Assay

Ergebnisse bei unterschiedlicher Verdünnung der zu testenden Probe aus.

Die Linearität ist hier definiert als der kalkulierte Betrag des zu analysierenden

Materials basierend auf der Standardkurve. Ist die Linearität über einen weiten Bereich

der Verdünnung vorhanden, dann ist der Assay sehr flexibel in der Verwendung von

verschiedenen Probenspiegeln. Ein zu analysierendes Material mit hohen

Probenspiegeln kann mehrfach verdünnt werden, ohne dass es aus der Standardkurve

herausfällt. Dagegen kann ein zu analysierendes Material mit niedrigen Spiegeln nur

ohne Verdünnung gemessen werden (Thermoscientific 2007).

Durchführung des Vortests:

Zur Herstellung der Verdünnung Probe 1 (Nr. 297) wurden 2,4μl des Homogenats in

117,6μl des ELISA Assay Puffers (1:50) gelöst und 5 Sek. gevortext. Anschließend

wurden aus der einfachen (1:50) Verdünnung 60μl entnommen und in 60μl des ELISA

98

Assay Puffers (1:2) gelöst. Ich einem weiteren Schritt wurden ebenfalls 60μl

entnommen und in 60μl des ELISA Assay Puffers (1:4) gelöst.

Der pNF-H Standard wurde, wie vom Hersteller beschrieben vorbereitet. Aus dem

Tube mit 15ng/ml blieben 20μl für den Vorversuch übrig. Von dieser Menge wurden

10μl entnommen und mit 30μl ELISA Assay Puffer (1:3) auf eine Konzentration von

3,75 ng/ml verdünnt. Anschließend wurden 10μl aus den 40μl der 3,75 ng/ml

Standardlösung herausgenommen und mit 40μl der jeweils unterschiedlich (1, 1:2, 1:4)

verdünnten Proben 1 gelöst und für 5 Sek. gevortext.

Zur Herstellung der Verdünnungsreihe (1:2; 1:4; 1:8; 1:16) von Probe 2 (Nr.

311)wurden 4,8μl des Homogenats in 235,2μl des ELISA Assay Puffers gelöst und 5

Sek. gevortext. Anschließend wurden aus der einfachen (1:50) Verdünnung 120μl

entnommen und in 120μl des ELISA Assay Puffers (1:2) gelöst. In einem weiteren

Schritt wurden ebenfalls 60μl entnommen und in 60μl des ELISA Assay Puffers (1:4)

gelöst. Mit den andern beiden Verdünnungen wurde genauso verfahren.

Bevor die Wells mit den Proben belegt werden konnten, wurden sie mit je 100 μl TBS

hydratisiert und 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Dann entfernte man das TBS

und klopfte die Wells trocken.

Anschließend wurden sie, wie im Protokoll dokumentiert, mit je 50μl des Standards

und der Proben 1 + 2 belegt.

Jede Probe wurde doppelt bestimmt. Der Standard und die Proben wurden 1 h bei RT

unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Wells wurden während der Inkubationszeit mit

einem Plate Sealer abgedeckt.

Nachdem die Inkubationszeit abgelaufen war, wurden die Wells von den

Probelösungen befreit und ausgeklopft. Es folgte der Waschschritt:

Die Wells wurden mit je 200 μl Waschpuffer gelöst. Nach kurzem Schütteln der

Wellplatte wurden sie erneut ausgeklopft. Dieser Vorgang wurde sechsmal wiederholt.

Infolge wurde jeder Well mit 100 μl des gelösten anti-pNF-H Antikörpers gelöst, und

sie wurden erneut 1 h bei RT unter leichtem Schütteln inkubiert.

Nachdem die Inkubationszeit abgelaufen war, folgte ein weiterer Waschschritt, wie

schon oben beschrieben.

Im folgenden Schritt wurde jeder Well mit 100 μl des gelösten Goat anti-rabbit

polyklonalen Antikörpers, der mit einer Alkaline Phosphatase konjugiert war, benetzt

99

und erneut 1 h bei RT unter leichtem Schütteln inkubiert. Es folgte wieder ein

Waschvorgang.

Anschließend wurden die Wells mit jeweils 200 μl 1×TBS gespült und danach wieder

trocken geklopft.

Infolge gab man dann 100 μl des gelösten 1× pNPP Alkaline Phospatase Substrats in

die Wells.

Die 96-Well Platte wurde daraufhin im Dunkeln ca. 1h bei RT gelagert. Sofort danach

wurden die Wells mit Hilfe des ELISA Plate Readers bei einer Wellenlänge von 430

nm gemessen.

Auswertung des Vortest

Jede Probe wurde doppelt bestimmt und deren gemessene Werte wurden gemittelt.

Recovery

Recovery in %=100× ((Probe mit Spike – Spike)/ Probe ohne Spike)

Tabelle 6: Auswertung des Spike and Recovery Experimentes der pNFH. Gemessen wurde die Probe

2 mit und ohne Spike in den Verdünnungen 1, 1:2, 1:4, sowie der Spike ohne Probe 2. Es wurde

daraufhin der Mittelwert, der Recovery und der Recovery in % ermittelt. Untersuchung des

Wirkmechanismus von FTY720 am Universitätsklinikum Ulm im Jahr 2014. Grün= die verwendete

Verdünnung im Experiment pNFH ELISA, pNFH= phosphorilierte Neurofilamente Heavy Chain.

2. Probe

ohne Spike:

1-fach:

2. Probe

ohne Spike:

1:2

2. Probe

ohne Spike:

1:4

2. Probe mit

Spike: 1-

fach:

2. Probe mit

Spike: 1:2

2. Probe mit

Spike: 1:4 Spike

1. Rohdaten 0.88404443 0.53506564 0.31728919 1.6892751 1.6892751 1.26037475 1.08964512

2. Rohdaten 0.98577664 0.61030831 0.53506564 1.83192048 1.66584685 1.8078966 1.3258696

Mittelwert 0.935 0.573 0.426 1.761 1.678 1.534 1.208

Spike 0.553 0.470 0.326

Recovery 0.826 1.105 1.108

Recovery in

% 68.4 91.5 91.7

100

Linearity of Dilution

Tabelle 7: Auswertung des Linearity of Dilution Experiment der pNFH. Gemessen wurde die Probe 2 in

den Verdünnung 1, 1:2, 1:4, 1:8; 1:16. Jede Verdünnungsreihe wurde doppelt bestimmt und der

Mittelwert ermittelt. Untersuchung des Wirkmechanismus von FTY720 am Universitätsklinikum Ulm im

Jahr 2014. Grün= die verwendete Verdünnung im Experiment pNFH ELISA, pNFH= phosphorilierte

Neurofilamente Heavy Chain.

Abbildung 18: Standardkurve des Vortest pNFH ELISA. pNFH= phosphorilierte Neurofilamente Heavy

Chain. Untersuchung des Wirkmechanismus von FTY720 am Universitätsklinikum Ulm im Jahr 2014.

Probe 2: 1-

fach Probe 2: 1:2 Probe 2: 1:4 Probe 2: 1:8 Probe 2: 1:16

1. Rohdaten 0.784415932 0.591374473 0.370599005 0.299691994 0.162197235

2. Rohdaten 0.884044429 0.591374473 0.479496996 0.424672343 0.213048521

Mittelwert 0.834 0.591 0.425 0.362 0.188

101

Danksagung

103

Lebenslauf

Untersuchung des Wirkmechanismus von FTY720 in einem ...

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