Untersuchungen zum Nachweis von Listeria monocytogenes in ... · Aus der Zentrumsabteilung für...

Aus der Zentrumsabteilung für Lebensmittelkunde, Fleischhygiene und -technologie

des Zentrums für Lebensmittelwissenschaften

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Untersuchungen zum Nachweis von Listeria monocytogenes

in Schweinehackfleisch:

Kulturelle Referenzmethode, ELISA, PCR und Microarray

I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Melanie Tina Leidreiter

aus Bochum

Hannover 2003

Wissenschaftliche Betreuung: Priv.-Doz. Dr. M. Kühne

1. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. M. Kühne

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand

Tag der mündlichen Prüfung: 17. November 2003

Die Arbeit wurde aus Mitteln der Dr. Eberhard Lienhop Stiftung gefördert.

Gewidmet

meinen Eltern, meinem Opa

und in Gedenken Frau Helene Schröder

INHALTSVERZEICHNIS

1. Einleitung..........................................................................................................................................................................13

2. Schrifttum.........................................................................................................................................................................15

2.1 Genus Listeria ....................................................................................................................................................................15

2.1.1 Geschichte .............................................................................................................................................................15

2.1.2 Taxonomie und mikrobiologische Eigenschaften ...................................................................15

2.1.3 Differenzierung der Spezies von Listerien.................................................................................... 16

2.1.4 Epidemiologie der humanen Listeriose .......................................................................................... 17

2.1.5 Listeriose: Klinische Symptomatik des Menschen................................................................. 19

2.1.6 Prophylaxe ............................................................................................................................................................ 19

2.2 Hackfleisch ...........................................................................................................................................................................20

2.2.1 Allgemeines.......................................................................................................................................................... 20

2.2.2 Kontaminationen von Fleisch und Fleischerzeugnissen mit Listeria spp..............20

2.3 Methoden zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln.......................23

2.3.1 Kulturelle Nachweismethoden................................................................................................................ 23

2.3.1.1 Erfahrungen mit den Medien der Amtlichen Methode nach § 35 LMBG

(DIN EN ISO-Methode 11290-1 von 1996 – qualitativer Nachweis)..................... . 23

2.3.2 Immunologische Nachweismethoden................................................................................................ 27

2.3.2.1 Allgemeines.......................................................................................................................................................... 27

2.3.2.2 Immunologische Verfahren zum Nachweis von Listeria (monocytogenes).........27

2.3.2.3 Anwendung Listeria spp.-spezifischer Enzymimmunoassays........................................29

2.3.2.4 Anwendung Listeria monocytogenes-spezifischer Enzymimmunoassays............ 33

2.3.3 Molekularbiologische Methoden.......................................................................................................... 35

2.3.3.1 PCR als integrales System ........................................................................................................................ 6336

2.3.3.2 Anreicherung der Zielkeime im Vorfeld der PCR...................................................................36

2.3.3.3 Listeria monocytogenes-spezifische Zielsequenzen.............................................................. 38

2.3.3.4 Multiplex-PCR................................................................................................................................................... 39 39

2.3.3.5 Detektion der PCR-Produkte....................................................................................................................40

2.3.3.6.1 Nachweisgrenzen und Spezifität von PCR-Systemen bei Untersuchungen

von Listeria monocytogenes-Reinkulturen.................................................................................... 42

2.3.3.6.2 Nachweisgrenzen von PCR-Systemen bei Untersuchung von Listeria mono-

cytogenes-dotierten Lebensmitteln (mit oder ohne Anreicherung). ........................... 4 44

2.3.3.6.3 Sensitivität und Spezifität verschiedener PCR-Systeme nach Untersuchungen

von Feldproben................................................................................................................................................... 48

2.3.4 Methodenvergleich.......................................................................................................................................... 51

2.4 Schlussfolgerungen aus dem wissenschaftlichen Schrifttum.................................................... 55

3. Eigene Untersuchungen ................................................................................................................................ 57

3.1 Material ................................................................................................................................................................................... 57

3.1.1 Hackfleisch............................................................................................................................................................ 57

3.1.2 Mikroorganismen.............................................................................................................................................. 57

3.2 Methoden.................................................................................................................................................................................58

3.2.1 Kulturelle Nachweismethode................................................................................................................... 59

3.2.2 Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA …...................................................…............ 62

3.2.3 PCR...............................................................................................................................................................…...........64

3.2.4 NUTRI®-Chip...…............................................................................................................................................... 69

3.3 Versuche ..................................................................................................................................................................................74

3.3.1 Dotieren von Schweinehackfleisch mit Listeria monocytogenes sowie mit

Listeria innocua................................................................................................................................................. 74

3.3.1.1 Prüfung der Anreicherungsbedingungen zur Erzielung bestimmter Listeria

monocytogenes-Konzentrationen .........................................................................................................74

3.3.1.2 Herstellen einer TK-Keimbank mit einem Freezing Medium........................................ 75

3.3.1.3 Dotieren (künstliche Kontamination)................................................................................................ 76

3.3.1.4 Überprüfung des Einflusses von Brillantschwarz auf das Wachstum von

Listerien................................................................................................................................................................... 78

3.3.2 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in

Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode.................................................................78

3.3.2.1 Ermittlung des Zeitaufwandes.................................................................................................................78

3.3.2.2 Spezifität der mikrobiologischen Referenzmethode für Mischkulturen mit

Listeria innocua in Schweinehackfleisch....................................................................................... 80


Schweinehackfleisch mittels PCR........................................................................................................82

3.3.3.1 Versuche zur Sensitivität und Spezifität der PCR....................................................................82

3.3.3.1.1 Sensitivität der PCR nach Anreicherung von Listeria monocytogenes

in TSYE- und Halbfraser-Bouillon......................................................................................................82

3.3.3.1.2 Prüfung der Spezifität der PCR mit DNA von Listeria innocua.................................. 82

3.3.3.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis

von Listeria monocytogenes in Schweinefleisch mittels PCR...................................... 83


Schweinehackfleisch mittels Microarray........................................................................................85


von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels Microarray............85

3.3.4.2 Spezifität des Microarray-Nachweises für Mischkulturen mit Listeria

innocua in Schweinehackfleisch...........................................................................................................85


Schweinehackfleisch mittels ELISA.................................................................................................. 86

3.3.5.1 Überprüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Einflüsse auf

die ELISA-Methode (Tranisa plate® Listeria moncytogenes-ELISA) sowie

der vom Hersteller angegebenen Sensitivität für das Testkit.......................................... 86

3.3.5.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis von

Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels ELISA................................. 87


Feldproben mittels molekularbiologischen Verfahren......................................................... 89

3.3.6.1 Untersuchung von Listerien-positiven Feldproben mittels

Agargel-Elektrophorese und Microarray........................................................................................ 89

4. Ergebnisse........................................................................................................................................................................ 90

4.1 Dotieren von Schweinehackfleisch mit Listeria monocytogenes sowie mit

Listeria innocua................................................................................................................................................................ . 90

4.1.1 Prüfung der Anreicherungsbedingungen zur Erzielung bestimmter Listeria

monocytogenes-Konzentrationen.......................................................................................................... 90

4.1.2 Herstellen einer TK-Keimbank mit einem Freezing Medium........................................ 91

4.1.3 Dotieren (künstliche Kontamination) des Hackfleisches....................................................92

4.1.4 Prüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Wirkungen auf das

kulturelle Wachstum von Listerien..................................................................................................... 92

4.2 Nachweis von Listerien in Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode........ 93

4.2.1 Ermittlung des Zeitaufwandes für den qualitativen Nachweis von Listeria

monocytogenes in Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode.....................93

4.2.2 Spezifität der mikrobiologischen Referenzmethode für Mischkulturen mit

Listeria innocua in Schweinehackfleisch....................................................................................... 95

4.3 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in

Schweinehackfleisch mittels PCR..................................................................................................................... 97

4.3.1 Versuche zur Sensitivität und Spezifität der PCR................................................................... 97

4.3.1.1 Sensitivität der PCR nach Anreicherung von Listeria monocytogenes in

TSYE-respektive Halbfraser-Bouillon............................................................................................. 97

4.3.1.2 Prüfung der Spezifität der PCR mit DNA von Listeria innocua.................................. 97

4.3.2 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis

von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels PCR............................ 99


Schweinehackfleisch mittels Microarray.................................................................................................100

4.4.1 Ermittlung der Mindestanreicherungszeit für den qualitativen Nachweis von

Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels Microarray.................... 100

4.4.2 Molekularbiologischer Nachweis von Listeria monocytogenes mittels

Microarray in Anwesenheit von Listeria innocua................................................................ 105


Schweinehackfleisch mittels ELISA.............................................................................................................107

4.5.1 Überprüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Einflüsse auf


der vom Hersteller angegebenen Sensitivität für das Testkit....................................... 107


Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels ELISA.............................. 108

4.6 Qualitativer Nachweis von Listeria monocytogenes in Feldproben mittels

Agargel-Elektrophorese und Microarray............................................................................................... 110

5. Diskussion....................................................................................................................................................................... 115

5.1 Diskussion des Dotierens von Schweinehackfleisch ..................................................................... 115

5.2 Diskussion zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in

Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode........................................................................ 116


Schweinehackfleisch mittels PCR.................................................................................................................. 122


Schweinehackfleisch mittels ELISA............................................................................................................. 132

5.5 Bedeutung der Halbfraser-Anreicherungskultur in Verbindung mit

Schnellmethoden............................................................................................................................................................ 136

5.6 Vergleich der Schnellmethoden....................................................................................................................... 136

6. Zusammenfassung................................................................................................................................................140

7. Summary.......................................................................................................................................................................... 142

8. Schrifttumsverzeichnis................................................................................................................................... 144

9. Anhang .............................................................................................................................................................................. 169

9.1 Nähr- und Differenzierungsmedien ............................................................................................................ 169

9.2 ELISA-Materialien .................................................................................................................................................... 172

9.3 Materialien für molekularbiologische Untersuchungen ........................................................... 172

9.3.1 Reagenzien ........................................................................................................................................................ 172

9.3.2 Rezepturen ......................................................................................................................................................... 173

9.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien ............................................................................................................ 175

9.5 Tabellenverzeichnis ................................................................................................................................................... 177

9.6 Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................................................ 178

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

aqua dest. Aqua destillata

bp Basenpaar

bzw. beziehungsweise

ca. circa

d. h. das heißt

DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

et al. et alii

evtl. eventuell

°C Grad Celsius

FDA United States Food and Drug Administration

g Gramm

ggf. gegebenenfalls

GKZ Gesamtkeimzahl

h Stunde

i. d. R. in der Regel

inkl. inklusive

ITS Interner Standard

i. w. im wesentlichen

KbE Kolonie-bildende Einheit

kDA Kilodalton

L. Listeria

µl Mikroliter

mAK monoklonale Antikörper

mg Milligramm

min Minute

ml Milliliter

mm Millimeter

o. A. ohne Angabe

n Anzahl der Proben

pAK polyklonale Antikörper

PALCAM (Polymyxin B, Akriflavin, Lithiumchlorid, Ceftazidim,

Moxalactam)

PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)

pH pondus hydrogenii

RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)

s. siehe

spp. Spezies

Tab. Tabelle

TSYEB Tryptone Soya Yeast Enrichment Broth

USDA United States Department of Agriculture

u. und

UV Ultraviolett

v. a. vor allem

z. B. zum Beispiel

z. Z. zur Zeit

Einleitung

13

1. Einleitung

Im Sinne eines vorbeugenden Gesundheitsschutzes ist der Nachweis von Listeria

monocytogenes (L. m.) in Lebensmitteln Gegenstand vieler Studien. Innerhalb der Gattung

Listeria ist Listeria monocytogenes die weitaus bedeutendste humanpathogene Spezies

(FARBER u. PETERKIN 1991).

Die Listeriose tritt relativ selten manifest in Erscheinung, wenn sie es aber tut, dann handelt es

sich - mit einer durchschnittlichen Mortalitätsrate von 30 bis 40 % - um eine äußerst ernst zu

nehmende Infektion (McLAUCHLIN 1987; 1990a).

Listerien werden regelmäßig in Lebensmitteln, besonders auch in rohem Fleisch, nach-

gewiesen (Tab. 3). Der herkömmliche qualitative und quantitative Listerien-Nachweis

benötigt für ein Ergebnis mehrere Tage. Die Laborpraxis braucht für einen ausreichend

empfindlichen, spezifischen und zuverlässigen Nachweis von Listerien Schnellmethoden,

deren Entwicklung auch im Hinblick auf die begrenzte Haltbarkeitsdauer bestimmter

Lebensmittel und die hohen Kosten der Lagerung erforderlich ist (NIEDERHAUSER et al.

1992).

Schnelle spezifische und sensitive Methoden sollen in Zukunft Zeit- und Arbeitsaufwand im

Labor minimieren. In jüngster Zeit sind insbesondere auch Microarrays, die auf molekular-

biologischen Methoden basieren, ins Zentrum des Interesses gerückt.

Verzehrsfertige Lebensmittel wie Hackfleisch, die mit L. monocytogenes kontaminiert sein

können und auch eine Vermehrung ermöglichen (gemäß der Empfehlung des BgVV folgt

daraus eine Zuordnung in die Kategorie II), sollen nach der Empfehlung des BgVV anhand

des quantitativen Listerien-Nachweises beurteilt werden: Als verkehrsfähig wäre beispiels-

weise Hackfleisch nur anzusehen, wenn in 1 g höchstens 100 KbE Listeria monocytogenes

gefunden werden könnten (WEISE et al. 1999).

Aus diesem Kontext heraus ergeben sich die Fragen nach den für den Listerien-Nachweis

geeigneten Methoden. Neben der Zuverlässigkeit sowie Schnelligkeit ist die praktikable

Einsetzbarkeit im Labor der entscheidende Parameter in der Wahl der Methode.

Einleitung

14

Bisher gibt es keine Veröffentlichungen über vergleichende Untersuchungen zum Nachweis

von Listerien mittels bakteriologischer Untersuchung gemäß § 35 LMBG, ELISA und PCR

mittels Detektion der PCR-Produkte anhand Agargel-Elektrophorese und Microarray-

Analyse.

Ziel dieser Arbeit ist es, kulturelle, serologische und molekularbiologische Methoden für den

spezifischen Listeria monocytogenes-Nachweis (besonders hinsichtlich Zeitaufwand) zu

vergleichen. Diese Arbeit soll einen Beitrag leisten zu den Erkenntnissen hinsichtlich der

Praktikabilität von Schnellmethoden für den Nachweis von Listeria monocytogenes in

Schweinehackfleisch.

Schrifttum

15

2. Schrifttum

2.1 Genus Listeria

Listeria-Arten sind weltweit verbreitet. Sie sind relativ anspruchslose Bakterien und werden

z. B. in Wasser, Abwasser, Erdboden, Pflanzen, Silage, Schlachthofabfällen oder Gullies von

LM-verarbeitenden Betrieben gefunden (GRAY u. KILLINGER 1966; BAUMGART et al.

1997, III.3, S. 61).

2.1.1 Geschichte

1893 berichtete Henle nach Sektionen von Patienten in Deutschland von gram-positiven

Stäbchenbakterien, bei denen es sich aus heutiger Sicht um pathogene Listerien gehandelt hat

(GRAY u. KILLINGER 1966). Als Auslöser einer Erkrankung bei Laborkaninchen, die mit

einer charakteristischen Vermehrung der Monozyten im Blut einherging, wurde der Keim

1926 von Murray erstmals beschrieben und als Bacterium monocytogenes bezeichnet. Den

gleichen Keim isolierte Pirie 1927 bei einer seuchenartigen Erkrankung von Wüstenspring-

mäusen und nannte ihn Listerella hepatolytica. Seit 1940 trägt der Keim die bis heute gültige

Bezeichnung Listeria monocytogenes (s. Review FARBER u. PETERKIN 1991).

Erst seit den 1980er Jahren wird L. monocytogenes (Erreger der Listeriose) als ein wichtiger

Faktor der öffentlichen Gesundheit wahrgenommen, nachdem der Verzehr kontaminierter LM

mit Listeriose-Epidemien in Verbindung gebracht wurde (SCHLECH et al. 1983).

Im (human-)medizinischen Sinne galten die Listerien bis dahin als relativ unbedeutend, und

es gab weder offizielle noch zufriedenstellende Nachweismethoden für die Isolation und

Identifizierung von pathogenen Listerien (McLAUCHLIN 1987).

2.1.2 Taxonomie und mikrobiologische Eigenschaften

Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology (SEELIGER u. JONES 1986) führt die Gattung

Listeria unter der Gruppe der regelmäßigen, nicht sporenbildenden, gram-positiven Stäbchen-

bakterien. Bergey`s Manual of Determinative Bacteriology (HOLT et al. 1994) unterscheidet

sieben Arten: L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. monocytogenes, L. murrayi, L. seeligeri und

L. welshimeri.

Schrifttum

16

Nach phylogenetischen, molekularbiologischen Studien wird jedoch davon ausgegangen, dass

L. grayi und L. murrayi eine einzige Spezies (Grayi) darstellen (BOERLIN et al. 1992).

Die an den Enden abgerundeten, zumeist kurzen Stäbchenbakterien (Länge 0,5 bis 2,0 µm

und Durchmesser 0,4 bis 0,5 µm) kommen einzeln und in kurzen Ketten, V-förmig oder

palisadenförmig aneinandergereiht vor. Listerien bewegen sich charakteristisch taumelnd, was

sie bei Temperaturen von 20 - 25°C am besten ausprägen. Das Wachstum ist fakultativ an-

aerob und optimal bei Temperaturen zwischen 30 und 37°C. Temperaturen von unter 1°C und

über 45°C verhindern eine Vermehrung (HOLT et al. 1994). Der Mindest-pH-Wert ist tem-

peraturabhängig (FARBER u. PETERKIN 1991). Kolonien sind katalase-positiv, hydro-

lysieren Äskulin und können Hämolysin (Listeriolysin O) sowie Cytochrome produzieren

(SEELIGER u. JONES 1986). Generationszeiten verschiedener Stämme waren annähernd

vergleichbar (BESSER 2000). Weitere mikrobiologische Eigenschaften s. unter 2.1.3.

2.1.3 Differenzierung der Spezies von Listerien

Die Spezies der Listerien werden im Allgemeinen mit Hilfe von kulturellen, biochemischen

und mikroskopischen Methoden differenziert (SEELIGER u. JONES 1986).

Für die Unterscheidung β-hämolysierender Kulturen (L. ivanovii, L. monocytogenes und

L. seeligeri) muß der CAMP-Test durchführt werden (Tab. 1).

Tab. 1: Charakteristika zur Differenzierung der Listerien (nach HOLT et al. 1994).

+ = 90 % der Stämme oder mehr sind positiv; - = 90 % der Stämme oder mehr sind negativ. V = 11 - 89 % der Stämme sind positiv.

(1) im Allgemeinen breite Zonen oder multiple Zonen(2) wenige Stämme sind nicht-hämolytisch

Merkmal L.grayi

L.innocua

L.ivanovii

L.monocytogenes

L.murrayi

L.seeligeri

L.welshimeri

β-Hämolyse – – +(1) +(2) – + –CAMP-Testmit S. aureus – – – + – + –CAMP-Testmit R. equi – – + – – – –Säurebildungaus:

Rhamnose – V – + V – V

Xylose – – + – – + +

Schrifttum

17

Nach der Beurteilung des Hämolyseverhaltens eines Stammes wird das Fermentations-

verhalten geprüft (Tab. 1). L. monocytogenes ist der einzige hämolytische Stamm, der

Rhamnose – unter Säurebildung – fermentiert.

Die serologischen Methoden zur Differenzierung von L. monocytogenes in 13 Serotypen

sollen hier nicht weiter erläutert werden.

2.1.4 Epidemiologie der humanen Listeriose

Die humane Listeriose tritt sowohl epidemisch als auch sporadisch in Erscheinung. Die Er-

krankungsrate beträgt durchschnittlich 6,2 bzw. 8 Erkrankte pro eine Million Einwohner und

Jahr. Die Erkrankungsrate wird sehr wahrscheinlich unterschätzt, weil in vielen Fällen der

Erreger entweder nicht vermutet (z. B. bei Aborten) oder auch nicht nachgewiesen wird

(FARBER u. PETERKIN 1991; ANON. 1991). Die klinische Listeriose geht mit einer

durchschnittlichen Mortalitätsrate von 30 bis 40 % einher. Bei den nicht mit perinataler

Listeriose assoziierten Fällen steigen das Risiko einer manifesten Erkrankung und die

Mortalitätsrate mit dem Alter (McLAUCHLIN 1987; 1990b). Bundesländer mit einer Melde-

pflicht für listerielle Meningitiden verzeichneten für diese einen Anteil an den bakteriellen

Meningitiden zwischen 4 und 6 %. Klinische Listeriosen treten am häufigsten bei

Neugeborenen und Menschen über 60 Jahren auf (McLAUCHLIN 1990a; ANON. 1991).

Nach dem deutschen Infektionsschutzgesetz unterliegt lediglich die Neugeborenen-Listeriose

(Erkrankung und Tod) der Meldepflicht. Pro Jahr werden zwischen 30 und 40 Fälle amtlich

erfasst (ANON. 1999).

Lebensmittel (LM) gelten als wichtigste Infektionsquellen für den Menschen (BAUMGART

2000). Risikoreich ist u. a. der Verzehr von roher Milch und Rohmilchprodukten sowie von

rohem Fleisch und nur unzureichend durchgegartem Fleisch und Fleischerzeugnissen. Die

Serotypen 1/2a und 1/2b sowie 4b verursachen über 90 % der menschlichen Listeriosen

(FARBER u. PETERKIN 1991). Weltweit dominiert beim Fleisch der Serotyp 1 (ANON.

1991; FARBER u. PETERKIN 1991; VINES u. SWAMINATHAN 1997; PERLBERG et al.

2000). Die orale Aufnahme der Listerien führt u. U. zu einer lokal begrenzten Besiedlung des

Intestinaltraktes. Symptomfreie Dauerausscheider innerhalb der Bevölkerung (FARBER u.

PETERKIN 1991; SLUTSKER u. SCHUCHAT 1999) spielen wahrscheinlich eine Rolle in

der Epidemiologie der Listeriose (ANON. 1991).

Schrifttum

18

BOJSEN-MØLLER (1964) berichtete über die Isolation des Erregers aus menschlichen Fäzes

bei listeriosekranken Kindern, bei Personen mit Kontakt zu Listeriosekranken, bei stationären

Patienten sowie bei symptomfreien Schlachthofarbeitern. Bei immunkompetenten Menschen

verläuft eine L. monocytogenes-Infektion i. d. R. subklinisch bzw. nicht-invasiv mit einem

leichten Verlauf und leichtem Fieber, wobei über das Ausmaß der Verbreitung subklinischer

Infektionen kaum etwas Konkretes bekannt ist (ANON. 2000; McLAUCHLIN 1987). Bei

Ausbruch einer fieberhaften Gastroenteritis in Schweden deuteten alle mikrobiologischen und

epidemiologischen Analysen darauf hin, dass es sich dabei um einen Ausbruch von Listeriose

handelte (CARRIQUE-MAS et al. 2003).

Zu den Risikogruppen für eine klinische Manifestation zählen Schwangere und deren un- oder

neugeborene Kinder, ältere Menschen und immungeschwächte Personen. Zu letzteren

gehören u. a. Patienten mit Krebs, AIDS oder Diabetes mellitus (ANON. 1991; ANON. 1999;

ANON. 2000; BECKER u. HOLZAPFEL 2000; SLUTSKER u. SCHUCHAT 1999). Das

Listeriose-Risiko für die Bevölkerung nimmt in dem Maße zu, in dem das Durchschnittsalter

der Bevölkerung steigt (ANON. 1991).

Die infektiöse Dosis ist stark von dem Gesundheitszustand der einzelnen Person abhängig.

Bedingt durch die lange Inkubationszeit sind Daten über die aktuelle Erregerexposition resp.

die minimale infektiöse Dosis bei invasiven Listeriosen spärlich gesät. Infektiöse Dosen bei

gesunden Erwachsenen in dokumentierten Listeriose-Fällen rangierten zwischen 109 und 105

KbE pro ml bzw. g LM. Für gefährdete Personen betrug die infektiöse Dosis 104, 102 – 104

bzw. weniger als 10 KbE pro g LM. Weit unter 102 KbE L. moncytogenes können wahr-

scheinlich eine Listeriose auslösen, wenn diese Erregermengen über einen längeren Zeitraum

täglich aufgenommen werden. Auch der Verzehr von überdurchschnittlichen Mengen eines

kontaminierten Lebensmittels ist bei der Entstehung einer LM-Infektion evtl. von Bedeutung

(MAIJALA et al. 2001). Kontaminationsraten von weniger als 1 KbE pro g liegen zu häufig

in LM vor, als dass sie für Erkrankungsfälle verantwortlich gemacht werden könnten. Die in

den USA festgestellte Listerioserate ging allerdings mit der Wahrscheinlichkeit einher, eine

Dosis von ≥ 103 KbE pro g Lebensmittel zu sich zu nehmen (HITCHINS 1996).

Die Zeit von der Aufnahme des Erregers bis zur Erkrankung (Inkubationszeit) ist nicht

eindeutig zu definieren (1 Tag bis 90 Tage). Symptome können bei Aufnahme großer Mengen

des Erregers bereits nach 1 bis 7 Tagen auftreten (McLAUCHLIN 1990b; ANON. 1999).

Schrifttum

19

2.1.5 Listeriose: Klinische Symptomatik des Menschen

Die Listeriose manifestiert sich in schweren, invasiven Fällen mit Blutvergiftungen (Septi-

tiden) und Hirnhautentzündungen (v. a. eitrige Meningitiden). Alle Organe können im Krank-

heitsverlauf angegriffen werden. Bei schwangeren Frauen nimmt die Listeriose i. d. R. einen

milden grippeähnlichen Verlauf (McLAUCHLIN 1987). Schon vor bzw. während der Geburt

kann der Erreger auf das Kind übergehen. Spontane Aborte, Früh- und Totgeburten sowie

verschiedene Formen der neonatalen Listeriose (Granulomatosis infantiseptica, Meningitis)

sind charakteristisch (ANON. 1999; ANON. 1991). Selbst bei einer baldmöglichst einge-

leiteten Therapie ist die Letalität kaum zu beeinflussen (ANON. 1999; ANON. 2000).

2.1.6 Prophylaxe

Für die Bekämpfung der Listeriose haben präventive Maßnahmen, die eine Vermehrung von

L. monocytogenes in LM verhindern oder eine wirkungsvolle Keimabtötung sicherstellen,

sowie umfassende Produktkontrollen auf L. monocytogenes, die sich am Risikopotential des

Lebensmittels orientieren, eine besondere Bedeutung. Die Etablierung des Hazard Analysis

and Critical Control Point-Konzeptes (HACCP) ist wichtig für die Kontrolle von L. mono-

cytogenes-Kontaminationen von Lebensmitteln. Als CCP (critical control point) ist die Ein-

haltung der Lagerungstemperatur gekühlter verzehrsfertiger LM anzusehen. Die Anwendung

hygienischer Maßnahmen trägt wesentlich zur Minimierung von Listerien-Kontaminationen

in Lebensmitteln bei (ANON. 1991). Insbesondere bei der Herstellung von LM, die für

Risikogruppen bestimmt sind, sind Kontrollen im Rahmen des HACCP-Konzepts von Be-

deutung (MAIJALA et al. 2001). Herkömmliche mikrobiologische Nachweismethoden sind

ungeeignet für den Gebrauch innerhalb von HACCP-Systemen, weil die Ergebnisse erst mit

zeitlicher Verzögerung zu erhalten sind und sich z. T. als unzuverlässig erwiesen

(SHERIDAN et al. 1997; PENG u. SHELEF 2001). Solange keine kosteneffektiven Schnell-

methoden in HACCP-Konzepten angewendet werden, bereiten die Kontrollen von L. mono-

cytogenes-Kontaminationen Schwierigkeiten. Schnellmethoden ermöglichen ein Online-

Monitoring im Rahmen von HACCP-Konzepten der LM-Industrie (SHERIDAN et al. 1997).

Bewertungskriterien für Schnellmethoden sind Sensitivität, Arbeitsaufwand, (Anschaffungs-)

Kosten und erforderliche Fachkenntnis (FARBER u. PETERKIN 1991).

Schrifttum

20

2.2 Hackfleisch

2.2.1 Allgemeines

Hackfleisch ist ein Gemenge aus stark zerkleinerter roher Muskulatur, das außer Kühlung

keine weitere Zubereitung oder Behandlung erfährt. Gegenüber dem Rohstoff Fleisch besitzt

Hackfleisch eine enorm vergrößerte Oberfläche. Dadurch bietet es ideale Vermehrungs-

bedingungen für Mikroorganismen und stellt im Hinblick auf einen möglichen Rohverzehr

ein besonders hohes hygienisches Risiko dar (SCHALCH et al. 1996).

Die GKZ handelsüblichen Hackfleisches beträgt innerhalb von 48 h ab Herstellung bei einer

konstanten Lagerungstemperatur von 2 - 7°C i. d. R. etwa 105 KbE pro Gramm (LOUWERS

et al. 1999). Die Fleischhygiene-Verordnung (FlHV vom 21.5.1997) gibt einen Grenzwert für

die aerobe mesophile GKZ von log 6,7 KbE pro Gramm vor, der allerdings in praxi immer

wieder überschritten wird (HILDEBRAND et al. 2001; SCHALCH et al. 1996).

Verzehrsfertige Lebensmittel wie Hackfleisch, die mit L. monocytogenes kontaminiert sein

können und auch eine Vermehrung ermöglichen (gemäß der Empfehlung des ehemaligen

BgVV folgt daraus eine Zuordnung in die Kategorie II), sollen nach der Empfehlung des

BgVV anhand des quantitativen Nachweises beurteilt werden: Im Sinne des vorbeugenden

Gesundheitsschutzes soll ein Inverkehrbringen nur bei Keimgehalten < 102 KbE pro g bzw.

ml möglich sein (WEISE et al. 1999).

Gemäß der Lebenmittelhygiene-Verordnung (LMHV) sind die Betriebe zur Durchführung

von Eigenkontrollsystemen im Rahmen eines HACCP-Konzepts verpflichtet. Die Über-

wachung des Vorkommens sowohl pathogener als auch apathogener Listerien unterliegt

dieser Vorschrift, deren Anwendung die hygienische Unbedenklichkeit sicherstellen soll.

2.2.2 Kontaminationen von Fleisch und Fleischerzeugnissen mit Listeria spp.

Ein nicht unerheblicher Anteil von frischem Fleisch (19 % bis 100 %) und Fleisch-

erzeugnissen ist mit Listeria monocytogenes und Listeria innocua kontaminiert. In Hack-

fleischprodukten und Produkten, die vor dem Verzehr gegart werden müssen, rangierte die

Häufigkeit der Listerien nach JOHNSON et al. (1990) zwischen 8 % und 92 %.

Schrifttum

21

Gelegentlich werden L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi, L. murrayi und L. ivanovii als

Kontaminanten in Fleisch nachgewiesen. Mischkulturen aus L. monocytogenes und anderen

Listeria spp., insbesondere mit L. innocua, kommen regelmäßig vor (BREUER u. PRÄNDL

1988; BUNČIĆ 1991; COMI et al. 1992; NICOLAS et al. 1989; OZARI u. STOLLE 1990;

RYSER et al. 1996; SCHMIDT et al. 1988; SKOVGARD u. MORGEN 1988; SKOVGARD

u. N∅ RRUNG 1989; TENGEL et al. 2001). Der Nachweis von Listeria spp. ist auch als

Indikator für das Vorhandensein von Listeria monocytogenes anzusehen. Keimgehalte reichen

von über 0 bis 2000 KbE L. monocytogenes pro Gramm (Tab. 2).

Tab. 2: Konzentrationen von L. monocytogenes (L. m.) oder Listeria spp. in Fleisch.

Art der Proben Range KbE g-1 Anteil positiver Proben Referenz

gemischtesHackfleisch (je 50 %Rind und Schwein)

> 0 - ≤ 1,1> 1,1 - ≤ 12> 12 - ≤ 110Listeria spp.

13 %17 %23 %

BREUER u. PRÄNDL(1988)

Hackfleisch(Schwein)

< 10 L. m. 8 (50%) SCHMIDTet al. (1988)

Hackfleisch (Rind)

Schweinefleisch

< 100 L. m.

< 100 L. m.

91,6 %

92,6 %

COMIet al. (1992)

Hackfleisch(Schwein)

< 0,30,3 - < 1,11,1 - < 1010 - < 100 L. m.

28,6 %14,3 %28,6 %28,6 %

INOUEet al. (2000)

Die L. monocytogenes-Serotypen 1/2a, 1/2b, 1/2c und 4b wurden am häufigsten isoliert,

seltener wurden die Serotypen 3c, 4c und 4e gefunden (COMI et al. 1992; CORDANO u.

ROCOURT 2001; FANTELLI u. STEPHAN 2001; INOUE et al. 2000; NICOLAS et al.

1989 ; NOACK u. JÖCKEL 1993; OZARI u. STOLLE 1990; SCHMIDT et al. 1988; WANG

et al. 1990).

Mit dem Grad der Bearbeitung nimmt die Häufigkeit von Listeria spp. zu (BREUER u.

PRÄNDL 1988; JOHNSON et al. 1990; NOACK u. JÖCKEL 1993; OZARI u. STOLLE

1990; SKOVGARD u. N∅ RRUNG 1989; VAN DEN ELZEN u. SNIJDERS 1993). Auf den

Oberflächen von Schlachttierkörpern von Schweinen und Rindern wurde L. monocytogenes in

2 % und 22 % der Fälle bzw. Listeria spp. in 10 % und 54 % der Fälle nachgewiesen

(KORSAK et al. 1998).

Schrifttum

22

Die Inzidenz in Muskulatur und Milz von Schlachttieren war hingegen mit unter 1 % gering

(AMTSBERG et al. 1969). Im Zerlegeraum wurde eine mindestens siebenfache Konzen-

trierung gegenüber der reinen Seite der Schweineschlachtlinie festgestellt (VAN DEN

ELZEN u. SNIJDERS 1993). In Feldproben von Fleisch und Fleischerzeugnissen wurden

Mischkulturen aus unterschiedlichen Spezies und / oder Stämmen einer Spezies festgestellt

(RYSER et al. 1996).

Als Kontaminationsquellen sind dabei vor allem die Fäzes der Schlachttiere und das Personal

anzusehen (WEISS u. AMTSBERG 1995). Lokalisationen, an denen Sekundärkontaminatio-

nen auftreten, müssen an jedem einzelnen Punkt der Herstellung vermutet werden und ent-

stehen vermutlich über den Kontakt des Fleisches mit Schneidebrettern, Messern, anderen

Oberflächen und über den Kontakt mit Menschen (JOHNSON et al. 1990).

Tab. 3: Inzidenz von L. monocytogenes sowie Listeria spp. bzw. L. innocua in Fleisch undFleischerzeugnissen.

Probe Anteil der Probenmit positivem Nachweis von

L. mono Listeria spp. L. innocua

Referenz

rohes Fleisch (Schwein)Hackfleisch (Rind)Wurstwaren

15,9 %9,5 %14,3 %

19,0 %43,2 %43,9 %

(ja) COMIet al. (1992)

rohes Fleisch (Schwein) 35,7 % 60,0 %nicht L. m

k. A. WANGet al. (1992)

rohes Fleisch, stückigrohes Fleisch, zerkleinert(v. a. Hack- undSchabefleisch)

8,6 %23,6 %

32,9 %29,8 %

k. A. NOACK u.JÖCKEL (1993)

Hackfleisch (Rind)Wurst (Schwein)Hackfleisch (Pute)Geflügelfleisch

40 %*100 %*40 %*60 %*

89 %96 %76 %75 %

60 %*40 %*

100 %*80 %*

RYSERet al. (1996)

Hackfleisch (Schwein) 13,5 % k. A. k. A. HILDEBRAND etal. (2001)

Hackfleisch (Schwein)gemischtes Hackfleisch(50 % Schwein, 50 %Rind)

20,6 %25,0 %

k. A. k. A. INOUEet al. (2000)

400 Hackfleischproben(Schwein bzw. Rind)

10,8 % 17,5 % k. A. FANTELLI u.STEPHAN (2001)

* von 15 Listeria spp.-positiven Proben

Schrifttum

23

2.3 Methoden zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln

2.3.1 Kulturelle Nachweismethoden

Ältere Studien demonstrierten das Auftreten von falsch-negativen Ergebnissen nach Durch-

führung verschiedener kultureller Nachweis- und Referenzmethoden (HEISICK et al. 1989;

KING et al. 1989; NIEDERHAUSER et al. 1992; RYSER et al. 1996; WALKER et al. 1990).

HAYES et al. ermittelten 1992, dass in 25 % aller L. monocytogenes-positiven Lebensmittel

der Zoonoseerreger kulturell nicht nachweisbar war. Falsch-negative Resultate gängiger

mikrobiologischer Referenzmethoden, die noch immer als golden standard für den Nachweis

von Listeria monocytogenes herangezogen werden, hatten zur Ursache, dass entweder die

L. monocytogenes-Kontamination aus einer sehr geringen Anzahl Bakterien bestand oder die

Zielkeime sich nicht homogen über die Untersuchungsmatrix verteilten.

Die Identifikation von L. monocytogenes gelang generell häufiger, sobald die Lebensmittel-

proben in mehr als einem Anreicherungsmedium angereichert wurden (SCHMIDT et al.

1988; HAYES et al. 1992; RYSER et al. 1996; SCOTTER et al. 2001).

2.3.1.1 Erfahrungen mit den Medien der Amtlichen Methode nach § 35 LMBG

(DIN EN ISO-Methode 11290-1 von 1996 – qualitativer Nachweis)

Studien mit dem Referenzverfahren DIN EN ISO-Methode 11290-1 (1996) belegten, dass

L. monocytogenes-positive aber auch L. innocua-positive Proben mit dem kulturellen

Verfahren nicht in jedem Fall identifizierbar sind (Tab. 4).

Die Arbeitsgruppe nach § 35 LMBG „Molekularbiologische Methoden – Mikrobiologie“ des

damaligen BgVV (ANON. 2002) stellte zwei kritische Punkte in der praktischen Durch-

führung heraus:

Erstens waren Proben, die auch L. innocua enthielten, anfällig für falsche Diagnosen. Dafür

wurden sowohl das kompetitive Wachstum als auch fehlerhafte Interpretation von L. innocua

als L. monocytogenes verantwortlich gemacht. Zweitens konnte L. monocytogenes aus LM

mit viel Begleitflora nicht isoliert werden.

Schrifttum

24

Tab. 4: Leistungsfähigkeit des kulturellen Referenzverfahrens nach § 35 LMBG (DIN ENISO 11290-1 (1996).

Spezifität Sensitivität Referenz

100 % 93,6 % BECKER et al. (1998)

97,4 % 85,6 % SCOTTER et al. (2001)

95,0 % 88,3 % ANON. (2002)

Erfahrungen mit den selektiven Anreicherungsmedien und Nährböden gemäß DIN EN ISO

11290-1 von 1996 (§ 35 LMBG) wurden seit deren Entwicklung gegen Ende der 1980er Jahre

gewonnen.

FRASER und SPERBER (1988) entwickelten die Fraser-Bouillon (Fraser) mit der Ziel-

setzung, die präsumtive Anwesenheit von Listerien in Proben anhand des Anreicherungsme-

diums ablesen zu können. Alle Listeria spp. hydrolysieren Äskulin. In Fraser reagieren Eisen-

ionen mit den Produkten der Äskulinhydrolyse zu stabilen Komplexen, erkennbar an einem

schwarzen Präzipitat. Nach dem Bebrüten wurden Anreicherungskulturen, die sich schwärz-

ten, als listerienverdächtig bezeichnet. Die Schwärzung vollzog sich besser bei 35°C als bei

30°C und war nach 24 h komplett abgeschlossen.

In anderen Versuchen trat die Schwarzfärbung erst nach 48 h bei allen Proben ein (WALKER

et al. 1990). Schließlich färbten sich auch Anreicherungskulturen, die keine Listerien enthiel-

ten, schwarz (WALKER et al. 1990).

Das selektive Agens Akriflavin beeinträchtigt das Wachstum von Listeria monocytogenes

nicht aber von Listeria innocua, wodurch letzterer insbesondere in Fraser (höher konzentriert

als Halbfraser) einen Selektionsvorteil hat (BEUMER u. HAZELEGER 2003).

Auf dem nach DIN EN ISO 11290 vorgeschriebenen Oxford-Agar (CURTIS et al. 1989)

bilden sich i. d. R. nach 24 h Inkubation präsumtive Listerienkolonien, die makroskopisch zu

erkennen sind – zum einen an der Färbung, zum anderen an den schwarzen Höfen, die sich

aufgrund der Reaktion zwischen Produkt der Äskulinhydrolyse und Eisen-Ammonium-Citrat

bilden. Nach 48 h weisen typische Kolonien eingesunkene Zentren auf. Die Produktivität von

L. monocytogenes als auch L. innocua erschien annähernd gleich zu sein.

Bei erheblichem Wachstum der Begleitflora wurde die Isolation von Listeria spp. teilweise

unmöglich (BUNČIĆ 1991; KORSAK et al. 1998).

Schrifttum

25

Der zweite feste Nährboden, den die DIN EN ISO 11290 vorschreibt, ist der PALCAM-Agar

(VAN NETTEN et al. 1989). Auch im PALCAM-Agar sind Äskulin und Eisen enthalten, so

dass nach 24 h Inkubation ca. 1 mm große, graugrüne Kolonien entstehen, die regelmäßig

nach 48 h in den Zentren eingesunken und von schwarzen Höfen umgeben sind.

SCOTTER et al. (2001) demonstrierten eine höhere Sensitivität des PALCAM-Agars, die

allerdings nicht signifikant war. In Fleischerzeugnissen wurde mit Oxford-Agar, PALCAM-

Agar und LPM je eine vergleichbare Anzahl positiver Nachweise ermittelt (CORDANO u.

ROCOURT 2001). Weitere Studien bestätigen PALCAM gegenüber Oxford als sensitiveren

und selektiveren Nährboden für die Isolation von Listerien (JOHANSSON 1998; WANG et

al. 1992). Bei Untersuchungen von Fleisch bzw. Fleischerzeugnissen verhinderte PALCAM-

Agar das Wachstum der Begleitflora effektiver als Oxford-Agar (WANG et al. 1992;

GUNASINGHE et al. 1994).

Die Ergebnisse verdeutlichen die Abhängigkeit der tatsächlichen Sensitivität der festen

selektiven Nährmedien von der Art der untersuchten Lebensmittelprobe. In vergleichenden

Studien konnte kein Nährbodentyp in jedem Fall Listerien aus den Proben isolieren. Die

Verwendung zweier Nährmedientypen zur Differenzierung wurde als positiv bewertet,

wenn nicht gar als notwendig angesehen (BRUNNER u. BÜLTE 2001; CORDANO u.

ROCOURT 2001; JINNEMAN et al. 2003; SCHMIDT et al. 1988).

Lebensmittel enthalten häufig Mischkontaminationen, in denen L. innocua aufgrund einer

kürzeren Generationszeit den eigentlichen Zielkeim in der Anreicherungskultur überwachsen

kann, was dann zu falsch-negativen Ergebnisse führt (BECKER et al. 1998; BRUNNER u.

BÜLTE 2001; CURIALE u. LEWUS 1994; JOHANSSON 1998). In Abwesenheit von

Listeria innocua wurde Listeria monocytogenes immer nachgewiesen. Je größer ein gegebe-

nes Verhältnis von Listeria monocytogenes zu Listeria innocua ist, desto wahrscheinlicher ist

der Nachweis des Erregers (CURIALE u. LEWUS 1994). Obwohl das Verhältnis 1:2 betrug,

wurden nur 5,4 % der Erreger-enthaltenden Proben als solche identifiziert. Damit wird die

entscheidende Bedeutung des Verhältnisses von L. monocytogenes zu L. innocua deutlich.

Die bevorzugte Wiederfindung von Innocua ist vereinbar mit den Unterschieden in der

Wachstumsrate.

Schrifttum

26

Falsch-negative Ergebnisse konnten dadurch erklärt werden, dass v. a. L. innocua aufgrund

einer schnelleren Generationszeit L. monocytogenes überwuchs und interferierte bzw. dass die

Medien nicht das Potential hatten, zwischen L. monocytogenes und L. innocua zu unterschei-

den (JOHANSSON 1998). Daraus folgt, dass der Nachweis von nicht-pathogenen Listerien in

Lebensmitteln nicht die Möglichkeit ausschließt, dass L. monocytogenes enthalten sein

könnte, jedoch nicht isoliert wurde. Bei JOHANSSON (1998) belief sich die Übereinstim-

mung bezüglich positiver Proben, die mit unterschiedlicher Sensitivität mittels verschiedener

Nährböden erkannt wurden, auf 77 % (Übereinstimmung für alle Proben und alle Nährböden).

Es wurde vorgeschlagen, neue Differenzierungsnährböden in das Protokoll der ISO 11290-

1 zu integrieren, damit die Identifizierung von L. monocytogenes in zusätzlichen positiven

Proben ermöglicht wird, die evtl. nicht mit der bisherigen Vorgehensweise erkannt würden

(BEUMER u. HAZELEGER 2003). Die Häufigkeiten von L. monocytogenes in Lebens-

mitteln würden dann mit großer Wahrscheinlichkeit höhere Werte erreichen.

Arbeiten liegen vor zum Rapid’ L. mono-Agar (BECKER u. MURPHY 2001; POLIVKA

2001; GRACIEUX et al. 2002), zum Agar Listeria nach Ottaviani und Agosti (ALOA)

(VLAEMYNCK et al. 2000; BAUWENS et al. 2003; BÜLTE et al. 2003; GRACIEUX et al.

2003), zum BCM L. monocytogenes-Agar (BCM-Agar) (JINNEMAN et al. 2003) und zum

Listeria monocytogenes-Blutagar (LMBA) (JOHANSSON 1998; BRUNNER u. BÜLTE

2001).

Schrifttum

27

2.3.2 Immunologische Methoden

2.3.2.1 Allgemeines

Als immunologische Methoden werden alle Analyseverfahren bezeichnet, die auf der

Immunoreaktion zwischen Antigen und Antikörper unter Bildung eines Antigen-Antikörper-

Komplexes basieren. Die Immunoreaktion verläuft nach dem Massenwirkungsgesetz

(OELLERICH 1983, S. 239f; NELSON u. COX 2001, S. 242 f).

Markersubstanzen für die Reagenzien eines Immunoassays können radioaktive Isotope oder

Enzyme, Hemmstoffe von Enzymen, fluorogene Substrate, Fluoreszenzfarbstoffe und

metallische Atome sein (OELLERICH 1983, S. 236 – 237, S. 233).

Antigen-Antikörper-Reaktionen mit enzymmarkierten Reagenzien (Enzymimmunoassay,

EIA, und Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) verfügen im Vergleich zu anderen

immunologischen Methoden über eine um 2 bis 3 Zehnerpotenzen gesteigerte Nachweis-

empfindlichkeit (BAUMGART et al. 1997, III.4, S. 2).

Für den Nachweis von Antigenen in der Lebensmitteldiagnostik kommt hauptsächlich der

ELISA zum Einsatz. Verwendete Systeme sind der Sandwich-ELISA (nicht-kompetitiver

ELISA) und der kompetitive ELISA, die sich in ihrem Testprinzip unterscheiden

(BAUMGART et al. 1997, III, S. 2 – 4; GOTTSTEIN 1991).

2.3.2.2 Immunologische Verfahren zum Nachweis von Listeria (monocytogenes)

Innerhalb der Gattung Listeria gibt es eine beträchtliche Anzahl gemeinsamer Antigene

(SEELIGER u. JONES 1986), weshalb Listeria monocytogenes nicht auf Basis konventio-

neller serologischer Reaktionen identifiziert werden kann.

Polyklonale Antikörper gegen Listeria spp. erwiesen sich als nicht gattungsspezifisch (GRAY

u. KILLINGER 1966). Um L. monocytogenes z. B. in LM nachzuweisen, wurden auf

monoklonalen Antikörpern (mAK) basierende Enzymimmunoassays entwickelt (FARBER u.

SPEIRS 1987; FARBER et al. 1988; McLAUCHLIN et al. 1988; McLAUCHLIN u. PINI

1989). Diese mAK richteten sich gegen Proteine (BUTMAN et al. 1988), Zell-

oberflächenproteine (FARBER u. SPEIRS 1987; BHUNIA et al. 1991), Stoffwechselprodukte

und Virulenzfaktoren wie Listeriolysin O (NATO et al. 1991).

Schrifttum

28

Listeriolysin O zeigte strukturell strenge Homologien zu Cytolysinen von Streptococcus

pyogenes und von Streptococcus pneumoniae (KEHOE et al. 1987; MENGAUD et al. 1987,

1988), die sich immer wieder in Kreuzreaktionen niederschlugen (NATO et al. 1991).

Frühe mAK reagierten entweder gattungsspezifisch mit Listerien (BUTMAN et al. 1988;

FARBER u. SPEIRS 1987; MATTINGLY et al. 1988; McLAUCHLIN et al. 1988) oder mit

L. monocytogenes, wobei Kreuzreaktionen mit L. welshimeri und / oder L. innocua

(SIRAGUSA u. JOHNSON 1990; BHUNIA et al. 1991) auftraten.

Der Schwerpunkt der Entwicklung von Listeria spp.-spezifischen Antikörpern verlagerte sich

auf das Protein p60 (s. Tab. 5).

Für einen indirekten Fluoreszenz-Immunoassay wurden polyklonale Antikörper (pAK)

hergestellt, die sich gegen ein extrazelluläres 60 kDA Protein (p60; Tab. 5) von L. mono-

cytogenes richteten. Das Anti-p60-Antiserum reagierte mit verschiedenen Listerien-Stämmen

(RUHLAND et al. 1993). Alle Spezies der Gattung Listeria sekretieren p60 als extrazelluläres

Protein (BUBERT et al. 1992a), wobei das p60 von Listeria monocytogenes charakteristische

Unterschiede in der Aminosäuren-Sequenz gegenüber anderen Listerien-Arten aufweist.

Bei invasiven Stämmen ist die Aktivität der Sekretion sehr hoch (KUHN u. GOEBEL 1989;

BUBERT et al. 1992b). Das p60 kommt an der Zelloberfläche gleichmäßig verteilt vor

(RUHLAND et al. 1993).

Aufgrund dieser Charakteristika ist das p60 prädestiniert, in der Lebensmitteldiagnostik als

Ziel-Antigen für Listeria monocytogenes zu fungieren.

Tab. 5: Charakterisierung des Antigens p60 (sowie des p60-kodierenden Gens iap).

Eigenschaften Referenz

Protein in Überständen von Anreicherungskulturen jede Listeria-Spezies besitzt spezifisches Molekulargewicht

KUHN u. GOEBEL 1989

Mureinhydrolase: essentiell für die Vermehrungsfähigkeit der Zelle WUENSCHER et al. 1993

thermoregulierte Genexpression RUHLAND et al. 1993

kodiert durch das iap-Gen („invasion associated protein“) KÖHLER et al. 1990

interne iap-Sequenzen für die spezies-spezifische Differenzierung von Listeria monocytogenes oder von Listeria innocua geeignet

BUBERT et al. 1992a, 1992b, 1999; FURRER et al. 1991; NIEDERHAUSER et al. 1992

Schrifttum

29

Mit g a n z e n Zellen von L. monocytogenes reagierte das Anti-p60-Antiserum in jedem Fall

und unabhängig von der Wachstumsphase der Kultur und von der Inkubationstemperatur

(RUHLAND et al. 1993). In Ü b e r s t ä n d e n von Kulturen, die sich in einer frühen oder

mittleren Wachstumsphase befanden, war das p60 hingegen n i c h t nachweisbar.

Inkubationstemperaturen von 37°C begünstigten die Antigen-Antikörper-Reaktion: bei

geringeren Temperaturen (26°C) war eine weniger intensive Reaktion zu beobachten. Bei

apathogenen L. monocytogenes-Stämmen stagnierte die Sekretion des p60, nicht aber die

Genexpression des p60 als Zelloberflächenantigen.

Antiserum gegen ein synthetisches Peptid reagierte mit p60 aller L. monocytogenes-

Serotypen, ohne mit anderen Listeria spp. kreuzzureagieren (BUBERT et al. 1994). Die pAK

reagierten im ELISA mit sekretiertem p60, was anzeigte, dass zusätzlich zur denaturierten

Form des p60 auch das native Antigen erkannt wurde. Zusätzlich wurde das Vorhandensein

von p60 in Listeria monocytogenes-Feldstämmen nachgewiesen.

2.3.2.3 Anwendung Listeria spp.-spezifischer Enzymimmunoassays

Allgemeine Mängel der kulturellen wie auch immunologischen Nachweissysteme offenbarten

sich ebenso wie die Inkompatibilität von Bestandteilen des Analysensystems wie

Anreicherung und Differenzierung (FELDSINE et al. 1997).

Die Sensitivität eines immunologischen Testsystems scheint von der Art des untersuchten

Lebensmittels wie auch von der für ein LM typischen bakteriellen Flora abhängig zu sein

(BEUMER u. BRINKMAN 1989; HEISICK et al. 1989; BARBUTI et al. 1995), und die

Notwendigkeit, Inkubationszeiten an die Nachweismethoden anzupassen, wurde deutlich. Die

Nachweisbarkeit scheint sowohl von der initialen Listerienanzahl als auch von der Vitalität

der Zielkeime und von der Konzentration der lebensmitteltypischen Mikroflora abzuhängen

(HEISICK et al. 1989). Diese Tatsache erlaubt den Schluß, dass bei einem Methodenvergleich

zwischen einem neuen Test und einer Standardmethode die ermittelte Leistungsfähigkeit

eines Tests von Sensitivität und Selektivität der verwendeten Medien abhängig ist. Dieser

Zusammenhang wird durch die Aussagen einer Studie bekräftigt, bei der kulturelle Ergebnisse

getrennt nach Typ des Nährbodens dokumentiert wurden (CAPITA et al. 2001). Sensitivitäts-

und Spezifitätsgrade sowie die Übereinstimmungsgrade zwischen der kulturellen Methode

und Immunoassay wurden nachfolgend in Abhängigkeit vom Agartyp ermittelt.

Schrifttum

30

Ein Ansatz, den Anteil (falsch-)positiver Diagnosen eines getesteten immunologischen

Systems gegenüber der kulturellen Methode zu verringern, war es, jede Probe, sobald sie als

Listeria-positiv identifiziert war, als (richtig-)positiv anzusehen (HEISICK et al. 1989;

BECKER et al. 1998).

Zur Verkürzung des Untersuchungszeitraums wurden Methoden erprobt, den Zielkeim aus

dem LM zu konzentrieren und zu extrahieren. Die Konzentrierungsmethoden wurden

teilweise mit einem, selektiven oder nicht-selektiven, Anreicherungsschritt kombiniert

(SHERIDAN et al. 1991, 1997; CLOAK et al. 1999).

Verschiedene Kombinationen aus mehreren Anreicherungsmedien wurden durchführt, um die

vergleichsweise erfolgversprechendste zu ermitteln (ROBERTS 1994). Kombinationen mit

Halbfraser-Bouillon stellten sich als die effektivsten heraus. Bei 30°C wurden noch Antigene

(Flagellen) ausgebildet, während die Wachstumsrate der Keime suboptimal war.

Die Nachweisgrenze eines Sandwich-ELISA lag bei über 106 KbE pro ml (KERR et al. 1990).

Die Resultate ließen vermuten, dass der ELISA in Proben mit geringen Konzentrationen von

Listerien falsch-negative Ergebnisse erzielte; nach Reinkubation über 24 Stunden lieferte der

Test positive Listerien-Nachweise.

Vergleichende Untersuchungen mit immunologischen Testsystemen (z. T. automatisiert wie

EiaFoss oder VIDAS LIS, Vitek Immunodiagnostic Assay System) und herkömmlichen

Methoden wurden durchgeführt (HEISICK et al. 1989; WALKER et al. 1990; ROBERTS

1994; FELDSINE et al. 1997; KERDAHI u. ISTAFANOS 1997; PETERSEN u. MADSEN

2000).

Nachdem früher mit Hilfe der entwickelten Enzymimmunoassays und Koloniematerial der

Nachweis von Listerien in LM geführt wurde (FARBER u. SPEIRS 1987; McLAUCHLIN u.

PINI 1989), gelangen immunologische Systeme heute typischerweise nach selektiven

Anreicherungsschritten zur Anwendung (MATTINGLY et al. 1988; S∅ LVE et al. 2000; s.

auch Tab. 6).

Die Tabellen 6 und 7 enthalten Ergebnisse verschiedener Studien, die Untersuchungen von

dotiertem Fleisch bzw. Feldproben mit Hilfe von genus-spezifischen immunologischen Test-

systemen durchführten.

Schrifttum

31

Tab. 6: Nachweisgrenzen verschiedener Listeria spp.-spezifischer immunologischer Nach-weissysteme nach Untersuchungen von dotiertem Fleisch.

Ref

eren

z

BE

UM

ER

u.

BR

INK

MA

N

(198

9)

BE

UM

ER

u.

BR

INK

MA

N

(198

9)

SH

ER

IDA

N e

t al.

(199

1)

UY

TT

EN

DA

EL

E

et a

l. (1

995)

CL

OA

K e

t al.

(199

9)

Nac

hwei

s-gr

enze

107

Lis

teri

en/m

l

(neg

ativ

er

Nac

hwei

s)

ca.

105 K

bE/g

(pos

itiv

er

Nac

hwei

s)

103

- 4

KbE

/g

Anr

eich

erun

g

- Ja (

sele

ktiv

) P

A/S

A

- Ja (

sele

ktiv

) P

A/S

A

Ja

(nic

ht-

sele

ktiv

)

Imm

unol

ogis

ches

Sy

stem

Lis

teri

a-T

ek E

LIS

A

Lis

teri

a-T

ek E

LIS

A

Indi

rekt

er I

mm

uno-

fluo

resz

enzt

est

(Bew

ertu

ng in

Kom

-bi

nati

on m

it H

ämol

yse-

Rea

ktio

n)

Lis

teri

a-T

ek E

LIS

A

SA

IF (

surf

ace

adhe

sion

im

mun

oflu

ores

cent

te

chni

que)

Ant

ikör

per

mA

K

mA

K

mA

K

CL

2

mA

K

CL

2

Dot

iert

: [K

bE]

103 , 1

05 un

d 1

07 L

iste

rien

/ m

l

10 –

100

/ 25

g

ca. 1

02 -10

7 /g

1, 1

0 un

d 10

0 K

bE/

25 g

100

K

bE/g

Prob

enm

ater

ial

u. a

. Hac

kfle

isch

(o

. A. d

er T

iera

rt)

u. a

. Hac

kfle

isch

(o

. A. d

er T

iera

rt)

Rin

dfle

isch

(H

omog

enat

)

gem

isch

tes

Hac

kfle

isch

Hac

kfle

isch

vom

R

ind

Schrifttum

32

Tab. 7: Sensitivität und Spezifität verschiedener Listeria spp.-spezifischer immunologischer Nachweissysteme nach Untersuchungen von Feldproben.

Ref

eren

z

SH

ER

IDA

N

et a

l. (1

991)

CL

OA

K

et a

l. (1

999)

BE

UM

ER

et

al.

(199

6)

RO

BE

RT

S

et a

l. (1

994)

Übereinstimmung Immunologisches System & Kultur 62

,5 %

96,7

%

82,6

%

99,9

%

Spezifität (Immunologisches System) 10

0 %

100

%

100

%

100

%

Sensitivität (Immunologisches System) 25

%

91,3

%

79,2

%

98 %

Immunologisches System –, Kultur + 3 2 5 1

Immunologisches System +, Kultur – 0 0 0 0

Immunologisches System & Kultur – 4 37

19

945

Immunologisches System & Kultur + 1 21

19 49

Feld

prob

en

Rin

dfle

isch

(n

= 8

)

Gef

lüge

l und

R

inde

rhac

kfle

isch

(n

= 6

0)

Flei

sche

rzeu

gnis

se

(n =

46)

dive

rse

LM

(n

= 9

95; d

avon

155

Fl

eisc

hpro

ben)

Vergleich mit Kultur ja

ja ja ja

Imm

unol

ogis

ches

Sy

stem

Indi

rekt

er

Imm

uno-

fluo

resz

enzt

est

SA

IF (

surf

ace

adhe

sion

im

mun

oflu

ores

cent

te

chni

que)

Lis

teri

a R

apid

Tes

t C

lear

view

L

iste

ria

Rap

id T

est

Cle

arvi

ew

Schrifttum

33

2.3.2.4 Anwendung Listeria monocytogenes-spezifischer Enzymimmunoassays

Der Transia plate Listeria monocytogenes-ELISA (Zielantigen p60) wurde auf künstlich

kontaminierte Hackfleisch- und Brühwurstproben (rohe und hitzebehandelte Fleisch-

erzeugnisse) sowie auf Feldproben von rohen Lebensmitteln angewendet, die nach

zwei Anreicherungsschritten untersucht wurden (KLEINER u. SCHINKEL 2002). Die

Ergebnisse (s. Tab. 8) wurden mit den kulturellen Nachweisergebnissen gemäß § 35 LMBG

in Beziehung gesetzt. Dieses ELISA-System bewies dieselbe Sensitivität wie die amtliche

Methode nach § 35 LMBG, wobei die Nachweisrate in deutlicher Abhängigkeit zur

anfänglichen Kontaminationsrate zu sehen war. Innerhalb von 2 Tagen lag der Anwesenheits-

bzw. Abwesenheitsnachweis von L. monocytogenes vor. Weil mit dem Überstand einer

Listerien-Anreicherung gearbeitet wird, sind weniger Komponenten der Lebensmittelprobe in

dem zu untersuchenden Aliquot (0,1 ml) vorhanden. Ein negativer Einfluß auf die

Nachweisgrenze des ELISA-Systems wird dadurch unwahrscheinlicher. Der p60-Nachweis

wird anhand von denaturierten Zellen geführt, was für das Laborpersonal den Vorteil bietet,

im geringeren Umfang mit infektiösem Material arbeiten zu müssen.

Eine vergleichende Studie unternahmen KERDAHI und ISTAFANOS (2000). Sie unter-

suchten künstlich kontaminierte Lebensmittel mit dem VIDAS LMO (Vitek Immuno

Diagnostic Assay System Listeria monocytogenes) (s. Tab. 8).

In Abhängigkeit vom Inokulationsniveau wurden 100 % und 89 % der positiven Proben

bestätigt. Die positive Bestätigung gelang mit einer DNA-Gensonde bei 96 % und 87 % der-

selben Proben. Der VIDAS LMO kombiniert mit der DNA-Gensonde erwies sich in einem

Vergleich mit dem kulturellen Nachweis als sehr spezifisches System, das nach Anreicherung

zwischen L. monocytogenes und anderen Listeria spp. unterscheiden kann.

Tab. 8: Nachweisgrenzen verschiedener L. monocytogenes-spezifischer immunologischer Nachweissysteme nach Untersuchungen von dotierten Lebensmitteln.

Probenmaterial Dotiert: Immunologisches System

Nachweisgrenze Referenz

Gemüse, Räucherlachs

1 – 10 und 10 – 100 KbE/25 g

VIDAS LMO 1 – 10 bis 10 – 100 KbE/25 g

KERDAHI u. ISTAFANOS (2000)

Hackfleisch, Brühwurst

1 und 10 KbE/10 g

Transia plate Listeria monocytogenes-ELISA

1 KbE/10 g

KLEINER u. SCHINKEL (2002)

Schrifttum

34

BECKER et al. (1998) führten auch Untersuchungen mit den ELISA-Testkits von Merck

(Pathalert Listeria monocytogenes) und bioMerieux (VIDAS LMO) durch.

Die untersuchten Proben und prinzipiell die Vorgehensweise waren dieselben wie bei dem

gattungs-spezifischen Nachweis (2.3.2.3). Die Testsysteme zeigten eine Anfälligkeit für

falsch-negative Ergebnisse. Sie erwiesen sich aber als geeignet, in einer Mischkultur aus

L. monocytogenes und L. innocua den Erreger nachzuweisen. In einer anderen Probe

korrespondierten die immunologischen Tests bezüglich des positiven Ergebnisses, obwohl aus

keiner Anreicherung kulturell L. monocytogenes isoliert wurde. Allerdings wurde kulturell

mehrfach L. innocua differenziert.

Prinzipiell ist der Nachweis nur schwach hämolytischer Monocytogenes-Stämme möglich,

wie anhand des Pathalert Listeria monocytogenes gezeigt wurde (FRIEDRICH u.

SCHUBERT 1995).

Mittlerweile stehen mAK zur Verfügung, die ausschließlich l e b e n d e Listerien – auch

L. monocytogenes-spezifisch – detektieren (TORENSMA et al. 1993; KATHARIOU et al.

1994). Diese mAK könnten bei immunologischen Separationen nützlich sein, die im Vorfeld

einer PCR durchgeführt werden könnten (S∅ LVE et al. 2000). Dadurch könnten falsch-

positive PCR-Ergebnisse ausgeschlossen bzw. könnten Anreicherungszeiten reduziert

werden.

Schrifttum

35

2.3.3 Molekularbiologische Methoden

Bei den molekularbiologischen Methoden gibt es zum einen die Möglichkeit der direkten

DNA-Hybridisierung mit molekularen Gensonden. Zum anderen ist im Rahmen der

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nach der Vervielfältigung (Amplifikation) von DNA-

Abschnitten die Darstellung spezifischer PCR-Produkte (Amplifikate) möglich. Eine Anzahl

von Gensonden (Segmente einzelsträngiger Nukleinsäuren) wurden für den Nachweis von

L. monocytogenes konstruiert und radioisotopisch (KLINGER et al. 1988), enzymatisch

(KING et al. 1989) oder chemolumineszent (BOBBITT u. BETTS 1992; NINET et al. 1992;

BECKER u. MURPHY 2001) markiert. Die Sonden basierten entweder auf dem Listeriolyin

O-(β-Hämolysin-) Gen (CHENEVERT et al. 1989; DATTA et al. 1987, 1988a, 1988b, 1990;

KIM et al. 1991) oder auf einer 16s rRNA-Sequenz (KLINGER et al. 1988; KING et al. 1989;

BOBBIT u. BETTS 1992; NINET et al. 1992; BECKER u. MURPHY 2001).

NASBA®, eine alternative, isothermal ablaufende Amplifikationstechnik, wurde ebenfalls

erprobt (UYTTENDAELE et al. 1995). Die Amplifikationsprodukte wurden per Agarosegel-

Elektrophorese oder Enzyme Linked Gel Assay (ELGA) nachgewiesen. Die enzymmarkierte

ELGA-Sonde war spezifisch für 16s rRNA und hybridisierte mit den NASBA®-Produkten.

Nicht-hybidisierte ELGA-Sonden und Hybride wurden mittels vertikaler Polyamidgel-

Elektrophorese getrennt.

Die Nachweisgrenze betrug 2 x 106 KbE Listeria monocytogenes pro ml.

Die PCR ist ein Instrument für die exponentielle Vervielfältigung gesuchter Nukleotid-

sequenzen von Genombereichen, die z. B. für den spezifischen Nachweis von Listeria

monocytogenes geeignet sind. Die PCR steigert die Sensitivität des Nachweises, der

theoretisch mit einem einzigen Molekül der Ziel-DNA geführt werden kann (BEJ et al. 1990).

Die DNA-Sequenz erreicht nachweisbare Konzentrationen, die z. B. durch Agargel-

Elektrophorese oder DNA-Hybridisierung dargestellt werden können.

In Schritt 1 (Denaturierung der DNA-Doppelstränge) des ersten Amplifikationszyklus einer

PCR wird die DNA durch Erhitzen auf 95°C in ihre Einzelstränge überführt.

In Schritt 2 (Annealing) erfolgt eine Abkühlung auf ca. 55°C. Die Primer können mit den

3‘-Enden der komplementären Abschnitte der Einzelstränge hybridisieren.

Schrifttum

36

Für Schritt 3 (DNA-Synthese bzw. Elongation) wird die Temperatur auf die optimale

Reaktionstemperatur der hitzestabilen DNA-Polymerase (72°C) erhöht. Die DNA-Polymerase

kopiert von 3‘ nach 5‘ einen neuen komplementären Strang unter Verwendung der vier

Nukleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Der neue Strang ist einseitig begrenzt durch die

Sequenz des Primers und enthält die Sequenz, die komplementär zum zweiten Primer ist.

Im zweiten Zyklus dient der neu synthetisierte Strang neben dem ursprünglichen als Matrize.

Weil der Strang mit der Sequenz des ersten Primers endet, kommt es bei der DNA-Synthese

an dieser Stelle zum Kettenabbruch. Durch Wiederholung der Zyklen kommt es zu einer

exponentiellen Vervielfältigung des zwischen den beiden Primern gelegenen DNA-

Abschnittes (CANDRIAN et al. 1991).

2.3.3.1 PCR als integrales System

Die Definition integraler Systeme ist, dass alle Prozessschritte einer Analyse, bei der als

letzter Schritt eine PCR durchgeführt wird, aufeinander abgestimmt sind (KRISMER et al.

2002). Dabei sind die Prozessschritte (Probenaufbereitung, Anreicherung, Extraktion der

DNA) geprüft worden, ob sie für die PCR in einem speziellen Fall kompatibel sind.

Die dringende Notwendigkeit, integrale Systeme zu etablieren, ergibt sich sowohl aus der

Komplexität als auch aus der Verschiedenheit der Lebensmittelmatrizes hinsichtlich ihrer

mikrobiologischen und chemischen Bestandteile.

2.3.3.2 Anreicherung der Zielkeime im Vorfeld der PCR

Die Keimzahlen der Ziel-Organismen liegen nach Anreicherung mit höherer Wahrschein-

lichkeit oberhalb der Nachweisgrenze eines PCR-Systems (CANDRIAN et al. 1991). Vor der

Durchführung des eigentlichen Schnelltests erfolgen oft zweistufige Inkubationsschritte,

damit geringe Mengen von Pathogenen in Lebensmitteln höhere Zielkeim-Konzentrationen

erreichen, die genügen, um detektiert werden zu können.

Gegenstand heutiger Studien ist das Interesse, mit Hilfe von Schnellmethoden innerhalb eines

Tages zu einer Diagnose über die Präsenz von L. monocytogenes zu gelangen (DEVER et al.

1993).

Die PCR ist eine hochsensitive Methode (s. 2.3.3). Sie ist in der Lage, DNA von toten

respektive nicht vermehrungsfähigen Mikroorganismen nachzuweisen.

Schrifttum

37

Durch die Verdünnung mit einem Anreicherungsmedium reduziert sich das Risiko falsch-

positiver Ergebnisse durch nicht kultivierbare Mikroorganismen (CANDRIAN et al. 1991;

WERNARS et al. 1992; NIEDERHAUSER et al. 1992; SCHEU et al. 1998).

Verglichen mit der Nachweisgrenze für Reinkulturen oder reiner DNA liegt die Nachweis-

grenze für natürliche Proben oft deutlich höher (WERNARS et al. 1992; ROSSEN et al. 1991,

1992; DICKINSON et al. 1995). Das Erreichen einer höheren Zielkeim-Konzentration mit

Hilfe einer Anreicherung ist gerade bei der Diagnostik aus Lebensmittelmatrizes von Be-

deutung, weil bei der Durchführung der PCR technische Probleme durch Inhibitions-

phänomene auftreten können (ROSSEN et al. 1992). In einer Studie zum PCR-Nachweis von

Yersinia enterocolitica inhibierte ein Zusatz von Schweinefleischhomogenat die PCR-

Reaktion vollständig (LANTZ et al. 1998). Anreicherungsmedien (z. B. Fraser) können

inhibierend auf eine PCR-Reaktion wirken (ROSSEN et al. 1991, 1992). Die PCR toleriert

lediglich 0,0001 % der gebräuchlichen Eisen-Ammoniumcitrat-Konzentration, was einer 50-

fachen Verdünnung der Fraser-Bouillon entspricht (ROSSEN et al. 1992). PCR-Inhibitoren

werden durch eine Anreicherung vor der PCR-Amplifikation ebenfalls verdünnt.

Die Anreicherung von Lebensmittelproben vor der PCR-Analyse wurde in vielen Studien

angewendet (Tab. 10) und ist i. d. R. angezeigt.

Die direkte PCR (Verzicht auf Anreicherung) bietet die Möglichkeit, schwer kultivierbare

Mikroorganismen nachzuweisen oder Proben zu analysieren, die ohnehin mit einer hohen

Konzentration des Zielkeimes belastet sind (BECKER u. HOLZAPFEL 2002). Die direkte

PCR zum Nachweis von L. monocytogenes aus Lebensmitteln (z. B. WERNARS et al. 1992;

MAKINO et al. 1995; SIMON et al. 1996) wird als eine nicht praktikable Methode für die

Routine-Detektion angesehen. Gerade dem Nachweis dieses Erregers aus Fleisch sind enge

Grenzen gesetzt (ROSSEN et al. 1992; LANTZ et al. 1998; DICKINSON et al. 1995).

Nur geringe Volumina einer Anreicherungskultur resp. einer Lebensmittelprobe können je

PCR-Reaktion analysiert werden, was ein zusätzliches Problem bei der direkten Anwendung

einer PCR darstellt (CANDRIAN 1994).

Das limitierte Volumen der Aliquote in Verbindung mit einer nicht-homogenen Verteilung

der Zielkeime in der Lebensmittelmatrix kann zu falsch-negativen Resultaten in der Analyse

führen (z. B. GOLSTEYN THOMAS et al. 1991).

Schrifttum

38

Idealerweise wird während der Anreicherung das Wachstum einer Auswahl bestimmter

Keime unterstützt; und zwar am besten mehr als eine Spezies und / oder mehr als eine Art von

Interesse (CLOAK et al. 1999). BAILEY und COX (1992) beschrieben die Anwendung eines

simultanen Anreicherungsschrittes für Listeria und Salmonella in Lebensmitteln.

Ein simultaner Anreicherungsschritt wäre insofern vorzuziehen, als dass die Durchführung

billiger und weniger arbeitsintensiv wäre. Ein Nachteil ist die Selektivität einer einzigen

Anreicherungs-Bouillon für die verschiedenen Organismen und die Effektivität der Bouillon

bei der simultanen Isolation von gram-positiven und gram-negativen Mikroorganismen

(BEUMER u. HAZELEGER 2003).

Frische Anreicherungskulturen sollten bevorzugt eingesetzt werden, weil eine Lagerung zum

Abbau der DNA führen könnte (NIEDERHAUSER et al. 1992).

Zur Verkürzung der Nachweiszeit gibt es weitere Methoden, die die Konzentration und

Extraktion der Ziel-Spezies aus dem Lebensmittel ermöglichen (SCHEU et al. 1998).

2.3.3.3 Listeria monocytogenes-spezifische Zielsequenzen

Verschiedene Proteine wurden charakterisiert, die für die Pathogenität von L. monocytogenes

von Bedeutung sind. Dazu gehören das Listeriolysin O und die Zink-Metalloprotease.

Die Eigenschaften (letale Toxizität im Mausversuch, entzündungsauslösend) des Hämolysins,

als Listeriolysin O bezeichnet, führten zu der Annahme, dass es sich dabei um einen

wichtigen Pathogenitätsfaktor von L. monocytogenes handelt (GEOFFROY et al.1987). Es

wird kodiert durch das L. monocytogenes-spezifische hlyA-Gen (MENGAUD et al. 1988).

Das Listeriolysin O (Molekulargewicht 58 kDa), nicht zell-assoziiert, liegt in relativ großen

Mengen – verglichen mit sekretierten Mengen an Protein p60 – in den Überständen von

Anreicherungskulturen vor (KUHN u. GOEBEL 1989; RUHLAND et al. 1993). Es ist hämo-

lytisch aktiv und essentiell für die Virulenz bzw. das intrazelluläre Vorkommen von L. mono-

cytogenes (COSSART et al. 1989; PORTNOY et al. 1988). Die Serotypen 1/2b und 4b

verfügen über eine identisches Listeriolysin O (VINES u. SWAMINATHAN 1997). Trotz

zahlreicher Homologien mit anderen Cytolysinen in Sequenzen der Aminosäuren

(MENGAUD et al. 1987, 1988; KEHOE et al. 1987) besteht hinsichtlich der DNA-Sequenzen

keine substantielle Homologie (MENGAUD et al. 1988).

Schrifttum

39

Das hlyA-Gen steht im Mittelpunkt verschiedener PCR-Systeme (z. B. BESSESEN et al.

1990; BORDER et al. 1990; GOLSTEYN THOMAS et al. 1991; DENEER u. BOYCHUK

1991; FURRER et al. 1991; ROSSEN et al. 1991; FITTER et al. 1992; NIEDERHAUSER et

al. 1992; BASSLER et al. 1995).

Die Transkription von hlyA wird an die Milieubedingungen des Erregers angepasst und ist

dabei der Temperatur und der Wachstumsphase unterworfen: unter 30°C ist die Transkription

des hlyA-Gens gehemmt, bei 37°C hingegen beträgt die hämolytische Aktivität das 8- bis 16-

fache (LEIMEISTER-WÄCHTER et al. 1992). Die Transkription von hlyA zeigt zwei deut-

liche Peaks entlang der Wachstumskurve. Der erste Peak während des frühen exponentiellen

Wachstums erstreckt sich über einen kürzeren Zeitraum und ist schwächer ausgeprägt als der

zweite in der frühen stationären Phase (ab Stunde 10 der Inkubation) (MENGAUD et al.

1991b). Gegen Ende der exponentiellen Wachstumsphase und Beginn der stationären Phase

besteht in Überständen von Anreicherungskulturen eine maximale hämolytische Aktivität

(GEOFFROY et al. 1989). Bei GEOFFROY et al. (1989) erreichte die hämolytische Aktivität

ihren Höhepunkt nach 8 bis 10 h Inkubation, um danach sofort stark abzufallen. Nach 48 h

war das Listeriolysin O nicht mehr nachweisbar (MENGAUD et al. 1991b).

L. monocytogenes sekretiert eine Proteinase, die einen Pathogenitätsfaktor darstellt, zur

Gruppe der Zink-Metalloproteasen zählt und durch das mpl-Gen kodiert wird (DOMANN et

al. 1991; MENGAUD et al. 1991a). Das mpl-Gen ist stromabwärts des hlyA-Gens lokalisiert

und existiert ausschließlich bei pathogenen L. monocytogenes-Stämmen (LEIMEISTER-

WÄCHTER u. CHAKRABORTY 1989; DOMANN et al. 1991; MENGAUD et al. 1991a).

Das prfA-Gen kodiert ein DNA-bindendes Protein (FREITAG et al. 1993), prfA (positive

regulatory factor of listeriolysin A), das die Expression vieler L. monocytogenes-Virulenz-

gene, einschließlich hlyA-, mpl- und prfA-Gen, aktiviert (CHAKRABORTY et al. 1992;

LEIMEISTER-WÄCHTER et al. 1990; MENGAUD et al. 1991b).

2.3.3.4 Multiplex-PCR

Ziel der Multiplex-PCR ist es, verschiedene Amplifikate von Abschnitten der Ziel-DNA zu

erhalten. Dazu wird mehr als ein Primerpaar verwendet. Die Primerpaare sollen keine

homologen Sequenzen amplifizieren, ansonsten kann es leicht zu einem Fehlannealing der

Primer oder auch der Produkte kommen.

Schrifttum

40

Je unterschiedlicher die Amplifikate in ihrer Länge sind, desto leichter und eindeutiger

gestaltet sich der Nachweis (MÜLHARDT 1999).

Darüber hinaus erübrigt sich die weitere Identifizierung der Fragmente durch Methoden wie

Restriktionsenzymanalyse oder Hybridisierung mit Oligonukleotiden, weil sich der ver-

gleichsweise einfache Größenvergleich der PCR-Produkte für eine sichere Aussage als

ausreichend erwiesen hat (FURRER et al. 1991; NIEDERHAUSER et al. 1992).

Mit den ersten PCR-Systemen konnte entweder die Gattung Listeria oder die Art Listeria

monocytogenes detektiert werden (BUBERT et al. 1992a; DENEER u. BOYCHUK 1991;

FURRER et al. 1991).

BORDER et al. (1990) erzielte in einer einzigen PCR-Amplifikation 3 PCR-Amplifikate von

unterschiedlicher Größe, wovon eines als Listerien-spezifisch und ein anderes als

L. monocytogenes-spezifisch beschrieben wurde. 1991 erschien die erste Studie über die

Anwendung einer Multiplex-PCR für den Nachweis von Listerien in Lebensmitteln

(FURRER et al. 1991).

Neben dem Nachweis von Listeria monocytogenes geriet vor allem Listeria innocua in das

Zentrum des Interesses.

BUBERT et al. (1999) gelang es, eine Multiplex-PCR zu entwickeln, die parallel den

Nachweis von Listeria spp. und die Differenzierung zwischen Listeria monocytogenes,

Listeria innocua und zwei weiteren Gruppen (erste Gruppe: L. seeligeri, L. welshimeri,

L. ivanovii; zweite Gruppe: L. grayi, L. murrayi) zuließ.

Eine Weiterführung des Prinzips der Multiplex-PCR stellt die sogenannte MAMA-PCR

(Mismatch Amplification Mutation Assay-PCR) dar. Mit MAMA-Primern können Listeria

monocytogenes-Isolate identifiziert und nach den drei evolutionären Abstammungsgenotypen

von Listeria monocytogenes unterschieden werden, was den Zusammenhang zwischen LM-

Probe und einer Listeriose-Erkrankung herstellen kann (JINNEMANN u. HILL 2001).

2.3.3.5 Detektion der PCR-Produkte

Erste Studien über den Listeria monocytogenes-Nachweis nach der Durchführung einer PCR

stammen von dem Beginn der 1990er Jahre (BESSESEN et al. 1990; BORDER et al. 1990).

PCR-Produkte wurden seitdem i. d. R. mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese detektiert

oder mit Slot-Blot-Hybridisation bestätigt.

Schrifttum

41

Die Analyse mit Microarrays (Synonyme: Biochips, Microchips, DNA-Arrays, DNA-Chips

etc.) stellt eine Weiterentwicklung in der Hybridisierungstechnologie dar. Ein Microarray ist

ein stabiler Träger, auf dem DNA-Sonden in hoher Anzahl und Dichte in definierter Anord-

nung gebunden vorliegen. Es gibt grundsätzlich 2 Typen von Microarrays (HARRINGTON et

al. 2000): spotted DNA array und high density oligonucleotide array (Tab.9).

Tab. 9: Typen von Microarrays und deren Charakteristika.

• DNA-Amplifikate werden auf einen festen Träger (i. d. R. aus Glas) gedruckt („Spot“ = Punkt = kreisförmig bedruckte Fläche)

• entweder im hauseigenen Labor oder durch entsprechende Anbieter nach individuellen Wünschen produzierbar

Dieser Microarray-Typ kann mit verschiedenen Eigenschaften, die von den verwendeten Gensonden bestimmt sind, hergestellt werden (ZHOU 2003):

Spotted DNA array Quantifizierung möglich

• CGA (community genome array): Sonde besteht aus Genom in toto; Anwendung bei phylogenetischen Studien; (relativ) höchste Sensitivität und geringste Spezifität

• FGA (functional gene array): - Gensonden i. d. R. 200 – 1000 bp - differenziert DNA-Fragmente, die zu bis 80 – 85 % homolog sind • Oligonukleotid-FGA: - Gensonden i. d. R. 50 – 70 bp

(weiterentwickelter FGA) - differenziert DNA-Fragmente, die bis zu 86 – 90 % homolog sind

- Herstellung und Handhabung einfacher (im Vergleich zu FGA)

High density oligonucleotide array Quantifizierung möglich

Auf einem kleinen Glasträger entstehen in einer Abfolge chemischer Synthesen Tausende verschiedene Oligomer-Sonden (15 - 20 bp) an genau festgelegten Positionen. Anwendung: - qualitative Erfassung von Keimgehalten, Vergleich der Keimgehalte verschiedener Proben

- Erstellung mikrobieller Transkriptionsprofile (z. B. bei unterschiedlichen Milieubedingungen)

- kommerziell erhältlich

Die Microarray-Analyse hat das Potential, mikrobielle Kontaminationen hoch-spezifisch,

hoch-sensitiv und dabei quantitativ nachzuweisen (HOHEISEL u. VINGRON 1998; ZHOU

2003); dabei ist gleichzeitig ein hoher Probendurchsatz möglich (Automatisierbarkeit).

Kommerziell erhältlich sind Microarray-Testkits für den Nachweis von Bakterien wie z. B.

Escherichia coli und Bacillus subtilis (LUCCHINI et al. 2001). Der Nachweis von Listeria

monocytogenes mit Microarray-Technologie wurde von BUSCH et al. (2002) und HUBER et.

al. (2002) beschrieben.

Schrifttum

42

Der NUTRI®-Chip (= spotted DNA array) bestätigte erfolgreich die kulturell erhobenen

Diagnosen für verschiedene Feldproben (BUSCH et al. 2002; HUBER et al. 2002). Der

parallele Nachweis von Listeria monocytogenes, Campylobacter coli respektive jejuni und

Salmonella spp. konnte mit dem NUTRI®-Chip-Analysekit in einer einzigen Untersuchung

erzielt werden.

Die technische Umsetzung eines quantitativen Nachweises von mikrobiellen Genen wurde

besonders ausführlich bei CHO und TIEDJE (2002) beschrieben. Sie stellten die lineare Ab-

hängigkeit von (Hybridisierungs-)Signalstärke und DNA-Konzentration dar. Die Nachweis-

grenze ist abhängig und proportional zu der Menge an DNA, die auf dem Träger (Membran)

immobilisiert vorliegt. Die Nachweisgrenze für bakterielle Mischkulturen (Umgebungs-

proben) mittels Microarray-Analyse wurde mit 105 Zielzellen bzw. Zielsequenzen kalkuliert.

Dies war eine verhältnismäßig hohe Anzahl erforderlicher Zielkeime unter Berücksichtigung

herkömmlicher Hybridisierungsmethoden, die mit Hilfe einer Membran durchgeführt werden

und dabei i. d. R. Nachweisgrenzen im Femtogramm-Bereich erzielen. Grund dafür war, dass

jeder Bestimmungspunkt auf einer Membran (dot) mehr als 1 µg Sonden-DNA enthält,

wohingegen pro Bestimmungspunkt (spot) eines Glasträgers bzw. Microarrays maximal 20 pg

Sonden-DNA aufgetragen waren. Um das Problem der relativ hohen Nachweisgrenze zu

lösen, wurden Maßnahmen wie das Aufbringen von Sonden in größerer Dichte bzw. Menge,

eine Verbesserung des Systems zur Detektion der Microarray-Hybridisierungs-Signale und

die Anreicherung von Ziel-DNA bzw. von Zielkeimen vorgeschlagen.

2.3.3.6.1 Nachweisgrenzen und Spezifität von PCR-Systemen bei Untersuchungen

von Listeria monocytogenes-Reinkulturen

Seit 1990 wurden für den spezifischen Nachweis von Listeria monocytogenes mittels PCR

zahlreiche Primer entwickelt. Die Ziel-DNA-Sequenzen waren hauptsächlich Listeria

monocytogenes-spezifische, Virulenz-kodierende Gene (Tab. 10). Daneben wurden auch

rRNA-kodierende Gene für einen Nachweis identifiziert. Bei den meisten in der Tabelle 10

aufgeführten Studien waren nicht humanpathogene Listerien-Stämme, insbesondere Listeria

innocua, in den Versuchen berücksichtigt. Die Spezifität der Monocytogenes-spezifischen

Primerpaare und der Pathogenitätsfaktoren konnte in jedem Fall bestätigt werden.

Schrifttum

43

Gerade in älteren Studien wurden Nicht-Listerien-Stämme in die Experimente integriert

(BESSESEN et al. 1990; BORDER et al. 1990; DENEER u. BOYCHUK 1991; FITTER et al.

1992).

Die methodische Sensitivität (Nachweisgrenze) der PCR für den Nachweis aus Reinkulturen

betrug zwischen 5 KbE im günstigsten und 3 x 106 KbE im ungünstigsten Fall (Tab. 10).

Höhere Nachweisgrenzen (log 3 – 6 KbE Listeria monocytogenes) wurden v. a. nach dem

Jahr 1995 festgestellt. In manchen Fällen könnten für die Berechnung von Nachweisgrenzen

falsch-positive Ergebnisse zugrundegelegen haben, die auf PCR-Kontaminationen mit Ziel-

DNA basierten. Hätten diese tatsächlich vorgelegen, wären höhere Nachweisgrenzen ab log 3

eine realistische Größe, an der sich ein PCR-System zu messen hätte.

Wenige Studien legten die methodische Sensitivität von kommerziell erhältlichen PCR-

Systemen dar. Das BAXTM for Screening / Listeria monocytogenes-System war in der Lage,

log 4 KbE ml-1 Anreicherungskultur zu detektieren. Andere Arbeitsgruppen ermittelten für

dieses PCR-System Nachweisgrenzen zwischen log 5 und log 6 KbE ml-1 (STEWART u.

GENDEL 1998; BESSER 2000). Die Sensitivität wurde in Gegenwart hoher Konzentrationen

anderer Listeria spp. (u. a. Listeria innocua) sowie von Nicht-Listerien nicht negativ beein-

flusst. SCHEU et al. (1999) drückten die Nachweisgrenze mit der Anzahl der detektierbaren

Kopien einer Standard-DNA – in dem Fall 300 – aus.

Die Detektion der Amplifikate erfolgte meist mit Hilfe der Agargel-Elektrophorese und

Färbung der Amplifikate mit Ethidiumbromid. In einigen Fällen wurde zusätzlich ein

Southern Blot bestätigend durchgeführt (KLEIN u. JUNEJA 1997).

Die Sensitivität für das iap-spezifische Produkt unterschied sich je nachdem, welches

Detektionsverfahren verwendet wurde: die Agargel-Elektrophorese war sensitiv genug, eine

initiale Kontamination von etwa 3000 KbE ml-1 nachzuweisen; hingegen erwies sich die

Hybridisierung als annähernd 1000-fach sensitiver mit einer Nachweisgrenze von ca. 3 KbE

ml-1 (KLEIN u. JUNEJA 1997).

Kommerziell erhältliche PCR-Testkits für den Nachweis von L. monocytogenes sind z. B. das

BAXTM-System, die Listeria test-PCR und das PROBELIATM-PCR-Hybridisierungssystem.

Nähere Einzelheiten sind aus verschiedenen Veröffentlichungen zu entnehmen (CANDRIAN

et al. 1991; STEWART u. GENDEL 1998; BESSER 2000).

Schrifttum

44

Tab. 10: Nachweisgrenzen und Spezifität von PCR-Systemen bei Untersuchungen von Listeria monocytogenes-Reinkulturen. Referenz DUFFY

et al. (1999)

SCHEU et al. (1999)

BESSER (2000)

HOCHBERG et al. (2001)

BECKER u. HOLZAPFEL (2002)

Nicht-Listerien-Stämme

6

40 -

9

3 41 -

Andere Listerien-Stämme

6

33

- 13

5

15

-

L. monocyto-genes-Stämme

1 103 1

17

11 97 1

Nachweis-grenze

log10 4 KbE

(s. Text) 1,6 x 106 KbE ml-1

1,4 x 102 KbE ml-1

3,4 x 103 KbE ml-1

k. A. log10 4 KbE ml-1

Ziel-DNA-Sequenz

hlyA mpl unbe-kannt;

BAXTM-PCR

hlyA

hlyA

unbekannt; BAXTM-PCR

unbekannt; BAXTM-PCR

2.3.3.6.2 Nachweisgrenzen von PCR-Systemen bei Untersuchung von Listeria

monocytogenes-dotierten Lebensmitteln (mit oder ohne Anreicherung)

Mit Dotierungsversuchen wurde die Anzahl von L. monocytogenes in Lebensmitteln ermit-

telt, die einen positiven Nachweis ermöglichte. Tabelle 11 zeigt eine Auswahl von Unter-

suchungen.

Die Mehrzahl der PCR-Analysen wurde nach einem oder auch zwei Anreicherungsschritten

durchgeführt. Dabei wurden Nachweisgrenzen zwischen 0,1 und 100 KbE L. monocytogenes

pro g LM ermittelt. Die Nachweisgrenze für ein PCR-System ist hier in Abhängigkeit von

Nachweissystem u n d Anreicherung zu sehen.

Im Vergleich dazu führte der d i r e k t e PCR-Nachweis erst bei erheblich größeren

Inokulationsmengen (103 – 108 KbE g-1) zu einem positiven Ergebnis. Daher ist die direkte

PCR für den Nachweis eines Zielkeimes wie L. monocytogenes, der gewöhnlich in weit

geringeren Konzentrationen in Fleisch und Fleischerzeugnissen vorkommt, ungeeignet.

Schrifttum

45

NIEDERHAUSER et al. (1992) und BANSAL et al. (1996) führten parallel zur PCR-Analyse

mikrobiologische Untersuchungen zum Nachweis von L. monocytogenes durch, und die Er-

gebnisse beider Methoden stimmten vollständig überein. Wurden keine Listerien wiederge-

funden, wurde dies mit sehr niedrigen Inokulationsmengen begründet (BANSAL et al. 1996).

In einer Veröffentlichung des BgVV (ANON. 2002) wird ein Ringversuch (s. 2.3.4)

beschrieben. Nach Analyse mittels PCR-ELISA und dem kulturellen Referenzverfahren nach

DIN EN ISO 11290-1 wurden die beiden Verfahren anhand ihrer Ergebnisse verglichen. Das

kulturelle Verfahren hatte immerhin für mehr als jede zehnte Probe ein falsch-negatives

Ergebnis produziert. Als problematisch wurden die DNA-Präparation und die anschließenden

Arbeitsschritte bewertet, die die Gefahr der Kreuzkontamination in sich bergen, wenn

verschiedene Proben gleichzeitig zu bearbeiten sind.

Schweinehackfleisch wurde mit dem BAXTM for Screening/Listeria monocytogenes-System

nach einer zweistufigen Anreicherung untersucht (BECKER u. HOLZAPFEL 2002; Tab. 10).

Die Primäranreicherung wurde einerseits 24 Stunden und andererseits 48 Stunden inkubiert.

Nach 48 Stunden Inkubation waren die Signale deutlicher zu erkennen, insbesondere nach

Primäranreicherung in PALCAM-Bouillon, die das Wachstum von L. monocytogenes etwas

besser förderte als Fraser (log 9 KbE ml-1 gegenüber log 8 KbE ml-1).

Bei HOCHBERG et al. (2001) wurden mit dem BAX-System besonders geringe Konzen-

trationen von Listeria monocytogenes nachgewiesen (Tab. 10). Eine Probe, die zu den nicht

inokulierten Untersuchungsmaterialien zählte, wurde mit dem BAX-System positiv getestet;

gleichzeitig gelang mit der ISO-Methode der kulturelle Nachweis des Erregers nicht.

Primäre und sekundäre selektive Anreicherungen gemäß DIN EN ISO-Standard wurden

(anhand von Milch und Käsearten) im Vorfeld verschiedener PCR-Systeme eingesetzt, um die

Mindestanreicherungszeit zu ermitteln (BESSER 2000). Nach einer Mindestanreicherungszeit

von 22 Stunden betrug die detektierbare Keimzahl wenigstens 2 x 103 KbE ml-1.

Schrifttum

46

Tab. 11: Untersuchungen zur Nachweisgrenze von PCR-Systemen zum Nachweis von L. monocytogenes aus dotierten Lebensmitteln (mit oder ohne Anreicherung).

Ref

eren

z

GO

LS

TE

YN

T

HO

MA

S e

t al.

(199

1)

NIE

DE

RH

AU

SE

R

et a

l. (1

992)

FIT

TE

R

et a

l. (1

992)

DIC

KIN

SO

N

et a

l. (1

995)

MA

KIN

O

et a

l. (1

995)

BA

NS

AL

et

al.

(199

6)

KL

EIN

u.

JU

NE

JA (

1997

)

DU

FF

Y

et a

l. (1

999)

Sen

siti

vitä

t

1,2

K

bE/g

H

ackf

leis

ch

(Rin

d)

40

KbE

/10

g

10 –

100

K

bE/g

103 -

104

KbE

/g

104

KbE

/0,5

g

1 KB

E/g

Nac

h In

kuba

tion

von

2 h:

ca

. 3 K

bE/g

ca. 2

00 K

bE/g

N

ach

4 –

6 h

Inku

bati

on:

Ca.

104

– 1

05

KbE

/ml

Anr

eich

erun

gs-

Anr

eich

erun

g

Ja (

sele

ktiv

) +

Näh

rbod

en

Ja (

sele

ktiv

) 20

– 2

4 h

Ja (

sele

ktiv

) 18

h

- - Ja (

sele

ktiv

) P

A /

SA

Ja

TS

B

2, 6

ode

r 8

h

37°C

Ja

BP

W

0 / 2

/ 4

/ 6 /

8 /

10 h

30

°C

Nac

hwei

ssys

tem

Gel

Mul

tipl

ex-P

CR

; G

el

Gel

; R

estr

ikti

onse

n-zy

man

alys

e +

Gel

Gel

Gel

Mul

tipl

ex-P

CR

; G

el

RT

-PC

R;

Sou

ther

n B

lot

SA

-PC

R;

Gel

Zie

l-se

quen

z

hlyA

hlyA

ia

p

hlyA

prfA

genu

s-sp

ezif

isch

hlyA

iap-

mR

NA

hlyA

Dot

iert

:

0 –

105

KbE

/g

4 –

4 x

105

KbE

/10

g

101 -

104

KbE

/g

100 –

109

KbE

/g

101 –

108

KbE

/0,5

g

1

KbE

/g

0,3

– 30

K

bE/g

ca. 2

00

KbE

/g

Pro

benm

ater

ial

Rin

dfle

isch

, H

ackf

leis

ch (

Rin

d)

Hac

kfle

isch

(S

chw

ein,

Rin

d) u

. a.

Gef

lüge

lhau

t

Gef

lüge

lfle

isch

Hac

kfle

isch

(k

. A. z

ur T

iera

rt)

Sal

ami,

Sch

inke

n

Gek

ocht

es

Hac

kfle

isch

(R

ind)

Hac

kfle

isch

(R

ind)

Schrifttum

47

Tab. 11: Untersuchungen zur Nachweisgrenze von PCR-Systemen zum Nachweis von L. monocytogenes aus dotierten Lebensmitteln (mit oder ohne Anreicherung).

Ref

eren

z

DU

FF

Y

et a

l. (1

999)

KR

ISM

ER

et

al.

(200

2)

HO

CH

BE

RG

et

al.

(200

1)

PE

NG

u.

SH

EL

EF

(200

1)

BE

CK

ER

u.

HO

LZ

AP

FE

L

(200

2)

Sen

siti

vitä

t

ca. 2

00 K

bE/g

N

ach

4 –

6 h

Inku

bati

on:

Ca.

104

– 1

05

KbE

/ml

Anr

eich

erun

gs-

kult

ur

Init

ial:

1

– 10

K

bE/2

5 g

Init

ial:

3

KbE

/25

g 30

KbE

/25

g

Init

ial:

10

– 5

0

KbE

Lis

teri

en

(all

e S

pezi

es)

sow

ie

Sal

mon

elle

n

/25

g

Init

ial:

P

A24

h +

SA

: 10

2 KbE

/g

PA

48 h

+ S

A:

101 K

bE/g

Anr

eich

erun

g

Ja

BP

W

0 / 2

/ 4

/ 6 /

8 / 1

0 h 30

°C

Ja

BP

W

16 h

35

°C

Ja

(PA

und

SA

: IS

O-

Met

hode

)

Ja

PA

(n

icht

-sel

ekti

v)

6 h

SA

(se

lekt

iv)

über

Nac

ht

Ja

PA

: Fra

ser-

&

PA

LC

AM

-B

ouil

lon,

24

/ 48

h S

A: B

HI,

3 h

je

37°

C

Nac

hwei

ssys

tem

SA

-PC

R;

Gel

Mul

tipl

ex-s

emi-

nest

ed P

CR

; G

el

BA

XT

M-S

yste

m

L. m

onoc

ytog

enes

; G

el

BA

XT

M-S

yste

m

L. m

onoc

ytog

enes

; G

el

BA

XT

M-S

yste

m

L. m

onoc

ytog

enes

; G

el

Zie

l-se

quen

z

hlyA

hlyA

nich

t an

gege

-be

n

nich

t an

gege

-be

n

nich

t an

gege

-be

n

Dot

iert

:

ca. 2

00

KbE

/g

0,1

– 10

00

KbE

L. m

ono-

cyto

gene

s/

Salm

onel

len/

Y

ersi

nien

pr

o 25

g

3 K

bE/2

5 g

30 K

bE/2

5 g

10 –

50

K

bE L

iste

rien

(a

lle

Spe

zies

) so

wie

S

alm

onel

len/

25

g

101 –

105

KbE

/g

Pro

benm

ater

ial

Hac

kfle

isch

(R

ind)

Leb

erpa

stet

e u.

a. H

ackf

leis

ch

(Rin

d)

Hac

kfle

isch

(k

. A. z

ur T

iera

rt)

fris

che

Sch

wei

ne-

zusc

hnit

te

Hac

kfle

isch

(S

chw

ein)

Schrifttum

48

2.3.3.6.3 Sensitivität und Spezifität verschiedener PCR-Systeme nach

Untersuchungen von Feldproben

Feldproben wurden parallel mit kulturellen Verfahren und PCR-Systemen auf die Anwesen-

heit von Listeria monocytogenes untersucht. Anhand der Ergebnisse wurden Erkennnisse über

Sensitivität und Spezifität eines PCR-Systems sowie den Übereinstimmungsgrad der

Methoden als Parameter für die Qualität eines Nachweisverfahrens gewonnen. Als Referenz

werden i. A. Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung zugrunde gelegt. Eine

Zusammenfassung von Vergleichsuntersuchungen ist der Tabelle 12 zu entnehmen.

Als Grundlage für die Berechnung der Parameter sind ebenfalls jeweils die Anzahl der unter-

suchten Feldproben, richtig-positive und richtig-negative Ergebnisse sowie falsch-positive

und falsch-negative Ergebnisse aufgeführt. Gut die Hälfte der genannten PCR-Systeme

erreichte eine Sensitivität von 100 %.

Nach allgemeiner Ansicht ist ein falsch-positives Ergebnis nach einer Multiplex-PCR

unwahrscheinlich, solange beide bzw. mehrere spezifische Banden visualisiert werden

(BANSAL et al. 1996; NIEDERHAUSER et al. 1992). Schwach ausgeprägte Banden im Gel

wurden als Hinweis auf eine geringe Kontamination gewertet (BANSAL et al. 1996).

Mit einem Multiplex-PCR-System erzielten NIEDERHAUSER et al. (1992) korrespon-

dierende Ergebnisse mit Kultur und PCR. Allerdings musste das Analysenprotokoll für

Feldproben um eine sekundäre selektive Anreicherung ergänzt werden, auf die bei künstlich

kontaminierten Proben verzichtet werden konnte.

Auch kommerziell erhältliche, Listeria monocytogenes-spezifische PCR-Systeme wurden mit

Feldproben getestet (BRUNNER u. BÜLTE 2000; PENG u. SHELEF 2001; SIMON et al.

1999). Dabei erreichte kein PCR-Testsystem eine vollständige Übereinstimmung mit den

kulturellen Ergebnissen, wobei in zwei von drei Untersuchungen mehr falsch-negative als

falsch-positive Nachweise erbracht wurden. In Verbindung mit Käsereiprodukten hatten die

von BRUNNER und BÜLTE (2000) getesteten Systeme BAXTM und PROBELIATM die

relativ geringste Übereinstimmung (85,8 %); bei beiden kam es zu etwas mehr positiven

Ergebnissen. Das BAXTM-System, auf fleischhaltige Proben angewendet, erzielte in allen drei

Parametern die höchsten Werte (PENG u. SHELEF 2001).

Schrifttum

49

Umgebungsproben wurden kulturell und mit dem BAXTM-System übereinstimmend negativ

auf L. monocytogenes getestet (TENGEL et al. 2001). Ebenfalls mit dem BAX-PCR-System

wurden 16 verschiedene Lebensmittel untersucht (HOCHBERG et al. 2001). Insgesamt

ergaben sich 2,4 % falsch-negative und 1,8 % falsch-positive Ergebnisse.

Unter Verwendung der Listeria test-PCR (BESSER 2000) wurde die Abhängigkeit der PCR-

Sensitivität von der Dauer einer bestimmten Anreicherung deutlich. Nachdem die Bebrü-

tungszeit verlängert worden war, wurden keine falsch-positiven Diagnosen mehr beobachtet.

BUSCH et al. (2002) nutzten die Microarray-Analyse für den parallelen Nachweis von

3 pathogenen Arten. Neben Voranreicherungen, die untersucht wurden, wurden Bakterien-

Isolate (identifiziert als Listeria monocytogenes, Campylobacter und Salmonella spp.) nach

separater Kultivierung vereinigt und simultan mit dem NUTRI®-Chip analysiert. Die isolier-

ten Bakterien wurden alle mit dieser Methode bestätigt. Der Vergleich von PCR-Systemen

mit der Kulturmethode nach DIN EN ISO 11290-1 (1996) ist bisher in wenigen Studien

gezogen worden (Tab. 12).

Die Anwesenheit der kulturell nachgewiesenen Spezies Innocua führte mit keinem PCR-

System zu falsch-positiven Ergebnissen (BRUNNER u. BÜLTE 2000; DUFFY et al. 1999).

Eine Häufung der falsch-negativen PCR-Ergebnisse wurde mit einer geringen Ausgangs-

konzentration von L. monocytogenes bzw. Anwesenheit von L. innocua in Verbindung

gebracht (SIMON et al. 1999).

Schrifttum

50

Tab. 12: Sensitivität und Spezifität verschiedener PCR-Systeme nach Untersuchungen von Feldproben.

Ref

eren

z

BA

NS

AL

et

al.

(199

6)

BU

SC

H

et a

l. (2

002)

DU

FF

Y

et a

l. (1

999)

PE

NG

u.

SH

EL

EF

(2

001)

Übereinstimmung PCR & Kultur 99

,4 %

100

%

100

%

92,9

%

Spezifität (PCR)

99,3

%

100

%

100

%

100

%

Sensitivität (PCR)

100

%

100

%

100

%

85,3

%

─ +

0 0 PA

: k.

A.

S

A:

0 0

+ ─

0 0 PA

: k.

A.

S

A:

0 0

─ ─ 15

88

PA

: k.

A.

S

A:

310 88

PCR

Kultur

+ +

3 12

PA

:3

SA

: 20

12

Feld

prob

en

Mil

chpr

oduk

te, F

isch

-er

zeug

niss

e, G

emüs

e,

geko

chte

s F

leis

ch, W

urst

u.

a. (

n =

350)

Gef

lüge

l, S

chw

ein,

Kal

b,

Hir

sch,

Was

ser

(n =

18)

Hac

kfle

isch

(Rin

d)

(n =

80)

G

eflü

gel (

n =

20)

Hac

kfle

isch

(R

ind)

(n

= 2

0)

Rea

dy-T

o-E

at M

eat

(n =

10)

S

chw

eine

flei

sch

(n =

25)

an

dere

LM

(n =

15)

Vergleich mit Kultur

ja

ja

(§ 3

5)

ja

ja

PC

R-S

yste

m

Mul

tipl

ex-P

CR

; hl

yA (

750

bp);

rD

NA

(93

8 bp

, ge

nus-

spez

if.)

Mic

roar

ray

nach

M

ulti

plex

-PC

R;

mpl

(14

8 bp

) hl

yA (

234

bp)

(Sur

face

adh

esio

n)

SA

-PC

R;

hlyA

(52

0 bp

)

BA

XT

M-S

yste

m

(L. m

.)

Schrifttum

51

2.3.4 Methodenvergleich

Parameter zur Charakterisierung einer Methode sind insbesondere Sensitivität (Wahrschein-

lichkeit, dass eine Methode eine positive Probe als positiv erkennt) und Spezifität (Wahr-

scheinlichkeit, dass ein Methode eine negative Probe als negativ erkennt) (BECKER et al.

1998). Beide Werte ergeben sich aus qualitativen Untersuchungsergebnissen.

Die Übereinstimmung zweier Methoden entspricht der Wahrscheinlichkeit einer richtigen

Diagnose (CAPITA et al. 2001).

Sensitivität = a / (a + c) Spezifität = b / (b + d)

a = richtig-positiv; positiver Test

& L. monocytogenes bestätigt

b = richtig-negativ; negativer Test ohne

Bestätigung von L. monocytogenes

c = falsch-negativ; negativer Test

& L. monocytogenes bestätigt

d = falsch-positiv; positiver Test ohne

Bestätigung von L. monocytogenes

Übereinstimmung = (a + d) / (a + b + c + d)

Ein „golden standard“ im eigentlichen Sinne steht als Referenz für einen Methodenvergleich

nicht zur Verfügung. Der Vergleich neuer Schnellmethoden ist daher mit der herkömmlichen

Referenzmethode nicht ohne weiteres durchführbar (BAILEY 1998). Dies gilt insbesondere

für die hochspezifische und hochsensitive PCR.

Wird aber trotzdem bei einem kulturell falsch-negativen / falsch-positiven Ergebnis dieses mit

dem positiven / negativen, mit Hilfe einer neuen Methode erzielten Ergebnis direkt

verglichen, dann wird fälschlicherweise davon ausgegangen, dass die neue Methode („falsch-

posititv“ / „falsch-negativ“) eine geringere Spezifität / Sensitivität aufweist als die Referenz-

methode.

Dass die ermittelte Leistungsfähigkeit neuer Tests abhängig ist von Sensitivität und

Selektivität der festen oder flüssigen selektiven Medien der Standardmethode, wurde z. B. für

Immunoassays gezeigt (BECKER et al. 1998; CAPITA et al. 2001; GUNASINGHE et al.

1994; JOHANSSON 1998; WANG et al. 1992).

Schrifttum

52

Der Gebrauch i d e n t i s c h e r Anreicherungsprotokolle bzw. Nährböden wird angeraten

(BEUMER et al. 1996). HITCHINS und DUVALL (2000) sprachen sich ausdrücklich dafür

aus, v e r s c h i e d e n e Methoden p a r a l l e l anzuwenden, wobei alle anderen

Bedingungen soweit wie möglich standardisiert werden sollten.

Die Konzentration von Listeria monocytogenes ist bei Inokulationsversuchen bereits auf das

geringste Maß reduziert worden, um erfolgreich spezifische DNA oder spezifische Antigene

in Lebensmitteln nachzuweisen.

Wenn das Inokulationsniveau relativ niedrig ist, können schon geringe Unterschiede in der

Kontaminationsdosis großen Einfluß auf das Resultat haben. Das gilt insbesondere für

Inokulationsversuche mit Listerien, die relativ langsam wachsen (FELDSINE et al. 1997).

Ansonsten sind Inokulationsversuche, die sich dadurch auszeichnen, dass die Zielkeim-

konzentration im Lebensmittel bekannt ist, ein geeignetes Mittel, um aussagekräftige

Informationen über die Sensitivität bzw. Spezifität einer Methode zu erhalten. Darin unter-

scheiden sich diese Versuche von Feldstudien, bei denen die Kontamination nachzuweisender

Pathogene als Häufigkeit des Vorkommens allgemein vorausgesetzt werden kann.

Eine weitere Möglichkeit, die indirekt etwas über die Höhe der Sensitivität aussagt, ist die

genaue Erfassung der Inkubationsdauer, die mindestens notwendig ist, damit in allen

gleichartigen Proben - gleiche Art des Lebensmittels und gleiches Kontaminationsniveau

vorausgesetzt - der positive Nachweis des Erregers erfolgt (Mindestanreicherungszeit).

Die Mindestanreicherungszeit ist auch insofern von Interesse, als dass eine s c h n e l l e

Nachweisfindung Gegenstand der heutigen Forschung in der Diagnostik von Lebensmittel-

infektionserregern ist.

Als Methodenvergleich wurden auch immer wieder Ringversuche (z. B. KNIGHT et al. 1996;

GANGAR et al. 2000) angesehen. Ringversuche sind an sich ein Instrument der

Qualitätssicherung, wobei die Leistungsfähigkeit eines Labors, die wesentlich von der

Arbeitsleistung des Personals abhängig ist, bewertet wird. Nach Ansicht von BEUMER et al.

(1996) sind Ringversuche daher nicht geeignet, Methoden zu evaluieren.

Untersuchungen von Feldproben gelten als unerlässlich, weil die Bedingungen in Feldproben

durch dotierte Proben nicht vollständig simuliert werden. Bedingungen in Feldproben sind

allerdings variabel bzw. nicht standardisiert (HITCHINS u. DUVALL 2000), was den Wert

einer Feldprobenstudie relativiert.

Schrifttum

53

Vergleicht man den Aufbau der Studien verschiedener Arbeitsgruppen, finden sich in den

meisten Fällen erhebliche Unterschiede. Angefangen bei den Testsystemen beziehen sich

diese v. a. auf das Kontaminationsniveau (sowohl natürlich als auch künstlich kontaminierter

Lebensmittel), die Lebensmittelmatrix und die Art der Anreicherung sowie die originäre

Mikroflora im Lebensmittel, die (HITCHINS u. DUVALL 2000) die mit am wenigsten

kontrollierbare Variable darstellt, und die quantitativ und qualitativ mit dem Lebensmitteltyp

und innerhalb eines Probenvolumens variiert.

Allgemein besteht die Auffassung, dass für die Isolation von Listerien insbesondere die 2-

stufige Anreicherung, und zwar i. w. bei geringgradigen Kontaminationen, eine wichtige

Bedeutung hat. Nach Meinung von HITCHINS und DUVALL (2000) basiert diese

Auffassung auf Unterschieden, die lediglich in dem Ausmaß bestanden, dass sie sich als

statistisch nicht signifikant erwiesen; in Untersuchungen konnte kein Unterschied bei dem

Nachweis nach Anwendung von 1-stufiger bzw. 2-stufiger Anreicherung festgestellt werden.

Methodenvergleich zwischen verschiedenen veröffentlichten Studien

Die Anwendung der PCR (wie auch des ELISA) in der Lebensmitteldiagnostik sollte als ein

integrales System angesehen werden (2.3.3.3). Die Faktoren eines integralen Systems beein-

flussen sich gegenseitig und müssen aufeinander abgestimmt (kompatibel) sein. Die Er-

fahrungen mit Systemen zum Nachweis von L. monoctogenes lehrten, dass die Leistungs-

fähigkeit eines Tests abhängig ist von

- Sensitivität und Selektivität der verwendeten Medien (2.3),

- Zielkeimkonzentration,

- Inkubationsdauer (2.3.2.2.2),

- der untersuchten Lebensmittelmatrix.

Diese Abhängigkeitsfaktoren sind in den bekannten Studien meist sehr unterschiedlich ge-

wählt, was die Möglichkeit, einen Methodenvergleich zwischen den Ergebnissen der Arbeits-

gruppen zu ziehen, stark einschränkt (BECKER et al. 1998).

Mit der kulturellen ISO-Methode 11290-1 sind, wie bereits für eine Auswahl von Lebens-

mitteln gezeigt (SCOTTER et al. 2001; ANON. 2002), zwischen 5 und 10 KbE in 25

Gramm Lebensmittel (Inokulation mit L. monocytogenes) bzw. zwischen 50 und 100 KbE

in 25 g (Inokulation zusätzlich mit L. innocua) nachweisbar.

Schrifttum

54

Immunologisch ist mittels Sandwich-ELISA (Transia plate Listeria monocytogenes) bereits

1 KbE, mit der 10 g Hackfleisch beimpft wurde, nach primärer und sekundärer Anreicherung

(L-PALCAM-Bouillon plus Fraser-Bouillon) nachgewiesen worden (KLEINER u.

SCHINKEL 2003). KERDAHI und ISTAFANOS (2000) berichteten sogar von 1 – 10 KbE

des Erregers, die in 25 g Lebensmittel nachgewiesen werden konnten.

Auf Genus-Ebene ist der immunologische Nachweis von 1 KbE in 25 g Hackfleisch

(Schwein und Rind gemischt) beschrieben (UYTTENDAELE et al. 1995).

Dotierungsversuche zum molekularbiologischen Nachweis (PCR) von Listeria monocyto-

genes führten bei Proben tierischen Ursprungs bei 10 – 100 KbE pro Gramm (Geflügelhaut;

18 h selektive Anreicherung), 100 KbE pro Gramm (Schweinehackfleisch, 24 h selektive

Anreicherung plus 3 h selektive Anreicherung) oder 40 KbE pro 10 g (n i c h t bei 4 KbE in

10 g Hackfleisch; 20 – 24 h selektive Anreicherung) zur Identifizierung der gesuchten DNA

(Tab. 6). Für Proben tierischen Ursprungs wurde im Fall der PCR gezeigt, dass 4 KbE in 10 g

n i c h t nachweisbar waren; zu bemerken ist, dass die Inkubation im selektiven Medium

nicht länger als 24 Stunden erfolgte.

Zwar wurde auch über den Nachweis von ca. 1 KbE pro Gramm Rinderhackfleisch berichtet,

allerdings wurde dabei verdächtiges Koloniematerial für die PCR eingesetzt (Tab. 6). Durch

diesen Zwischenschritt wird eher eine Aussage über die methodische Sensitivität des

mikrobiologischen Nachweises getroffen.

In Rinderhackfleisch konnten schließlich – im Gegensatz zu Schweinefleisch (s. o.) – 3 KbE

in 25 g nachgewiesen werden; dabei folgte die zweistufige Anreicherung dem Protokoll der

kulturellen ISO-Methode (Tab. 6).

Insofern gilt, dass mit Hilfe von zweistufigen Anreicherungen die heutigen Schnellmethoden

erwiesenermaßen geeignet sind, selbst geringste Konzentrationen von Listeria monocytogenes

in Lebensmitteln zu detektieren.

Das Potential der Schnellmethoden, Untersuchungszeit einzusparen, wird derzeit aufgrund

mangelnder Erfahrung mit den Nachweissystemen in der Praxis noch nicht ausgeschöpft. Es

gilt, die Frage nach dem kürzesten Untersuchungszeitraum, der für eine sichere Diagnose

ausreichend ist, zu beantworten.

Schrifttum

55

2.4 Schlußfolgerungen aus dem wissenschaftlichen Schrifttum

Die kulturelle Referenzmethode nach § 35 LMBG weist den Zoonoseerreger Listeria

monocytogenes nicht zuverlässig nach.

Die an sich sehr hohe Sensitivität der Methode leidet in einem mehr oder weniger

unbestimmten Ausmaß unter dem Einfluß der Listeria-Spezies Innocua, die häufig aus

Fleisch und Fleischerzeugnissen, auch in Mischkulturen mit L. monocytogenes, isoliert wird,

weshalb das Ausmaß dieses Einflusses hier miteinbezogen werden soll.

Das Lebensmittel Fleisch bzw. Hackfleisch ist insbesondere für Risikogruppen als Vektor von

Listeriose-Erregern anzusehen. Die hohe Dichte der kompetitiven Flora in diesem LM kann

den Nachweis von L. monocytogenes, einem Mikroorganismus mit einer relativ langen

Generationszeit, erschweren.

Es stellt sich die Frage nach der Leistungsfähigkeit – Spezifität und Sensitivität innerhalb

einer bestimmten Zeit – von sogenannnten Schnellmethoden (ELISA und PCR; letztere auch

in Verbindung mit Microarray-Technologie) in Bezug auf dieses Lebensmittel.

Sensitivität und Spezifität von Listeria monocytogenes-spezifischen immunologischen Nach-

weissystemen wurden mit inokulierten Lebensmitteln, auch bei niedrigsten Erregerkonta-

minationen, untersucht; insbesondere mit dem Transia plate Listeria monocytogenes-ELISA

wurde der Zielkeim hochspezifisch und hochsensitiv in Hackfleisch mit dem Nachweis von

p60 identifiziert. Die Sensitivität dieses Testkits in Anwendung auf Schweinehackfleisch soll

hier weiter definiert werden, indem die Mindestanreicherungszeit (= Reduzierung des / der

vorgeschalteten Anreicherungsschritte) festgestellt werden soll.

Für PCR-Systeme konnte gezeigt werden, dass selbst geringste Listeria monocytogenes-

Konzentrationen in Lebensmitteln nachweisbar sind. Der nächste Schritt ist zu ermitteln,

inwieweit das diagnostische Potential der PCR-Methode ausgeschöpft werden kann, indem

der Zeitaufwand für die Inkubationsschritte reduziert wird.

Für den Nachweis von Listeria monocytogenes mittels PCR/Microarray-Technologie liegen

bislang nur wenige Erfahrungsberichte vor.

Mit der Microarray-Analytik steht der Diagnostik von pathogenen Mikroorganismen in

Lebensmitteln prinzipiell eine leistungsstarke Methode (spezifisch, sensitiv, quantitativ,

automatisierbar) zur Verfügung.

Schrifttum

56

Neben der Prüfung der Kompatibilität der einzelnen Bestandteile in einem System (Halb-

fraser-Anreicherungsbouillon, Schweinehackfleisch (dotiert), DNA-Extraktion, Multiplex-

PCR-System und Microarray-Analyse) soll festgestellt werden, ob der Nachweis von

L. monocytogenes bei Mischkulturen aus L. monocytogenes und L. innocua beeinträchtigt

wird.

Eine Multiplex-PCR, die Fragmente von zwei Virulenzgenen vervielfältigt, soll weitere

Bestätigungsreaktionen im Rahmen der Routinediagnostik entbehrlich machen, weil anhand

der relativ einfachen Größenbestimmung von zwei spezifischen Amplifikaten der Nachweis

ausreichend verifiziert ist. Zu klären ist, ob die Detektion der PCR-Produkte ohne weiteres in

positiven Proben möglich ist.

Zum Erreichen der Nachweisgrenze der PCR-Systeme wie auch des ELISA-Systems muss

eine Anreicherung der Keime vorgenommen werden, da die Nachweisgrenzen die vor-

liegenden Konzentrationen des Erregers in Lebensmitteln in praxi oft weit übersteigen.

Das gemäß DIN EN ISO 11290-1 (1996) einzusetzende primäre Selektivmedium soll auf

Kompatibilität mit den Schnellmethoden u n d Schweinehackfleisch getestet werden.

Zum Nachweis von Monocytogenes-spezifischer DNA sowie des Monocytogenes-

spezifischen p60 soll die (Primär-) Anreicherungkultur bei 37°C (anstelle von 30°C) inkubiert

werden.

Die Hackfleischproben sollen alle mit annähernd gleichen Keimkonzentrationen dotiert

werden, um das Probenvolumen als feste Größe in einen Methodenvergleich einbringen zu

können. Damit Schwierigkeiten bei der Beimpfung mit sehr kleinen Keimzahlen vermieden

werden, ist je eine größere Menge Hackfleisch mit einer Inokulationsmenge von 10 bis zu 40

KbE pro Gramm zu dotieren. Die Gleichmäßigkeit der Inokulation soll kontrolliert werden.

Als Parameter zur Charakterisierung kann die Mindestanreicherungszeit im Rahmen von

Inokulationsversuchen herangezogen werden.

Eigene Untersuchungen

57

3. Eigene Untersuchungen

3.1 Material Für die im folgenden dargestellten Versuche wurden Hackfleisch vom Schwein und

Referenzstämme verschiedener Mikroorganismen verwendet.

3.1.1 Hackfleisch Das Hackfleisch wurde in der Zentrumsabteilung für Lebensmittelkunde, Fleischhygiene

und -technologie durch Wolfen mit der 2 mm-Scheibe (einfacher Satz) hergestellt. Als

Ausgangsmaterial diente Schinkenmuskulatur vom Schwein (Kaltfleisch, 0 – 4°C, 2 Tage

post mortem, von sichtbaren Fett- und Bindegewebsanteilen befreit). Direkt im Anschluß an

die Herstellung wurden Portionen von je 80 g in Kunststoffbeutel verpackt und bei –20°C

tiefgefroren.

Das Auftauen erfolgte langsam bei Kühlschranktemperaturen (6 – 8°C) über 8 bis 15

Stunden. Jede Charge wurde auf eine natürliche Kontamination mit Listeria monocytogenes

untersucht, damit in den Versuchen ausschließlich Monocytogenes-freies Hackfleisch

eingesetzt wurde.

3.1.2 Mikroorganismen Für die künstliche Kontamination des Hackfleischs wurden die Stämme Listeria

monocytogenes SLCC* 9091 Serotyp 1/2a und Listeria innocua SLCC* 9053 eingesetzt.

Die Keime wurden freundlicherweise von Herrn Prof. Amtsberg, Institut für Mikrobiologie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover, zur Verfügung gestellt.

Zur Herstellung einer Stammkultur wurde Listeria monocytogenes in 10 ml TSYE-Bouillon

bei 37°C für 20 Stunden angereichert. Nachfolgend wurde 1 ml Anreicherungskultur in ein

MicrobankTM-Kryogefäß überführt. Dieses wurde geschüttelt, wobei sich die Keime an die in

dem Kryogefäß enthaltenen Kügelchen binden. Überstände wurden verworfen. Mit dem

Listeria innocua-Stamm wurde analog verfahren.

* SLCC: Special Listeria Culture Collection, Würzburg


58

Die Listerien-Stämme wurden als Dauerkulturen, die mit dem MicrobankTMSystem

tiefgefroren bei –20°C gelagert wurden, vorrätig gehalten.

Aus der Stammkultur wurde bei Bedarf ein Kügelchen steril entnommen, in 10 ml TSYE-

Bouillon verbracht und bei 37°C für 18 – 24 Stunden inkubiert. Nach Ausstrich auf TSYE-

Agar und Bebrütung konnte über eine Gebrauchskultur für den Einsatz in praktischen

Untersuchungen verfügt werden.

Staphylococcus aureus- und Rhodococcus equi-Kulturen (beide aus dem Institut für Mikro-

biologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover) wurden ebenfalls mit Hilfe des

MicrobankTMSystems als Stammkultur aufbewahrt. Gebrauchskulturen wurden auf Blutagar

angezüchtet.

3.2 Methoden

In dem Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden mikrobiologische, immunologische und

molekularbiologische Verfahren zum Nachweis von Listeria monocytogenes verwendet:

a) Kulturelle Nachweismethode entsprechend DIN EN ISO 11290 : Teil 1 (1996),

b) Transia plate Listeria monocytogenes-ELISA (Transia GmbH),

c) PCR (GeneScan Analytics GmbH),

d) NUTRI®-Chip (GeneScan Analytics GmbH).


59

3.2.1 Kulturelle Nachweismethode

Das kulturelle Nachweisverfahren wurde nach der vorgeschriebenen Methode der Amtlichen

Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG (L 00.00-32), mit der die DIN EN

ISO 11290-1 (1996) umgesetzt ist (ANON. 1998), durchgeführt.

Dieses qualitative Verfahren zum Nachweis von Listeria monocytogenes erforderte vier

aufeinanderfolgende Stufen:

1. Erste Anreicherung in einem selektiven flüssigen Anreicherungsmedium mit verminderten

Konzentrationen an selektiven Agentien (Halbfraser-Bouillon).

2. Zweite Anreicherung in einem selektiven flüssigen Anreicherungsmedium mit voll-

ständigen Konzentrationen an selektiven Agentien (Fraser-Bouillon).

3. Ausstreichen und Identifizieren.

4. Bestätigung.

Von dem Untersuchungsmaterial wurden 25 g in einen Stomacherbeutel eingewogen. Zur

Herstellung der ersten Anreicherungssuspension wurden 225 ml Halbfraser-Bouillon hinzu-

gefügt (1:10-Verhältnis von Untersuchungsmenge zum ersten selektiven Anreicherungs-

medium, Masse zu Volumen), und Untersuchungsgut und Verdünnungsflüssigkeit wurden mit

einem Beutel-Walk-Gerät (Stomacher) durchmischt.

50 g der ersten Anreicherungssuspension wurden anschließend bei 30°C für 24 Stunden

inkubiert (Erst- / Primäranreicherung = PA).

Nach dem Bebrüten wurde 0,1 ml der Erstanreicherungskultur in ein Kulturröhrchen mit

10 ml des zweiten selektiven Anreicherungsmediums (Fraser-Bouillon) überführt.

Die beimpfte Fraser-Bouillon wurde 48 Stunden bei 37°C bebrütet (Zweit- / Sekundäran-

reicherung = SA).

Von der Erstanreicherungskultur, die 24 Stunden bei 30°C bebrütet wurde, und von der

Zweitanreicherungskultur, die 48 Stunden bei 37°C bebrütet wurde, wurde mit einer Impföse

jeweils ein Tropfen entnommen, und die Oberflächen der ersten und zweiten festen Selektiv-

medien (je einmal PALCAM- und zweimal Oxford-Agar) wurden beimpft.


60

Die Bebrütung der Oxford-Agarplatten erfolgte zum einen bei 30°C und zum anderen bei

37°C, die aerobe Bebrütung des PALCAM-Agars bei 37°C. Nach 24 und 48 Stunden

Bebrütung wurden die Platten auf die Anwesenheit von Kolonien untersucht, die vermutlich

Listeria spp. sein konnten.

Typische, 24 Stunden auf Oxford-Agar gewachsene Kolonien von Listeria spp. sind klein

(1 mm), gräulich und von Schwärzungshöfen umgeben. Die nach 48 Stunden erhaltenen

Kolonien sind dunkler, möglicherweise mit einem grünlichen Schimmer, etwa 2 mm im

Durchmesser, mit Schwärzungshöfen und eingesunkenen Zentren.

Auf PALCAM-Agar wachsen Listeria spp. nach 24 Stunden Bebrütung in kleinen oder sehr

kleinen Kolonien, 1,5 bis 2,0 mm im Durchmesser, manchmal mit schwarzen Zentren, aber

immer mit Schwärzungshöfen. Nach 48 Stunden erscheinen Listeria spp. als grüne Kolonien,

1,5 bis 2,0 mm im Durchmesser, mit eingesunkenen Zentren und mit Schwärzungshöfen.

Nach der Identifizierung von Verdachtskolonien erfolgte die Bestätigung von Listeria spp.

sowie von Listeria monocytogenes. Dazu wurden von beiden festen Selektivmedien, auf

denen verdächtige Kolonien wuchsen, bis zu 5 verdächtige Kolonien genommen. Die ausge-

wählten Kolonien wurden auf Platten mit dem nicht-selektiven Nährmedium Trypton-Soja-

Hefe-Extrakt-Agar (TSYEA) ausgestrichen, um eine Reinkultur zu erhalten. Die beimpften

TSYEA-Platten wurden für 18 bis 24 Stunden bei 37°C bebrütet.

Auf TSYEA wachsen Listerienkolonien typischerweise mit einem Durchmesser von 1,0 bis

2,0 mm. Sie sind farblos, konvex, opak und haben einen vollständigen Rand. Wenn die

Kolonien nicht gut voneinander getrennt wachsen, wird eine für Listerien typische Kolonie

entnommen und davon eine Subkultur auf einer weiteren Platte mit TSYEA erstellt.

Die folgenden Untersuchungen zur Bestätigung von Listeria spp. wurden mit den

Reinkulturen durchgeführt. Und zwar wurden der Beleuchtungstest nach Henry, die Gram-

färbung und die Katalase-Reaktion angewendet. Verzichtet wurde auf die Prüfung zur

Feststellung der Listerien-charakteristischen torkelnden Bewegung, die nur dann unbedingt

erforderlich ist, wenn die Untersuchung von einer Person durchgeführt wird, die nicht

regelmäßig L. monocytogenes nachweist.


61

Für den Beleuchtungstest nach Henry wurden die Platten so mit gebündeltem weißen Licht

durchleuchtet, dass in einem schrägen Durchlicht (Henry-Beleuchtung) durch Prüfung direkt

oberhalb der Platte die typische bläuliche Tönung der Listerienkolonien deutlich wurde.

Eine Kolonie wurde auf einem Objektträger in einem Tropfen 3%iger Wasserstoffperoxid-

Lösung suspendiert. Sofortige Bildung von Gasblasen zeigte die positive Katalase-Reaktion

an.

Eine Kolonie wurde nach Gram gefärbt. Listerien waren gram-positive dünne kurze Stäbchen.

Die Bestätigung von Listeria monocytogenes erfolgte mit Prüfung der Hämolyse-Reaktion,

des Kohlenhydratabbaus und nach Durchführung des CAMP-Tests (s. Tab. 2).

Die Hämolyseeigenschaft wurde bestimmt, indem Columbia SchafblutPLUS Agar mit

verdächtigen Kolonien beimpft wurde. L. monocytogenes zeigte nach der Bebrütung enge,

klare und helle Hämolysezonen (β-Hämolyse).

Zur Durchführung des CAMP-Tests wurden verdächtige Kolonien jeweils rechtwinklig zu

einem Staphylococcus aureus (S. aureus)- und einem Rhodococcus equi (R. equi)-Impfstrich

auf Columbia SchafblutPLUSAgar ausgestrichen. Der Ausstrich erfolgte in der Weise, dass

sich die Impfstriche von Prüfstamm und S. aureus sowie R. equi nicht berührten und ein

Abstand von etwa 1 mm bis 2 mm bestand. War an der Schnittstelle zwischen der Verdachts-

kultur und S. aureus nach spätestens 18 Stunden Inkubation bei 37°C eine β-Hämolysezone

(CAMP-Phänomen) entstanden, wurde die Reaktion als L. monocytogenes-positiv beurteilt.

Diese kleine, abgerundete β-Hämolysezone dehnt sich vom Prüfstamm bis zu 2 mm in die nur

schwach hämolytische Zone der S. aureus-Kultur aus.

Die Kohlenhydrat-Bouillons wurden jeweils mit einer Öse mit TSYEA-Koloniematerial

(anstelle einer Öse mit TSYEB-Kultur) beimpft und bis zu 2 Tage bei 37°C bebrütet. Die

Bebrütungsdauer kann nach der amtlichen Vorschrift auf bis zu 5 Tage erhöht werden.

L. monocytogenes bildet als positive Reaktion Säure aus Rhamnose (Gelbfärbung der

Bouillon). Keine Säurebildung findet statt in der Xylose-Bouillon, die ihre ursprüngliche

violette Färbung behält.


62

3.2.2 Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA

Nach Angaben des Herstellers ist der Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA für alle

Lebensmittel wie Fleisch-, Fisch- und Milchprodukte und Gemüse geeignet. Für den

zeitlichen Aufwand werden 48 Stunden für die Inkubation der selektiven Anreicherung

angegeben. Bei 106 – 107 KbE ml-1 Anreicherungsbouillon ist dann der Nachweis innerhalb

von ca. 3 Stunden möglich. Insgesamt beträgt die vorgesehene Dauer für den Listeria

monocytogenes-Nachweis mittels Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA 51 Stunden.

Der ELISA wird in den mit Antikörpern beschichteten Kavitäten einer brechbaren Mikro-

titerplatte durchgeführt. Die monoklonalen Antikörper richten sich gegen das Protein p60 von

Listeria monocytogenes. Auch andere kommerzielle ELISA-Systeme im Mikrotiterplatten-

format integrieren p60-spezifische Antikörper (z. B. Pathalert L. m.). Systeme in diesem

Format können auch automatisiert bearbeitet werden.

Testprinzip

Bei dem Testkit handelt es sich um einen nicht-kompetiven Sandwich-ELISA. Nach

selektiver Anreicherung werden die Zellen hitzedenaturiert. Dabei wird das zellassoziierte

p60 freigesetzt. Diese werden zuerst mit den Proben und dann mit einem Antikörper-

Konjugat beschickt. Der Sandwich-Komplex bildet sich während der Inkubationsschritte aus.

Nicht gebundene Anteile werden in den Waschschritten entfernt.

Nach Zugabe von Substrat-Lösung und Chromogen entsteht eine blaue Reaktionsfarbe. Die

Blaufärbung ist direkt proportional zur p60-Konzentration. Je intensiver die Blaufärbung

desto größer war die Listeria monocytogenes-Konzentration in der selektiven Anreicherungs-

kultur. Die weitere Intensivierung einer Blaufärbung wird gestoppt und danach die Färbung

der Lösung, die nach Zugabe der Stopplösung gelb ist, gemessen.

Testdurchführung

Nach selektiver Anreicherung erfolgte die test-spezifische Probenaufbereitung. Aus der

Erstanreicherungs- oder Zweitanreicherungskultur wurde je Probe ein- bzw. zweimal 1 ml

(= Einfach- bzw. Doppelansatz) in ein hitzebeständiges Röhrchen (2 ml-Eppendorf-

Reaktionsgefäß) überführt. Die Proben wurden darin für genau 20 Minuten bei 100°C

(Wasserbad) denaturiert und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt.


63

Sowohl die Reagenzien als auch die Mikrotiterplatte wurden zunächst auf 18 - 25°C

temperiert (Raumtemperatur). Flascheninhalte wurden vor der Entnahme gemischt.

Für Schritt 1 wurden das Reagenz für die Negativkontrolle (bestehend aus Fraser-Bouillon)

zu je 100 µl in zwei Kavitäten und das Reagenz für die Positivkontrolle (bestehend aus

Listeria monocytogenes-Antigen) zu 100 µl in eine Kavität gegeben. Von den denaturierten

Proben wurden je 100 µl in eine Kavität des Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA

pipettiert. Die Abdeckplatte wurde auf die Mikrotiterplatte gelegt und der Inhalt in den

Kavitäten sorgfältig durch kreisende horizontale Bewegungen mit und gegen den Uhrzeiger-

sinn gemischt. Zur Inkubation wurde die Mikrotiterplatte für 1 Stunde in den 37°C-Brut-

schrank verbracht. Das Monocytogenes-spezifische Antigen p60 bindet an die Antikörper, mit

denen die Kavitäten beschichtet sind.

In Schritt 2 wurden als Konjugat Antikörper gegen das p60-Protein hinzugegeben. Dazu

wurden 100 µl des Reagenz in jede Kavität pipettiert. Wie im ersten Schritt erfolgte das

sorgfältige Mischen und die Bebrütung (37°C, 1 Stunde). Das Antikörperkonjugat bindet an

p60, das bereits über Antikörper an die Kavität gebunden wurde (= Bildung des Sandwich-

Komplexes).

Sowohl nach dem ersten als auch nach dem zweiten Schritt wurden die Kavitäten geleert und

nicht-gebundene Antigene bzw. Antikörper in Waschschritten entfernt. Bei jedem Waschen

wurden alle Kavitäten fünfmal bis zum Rand mit Waschpuffer gefüllt (kräftiger Strahl) und

wieder geleert, und schließlich auf saugfähigem Papier trockengeklopft.

Der dritte Schritt bestand aus der Zugabe von je 100 µl einer 1:1-Mischung aus Substrat

(Harnstoffperoxid-Lösung) und Chromogen (Tetramethylbenzidin-Lösung). Die 30-minütige

Inkubation erfolgte abgedunkelt bei Raumtemperatur (18 – 25 °C). Mit der Reaktion

zwischen Sandwich-Komplex und Substrat-Chromogen-Lösung entsteht eine blaue Färbung,

die der Listeria monocytogenes-Konzentration in der beprobten Anreicherungskultur direkt

proportional ist. Nach der Inkubation wurde die Reaktion inhibiert, indem 1 M Schwefelsäure

(je 100 µl „Stopp-Lösung“) zugegeben wurde. Dabei entsteht eine Gelbfärbung der

Testlösung, die zu der vorherigen Blaufärbung proportional ist.

Das Messen in dem gegen Luft eingestellten Mikrotiterplatten-Reader erfolgt bei 450 nm.


64

3.2.3 PCR

Im Rahmen der molekularbiologischen Methode wurde in Anlehnung an die Vorschriften der

Amtlichen Sammlung von Untersuchungsmethoden nach § 35 LMBG (L 00.00-52 und

L 00.00-45) und in Anlehnung an die Arbeitsvorschriften des Herstellers gearbeitet.

Zur Steigerung der Anzahl lebensfähiger Bakterien, Verdünnung nicht-lebensfähiger

Bakterien und potentieller PCR-Inhibitoren wurde initial eine selektive kulturelle

Anreicherung vorgenommen. Dafür wurde das Probenmaterial in einen Stomacherbeutel

eingewogen und im Verhältnis 1:10 (Masse zu Volumen) mit Halbfraser-Bouillon verdünnt.

Nach dem Mischen von Probenmaterial und Anreicherungsflüssigkeit mit Hilfe eines

Stomachers und nach dem Überführen von 50 g des verdünnten Probenmaterials in einen

weiteren Stomacherbeutel erfolgte die Inkubation bei 37°C.

DNA-Extraktion

Nachdem das Untersuchungsmaterial verdünnt und inkubiert worden war, folgte anschließend

die Extraktion der Desoxyribonukleinsäure (DNA) mit Hilfe der sog. CTAB-Methode.

Durchführung der DNA-Extraktion:

Für die DNA-Extraktion wurde jeweils ein Probenvolumen von 1 ml aus der

Erstanreicherungskultur entnommen und in ein 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt.

Damit Keime und Verdünnungsflüssigkeit getrennt werden konnten, wurde die Erst-

anreicherungskultur zunächst bei 10 000 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Nach dem

Zentrifugieren konnte der Überstand über dem Keimsediment verworfen werden.

In einigen Fällen, in denen das Keimsediment durch Rückstände aus der Erst-

anreicherungskultur stark verunreinigt erschien, folgte dann ein Waschschritt. Das Keim-

sediment wurde mit 1 ml physiologischer Kochsalzlösung in Suspension gebracht und der

erste Zentrifugationsschritt und das Verwerfen des Überstandes wiederholt.

Zur Freisetzung der DNA aus den Zellen wurden Enzyme zugesetzt. Dazu wurde das

Keimsediment in 1 ml CTAB-Puffer gründlich suspendiert. Es wurden 50 µl Lysozym sowie

50 µl RNAse hinzugegeben und kurz gevortext.


65

Bei 37°C wurde die Probe mindestens 1 Stunde bebrütet.

Nach Zugabe von 25 µl Proteinase K und kurzem Vortexen wurde die Probe im Heizblock bei

65°C für mindestens 1 Stunde bebrütet. Danach lag die DNA in freier Form in der Probe vor.

Zur Entfernung der Nicht-DNA-Bestandteile wurde die Probe auf dem Vortex gemischt

und dann kurzzeitig zentrifugiert. Als organisches Lösungsmittel wurde Chloroform (700 µl)

mit der Probe durch Vortexen bei mittlerer Intensität für einige Sekunden vermengt. Die

Phasentrennung wurde mit einer 15-minütigen Zentrifugation bei 10 000 x g beschleunigt.

Wenn sich eine starke Interphase ausgebildet hatte, wurde die Aufreinigung der DNA mit

Chloroform wiederholt.

Die obere, wässrige, DNA-enthaltende Phase wurde in ein neues 2 ml-Eppendorf-Reaktions-

gefäß überführt.

Zur Konzentrierung der DNA wurden im Verhältnis 10:1 Isopropanol (750 µl) und

Natriumacetat (75 µl) zugesetzt. Nach kurzem Schütteln fiel die DNA für mindestens

30 Minuten bei Raumtemperatur aus. Durch Zentrifugieren (10 000 x g, 15 Minuten) wurde

die DNA pelletiert und anschließend der Überstand verworfen.

Um das relativ wenig flüchtige Isopropanol von der extrahierten Probe zu trennen, wurde das

besser flüchtige Ethanol (70 – 75 %ig, 500 µl) zugegeben, zentrifugiert (10 000 x g, 5 min)

und der Überstand möglichst vollständig entfernt. Das Reaktionsgefäß wurde mit offenem

Deckel in den Heizblock (60°C) gestellt, bis das DNA-Pellet trocken war.

Das DNA-Pellet wurde in 100 µl Pufferlösung (0,2x TE-Puffer) suspendiert. In dieser Form

konnte das DNA-Extrakt direkt verwendet oder bis zur weiteren Verwendung bei –18°C

tiefgefroren gelagert werden.

Fertigstellen des Reaktionsansatzes für die Multiplex-PCR (mit nachfolgender Agargel-

Elektrophorese)

Hier wurde der PREMaster LID-C/A (Listeria Duplex) der Firma Genescan Analytics

GmbH eingesetzt. Dieser PCR-Mastermix enthielt zwei Primerpaare, mit deren Hilfe zwei

verschiedene PCR-Produkte (148 bp und 234 bp) amplifiziert wurden.


66

Die Amplifikate stellten Fragmente der Monocytogenes-spezifischen Metalloprotease-Gene

und Hämolysin-Gene dar.

Der PCR-Reaktionsansatz wurde aus folgenden Komponenten fertiggestellt (pro PCR-

Reaktion):

19,7 µl PREMaster LID-C/A (Listeria Duplex)

0,3 µl Hot Star Taq Polymerase (5 U/µl)

5,0 µl DNA-Extrakt der Probe

Um sicherzustellen, dass es während der DNA-Extraktion und nachfolgend zu keiner

Kontamination mit Ziel-DNA gekommen und der PCR-Reaktionsansatz einwandfrei zusam-

mengesetzt worden war, wurden zusätzlich je eine Positiv- sowie eine Negativkontrolle

präpariert.

Zusammensetzung des PCR-Reaktionsansatzes für die Positivkontrolle:



5,0 µl aqua dest.

0,1 µl Kontroll-DNA

Zusammensetzung des PCR-Reaktionsansatzes für die Negativkontrolle:



5,0 µl aqua dest.

Amplifikationskontrollen im Sinne einer Prüfung auf Inhibition der Vervielfältigung der

DNA durch Bestandteile im PCR-Reaktionsansatz wurden durchgeführt.

Zusammensetzung des PCR-Reaktionsansatzes für die Amplifikationskontrolle:




0,1 µl Kontroll-DNA

Verwendete PCR-Reaktionsgefäße waren Achterstreifen oder Mµlti®-Ultra Tubes und fassten

ein Volumen von 0,2 ml.


67

Amplifikation (Vervielfältigung der DNA)

In jedem Fall wurde die PCR mit dem Thermocycler unter folgenden Bedingungen durch-

geführt (Tab. 13):

Tab. 13: Funktionen der einzelnen Zyklen und Temperatur-Zeit-Profil.

Zyklen Funktion Temperatur Zeit

Zyklus 1 Denaturieren der Ziel-DNA-Doppelstränge

Aktivieren der Taq Polymerase

94°C 15 min

Zyklus 2 - 41 DNA-Denaturierung

Annealing (Bindung der Primer) Elongation (Synthese durch Taq Polymerase)

94°C

60°C

72°C

30 sec 1 min 1 min 20 sec

Zyklus 42 Elongation unvollständiger PCR-Produkte 72°C 7 min

Nach Abschluß des zyklischen PCR-Vorgangs wurden die Amplifikate auf eine Temperatur

von 4°C abgekühlt.

Agargel-Elektrophorese

Zur Detektion der PCR-Produkte (Amplifikate) wurde eine Agargel-Elektrophorese

durchgeführt.

Mit dieser wurden die Amplifikate anhand ihrer Größe in einem 2%igen bzw. 2,5%igen

Agarosegel aufgetrennt. Durch Zusatz von Ethidiumbromid wurden die Amplifikate sichtbar.

Die Gele wurden hergestellt, indem Agarose (6,0 bzw. 7,5 g) in 300 ml 1x TBE-Puffer

suspendiert und in einem 500 ml-Becherglas auf einem Magnet-Heizrührer für 1 Stunde bei

200°C gelöst wurden. Der Magnet-Heizrührer war dabei auf 300 – 450 Umdrehungen pro

Minute eingestellt. Anschließend wurde das Agarose-1x TBE-Puffer-Sol zur Abkühlung auf

einen Magnetrührer gestellt, und es wurden 7,5 µl Ethidiumbromid zugesetzt.


68

Nach etwa 30 Minuten konnte das ausreichend abgekühlte Agarose-1x TBE-Puffer-Sol in

eine Gelgießkammer gegossen werden.

Dieses geschah vorsichtig, um zum einen eine Blasenbildung im Gel und zum anderen eine

Belastung der Gelgießkammer durch zu hohe Temperaturen zu vermeiden. In die Gel-

gießkammer waren vier Kunststoffkämme (mit 20, 30 oder 42 Zähnen) eingesetzt. Nachdem

das Agarose-1x TBE-Puffer-Sol abgekühlt und zu einem Gel erstarrt war, wurden die

Kunststoffkämme entfernt und das Gel geviertelt. Die einzelnen Gelviertel wurden für die

Agargel-Elektrophorese verwendet.

Die Gelviertel wurden so in die mit 1x TBE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammer gelegt,

dass die Kavitäten des Gels alle mit 1x TBE-Puffer volliefen. Die PCR-Produkte wurden mit

einer Pipettenspitze Blaumarker durchmischt, und 7 µl bis 10 µl von den Amlifikat-

Blaumarker-Gemischen wurden in die Gelkavitäten pipettiert.

An die Elektrophoresekammer wurde eine elektrische Spannung von 200 Volt angelegt, die

für 30 Minuten gehalten wurde. Die amplifizierten DNA-Fragmente (und zusätzlich der

DNA-Längenstandard pUC 19/MSP I) wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen Länge und

der damit einhergehenden Unterschiede in der elektrischen Ladung aufgetrennt.

Nach der Elektrophorese folgte die Fluoreszenz-Detektion zur Darstellung der Amplifikate.

Dafür wurde das Gel auf den Transilluminator gelegt, und durch das Ethidiumbromid, das mit

der DNA interkaliert, konnten gesuchte Fragmente in Form von Banden visualisiert werden.

Die Dokumentation erfolgte mittels Polaroidfotografie.

Eine Probe, die eine Bande aus PCR-Produkten mit einer Länge von ca. 190 bp und außerdem

eine zweite Bande aus PCR-Produkten mit einer Länge von ca. 242 bp aufzuweisen hatte,

wurde unter Beachtung der Banden der Positivkontrolle als Listeria monocytogenes-positiv

beurteilt.


69

3.2.4 NUTRI®-Chip

Bei dem NUTRI®-Chip handelt es sich um einen Microarray, der für den parallelen Nachweis

von Listeria monocytogenes, Salmonella spp. und Campylobacter jejuni bzw. coli in

Lebensmitteln konzipiert wurde.

Im Vorfeld des Nachweises werden die spezies-spezifischen DNA-Abschnitte der nachzu-

weisenden Mikroorganismen simultan in einer einzigen PCR-Reaktion (Multiplex-PCR)

vervielfältigt. Dabei erkennen hochspezifische PCR-Primerpaare die für die einzelnen Ziel-

keime charakteristischen Gene, d. h. Gene, die nur in den gesuchten Mikroorganismen vor-

kommen. Die doppelsträngigen Amplifikate werden in Einzelstränge überführt (Einzelstrang-

verdau), wodurch die Hybridisierungsrate gesteigert wird. Die einzelsträngigen PCR-

Reaktionsprodukte werden direkt auf die Hybridisierungsregion des NUTRI®-Chip (Array)

gegeben, wo sie mit den Sonden hybridisieren können (Tab. 14). Nach Färben der

hybridisierten DNA, die Biotin-markierte dNTPs enthält, mit dem Fluoreszenzfarbstoff

Streptavidin-Cy5 wird der Farbstoff mit Laserstrahlen zur Fluoreszenz angeregt. Der

BioChip-Analysator (BioDetect 645TM) detektiert die Fluoreszenzsignale und visualisiert die

Hybridisierung. Die Auswertung erfolgt mit Hilfe einer Software oder visuell.

Verschiedene Kontrollsysteme (Kopplungskontrollen, Färbekontrollen und Hybridisierungs-

kontrollen), die zusätzlich in den Array integriert sind, ermöglichen die Prüfung hinsichtlich

der Drucktechnik, die Prüfung der Färbung im Verlauf des Nachweises und die Prüfung der

stattgehabten Hybridisierung.

Interne Positivkontrollen (oder auch „Inhibitionskontrollen“) verhindern, dass falsch-negative

Ergebnisse unerkannt bleiben, die z. B. durch Inhibition der Amplifikation entstehen können.

Für die internen Positivkontrollen enthält der PCR-Mastermix die sogenannten „Internen

Standards“. Dabei handelt es sich um DNA-Abschnitte der Zielkeime, die in einer nicht-

inhibierten PCR-Amplifikation immer (auch bei Nichtvorhandensein eines Zielkeims in einer

Probe) vervielfältigt und anschließend als Amplifikate visualisiert werden.


70

Tab. 14: Hybridisierungsregion des Microarrays: Anordnung der verschiedenen Sonden und ihre Funktionen.

KK KK KK KK

Salm spp.

Salm spp.

C. coliC. jej.

C. coliC. jej.

L. m. A

L. m. A

L. m. B

L. m. B

Salm PK

Salm PK

CampPK

CampPK

L. m. A PK

L. m. A PK

L. m. B PK

L. m. B PK

FK FK FK FK

Pos. HK

Pos. HK

Neg. HK

Neg. HK

KK KK KK KK

Salm spp.

Salm spp.

C. coliC. jej.

C. coliC. jej.

L. m. A

L. m. A

L. m. B

L. m. B

Salm PK

Salm PK

CampPK

CampPK

L. m. A PK

L. m. A PK

L. m. B PK

L. m. B PK

FK FK FK FK

Pos. HK

Pos. HK

Neg. HK

Neg. HK

Sonden: L. m. A = spezifisch für Listeria monocytogenes (Virulenzgen A) L. m. B = spezifisch für Listeria monocytogenes (Virulenzgen B) Salm spp. = spezifisch für Salmonella spp. C. coli / C. jej. = spezifisch für Campylobacter coli resp. jejuni PK = Positivkontrolle HK = Hybridisierungskontrolle FK = Färbekontrolle KK = Kopplungskontrolle


71

Kulturelle Anreicherung

s. 3.2.3

DNA-Extraktion

s. 3.2.3

Fertigstellen des Reaktionsansatzes für die Multiplex-PCR (nachfolgende Detektion mittels

Biochip-Technologie)

Hier wurde der PCR-Mastermix des NUTRI®-Chip-Testkits der Firma Genescan Analytics

GmbH eingesetzt. Dieser PCR-Mastermix enthält mehrere Primerpaare (= Multiplex-PCR),

mit deren Hilfe folgende PCR-Produkte amplifiziert wurden:

- Listeria monocytogenes-spezifische Amplifikate 1. 148 bp

2. 234 bp

- Salmonellen-spezifische Amplifikate 424 bp

- Campylobacter-spezifische Amplifikate 453 bp

- Interne Kontrollstandards: ITS (Listeria moncytogenes) 186 bp plus 252 bp

ITS (Salmonella) 493 bp

ITS (Campylobacter) 597 bp

Für eine PCR-Reaktion wurde der PCR-Reaktionsansatz aus folgenden Komponenten fertig-

gestellt:

19,0 µl PCR-Mastermix des NUTRI®-Chip-Testkits

1,0 µl Interne Kontrollstandards des NUTRI®-Chip-Testkits


Die Listeria monocytogenes-spezifischen Amplifikate spiegeln Sequenzen des Erreger-

Genoms, die jeweils Monocytogenes-spezifische Enzyme bzw. Proteine kodieren

(Metalloprotease-Gene und Hämolysin-Gene). Verwendete PCR-Reaktionsgefäße waren

Mµlti®-Ultra Tubes und fassten ein Volumen von 0,2 ml.

Amplifikation

s. 3.2.3


72

NUTRI®-Chip-Analyse

Zur Detektion der Amplifikate wurde eine NUTRI®-Chip-Analyse durchgeführt. Nachdem

die Amplifikate zu Einzelsträngen verdaut worden waren, wurden diese nach Hybridisierung

mit spezifischen Sonden gefärbt und visualisiert.

Einzelstrangverdau

1. 4,0 µl Exonukleasepuffer (5x) wurden in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß pipettiert und mit

16,0 µl des PCR-Produktes versetzt und sorgfältig gemischt.

2. Nach Zugabe von 1,0 µl Exonuklease war der Ansatz zum Einzelstrangverdau sorgfältig

zu mischen.

3. Durch direkt anschließendes Inkubieren im Heizofen bei 37°C für 15 Minuten wurde die

Effektivität des Exonuklease-Umsatzes optimiert.

4. Sofort danach wurde das Enzym im Heizblock Temperaturen von 80°C für 5 Minuten

ausgesetzt, um es zu deaktivieren.

5. Das Reaktionsgemisch mit den nun einzelsträngigen PCR-Produkten wurde kurz zentri-

fugiert.

Hybridisierung

1. Von der Hybridisierungslösung, die bis ca. 37°C erwärmt worden war, wurden 6,0 µl in

ein ebenfalls vorgewärmtes 1,5 ml-Eppendorfgefäß pipettiert.

2. Aus dem Reaktionsgemisch des Einzelstrangverdaus wurden 6,0 µl entnommen und in

die 6,0 µl Hybridisierungslösung überführt sowie mit dieser vermischt.

3. Dieser Hybridisierungsansatz mit einem Volumen von 12,0 µl wurde im Heizblock bei

80°C für 5 Minuten denaturiert.

4. Es folgte ein kurzes Zentrifugieren des Hybridisierungsansatzes.

5. Von dem Hybridisierungsansatz wurden 10,0 µl auf die Hybridisierungsregion (Array)

des NUTRI®-Chips gegeben, und zwar in der Weise, dass keine Bereiche, in denen

Sonden gekoppelt wurden, beschädigt werden konnten.


73

6. Mit einem Deckglas und einer Dichtung aus Fixogum®-Klebstoff wurde die Hybridi-

sierungsregion vom äußeren Milieu isoliert.

7. Hybridisierung: In einer feuchten Kammer wurden die NUTRI®-Chips bei 60°C im

Wasserbad für 15 Minuten inkubiert.

8. In Waschschritten wurde die Hybridisierungsregion von nicht-gebundenen bzw. nicht-

spezifischen Nukleinsäuren gereinigt: Nach dem Entfernen des Deckglases erfolgte in

einer Färbeküvette ein dreimaliges Waschen à 5 Minuten mit der Waschlösung I/A.

Färben

1. Mit Waschlösung II/B wurden die NUTRI®-Chips kurz gewaschen, anschließend wurde

die Hybridisierungsregion durch Klopfen der NUTRI®-Chips auf saugfähigem Papier

weitestgehend von Resten der Waschlösung befreit.

2. 15,0 µl Färbelösung wurden auf die Hybridisierungsregion aufgetragen. Mit einem Deck-

glas wurde die Hybridisierungsregion vorsichtig abgedeckt.

3. Nach dem Deponieren in einer feuchten Kammer wurden die NUTRI®-Chips für

30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert (Färbung).

4. In Waschschritten wurde die Hybridisierungsregion von überschüssiger Färbelösung

gereinigt: Nach dem Entfernen des Deckglases erfolgte in einer Färbeküvette ein

dreimaliges Waschen à 5 Minuten mit der Waschlösung II/B. Nachfolgend wurden die

NUTRI®-Chips kurz in destilliertem Wasser gewaschen.

5. Das Trocknen der NUTRI®-Chips wurde in einem Luftstrom aus synthetischer Luft vor-

genommen.

Messung, Visualisierung und Auswertung

Mit Hilfe des Biodetect 645TM wurden die Messwerte ermittelt. Die Belichtungszeit betrug

160 Sekunden. Messung, Visualisierung und Auswertung wurden mit den Software-

Programmen „BioChip Reader Control“ bzw. „Signalyse“ unterstützt.


74

3.3 Versuche

3.3.1 Dotieren von Schweinehackfleisch mit Listeria monocytogenes sowie mit Listeria

innocua

3.3.1.1 Prüfung der Anreicherungsbedingungen zur Erzielung bestimmter

Listeria monocytogenes-Konzentrationen

Für die künstliche Kontamination von Hackfleisch wurden bestimmte L. monocytogenes-

respektive L. innocua-Konzentrationen benötigt. Mit diesem Versuch sollte überprüft werden,

ob eine 20-stündige Inkubation des Erregers in TSYE-Bouillon (TSYEB) bei 37°C eine

Keimkonzentration zwischen 1,0 und 4,0 x 109 KbE ml-1 Anreicherungsbouillon ermöglicht.

In die raumtemperierte TSYEB wurde mit einer Impföse Koloniematerial des Teststammes

eingebracht, indem die Kultur zunächst mit etwas Flüssigkeit am Reagenzglasrand verrieben

und dann in die 10 ml abgeschwemmt wurde. Anschließend wurde die Suspension

homogenisiert und für 20 Stunden bei 37°C inkubiert.

Nach 20 Stunden Inkubation wurde von der Anreicherungskultur eine dezimale Verdünnungs-

reihe (bis zur 8. Verdünnungsstufe) hergestellt, damit die Gesamtkeimzahl ermittelt werden

konnte.

Dazu wurde die Anreicherungskultur durchmischt und mit einer Pipette 1 ml entnommen und

in ein Röhrchen mit 9 ml steriler physiologischer NaCl-Lösung gegeben

(1. Verdünnungsstufe). Aus diesem Röhrchen wurde wiederum nach Durchmischen 1 ml in

ein weiteres Röhrchen überführt (2. Verdünnungsstufe). Dieser Vorgang wurde wiederholt

(bis zur 8. Verdünnungsstufe).

Die Verdünnungsstufen 6 bis 8 (103 bis 101 KbE ml-1) wurden zur Bestimmung der

Keimkonzentration mittels Plattengussverfahren verwendet. Jeweils 1 ml einer Verdünnungs-

stufe wurde in eine Petrischale (92 mm x 16 mm) pipettiert und mit ca. 10 ml flüssigem

Standard-I-Agar vermischt (Doppelansatz).


75

Das erstarrte Nährmedium wurde bei 37°C eingestellt. Nach 18 bis 24 Stunden Inkubation

wurden die gewachsenen kolonienbildenden Einheiten ausgezählt und die Keimkonzentration

berechnet.

Die Gesamtkeimzahl der Anreicherungskultur (GKZ der Verdünnungsstufe 0; GKZ0) wurde

mit folgenden Formeln berechnet:

Σ a 1) ā = n1 · 1 + n2 · 0,1

ā gewogenes arithmetisches Mittel der Koloniezahlen

Σ a Summe der Kolonie-bildenden Einheiten aller ausgezählten Petrischalen

(niedrigste und nächst höhere Verdünnungsstufe)

n1 Anzahl von ausgezählten Petrischalen der niedrigsten Verdünnungsstufe

n2 Anzahl von ausgezählten Petrischalen der nächsthöheren Verdünnungsstufe

2) GKZ0 = ā · d

d Faktor der niedrigsten ausgezählten Verdünnungsstufe

3.3.1.2 Herstellen einer TK-Keimbank mit einem Freezing Medium

Mit Hilfe eines „Freezing Mediums“ (1x FM), einer Lösung, die Bakterienzellen während des

Tiefgefrierens schützt, wurden tiefgefrorene Keimsuspensionen (= halbe Stammkulturen) in

Aliquoten von 1 ml hergestellt. Jede halbe Stammkultur enthielt bekannte Anzahlen von

Keimen. Die Lagerung erfolgte bei –20°C. Nach Auftauen einer Portion konnte diese direkt

für das Dotieren benutzt werden.


76

Anreicherung

Ein Teststamm wurde in 10 ml TSYE-Bouillon bei 37°C für 20 Stunden angereichert. Danach

enthält die Anreicherungskultur regelmäßig log 9 KbE Listeria monocytogenes (etwa 1 – 3 x

109 KbE) pro ml.

Eine dezimale Verdünnungsreihe (bis zur 8. Verdünnungsstufe) wurde hergestellt, und zur

Bestimmung der Keimkonzentration wurde die Plattengusstechnik angewandt (s. o.).

Herstellung einer halben Stammkultur

Aus der Verdünnungsstufe 10-6 (ca. 1.000 bis 3.000 KbE L. m.) wurde je 1 ml in 2,0 ml-

Eppendorf-Reaktionsgefäße pipettiert.

Anschließend wurden die Reaktionsgefäße für 12 Minuten bei 5.000 x g zentrifugiert. Der

Überstand wurde verworfen, wobei das Entnehmen des Überstandes vorsichtig zu erfolgen

hatte (nicht-erkennbares Pellet). Das Pellet wurde mit 250 µl des 1x FM in Suspension

gebracht. Die Keimsuspension wurde bei –20°C tiefgefroren.

Zur Überprüfung der Herstellung wurde jeweils eine kleine Anzahl der tiefgefrorenen

Keimsuspensionen aufgetaut, und die Keimkonzentrationen wurden mit dem Platten-

gussverfahren bestimmt.

3.3.1.3 Dotieren (künstliche Kontamination)

Präparation einer Listeria monocytogenes-Brillantschwarz-Suspension

Für das Beimpfen wurde eine halbe Stammkultur von Listeria monocytogenes mit einer

Anzahl von x mal 103 koloniebildenden Einheiten bei Kühlschranktemperatur aufgetaut. Die

halbe Stammkultur mit einem Volumen von 0,25 ml wurde in 9,0 ml physiologische

Kochsalzlösung, die mit 0,005 g Brillantschwarz (Lebensmittelfarbstoff, Zusatzstoff E 151)

versetzt war, überführt. Das Behältnis der halben Stammkultur wurde mit 0,75 ml

physiologischer Kochsalzlösung gespült, und die Waschlösung wurde ebenfalls überführt

(= Listeria monocytogenes-Brillantschwarz-Suspension). Die Keimsuspension wurde auf dem

Vortex homogenisiert.


77

Als Alternative zur halben Stammkultur wurde in einigen Versuchen eine frische Listerien-

Anreicherungskultur verwendet. Listeria monocytogenes respektive Listeria innocua wurden

dazu in 10 ml TSYEB für 20 Stunden bei 37°C bebrütet. Nachfolgend wurde eine dezimale

Verdünnungsreihe erstellt. Zur Kontrolle der Keimkonzentration in der Anreicherungskultur

wurde diese mittels Plattengusstechnik bestimmt. 1 ml der 6. Verdünnungsstufe (log 3 KbE)

wurde anstelle einer halben Stammkultur für die Herstellung der Listerien-Brillantschwarz-

Suspension benutzt.

Dotieren des Hackfleisches

Mit einer 10 ml-Pipette wurde die homogenisierte Listerien-Suspension möglichst

gleichmäßig über die 80 g Hackfleisch verteilt.

Vorversuche ergaben, dass das 2-minütige Walken im Beutel-Walk-Gerät (Stomacher 400)

bei normaler Intensität (für die Probenvorbereitung üblich) n i c h t zu einer gleichmäßigen

Blaufärbung (= Homogenität) des beimpften Hackfleisches führte. Deshalb wurde der

Mischvorgang wie folgt durchgeführt:

Die beimpfte Probe wurde zunächst manuell vorgemischt und dann 1 Minute mit normaler

Intensität maschinell gewalkt. Das Gemenge wurde visuell auf Homogenität überprüft, ggf.

manuell gemischt und nochmals maschinell 1 Minute mit normaler Intensität gewalkt.

Wenn das Brillantschwarz eine gleichmäßige Blaufärbung des Hackfleisches hervorrief, und

wenn außerdem keine freie Flüssigkeit mehr beobachtet wurde, dann konnte von einer

homogenen künstlichen Kontamination des Gemenges ausgegangen werden. Das beimpfte

Hackfleisch (80 g Hackfleisch plus 10 ml Listeria monocytogenes-Brillantschwarz-

Keimsuspension = 90 g beimpftes Hackfleisch) wurde in Portionen von 10 g bzw. 25 g

aufgeteilt.


78

3.3.1.4 Überprüfung des Einflusses von Brillantschwarz auf das Wachstum von

Listerien

Damit ausgeschlossen werden konnte, dass der Zusatzstoff Brillantschwarz hemmende

Wirkungen auf das Wachstumspotential von Listerien ausübt, wurde dessen Einfluß

überprüft. Dazu wurde Listeria monocytogenes mit physiologischer NaCl-Lösung in

Suspension gebracht und mit einem Spatel zweimal auf TSYE-Agar ausgestrichen.

Auf eine der beimpften Agarplatten wurde zusätzlich viermal 1 Tropfen einer 0,05 %igen

Brillantschwarzlösung (5,0 mg Brillantschwarz in 9,0 ml physiologischer NaCl-Lösung)

gegeben. Die beimpften Agarplatten wurden 24 respektive 48 Stunden bei 37°C bebrütet, und

anschließend wurde das Bakterienwachstum beurteilt.


Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode

3.3.2.1 Ermittlung des Zeitaufwandes

Das kulturelle Referenzverfahren für den Nachweis von Listeria monocytogenes ist im

Allgemeinen dafür bekannt, dass es sowohl zeit- als auch arbeitsintensiv ist. Mit dem

folgenden Versuch wurde ermittelt, wie hoch der zeitliche Aufwand für den sicheren

Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch ist.

Zu diesem Zweck wurden Hackfleisch-Portionen von je 80 g mit einer bestimmten Anzahl

koloniebildender Einheiten von L. monocytogenes, suspendiert in einer Lösung aus

physiologischem Kochsalz und Brillantschwarz, beimpft. 10 ml einer L. monocytogenes-

Brillantschwarz-Keimsuspension setzten sich wie folgt zusammen:

9 ml physiologische Kochsalzlösung plus 5 mg Brillantschwarz plus 1 ml der 6.

Verdünnungsstufe aus einer Anreicherungskultur, die nach dem Beimpfen von 10 ml

TSYEB mit Listeria monocytogenes 20 Stunden bei 37°C bebrütet worden war*.

*In Versuch 1 wurden ausnahmsweise 2 ml einer Anreicherungskultur zu 8 ml physiologischer Kochsalzlösung gegeben.


79

Direkt im Anschluß an die Herstellung der L. monocytogenes-Brillantschwarz-Keim-

suspension erfolgte das Dotieren des Hackfleisches (siehe 3.3.1.3).

Von den 90 g des beimpften Hackfleisches wurden drei Portionen von 25 g (A, B, C) ent-

nommen. Reste des kontaminierten Hackfleisches wurden verworfen.

Die 25 g-Portionen A, B und C wurden jeweils mit dem ersten flüssigen Selektivmedium

(Halbfraser) im Verhältnis 1:10 (Masse des Untersuchungsmaterials zu Volumen des

Anreicherungsmediums) verdünnt. Kontaminiertes Hackfleisch und Verdünnungsflüssigkeit

wurden mit dem Stomacher bei normaler Intensität für 1 Minute (bis zur Homogenität)

durchmischt.

Aus diesen homogenen Schweinehackfleischverdünnungen A, B und C wurden jeweils

viermal 50 g entnommen und bei 30°C für 24 Stunden inkubiert und im Folgenden als

Teilmengen 1 bis 12 gemäß dem kulturellen Referenzverfahren untersucht.

Als Negativkontrolle wurde parallel eine Verdünnung von 25 g undotiertem Hackfleisch wie

die Prüfkulturen behandelt. Damit sollte eine mögliche natürliche Kontamination des

Hackfleisches mit Listerien ausgeschlossen werden.

Je 1 ml der Listeria monocytogenes-Brillantschwarz-Keimsuspension wurde in 225 ml Halb-

fraser gegeben und als Positivkontrolle mitgeführt. Auf diese Weise wurde überprüft, ob die

Medien zur Anreicherung und Identifizierung in ausreichendem Maße bzw. effektiv genug

das selektive Wachstum von L. monocytogenes ermöglichten.


80

3.3.2.2 Spezifität der mikrobiologischen Referenzmethode für Mischkulturen mit

Listeria innocua in Schweinehackfleisch

Weil L. innocua als häufiger Begleiter von L. monocytogenes in Fleisch und Fleischprodukten

identifiziert ist, galt es in diesem Versuch, die Spezifität der mikrobiologischen

Referenzmethode bei gleichzeitiger Kontamination eines Lebensmittels mit L. monocytogenes

und L. innocua am Beispiel von Schweinehackfleisch festzustellen.

Die Listerienkontamination in 90 g dotiertem Schweinehackfleisch sollte für jede Spezies

x log 3 KbE betragen. Dafür wurde von einer TSYEB-Anreicherungskultur, die 20 Stunden

bei 37°C bebrütet worden war, eine Verdünnungsreihe erstellt. Die 6. Verdünnungsstufe

wurde zur künstlichen Kontamination des Hackfleisches herangezogen. Gleichzeitig wurde

die Keimkonzentration in der TSYEB-Anreicherungskultur mit Hilfe der Plattengusstechnik

ermittelt. Die Anzahl der dotierten Keime pro Gramm dotiertes Schweinehackfleisch wurde

dann mit Hilfe der Gesamtkeimzahl berechnet.

Hier wurden Hackfleisch-Portionen von je 80 g mit einer bestimmten Anzahl kolonie-

bildender Einheiten von L. monocytogenes sowie von L. innocua beimpft. Beide Spezies

wurden in einer Lösung aus physiologischem Kochsalz und Brillantschwarz suspendiert.

Diese Listeria monocytogenes-Listeria innocua-Brillantschwarz-Keimsuspension setzte sich

wie folgt zusammen:

8 ml physiologische Kochsalzlösung plus 5 mg Brillantschwarz plus je 1 ml der 6.

Verdünnungsstufe aus Anreicherungskulturen, die jeweils nach dem Beimpfen von 10

ml TSYEB mit Listeria monocytogenes respektive Listeria innocua 20 Stunden bei

37°C bebrütet worden war.

Nach der Erstellung der Brillantschwarz-Keimsuspension erfolgte das Dotieren des Hack-

fleisches in gleicher Weise wie unter 3.3.2.1.


81

Von den 90 g des beimpften, auf homogene Verteilung der inokulierten Keime überprüften

Hackfleisches (80 g Hackfleisch plus 10 ml Listeria monocytogenes-Listeria innocua-

Brillantschwarz-Keimsuspension) wurden drei Portionen von 25 g (a, b, c) entnommen. Reste

des kontaminierten Hackfleisches wurden verworfen.

Die 25 g-Portionen a, b und c wurden jeweils verdünnt und homogenisiert (siehe 3.3.2.1).

Aus diesen homogenen Schweinehackfleischverdünnungen a, b und c wurden jeweils viermal

50 g entnommen und bei 30°C für 24 Stunden inkubiert. Die 12 Teilmengen I bis XII wurden

im Folgenden gemäß dem kulturellen Referenzverfahren untersucht.

Als Negativkontrolle, die zum Ausschluß einer etwaigen natürlichen Kontamination des

Hackfleisches mit Listerien nötig ist, konnte hier diejenige zu dem Versuch 3.3.2.1

herangezogen werden, da die Untersuchungen unter 3.3.2.1 und dieser Versuch erstens

zeitlich parallel durchgeführt wurden und zweitens jeweils dieselbe Hackfleischcharge

verwendet wurde.

Als Positivkontrolle diente ebenfalls die unter 3.3.2.1 Beschriebene.


82


Schweinehackfleisch mittels PCR

3.3.3.1 Versuche zur Sensitivität und Spezifität der PCR

3.3.3.1.1 Sensitivität der PCR nach Anreicherung von Listeria monocytogenes in

TSYE- und Halbfraser–Bouillon

Koloniematerial des Teststammes wurde in 10 ml TSYE-Bouillon über 20 Stunden bei 37°C

angereichert, und im Anschluß wurde eine Verdünnungsreihe (bis zur Verdünnungsstufe 9)

erstellt und die Gesamtkeimzahl mit Hilfe des Plattengussverfahrens bestimmt.

Aus je 1 ml verschiedener Verdünnungsstufen wurde die DNA extrahiert (siehe 3.2.3), die

mittels L. monocytogenes-spezifischer Primer in einer Multiplex-PCR amplifiziert wurde

(siehe 3.2.3). Die Detektion der Amplifikate erfolgte in einer Agargel-Elektrophorese (siehe

3.2.3).

Analog zu dieser Vorgehensweise wurde eine weitere Untersuchung durchgeführt, bei der die

TSYE-Bouillon gegen Halbfraser -Bouillon ausgetauscht wurde.

3.3.3.1.2 Prüfung der Spezifität der PCR mit DNA von Listeria innocua

Von einer L. innocua-Reinkultur wurde 1 Öse Koloniematerial entnommen und für

20 Stunden bei 37°C in 10 ml TSYE-Bouillon bebrütet.

Die Keimzahl wurde mittels Plattengussverfahrens bestimmt. Die DNA wurde extrahiert,

amplifiziert, und die Amplifikate wurden mittels Agargel-Elektrophorese detektiert (siehe

3.2.3).


83


von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels PCR

Besondere Beachtung galt in diesem Versuch dem Zeitraum der Inkubation, nach dem

erstmals jede Probe als Listeria monocytogenes-positiv bewertet werden konnte. Dieser

Zeitraum wird als Mindestanreicherungszeit definiert. Für die Untersuchungen wurde Listeria

monocytogenes-dotiertes Schweinehackfleisch verwendet.

Dotieren des Hackfleisches

Die Kontamination sollte eine Anzahl von 30 KbE L. monocytogenes pro Gramm Hackfleisch

nicht überschreiten. Für das Dotieren (siehe 3.3.1.3) wurde eine halbe Stammkultur von

L. monocytogenes SLCC 9091 1/2a mit einer Anzahl von 2,0 x 103 KbE bei

Kühlschranktemperatur aufgetaut. Das beimpfte Hackfleisch wurde in Portionen von 10 g und

25 g aufgeteilt.

Mit raumtemperierter Halbfraser-Bouillon (90 bzw. 225 ml) wurde jede Probe neunfach

verdünnt. Jeweils 50 g der Anreicherungssuspension wurden aus den Schweinehackfleisch-

verdünnungen entnommen und bei 37°C inkubiert.

Kulturelle Anreicherung

In Vorversuchen hatten sich Inkubationszeiten von 6 und 9 Stunden als nicht ausreichend für

einen positiven Monocytogenes-Nachweis erwiesen. Ein positiver Nachweis von Listeria

monocytogenes war nach 20- bzw. 24-stündiger Anreicherung im selektiven

Anreicherungsmedium (Halbfraser) möglich. Die Anzahl Kolonie-bildender Einheiten pro

Gramm Hackfleisch betrug dabei nach dem Dotieren 42,2 (in Vorversuch I: 24 h Inkubation)

und 30,0 (in Vorversuchen II – VI: 6, 9, 20 und 24 h Inkubation).

Zur Ermittlung der Mindestanreicherungszeit betrugen die Anreicherungszeiten bis zu

18 Stunden. Die Probenahme erfolgte nach 10, 12, 14, 16 und 18 Stunden.


84

Nachweis von Listeria monocytogenes-spezifischen DNA-Sequenzen

1 ml der Anreicherungskultur wurde jeweils für die DNA-Extraktion entnommen und in 2 ml-

Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt. Nach Extraktion und Amplifikation der DNA mit der

Multiplex-PCR erfolgte zunächst eine Detektion der PCR-Produkte mittels Agargel-

Elektrophorese (siehe 3.2.3).

Die Durchführung des Versuchs erfolgte in 9-facher Wiederholung. Jede Charge Hackfleisch

wurde analog auf die Anwesenheit von Listeria monocytogenes untersucht. Die DNA-

Extrakte wurden für die Nachweisführung mittels Microarray (siehe 3.3.4.1) bei –20°C

zurückgestellt.

Berechnung der Anzahl der dotierten Keime in den Vorversuchen

Die Anzahl der Keime pro Gramm Hackfleisch wurde wie folgt bestimmt:

10 ml Keimsuspension mit x KbE L. monocytogenes + 80 g Schweinehackfleisch

= 90 g dotiertes Schweinehackfleisch

Anzahl KbE L. monocytogenes pro 90 g Hackfleisch → x KbE 90 g-1

= (x / 90) KbE g-1

x = Anzahl koloniebildender Einheiten in 1 ml Anreicherungskultur

ad Vorversuch I:

10 ml Keimsuspension enthalten 3,8 x 103 KbE L. monocytogenes

� 42,2 KbE L. monocytogenes / g Hackfleisch

ad Vorversuche II-VI:

10 ml Keimsuspension enthalten 2,7 x 103 KbE L. monocytogenes



85

3.3.4 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweine-

hackfleisch mittels Microarray


von Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels Microarray

Zur Ermittlung der Mindestanreicherungszeit (siehe 3.3.3.2) wurden die DNA-Extrakte aus

dem unter 3.3.3.2 beschriebenen Versuch herangezogen. Der Nachweis von Monocytogenes-

spezifischer DNA wurde mit der NUTRI®-Chip-Analyse (siehe 3.2.4) geführt.

3.3.4.2 Spezifität des Microarray-Nachweises für Mischkulturen mit Listeria

innocua in Schweinehackfleisch

Natürlich mit Listerien kontaminierte Lebensmittel enthalten häufig gleichzeitig Listeria

monocytogenes und Listeria innocua. Es ist daher immer wahrscheinlich, dass nach

Extraktion der DNA aus einer natürlich kontaminierten Probe neben der Monocytogenes-

DNA ebenfalls DNA von Listeria innocua in dem Extrakt vorliegt.

Zur Prüfung des Unterscheidungsvermögens der Methode wurde aus dem unter 3.3.2.2

beschriebenen Versuch von jeder der 56 Schweinehackfleischverdünnungen nach der selekti-

ven Anreicherung in Halbfraser-Bouillon eine Probe für den molekularbiologischen Nachweis

entnommen. Zusätzlich wurde von einer L. innocua-Reinkultur eine Probe entnommen, die

genauso wie die Schweinehackfleischverdünnungen behandelt wurde.

Die Probenahme erfolgte nach 24 Stunden Inkubation der Proben bei 30°C. Aus je 1 ml der

Halbfraser-Anreicherungskultur wurde die DNA extrahiert und amplifiziert (siehe 3.2.3).

Reste der Halbfraser-Anreicherungskulturen wurden in 50 ml-Sarstedt-Röhrchen überführt

und bei –20°C tiefgefroren.

Die Amplifikate wurden nach den Angaben des Herstellers mit Hilfe der NUTRI®-Chip-

Analyse auf Monocytogenes-spezifische DNA untersucht.

Es erfolgte zudem eine Prüfung der Extraktionskontrollen auf Kontamination mit Ziel-DNA.


86

3.3.5 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweine-

hackfleisch mittels ELISA

3.3.5.1 Überprüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Einflüsse auf


der vom Hersteller angegebenen Sensitivität für das Testkit

Damit ausgeschlossen werden konnte, dass der Zusatzstoff Brillantschwarz hemmende

Wirkungen auf die ELISA-Reaktionen ausübt, wurde dessen Einfluß überprüft.

Zu diesem Zweck wurde die Nachweisgrenze des ELISA mit und ohne Zusatz von

Brillantschwarz ermittelt.

Listeria monocytogenes wurde 20 Stunden in 10 ml TSYE-Bouillon bei 37°C angereichert.

Anschließend wurden von der Anreicherungskultur zwei Verdünnungsreihen bis zur

8. Verdünnungsstufe erstellt.

Während die Kulturröhrchen der Verdünnungsreihe 1 wie üblich physiologische NaCl-

Lösung enthielten, wurde jedem Kulturröhrchen der Verdünnungsreihe 2 zusätzlich 5 mg

Brillantschwarz beigefügt.

Die Verdünnungsreihen wurden erstellt, und aus den Verdünnungsstufen 1 bis 4 sowie aus der

unverdünnten Anreicherungskultur wurden Proben für den Nachweis mittels ELISA

entnommen. Die Durchführung des ELISA erfolgte nach den Empfehlungen des Herstellers.

Die Verdünnungsstufen 7 und 8 wurden zu einer Bestimmung der Gesamtkeimzahl mittels

Plattengussverfahren herangezogen.


87


von Listeria monocytogenes mittels ELISA

Der kommerziell erhältliche Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA der Firma Transia

GmbH (Artikel-Nr. 74029) wurde hier für den Nachweis von Listeria monocytogenes aus

Hackfleisch vom Schwein eingesetzt. Das Testkit besteht aus den Reagenzien und einer

Mikrotiterplatte.

Dieser Sandwich-Enzymimmunoassay weist anhand eines Listeria monocytogenes-

spezifischen Antigens (p60) die Anwesenheit des Keims in Lebensmitteln wie z. B.

Fleischprodukten nach.

In den Kavitäten der brechbaren Kavitätenstreifen, die mit Antikörpern gegen das p60

beschichtet sind, wurde der ELISA durchgeführt (siehe 3.2.2).

Im Vorfeld des Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA erfolgte die künstliche

Kontamination des Hackfleisches (siehe 3.3.1.3), die selektive Anreicherung der gesuchten

Keime und die Probenaufbereitung.

Für das Dotieren wurden halbe Stammkulturen verwendet. Bei einer sogenannten „halben

Stammkultur“ handelt es sich um ein Bakterienpellet, das mit einem „Freezing Medium“ in

Suspension gebracht wurde und bis zum Auftauen bei –20°C tiefgefroren gelagert wurde

(siehe 3.3.1.2).

Jeweils eine Portion von 80 g Schweinehackfleisch sollte mit 2 – 3 x 103 KbE Listeria

monocytogenes dotiert werden. Damit wären in 1 g Hackfleisch zwischen 22,2 und 33,3 KbE

Listeria monocytogenes enthalten.

Zunächst wurde eine L. monocytogenes-Brillantschwarz-Keimsuspension (10 ml) hergestellt.

Diese Keimsuspension wurde mit 80 g Hackfleisch möglichst homogen vermengt. Die

90 g Hackfleisch-Portion wurde anschließend in drei Teilmengen à 25 g aufgeteilt (siehe

3.3.1.3).

25 g dotiertes Hackfleisch wurden mit 225 ml Halbfraser-Bouillon verdünnt (1:10, Masse zu

Volumen) und von dieser Verdünnung 50 g zur weiteren Untersuchung entnommen.


88

Die erste selektive Anreicherung der Keime erfolgte bei 37°C. Dies stellt eine Abweichung

von der Methode nach § 35 LMBG dar, die eine Erstanreicherung in Halbfraser-Bouillon bei

einer Temperatur von 30°C vorsieht. Die Verwendung von Halbfraser-Bouillon stellt eine

Abweichung von der Herstellerempfehlung für den ELISA dar, nach der die Erstanreicherung

in L-PALCAM-Bouillon erfolgen sollte.

Anschließend wurde von verschiedenen Proben 0,1 ml in 10 ml Fraser-Bouillon überführt und

sekundär bei 37°C angereichert.

Die Probennahme erfolgte an unterschiedlichen Zeitpunkten während der Inkubation. Dabei

wurde 1 ml der Anreicherungskultur entnommen und test-spezifisch aufbereitet (Doppel-

ansatz). Der Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA wurde nach der Anleitung des

Herstellers durchgeführt (siehe 3.3.2).

Aus der Erstanreicherungs- oder Zweitanreicherungskultur wurde je Probe ein- bzw. zweimal

1 ml (Einfach- bzw. Doppelansatz) in ein hitzebeständiges Röhrchen (2 ml-Eppendorfgefäß)

überführt.


89

3.3.6 Versuche zum qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Feldproben

mittels molekularbiologischen Verfahren

3.3.6.1 Untersuchung von Listerien-positiven Feldproben mittels Agargel-

Elektrophorese und Microarray

Verschiedene Lebensmittel, i. d. R. hergestellt auf der Grundlage von tierischen Rohstoffen,

und Umweltproben waren im Gissel-Institut, Hannover, kulturell gemäß § 35 LMBG auf

Listeria monocytogenes untersucht worden. Die Zwischenlagerung der Halbfraser-

Anreicherungskulturen (24 Stunden inkubiert) erfolgte tiefgefroren (–20°C).

Von den insgesamt 71 Proben war mit der mikrobiologischen Untersuchung in 48 Proben

Listeria monocytogenes nachgewiesen worden. In einer weiteren Probe konnte die

Anwesenheit von Listeria spp. festgestellt werden. In 22 Proben hingegen konnten weder

Listeria monocytogenes noch andere Listerien-Spezies mikrobiologisch bestätigt werden.

Die aufgetauten Anreicherungskulturen wurden durchmischt, indem die Proben (in einem

50 ml-Sarstedt-Röhrchen) vorsichtig invertiert wurden.

Für die Untersuchung wurden von jeder Probe zweimal 1 ml (Doppelansatz) entnommen.

Nach der DNA-Extraktion wurden 2 verschiedene Master-Mixe (siehe 3.2.3 und 3.2.4)

bereitgestellt und die PCR (siehe 3.2.3) durchgeführt. Im Anschluß an die PCR wurden die

Amplifikate zum einen mittels Agargel-Elektrophorese und zum anderen mittels NUTRI®-

Chip-Analyse auf Monocytogenes-spezifische DNA untersucht.

Ergebnisse

90

4. Ergebnisse

4.1 Dotieren von Schweinehackfleisch mit Listeria monocytogenes sowie mit Listeria

innocua

4.1.1 Prüfung der Anreicherungsbedingungen zur Erzielung bestimmter Listeria

monocytogenes-Konzentrationen

Für die künstliche Kontamination von Hackfleisch sollten bestimmte Listeria monocytogenes-

Konzentrationen eingesetzt werden. Mit diesem Vorversuch wurde festgestellt, unter welchen

Bedingungen der Keim zu inkubieren war, damit Gesamtkeimzahlen zwischen 1,0 und 4,0 x

109 KbE pro ml Anreicherungsmedium vorlagen.

Die mittels Plattengusstechnik bzw. Spateltechnik (auf Blutagar) kultivierten Keime wurden

ausgezählt und die Gesamtkeimzahl berechnet. Damit ergaben sich die Gesamtkeimzahlen in

verschiedenen Anreicherungskulturen (Tab. 15).

Tab. 15: Gesamtkeimzahlen verschiedener Anreicherungskulturen zur Prüfung der Anreiche-rungsbedingungen.

KbE Listeria monocytogenes ml-1

AnreicherungskulturNr.

Plattengusstechnik Spateltechnik

1 1,6 x 109 1,7 x 109

2 4,0 x 109 0,9 x 109

3 3,4 x 109 3,4 x 109

4 3,8 x 109 -

Die Anreicherungsbedingungen (10 ml TSYE-Bouillon, Temperatur 37°C, Inkubationsdauer

20 Stunden) erwiesen sich als geeignet, die benötigten Keimzahlen zu erreichen.

Ergebnisse

91

Die Tatsache, dass die Auszählung von auf Blutagar gewachsenen Kolonien arbeits-

aufwendiger ist als bei der Plattengusstechnik, führte zu dem Entschluß, im folgenden mit der

einfacher zu arbeitenden Methode (Plattengusstechnik) zu arbeiten. Die Abweichung in der

ermittelten Gesamtkeimzahl für die Anreicherungskultur 2 läßt sich auf einen technischen

Fehler bei der Durchführung zurückführen; die ermittelten Gesamtkeimzahlen für die

Anreicherungskulturen 1 und 3 sprechen für eine Gleichwertigkeit der beiden Techniken.

4.1.2 Herstellen einer TK-Keimbank mit einem Freezing Medium

Jede Portion der TK-Keimbank sollte nach dem Auftauen eine Gesamtkeimzahl enthalten, die

der Gesamtkeimzahl vor dem Prozeß des Gefrierens möglichst entspricht. Von den

verschiedenen Chargen (= Gesamtheit halber Stammkulturen, die aus einer einzigen

Verdünnungsstufe einer Verdünnungsreihe hergestellt wurde) wurde von einer 1 ml-Portion

die Gesamtkeimzahl ermittelt.

Nach Auftauen der 1 ml-TK-Portionen bei Temperaturen von 6 – 8°C wurde eine

Verdünnungsreihe erstellt und die Gesamtkeimzahl mit Hilfe der Plattengusstechnik

bestimmt.

Die Gesamtkeimzahl betrug vor dem Einfrieren im Mittel 2,4 x 109 KbE je ml

Anreicherungskultur (unverdünnt). Nach dem Auftauen konnten im Durchschnitt je TK-

Portion (Verdünnungsstufe 10-6) 2,0 x 103 KbE wiedergefunden werden. Die Differenz

zwischen den Faktoren vor dem Einfrieren und den Faktoren nach dem Auftauen betrug im

Mittel 0,4 (Tab. 16).

Alle TK-Portionen entsprachen nach Auftauen hinsichtlich der Gesamtkeimzahl den

Erwartungen und enthielten zufriedenstellende Keimkonzentrationen, die sie für den Einsatz

in den Versuchen als gebrauchsfähig kennzeichneten.

Ergebnisse

92

Tab. 16: Gesamtkeimzahl von koloniebildenden Einheiten Listeria monocytogenes pro TK-Portion einer halben Stammkultur.

Charge KbE vor Einfrieren(pro ml Anreicherungskultur)

KbE nach Auftauen(pro TK-Portion)

DifferenzVOR - NACH

1 2,7 x 109 2,0 x 103 ─ 0,7

2 2,3 x 109 2,3 x 103 ± 0,0

3 2,1 x 109 1,7 x 103 ─ 0,4

4 2,3 x 109 2,1 x 103 ─ 0,2

5 2,5 x 109 1,9 x 103 ─ 0,6

6 2,3 x 109 1,8 x 103 ─ 0,5

7 2,3 x 109 1,9 x 103 ─ 0,4

Mittelwert 2,4 x 109 2,0 x 103 ─ 0,4

4.1.3 Dotieren (künstliche Kontamination) des Hackfleisches

Die homogene Verteilung der inokulierten Bakterien konnte über alle Versuche kontrolliert

erzielt werden. Dabei wurde von einer homogenen bakteriellen Verteilung ausgegangen,

wenn das Schweinehackfleisch in allen sichtbaren Teilen eine gleichmäßige Blaufärbung

angenommen hatte. Nach Unterbrechung des maschinellen Mischvorgangs und visueller

Beurteilung der Blaufärbung wurde in den meisten Fällen (wenn allzu deutlich ungefärbte

neben gefärbten Bereichen in Erscheinung traten) ein manuelles Mischen notwendig. Das

insgesamt 2-minütige Mischen im Stomacher konnte damit erfolgreich unterstützt werden.

4.1.4 Prüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Wirkungen auf das

kulturelle Wachstum von Listerien

Hemmhöfe oder Unterschiede im Bakterienwachstum unter Einfluß von Brillantschwarz nach

48 Stunden Inkubation bei 37°C wurden nicht beobachtet. Alle mit Listeria monocytogenes

beimpften TSYE-Agarplatten zeigten ein vergleichbares Wachstum des Testkeimes in Form

eines dichten Bakterienrasens.

Inhibierende Wirkungen des Zusatzstoffes Brillantschwarz auf das kulturelle Wachstum

wurden nicht festgestellt.

Ergebnisse

93

4.2 Nachweis von Listerien in Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode

4.2.1 Ermittlung des Zeitaufwandes für den qualitativen Nachweis von Listeria

monocytogenes in Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode

Um den zeitlichen Aufwand des kulturellen Referenzverfahrens in Anwendung auf

Schweinehackfleisch darzustellen, wurden 60 Schweinehackfleischverdünnungen mikrobio-

logisch untersucht.

Fünf Hackfleischportionen (Versuche 1 bis 5) zu je 80 g wurden mit dem Erreger dotiert und

enthielten danach zwischen 13,4 und 57,8 KbE pro Gramm. Von den dotierten Hackfleisch-

portionen wurden jeweils dreimal 25 g entnommen. Die drei 25 g-Portionen wurden verdünnt

und von jeder Verdünnung 4 Teilmengen entnommen. Auf diese Weise standen 60 Schweine-

hackfleischverdünnungen für die weitere Untersuchung zur Verfügung.

Die Anwesenheit von Listeria monocytogenes wurde in allen 60 dotierten Schweinehack-

fleischverdünnungen positiv bestätigt. Die Nachweisquote betrug 100 %. Das Ergebnis lag

jeweils nach 5 Untersuchungstagen vor.

Bei den parallel durchgeführten Untersuchungen der Negativkontrollen wurden durchweg

negative Ergebnisse erzielt. Die Positivkontrollen zeigten in allen Fällen die Wirksamkeit der

verwendeten Medien an.


10 ml Keimsuspension mit x KbE L. monocytogenes + 80 g Schweinehackfleisch

= 90 g dotiertes Schweinehackfleisch

Anzahl KbE L. monocytogenes pro 90 g Hackfleisch → x KbE 90 g-1

= (x / 90) KbE g-1


Ergebnisse

94

ad Versuch 1: 10 ml Keimsuspension enthalten 5 200 KbE L. monocytogenes










Im Durchschnitt wurde das Schweinehackfleisch mit etwa 28 KbE g-1 beimpft.

Zusätzlich konnte festgestellt werden, dass der PALCAM-Agar deutlich effektiver als der

Oxford-Agar eine Unterdrückung der Begleitflora, die mit dem Schweinehackfleisch

eingebracht wurde, bewirkt. Auf keiner PALCAM-Agar-Platte konnte ein nenneswertes

Wachstum unerwünschter Begleitkeime beobachtet werden.

Die S c h w a r z f ä r b u n g der Halbfraser-Bouillon war in den meisten Fällen nach 24 h

entwickelt. In den Fällen, bei denen dieses nicht so war, waren dunkle Inseln innerhalb des

Untersuchungsmaterials deutlich zu erkennen. Nach Durchmischen der Probe bzw. spätestens

5 h später bei Raumtemperatur war die Schwarzfärbung vollständig ausgebildet. Auch waren

hier gelegentlich Listerien-negative Proben nach 2 – 3 Tagen schwarz gefärbt, ohne dass

Listerien nachweisbar waren (= negativ). Nach 48 h Inkubation war die Fraser-Bouillon, die

Listeria monocytogenes enthielt, immer vollständig schwarz.

Ergebnisse

95

4.2.2 Spezifität der mikrobiologischen Referenzmethode für Mischkulturen mit

Listeria innocua in Schweinehackfleisch

Zur Darstellung des Potentials der mikrobiologischen Referenzmethode bei gleichzeitiger

Kontamination eines Lebensmittels mit L. monocytogenes sowie mit L. innocua wurde dieses

Verfahren mit 56 künstlich kontaminierten Schweinehackfleischverdünnungen, die von 5

dotierten Hackfleischportionen stammten, geprüft.

Die 5 Hackfleischportionen (Versuche 1 bis 5) enthielten nach dem Dotieren zum einen

zwischen 13,4 und 57,8 KbE L. monocytogenes pro Gramm und zum anderen zwischen 17,8

und 63,3 KbE L. innocua pro Gramm. Im Hackfleisch lag damit eine Mischkultur aus

L. innocua und L. monocytogenes mit einem durchschnittlichen Verhältnis von 1:1,2 vor

(Tab. 17).

Von den dotierten Hackfleischportionen wurden jeweils dreimal 25 g entnommen. Die drei

25 g-Proben wurden verdünnt und von jeder Verdünnung 3 bzw. 4 Teilmengen entnommen.

Auf diese Weise standen 56 Schweinehackfleischverdünnungen für die weitere Untersuchung

zur Verfügung.

Von den 56 Schweinehackfleischverdünnungen, denen jeweils sowohl L. monocytogenes als

auch L. innocua zugesetzt wurden, enthielten nachweislich alle Listeria spp. Der positive

qualitative Nachweis von L. monocytogenes gelang in 30 Fällen. Dies entspricht einer Nach-

weisquote von 53,6 %. Das Ergebnis lag jeweils am Tag 5 der Untersuchung vor.

Die Ergebnisse von Negativ- und Positivkontrollen waren identisch mit denen unter 4.2.1

beschriebenen (negativer Listerien-Nachweis in allen Negativkontrollen).

Wie in Versuch 3.3.2.1 wurde auch in dieser Versuchsreihe die Effektivität des PALCAM-

Agars in Bezug auf das selektive Wachstum deutlich. Während auf Oxford-Agar-Platte

innerhalb dieser Studien stets das Wachstum von unspezifischer Begleitflora beobachtet

wurde, konnte mittels PALCAM-Agar in jedem Fall die Begleitflora vollständig unterdrückt

werden. Die inokulierten primären Anreicherungskulturen färbten sich immer innerhalb der

Inkubationszeiten vollständig schwarz.


Ergebnisse

96

10 ml Keimsuspension mit x KbE L. monocytogenes sowie x KbE L. innocua + 80 g

Schweinehackfleisch = 90 g dotiertes Schweinehackfleisch

Anzahl KbE L. monocytogenes bzw. L. innocua pro 90 g Hackfleisch → x KbE 90 g-1

= (x / 90) KbE g-1




10 ml Keimsuspension enthalten 5 700 KbE L. innocua

� 63,3 KbE L. innocua / g Hackfleisch

















Tab. 17: Verhältnis der Anzahl von L. innocua zur Anzahl von L. monocytogenes ininokuliertem Hackfleisch.

Verhältnis inMischkultur

Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 Versuch 4 Versuch 5 gesamt

L. innocua :L. monocytogenes 1:1,1 1:1,1 1:1,2 1:1,1 1:1,3 1:1,16

Ergebnisse

97



4.3.1 Versuche zur Sensitivität und Spezifität der PCR

4.3.1.1 Sensitivität der PCR nach Anreicherung von Listeria monocytogenes in

TSYE- respektive Halbfraser-Bouillon

Zur Darstellung der Nachweisgrenze des verwendeten PCR-Systems wurde der Teststamm

in TSYE-Bouillon angereichert.

Die Verdünnungsstufen 0 bis 9 (je 1 ml) der Anreicherungskultur wurden aufbereitet und der

molekularbiologische Nachweis mittels PCR und nachfolgender Agargel-Elektrophorese

geführt. Die Gesamtkeimzahl in der Anreicherungskultur wurde bestimmt.

Analog zu dieser Vorgehensweise wurde eine weitere Untersuchung durchgeführt, bei der die

TSYE-Bouillon gegen Halbfraser-Bouillon ausgetauscht wurde.

Die Gesamtkeimzahlen der beimpften und bebrüteten TSYE-Bouillons beliefen sich auf

3,4 und 3,8 x 109 KbE Listeria monocytogenes. Die Gesamtkeimzahl in der Halbfraser-

Bouillon betrug nach der Inkubation 1,4 x 109 KbE Listeria monocytogenes.

Die Nachweisgrenze (s. Tab. 18) deutete sich in einem Bereich an, in dem sich die

Keimkonzentration zwischen log 3 und log 4 KbE Listeria monocytogenes bewegte (1.400 bis

34.000 KbE).

4.3.1.2 Prüfung der Spezifität der PCR mit DNA von Listeria innocua

Neben Listeria monocytogenes wird in Fleisch und Fleischerzeugnissen besonders häufig

Listeria innocua gefunden.

Von einer Listeria innocua-Anreicherungskultur, die 2,0 x 109 KbE pro ml enthielt, wurde die

DNA aus 1 ml extrahiert, anschließend amplifiziert und mittels Agargel-Elektrophorese auf

gebildete Banden hin untersucht.

Ergebnisse

98

In dem Gel war eine Bande zu erkennen, die eindeutig nicht Listeria monocytogenes-

spezifisch war (s. Abb. 1).

Die Bande wurde von DNA-Fragmenten gebildet, die nur wenige Basenpaare länger waren

als die Listeria monocytogenes-spezifischen, aus je 234 bp gebildeten DNA-Fragmente. Die

sichere definitive Unterscheidung zwischen Monocytogenes- und Innocua-Banden war

eindeutig vorzunehmen und wurde durch einen Vergleich mit der Positivkontrolle bestätigt.

Abb. 1: Spezifität der Multiplex-PCR: Agargel-Elektrophorese zum Nachweis von L. monocytogenes-DNA aus Reinkulturen sowie der DNA einer L. innocua-Anreicherung.

Linien 1 und 20: Bandenmarker; Linien 2 bis 11: Verdünnungsreihe 100 bis 10-9 einer 20 Stunden-Anreicherungskultur (L. monocytogenes) (s. Text); Linie 12: Extraktionskontrolle; Linie 13: L. innocua; Linie 14: Negativkontrolle; Linien 15 bis 18: Inhibitionskontrollen; Linie 19: Positivkontrolle L. monocytogenes

Tab. 18: Sensitivität der PCR in Verbindung mit Agargel-Elektrophorese.

Verdünnungsstufe 100 10-4 10-5 10-6 10-7

Nachweis von L. monocytogenes

in 3,4 x 10x KbE

pro ml TSYEB-Anreicherung

positiv

3,4 x 109

positiv

3,4 x 105

positiv

3,4 x 104

negativ

3,4 x 103

negativ

3,4 x 102


in 3,8 x 10x KbE

pro ml TSYEB-Anreicherung

positiv

3,8 x 109

positiv

3,8 x 105

positiv

3,8 x 104

positiv

3,8 x 103

negativ

3,8 x 102


in 1,4 x 10x KbE

pro ml Halbfraser-Anreicherung

positiv

1,4 x 109

positiv

1,4 x 105

positiv

1,4 x 104

positiv

1,4 x 103

negativ

1,4 x 102

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Ergebnisse

99


Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels PCR

Zur Ermittlung der Mindestanreicherungszeit wurde Hackfleisch vom Schwein mit Listeria

monocytogenes beimpft (pro Gramm mit 22,2 bzw. 18,9 KbE). Nach Verdünnen des

Hackfleisches mit Halbfraser-Bouillon wurden 50 g der Hackfleischverdünnung entnommen

und bei 37°C bis zu 18 Stunden inkubiert. Die Probennahmen sowie die Durchführung der

Nachweismethode erfolgten nach 10, 12, 14, 16 und 18 Stunden Inkubation.

Unabhängig von der Einwaage (10 g bzw. 25 g Hackfleisch) waren alle Proben immer nach

mindestens 16-stündiger Anreicherung im ersten selektiven Anreicherungsmedium positiv,

d. h. Listeria monocytogenes wurde nachgewiesen (Tab. 19 u. 20).

Die Mindestanreicherungszeit für den Nachweis von Listeria monocytogenes mittels PCR in

Kombination mit Agargel-Elektrophorese betrug 16 Stunden (s. Abb. 2).

Abb. 2: Sensitivität der Multiplex-PCR: Agargel-Elektrophorese zum Nachweis von L. monocytogenes-DNA aus Schweinehackfleischproben.

Linien 1 und 18: Bandenmarker; Linien 2 bis 6: 10g-Proben; Linien 8 bis 12: 25g-Proben; Anreicherungszeiten: 10 (Linien 2 u. 8), 12 (L. 3 u. 9), 14 (L. 4 u. 10), 16 (L. 5 u. 11) und 18 Stunden (L. 6 u. 12); Linien 7 u. 13: Extraktionskontrollen; Linie 14 und 15: Schweinehackfleisch nicht inokuliert; Linie 16: Negativkontrolle; Linien 17: Positivkontrolle. Alle nicht-beimpften Hackfleischproben erwiesen sich als Monocytogenes-negativ.

Die Anzahl der Keime pro Gramm Hackfleisch in den Vorversuchen wurde wie unter 4.2.1

bestimmt.

ad Versuch I-V: 10 ml Keimsuspension enthalten 2 000 KbE L. monocytogenes


ad Versuch VI-IX: 10 ml Keimsuspension enthalten 1 700 KbE L. monocytogenes


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Ergebnisse

100

Tab. 19: Nachweis von L. monocytogenes-DNA in 25 g inokuliertem Schweinhackfleisch mittels PCR und Agargel-Elektrophorese in Abhängigkeit von der Dauer der Anreicherung.

Proben- volumen

25 g

(pro Gramm ca. 20 KbE L. monocytogenes)

Dauer der Anreicherung [h]

Versuchs- reihe

18 16 14 12 10 8 6

I positiv positiv positiv neg* neg neg N. d.

II positiv positiv positiv neg** neg* neg N. d.

III positiv positiv positiv positiv neg neg N. d.

IV positiv positiv positiv neg neg neg N. d.

V positiv positiv neg* neg neg neg N. d.

VI positiv positiv neg** neg* neg neg N. d.

VII positiv positiv positiv positiv neg* neg N. d.

VIII positiv positiv positiv positiv neg** N. d. N. d.

IX positiv positiv neg** neg** neg** N. d. N. d.

neg* = negativ; aber bereits Bildung e i n e r spezifischen, schwachen Bande neg** = negativ; aber bereits Bildung e i n e r spezifischen Bande N. d. = nicht durchgeführt, da Reaktionsansatz nicht lieferbar

Ergebnisse

101

Tab. 20: Nachweis von L. monocytogenes-DNA in 10 g inokuliertem Schweinhackfleisch mittels PCR und Agargel-Elektrophorese in Abhängigkeit von der Dauer der Anreicherung.

Proben- volumen

10 g



Versuchs- reihe

18 16 14 12 10 8 6

I positiv positiv neg** neg* neg N. d. N. d.

II positiv positiv neg** neg* neg N. d. N. d.

III positiv positiv positiv neg* neg N. d. N. d.

IV positiv positiv positiv neg neg N. d. N. d.

V positiv positiv zweifel-

haft neg neg N. d. N. d.

VI positiv positiv neg** neg neg N. d. N. d.

VII positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.

VIII positiv positiv positiv neg** neg* N. d. N. d.

IX positiv positiv positiv neg** neg* N. d. N. d.

neg* = negativ; aber bereits Bildung e i n e r spezifischen, schwachen Bande neg** = negativ; aber bereits Bildung e i n e r spezifischen Bande zweifelhaft = zwei spezifische, allerdings nur andeutungsweise ausgebildete Banden N. d. = nicht durchgeführt, da Reaktionsansatz nicht lieferbar

Ergebnisse

102


Schweinehackfleisch mittels Microarray


Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels Microarray

Zur Ermittlung der Mindestanreicherungszeit wurde Hackfleisch vom Schwein mit Listeria

monocytogenes beimpft (pro Gramm mit 22,2 bzw. 18,9 KbE). Nach Verdünnen des

Hackfleischs mit Halbfraser-Bouillon wurden 50 g der Hackfleischverdünnung entnommen

und bei 37°C bis zu 18 Stunden inkubiert. Die Probennahmen sowie die Durchführung des

Nachweisverfahrens erfolgten nach 10, 12, 14, 16 und 18 Stunden Inkubation (s. auch 4.3.2).

Unabhängig von der Einwaage (10 g bzw. 25 g Hackfleisch) waren alle Proben immer nach

mindestens 10-stündiger Anreicherung in erstem selektiven Anreicherungsmedium positiv,

d. h. Listeria monocytogenes wurde nachgewiesen (s. Tab. 21 u. 22).

Mit dem System PCR/NUTRI®-Chip konnte bei Einwaage von 25 g Hackfleisch in allen

Fällen nach einer Mindestanreicherungszeit von 10 Stunden Listeria monocytogenes

nachgewiesen werden.

Alle nicht-beimpften Hackfleischproben erwiesen sich als Monocytogenes-negativ (siehe auch

4.3.2).

Zur Berechnung der dotierten Keimkonzentrationen siehe 4.3.2.

Ergebnisse

103

Tab. 21: Nachweis von L. monocytogenes-DNA in 25 g inokuliertem Schweinhackfleisch mittels PCR und Microarray-Analyse in Abhängigkeit von der Dauer der Anreicherung.

Proben- volumen

25 g



Versuchs- reihe

18 16 14 12 10 8 6

I positiv positiv positiv positiv positiv positiv positiv

II positiv positiv positiv positiv positiv positiv neg

III positiv positiv positiv positiv positiv neg neg

IV positiv positiv positiv positiv positiv positiv neg

V positiv positiv positiv positiv positiv neg positiv

VI positiv positiv positiv positiv positiv positiv neg

VII positiv positiv positiv positiv positiv positiv neg

Ergebnisse

104

Tab. 22: Nachweis von L. monocytogenes-DNA in 10 g inokuliertem Schweinhackfleisch mittels PCR und Microarray-Analyse in Abhängigkeit von der Dauer der Anreicherung.

Proben- volumen

10 g



Versuchs- reihe

18 16 14 12 10 8 6

I positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.

II positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.

III positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.

IV positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.

V positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.

VI positiv positiv positiv neg* positiv N. d. N. d.

VII positiv positiv positiv positiv positiv N. d. N. d.

neg* = negativ; aber bereits schwache, spezifische Signale (typischer Kreis) N. d. = nicht durchgeführt, da Reaktionsansatz nicht lieferbar

Ergebnisse

105

4.4.2 Molekularbiologischer Nachweis von Listeria monocytogenes mittels Microarray

in Anwesenheit von Listeria innocua

Mit diesem Versuch wurde zum einen die Spezifität und zum anderen der Zeitaufwand des

Microarray-Verfahrens (NUTRI®-Chip) untersucht.

Als Proben dienten 56 Schweinehackfleischverdünnungen, die parallel mit dem kulturellen

Verfahren auf Listeria monocytogenes untersucht wurden (siehe 3.3.2.2). Vor der Ver-

dünnung und der selektiven Anreicherung wurde das Schweinehackfleisch mit 13,4 – 57,8

KbE L. monocytogenes und 17,8 – 63,3 KbE L. innocua beimpft, d. h. in einem Verhältnis

von 1:1,6 (siehe 3.3.2.2).

Mit dem verwendeten NUTRI®-Chip konnte in allen 56 Schweinehackfleischverdünnungen

Monocytogenes-spezifische DNA nachgewiesen werden. Die Nachweisquote / Spezifität

betrug 100 %.

Mittels Biochip-Technologie wurden keine falsch-positiven Ergebnisse durch den L. innocua-

Teststamm hervorgerufen. Nach Kontrolle der Extraktion konnte in jedem Fall eine

Kontamination mit Ziel-DNA ausgeschlossen werden.

Für den erfolgreichen Nachweis genügte eine 24-stündige Inkubation der Keime in

Halbfraser-Bouillon. Ein Ergebnis lag nach Anreicherungskultur, DNA-Extraktion, PCR und

Detektion der DNA mit dem NUTRI®-Biochip am dritten Tag der Untersuchung vor.

Die Listerienkontamination pro 90 Gramm dotiertem Schweinehackfleisch belief sich auf

(siehe 4.2.2):

1. 5,2 x 103 KbE L. monocytogenes und 5,7 x 103 KbE L. innocua





Die Listerienkonzentration pro Gramm dotiertes Schweinehackfleisch betrug: siehe 4.2.2.

Ergebnisse

106

Tab. 23 a und b: Ergebnisse und Angaben über die Höhe und Art der Inokulation für den Listeria monocytogenes–Nachweis mittels kultureller Referenzmethode nach DIN EN ISO 11290-1 (1996): Tab. 23 a: Beimpfung ausschließlich mit L. monocytogenes (s. 4.2.1); Tab. 23 b: Beimpfung mit L. monocytogenes und L. innocua (s. 4.2.2).

Ergebnisse

Parameter

I II III IV V

Gesamt

Anzahl der Proben mit L. monocytogenes 12 12 12 12 12 60

KbE g-1

L. mono 57,8

22,2

24,4 24,4 13,3 13 – 58

Anzahl der Proben mit positivem Nachweis von

L. monocytogenes (Kultur) 12 12 12 12 12 60

Ergebnisse

Parameter

I II III IV V

Gesamt

Anzahl der Proben mit L. monocytogenes &

L. innocua 8 12 12 12 12 56

KbE g-1

L. innocua 63,3 23,3 27,8 25,6 17,8 18 - 63


L. monocytogenes (Kultur) 0 10 12 1 7 30


L. monocytogenes (Biochip)

8 12 12 12 12 56

Ergebnisse

107


Schweinehackfleisch mittels ELISA

4.5.1 Überprüfung von Brillantschwarz hinsichtlich inhibierender Einflüsse auf die

ELISA-Methode (Transia plate® Listeria moncytogenes-ELISA) sowie der vom

Hersteller angegebenen Sensitivität für das Testkit

Sowohl mit Zusatz als auch ohne Zusatz von Brillantschwarz gelang der eindeutige Listeria

monocytogenes-Nachweis mittels ELISA ab log 7 KbE pro ml.

Die Proben, die 105 bzw. 106 KbE pro ml enthielten, waren nach der Untersuchung als

zweifelhaft positiv anzusehen (Tab. 24).

Inhibierende Wirkungen des Zusatzstoffes Brillantschwarz auf die ELISA-Reaktionen wurden

nicht festgestellt. Die Sensitivität des ELISA-Testkits entspricht den Herstellerangaben, und

die Nachweisgrenze lag in den konkreten Fällen zwischen 105 und 107 KbE Listeria mono-

cytogenes pro ml (Tab. 24). Je höher die Konzentration von Zielzellen, desto größer ist die

gemessene optische Dichte.

Tab. 24: Nachweisgrenze des ELISA mit und ohne Brillantschwarz.

OD = optische Dichte OD der Negativkontrolle: 0,206 bzw 0,207 Zähler; OD der Positivkontrolle: 2,419 Zähler → positiver Grenzwert OD 0,3565 und negativer Grenzwert OD 0,3209; dazwischenliegende Zähler führen zu der Beurteilung „zweifelhaft positiv“.

mit Brillant-schwarz 1,3 x 109 1,3 x 108 1,3 x 107 1,3 x 106 1,3 x 105

Anzahl KbE pro

ml ohne Brillant-schwarz 1,4 x 109 1,4 x 108 1,4 x 107 1,4 x 106 1,4 x 105

mit Brillant-schwarz

POSITIV 2,688

POSITIV 2,252

POSITIV 0,887

zw. positiv 0,328

zw. positiv 0,348 ELISA-

Ergebnis (OD) ohne Brillant-

schwarz POSITIV

2,319 POSITIV

1,970 POSITIV

0,914 zw. positiv

0,350 zw. positiv

0,321

Verdünnungsstufe 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Ergebnisse

108


Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch mittels ELISA

Für einen sicheren qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln

beträgt die Empfehlung des Herstellers des Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA

bezüglich der Dauer der Anreicherung 48 Stunden.

Hier sollte für das Lebensmittel Hackfleisch (vom Schwein) die kürzeste Inkubationsdauer

festgestellt werden, nach der ein sicherer Nachweis mittels dieser immunologischen

Nachweismethode tatsächlich erfolgt (Mindestanreicherungszeit).

Hackfleischportionen zu je 80 g wurden mit dem Erreger dotiert und enthielten danach

zwischen 18,9 und 33,3 KbE pro Gramm. Von den dotierten Hackfleischportionen wurden

jeweils dreimal 25 g entnommen. Die 25 g-Proben wurden nach Verdünnung und verschieden

langen Inkubationszeiträumen mit Hilfe des Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA

immunologisch auf die Anwesenheit von L. monocytogenes untersucht.

In Versuch I betrug die Anreicherungszeit für einen nachfolgenden positiven Nachweis

insgesamt 45 Stunden, d. h. der Nachweis wurde nach etwa 48 Stunden erbracht. Damit

wurde die empfohlene Anreicherungszeit unterschritten.

Mit Blick auf dieses Ergebnis wurde im folgenden die Dauer der Erst- bzw.

Zweitanreicherung sukzessive reduziert. Dabei wurde in weiteren Vorversuchen L. mono-

cytogenes in Hackfleisch nach 45, 44, 42, 39, 35 und 31 Stunden (Gesamtzeitaufwand)

eindeutig nachgewiesen.

Weitere Versuche zeigten, dass die Anreicherung in Halbfraser-Bouillon bzw. die

Anreicherung in Halbfraser- plus Fraser-Bouillon (18 Stunden Halbfraser-Anreicherung

kombiniert mit 6 Stunden Fraser-Anreicherung) auf 24 Stunden beschränkt werden kann, um

in allen Fällen einen positiven L. monocytogenes-Nachweis zu führen.

Ergebnisse

109

Die Anzahl der Keime pro Gramm Hackfleisch (Tab. 25) wurde wie unter 4.2.1 beschrieben

bestimmt.

Tab. 25: Berechnete Anzahl KbE L. monocytogenes in 1 g dotiertem Hackfleisch.

Versuch Nr.

Anzahl KbE L. monocytogenes in

10 ml Keimsuspension*

Anzahl KbE L. monocytogenes in

1 g dotiertem Hackfleisch

I 1,7 x 103 18,9

II 2,1 x 103 23,3

III 2,1 – 2,5 x 103 23,3 – 27,8

IV 2,2 – 2,6 x 103 24,4 – 28,9

V 1,9 – 3,0 x 103 21,1 – 33,3

VI (1.Teil) ** 1,9 x 103 21,1

VI (2. Teil) 1,8 x 103 20,0

VII 1,9 x 103 21,1

VIII 1,96 x 103 21,8

* Die Anzahl koloniebildender Einheiten in 10 ml Keimsuspension ergab sich nach der Bestimmung der Keimzahl in einer TK-Portion. ** Versuch VI spaltet sich aus labortechnischen Gründen in 2 Teile.

Ergebnisse

110

4.6 Qualitativer Nachweis von Listeria monocytogenes in Feldproben mittels

Agargel-Elektrophorese und Microarray

Verschiedene Lebensmittel, i. d. R. hergestellt auf der Grundlage von tierischen Rohstoffen,

und Umfeldproben waren im Gissel-Institut, Hannover, kulturell gemäß § 35 LMBG

(Umsetzung des DIN EN ISO-Standards 11290-1 von 1996) auf Listeria monocytogenes

untersucht worden. Die Zwischenlagerung der Halbfraser-Anreicherungskulturen, 24 Stunden

inkubiert, erfolgte tiefgefroren (–20°C).

Von den insgesamt 71 Proben war mit der mikrobiologischen Untersuchung in 49 Proben

Listeria monocytogenes nachgewiesen worden. In 22 Proben hingegen konnte Listeria

monocytogenes nicht mikrobiologisch diagnostiziert werden.

Bemessen an den Resultaten nach der DIN EN ISO 11290-1-Methode wurden mit der

Agargel-Elektrophorese und der NUTRI®-Chip-Analyse positive (45 und 45), negative (16

und 17), falsch-positive (6 und 5) sowie falsch-negative (4 und 4) Untersuchungsergebnisse

erhalten (Abb. 3). Die Ergebnisse von 57 L. monocytogenes-positiven und –negativen

Feldproben (80,3%) korrelierten mit allen drei Verfahren (vgl. Abb. 4).

Wenn die molekularbiologischen Untersuchungsergebnisse im Verhältnis zum kulturellen

Referenzverfahren betrachtet werden, ergeben sich für die beiden molekularbiologischen

Methoden im Durchschnitt eine Spezifität von 75 %, eine Sensitivität von 91,8 % und eine

Übereinstimmung von 86,6 % (Tab. 26).

Tab. 26: Spezifität und Sensitivität der molekularbiologischen Methoden und deren Übereinstimmung mit der kulturellen Methode.

Methoden Gel Microarray

Spezifität 72,7 % 77,3 %

Sensitivität 91,8 % 91,8 %

Übereinstimmung 85,9 % 87,3 %

Ergebnisse

111

49

45 45

22

17 16

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Anz

ahl P

robe

n

Positiv Negativ

Untersuchung von Feldproben mit drei verschiedenen Methoden

Kulturelles Referenzverfahren

Agargel-Elektrophorese

Micorarray-Analyse

Abb. 3: Positive und negative Untersuchungsergebnisse von Feldproben mit Agargel-Elektrophorese und NUTRI®-Chip-Analyse (bezogen auf die kulturelle Referenzmethode).

Vergleich der Untersuchung von Feldproben mit drei verschiedenen Methoden

22

49

21

50

20

51

13

44

0

10

20

30

40

50

60

Positiv Negativ

Anz

ahl d

er P

robe

n

Kulturelles Referenzverfahren

Agargel-ElektrophoreseMicroarray-AnalyseÜbereinstimmung

Abb. 4: Positive und negative Untersuchungsergebnisse von Feldproben mit Agargel-Elektrophorese und Microarray-Analyse (in der Annahme, dass jedes positive Testergebnis unabhängig von der Methode als richtig-positiv zu bewerten ist).

Ergebnisse

112

Die Abbildungen 3 und 4 verdeutlichen die Unterschiede in der Anzahl der positiven bzw.

negativen Diagnosen, je nachdem, welche Ergebnisse als Bezug gewählt werden. In dem Fall,

dass jedes positive Testergebnis als richtig-positiv beurteilt wird, wurde mit der Analyse von

Microarrays die größte Anzahl positiver Proben identifiziert (Abb. 4).

Von den 49 kulturell Listeria monocytogenes-positiven Feldproben enthielten 62,0 % (44 von

71 Feldproben) nachweislich Erreger-spezifische DNA (Tab. 27):

Die gesuchten Amplifikate konnten sowohl in einem Agarosegel als auch mit Hilfe der

NUTRI®-Chip-Analyse dargestellt werden.

In 5 von 49 Fällen waren die Ergebnisse von Kultur, PCR & Gel sowie PCR & Microarray

nicht bzw. nicht eindeutig übereinstimmend:

• In 3 Feldproben wurde der positive kulturelle L. monocytogenes-Nachweis mit keinem

PCR-System bestätigt. Der Erreger war dabei in einem Fall aus 1 g Probenmaterial

isoliert worden.

• Für eine weitere Feldprobe zeigte der NUTRI®Chip ein negatives Ergebnis, und im

Gel waren bei einem der Doppelansätze positive spezifische Banden erkennbar.

• Für eine andere Feldprobe konnten bei der NUTRI®Chip-Analyse visuell Signale

gefunden werden, die gerade für eine positive Diagnose ausreichten (Gel negativ).

Die kulturell Listeria monocytogenes-negativen Untersuchungsergebnisse von 22 Feldproben

korrelierten in 13 Fällen mit denen der beiden PCR-Systeme (Abb. 4 u. Tab. 28).

Zwar war in einem Fall eine einzige positive spezifische Bande im Agarosegel vorhanden,

jedoch wurde diese Bande alleine nicht als positiv sondern als verdächtig bewertet. Hier

müsste der Verdacht verifiziert werden.

In 9 weiteren Fällen stimmten die Ergebnisse dagegen nicht bzw. nicht eindeutig überein.

Zwei dieser Proben waren in beiden PCR-Systemen positiv, vier Proben wurden mittels

PCR/Agargel-Elektophorese positiv bewertet, während drei weitere Proben lediglich mit

PCR/Microarray-Analyse positiv ausfielen (Tab. 28).

Ergebnisse

113

Tab. 27: Monocytogenes-positive Proben (nach der kulturellen Methode gemäß § 35 LMBG).

* Eine Probe mit NUTRI®-Chip-Analyse auf Anhieb positiv; mit Agargelelektrophorese erst nach zweiter Extraktion der DNA.

** Davon eine Probe kulturell in 1g Probenmaterial L. mono-positiv. *** Die positive Aussage wurde nach visueller Auswertung der NUTRI®-Chip-Analyse getroffen.

Die Signale waren gerade ausreichend für einen positiven Befund.

Tab. 28: Monocytogenes-negative Proben (nach der kulturellen Methode gemäß § 35 LMBG).

*In einem Fall war eine einzige positive spezifische Bande im Agarosegel vorhanden, jedoch wurde diese Bande alleine nicht als positiv sondern als verdächtig bewertet. Hier müsste der Verdacht verifiziert werden.

Ergebnisse mit den Detektionsmethoden

des molekularbiologischen Nachweissystems

Gelelektrophorese NUTRI®-Chip

Anzahl der Proben (insgesamt 49)

positiv positiv 44*

negativ negativ 3**

positiv negativ 1

negativ positiv 1***

Ergebnisse mit den Detektionsmethoden

des molekularbiologischen Nachweissystems

Gelelektrophorese NUTRI®-Chip

Anzahl der Proben (insgesamt 22)

negativ negativ 13*

positiv positiv 2

positiv negativ 4

negativ positiv 3

Ergebnisse

114

Von dem Ergebnis der kulturellen Methode wichen insgesamt 19,7 % der molekular-

biologischen Untersuchungsergebnisse (14 Feldproben) ab. Die beiden PCR-Systeme

korrelierten hierbei nunmehr in 2 Fällen. Die Befunde waren häufig uneindeutig (z. B. nur in

einem Doppelansatz oder nur in 1 Lokalisation des Microarrays positiv; s. Tab. 29).

Tab. 29: Von der herkömmlichen Referenzmethode abweichende Untersuchungsergebnisse der Schnellmethoden.

Kultur Gel Microarray Anzahl

- ++ / ++ + - positiv 1

- ++ / - - + - positiv 1

- ++ / ++ - - Nur Gel positiv, Microarray negativ 1

- ++ / - - - - Nur Gel positiv, Microarray negativ 3

- - - / - - ++ NUTRI®-Chip positiv 1

- - - / - - + - NUTRI®-Chip positiv 2

+ - - / - - - - Nur Kultur positiv 3

+ ++* / - - - - Kultur und Gel positiv 1

+ - - / - - ++** ** visuell bewertet NUTRI®-Chip positiv 1

- 6 5 Falsch-positive insgesamt 9

+ 4 4 Falsch-negative insgesamt 5

+ = positiv, - = negativ; ++ / ++ bzw. - - / - - = beide Ansätze positiv bzw. negativ; ++ bzw. - - = beide Lokalisationen positiv bzw. negativ, + - = eine Lokalisation positiv, andere Lokalisation negativ.

Diskussion

115

5. Diskussion

5.1 Diskussion des Dotierens von Schweinehackfleisch

Mit verschiedenen Prozeduren kann der Inhomogenität des Probenmaterials bezüglich der

physikalischen Eigenschaften entgegengesteuert werden. Die Wahl der Prozedur hängt von

der Zusammensetzung eines Lebensmittels ab. Zur Vorbereitung auf die chemische

Untersuchung von Fleisch und Fleischerzeugnissen sind Vorschriften in der Amtlichen

Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG (L 06.00-1) enthalten. Diese sollen

sicherstellen, dass die Probe zum Zeitpunkt der Untersuchung in allen Teilen dieselben

physikalischen Eigenschaften aufweist.

Um falsch-negative Resultate durch inhomogene Verteilung der Zielkeime praktisch

auszuschließen, existieren keine amtlichen Vorschriften. Das Homogenisieren bzw.

Herstellen der Verdünnungen erfolgte grundsätzlich in Orientierung an BAUMGART (1997).

Das dotierte Schweinehackfleisch wurde hier auf eine homogene Verteilung der

Keimsuspension hin kontrolliert. Die Methode, das Einfärben des Hackfleisches mit

Brillantschwarz (Lebensmittelfarbstoff E 151), wurde bei LUBENOW (2002) beschrieben.

Eine inhibierende Wirkung von Brillantschwarz auf die Vermehrungsfähigkeit der Listerien

bzw. Nachweisreaktionen wurde nicht festgestellt.

Die Methode zur Kontrolle des gleichmäßigen Dotierens ist nach den gewonnenen

Erfahrungen notwendig und zweckentsprechend. Trotzdem ist ansonsten keine Ver-

öffentlichung bekannt, die eine Erfolgskontrolle der gleichmäßigen Inokulation beinhaltete.

Gerade wenn für eine Beimpfung von Proben sehr niedrige Keimzahlen herangezogen

werden, besteht das Problem der gleichmäßigen Verteilung der Keime über das

Untersuchungsgut (FELDSINE et al. 1997). Heterogene Verteilungen können v. a. bei

Listerien, die im Vergleich zu anderen, in Lebensmitteln vorkommenden Mikroorganismen

nur langsam wachsen, den Wert einer Studie beeinträchtigen.

Insbesondere für Inokulationsversuche, in denen mit Listerien und / oder mit geringgradigen

Kontaminationsraten operiert wird, ist die Anwendung der Brillantschwarz-Färbemethode zur

Sicherstellung der Homogenität empfehlenswert.

Diskussion

116

Das Tiefgefrieren und Auftauen der Inokulate führt nach GOLDEN et al. (1988) zu Schäden

der Bakterien; die Kolonie-bildenden Einheiten, die die Prozedur überleben, sind zu über

80 % geschädigt.

Die für die Inokulationen herangezogenen Keime aus TK-Portionen hätten demnach eine

herabgesetzte Vitalität besessen. Die Gesamtkeimzahlen (vor und nach dem Tiefgefrieren

ermittelt) deuteten darauf hin, dass die für die Inokulation herangezogenen Keime

eingeschränkt vermehrungsfähig waren.


Schweinehackfleisch mit der kulturellen Methode

Schweinehackfleisch, beimpft mit durchschnittlich ca. 28 KbE g-1 (niedrigstes In-

okulationsniveau 13 KbE g-1), wurde mit Hilfe der derzeitigen kulturellen Referenzmethode

(amtliches Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG, Umsetzung der DIN EN ISO 11290-1

von 1996) qualitativ auf Listeria monocytogenes untersucht.

In Abwesenheit von Listeria innocua belief sich die diagnostische Sensitivität auf 100 %.

Am Tag 5 der Untersuchung konnte Listeria monocytogenes in Schweinehackfleisch, das im

Allgemeinen mindestens 105 – 106 KbE kompetitive Keime pro Gramm enthält, immer sicher

identifiziert werden. Dies ist der frühest mögliche Zeitpunkt, mit Hilfe der kulturellen

Referenzmethode Listeria monocytogenes zu identifizieren. Bei Anwendung der Methode auf

andere Lebensmittel kann ein Ergebnis auch erst am Tag 7 oder später vorliegen.

Bei Anwendung auf Schweinehackfleisch, das mit definierten M i s c h k u l t u r e n

(Verhältnis ca. 1:1,2) aus Listeria monocytogenes (durchschnittlich 28,3 KbE g-1) und Listeria

innocua (durchschnittlich 31,6 KbE g-1) präpariert war, sank die diagnostische Sensitivität der

kulturellen Referenzmethode drastisch. Falsch-negative Diagnosen mussten für nahezu die

Hälfte der Proben (46,4 %), die Krankheitserreger u n d Indikator enthielten, hingenommen

werden. Damit verringerte sich die diagnostische Sensitivität der kulturellen Referenzmethode

auf nunmehr 53,6 %.

Tatsächlich bestehende Kontaminationen blieben unerkannt, und anstelle des Zielkeims

wurde, wie in anderen Studien (CURIALE u. LEWUS 1994; BRUNNER u. BÜLTE 2001),

zuverlässig die apathogene Art Innocua differenziert.

Diskussion

117

Grund dafür ist die Generationszeit von Listeria innocua, die z. B. durch Akriflavin-Gehalte

in selektiven Anreicherungsmedien gegenüber der Generationszeit von Listeria monocyto-

genes verkürzt ist (BEUMER u. HAZELEGER 2003). Der Zielkeim wird somit „maskiert“.

In den Dotierungsversuchen von CURIALE und LEWUS (1994) waren verhältnismäßig mehr

Kolonie-bildende Einheiten Innocua (Verhältnis L. m. : L. i. = 1:2) für die künstliche

Kontamination von Fleisch (Rind) eingesetzt worden. Dieses Verhältnis ließ den

Erregernachweis in sogar nur jeder 20. Probe zu. Bei einem Verhältnis von annähernd 1:1 und

einer Sensitivität von 53,6 % wird L. monocytogenes mit großer Wahrscheinlichkeit in jeder

2. Probe nachgewiesen. Der Kontext erlaubt zumindest zwei mögliche Deutungen: Die hier

verwendete kulturelle Methode resp. die Differenzierungsmedien erfüllen ihren Zweck

womöglich besser als die damaligen. Und: Der unbestreitbar h o h e negative Einfluß, den

Listeria innocua auf die diagnostische Sensitivität ausübt, ist methodisch bedingt und bislang

mit der amtlich vorgeschriebenen kulturellen Methode noch nicht vermeidbar.

Die Hackfleisch-spezifische Begleitflora wird in der Kombination aus Anreicherung plus

Nährboden mit besserem Erfolg unterdrückt als es bei anderen Fleischerzeugnissen z. T. der

Fall ist (s. ANON. 2002).

Die gewonnenen Erfahrungen und Ergebnisse sprechen dafür, dass Halbfraser-Bouillon die

Vermehrung von Listerien hinreichend fördert.

Die generelle Befürwortung der parallelen Verwendung verschiedener Anreicherungsmedien

(HAYES et al. 1992; SCHMIDT et al. 1988; RYSER et al. 1996; SCOTTER et al. 2001)

kann speziell für den hier untersuchten Nachweis nicht unterstützt werden.

Selbst bei n i e d r i g s t e n Kontaminationsraten erwies sich die Halbfraser-Bouillon für

den Zweck eines positiven qualitativen L. monocytogenes-Nachweises in Hackfleisch als

effektives Selektivmedium (KLEINER u. SCHINKEL 2003).

Die S c h w a r z f ä r b u n g der Halbfraser-Bouillon ist nicht immer nach 24 h entwickelt,

was die Beobachtung von WALKER et al. (1990) bestätigt. Auch hier waren gelegentlich

Listerien-negative Proben nach 2 – 3 Tagen schwarz gefärbt, ohne dass Listerien nachweisbar

waren.

Diskussion

118

Als Indikator ist die Halbfraser-Bouillon dennoch geeignet, denn es zeichnet sich ab, dass die

Schwarzfärbung umso schneller eintritt, wenn Listerien anwesend sind und je mehr anwesend

sind. Nach 48 h Inkubation war die Fraser-Bouillon immer vollständig schwarz.

Mit n i c h t – s e l e k t i v e r Anreicherung wuchs L. monocytogenes neben anderen

Pathogenen, nach einer kürzeren Regenerationszeit, zu Konzentrationen heran, die über der

Nachweisgrenze einer Schnellmethode lagen (CLOAK et al. 1999; KRISMER et al. 2002).

Allerdings war PALCAM zu wenig selektiv, um die Kolonien von Listerien darstellen zu

können (KRISMER et al. 2002). Der Vorteil der kürzeren Generationszeit des Erregers in

nicht-selektiven Medien kann womöglich dann in Erwägung gezogen werden, wenn feste

Medien, die selektiver sind als Oxford und PALCAM, etabliert sind.

Es bestätigte sich, dass der PALCAM-Agar deutlich effektiver als Oxford-Agar originäre

kompetitive Keime unterdrücken kann. Auf keiner PALCAM-Agar-Platte konnte ein

nennenswertes Wachstum unerwünschter Begleitkeime beobachtet werden (die Verdachts-

kolonien lagen quasi in „Reinkultur“ vor), während auf Oxford stets ein deutliches Wachstum

der unspezifischen Begleitflora auffällig wurde. Größe und Charakteristika der Verdachts-

kolonien auf einzelnen Nährböden waren abhängig von der Dichte des bakteriellen

Wachstums: je dichter der Bewuchs, desto kleiner und uncharakteristischer die Ausbildung

der Kolonien.

Wenn auf Oxford die kompetitive Flora nur gering bis mäßig ausgeprägt wuchs, entwickelten

die Verdachtskolonien in jedem Fall und früher die typischen Merkmale, was mit einer

leichteren Interpretation einherging (bestätigt WALKER et al. 1990).

Oft konnte die Begleitflora nicht an einem hochgradigen Wachstum gehindert werden, was

die Isolation von Listeria spp. sehr erschwerte, und es brauchte viel Erfahrung, damit diese

nicht teilweise unmöglich wurde (bestätigt BUNČIĆ 1991; KORSAK et al. 1998).

Gerade in Proben aus rohem Fleisch scheint die Tendenz zu bestehen, dass Oxford ein

hochgradiges Wachstum der kompetitiven Flora wie Mikrokokken unterstützt bzw. nicht

verhindert (vgl. KORSAK et al. 1998). Beobachtet wurden hier Kolonien mit Merkmalen von

Staphylokokken.

Diskussion

119

Speziell Mischkontaminationen: Obwohl präsumtive Listerienkolonien wieder zahlreich

wuchsen (trotz eines oft erneut hochgradigen Wachstums der kompetitiven Nicht-Listerien-

Flora), handelte es sich bei den je insgesamt 10 Verdachtskolonien vorzugsweise um Listeria

innocua. Auf PALCAM wuchsen wieder praktisch „reine“ präsumtive Listerien-Kulturen

heran. Die Nachweisrate wurde demnach besonders effektiv durch Anwesenheit von Listeria

innocua reduziert. Weniger Einfluß übten hingegen offensichtlich die kompetitiven Bakterien

aus. Vermutungen anderer Autoren (z. B. ANON. 2002) ließen offen, inwieweit das

kompetitive Wachstum als bedeutsam einzuschätzen wäre.

Die Henry’sche Beleuchtung (ohne Blaufilter) erwies sich als zuverlässiges Mittel, um den

Listerien-Verdacht auf TSYEA zu bestätigen. Hervorragend eignet sich die Hämolyse-

Reaktion in Verbindung mit dem CAMP-Test für die Differenzierung auf Speziesebene; beide

Bestätigungsprüfungen konnten direkt in Anschluß an die Beleuchtungsprüfung erfolgreich

durchgeführt werden.

Speziell Mischkontaminationen: Die Ergebnisse der biochemischen und kulturellen

Eigenschaften konnten jeweils eindeutig und problemlos interpretiert werden. In der Literatur

wird allerdings von derartigen Schwierigkeiten berichtet, die insbesondere bei der

Interpretation der Hämolyse-Reaktion auftraten, die immer zusammen mit dem CAMP-Test

durchgeführt werden sollte (NOACK u. JÖCKEL 1993; SCOTTER et al. 2001).

Die Arbeitsschritte, die in der amtlichen Methode dargestellt sind, sollten evtl. ausführlicher

bzw. anschaulicher formuliert werden.

Eine fehlerhafte Interpretation von Listeria innocua als Listeria monocytogenes wird für die

Untersuchungen, die dieser Arbeit zugrunde liegen, ausgeschlossen.

Speziell Mischkontaminationen: Die „Fehler“ passierten an dem Punkt der Untersuchung, an

dem zahlreiche Verdachtskolonien zur Auswahl standen; aufgrund der kürzeren

Generationszeit handelte es sich bei den meisten um Kolonien von Listera innocua.

Wenn es ein selektives Anreicherungsmedium gäbe, das s p e z i e l l die A r t

Monocytogenes im Wachstum fördern könnte, wäre dies ein großer Vorteil. Es sind jedoch

hier keine Veröffentlichungen über die Existenz eines Mediums mit dieser Eigenschaft

bekannt. Das gleiche gilt für Kenntnisse darüber, ob und / oder inwieweit diese beiden Arten

unterschiedliche Ansprüche an ein flüssiges Medium stellen.

Diskussion

120

In einigen Studien wurde favorisiert, für die Bestätigung von L. monocytogenes im Rahmen

kultureller Untersuchungen die Anzahl der zu untersuchenden Verdachtskolonien auf 10 je

Platte zu verdoppeln. Wahrscheinlich würden dadurch falsch-negative Ergebnisse vermieden.

Der Arbeitsaufwand ist bisher allerdings schon sehr hoch und verdoppelte sich damit noch.

Eine andere Möglichkeit, dieses Problem zu lösen, ist, zu diesem Zeitpunkt verdächtige

Kolonien anhand von kulturellen Eigenschaften in z. B. „pathogene Spezies“ und „nicht

pathogene Spezies“ zu klassifizieren.

Dafür bieten sich neue, teilweise chromogene Nährböden wie ALOA, BCM-, LMBA- oder

Rapid’L. mono-Agar an. Sie ermöglichen ein differenziertes Wachstum von Listeria

monocytogenes. Anderen Studien zufolge ist von ihnen ALOA der überlegene Nährboden;

ALOA war für die Analyse von Rinderhackfleisch (Sensitivität von ALOA 92 %) geeignet

(GRACIEUX et al. 2002; BÜLTE et al. 2003).

In Anbetracht der Tatsache, dass das Laborpersonal über unterschiedliche Erfahrungswerte

verfügt (s. Ringversuch SCOTTER et al. 2001) und der hier gewonnenen Ergebnisse, ist die

(statistische) Präzision der ISO-Methode 11290-1 (1996) (ANON. 1998) einmal mehr in

Frage zu stellen.

Fazit:

Die diagnostische Sensitivität (53,6 %) der kulturellen Referenzmethode nach § 35 LMBG

bei Mischkontaminationen bedeutet, dass damit Listeria monocytogenes nicht zuverlässig in

Schweinehackfleisch nachgewiesen werden kann.

Die durchgeführten Untersuchungen erhärten den Verdacht, dass ein hoher Anteil – im

Schrifttum wurde von 25 % der untersuchten Lebensmittel ausgegangen (HAYES et al. 1992)

– untersuchten Schweinehackfleisches Kontaminationen mit Listeria monocytogenes enthält,

die kulturell nicht nachweisbar sind; das Auftreten von falsch-negativen Ergebnissen selbst

bei standardisierten kulturellen Methoden ist wahrscheinlich noch immer alltäglich.

Ursache dafür ist im wesentlichen Listeria innocua, der den Erreger durch schnelleres

Wachstum „maskiert“; die Medien aus den 90er Jahren bzw. noch ältere verfügen nicht über

ein ausreichendes Potential, zwischen L. monocytogenes und L. innocua zu unterscheiden

(JOHANSSON 1998; SCOTTER et al 2001).

Diskussion

121

Der ausschließliche Nachweis von nicht-pathogenen Listerien in Schweinehackfleisch

schließt nicht die Möglichkeit aus, dass der gesuchte Zoonoseerreger in untersuchtem

Schweinehackfleisch – nicht nachweisbar aufgrund fehlender diagnostischer Sensitivität –

enthalten ist. Zusammenfassend bewertet, leidet die kulturelle Referenzmethode an dem

Unvermögen der angewandten Selektivnährböden Oxford und PALCAM, Listeria

monocytogenes von apathogenen Listerien unterscheiden zu können.

In Anbetracht der Tatsache, dass L. innocua, Indikatorkeim für L. monocytogenes, nicht in

Ausnahmefällen sondern mit regelmäßiger Häufigkeit in Lebensmitteln vorkommt, ist die

Integration eines Mediums in die amtliche Methode empfehlenswert, das makroskopisch die

Unterscheidung zwischen Listeria monocytogenes und anderen Listerien ermöglicht (z. B.

ALOA). Der Agar Listeria nach Ottaviani und Agosti (ALOA) hat sich anderen Medien

gegenüber, die sich durch diese Eigenschaften grundsätzlich auszeichnen (Rapid’L. mono-

Agar und Listeria monocytogenes-Blutagar, LMBA) bisher als überlegen erwiesen. Er kann

allerdings die vorgeschriebenen Medien nicht vollständig ersetzen, weil er selbst ebenfalls

keine vollständige Nachweissicherheit garantieren kann.

Diskussion

122



Methodische Charakterisierung des PCR-Systems

Die Nachweisgrenze des PCR-Systems – festgestellt mit Hilfe von Reinkulturen aus TSYE-

bzw. Halbfraser-Bouillon – bewegt sich in einem Bereich zwischen 103 und 104 KbE

Listeria monocytogenes pro ml. Die methodische Sensitivität anderer PCR-Systeme für den

Nachweis aus Reinkulturen betrug zwischen 5 KbE im günstigsten Fall und l06 KbE im

ungünstigsten Fall. Die Häufung einer sehr niedrigen Nachweisgrenze (wie z. B. 5 KbE pro

ml) in älteren Studien (DENEER u. BOYCHUK 1991; FURRER et al. 1991; FITTER et al.

1992; WIEDMANN et al. 1993) zum Nachweis von Monocytogenes-DNA wird in neueren

Studien, in denen teilweise auch kommerziell erhältliche PCR-Nachweissysteme besprochen

werden, nicht mehr erreicht. Das mit einem einfachen PCR-System derart niedrige

Konzentrationen heutzutage nachweisbar sind, ist daher zweifelhaft.

Das PCR-System der Fa. GeneScan Analytics GmbH erfüllt die Anforderungen, die bezüglich

der methodischen Sensitivität gestellt werden können; die methodische Sensitivität der

Multiplex-PCR ist vergleichbar mit derjenigen des wohl am meisten in Veröffentlichungen

besprochenen kommerziellen PCR-Systems (BAXTM for Screening/Listeria monocytogenes).

Gewöhnlich beläuft sich die Kontamination von Lebensmitteln mit Listeria monocytogenes

auf weniger als 100 KbE pro Gramm. Daher ist aufgrund der Nachweisgrenze des PCR-

Systems die Anreicherung der Zielkeime vor der Durchführung der DNA-Extraktion

erforderlich bzw. ist die Anwendung einer direkten PCR bei diesem Erreger nicht sinnvoll.

Mit Hilfe dieses Multiplex-PCR-Systems werden Abschnitte von zwei voneinander

unabhängigen Virulenzgenen des Listerioseerregers parallel vervielfältigt. Die Banden sind

eindeutig identifizierbar und unterscheidbar; eine Verifizierung der Amplifikate durch z. B.

Restriktionsenzymanalyse oder Southern-Blot zur Bestätigung der Diagnose ist nicht

notwendig (vgl. FURRER et al. 1991; NIEDERHAUSER et al. 1992).

Diskussion

123

Mittels chromosomaler L. innocua-DNA wird ein PCR-Produkt amplifiziert. Die Lauflänge

der L. innocua-Fragmente ist zwar nur geringgradig kürzer als die des L. monocytogenes-

spezifischen 234 bp-DNA-Fragmentes, aber die Banden sind ohne weiteres – letztendlich

durch einen Vergleich mit der Positivkontrolle – zu unterscheiden.

Bei diesem Amplifikat kann es sich entweder um L. innocua-spezifische oder Listerien-

spezifische DNA-Abschnitte handeln, und es könnte ggf. geprüft werden, inwieweit dieses für

den parallelen Nachweis aus Lebensmittelproben nutzbar wäre.

Das verwendete PCR-System ermöglicht demnach die Amplifikation sowohl von

L. moncytogenes-spezifischer DNA als auch von L. innocua-DNA, wodurch sich das PCR-

System von anderen unterscheidet, die entweder die Gattung Listeria oder die Art Listeria

monocytogenes detektierten (DENEER u. BOYCHUK 1991; FURRER et al. 1991).

Bis zu 4 verschiedene Primerpaare wurden in einer Multiplex-PCR zum Nachweis von

verschiedenen Listeria (monocytogenes)-DNA-Fragmenten parallel eingesetzt (BORDER et

al. 1990; BUBERT et al. 1999).

Die Spezifität der Primer für die Virulenzgene von Listeria monocytogenes musste hier nicht

weiter untersucht werden, da das spezifische Vorkommen der Pathogenitätsfaktoren von

L. monocytogenes (v. a. Listeriolysin O) bereits in vielen Studien hinreichend unter Beweis

gestellt wurde (wie bei BESSESEN et al. 1990; BORDER et al. 1990; DENEER u.

BOYCHUK 1991; FITTER et al. 1992).

Kommerzielle Reaktionsansätze (soweit bekannt nicht-Multiplex-PCR-Systeme) enthalten

teilweise eine interne Reaktionskontrolle. Mit dieser steigt die Diagnosesicherheit, indem das

Risiko der DNA-Kontamination und der Arbeitsaufwand der Präanalyse reduziert werden.

Das hier verwendete PCR-System enthielt eine solche interne Kontrolle der erfolgten PCR-

Reaktion bisher nicht.

Diskussion

124

Diagnostische Charakterisierung der verwendeten PCR-Systeme zum Nachweis von

Listeria monocytogenes-spezifischer DNA aus Schweinehackfleisch

Die diagnostische Sensitivität eines PCR-Systems hängt sowohl von den Eigenschaften des

Nachweissystems als auch von der Art des Lebensmittels und der Anreicherung ab.

Aufgrund der Höhe der methodischen Sensitivität – s. o. – und dem Auftreten von PCR-

Inhibitionen allgemein bei der Analyse von Lebensmitteln ist die Anreicherung der Zielkeime

vor der PCR erforderlich.

Hier wurde die Dauer der Anreicherung ermittelt, die mindestens erforderlich ist, in a l l e n,

vor Untersuchungsbeginn gleich- und regelmäßig inokulierten Schweinehackfleischproben

L. monocytogenes-spezifische DNA nachzuweisen (Mindestanreicherungszeit).

Aus Schweinehackfleisch, das mit ca. 20 KbE pro Gramm kontaminiert ist, kann Listeria

monocytogenes-spezifische DNA nach einstufiger Anreicherung sicher mit den genutzten

molekularbiologischen Systemen detektiert werden.

In Anlehnung an die ISO-Methode wurde Halbfraser-Bouillon erfolgreich als selektives

Anreicherungsmedium in den PCR-Nachweis integriert. Weil im Rahmen der vorliegenden

Arbeit der geringst mögliche Zeitbedarf ermittelt werden sollte, und die Wachstumsrate der

Listerien bei 37°C höher ist als bei 30°C, erfolgte die Inkubation abweichend vom ISO-

Standard nicht bei 30°C sondern bei 37°C.

Die Mindestanreicherungszeiten unterschieden sich je nachdem, welches Verfahren zur

Detektion der Listeria monocytogenes-spezifischen DNA-Fragmente angewendet wurde

(Mindestanreicherungszeit für Agargel-Elektrophorese 16 Stunden bzw. für Microarray-

Analyse 10 Stunden).

Innerhalb von 10 bzw. 16 Stunden vermehrt sich Listeria monocytogenes unter den oben

genannten Bedingungen zu Konzentrationen, die s i c h e r oberhalb der Nachweisgrenze der

PCR-Systeme liegen.

Dieser Sachverhalt belegt außerdem, dass der Nachweis mittels Hybridisierung anhand einer

geringeren Anzahl von Zielkeimen möglich ist. Die Hybridisierungstechnik ist damit der

Agargel-Elektrophorese hinsichtlich diagnostischer Sensitivität überlegen.

Diskussion

125

Diese Beobachtung deckt sich mit den Ergebnissen anderer Studien (KLEIN u. JUNEJA

1997). Im Vergleich zu einer DNA-Detektion mittels Agargel-Elektrophorese kann mit der

Microarray-Analyse die Mindestanreicherungszeit zur Vermehrung von Listeria

monocytogenes um annähernd 40 % reduziert werden kann. Die kurze Mindest-

anreicherungszeit ist Ausdruck der vielfach höheren methodischen Sensitivität einer

Hybridisierungs-Technik gegenüber der vielfach gebräuchlichen Agargel-Elektrophorese. Die

höhere Sensitivität basiert auf der Testgrundlage (Hybridisierung von Nukleinsäuren).

Mindestanreicherungszeiten für den Nachweis mittels PCR stehen also unter dem Einfluß der

Detektionsmethode. Bei Einsatz der Microarray-Analyse kann aufgrund der höheren

Sensitivität die Anreicherung zeitlich stärker reduziert werden.

Wie anhand anderer Studien gezeigt wurde, ist die Mindestanreicherungszeit multifaktoriell

bestimmt. Das PCR-System, die Anreicherungsbedingungen und die Lebensmittelmatrix

führen zu deutlichen Unterschieden für den positiven Nachweis in spezifischen Fällen.

Auch die hier gewonnenen Erfahrungen stützen die Sichtweise, jede molekularbiologische

Nachweisführung für sich als ein i n t e g r a l e s S y s t e m (KRISMER et al. 2002) zu

betrachten.

Je weiter die Mindestanreicherungszeit unterschritten wurde, desto geringer wurde der Anteil

positiver Diagnosen. Während nach Stunde 14 der Inkubation Agargel-elektrophoretisch mehr

als die Hälfte der Proben als positiv identifiziert wurde, ist der Nachweis ab 12 Stunden und

darunter relativ unsicher.

Dies korreliert mit der Beobachtung, dass das hlyA-Gen in der frühen stationären

Wachstumsphase des Erregers verstärkt transkripiert wird, was mit maximaler hämolytischer

Aktivität in diesem Zeitraum einhergeht (GEOFFROY et al. 1989; MENGAUD et al. 1991b).

D. h., dass hier indirekt deutlich wird, dass die beimpften, inokulierten Erreger in diesem

Zeitraum in der Halbfraser-Bouillon bei 37°C in die frühe stationäre Wachstumsphase

eintreten. Im folgenden ist allmählich mit einer Abnahme der hämolytischen Aktivität zu

rechnen, die schließlich nach 48 Stunden anhand des Hämolysins nicht mehr nachgewiesen

werden kann (MENGAUD et al. 1991b).

Diskussion

126

Für die selektive Anreicherung wurde Halbfraser-Anreicherungsbouillon ausgewählt, weil

sich diese u. a. bei lebensmittelrechtlichen Fragestellungen bewährt hat.

Wenn zur Diagnostik mit verschiedenen Nachweismethoden Analysen vorgenommen werden,

ist die Arbeit mit einem einzigen Anreicherungsmedium ökonomischer. Voraussetzung ist

aber, dass beide Methoden mit dem Anreicherungsmedium kompatibel sind.

Unter Berücksichtigung der Ergebnisse anderer Autoren (ANON. 2002), zeichnet sich ein

Trend dahingehend ab, dass Listeria monocytogenes in Fleisch i. d. R. bereits nach der

Primäranreicherung (reguläre Inkubationszeit: 24 h ±) anhand von DNA nachgewiesen

werden kann. Bei der Anwendung von PCR-Systemen auf Fleisch sollte dies zunächst immer

bedacht werden und getestet werden, ob Materialien und Arbeit (und Zeit) für sekundäre

Anreicherungen im konkreten Fall eingespart werden können.

Einschränkend sollte aber immer der integrale Charakter des PCR-Nachweises Berück-

sichtigung finden, solange für ein System nicht im ausreichenden Maße empirische Daten

vorliegen. So empfiehlt der Hersteller des PROBELIATM-Testkits für Lebensmittel mit

Fleischkomponenten, sekundär eine Fraser-Anreicherung durchzuführen. Welche Daten

dieser Empfehlung zugrunde liegen, ist hier nicht bekannt.

Potentielle originäre PCR-Inhibitoren, enthalten in der Fraser-Bouillon und im

Schweinehackfleisch (ROSSEN et al. 1992; LANTZ et al. 1998), wurden im Rahmen der

Probenaufbereitung ausreichend verdünnt. Wie sich hier zeigte, kann Halbfraser-Bouillon, die

die als PCR-Inhibitoren identifizierten Stoffe (ROSSEN et al. 1992) in geringeren

Konzentrationen als Fraser enthält, durchaus in ein PCR-System zum Nachweis von

L. monocytogenes in Schweinehackfleisch integriert werden.

Das Risiko falsch-positiver Diagnosen durch nicht vermehrungsfähige Zielkeime ist bedingt

durch die Verdünnung unwahrscheinlich. Außerdem beugt die Sensitivität des PCR-Systems,

die eben nicht absolut ist, mit einer Nachweisgrenze von 103 KbE Listeria monocytogenes pro

ml Anreicherungskultur dem Entstehen falsch-positiver Ergebnisse wirksam vor.

Diskussion

127

Die PCR-Produkte sind spezifisch und nach gelelektrophoretischer Auftrennung auf

Grundlage molekularer Größenunterschiede leicht und eindeutig zu identifizieren.

Es kommt aber mit der DNA des Schweinehackfleisches bzw. mit der DNA der kompetitiven

Flora zu Fehlannealing von Primern, wodurch ein typisches Bandenmuster entsteht. Je länger

die Dauer der Inkubation (Zunahme der Anzahl von Zielzellen), desto undeutlicher werden

diese Banden und verschwinden schließlich ganz.

Bei der Analyse von Schweinehackfleisch mit dem PCR/Agargel-Elektrophorese-System

kann es also zu einer Amplifikation von nicht-listerieller DNA kommen, die allerdings zu

keiner Fehlinterpretation im Sinne einer falsch-positiven Diagnose führte.

In der Hybridierungsregion eines Microarrays sind Sonden mit bekannter Spezifität (z. B.

Amplifikat einer Moncytogenes-DNA-Sequenz) an bestimmten Lokalisationen (Sondenfelder)

gebunden.

Die Nukleinsäuren-Hybridisierung ist eine hochempfindliche Reaktion komplementärer

Einzelstränge. Wenn ein unspezifisches DNA-Fragment vorliegt, kann der NUTRI®-Chip als

„functional gene array“ (FGA) dieses so lange von den Ziel-DNA-Fragmenten differenzieren,

wie der Anteil homologer Sequenzen des unspezifischen Fragmentes ca. 85 % nicht

übersteigt. Daher ist, wenn außer den vorgesehenen PCR-Produkten unspezifische Amplifi-

kate entstehen, eine Interferenz auf dem Microarray sehr unwahrscheinlich und wurde hier bei

Einsatz von Innocua-DNA nicht beobachtet.

Die Mehrzahl der im Schrifttum dargestellten PCR-Analysen, die Fleisch, Fleischerzeugnisse

sowie Geflügel umfassen, wurde nach einem oder auch zwei Anreicherungsschritten

durchgeführt. Dabei wurden Nachweisgrenzen zwischen 0,1 und 100 KbE Listeria

monocytogenes pro Gramm Lebensmittel ermittelt.

Als Bestandteile integraler PCR-Systeme – dotiertes Schweinehackfleisch (Einwaage von

25 g Hackfleisch mit ca. 20 KbE L monocytogenes pro Gramm), Inkubation in Halbfraser-

Bouillon bei 37°C, PCR-Reaktionsansätze für Agargel-Elektrophorese bzw. Microarray-

Analyse – haben sich die PCR-Systeme hier bewährt; sie sind schnell, hochsensitiv und

hochspezifisch.

Diskussion

128

Die Feldproben (v. a. LM auf Basis tierischer Rohstoffe) wurden 3-fach untersucht: mittels

kultureller Methode nach § 35 LMBG, PCR/Agargel-Elektrophorese und PCR/Microarray-

Analyse. Die Methoden zeigten eine gute Übereinstimmung.

Es lässt sich daraus ableiten, dass die Wahrscheinlichkeit, dass das Ergebnis einer Probe

richtig ist, relativ hoch ist. Die Nachweisergebnisse mittels Microarray-Analyse deuten an,

dass diese Methode sowohl spezifischer als auch sensitiver als die Agargel-Elektrophorese ist.

Die beiden molekularbiologischen Methoden produzierten mehr positive Ergebnisse als die

kulturelle Nachweismethode. Weil sich molekularbiologische Detektionsmethoden bereits in

früheren Arbeiten als mindestens so spezifisch und sensitiv erwiesen haben wie kulturelle

Methoden, ist davon auszugehen, dass es sich dabei um „richtig“-positive Nachweise von

Listeria monocytogenes handelt, die jedoch kulturell nicht identifiziert werden konnten.

Falsch-negative kulturelle Nachweise von Listeria monocytogenes sind zudem hinreichend

bekannt.

Für drei kulturell positive Feldproben konnte die Diagnose molekularbiologisch nicht

bestätigt werden. Eine Ursache wäre eine besonders niedrige initiale Kontamination mit

Listeria monocytogenes; in diesem Fall wäre die Nachweisgrenze der PCR-Systeme innerhalb

der 24-Stunden Anreicherung womöglich nicht erreicht worden.

Eine andere Möglichkeit ist, dass die Verwendung von älteren, zuvor tiefgefrorenen

Anreicherungskulturen tatsächlich nicht empfehlenswert ist, weil es darin bereits zu einer

Degradation der (Ziel-)DNA gekommen ist, wie NIEDERHAUSER et al. (1992) vermuteten.

Gezeigt wurde hier, dass mit einer molekularbiologischen Schnellmethode

(PCR/Microarray-Analyse) möglich ist, was nicht mit derselben Nachweissicherheit

kulturell erreicht werden konnte: Der Nachweis von Listeria monocytogenes in

Mischkontamination mit Listeria innocua.

Mit dem verwendeten NUTRI®-Chip können 13 KbE L. monocytogenes pro Gramm in

Schweinehackfleisch mit einer Sensitivität von 100 % nachgewiesen werden.

Dasselbe ist nach Anreicherung möglich, wenn das Schweinefleisch mit einer Mischkultur

kontaminiert ist (Verhältnis von Listeria monocytogenes zu Listeria innocua etwa 1:1,2).

Diese Bedingungen führten zwingend dazu, dass die DNA-Extrakte der Proben relativ mehr

Innocua-DNA als Monocytogenes-DNA enthielten.

Diskussion

129

In allen Proben erfolgte trotzdem mit uneingeschränkter Sicherheit die Wiederfindung des

Erregers anhand der Detektion spezifischer DNA. Alles deutet darauf hin, dass die

diagnostische Sensitivität (100 %) der Microarray-Analyse in keiner Weise durch das

kompetitive Wachstum von L. innocua beeinträchtigt ist.

Das PCR-Microarray-System ist damit dem kulturellen Referenzverfahren (Sensitivität bei

Mischkontaminationen im 1:1,2-Verhältnis: 53,6 %) nach DIN EN ISO Standard 11290-1

(1996) überlegen.

Für den erfolgreichen Nachweis wurde eine 24-stündige Inkubation der kompetitiven Keime

in vorgenommen. Die Signale, die die Anzahl der stattgehabten Hybridisierungen zwischen

Gensonden und Monocytogenes-Fragmenten semiquantitativ wiedergeben, waren über-

wiegend sehr stark; es ist davon auszugehen, dass der positive Nachweis auch nach einer

kürzeren Inkubationszeit möglich ist, als noch keine Analysen bezüglich einer

Mindestanreicherungszeit durchgeführt wurden. Weil der PCR-Reaktionsansatz für das

PCR/Agargel-Elektrophorese-System z. Z. der Durchführung der eigenen Untersuchungen

nicht lieferbar war, konnten mit diesem System zum Nachweis von Listeria monocytogenes

leider keine Versuchsreihen mit L. innocua-Mischkulturen in die Untersuchungen einbezogen

werden. Die Nachweissensitivität molekularbiologischer Nachweissysteme scheint aber nicht

durch L. innocua-DNA beeinflusst zu werden. L. monocytogenes erreichte in Mischkulturen

mit L. innocua – durchaus bei einem initialen Verhältnis von ca. 1:1 in Lebensmitteln – die

Nachweisgrenzen (STEWART u. GENDEL 1998; BESSER 2000).

Es ist auch aufgrund der molekularbiologischen Prinzipien (Spezifität der Primer für

Abschnitte von Virulenzgenen, Spezifität der Oligonukleotidsonden für Zielsequenzen) davon

auszugehen, dass auch hier kein negativer Einfluß zu ermitteln gewesen wäre.

Nach Kontrolle der Extraktion konnte in jedem Fall eine Kontamination mit Ziel-DNA

ausgeschlossen werden. Es wurden keine falsch-positiven Ergebnisse durch L. innocua-DNA

hervorgerufen.

Zur Kontrolle von mikrobiellen Kontaminationen in Lebensmitteln stellt die Microarray-

Analyse eine brauchbare Alternative zu kulturellen Methoden aber auch Schnellmethoden dar,

was die Erfahrungen anderer Autoren bestätigt (BUSCH et al. 2002).

Diskussion

130

Multiplex-PCR/Agargel-Elektrophorese im Vergleich mit anderen molekularbiologischen

Testsystemen (außer Microarray-Technologie)

Eine im Jahre 2002 veröffentlichte Studie beschreibt Untersuchungen von

Schweinehackfleisch mit dem kommerziellen BAX-System (BECKER und HOLZAPFEL

2002). Das Inokulationsniveau war dem hier gewählten sehr ähnlich (10 Kbe g-1), und die

Bebrütungstemperatur wurde ebenfalls auf 37°C erhöht. Der positive Nachweis erfolgte dort

immer nach 24 h PA und 3 h SA in Schweinehackfleisch mit 10 - 100 KbE g-1. Bei BECKER

und HOLZAPFEL (2002) wurde jedoch nicht die Inkubationsdauer sondern die Inokulations-

höhe variiert (bis 105 KbE g-1).

Diese Ergebnisse korrespondieren mit den eigenen Resultaten.

Sowohl in Rinder- als auch in Schweinehackfleisch betrug die Nachweisgrenze einer

Multiplex-PCR 40 KbE pro 10 Gramm, wobei die Anreicherung zwischen 20 und 24 Stunden

dauerte (NIEDERHAUSER et al. 1992). Nach 24 Stunden selektiver Anreicherung konnten

1,2 KbE pro Gramm Rinderhackfleisch nachgewiesen werden (GOLSTEYN THOMAS et al.

1991).

Allerdings wurden keine Untersuchungen zur Mindestanreicherungszeit durchgeführt, und die

Analysefaktoren stimmen – die Nachweisführung als integrale Systeme betrachtend – nicht

mit den hier verwendeten überein.

Es lässt sich aber mutmaßen (und wäre zu überprüfen), dass bei einer Verlängerung der

Inkubation um 8 Stunden (Studie GOLSTEYN THOMAS et al. 1991) bzw. 4 bis zu 8

Stunden (NIEDERHAUSER et al. 1992) auch mit dem hier verwendeten PCR-System die

Identifizierung von Ziel-DNA möglich wäre.

Die kürzesten Inkubationszeiten bei r o h e m Hackfleisch (Rind) belaufen sich auf 4 bzw. 6

Stunden (DUFFY et al. 1999). Das Inokulationsniveau war allerdings deutlich höher (etwa

200 KbE pro Gramm), und es folgte zudem ein zusätzlicher Konzentrierungsschritt der

Keime. V. a. aufgrund dieser Sachverhalte ist ein Vergleich – wenn überhaupt – nur schwer

vorzunehmen.

Interessant ist, dass nach 16 Stunden Inkubation weniger als 1 KbE L. monocytogenes in

einem nicht-selektiven Anreicherungsmedium nachgewiesen wurde. Jede Probe war dabei mit

insgesamt drei Pathogenen (inkl. Salmonellen) inokuliert worden (KRISMER et al. 2002).

Diskussion

131

Es ist nicht bekannt, ob die Anreicherungszeiten weiter unterschritten wurden. Und es bleibt

fraglich, ob dieses Ergebnis infolge der Tatsache, dass es sich um ein anderes PCR-System

(Multiplex-seminested PCR) oder um eine andere Probenart (Leberpastete) handelte, zustande

kam.

Die eigenen Ergebnisse stellen die Möglichkeit in Aussicht, dass auch für die verwendeten

PCR-Systeme eine nicht-selektive Anreicherung kompatibel ist. Der Erfolg ist zwar möglich

aber eher fraglich, denn die Lebensmittel-typische Hackfleischflora liegt bekanntlich in hohen

Konzentrationen vor. Nichtsdestotrotz ist ein gleichzeitiger Nachweis mehrerer Zielkeime aus

einer einzigen Anreicherung reizvoll, weil es ein ökonomischeres Arbeiten bedeutete. Erste

Erfahrungen dazu sind vorhanden (BAILEY u. COX 1992; CLOAK 1999).

Multiplex-PCR/Microarray-Analyse im Vergleich mit anderen molekularbiologischen

Schnellmethoden

Die Mindestanreicherungszeit von 10 Stunden wird von keinem bekannten integralen PCR-

System unterschritten, das dem hier aufgestellten genügend ähnelt.

Die einzige Studie, die unter ähnlichen Größen eine kürzere Mindestanreicherungszeit

(2 Stunden) präsentiert, ist die von KLEIN und JUNEJA (1997). Leider hinkt der Vergleich

insofern, als dass das Hackfleisch (Rind) im gegarten Zustand beimpft wurde. Die

kompetitive Flora war somit praktisch nicht mehr vorhanden, was einem soliden Vergleich

die Grundlage entzieht.

Microarrays lassen sich hervorragend automatisiert analysieren. Sie unterscheiden sich damit

von der Agargel-Elektrophorese, bei der das Probenaufkommen je Durchgang begrenzt ist;

zudem entfällt die Visualisierung der DNA-Banden mittels Ethidiumbromid, das umfang-

reiche Vorsichtsmaßnahmen im Umgang zum Schutz vor einer mutagenen / teratogenen

Gesundheitsgefährdung erfordert.

Fazit:

Die Leistungsfähigkeit der verwendeten PCR-Systeme entspricht – mindestens bezüglich der

Anwendung auf Schweinehackfleischproben – somit den Anforderungen, die an ein

molekularbiologisches Verfahren gestellt werden können. Die Kompatibilität der einzelnen

Faktoren zueinander konnte belegt werden.

Diskussion

132


Schweinehackfleisch mittels ELISA

Methodische Charakterisierung des Sandwich-ELISA

Die methodische Sensitivität dieses ELISA-Tests entspricht den Herstellerangaben. Die

Nachweisgrenze lag bei 107 KbE Listeria monocytogenes pro ml. Ab 105 KbE werden

„zweifelhaft positive“ Nachweise erhalten.

Der Zusatz von Brillantschwarz wirkte sich nicht nachteilig auf die Nachweisgrenze aus.

Diagnostische Charakterisierung des Sandwich-ELISA

Schweinehackfleisch enthielt nach dem Dotieren etwa 20 – 30 KbE Listeria monocytogenes

pro Gramm. Die Mindestanreicherungszeit (Dauer der Anreicherung, nach der zum ersten

Mal in allen 25 g-Proben L. monocytogenes nachgewiesen werden konnte) in Halbfraser-

Bouillon bzw. zweistufig in Halbfraser- plus Fraser-Bouillon (18 Stunden PA plus 6 Stunden

SA) betrug in Verbindung mit dem Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA

24 Stunden.

Für einen sicheren qualitativen Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln mit

dem Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA konnte die Herstellerempfehlung für die

Dauer der Anreicherung (48 Stunden) damit weit unterschritten werden. Die Ergebnisse lagen

ca. 27,5 Stunden nach Beginn der Inkubation vor.

Nach der Empfehlung des BgVV sollte die L. monocytogenes-Konzentration nicht mehr als

100 KbE pro Gramm Lebensmittel betragen. Die Inkubationszeiten für Schweinehackfleisch

können kürzer sein, als die vom Hersteller – allgemein für alle Lebensmittel – empfohlene

Gesamtinkubationszeit einer 2-stufigen Anreicherung (48 Stunden).

Um Monocytogenes-Konzentrationen in Schweinehackfleisch, die weit unterhalb des BgVV-

Richtwertes liegen, nachzuweisen, sind wahrscheinlich Inkubationszeiten (weit) u n t e r

48 Stunden ausreichend.

Der Hersteller des Transia plate® Listeria monocytogenes-ELISA empfiehlt als erstes

selektives Anreicherungsmedium den Einsatz von L-PALCAM-Bouillon (anstelle von Halb-

fraser-Bouillon). Aliquote von Halbfraser- bzw. Fraser-Anreicherungskulturen (0,1 ml; hitze-

denaturiert) konnten hier der ELISA-Analyse direkt und erfolgreich zugeführt werden.

Diskussion

133

Die integralen Bestandteile des Testsystems, bestehend aus

a) Halbfraser- und Fraser-Bouillon,

b) Inkubationstemperatur 37°C,

c) 1-stufiger bzw. 2-stufiger selektiver Anreicherung (Mindestanreicherungszeit 24

Stunden),

d) Schweinehackfleisch (kontaminiert mit ca. 20 – 30 KbE Listeria monocytogenes pro

Gramm) und

e) Sandwich-ELISA (Transia plate® Listeria monocytogenes)

erwiesen sich als kompatibel.

Die Zuhilfenahme einer Anreicherung zum Erreichen der Zielkeim-Konzentration ist

außerdem insofern vorteilhaft, da weniger Anteile der Lebensmittelprobe in dem Aliquot, das

mit dem ELISA zu untersuchen ist, vorhanden sind. Ein negativer Einfluß auf die

Nachweisgrenze des ELISA-Systems wird dadurch unwahrscheinlicher (BECKER et al.

1998). Im Rahmen der eigenen Arbeiten gestaltete sich insbesondere das Aliquotieren der

Primäranreicherung, d. h. das Pipettieren eines kleinen Volumens von 100 µl mit einer

entsprechend englumigen Pipette, als nicht unproblematisch. Bestandteile des Schweine-

hackfleisches (v. a. Faszien, fetthaltig) erschwerten den Arbeitsschritt z. T. beträchtlich.

Allerdings muß für das Vornehmen einer Sekundäranreicherung die gleiche Menge überführt

werden, was den Arbeitsaufwand relativiert.

Bei Unterschreiten der Mindestanreicherungszeit waren nach einstufiger Anreicherung

(21 Stunden und weniger) noch immer mehr Proben positiv als nach der zweistufigen

Anreicherung (18 Stunden plus 5 bzw. 4 Stunden).

Eine Inhibition der Immunoreaktion durch Lebensmittelkomponenten in einer 24-Stunden-

PA-Anreicherungskultur beeinträchtigte die Nachweisrate weniger als das Verdünnen von 0,1

ml PA-Anreicherungskultur in 10 ml SA-Anreicherungsmedium (enthielt dann annähernd

105 KbE pro ml). Nach 6 Stunden SA erreichte die Erregerkonzentration wieder die

Nachweisgrenze des ELISA.

Diskussion

134

Der Vorteil einer Anreicherung mit nachfolgender Denaturierung der Zellen, wie es in vielen

Fällen vor der Durchführung eines ELISA üblich ist, bietet Laboranten den Vorteil, in

geringerem Umfang mit infektiösen Materialien umgehen zu müssen. Dieser Vorteil besteht

v. a. gegenüber den direkten Konzentrierungsmethoden (wie bei SHERIDAN et al. 1991;

1997).

KERDAHI und ISTAFANOS (2000) untersuchten Lebensmittel (mit zwei unterschiedlichen

Kontaminationsniveaus dotiert) mit VIDAS LMO. Bei geringer kontaminierten Lebensmitteln

erhielten auch sie zunächst für etwa jede zehnte Probe ein falsch-negatives Resultat. Nach

einer Reinkubation über 24 Stunden waren allerdings auch in diesen Anreicherungskulturen

die Nachweisgrenzen erreicht, und der Test lieferte in allen dotierten Proben positive

Nachweise von L. monocytogenes.

Die Nachweisrate steht also in deutlicher Abhängigkeit zur anfänglichen Kontaminationsrate

bzw. zur Dauer der Anreicherung (KERR et al. 1990; KERDAHI u. ISTAFANOS 2000;

KLEINER u. SCHINKEL 2002); letzteres kann anhand der eigenen Ergebnisse bestätigt

werden.

In vielen Studien wird die sekundäre Anreicherung über 24 ± wenige Stunden praktiziert. Die

primäre Anreicherungskultur in Halbfraser unterstützt aber das Listerienwachstum in dem

Maße, dass angenommen werden kann, dass ein relativ k u r z e r zweiter

Anreicherungsschritt von wenigen Stunden genügen müsste, den Listerien eine Vermehrung

bis über die Nachweisgrenze eines ELISA-(oder auch PCR-)Systems zu ermöglichen

(s. eigene Ergebnisse; BECKER u. HOLZAPFEL 2002).

In anderen Studien wurde die Abhängigkeit des immunologischen Listerien-Nachweises von

der untersuchten Lebensmittelmatrix deutlich (vgl. BEUMER u. BRINKMAN 1989;

HEISICK et al. 1989; BARBUTI et al. 1995). Zwar wurde im Rahmen der vorliegenden

Arbeit ausschließlich mit Hackfleisch vom Schwein und dem Transia plate Listeria

monocytogenes gearbeitet, aber mit Blick auf die bereits veröffentlichten Studien kann

hypothetisch von der Annahme ausgegangen werden, dass der ELISA-Nachweis von

Listerien in Schweinehackfleisch mit einer höheren Sensitivität einhergeht als der ELISA-

Nachweis von Listerien in Fleischerzeugnissen bzw. mit einer geringeren methodischen

Sensitivität einhergeht als der ELISA-Nachweis von Listerien in Milch.

Diskussion

135

Ergebnisse verschiedener Testkits lassen sich nur bedingt einem Vergleich unterziehen. Ein

verlässlicher Vergleich wäre nur dann möglich, wenn alle Faktoren eines Testsystems mit

Ausnahme des zu vergleichenden Testkits identisch wären.

Beachtet man z. B. die Vorgehensweise von BECKER et al. (1998), wird die unterschiedliche

Effektivität von Listeria-Anreicherungsmedien deutlich.

So könnte z. B. nicht automatisch davon ausgegangen werden, dass für L-PALCAM-Bouillon

dieselbe Mindestanreicherungszeit ermittelt worden wäre. Wahrscheinlich wären mit dem hier

untersuchten Testsystem, bei dem nur der integrale Bestandteil „Art der Lebensmittelprobe“

verändert wäre, die Mindestanreicherungszeit für z. B. eine Salami gegenüber der des

Schweinehackfleischs verlängert (vgl. BARBUTI et al. 1995).

Bei Studien über die Leistungsfähigkeit des Pathalert Listeria monocytogenes war dieses

Testsystem (wie auch der VIDAS LMO) für falsch-negative Ergebnisse anfällig. Es konnte

aber gezeigt werden, dass der Nachweis aus Mischkulturen von L. monocytogenes und

L. innocua möglich ist (BECKER et al. 1998). Die Untersuchungen wurden anhand von

Feldproben – also mit unbekanntem Kontaminationsgrad – durchgeführt, wobei es sich aber

v. a. um Käsearten und in keinem Fall um Fleisch oder Fleischerzeugnisse handelte.

Speziell für den Transia plate Listeria monocytogenes-ELISA in Verbindung mit DIN EN

ISO-Standard 11290-1 (1996) ist belegt, dass der Zoonoseerreger immunologisch mit der

gleichen Sensitivität wie die ISO-Methode nachgewiesen werden kann (KLEINER und

SCHINKEL 2002).

Der ELISA identifizierte den Zielkeim dabei noch bei n i e d r i g s t e n initialen

Kontaminationsraten nach 43 / 47 Stunden Gesamtinkubationszeit.

Auch allgemein verfügten ELISA-Systeme mindestens über dieselbe Sensitivität wie die

bisher entwickelten kulturellen Methoden (BEUMER u. BRINKMAN 1989; MATTINGLY

et al. 1988; WALKER et al. 1990; KERR et al. 1990; HEISICK et al. 1989;

UYTTENDAELE et al. 1995; BECKER et al. 1998). Verschiedene kulturelle Verfahren (u. a.

Referenzmethode nach § 35 LMBG) produzieren, auch gegenüber immunologischen

Systemen, falsch-negative Ergebnisse. Abzuwarten ist, inwieweit die Kombination eines

immunologischen Verfahrens mit einer Gensonde (KERDAHI und ISTAFANOS 2000) sich

auf künftige Nachweisgrenzen - auch innerhalb kürzerer Anreicherungszeiten - auswirkt.

Diskussion

136

Für den Nachweis von Listeria monocytogenes in der Lebensmitteldiagnostik erwies sich der

Transia plate Listeria monocytogenes-ELISA besonders unter den speziellen Versuchs-

bedingungen (Hackfleisch vom Schwein, Anreicherungsmedium Halbfraser- bzw. Fraser-

Bouillon, Inkubation bei 37°C) als sehr gut geeignet.

5.5 Bedeutung der Halbfraser-Anreicherungskultur in Verbindung mit Schnell-

methoden

Die Schwärzung der Halbfraser-Anreicherungskultur zeigt präsumtiv die Anwesenheit von

Listerien in einer Probe an. Je höher die Kontaminationsrate ist, desto früher setzt der

Farbumschlag ein. Der Farbumschlag verläuft graduell, bis schließlich die endgültige

schwarze Farbe vorliegt. Der Grad der Färbung erlaubt somit indirekt Rückschlüsse auf eine

mögliche Listerien-Konzentration.

Wenn bereits erste Merkmale des Farbumschlags erkennbar sind, könnten diese indizieren,

dass die Analyse mit einer Schnellmethode zu diesem Zeitpunkt bereits Aussicht auf Erfolg

hat. Eine k u r z e Verlängerung der Inkubation um wenige Stunden bzw. ein kurzer

sekundärer Anreicherungsschritt könnte in diesem Fall möglicherweise ausreichen, um den

Nachweis zu ermöglichen.

5.6 Vergleich der Schnellmethoden

Betrachtet man die Mindestanreicherungszeiten der Schnellmethoden (PCR/Agargel-

Elektrophorese, PCR/Microarray-Analyse und Sandwich-ELISA), ergibt sich für diese

„integralen“ Systeme folgende Sensitivitätsreihe (Abb. 5):

PCR/ PCR/ Microarray-Analyse >> Agargel-Elektrophorese >> Sandwich-ELISA

Mindestanreicherungszeit

10 h


16 h


24 h

Abb.5: Sensitivitätsreihe der verwendeten Schnellmethoden (erstellt unter Berücksichtigung der Mindestanreicherungszeit).

Diskussion

137

Die Abhängigkeit – sowohl einer molekularbiologischen als auch einer immunologischen

Analyse bei dem Nachweis von Listerien – von verschiedenen Faktoren (Lebensmittelmatrix

inkl. deren begleitende Flora, Anreicherungsmedium, Inkubationsdauer, Nachweisgrenze des

Testsystems und möglicherweise auch die Inkubationstemperatur) erschwert einen Vergleich

zwischen verschiedenen Studien, deren Versuchsbedingungen sich zumeist in mehr als einem

dieser Faktoren unterscheiden. Nur integrale Systeme, die sich lediglich in einem Faktor

(z. B. Lebensmittel) unterscheiden, können miteinander verglichen werden.

Das bedeutet außerdem, dass die oben erstellte Sensitivitätsreihe ausschließlich für die hier

verwendeten Versuchsbedingungen ohne Einschränkungen angenommen werden kann.

Der Zeitaufwand in Abhängigkeit von der verwendeten Methode ist der Tabelle 30 zu

entnehmen. Alle Schnellmethoden führten zu einer drastischen Reduzierung der Analysen-

dauer. Microarray und ELISA sind dabei besonders interessante Technologien, weil die

Analyse automatisiert durchgeführt werden kann.

Tab. 30: Mindestanreicherungszeiten und Zeitaufwand für einen zuverlässigen positiven Nachweis von Listeria monocytogenes in künstlich kontaminiertem Hackfleisch vom Schwein.

Methode PCR

Microarray-Analyse (NUTRI®-Chip)

PCR Agarosegel-

Elektrophorese

Transia plate® Listeria

monocytogenes- Sandwich-ELISA

*Mindest-anreicherungszeit

10 h 16 h 24 h

**Arbeitsschritte zwischen

Anreicherung und Analye

11,5 – 13,5 h 9,5 –10,5 h 25 Minuten

Analyse 5 Minuten 45 Minuten 3 h

Zeitaufwand insgesamt 24 h max. 28 h 27,5 h

* Gilt bei Einsatz von Halbfraser-Bouillon wie nach § 35 LMBG beschrieben. ** Der Zeitaufwand für diese Zwischenschritte ist abhängig von der Probenanzahl. Die Angabe beruht auf eigenen Erfahrungswerten.

Diskussion

138

Die Mindestanreicherungszeiten bestätigen die theoretischen Erwartungen an die Sensitivität

eines PCR-Systems. Das überlegene Prinzip der Hybridisierung gegenüber der Detektion

mittels Agargel-Elektrophorese wurde bereits in anderen Studien demonstriert (KLEIN u.

JUNEJA 1997).

Ausblick

Alle drei Methoden würden von einer verbesserten Anreicherungsprozedur bzw. einem

verbesserten Konzentrierungsschritt profitieren.

Die Präparation der DNA ist ein wichtiger Schritt in der Analyse, der noch

anpassungsbedürftig ist: Die CTAB-Methode – beschrieben in der Amtlichen Sammlung zur

Durchführung der PCR – kann durch andere Extraktionsmethoden ersetzt werden, die

innerhalb von 50 % der benötigten Zeit brauchbare DNA-Extrakte liefern, mit denen die

Identifizierung von Monocytogenes-spezifischer DNA möglich ist.

Jedenfalls ist hier noch Potential zur Verkürzung der Nachweisdauer gegeben (DNA-

Extraktion für BAX-System benötigt ca. 2,5 Stunden). Mit der derzeit erhältlichen Version

des NUTRI®-Chips wäre dann der Nachweis von Listeria monocytogenes bereits innerhalb

von ca. 20 Stunden möglich.

Der Anspruch zur Verkürzung der Nachweiszeit sollte damit allerdings noch nicht erfüllt sein.

Weiterhin gilt es festzustellen, ob der Nachweis von Listeria monocytogenes mit einer

Methode in Anwesenheit einer starken kompetitiven Begleitflora (in der vorliegenden Studie

vertreten durch Listeria innocua) beeinträchtigt ist. Darüberhinaus ist von Interesse, inwieweit

dieser Einfluß ein Nachweissystem beeinträchtigt, was z. B. anhand der Ermittlung der

Mindestanreicherungszeit ermessen werden kann.

Die gleichzeitige Prüfung verschiedener Methoden unter denselben Bedingungen kann eine

graduelle Gewichtung über den praktischen Wert dieser Methoden ermöglichen.

Speziell für die Microarray-Analyse wäre der nächste Schritt nach Abschluß dieser Studie, die

Sensitivität mit der Mindestanreicherungszeit als Parameter in Gegenwart von z. B. Listeria

Diskussion

139

innocua zu testen. Das ELISA- wie auch das Multiplex-PCR-System sollten in gleicher Weise

getestet werden.

Dabei ist es nicht die methodische Sensitivität, die in Frage gestellt wird, sondern die

Effektivität der selektiven Anreicherung.

Zwar wurde in der vorliegenden Arbeit dargestellt, dass übliche selektive Anreicherungs-

medien (hier Halbfraser-Bouillon) das Wachstum von Listerien ausreichend fördern, aber in

welchem Maße eine stark vermehrungsfähige begleitende Flora die Nachweisqualität

beeinflusst, kann hier nur am Beispiel von Listeria innocua erahnt werden.

Enzymimmunoassays, die vielfach als ELISA konzipiert sind und eine breite Akzeptanz

genießen, sind in einer größeren Anzahl auf dem Markt erhältlich; die meisten sind ebenfalls

voll automatisierbar. Ein Format wie eine 96-Loch-Mikrotiterplatte ist aber auch für kleinere

(betriebliche) Labore geeignet. Das Potential zur Steigerung der methodischen Sensitivität für

Enzymimmunoassays besteht in der Entwicklung neuer, rekombinanter Antikörper (VON

BLANKENFELD-ENKVIST u. BRÄNNBACK 2002). Die PCR ist für größere Betriebs-

einheiten geeignet. Das Potential ist auch heutzutage noch nicht ausgeschöpft bzw. an die

Anwendung in der Lebensmitteldiagnostik angepasst.

Wie sich hier zeigte, sind methodische und diagnostische Sensitivität des Microarray-

Systems, hier repräsentiert durch den NUTRI®-Chip, anderen Methoden überlegen.

Der Vorteil eines Microarrays ist, dass die Anzahl der Sondenfelder mit unterschiedlichen

Spezifitäten praktisch beliebig ist. Aus diesem Grund erwartet man im Bereich der

mikrobiologischen (Lebensmittel-)Diagnostik einen Durchbruch der Microarray-Analyse, die

allgemein als die vielversprechendste unter den (Schnell-)Methoden anzusehen und zudem

kostengünstig und im routinemäßigen Gebrauch einsetzbar ist.

Im Rahmen von HACCP-Konzepten besteht damit erstmals die Möglichkeit, geeignete

Kontrollmaßnahmen insbesondere auch im Bereich roher Lebensmittel / Rohstoffe von

Lebensmitteln hinsichtlich bakterieller Parameter von Critical Control Points (CCPs) zu

konstruieren.

Zusammenfassung

140

6. Zusammenfassung


Untersuchungen zum Nachweis von Listeria monocytogenes in Schweine-

hackfleisch: Kulturelle Referenzmethode, ELISA, PCR und Microarray.

Die vorliegende Untersuchung diente dem vergleichenden Nachweis von Listeria

monocytogenes in dotiertem Hackfleisch mittels kultureller Referenzmethode nach § 35

LMBG, ELISA (Transia plate Listeria monocytogenes), Multiplex-PCR und Microarray in

Hinblick auf Sensitivität und Spezifität. Daneben erfolgte eine vergleichende Untersuchung

von 71 Feldproben von Lebensmitteln, von denen in 49 Proben zuvor kulturell der Nachweis

von Listeria monocytogenes erfolgt war.

Schweinehackfleisch wurde unter kontrollierten Bedingungen mit 20 – 30 KbE L. monocyto-

genes pro Gramm inokuliert. Die homogene Verteilung wurde über Färbeversuche des

Probengutes mit einem zu der Keimsuspension zugemischten Lebensmittelfarbstoff (Brillant-

schwarz, E 151) kontrolliert.

Außerdem wurden in einem weiteren Ansatz Hackfleischproben mit Mischkulturen von

Listeria monocytogenes und Listeria innocua im Verhältnis 1:1,2 inokuliert.

Die dotierten Proben wurden anschließend in selektiven Anreicherungsmedien inkubiert. Für

die kulturelle Referenzmethode wurde eine primäre Anreicherung bei 30°C und für ELISA,

PCR und Microarray eine Anreicherung bei 37°C in Halbfraser-Bouillon durchgeführt. Für

die kulturelle Nachweisführung erfolgte zudem eine Sekundäranreicherung.

Zur Bestimmung der für die Schnellmethoden erforderlichen Mindestanreicherungszeiten,

anhand derer die Sensitivität der einzelnen Methoden zu bemessen war, wurde die Dauer der

Inkubation variiert und sukzessive reduziert. Der Zeitraum der Inkubation, nach dem erstmals

jede Probe als Listeria monocytogenes-positiv bewertet werden konnte, wurde als

Mindestanreicherungszeit definiert.

Zusammenfassung

141

Mit der kulturellen Nachweismethode konnte Listeria monocytogenes mit einem Gesamt-

untersuchungsaufwand von 5 Tagen in 100 % der Proben nachgewiesen werden. Bei

Mischinokulationen mit Listeria innocua war der Zielkeim Listeria monocytogenes in 46,7 %

der Proben nicht nachweisbar.

Mit dem ELISA wurde Listeria monocytogenes nach einer Mindestanreicherungszeit von 24

Stunden in allen Proben nachgewiesen.

Die Multiplex-PCR führte bereits nach einer Anreicherungszeit von 16 Stunden in 100 % der

Proben zum sicheren Nachweis von Listeria monocytogenes.

Als sensitivste Nachweismethode wurde die Microarray-Analyse identifiziert, bei der eine

Mindestanreicherungszeit von lediglich 10 Stunden erforderlich war, um eine ursprüngliche

Kontamination von 13 KbE Listeria monocytogenes pro Gramm sicher nachzuweisen.

Beeinträchtigungen durch Mischkontaminationen mit Listeria innocua traten ebenfalls nicht

auf.

Der Vergleich der Nachweismethoden anhand von Untersuchungen von Feldproben auf eine

natürliche Kontamination mit Listeria monocytogenes ergab insgesamt eine 86,6 %ige Über-

einstimmung der Schnellmethoden mit den kulturell erhobenen Ergebnissen. In 6 bzw. 5 von

22 Proben konnte mit PCR bzw. Microarray eindeutig Listeria monocytogenes nachgewiesen

werden, obwohl diese mittels kultureller Referenzmethode als negativ diagnostiziert wurden.

Summary

142

7. Summary


Investigations on the detection of Listeria monocytogenes in minced pork:

Cultural reference method, ELISA, PCR, and Microarray.

Abstract Species-specific detection of Listeria monocytogenes contaminating ground pork was

demonstrated by performing various methods. For this purpose, samples were artificially

inoculated with about 20 - 30 cfu g-1. Special care was taken with the homogenous

distribution of the inoculated bacteria by colouring of the ground pork with an additive

(E 151). For control, the inoculated ground pork had to get evenly blue-coloured.

As a conventional method, DIN EN ISO 11290-1 (1996), and as rapid methods multiplex

PCR (detection of target DNA with agarose gel electrophoresis and also with microarray

analysis, respectively) as well as a sandwich-ELISA were performed. Generally, to reach

level of detection, the amount of target cells needed to be increased. This was done by

selective enrichment carried out in half-Fraser broth at 30°C (conventional method) or 37°C

(rapid methods). Conditions served well to support growth of target cells in a most

satisfactory way.

As long as Listeria innocua was absent, cultural DIN EN ISO method (1996) gave no false-

negative results. The rate of detection was 100 %, and results were obtained within 5 days.

However, in presence of Listeria innocua, which is the most frequent indicator for a

contamination with Listeria monocytogenes in meat and meat products (often occurs in mixed

contamination with this pathogen), sensitivity was reduced considerably. Almost 50 % of the

samples, contaminated artificially with both species in mixed culture, escaped detection.

Therefore, new types of solid media, which have been designed to differentiate between

Listeria monocytogenes and other Listeriae, e. g. ALOA, a chromogenic medium, should be

integrated with the current official cultural method (according to § 35 LMBG).

Summary

143

Transia plate™ Listeria monocytogenes ELISA system served as well as the other rapid

methods did. It is to be found superior to the current official cultural method, since positive or

negative findings are possibly available within 28 hours after starting enrichment. The

minimum enrichment period – determined with 24 hours – represents the high sensitivity of

the ELISA method, though the ELISA is not as sensitive as methods based on molecular

biology techniques.

By amplification of two virulence gene fragments, multiplex PCR followed by agarose gel

electrophoresis gives evidence of Listeria monocytogenes with equal reliability. The detection

of DNA was less sensitive when performed with microarrays: with agarose gel

electrophoresis, it took 16 hours of enrichment to detect the pathogen in every sample.

Running DNA microarray analysis, this innovative method of detection proved to be the most

rapid, since the most reduced enrichment period led to a positive finding. For this purpose,

enrichment period could be reduced to a minimum of 10 hours. Positive detection was

possible with the smallest amounts of target cells in comparison with the other methods used

here.

In contrast to the official cultural method, microarray analysis, at any rate, made detection of

Listeria monocytogenes feasible even in mixed contamination with Listeria innocua. With

naturally contaminated foods, both PCR detection systems led to satisfactory results.

Microarray analysis is predetermined for automation. Furthermore, the employed NUTRI™-

Chip is also prepared with probes against specific DNA-sequences of Salmonella and

Campylobacter. A simultaneous detection of three food-borne pathogens in one food sample

then becomes possible.

However when tested, each detection system proved especially compatible with any of the

single factors given: target organism, enrichment medium, length of incubation or minimum

enrichment period (characteristics of applied detection methods). Furthermore, they constitute

integral systems that should be useful for routine application.

These rapid methods are most r e l i a b l e and t i m e – s a v i n g with diagnosis obtained

on the second day of analysis. Microarray analysis is the most sensitive rapid method.

Schrifttumsverzeichnis

144

8. Schrifttumsverzeichnis

AMTSBERG, G., A. ELSNER, H. A. GABBAR u. W. WINKENWERDER (1969):

Die epidemiologische und lebensmittelhygienische Bedeutung der Listerieninfektion des Rindes.

Dtsch. Tierärztl. Wschr. 76, 497 - 501

ANONYM (1991):

Listeria monocytogenes – recommendations by the National Advisory Commitee on Microbiological

Criteria for Foods.

Int. J. Food Microbiol. 14, 185 - 246

ANONYM (1998):

Untersuchung von Lebensmitteln: Horizontales Verfahren für den Nachweis und die Zählung von

Listeria monoctogenes. Teil 1: Nachweisverfahren (L. 00.00.32).

in: Amtliche Sammlung nach Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG (1998) (Übernahme der

gleichnamigen DIN-Norm DIN EN ISO 11290-1, Ausgabe März 1997).

ANONYM (1999):

Ratgeber Infektionskrankheiten – Listeriose.

[Internet: www.rki.de]

ANONYM (2000):

Listeriosis.

[www.cdc.gov]

ANONYM (2002):

Empfehlungen des BgVV - Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln mit der

Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

Bundesgesundheitsbl. 45, 59 - 66

BAILEY, J. S. (1998):

Detection of Salmonella cells within 24 to 26 hours in poultry samples with the polymerase chain

reaction BAX system.

J. Food Prot. 61, 792 - 795


145

BAILEY, J. S. u. N. A. COX (1992):

Universal preenrichment broth for the simultaneous detection of Salmonella and Listeria in foods.

J. Food Protect. 55, 256 - 259

BANSAL, N. S., F. H. Y. McDONELL, A. SMITH, G. ARNOLD u. G. F. IBRAHIM (1996):

Multiplex PCR assay for the routine detection of Listeria in food.


BARBUTI, S., E. PANCINI u. G. DELLAPINA (1995):

Use of an immunochromatographic method for rapid determination of Listeria in meat products.

Industria conserve 70, 398 - 403

BASSLER, H. A., S. J. A. FLOOD, K. J. LIVAK, J. MARMARO, R. KNORR u. C. A. BATT (1995):

Use of a fluorogenic probe in a PCR- based assay for the detection of Listeria monocytogenes.

Appl. Environ. Microbiol. 61, 3724 - 3728

BAUMGART, J. (1997):

Kapitel II.4: Herstellung von Verdünnungen.

in: J. BAUMGART (Hrsg.): Mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln.

Behr`s Verlag, Hamburg, S. 1

BAUMGART, J., H. BECKER, J. BOCKEMÜHL, A. LEHMACHER u. E. MÄRTLBAUER (1997):

Kapitel III: Nachweis von Mikroorganismen.

in: J. BAUMGART (Hrsg.): Mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln.

Behr`s Verlag, Hamburg

BAUWENS, L., F. VERCAMMEN u. A. HERTSENS (2003):

Detection of pathogenic Listeria spp. in zoo animal faeces: use of immunomagnetic separation and a

chromogenic isolation medium.

Vet. Microbiol. 91, 115 - 123

BECKER, B. u. J. MURPHY (2001):

Vergleichende Untersuchungen zum schnellen Nachweis von Listeria monocytogenes mittels eines

Gensondentests und eines chromogenen Mediums.

in: DVG (Hrsg.) (2001): Proceedings der 41. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebens-

mittelhygiene“, Garmisch-Partenkirchen, S. 436 - 441


146

BECKER, B. u. W. H. HOLZAPFEL (2000):

Erhöhte Listeriose-Gefahr in Deutschland?

[Internet: www.bml.de/forschungsreport]

BECKER, B. u. W. H. HOLZAPFEL (2002):

Application of a simple PCR assay for the rapid detection of Listeria monocytogenes in minced meat.

Arch. Lebensmittelhyg. 53, 73 - 96

BECKER, H., G. SCHALLER, M. FAROUQ u. E. MÄRTLBAUER (1998):

Nachweis einiger pathogener Mikroorganismen in Lebensmitteln mit kommerziellen Testkits – Teil 2:

Nachweis von Listerien.


BEJ, A. K., R. J. STEFFAN, J. DICESARE, L. HAFF u. R. M. ATLAS (1990):

Detection of coliform bacteria in water by polymerase chain reaction and gene probes.


BESSER, I. (2000):

Untersuchungen zur Optimierung und Prüfung spezifischer PCR-Nachweisverfahren für Listeria

monocytogenes in Milchprodukten.

München, Univ., Tierärztl. Fak., Diss.

BESSESEN, M. T., Q. LUO, H. A. ROTBART, M. J. BLASER u. R. T. ELLISON (1990):

Detection of Listeria monocytogenes by using the polymerase chain reaction.

Appl. Environ. Microbiol. 56, 2930 – 2932

BEUMER, R. R. u. E. BRINKMAN (1989):

Detection of Listeria spp. with a monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA).

Food Microbiol. 6, 171 - 177

BEUMER, R. R., M. C. TE GIFFEL u. F. M. ROMBOUTS (1996):

A comparison of rapid methods for the detection of Listeria spp. and Listeria monocytogenes.

in: R. R. BEUMER: Listeria monocytogenes – detection and behaviour in food and in the

environment.

Thesis Landbouwuniversiteit Wageningen, Niederlande


147

BEUMER, R. R. u. W. C. HAZELEGER (2003):

Listeria monocytogenes: diagnostic problems.

FEMS Immunology and Medical Microbiol. 35, 191 - 197

BHUNIA, A. K., P. H. BALL, A. T. FUAD, B. W. KURZ, J. W. EMERSON u. M. G. JOHNSON

(1991):

Development and characterization of a monoclonal antibody specific for Listeria monocytogenes and

Listeria innocua.

Infect. Immun. 59, 3176 - 3184

BOBBITT, J. A. u. R. P. BETTS (1992):

Confirmation of Listeria monocytogenes using a commercially available nucleic acid probe.


BOERLIN, P., J. ROCOURT, F. GRIMONT, P. A. D. GRIMONT, C. JACQUET u. J. C.

PIFFARETTI (1992):

Listeria ivanovii subsp. londoniensis subsp. nov.

Int. J. System. Bacteriol. 42, 69 - 73

BOJSEN-M∅ LLER, J. (1964):

Occurence of Listeria moncytogenes in feces from healthy and sick persons.

Proc. Scan. Congr. Pathol. Microbiol. 14, 97 - 98

zit. nach M. L. GRAY u. A. H. KILLINGER (1966): Listeria monocytogenes and listeric infections.

Bacteriol. Rev. 30, 309 - 382

BORDER, P. M., J. J. HOWARD, G. S. PLASTOW u. K. W. SIGGENS (1990):

Detection of Listeria species and Listeria monocytogenes using polymerase chain reaction.

Lett. Appl. Microbiol. 11, 158 - 162

BREUER, J. u. O. PRÄNDL (1988):

Nachweis von Listerien und deren Vorkommen in Hackfleisch und Mettwürsten in Österreich.


BRUNNER, B. u. M. BÜLTE (2000):

Umgebungs- und Produktuntersuchungen auf Listeria monocytogenes mit PCR-Systemen.




148

BRUNNER, B. u. M. BÜLTE (2001):

Eignung des Listeria monocytogenes-Blutagars (LMBA) zum Nachweis von Listeria monocytogenes.



BUBERT, A., S. KÖHLER u. W. GOEBEL (1992a):

The homologous and heterologous regions within the iap gene allow genus- and species-specific

identification of Listeria spp. by polymerase chain reaction.


BUBERT, A., M. KUHN, W. GOEBEL u. S. KÖHLER (1992b):

Structural and functional properties of the p60 proteins from different Listeria species.

J. Bacteriol. 174, 8166 - 8171

BUBERT, A., P. SCHUBERT, S. KÖHLER, R. FRANK u. W. GOEBEL (1994):

Synthetic peptides derived from the Listeria monocytogenes p60 protein as antigens for the generation

of polyclonal antibodies specific for secreted cell-free L. monocytogenes p60 proteins.


BUBERT, A., I. HEIN, M. RAUCH, A. LEHNER, B. YOON, W. GOEBEL u. M. WAGNER (1999):

Detection and differentiation of Listeria spp. by a single reaction based on Multiplex PCR.


BÜLTE, M., P. SIMON u. B. KRATZHELLER (2003):

Die Erfassung von Listerien in Lebensmitteln mit dem ALOA-Medium – gleichzeitig ein Beitrag zur

Ökologie der Listerien.



BUNČIĆ, S. (1991):

The incidence of Listeria monocytogenes in slaughtered animals, in meat, and in meat products in

Yugoslavia.



149

BUSCH, U., M. KNOLL-SAUER, B. MÜHLBAUER, R. ZUCKER, I. HUBER u. H. BECK (2002):

Nachweis von Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes und Salmonella

spp. mit dem NUTRI®-Chip-Analysekit.



BUTMAN, B. T., M. C. PLANK, R. J. DURHAM u. J. A. MATTINGLY (1988):

Monoclonal antibodies which identify a genus-specific Listeria antigen.


CANDRIAN, U., C. NIEDERHAUSER, C. HÖFELEIN, H. P. BÜHLER, U. MÜLLER u. J. LÜTHY

(1991):

Polymerase-Kettenreaktion in der bakteriologischen Lebensmitteldiagnostik am Beispiel von Listeria

monocytogenes.

Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg. 82, 539 - 558

CANDRIAN, U. (1994):

Die Polymerase-Kettenreaktion in der Lebensmittelanalytik.


CAPITA, R., C. ALONSO-CALLEJA, B. MORENO u. M. C. GARCIA-FERNANDEZ (2001):

Occurrence of Listeria species in retail poultry meat and comparison of a cultural / immunoassay for

their detection.


CARRIQUE-MAS, J. J., I. HÖKEBERG, Y. ANDERSSON, M. ARNEBORN, W. THAM, M. L.

DANIELSSON-THAM, B. OSTERMAN, M. LEFFLER, M. STEEN, E. ERIKSSON, G. HEDIN u. J.

GIESECKE (2003):

Febrile gastroenteritis after eating on-farm manufactured fresh cheese – an outbreak of listeriosis?

Epidemiol. Infect. 130, 79 - 86

CHAKRABORTY, T., M. LEIMEISTER-WÄCHTER, E. DOMANN, M. HARTL, W. GOEBEL, T.

NICHTERLEIN u. S. NOTERMANS (1992):

Coordinate regulation of virulence genes in Listeria monocytogenes requires the product of the prfA

gene.

J. Bacteriol. 174, 568 - 574


150

CHENEVERT, J., J. MENGAUD, E. GORMLEY u. P. COSSART (1989):

A DNA probe specific for L. monocytogenes in the genus Listeria.


CHO, J. C. u. J. M. TIEDJE (2002):

Quantitative detection of microbial genes by using DNA microarrays.


CLOAK, O. M., G. DUFFY, J. J. SHERIDAN, I. S. BLAIR u. D. A. McDOWELL (1999):

Isolation and detection of Listeria spp., Salmonella spp. and Yersinia spp. using a simultaneous

enrichment step followed by a surface adhesion immunofluorescent technique.

J. Microbiol. Methods 39, 33 - 43

COMI, G., R. FRIGERIO u. C. CANTONI (1992):

Listeria monocytogenes serotypes in Italian meat products.


CORDANO, A. M. u. J. ROCOURT (2001):

Occurrence of Listeria monocytogenes in food in Chile.


COSSART, P., M. F. VICENTE, J. MENGAUD, F. BAQUERO, J. C. PEREZ-DIAZ u. P. BERCHE

(1989):

Listeriolysin O is essential for virulence of Listeria monocytogenes: direct evidence obtained by gene

complementation.

Infect. Immun. 57, 3629 - 3636

CURIALE, M. S. u. C. LEWUS (1994) :

Detection of Listeria monocytogenes in samples containing L. innocua.

J. Food Protect. 57, 1048 - 1051

CURTIS, G. D. W., R. G. MITCHELL, A. F. KING u. E. J. GRIFFIN (1989):

A selective differential medium for the isolation of Listeria monocytogenes.



151

DATTA, A. R., B. A. WENTZ u. W. E. HILL (1987):

Detection of hemolytic Listeria monocytogenes by using DNA colony hybridization.


DATTA, A. R., B. A. WENTZ u. W. E. HILL (1988a):

Identification and enumeration of beta-hemolytic Listeria monocytogenes in naturally contaminated

dairy products.

J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 673 - 675

DATTA, A. R., B. A. WENTZ, D. SHOOK u. M. W. TRUCKSESS (1988b):

Synthetic oligodeoxyribonucleotide probes for detection of Listeria monocytogenes.


DATTA, A. R., B. A. WENTZ u. J. RUSSELL (1990):

Cloning of the listeriolysin O gene and development of specific gene probes for Listeria

monocytogenes.


DENEER, H. G. u. I. BOYCHUK (1991):

Species-specific detection of Listeria monocytogenes by DNA amplification.


DEVER, F. P., D. W. SCHAFFNER u. P. J. SLADE (1993):

Methods for the detection of foodborne Listeria monocytogenes in the U. S.

J. Food Safety 13, 263 - 292

DICKINSON, J. H., R. G. KROLL u. K. A. GRANT (1995):

The direct application of the polymerase chain reaction to DNA extracted from foods.


DOMANN, E., M. LEIMEISTER-WÄCHTER, W. GOEBEL u. T. CHAKRABORTY (1991):

Molecular cloning, sequencing, and identification of a metalloprotease gene from Listeria

monocytogenes that is species specific and physically linked to the listeriolysin gene.

Infect. Immun. 59, 65 - 72


152

DUFFY, G., O. M. CLOAK, J. J. SHERIDAN, I. S. BLAIR u. D. A. McDOWELL (1999):

The development of a combined surface adhesion and polymerase chain reaction technique in the

rapid detection of Listeria monocytogenes in meat and poultry.


FANTELLI, K. u. R. STEPHAN (2001):

Prevalence and characteristics of shigatoxin-producing Escherichia coli and Listeria monocytogenes

strains isolated from meat in Switzerland.


FARBER, J. M. u. J. I. SPEIRS (1987):

Monoclonal antibodies directed against the flagellar antigens of Listeria species and their potential in

EIA-based methods.


FARBER, J. M., G. W. SANDERS u. J. I. SPEIRS (1988):

Methodology for isolation of Listeria from foods – a Canadian perspective.


FARBER, J. M. u. P. I. PETERKIN (1991):

Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen.

Microbiol. Rev. 55, 476 - 511

FELDSINE, P. T., A. H. LIENAU, R. L. FORGEY u. R. D. CALHOON (1997):

Visual immunoprecipitate assay (VIP) for Listeria monocytogenes and related Listeria species

detection in selected foods: collaborative study.

J. AOAC Int. 80, 791 - 805

FITTER, S., M. HEUZENROEDER u. C. J. THOMAS (1992):

A combined PCR and selective enrichment method for rapid detection of Listeria monocytogenes.

J. Appl. Bact. 73, 53 - 59

FRASER, J. A. u. W. H. SPERBER (1988):

Rapid detection of Listeria spp. in food and environmental samples by esculin hydrolysis.

J. Food Prot. 51, 762 - 765


153

FREITAG, N. E., L. RONG u. D. A. PORTNOY (1993):

Regulation of the prfA transcriptional activator of Listeria monocytogenes: multiple promoter

elements contribute to intracellular growth and cell-to-cell spread.

Infect. Immun. 61, 2537 - 2544

FRIEDRICH, K. u. P. SCHUBERT (1995):

Nachweis von L. monocytogenes sowie des Genus Listeria mittels p60-spezifischen Antikörpern.



FURRER, B., U. CANDRIAN, C. HOEFELEIN u. J. LUETHY (1991):

Detection and identification of Listeria monocytogenes in cooked sausage products and in milk by in

vitro amplification of haemolysin gene fragments.

J. Appl. Bacteriol. 70, 372 - 379

GANGAR, V., M. S. CURIALE, A. D’ONORIO, A. SCHULTZ, R. L. JOHNSON u. V. ATRACHE

(2000):

VIDAS® enzyme-linked immunofluorescent assay for detection of Listeria in foods: collaborative

study.

J. AOAC Int. 83, 903 - 918

GEOFFROY, C., J. L. GAILLARD, J. E. ALOUF u. P. BERCHE (1987):

Purification, characterization, and toxicity of the sulfhydryl-activated hemolysin listeriolysin O from

Listeria monocytogenes.

Infect. Immun. 55, 1641 - 1646

GEOFFROY, C., J. L. GAILLARD, J. E. ALOUF u. P. BERCHE (1989):

Production of thiol-dependent haemolysins by Listeria monocytogenes and related species.

J. Gen. Microbiol. 135, 481 - 487

GOLDEN, D. A., L. R. BEUCHAT u. R. E. BRACKETT (1988):

Inactivation and injury of Listeria monocytogenes as affected by heating and freezing.



154

GOLSTEYN THOMAS, E. J., R. K. KING, J. BURCHAK u. V. P. J. GANNON (1991):

Sensitive and specific detection of Listeria monocytogenes in milk and ground beef with the

polymerase chain reaction.


GOTTSTEIN, B. (1991):

Ausgewählte Prinzipien der immundiagnostischen Methoden.


GRACIEUX, P., S. M. ROCHE, P. PARDON u. P. VELGE (2003):

Hypovirulent Listeria monocytogenes strains are less frequently recovered than virulent strains on

PALCAM and Rapid’ L. mono media.


GRAY, M. L. u. A. H. KILLINGER (1966):

Listeria monocytogenes and listeric infections.

Bacteriol. Rev. 30, 309 - 382

GUNASINGHE, C. P. G. L., C. HENDERSON u. M. A. RUTTER (1994):

Comparative study of two plating media (PALCAM and Oxford) for detection of Listeria species in a

range of meat products following a variety of enrichment procedures.


HARRINGTON, C. A., C. ROSENOW u. J. RETIEF (2000):

Monitoring gene expression using DNA microarrays.

Curr. Opin. Microbiol. 3, 285 - 291

HAYES, P. S., L. M. GRAVES, B. SWAMINATHAN, G. W. AJELLO, G. B. MALCOLM, R. E.

WEAVER, R. RANSOM, K. DEAVER, B. D. PLIKAYTIS, A. SCHUCHAT, J. D. WENGER, R. W.

PINNER, C. V. BROOME, P. CASSIDAY, W. E. DEWITT, M. O. EGAL, M.

NEUENSCHWANDER, M. A. BULGARELLI, J. TAYLOR, P. RADOS, L. LEFKOWITZ, C.

HARVEY, D. STEPHENS, G. ANDERSON, E. STONE, K. KRAUSS, A. REINGOLD, P. ARCHER,

B. GILDEN, J. STRACK, G. ISTRE, L. MASCOLA u. M. CASTILLON (1992):

Comparison of three selective enrichment methods for the isolation of Listeria monocytogenes from

naturally contaminated foods.



155

HEISICK, J. E., F. M. HARRELL, E. H. PETERSON, S. MCLAUGHLIN, D. E. WAGNER, I. V.

WESLEY u. J. BRYNER (1989):

Comparison of four procedures to detect Listeria spp. in foods.


HILDEBRAND, A., G. HILDEBRANDT u. J. KLEER (2001):

Mikrobiologischer Status von industriell und handwerklich hergestelltem Schweinehackfleisch – Ein

Vergleich.



HITCHINS, A. D. (1996):

Assessment of alimentary exposure to Listeria monocytogenes.


HITCHINS, A. D. u. R. E. DUVALL (2000):

Feasibility of a defined microflora challenge method for evaluating the efficacy of foodborne Listeria

monocytogenes selective enrichments.

J. Food Protect. 63, 1064 - 1070

HOCHBERG, A. M., A. ROERING, V. GANGAR, M. CURIALE, W. M. BARBOUR u. P. M.

MROZINSKI (2001):

Sensitivity and specifity of the BAX® for Screening/Listeria monocytogenes Assay: internal validation

and independent laboratory study.

J. AOAC Int. 84, 1087 - 1097

HOHEISEL, J. D. u. M. VINGRON (1998):

DNS-Chip-Technologie.

Biospektrum 6, 17 - 20

HOLT, J. G., N. R. KRIEG, P. H. A. SNEATH, J. T. STALEY u. S. T. WILLIAMS (1994):

Bergey’s manual of determinative bacteriology.

9. Aufl. Williams & Wilkins, Baltimore, USA, S. 570


156

HUBER, I., A. WIELAND, K. RISSLER, G. DAME, H. LÄMMEL, M. MÖHRLE, A. AL-AHMAD

u. P. ZELTZ (2002):

Einsatz der Microarray-Technologie zur mikrobiellen Kontrolle von Lebensmitteln.



INOUE, S., A. NAKAMA, Y. ARAI, Y. KOKUBO, T. MARUYAMA, A. SAITO, T. YOSHIDA, M.

TERAO, S. YAMAMOTO u. S. KUMAGAI (2000):

Prevalence and contamination levels of Listeria monocytogenes in retail foods in Japan.


JINNEMAN, K. C. u. W. E. HILL (2001):

Listeria monocytogenes lineage group classification by MAMA-PCR of the listeriolysin gene.

Curr. Microbiol. 43, 129 - 133

JINNEMAN, K. C., J. M. HUNT, C. A. EKLUND, J. S. WERNBERG, P. N. SADO, J. M.

JOHNSON, R. S. RICHTER, S. T. TORRES, E. AYOTTE, S. J. ELIASBERG, P. ISTAFANOS, D.

BASS, N. KEXEL-CALABRESA, W. LIN u. C. N. BARTON (2003):

Evaluation and interlaboratory validation of a selective agar phosphatidylinositol-specific

phospholipase C activity using chromogenic substrate to detect Listeria monocytogenes from foods.


JOHANSSON, T. (1998):

Enhanced detection and enumeration of Listeria monocytogenes from foodstuffs and food-processing

environments.

Int. J. Food Microbiol. 40, 77 – 85

JOHNSON, J. L., M. P. DOYLE u. R. G. CASSENS (1990):

Listeria monocytogenes and other Listeria spp. in meat and meat products – a review.

J. Food Prot. 53, 81 - 91

KATHARIOU, S., C. MIZUMOTO, R. D. ALLEN, A. K. FOK u. A. A. BENEDICT (1994):

Monoclonal antibodies with a high degree of specifity for Listeria monocytogenes serotype 4b.



157

KEHOE, M. A., L. MILLER, J. A. WALKER u. G. J. BOULNOIS (1987):

Nucleotide sequence of the streptolysin O (SLO) gene: structural homologies between SLO and other

membrane-damaging, thiol-activated toxins.

Infect. Immun. 55, 3228 - 3232

KERDAHI, K. F. u. P. F. ISTAFANOS (1997):

Comparative study of colorimetric and fully automated enzyme-linked immunoassay system for rapid

screening of Listeria spp. in foods.

J. AOAC Int. 80, 1139 - 1142

KERDAHI, K. F. u. P. F. ISTAFANOS (2000):

Rapid determination of Listeria monocytogenes by automated enzyme-linked immunoassay and

nonradioactive DNA probe.

J. AOAC Int. 83, 86 - 88

KERR, K. G., N. A. ROTOWA, P. M. HAWKEY u. R. W. LACEY (1990):

Incidence of Listeria spp. in pre-cooked, chilled chicken products as determined by culture and

enzyme-linked immunoassay (ELISA).

J. Food. Prot. 53, 606 - 607

KIM, C., L. M. GRAVES, B. SWAMINATHAN, L. W. MAYER u. R. E. WEAVER (1991):

Evaluation of hybridization characteristics of a cloned pRF106 probe for Listeria monocytogenes

detection and development of a nonisotopic colony hybridization assay.


KING, W., S. RAPOSA, J. WARSHAW, A. JOHNSON, D. HALBERT u. J. D. KLINGER (1989):

A new colorimetric nucleic acid hybridization assay for Listeria in foods.


KLEIN, P. G. u. V. K. JUNEJA (1997):

Sensitive detection of viable Listeria monocytogenes by Reverse Transcription-PCR.


KLEINER, U. u. K. SCHINKEL (2003):

Nachweis von Listeria monocytogenes in Lebensmittel- und Tupferproben mittels Sandwich-ELISA.




158

KLINGER, J. D., A. JOHNSON, D. CROAN, P. FLYNN, K. WHIPPIE, M. KIMBALL, J. LAWRIE

u. M. CURIALE (1988):

Comparative studies of nucleic acid hybridization assay for Listeria in foods.


KNIGHT, M. T., M. C. NEWMAN, M. J. BENZINGER JR., J. R. AGIN, M. ASH, P. SIMS u. D.

HUGHES (1996):

TECRA Listeria Visual Immunoassay (TLVIA) for detection of Listeria in foods: collaborative study.

J. AOAC Int. 79, 1083 - 1094

KÖHLER, S., M. LEIMEISTER-WÄCHTER, T. CHAKRABORTY, F. LOTTSPEICH u. W.

GOEBEL (1990):

The gene coding for protein p60 of Listeria monocytogenes and its use as a specific probe for Listeria

monocytogenes.

Infect. Immun. 58, 1943 - 1950

KORSAK, N., G. DAUBE, Y. GHAFIR, A. CHAHED, S. JOLLY u. H. VINDEVOGEL (1998):

An efficient sampling technique used to detect four foodborne pathogens on pork and beef carcasses in

nine Belgian abattoirs.

J. Food Prot. 61, 535 - 541

KRISMER, H., I. HEIN u. M. WAGNER (2002):

Ein integraler Ansatz zum Nachweis von Salmonella spp., Listeria monocytogenes und Escherichia

coli O157:H7 mittels Multiplex-Seminested PCR.



KUHN, M. u. W. GOEBEL (1989):

Identification of an extracellular protein of Listeria monocytogenes possibly involved in intracellular

uptake by mammalian cell.

Infect. Immun. 57, 55 - 61

LANTZ, P. G., R. KNUTSSON, Y. BLIXT, W. ABU AL-SOUD, E. BORCH u. P. RÅDSTRÖM

(1998):

Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in enrichment media and pork by a multiplex PCR: a

study of sample preparation and PCR-inhibitory components.



159

LEIMEISTER-WÄCHTER, M. u. T. CHAKRABORTY (1989):

Detection of listeriolysin, the thiol-dependent hemolysin in Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii,

and Listeria seeligeri.

Infect. Immun. 57, 2350 - 2357

LEIMEISTER-WÄCHTER, M., C. HAFFNER, E. DOMANN, W. GOEBEL u. T. CHAKRABORTY

(1990):

Identification of a gene that positively regulates expression of listeriolysin, the major virulence factor

of Listeria monocytogenes.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8336 - 8340

LEIMEISTER-WÄCHTER, M., E. DOMANN u. T. CHAKRABORTY (1992):

The expression of virulence genes in Listeria monocytogenes is thermoregulated.

J. Bacteriol. 174, 947 - 952

LOUWERS, J., R. FRIES u. G. REUTER (1999):

Einfluß externer Faktoren auf die Ergebnisse mikrobiologischer Routineuntersuchungen von

Hackfleisch.



LUBENOW, E. (2002):

Untersuchungen zum Nachweis von Salmonellen in natürlich und künstlich kontaminierten

Lebensmitteln mittels kultureller Methode, ELISA, PCR und Microarray.

Hannover, Tierärztl. Hochschule, Diss.

LUCCHINI, S., A. THOMPSON u. J. C. D. HINTON (2001):

Microarrays for microbiologists.

Microbiology 147, 1403 - 1414

MAIJALA, R., O. LYYTIKÄINEN, T. JOHANSSON, T. AUTIO, T. AALTO, L. HAAVISTO u. T.

HONKANEN-BUZALSKI (2001):

Exposure of Listeria monocytogenes within an epidemic caused by butter in Finland.



160

MAKINO, S. I., Y. OKADA u. T. MARUYAMA (1995):

A new method for direct detection of Listeria monocytogenes from foods by PCR.


MATTINGLY, J. A., B. T. BUTMAN, M. C. PLANK, R. J. DURHAM u. B. J. ROBISON (1988):

Rapid monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for sdetection of Listeria in

food products.


McLAUCHLIN, J. (1987):

A review - Listeria monocytogenes, recent advances in the taxonomy and epidemiology of listeriosis

in humans.

J. Appl. Bacteriol. 63, 1 - 11

McLAUCHLIN, J., A. BLACK, H. T. GREEN, J. Q. NASH u. A. G. TAYLOR (1988):

Monoclonal antibodies shown Listeria monocytogenes in necropsy tissue samples.

J. Clin. Pathol. 41, 983 - 988

McLAUCHLIN, J. (1990a):

Human listeriosis in Britain, 1967-85, a summary of 722 cases. 1. Listeriosis during pregnancy and in

the newborn.


McLAUCHLIN, J. (1990b):

Human listeriosis in Britain, 1967-85, a summary of 722 cases. 2. Listeriosis in non-pregnant

individuals, a changing pattern of infection and seasonal incidence.


McLAUCHLIN, J. u. P. N. PINI (1989):

The rapid demonstration and presumptive identification of Listeria monocytogenes in food using

monoclonal antibodies in direct immunofluorescence test (DIFT).



161

MENGAUD, J., M. F. VICENTE, J. CHENEVERT, J. M. PEREIRA, C. GEOFFROY, B. GICQUEL-

SANZEY, F. BAQUERO, J. C. PEREZ-DIAZ u. P. COSSART (1988):

Expression in Escherichia coli and sequence analysis of the listeriolysin O determinant of Listeria

monocytogenes.

Infect. Immun. 56, 766 - 772

MENGAUD, J., M. F. VICENTE u. P. COSSART (1989):

Transcriptional mapping and nucleotide sequence of the Listeria monocytogenes hlyA region reveal

structural features that may be involved in regulation.

Infect. Immun. 57, 3695 - 3701

MENGAUD, J., C. GEOFFROY u. P. COSSART (1991a):

Identification of a new operon involved in Listeria monocytogenes virulence: its first gene encodes a

protein homologous to bacterial metalloproteases.

Infect. Immun. 59, 1043 - 1049

MENGAUD, J., S. DRAMSI, E. GOUIN, J. A. VAZQUEZ-BOLAND, G. MILON u. P. COSSART

(1991b):

Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated.

Mol. Microbiol. 5, 2273 - 2283

MÜLHARDT, C. (1999):

Der Experimentator: Molekularbiologie.

Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Jena, Lübeck, Ulm, S. 77

NATO, F., K. REICH, S. LHOPITAL, S. ROUYRE, C. GEOFFROY, J. C. MAZIE u. P. COSSART

(1991):

Production and characterization of neutralizing and nonneutralizing monoclonal antibodies against

listeriolysin O.

Infect. Immun. 59, 4641 - 4646

NELSON, D. L. u. M. M. COX (Hrsg.) (2001):

Lehninger - Biochemie.

3. Aufl. Springer-Verlag, Heidelberg, S. 242 f.


162

NICOLAS, J. A., E. P. ESPAZE, B. CATIMEL, N. VIDAUD, J. ROCOURT u. A. L. COURTIEU

(1989):

Isolation of Listeria from French meat products.

Zbl. Bakteriol. 272, 242 - 247

NIEDERHAUSER, C., U. CANDRIAN, C. HÖFELEIN, M. JERMINI, H. P. BÜHLER u. J. LÜTHY

(1992):

Use of polymerase chain reaction for detection of Listeria monocytogenes in food.


NINET, B., E. BANNERMAN u. J. BILLE (1992):

Assessment of the accuprobe Listeria monocytogenes culture identification reagent kit for rapid colony

confirmation and its application in various enrichment broths.


NOACK, D. J. u. J. JÖCKEL (1993):

Listeria monocytogenes - Vorkommen und Bedeutung in Fleisch und Fleischerzeugnissen und

Erfahrungen mit den Empfehlungen zum Nachweis und zur Beurteilung.

Fleischwirtsch. 73, 581 - 584

OELLERICH, M. (1983):

Principles of enzyme-immunoassays.

in: H. U. BERGMEYER (Hrsg.): Methods of Enzymatic Analysis.

3. Aufl. Verlag Chemie, Weinheim, Vol. 1, S. 233 - 240

OZARI, R. u. R. A. STOLLE (1990):

Zum Vorkommen von Listeria monocytogenes in Fleisch und Fleischerzeugnissen einschließlich

Geflügelfleisch des Handels.


PENG, H. u. L. A. SHELEF (2001):

Automated simultaneous detection of low levels of listeriae and salmonellae in foods.



163

PERLBERG, K. W., S. LEHMANN u. H. RICHTER (2000):

Listeria monocytogenes – C: Weitere Beiträge.

in: M. HARTUNG (Hrsg.): Bericht über die epidemiologische Situation der Zoonosen in Deutschland

für 1999.

BgVV-Heft 8, 147 - 148

PETERSEN, L. u. M. MADSEN (2000):

Listeria spp. in broiler flocks: recovery rates and species distribution investigated by conventional

culture and the EiaFoss method.


POLIVKA, C. (2001):

Identification of Listeria with a new chromogenic medium RAPID’L.MONO®.


PORTNOY, D. A., P. S. JACKS u. D. J. HINRICHS (1988):

Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes.

J. Exp. Med. 167, 1459 - 1471

ROBERTS, P. (1994):

An improved cultural/immunoassay for the detection of Listeria species in foods and environmental

samples.

Microbiol. Eur. 2, 18 - 21

ROSSEN, L., K. HOLMSTR∅ M, J. E. OLSEN u. O. F. RASMUSSEN (1991):

A rapid polymerase chain reaction (PCR)-based assay for the identification of Listeria monocytogenes

in food samples.


ROSSEN, L., P. N∅ RSKOV, K. HOLMSTR∅ M u. O. F. RASMUSSEN (1992):

Inhibiton of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNA-extraction

solutions.



164

RUHLAND, G. J., M. HELLWIG, G. WANNER u. F. FIEDLER (1993):

Cell-surface location of Listeria-specific protein p60 – detection of Listeria cells by indirect

immunofluorescence.

J. Gen. Microbiol. 139, 609 - 616

RYSER, E. T., S. M. ARIMI, M. M. C. BUNDUKI u. C. W. DONNELLY (1996):

Recovery of different Listeria ribotypes from naturally contaminated, raw refrigerated meat and

poultry products with two different primary enrichment media.


SCHALCH, B., H. EISGRUBER u. A. STOLLE (1996):

Praktische Erfahrungen mit den mikrobiologischen Anforderungen der EG-Hackfleischrichtlinie.


SCHEU, P., A. GASCH u. K. BERGHOF (1998):

Detection of pathogenic and spoilage micro-organisms in food with the polymerase chain reaction.


SCHEU, P., A. GASCH u. K. BERGHOF (1999):

Nachweis von Listeria monocytogenes mittels PCR-ELISA.



SCHLECH, W. F., P. M. LAVIGNE, R. A. BORTOLUSSI, A. C. ALLEN, E. V. HALDANE, A. J.

WORT, A. W. HIGHTOWER, S. E. JOHNSON, S. H. KING, E. S. NICHOLLS u. C. V. BROOME

(1983):

Epidemic listeriosis – evidence for transmission by food.

New England Journal of Medicine 308, 203 - 206

SCHMIDT, U., H. P. R. SEELIGER, E. GLENN, B. LANGER u. L. LEISTNER (1988):

Listerienfunde in rohen Fleischerzeugnissen.


SCOTTER, S. L., S. LANGTON, B. LOMBARD, S. SCHULTEN, N. NAGELKERKE, P. H. IN’T

VELD, P. ROLLIER u. C. LAHELLEC (2001):

Validation of ISO method 11290 Part 1 – detection of Listeria monocytogenes in foods.



165

SEELIGER, H. P. R. u. D. JONES (1986):

Genus Listeria - Pirie 1940, 383AL.

in: P. H. A. SNEATH, N. S. MAIR, M. E. SHARPE u. J. G. HOLT (Hrsg.): Bergey’s manual of

systematic bacteriology.

Williams & Wilkins, Baltimore, S. 1235 - 1245

SHERIDAN, J. J., I. WALLS, J. McLAUCHLIN, D. McDOWELL u. R. WELCH (1991):

Use of a microcolony technique combined with an indirect immunofluorescence test for the rapid

detection of Listeria in raw meat.


SHERIDAN, J. J., G. DUFFY, D. A. McDOWELL u. I. S. BLAIR (1997):

Development of a surface adhesion immunofluorescent technique for the rapid isolation of Listeria

monocytogenes and Listeria innocua from meat.

J. Appl. Microbiol. 82, 225 - 232

SIMON, M. C., D. GRAY u. N. COOK (1996):

DNA extraction and PCR methods for the detection of Listeria monocytogenes in cold-smoked

salmon.


SIMON, P., B. BRUNNER u. M. BÜLTE (1999):

Nachweis von Listeria monocytogenes in Sauermilcherzeugnissen mit PCR-Systemen.

in: DVG (Hrsg.) (1999): Proceedings der 40. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebensmittel-

hygiene“, Garmisch-Partenkirchen, S. 400 - 405

SIRAGUSA, G. R. u. M. G. JOHNSON (1990):

Monoclonal antibody specific for Listeria monocytogenes, Listeria innocua, and Listeria welshimeri.


SKOVGAARD, N. u. C. A. MORGEN (1988):

Detection of Listeria spp. in faeces from animals, in feeds and in raw foods of animal origin.

Int. Food. Microbiol. 6, 229 - 242

SKOVGAARD, N. u. B. N∅ RRUNG (1989):

The incidence of Listeria spp. in faeces of Danish pigs and in minced pork meat.



166

SLUTSKER, L. u. A. SCHUCHAT (1999):

Listeriosis in humans.

in: RYSER, E. T. u. E. H. MARTH (Hrsg.): Listeria, listeriosis, and food safety.

2. Auflage, Verlag Marcel Dekker, New York, Basel

S∅ LVE, M., J. BOEL u. B. N∅ RRUNG (2000):

Evaluation of a monoclonal antibody able to detect live Listeria monocytogenes and Listeria innocua.


STEWART, D. u. S. G. GENDEL (1998):

Specifity of the BAX polymerase chain reaction system for detection of the foodborne pathogen

Listeria monocytogenes.

J. AOAC Int. 81, 817 - 822

TENGEL, C., S. JORDAN u. G. BECKMANN (2001):

Einsatz eines Schnellverfahrens auf PCR-Basis zum Nachweis von Listerien in Umgebungsproben.

Dtsch. Lebensmittel Rundsch. 97, 98 - 104

TORENSMA, R., M. J. C. VISSER, C. J. M. AARSMAN, M. J. J. G. POPPELIER, A. C. FLUIT u. J.

VERHOEF (1993):

Monoclonal antibodies that react with live Listeria spp.


UYTTENDAELE, M., R. SCHUKKINK, B. VAN GEMEN u. J. DEBEVERE (1995):

Development of NASBA®, a nucleic acid amplification system, for identification of Listeria

monocytogenes and comparison to ELISA and a modified FDA method.


VAN DEN ELZEN, A. M. G. u. J. M. A. SNIJDERS (1993):

Critical points in meat production lines regarding the introduction of Listeria monocytogenes.

Vet. Q. 15, 143 - 145

VAN NETTEN, P., I. PERALES, A. VAN DE MOOSDIJK, G. D. W. CURTIS u. D. A. A. MOSSEL

(1989):

Liquid and solid selective differential media for detection and enumeration of Listeria monocytogenes

and other Listeria spp.



167

VINES, A. u. B. SWAMINATHAN (1997):

Nucleotide sequence analysis of two virulence-associated genes in Listeria monocytogenes serotype

1/2b and comparison with the same genes in other serotypes important in human disease.


VLAEMYNCK, G., V. LAFARGE u. S. SCOTTER (2000):

Improvement of the detection of Listeria monocytogenes by the application of ALOA, a diagnostic,

chromogenic isolation medium.

J. Appl. Microbiol. 88, 430 - 441

VON BLANKENFELD-ENKVIST, G. u. M. BRÄNNBACK (2002):

Technological trends and needs in food diagnostics.

Teknologiakatsaus 132

WALKER, S. J., P. ARCHER u. J. APPLEYARD (1990):

Comparison of the Listeria-Tek ELISA kit with cultural procedures for the detection of Listeria

species in foods.


WANG, G. H., K. T. YAN, X. M. FENG, S. M. CHEN, A. P. LUI u. Y. KOKUBO (1992):

Isolation and identification of Listeria monocytogenes from retail meats in Beijing.


WEISE, E., E. BARTELT u. J. BRÄUNIG (1999):

Empfehlungen zum Nachweis und zur Bewertung von Listeria monocytogenes in Lebensmitteln.

in: DVG (Hrsg.) (1999): Proceedings der 40. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebensmittel-

hygiene“, Garmisch-Partenkirchen, S. 294 - 306

WEISS, R. u. G. AMTSBERG (1995):

Listeriose.

in: BLOBEL, H. u. T. SCHLIESSER (Hrsg.): Handbuch der bakteriellen Infektionen bei Tieren.

Gustav Fischer Verlag, Jena, Stuttgart, Bd. II, Teil 3

S. 59 - 61


168

WERNARS, K., K. HEUVELMAN, S. NOTERMANS, E. DOMANN, M. LEIMEISTER-

WÄCHTER u. T. CHAKRABORTY (1992):

Suitability of the prfA gene, which encodes a regulator of virulence genes in Listeria monocytogenes, s

in the identification of pathogenic Listeria spp.


WUENSCHER, M. D., S. KÖHLER, A. BUBERT, U. GERIKE u.W. GOEBEL (1993):

The iap gene of Listeria monocytogenes is essential for cell viability, and its gene product, p60, has

bacteriolytic activity.

J. Bacteriol. 175, 3491 - 3501

ZHOU, J. (2003):

Microarrays for bacterial detection and microbial community analysis.

Curr. Opin. Microbiol. 6, 288 - 294

Anhang

169

9. Anhang

9.1 Nähr- und Differenzierungsmedien

Columbia-Agar mit SchafblutPLUS

PB 5039 A, Oxoid, Wesel

Halbfraser-Anreicherungsbouillon / Fraser-Anreicherungsbouillon

Grundmedium (1.10398., VWR, Darmstadt)

Supplement (1.10399., VWR, Darmstadt)

aqua dest.

auf pH 7,0 ± 0,1 einstellen

15 min bei 121°C autoklavieren

Supplemente in je 1 ml sterilem aqua dest. lösen, zur Basisbouillon

(abgekühlt auf 50°C) geben, homogen verteilen durch vorsichtiges

Schwenken

55 ,0 g

je 1 Flasche

ad 1000 ml

NaCl-Lösung

Natriumchlorid zur Analyse (1.06404., Merck, Darmstadt)

Trytone (L 42, Oxoid, Wesel)

aqua dest.


in Reagenzgläser à 9 ml abfüllen


8,5 g

1,0 g

ad 1000 ml

Oxford-Agar


Supplemente (1.07006., VWR, Darmstadt)

aqua dest.

auf pH 7,2 ± 0,2 einstellen, im Dampftopf 35 – 40 min lösen


Supplemente in je 5,0 ml sterilem Ethanol-H2O-Gemisch (1:1) lösen,

zur Basisbouillon geben (abgekühlt auf < 50°C), mischen

in Petrischalen ausgießen

29,25 g

je 1 Flasche

ad 500 ml

Anhang

170

PALCAM-Agar


Supplement (1.12122., VWR, Darmstadt)

aqua dest.

auf pH 7,0 ± 0,2 einstellen, im Dampftopf 35-40 min lösen,


Supplement in 1 ml sterilem aqua dest. lösen, zur Basisbouillon

(abgekühlt auf < 50°C) geben, mischen


34,4 g

1 Flasche

ad 500 ml

Standard-I-Agar

Granulat (1.07214., VWR, Darmstadt)

aqua dest.

auf pH 7,5 ± 0,2 einstellen, ggf. in Reagenzgläser à 9 ml abfüllen


in Petrischalen ausgießen, ggf. als Schrägagar erstarren lassen

37,0 g

ad 1000 ml

TSYE-Agar

TSYE-Caso-Agar (1.05458., VWR, Darmstadt)

aqua dest.

auf pH 7,3 ± 0,2 einstellen, im Dampftopf 35-40 min lösen,



40,0 g

ad 1000 ml

TSYE-Bouillon

TSYE-Caso-Bouillon (1.05459., VWR, Darmstadt)

aqua dest.


in Reagenzgläser à 10 ml abfüllen


30,0 g

ad 1000 ml

Anhang

171

Kohlenhydrat-Bouillon

Grundmedium:

verdautes Gewebe

Fleischextrakt

NaCl

Bromkresolrot

aqua dest.

je 500 ml 15 min bei 121°C autoklavieren

je 500 ml L-Rhamnose / D-Xylose lösen

10 g

1 g

5 g

0,02 g

ad 1000 ml

25 g

10x Freezing Medium

K2H PO4

KH2 PO4

Na-Citrat

MgSO4 x 7 H2O

(NH4)2 SO4

Glycerin

aqua dest.

K2H PO4 und KH2 PO4 getrennt von den anderen Substanzen in 300 ml

aqua dest. lösen und autoklavieren

restliche Substanzen in 700 ml aqua dest. lösen und autoklavieren

nach Autoklavieren: Lösungen mischen

vor der Verwendung: mit sterilem aqua dest. 1:10 verdünnen

63 g

18 g

4,5 g

0,9 g

9 g

440 g

ad 1000 ml

Anhang

172

9.2 ELISA-Materialien

Transia plate Listeria monocytogenes ELISA Transia GmbH, Obermörlen

9.3 Materialien für molekularbiologische Untersuchungen

9.3.1 Reagenzien

2-Propanol, 6752.1

Agarose NEEO, 2267.4

Bromphenolblau, A512.1

Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), 9161.2

Chloroform, 3313.1

Control-DNA für Listeria monocytogenes,

150 µl: 1000 copies

EDTA, 8043.1

Glycerin, 3783.1

HotStarTaq Polymerase (1000)

Lysozym, 8259.1

Natriumacetat, 6773.2

Natriumchlorid, 3957.1

Natriumhydroxid, 6771.1

NUTRI®-Chip-Kit

PREMaster LiD – C/A (Listeria Duplex)

Proteinase K, 7528.2

puC 19 MSP I, T149.1

RNAse, 7156.1

Synthetische Luft, 2310152

tri-Natriumcitrat-Dihydrat, 3580.1

TRIS-Base, 4855.2

Tween®20, 9127.1

Roth GmbH, Karlsruhe





GeneScan Analytics GmbH, Bremen



Qiagen, Hilden










Linde Gas AG, Hannover




Anhang

173

9.3.2 Rezepturen

CTAB-Puffer:

Natriumchlorid

Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)

TRIS-Base

EDTA

Pufferlösung mit HCl auf pH 8,0 einstellen

aqua dest.

1 M Tris-HCL :

TRIS-Base

Pufferlösung mit HCl auf pH 8,3 einstellen

aqua dest.

autoklavieren

1 x TE:

1 M Tris-HCl pH 8,3

0,5 M EDTA pH 8,0

aqua dest.

autoklavieren

0,2 x TE:

1 x TE

aqua dest.

autoklavieren

81,8 g

20,0 g

12,1 g

5,8 g

ad 1000 ml

ad 1000 ml

10,0 ml

2,0 ml

ad 1000 ml

200 ml

ad 1000 ml

Anhang

174

10 x TBE:

TRIS-Base

Borsäure

EDTA pH 8,3

aqua dest.

Blaumarker:

Glycerin

60 % Glycerin gesättigt mit Bromphenolblau

1 x TBE

Proteinase-K-Lösung:

Proteinase K

aqua dest.

Lysozym-Lösung:

Lysozym

aqua dest.

RNAse-Lösung:

RNAse

aqua dest.

Natriumacetat-Lösung:

Natriumacetat

aqua dest.

Lösung mit HCl auf pH 5,0 einstellen

Natriumacetat-Lösung:

Natriumacetat

aqua dest.

Lösung mit HCl auf pH 5,0 einstellen

107,8 g

55,0 g

9,3 g

ad 1000 ml

400,0 µl

50,0 µl

550,0 µl

20,0 mg

1,0 ml

10,0 mg

1,0 ml

20,0 mg

1,0 ml

24,609 g

ad 100 ml

24,609 g

ad 100 ml

Anhang

175

9.6 Geräte und Verbrauchsmaterialien

BioDetect 645

Brillantschwarz für die Mikroskopie

Brutschrank 30°C

Brutschrank 37°C

Centrifuge 5417 R

Dri-Block®

Einmal-Küvetten 1,5 ml halbmikro

Elektrophorese Apparat Horizon® 20.25

Elektrophorese Apparat Horizon® 58

Fleischwolf

GelCam

Gelgießstation H20-25

Hybridisierungsinkubator 7601

Kämme für Gelgießstation:

20, 30 oder 42 Zähne

Kolbenhubpipetten:


Merck, Darmstadt

Heraeus, Hanau

Memmert, Schwabach

Eppendorf GmbH, Hamburg

Labtech International GmbH,

Burkhardtsdorf

Brand, Wertheim

GibcoBRL Life Technologies, Eggenstein


Alexanderwerk, Remscheid

Polaroid GmbH, Offenbach


GFL mbH, Burgwedel



0,5 – 10,0 µl

2,0 – 20,0 µl

20,0 – 200 µl

100 – 1000 µl

Mµlti-Ultra Tubes 0,2 ml, H561.1

Magnet-Heizrührer, Variomag® Monotherm

Microbank™-System

Microcentrifuge, C-1200

Mikrobiologische Sicherheitswerkbank,

CA / REV 3

Mikro-Zentrifuge 3-1820


H + P Labortechnik GmbH,

Oberschleißheim

MAST DIAGNOSTICA, Reinfeld

neoLab® GmbH, Heidelberg

Clean Air Techniek bv, Woerden, NL

neoLab® GmbH, Heidelberg

Anhang

176

Minishaker MK1

Petrischalen 94/16

Photometer Heλios β

IKA-Works Inc., Wilmington, USA

Greiner, Kemsmünster, Österreich

Unicam, Cambridge, UK

Pipettenspitzen: Sorenson™ BioScience, Inc., Salt Lake City, USA

0,5 – 10,0 µl

5,0 – 200 µl

30,0 µl

100 – 1000 µl

PowerPac 300

Reaktionsgefäße 8-Strips, 0,2 ml

Safe-Lock-Tubes (Eppendorfgefäß):

1,5 und 2,0 ml

Steriles Abstrichbesteck 10000230

Stomacher 400

Stomacherbeutel Model 400

Bio-Rad Laboratories GmbH, München

neoLab®, Heidelberg


Technolab Labortechnik, Herne

Seward, London, UK

Seward, London, UK

Thermocycler, GeneAmp® PCR-System 9700 PE Applied Biosystems, Norwalk, USA

Transilluminator, TI 4 und TI 2

UNIPREP Schüttelgerät

Waage 466-41

Waage BP 221 S

Waage Mettler

Biometra®, Göttingen

Uni Equip GmbH, Martinsried

Kern, Albstadt

Sartorius, Göttingen

Omnilab, Bremen

Anhang

177

9.5 Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Charakteristische Merkmale zur Differenzierung der Spezies innerhalb der

Gattung Listeria.

Tab. 2: Konzentrationen von L. monocytogenes (L. m.) oder Listeria spp. in Fleisch.

Tab. 3: Inzidenz von L. monocytogenes sowie Listeria spp. und L. innocua in Fleisch

und Fleischerzeugnissen.

Tab. 4: Leistungsfähigkeit des kulturellen Referenzverfahrens nach § 35 LMBG (DIN

EN ISO 11290-1 (1996).

Tab. 5: Charakterisierung des Antigens p60 (sowie des p60-kodierenden Gens iap).

Tab. 6: Nachweisgrenzen verschiedener Listeria spp.-spezifischer immunologischer

Nachweissysteme nach Untersuchungen von dotierten Lebensmitteln.

Tab. 7: Sensitivität und Spezifität verschiedener Listeria spp.-spezifischer immuno-

logischer Nachweissysteme nach Untersuchungen von Feldproben.

Tab. 8: Nachweisgrenzen L. monocytogenes-spezifischer immunologischer Nachweis-

systeme nach Untersuchungen von dotierten Lebensmitteln.

Tab. 9: Typen von Microarrays und deren Charakteristika.

Tab. 10: Nachweisgrenzen und Spezifität von PCR-Systemen bei Untersuchungen von

Listeria monocytogenes-Reinkulturen.

Tab. 11: Untersuchungen zur Nachweisgrenze von PCR-Systemen zum Nachweis von

L.monocytogenes aus dotierten Lebensmitteln (mit oder ohne Anreicherung).

Tab. 12: Sensitivität und Spezifität verschiedener PCR-Systeme nach Untersuchungen

von Feldproben.

Tab. 13: Funktionen der einzelnen Zyklen und Temperatur-Zeit-Profil.

Tab. 14: Hybridisierungsregion des Microarrays: Anordnung der verschiedenen Sonden

und ihre Funktionen.

Tab. 15: Gesamtkeimzahlen verschiedener Anreicherungskulturen zur Prüfung der

Anreicherungsbedingungen.

Tab. 16: Gesamtkeimzahl von koloniebildenden Einheiten Listeria monocytogenes pro

TK-Portion einer halben Stammkultur.

Tab. 17: Verhältnis der Anzahl von L. innocua zur Anzahl von L. monocytogenes in

inokuliertem Hackfleisch.

Anhang

178

Tab. 18: Sensitivität der PCR in Verbindung mit Agargel-Elektrophorese.

Tab. 19: Nachweis von L. monocytogenes-DNA in 25 g inokuliertem Schweinehack-

fleisch mittels PCR und Agargel-Elektrophorese in Abhängigkeit von der

Dauer der Anreicherung.


fleisch mittels PCR und Agargel-Elektrophorese in Abhängigkeit von der

Dauer der Anreicherung.


fleisch mittels PCR und Microarray-Analyse in Abhängigkeit von der Dauer

der Anreicherung.


fleisch mittels PCR und Microarray-Analyse in Abhängigkeit von der Dauer

der Anreicherung.

Tab. 23 a, b: Ergebnisse und Angaben über die Höhe und Art der Inokulation für den

Listeria monocytogenes–Nachweis mittels kultureller Referenzmethode nach

DIN EN ISO 11290-1 (1996).

Tab. 24: Nachweisgrenze des ELISA mit und ohne Brillantschwarz.

Tab. 25: Berechnete Anzahl KbE L. monocytogenes in 1 g dotiertem Hackfleisch.

Tab. 26: Spezifität und Sensitivität der molekularbiologischen Methoden und deren

Übereinstimmung mit der kulturellen Methode.

Tab. 27: Monocytogenes-positive Proben (nach der kulturellen Methode gemäß § 35

LMBG).

Tab. 28: Monocytogenes-negative Proben (nach der kulturellen Methode gemäß § 35

LMBG).

Tab. 29: Von der herkömmlichen Referenzmethode abweichende Untersuchungs-

ergebnisse der Schnellmethoden.

Tab. 30: Mindestanreicherungszeiten und Zeitaufwand für einen zuverlässigen

positiven Nachweis von Listeria monocytogenes in künstlich kontaminiertem

Hackfleisch vom Schwein.

Anhang

179

9.6 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Spezifität der Multiplex-PCR: Agargel-Elektrophorese zum Nachweis von

L. monocytogenes-DNA aus Reinkulturen sowie der DNA einer L. innocua-

Anreicherung.

Abb. 2: Spezifität der Multiplex-PCR: Agargel-Elektrophorese zum Nachweis von

L. monocytogenes-DNA aus Schweinehackfleischproben.

Abb. 3: Positive und negative Untersuchungsergebnisse von Feldproben mit Agargel-

Elektrophorese und NUTRI®-Chip-Analyse (bezogen auf die kulturelle

Referenzmethode).

Abb. 4: Positive und negative Untersuchungsergebnisse von Feldproben mit Agargel-

Elektrophorese und Microarray-Analyse (in der Annahme, dass jedes positive

Testergebnis unabhängig von der Methode als richtig-positiv zu bewerten ist).

Abb. 5: Sensitivitätsreihe der verwendeten Schnellmethoden (erstellt unter Berück-

sichtigung der Mindestanreicherungszeit).

Danksagung

Das Thema dieser Arbeit wurde mir durch die Hand von Herrn Prof. Dr. Siegfried Wenzel (im

Ruhestand) überlassen. Ihm möchte ich sehr herzlich danken für jegliche gewährte

Unterstützung und manches persönliche Wort. Ersteres war die essentielle Grundlage für die

vorliegende Arbeit, letzteres werde ich beherzigen.

Herr Privatdozent Dr. Michael Kühne, der von Beginn an als Betreuer an meiner Seite war,

übernahm die verantwortliche Leitung, nachdem Herr Prof. Dr. Siegfried Wenzel in den, um

mit dessen eigenen Worten zu sprechen, „Unruhezustand“ getreten ist.

Immer konnte ich auf die Unterstützung meines Betreuers und nun auch Doktorvaters zählen,

und ganz besonders wichtig war mir dies in der letzten Phase, in der er einmal mehr seine

bald schon berühmte Geduld aufbrachte. Das schätze ich sehr, und auch dafür will ich mich

sehr herzlich bedanken!

An die Assistenten, die mir gerne und bereitwillig mit Kenntnissen aushalfen, geht ebenfalls

mein aufrichtiger Dank. Die technischen Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter der Zentrums-

abteilung für Lebensmittelkunde, Fleischhygiene und -technologie müsste ich genau-

genommen alle – ohne Ausnahme – mit Namen aufzählen. Sie alle unterstützten mich in

meiner Arbeit, je nach Erfordernis mit einem kleineren oder größeren Anteil, mit ihrem

Wissen und/oder ihrer praktischen Hilfe.

Die Kenntnisse und Fähigkeiten für die praktischen Arbeiten im mikrobiologischen Labor

(ein weites Feld!) erwarb ich im wesentlichen durch Frau Christina Degenhardt. Nicht nur

dafür, sondern auch für ihren geduldigen Einsatz, wenn sie mir zeigte, was ich suchte, obwohl

es eigentlich direkt vor meiner Nase stand, möchte ich mich bedanken!

Herrn Prof. Dr. Gunter Amtsberg danke ich sehr herzlich für die mir zur Verfügung gestellten

Teststämme.

Frau Bendix und Frau Heppner, Gissel-Institut, haben mich ebenfalls immer sorgfältig und

bereitwillig unterstützt, und ich danke ihnen dafür und für die bereitgestellten Feldproben.

Frau Anja Gresch gilt mein Dank für das gewinnbringende Gegenlesen der englischen

Zusammenfassung.

Von der Dr. Eberhard Lienhop Stiftung wurden die ELISA-Untersuchungen maßgeblich

finanziell gefördert, was ich hier ebenfalls dankend betonen möchte.

Mein ganz persönlicher Dank gilt Frau TÄ Roswitha Merle und Herrn Manfred Krückeberg.

Beide waren immer für mich da, und sie halfen mir und meinem PC tatkräftig durch so

manche Krise. Manfred, mein PC verdankt Dir sein Leben!

An die, welche – bewusst oder unbewusst – für mich in dieser Lebensphase wichtig waren,

die mir Wärme, Zeit und Nähe geschenkt haben: Danke – es ist schön, dass es Euch gibt!

Schließlich und endlich verdanke ich meinen Eltern die Möglichkeit, diese Arbeit anfertigen

zu können. Danke für Euer Verständnis; Ihr habt mir eine sehr wichtige Zeit geschenkt.

Untersuchungen zum Nachweis von Listeria monocytogenes in ... · Aus der Zentrumsabteilung für...

Documents

Transcript of Untersuchungen zum Nachweis von Listeria monocytogenes in ... · Aus der Zentrumsabteilung für...