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Untersuchungen zum „Quorum Sensing“ (QS) cyanobakterieller Begleitbakterien und des

Cyanobakteriums Stamm Flo 1

Diplomarbeit

vorgelegt dem

Fachbereich 2 (Biologie/Chemie)

an der Universität Bremen

von

Peter Orszag

Mai 2008

Betreuender Gutachter: Prof. Dr. Ulrich Fischer

Zweiter Gutachter: PD Dr. Katarzyna A. Palinska

Danksagung

Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Ulrich Fischer für die

Bereitstellung meines Arbeitsplatzes sowie die Diskussions- und Hilfsbereitschaft bei

der Anfertigung meiner Diplomarbeit bedanken.

Bei Frau PD Dr. Katarzyna A. Palinska möchte ich mich für ihr Interesse und für die

Begutachtung meiner Diplomarbeit bedanken.

Ein großes Dankeschön gilt Dr. Birgit Heyduck-Söller, die mich hervorragend betreut

hat und immer Zeit sowie viel Geduld hatte.

Meine ehemaligen und gegenwärtigen Kollegen der Arbeitsgruppe danke ich für die

angenehme Arbeitsatmosphäre, ihre Unterstützung und stete Hilfsbereitschaft sowie

für die „Verpflegung“ durch Kekse und leckere Kuchen.

Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich über die gesamte Zeit des Studiums

unterstützt haben.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ i

Nomenklatur für aufgeführte AHL-Signalmoleküle .............................................. iii

1. Einleitung .............................................................................................................. 1

1.1 Zell-Zell-Kommunikation („Quorum Sensing“)............................................................................ 1

1.2 „Quorum Sensing“ bei Vibrio fischeri als grundlegendes Modell einer AHL-abhängigen Genregulation bei Gram-negativen Bakterien............................................................................. 4

1.3 N-Acyl-L-Homoserinlactone bei Gram-negativen Bakterien ...................................................... 6

1.4 AHL-Biosensoren............................................................................................................................ 7

1.5 Interspezifische Kommunikation bei Bakterien........................................................................... 7

1.6 „Quorum Quenching“ (QQ): Inhibierung der Zell-Zell-Kommunikation.................................... 9

1.7 Auswahl an Mikroorganismen als AHL-Produzenten ............................................................... 10

1.8 Ziel der Arbeit................................................................................................................................ 11

2. Material und Methoden....................................................................................... 12

2.1 Verwendete Bakterienstämme und deren Herkunft .................................................................. 12

2.2 Verwendete Kulturmedien ........................................................................................................... 13 2.2.1 ASNIII/2-Medium........................................................................................................................ 13 2.2.2 LB(Luria Bertani)-Medium........................................................................................................ 14

2.2.2.1 LB(Luria Bertani)-Weichagar........................................................................................... 15 2.2.3 Leuchtbakterien-Medium.......................................................................................................... 15 2.2.4 ABG-Medium............................................................................................................................ 16

2.2.4.1 ABG-Weichagar............................................................................................................... 17

2.3 Pufferlösungen.............................................................................................................................. 17

2.4 Lagerung der Bakterienstämme.................................................................................................. 19

2.5 Voranzucht der zu untersuchenden Bakterienstämme ............................................................ 19 2.5.1 Voranzucht der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 ............................................ 19 2.5.2 Voranzucht der Cyanobakterienstämme Flo 1, Bo 10 und Bo 53............................................ 20

2.6 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09......................................................................................................................................... 20

2.6.1 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten in ungepuffertem ASNIII/2-Medium im Dunkeln .. 21 2.6.2 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-Werten im Dunkeln.... 21 2.6.3 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei einem Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR. 22 2.6.4 pH-Wert-Bestimmung in den Kulturüberständen ..................................................................... 22

2.7 Nachweis von N-Acyl-L-Homoserinlactonen ............................................................................. 23 2.7.1 Verwendete Sensorbakterienstämme zum Nachweis von AHL-Signalmolekülen................... 23

2.7.1.1 Chromobacterium violaceum CV026............................................................................... 23 2.7.1.2 Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) .................................................................... 24

Inhaltsverzeichnis

2.7.2 Kultivierungsbedingungen und Inkubationsdauer der Versuchskulturen zur Untersuchung von AHL-Signalmolekülen........................................................................................................ 25

2.7.2.1 Kultivierungsbedingungen der AHL-Versuchskulturen mit den heterotrophen Bakterienstämmen Bo 53-33 und Bo 10-09 .................................................................... 25

2.7.2.2 Anzucht und Kultivierungsbedingungen der AHL-Versuchskulturen mit dem Cyanobakterium Stamm Flo 1......................................................................................... 26

2.7.3 Extraktion von N-Acyl-L-Homoserinlactonen der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo 1........................................................ 27

2.7.3.1 Herstellung zellfreier Kulturüberstände ........................................................................... 27 2.7.3.2 Azidifizierung von Kulturüberständen.............................................................................. 27 2.7.3.3 Extraktion von AHL-Molekülen aus Kulturüberständen................................................... 28 2.7.3.4 Extraktion von AHL-Molekülen aus Bakterienzellen ....................................................... 28

2.7.4 Dünnschichtchromatographische Auftrennung von AHL-Signalmolekülen ............................. 29 2.7.5 Visualisierung der DC-Signale ................................................................................................. 30

2.7.5.1 Anzucht der Indikatorbakterien und weiterer Referenzstämme ...................................... 30 2.7.5.2 Überschichtung der DC-Platten mit Indikatorbakterien ................................................... 31

2.7.6 Auswertung und Dokumentation der DC-Platten ..................................................................... 31 2.7.7 Agarplattentests mit Sensorbakterien zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien............ 32

2.7.7.1 Agarplattentest nach RAVN und Mitarbeitern (2001)...................................................... 33 2.7.7.2 Agarplattentest nach FARRAND und Mitarbeitern (2002) .............................................. 33 2.7.7.3 Agarplattentest mit Chromobacterium violaceum CV026 zum Nachweis von AHL-

Signalmolekülen nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997)............................................ 34

2.8 Molekularbiologische Untersuchungen ..................................................................................... 35 2.8.1 Extraktion der chromosomalen DNA........................................................................................ 35 2.8.2 Bestimmung der DNA-Konzentration....................................................................................... 37 2.8.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)........................................................................................... 37 2.8.4 Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte........................................................... 39 2.8.5 Elution und Aufreinigung von PCR-Produkten......................................................................... 40 2.8.6 Sequenzierung der 16S-rDNA und des gyrB-Gens ................................................................. 40 2.8.7 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen.................................................................... 40

2.9 Herkunft der verwendeten Chemikalien ..................................................................................... 41

3. Ergebnisse .......................................................................................................... 42

3.1 Verwendete Puffersysteme.......................................................................................................... 42

3.2 Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 bei unterschiedlichen pH-Werten ..................................................................................................... 43

3.2.1 pH-Werte der Zellkulturüberstände.......................................................................................... 46

3.3 Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 bei einem Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR........................................................................................... 47

3.3.1 pH-Werte der Zellkulturüberstände.......................................................................................... 49

3.4 Screeningtests zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien............................................... 50 3.4.1 Nachweis von AHL-Molekülen mit Chromobacterium violaceum CV026 nach MCCLEAN

und Mitarbeitern (1997)............................................................................................................ 50 3.4.2 Nachweis AHL-produzierender Bakterien nach RAVN und Mitarbeitern (2001) ..................... 51 3.4.3 Nachweis AHL-produzierender Bakterien nach FARRAND und Mitarbeitern (2002).............. 52

Inhaltsverzeichnis

3.5 Untersuchungen des Einflusses verschiedener Kultivierungsbedingungen auf die AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1 .................................................................................. 54

3.5.1 Einfluss des pH-Wertes auf die AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1 ................................ 54

3.5.1.1 Azidifizierung von Kulturüberständen der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 ................................................................................................................... 57

3.5.2 Einfluss von Licht auf die Produktion von AHL-Molekülen durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09............................................................................... 61

3.5.3 Einfluss der Temperatur und der Kohlenstoffquelle auf die Produktion von AHL-Molekülen durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 ....................................... 63

3.5.4 Produktion von AHL-Molekülen durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1.............................. 66 3.5.5 Intrazelluläre AHL-Untersuchungen mit den heterotrophen Bakterienstämmen Bo 53-33

und Bo 10-09 sowie dem Cyanobakterium Stamm Flo 1 ........................................................ 67

3.6 Auswertung der molekularbiologischen Untersuchungen ...................................................... 69 3.6.1 Extraktion der chromosomalen DNA........................................................................................ 69 3.6.2 Amplifikation der 16S-rDNA ..................................................................................................... 69 3.6.3 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen auf Basis der 16S-rDNA-Sequenz............ 69 3.6.4 Amplifikation des gyrB-Gens.................................................................................................... 73 3.6.5 Internal Transcribed Spacer (ITS)............................................................................................ 73

4. Diskussion........................................................................................................... 75

4.1 Wachstumsverhalten der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen ............................................................................... 75

4.1.1 Verwendete Puffersysteme...................................................................................................... 75 4.1.2 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-Werten .......................................................... 76 4.1.3 Wachstumsverhalten unter Lichteinfluss ................................................................................. 78

4.2 „Quorum Sensing“(QS) bei verschiedenen Gram-negativen Bakterien................................. 79 4.2.1 AHL-Nachweis mit bakteriellen Biosensoren ........................................................................... 80 4.2.2 Screeningtests zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien ............................................... 81 4.2.3 Extraktion und Nachweis von N-Acyl-L-Homoserinlactonen ................................................... 82 4.2.4 AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 unter

verschiedenen Kultivierungsbedingungen ............................................................................... 84 4.2.4.1 Einfluss des pH-Wertes auf die AHL-Signalmoleküle ..................................................... 84 4.2.4.2 Einfluss der Temperatur auf die AHL-Signalmoleküle .................................................... 87 4.2.4.3 Einfluss von Licht und Nährstoffen auf die Produktion von AHL-Signalmolekülen......... 88

4.2.5 Identifizierung der AHL-Signalmoleküle der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo 1............................................................... 89

4.3 Molekularbiologie ......................................................................................................................... 96

5. Ausblick............................................................................................................... 98

6. Zusammenfassung ........................................................................................... 100

7. Anhang .............................................................................................................. 103

8. Literatur ............................................................................................................. 105

Abkürzungsverzeichnis


Abb. Abbildung AI Autoinducer Aqua bidest. doppelt destilliertes Wasser AHL(s) N-Acyl-L-Homoserinlacton(e) ASN Artificial Seawater Nutrient Bchl a Bakteriochlorophyll a BLAST basic local alignment search tool Bp Basenpaare CFB Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides DC Dünnschichtchromatographie DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosidtriphosphat et al. et alteri ERG Eppendorfreaktionsgefäß FE Fleischextrakt g Gramm g Erdbeschleunigung GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie GFP Grün fluoreszierendes Protein h Stunde(n) HPLC High Performance Liquid Chromatography HPLC-MS High Performance Liquid Chromatography-Massen-

spektrometrie HSL(s) Homoserinlacton(e) ITS internal transcribed spacer (interne transkribierte Spacer) Kap. Kapitel l Liter LB Luria Bertani lt. laut M Molar mg Milligramm µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer

i


min Minute(n) ml Milliliter mM Millimolar MPI Max Planck-Institut n Anzahl N-Acyl-HSL(s) N-Acyl-L-Homoserinlacton(e) NCBI National Center for Biotechnology Information NJ Neighbour-Joining NK Negativkontrolle nm Nanometer O.D. optische Dichte p.A. per analyse (zur Analyse) PAR Photosynthetically Active Radiation (photosynthetisch

aktive Strahlung PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion) Probennr. Probennummer QQ „Quorum Quenching” QS „Quorum Sensing” rDNA ribosomale Desoxyribonukleinsäure Rf-Wert retention factor (Retentionsfaktor) rpm rotation per minute (Rotation pro Minute) RT Raumtemperatur sec Sekunde(n) Tab. Tabelle TMM Trace-Metal-Mix Tris Trishydroxymethylaminomethan U Unit (µmol/min) UFT Zentrum für Umweltforschung und nachhaltige Techno-

logien ÜK Übernachtkultur UV Ultraviolett V Volt v/v (volume per volume) Volumen pro Volumen w/v (weight per volume) Gewicht pro Volumen X-Gal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactopyranosid 2D-PAGE zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese

ii

Nomenklatur für AHL-Signalmoleküle

Nomenklatur für aufgeführte AHL-Signalmoleküle

C4-HSL N-Butanoyl-L-Homoserinlacton (BHL)

C6-HSL N-Hexanoyl-L-Homoserinlacton (HHL)

C7-HSL N-Heptanoyl-L-Homoserinlacton

C8-HSL N-Octanoyl-L-Homoserinlacton (OHL)

3-oxo-C4-HSL N-(3-oxo-Butanoyl)-L-Homoserinlacton (OBHL)

3-oxo-C6-HSL N-(3-oxo-Hexanoyl)-L-Homoserinlacton (OHHL)

3-oxo-C8-HSL N-(3-oxo-Octanoyl)-L-Homoserinlacton (OOHL)

3-oxo-C12-HSL N-(3-oxo-Dodecanoyl)-L-Homoserinlacton (OdDHL)

3-hydroxy-C4-HSL N-(3-hydroxy-Butanoyl)-L-Homoserinlacton (HBHL)

3-hydroxy-C6-HSL N-(3-hydroxy-Hexanoyl)-L-Homoserinlacton (HHHL)

3-hydroxy-C8-HSL N-(3-hydroxy-Octanoyl)-L-Homoserinlacton (HOHL)

3-hydroxy-C12-HSL N-(3-hydroxy-Dodecanoyl)-L-Homoserinlacton (HdDHL)

iii

1. Einleitung

1. Einleitung

Lange Zeit bestand die Auffassung, dass Bakterien unabhängig voneinander in strikt

solitärer Lebensweise existieren. Bereits vor 65 Jahren lieferten jedoch

Untersuchungen an marinen Leuchtbakterien erste Hinweise auf ein multizelluläres

Verhalten von Bakterien (DOUDOROFF, 1942). Die Fähigkeit zur interzellulären

Kommunikation bildet hierbei die Voraussetzung für eine derartige mikrobielle

Organisationsform (BEN JACOB et al., 2004; PARSEK und GREENBERG, 2005).

Die Zell-Zell-Kommunikation wurde erstmals bei dem Gram-positiven Bakterium

Streptococcus pneumoniae (TOMASZ, 1965) und den marinen Gram-negativen

Bakterien Vibrio fischeri und Vibrio harveyi (NEALSON et al., 1970; NEALSON und

HASTINGS, 1979) beschrieben, wobei chemische Signale der Kommunikation und

der Koordination von Gruppenaktivitäten dienen. Das Phänomen einer interzellulären

Kommunikation bei Bakterien wurde erst Jahrzehnte später anerkannt und

Kommunikation zwischen Individuen nicht mehr einzig höheren Organismen oder

spezialisierten Bakterien zugeschrieben. Anfang der 1990er Jahre gewann dieses

Arbeitsgebiet aufgrund von Untersuchungen an pflanzen- und humanpathogenen

Gram-negativen Bakterien (GAMBELLO und IGLEWSKI, 1991; BAINTON et al.,

1992; Fuqua et al., 1994) zunehmend an Bedeutung. Mittlerweile wird die Zell-Zell-

Kommunikation als die wichtigste intrazelluläre Signalreaktion zwischen Bakterien

verstanden (SZENTHE und PAGE, 2003).

1.1 Zell-Zell-Kommunikation („Quorum Sensing“) In der Literatur werden Kommunikationssysteme, mit Hilfe derer Bakterien die eigene

Populationsdichte wahrnehmen und in Abhängigkeit von dieser physiologische

Aktivitäten regulieren können, als „Quorum Sensing“-Systeme zusammengefasst.

Dabei stellt die kleinste Einheit, welche zu Zelldichte-abhängigen Reaktionen

befähigt ist, per Definition das Quorum dar (FUQUA et al., 1994; GEISENBERGER,

2000). Zur Ermittlung der Zellpopulationsdichte verwenden Mikroorganismen eine

große Vielfalt an niedermolekularen Substanzen, die unterschiedliche chemische

Strukturen aufweisen (siehe Abb. 1.1) (DONG und ZHANG, 2005; WILLIAMS, 2007).

Diese als „Autoinducer“ bezeichneten Signalmoleküle sind meistens sehr

artspezifisch (SMITH et al., 2004) und werden von den Bakterien zur Koppelung der

Expression bestimmter Gene an die Populationsdichte eingesetzt, welches eine

1

1. Einleitung

synchrone Koordination biologischer Aktivitäten innerhalb einer lokalen Population

ermöglicht (CHA et al., 1998; WILLIAMS, 2007). Das Wahrnehmen der eigenen

Populationsdichte wird dabei durch die Messung der Signalmolekül-Konzentration

ermöglicht, da die Konzentration der produzierten und in die Umwelt freigesetzten

Signalmoleküle mit Zunahme der Bakterienpopulation proportional ansteigt.

Mittlerweile wurden verschiedene QS-Systeme beschrieben, welche sich in der

Verwendung der Signalmoleküle und regulatorischen Proteine unterscheiden. Das

LuxR/LuxI-QS-System mit N-Acyl-L-Homoserinlactonen (AHLs) als Signalmolekülen

wird von den Gram-negativen Bakterien verwendet (FUQUA et al., 2001;

WHITEHEAD et al., 2001). Weitere QS-Systeme vereinigen Komponenten Gram-

negativer und Gram-positiver QS-Systeme, wie für Vibrio harveyi beschrieben

(READING und SPERANDIO, 2006). Dieses marine Bakterium verwendet zwei QS-

Systeme, ein AHL-QS-System zur intraspezifischen Kommunikation (BASSLER et

al., 1994) und ein weiteres System zur interspezifischen Kommunikation (SURETTE

und BASSLER, 1998; FEDERLE und BASSLER, 2003), an dem ein

Furanosylboratdiester (borhaltiges Furanon) als „Autoinducer“ („Autoinducer II“(AI-2),

siehe Abb. 1.1) beteiligt ist (CHEN et al., 2002). Genomanalysen belegten, dass das

für die AI-2-Synthese benötigte LuxS-Enzym unter den Bakterien weitverbreitet ist

(SUN et al., 2004). Für die mittlerweile weiteren nachgewiesenen Gram-positiven

und Gram-negativen Bakterien mit AI-2-Signalmolekülen (LuxS/AI-2-QS-System)

wird ebenfalls angenommen, dass die universellen Signalmoleküle eine

interspezifische Kommunikation ermöglichen (WATERS und BASSLER, 2005).

Die am häufigsten verwendeten Signalmoleküle zur interzellulären Kommunikation

unter den Gram-positiven Bakterien sind lineare, z.T. zyklische Oligopeptide (AIP =

autoinducing peptides) (KLEEREBEZEM et al., 1997; MILLER und BASSLER, 2001;

CAMILLI und BASSLER, 2006), aber es wurden auch γ-Butyrolactone bei

Streptomyceten und AI-2-Signalmoleküle bei z.B. Streptococcus pneumoniae,

S. anginosus und Staphylococcus aureus nachgewiesen (MILLER und BASSLER,

2001; AHMED et al., 2007, WILLIAMS, 2007) (siehe Abb. 1.1).

2

1. Einleitung

halogeniertes Furanon

Al-2

Abb. 1.1: Zusammenstellung verschiedener, repräsentativer QS-Signalmoleküle und deren Strukturen. 3-oxo-C6-HSL, N-3-oxo-hexanoyl-L-homoserine lactone; A-Factor, 2-isocapryloyl-3-hydroxymethyl-γ-butyrolactone; Pseudomonas quinolone signal (PQS), 2-heptyl-3-hydroxy-4(1H)-quinolone; HHQ, 2-heptyl-4(1H)-quinolone; DSF (“diffusible factor“), 11-methyl-2-dodecenoic acid; 3OH-PAME, hydroxyl-palmitic acid methyl ester; AIP-1, staphylococcal autoinducing peptide 1; DPD (AI-2-Precursor-Molekül), 4,5 dihydroxy-2,3-pentanedione; AI-2 (Autoinducer-2), furanosyl borate diester; halogeniertes Furanon aus Delisea pulchra. Strukturen zusammengestellt aus Angaben von WILLIAMS (2007) und FROMMBERGER (2005).

In den letzten Jahren wurde in vielen Gram-negativen Bakterienspezies,

überwiegend Proteobakterien, und in einigen Gram-positiven Bakterienspezies QS-

Systeme identifiziert, welche zum Informationsaustausch über den Zustand der

Gesamtpopulation befähigt sind. Damit bestätigte sich, dass „Quorum Sensing“ ein

weitverbreiteter Mechanismus der Genregulation in Bakterien ist (READING und

SPERANDIO, 2006; CAMILLI und BASSLER, 2006). Die Angaben über QS-Systeme

bei Gram-negativen Bakterien gehen in den Publikationen weit auseinander.

Berichten SHIN und Mitarbeiter (2007) von lediglich über 30 Spezies, konnten alleine

CASE und Mitarbeiter (2008) bei nahezu 50 Spezies (aus etwa 30 Gattungen) QS-

Systeme dokumentieren. Dabei werden für weit mehr Bakterienspezies AHL-QS-

Systeme angenommen.

Bereits 1996 wurde aber am Beispiel der Meeresalge Delisea pulchra aufgezeigt,

dass QS-Komponenten (z.B. halogenierte Furanone, siehe Abb. 1.1) auch in

Eukaryoten vorkommen (GIVSKOV et al., 1996), welche z.B. bakterielle QS-Systeme

durch eine Degradation des LuxR-Rezeptors inhibieren (MANEFIELD et al., 2002).

Die Alge wird folglich kaum von bakteriellen Biofilmen besiedelt.

3

1. Einleitung

„Quorum Sensing“ stellt ein Regulationssystem mit großem Wirkungsbereich dar,

welches eine Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen ermöglicht bzw. der

Bakterienpopulation einen erheblichen Vorteil verschaffen kann (CASE et al., 2008).

QS kann dabei eine Vielzahl physiologischer Prozesse und phänotypischer

Veränderungen der Bakterienzelle regulieren. Diese Prozesse schließen die

Antibiotika-Produktion, die bakterielle Konjugation, die Produktion von

Virulenzfaktoren, die Sporenbildung, die Lumineszenz, die Biosynthese von

Exopolysacchariden, die Produktion von Sekundärmetaboliten und Exoenzymen, die

Regulation von Zellfunktionen in der stationären Wachstumsphase, die Motilität und

das Schwärmen, die Biofilmbildung und die Zellaggregation ein (WITHERS et al.,

2001; WATERS und BASSLER, 2005; WILLIAMS, 2007; DIGGLE et al., 2007a).

Dementsprechend kommt dem bakteriellen QS z.B. in der Medizin hinsichtlich neuer

Therapieansätze eine entscheidende Bedeutung zu, da die Ausprägung wichtiger

Virulenzfaktoren sowie die Antibiotikaproduktion bei einer Reihe von Organismen,

wie dem humanpathogenen Bakterium Pseudomonas aeruginosa, unter QS-

Kontrolle stehen (BJARNSHOLT und GIVSKOV, 2007).

1.2 „Quorum Sensing“ bei Vibrio fischeri als grundlegendes Modell einer AHL-abhängigen Genregulation bei Gram-negativen Bakterien

Das marine Leuchtbakterium Vibrio (Photobacterium) fischeri lebt in der Natur im

freien Meerwasser oder als Symbiont in Lichtorganen von Fischen und Weichtieren,

in denen das Bakterium zu sehr hohen Zelldichten anwächst (1010 - 1011 Zellen/ml)

und die Lumineszenz ausgelöst (BOETTCHER und RUBY, 1995). Der

Wirtsorganismus zieht Nutzen aus der Lichtemission und stellt den Bakterien

innerhalb der Lichtorgane im Gegenzug Nährstoffe zur Verfügung. Im freien

Meerwasser liegen lediglich geringe Zelldichten vor, wodurch eine Lumineszenz nicht

induziert und keine Energie in dieser nährstoffarmen Umgebung für eine unnötige

Lichtproduktion verbraucht wird (NEALSON und HASTINGS, 1979; LEE und RUBY,

1992).

Bei V. fischeri sind niedermolekulare Verbindungen („Autoinducer“) für diese

Zelldichte-abhängige Regulation der Lumineszenz verantwortlich (EBERHARD et al.,

1981). Die acylierten Derivate des Homoserinlactons (bei V. fischeri: 3-oxo-C6-HSL)

werden dabei von dem LuxI-Protein, einer AHL-Synthase, konstitutiv synthetisiert

(EBERHARD et al., 1981; ENGEBRECHT und SILVERMAN, 1984) und diffundieren

4

1. Einleitung

frei durch biologische Membranen und die Zellwand (KAPLAN und GREENBERG,

1985) (siehe Abb. 1.2 A). Aufgrund der freien Diffusion werden die Signalmoleküle

auch außerhalb der Bakterienzelle lokal akkumuliert. Dementsprechend steigt die

intrazelluläre und (lokale) extrazelluläre Konzentration dieser „Autoinducer“ bei

Zunahme der Zellpopulationsdichte proportional. Die AHL-Signalmoleküle binden bei

einer kritischen Schwellenwert-Konzentration (treshold concentration) als Ligand an

das LuxR-Protein (Transkriptionsaktivator) im Cytoplasma mit nachfolgender

Aktivierung der Transkription des luxICDABE-Operons durch Bindung des LuxR-

„Autoinducer“-Komplexes an die Promotorregion (ENGEBRECHT et al., 1983) (siehe

Abb. 1.2 B). Diese als lux-Boxen bezeichneten speziellen Promotorsequenzen sind

20 bp große invertierte, repetitive Sequenzen (ZHANG et al., 2002a). Neben den für

die Lumineszenz benötigten Genen kodiert das lux-Operon das luxI-Gen. Eine

gesteigerte Transkription der Lumineszenz-Gene führt somit durch eine positive

„feedback“-Regulation zu einer Verstärkung der eigenen Signalmolekül-Produktion

(Autoinduktion) (EBERHARD et al., 1981) (siehe Abb. 1.2 B). Studien an V. fischeri

belegen, dass das LuxR/LuxI-QS-System zudem weitere, nicht für die Lumineszenz

erforderliche Gene reguliert (QIN et al., 2007).

Abb. 1.2: Zelldichte-abhängige QS-Regulation der Lumineszenz bei Vibrio fischeri. A: Bei niedrigen Zelldichten werden die Lumineszenz-Gene luxCDABE aufgrund einer niedrigen Konzentration des Signalmoleküls (3-oxo-C6-HSL) lediglich schwach transkribiert. B: Bei hohen Zelldichten bindet das Signalmolekül bei Erreichen einer Schwellenwert-Konzentration als Ligand an das LuxR. Die gesteigerte Transkription der luxCDABE-Gene führt zur Lichtemission sowe zur Verstärkung der Signalmolekül-Produktion. Abbildung nach WHITEHEAD (2001), verändert nach FROMMBERGER (2005)

5

1. Einleitung

1.3 N-Acyl-L-Homoserinlactone bei Gram-negativen Bakterien In vielen Gram-negativen Bakterien (vor allem bei α-, β- und γ-Proteobakterien)

wurden mittlerweile LuxR/LuxI-homologe QS-Systeme nachgewiesen. Diese auf

molekularer Ebene am besten verstandenen QS-Systeme setzen sich aus

regulatorischen LuxI- und LuxR-homologen Proteinen zusammen, wobei die LuxI-

homologen Proteine die N-Acyl-L-Homoserinlactone (AHLs) als „Quorum

Sensing“(QS)-Signalmoleküle synthetisieren (CASE et al., 2008). Die Stoffklasse der

N-Acyl-L-Homoserinlactone zeichnet sich durch einen Homoserinlactonring und einer

N-acylierten Seitenkette aus, verbunden über eine Amid-Bindung. Die N-Acyl-

Seitenketten unterscheiden sich in Länge (zwischen 4 - 18 C-Atomen), Sättigung

sowie durch eine eventuelle Substitution am C3-Atom (3-Oxo- oder 3-Hydroxygruppe)

(WHITEHEAD et al., 2001; WILLIAMS, 2007) (siehe Abb. 1.3). Dieses bedingt eine

beträchtliche strukturelle Diversität von AHL-Molekülen.

Abb. 1.3: Struktur von AHL-Signalmolekülen. AHL, N-Acyl-L-Homoserinlacton; 3-oxo-AHL, N-3-oxo-Acyl-L-Homoserinlacton; 3-hydroxy-AHL, N-3-hydroxy-Acyl-L-Homoserinlacton. R = C1 bis C15. . Die Acyl-Seitenketten können zudem eine oder mehrere Doppelbindungen aufweisen. 3-oxo-C12-HSL, N-3-oxo-Dodecanoyl-L-Homoserinlacton. Strukturen zusammengestellt aus Angaben von WILLIAMS (2007)

S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) und acyliertes acyl carrier protein (acyl-ACP),

letzteres ein Zwischenprodukt der Fettsäurebiosynthese, sind die Substrate der LuxI-

homologen Enzyme (AHL-Synthasen) für die AHL-Synthese. Der

Homoserinlactonring der N-Acyl-HSLs wird dabei aus dem S-Adenosyl-L-Methionin

(SAM) synthetisiert, die N-Acyl-Seitenkette der AHL-Moleküle aus den Acyl-Resten

der acyl-ACP-Moleküle (SCHAEFER et al., 1996).

6

1. Einleitung

1.4 AHL-Biosensoren Die Identifizierung einer großen Anzahl von AHL-QS-Systemen in Bakterien wurde

durch die Entwicklung und den Einsatz bakterieller AHL-Biosensoren bedeutend

vorangebracht, welche auch heutzutage in AHL-Untersuchungen Anwendung finden.

Diese bakteriellen Biosensoren produzieren selber keine AHL-Signalmoleküle,

zeichnen sich aber durch eine phänotypische Nachweisreaktion in Gegenwart

bestimmter N-Acyl-HSLs aus. Diese Reaktion beruht auf dem Vorhandensein eines

LuxR-homologen Proteins, welches die Aktivierung eines bestimmten Reportergens

induziert (z.B. Lumineszenz, β-Galaktosidase, GFP, Violacein-Pigment) (WAGNER-

DÖBLER et al., 2005; STEINDLER und VENTURI, 2007). Das jeweilige Protein aus

der LuxR-Familie bestimmt für jeden AHL-Biosensor die AHL-Spezifität, kann aber

auch in manchen Fällen (bei höheren Konzentrationen) durch nahverwandte AHLs

angesprochen werden. Dementsprechend gibt es gentechnisch konstruierte

Biosensoren, welche auf AHL-Moleküle mit kurz- und mittellangen Acyl-Seitenketten

(z.B. Chromobacterium violaceum CV026: MCCLEAN et al., 1997), mit langen Acyl-

Seitenketten (z.B. Pseudomonas aeruginosa PAO1 (M71LZ): DONG et al., 2005),

aber auch auf ein breites Spektrum von AHL-Molekülen (z.B. Agrobacterium

tumefaciens NTL4 (pZLR4): FARRAND et al., 2002) reagieren. Andere Biosensoren

reagieren hingegen nur auf bestimmte Modifikationen in der Acyl-Seitenkette, wie der

3-hydroxy-AHL detektierende Biosensor Pseudomonas fluorescens 1855 (pSF105,

pSF107) (KHAN et al., 2005). Neben Modifikation und Länge der Acyl-Seitenkette ist

die AHL-Konzentration für eine Aktivierung der jeweiligen Reportergene von großer

Bedeutung (Sensitivität) (STEINDLER und VENTURI, 2007).

1.5 Interspezifische Kommunikation bei Bakterien QS-Signalmoleküle sind größtenteils sehr art-spezifisch (SMITH et al., 2004). Die

N-Acyl-L-Homoserinlactone der Gram-negativen Bakterien weisen eine große

strukturelle Ähnlichkeit auf, werden aber dessen ungeachtet mit einer hohen

Spezifität von ihrem jeweiligen LuxR-homologen Protein erkannt (FEDERLE und

BASSLER, 2003; WAGNER-DÖBLER et al., 2005). Aufgrund dieser Spezifität

zwischen LuxR-Homologen und N-Acyl-HSL-Molekülen wurde das bakterielle AHL-

QS-System vor allem als ein intraspezifisches Kommunikationssystem verstanden

(FEDERLE und BASSLER, 2003; READING und SPERANDIO, 2006). Mittlerweile

sind einige LuxR-homologe Proteine bekannt, welche mehr als ein AHL-

7

1. Einleitung

Signalmolekül erkennen und in erster Linie an einer interspezifischen Kommunikation

beteiligt sind (READING und SPERANDIO, 2006). Eine Interspezies-Kommunikation

ist dabei nicht immer zu einem beiderseitigen Vorteil. Mögliche Interaktionen sind

dabei neben einer Aktivierung des LuxR-homologen Regulatorproteins des Weiteren

eine Blockierung der AHL-Bindungsstelle durch Spezies-fremde AHL-Moleküle. In

diesem Zusammenhang wurde für Chromobacterium violaceum eine Inhibierung der

Produktion von Violacein durch langkettige AHL-Moleküle (C10 - C14-Seitenketten)

beschrieben (MCCLEAN et al., 1997).

Ein Beispiel interspezifischer Kommunikation ist die zwischen den opportunistisch

pathogenen Bakterien Pseudomonas aeruginosa und Burkholderia cepacia, welche

die Lungen von Patienten mit Cystischer Fibrose co-infizieren und gemischte

Biofilme ausbilden. In diesem Fall aktivieren die synthetisierten AHL-Moleküle von

P. aeruginosa das Pathogenese regulierende QS-System bei B. cepacia, wodurch

B. cepacia Nutzen aus Spezies-fremden AHLs zieht (RIEDEL et al., 2001). Die LuxR-

homologen Proteine der beiden Spezies weisen eine hohe Verwandtschaft

zueinander auf, welches evolutionär auf einen lateralen Gentransfer schließen lässt,

resultierend in einer erleichterten Interspezies-Kommunikation (CASE et al., 2008).

Das marine Bakterium Vibrio harveyi existiert in natürlichen Habitaten in gemischten

Populationen, bestehend aus verschiedenen Bakterienspezies (MILLER und

BASSLER, 2001). Das interspezifische QS-System mit dem „Autoinducer II“(AI-2)-

Signalmolekül ermöglicht es V. harveyi neben der eigenen Populationsdichte zudem

die der anderen AI-2-synthetisierenden Bakterienspezies in ihrer lokalen Umgebung

wahrzunehmen (SURETTE und BASSLER, 1998; FEDERLE und BASSLER, 2003).

Die Fähigkeit einer Verhaltensänderung in Abhängigkeit von den

Populationsverhältnissen in der Gesamtpopulation beruht bei diversen

Bakterienspezies auf der Erkennung verschiedener AI-2-Signalmoleküle, ausgehend

vom 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD, siehe Abb. 1.1) (CHEN et al., 2002;

MILLER et al., 2004).

Untersuchungen an gemischten Bakterienpopulationen mit verschiedenen

Bakterienspezies zeigten, dass die AI-2-Produktion durch Escherichia coli in anderen

Bakterienspezies QS-gesteuerte Vorgänge bereits bei niedrigen Zelldichten

einleitete. Ein Abbau der AI-2-Signalmoleküle durch E. coli verursachte indes bei

benachbarten Bakterienspezies eine zu geringe Einschätzung der eigenen

8

1. Einleitung

Populationsdichte, wodurch QS-gesteuerte Prozesse nicht eingeleitet oder nicht

beendet wurden (XAVIER und BASSLER, 2005).

Neben der bakteriellen Interspezies-Kommunikation wurden auch Interaktionen

zwischen Bakterien und höheren Organismen beschrieben (inter-kingdom). Dabei

können höhere Organismen bakterielle QS-Systeme über sogenannte AHL-Mimetika

stimulieren, wobei Assoziationen mit Bakterien z.B. beim Menschen zur Erhaltung

seiner Darmflora dienen könnten (CAMILLI und BASSLER, 2006). In Reispflanzen

(Oryza sativa) wurden AHL-Mimetika nachgewiesen (DEGRASSI et al., 2007), deren

biologische Bedeutung bisweilen noch nicht erfasst wurde, aber vermutlich im

Zusammenhang mit Reis-pathogenen Burkholderia-Spezies stehen.

1.6 „Quorum Quenching“ (QQ): Inhibierung der Zell-Zell-Kommunikation Die Hemmung der interzellulären Kommunikation („Quorum Quenching“) stellt

womöglich einen wichtigen Mechanismus in der Regulation des bakteriellen QS, aber

auch bei der Interaktion von verschiedenen Mikroorganismen sowie von

Mikroorganismen und höheren Organismen dar. In diesem Zusammenhang

übernimmt wahrscheinlich der Abbau von Signalmolekülen durch „Quorum

Quenching“-Enzyme (als eine Möglichkeit des QQ) eine wichtige Funktion (DONG

und ZHANG, 2005). AHL-degradierende Enzyme, AHL-Lactonasen, wurden

beispielsweise bei Bacillus-Spezies (z.B. DONG et al., 2000) und bei Agrobacterium

tumefaciens (ZHANG et al., 2002b), AHL-Acylasen bei Pseudomonas aeruginosa

(HUANG et al., 2003) und einem Anabaena-Stamm (ROMERO et al., 2008)

nachgewiesen. Ein Abbau bzw. eine Inaktivierung von Signalmolekülen ermöglicht

wahrscheinlich, wie für A. tumefaciens beschrieben (ZHANG et al., 2004), das

Abschalten der QS-regulierten Genexpression. Des Weiteren wird für einige

Bakterienspezies eine Inhibierung der interzellulären Kommunikation konkurrierender

und pathogener Bakterienspezies vermutet. In vielen Fällen regulieren die

bakteriellen QS-Systeme die Expression von Virulenz-Genen sowie die Antibiotika-

Produktion. Die in höheren Organismen detektierten AHL-degradierenden Enzyme

besitzen ebenfalls eine inhibierende Funktion gegen pflanzen- bzw.

humanpathogene QS-Systeme (DONG und ZHANG, 2005). Dementsprechend kann

die bakterielle Virulenz deutlich herabgesetzt werden. Neben QS-Inhibitoren wird den

AHL-degradierenden Enzymen eine Rolle bei der medizinischen Bekämpfung von

humanpathogenen Bakterien zugesprochen (HASELTINE und ARNOLD, 2008).

9

1. Einleitung

1.7 Auswahl an Mikroorganismen als AHL-Produzenten In der vorliegenden Arbeit wurde eine Auswahl von marinen Gram-negativen

Bakterienstämmen für „Quorum Sensing“-Untersuchungen eingesetzt, welche zuvor

auf Grundlage von Voruntersuchungen (SCHOMAKER, 2007) als AHL-Produzenten

beschrieben worden waren.

Der marine heterotrophe Bakterienstamm Bo 53-33 wurde aus der nicht-axenischen

Cyanobakterienkultur Stamm Bo 53 (Nodularia harveyana) isoliert und nach 16S-

rDNA-Sequenzierung der Gattung Porphyrobacter zugeordnet (HUBE, 2008), welche

erstmals von FUERST und Mitarbeitern (1993) beschrieben wurde. Porphyrobacter-

Spezies sind aerobe anoxygen phototrophe Bakterien und gehören zur α-4-

Untergruppe der Proteobakterien (YURKOV und BEATTY, 1998).

Der marine heterotrophe Bakterienstamm Bo 10-09 wurde aus der nicht-axenischen

Cyanobakterienkultur von Oscillatoria brevis Stamm Bo 10 isoliert und nach

Sequenzierung der 16S-rDNA als Vertreter der Gattung Muricauda (Gruppe:

Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides, Familie: Flavobacteriaceae) identifiziert

(HUBE, 2008). Der Typenstamm Muricauda aquimarina ist ein Gram-negatives,

nicht-sporenbildendes, leicht halophiles Stäbchen (YOON et al., 2005). Das Genus

Muricauda wurde erstmals von BRUNS und Mitarbeitern (2001) beschrieben.

Weiterhin wurde das Cyanobakterium Stamm Flo 1 für QS-Untersuchungen

hinzugezogen. Dieser Cyanobakterienstamm gehört zur Ordnung Oscillatoriales und

wurde ursprünglich aufgrund rein morphologischer Kriterien als Oscillatoria limnetica

bezeichnet. Durch molekularbiologische Untersuchungen konnte SCHRÜBBERS

(2007) aber eindeutig aufzeigen, dass Stamm Flo 1 eine Spezies der Gattung

Geitlerinema ist.

Cyanobakterien leben in engen assoziierten Lebensgemeinschaften mit

heterotrophen Bakterien (STEVENSON und WATERBURY, 2006). Cyanobakterien

stellen den heterotrophen Bakterien im Austausch gegen remineralsierte Nährstoffe

labile Substrate zur Verfügung (TUOMAINEN et al., 2006). Durch Fluoreszenz-Insitu-

Hybridisierung (FISH) wurden Porphyrobacter Stamm Bo 53-33 und Muricauda

Stamm Bo 10-09 ebenfalls als Teil der heterotrophen Begleitflora des Geitlerinema-

Stammes Flo 1 detektiert (HUBE, 2008, persönliche Mitteilung). In diesem

Zusammenhang stellt sich die Frage, in wieweit die assoziierten

Lebensgemeinschaften interspezifisch über (AHL)-Signalmoleküle miteinander

kommunizieren und über QS-gesteuerte Prozesse beeinflusst werden.

10

1. Einleitung

1.8 Ziel der Arbeit In der vorliegenden Diplomarbeit sollte eine dünnschichtchromatographische

Methode mit Biosensoren zum Nachweis von AHL-Molekülen etabliert werden. Des

Weiteren sollte die AHL-Produktion in Abhängigkeit vom pH-Wert und der

Wachstumsphase für die heterotrophen Bakterien Porphyrobacter Stamm Bo 53-33

und Muricauda Stamm Bo 10-09 sowie für das Cyanobakterium Stamm Flo 1

untersucht werden. Eine Untersuchung des Lichteinflusses sowie weiterer

Einflussfaktoren wie Temperatur und Kohlenstoffquelle auf die AHL-Produktion der

heterotrophen Bakterien sollte zudem durchgeführt werden. Aussagen zum

Wachstumsverhalten der heterotrophen Bakterien sollten mittels physiologischer

Untersuchungen getroffen werden.

Ferner sollte durch die Anwendung molekularbiologischer Methoden wie 16S-rDNA-

Sequenzierung, gyrB-Gen-Analyse und ITS-Amplifikation überprüft werden, ob es

sich bei den aufgrund morphologischer Kriterien klassifizierten Cyanobakterien

Nodularia harveyana Stamm Bo 53 und Oscillatoria brevis Stamm Bo 10 tatsächlich

um diese Spezies handelt.

11

2. Material und Methoden


2.1 Verwendete Bakterienstämme und deren Herkunft Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bakterienstämme sowie deren Herkunft

sind in den Tabellen 2.1 - 2.3 zusammengefasst. Hierbei erfolgte eine Unterteilung in

die zu untersuchenden Bakterienstämme (siehe Tab. 2.1 und Tab. 2.2) sowie in die

für den Nachweis von AHL-Signalmolekülen erforderlichen Stämme und

Referenzstämme (siehe Tab. 2.3).

Die Cyanobakterienstämme (siehe Tab. 2.2) wurden aus der Stammsammlung der

Abteilung Marine Mikrobiologie (UFT, Universität Bremen) entnommen. Die Stämme

Bo 53 und Bo 10 stammen ursprünglich von einem marinen Standort an der Ostsee

(Boiensdorf, Stammbezeichnung Bo), Stamm Flo 1 stammt aus einem

Mangrovenwäldchen in Key Biscayne (Florida (USA), Stammbezeichnung Flo). Die

heterotrophen Bakterienstämme (siehe Tab. 2.1) wurden von Dipl.-Biologin A. Hube

(Abt. Marine Mikrobiologie, UFT, Universität Bremen) zur Verfügung gestellt

(siehe Kap. 1.7).

Tab. 2.1: Liste der ausgewählten heterotrophen Bakterien und ihre Identifizierung nach HUBE (2008)

Stammbezeichnung Identifizierung nach Sequenzierung

Bo 10-09 Muricauda sp.

Bo 53-33 Porphyrobacter sp.

Tab. 2.2: Übersicht der ausgewählten Cyanobakterienstämme aus der Stammsammlung und deren Stammbezeichnung sowie ihre taxonomische Einordnung und ihre Abteilungszugehörigkeit nach RIPPKA und Mitarbeitern (1979)

Stammbezeichnung

Ordnung Oscillatoriales (Unterabteilung III)

Geitlerinema sp. a) Flo 1Oscillatoria brevis Bo 10

Ordnung Nostocales (Unterabteilung IV)

Nodularia harveyana Bo 53

Stamm und Abteilungszugehörigkeit(RIPPKA et al., 1979)

a) reklassifiziert (SCHRÜBBERS, 2007)

12


Tab. 2.3: Zusammenstellung weiterer Bakterienstämme sowie deren Verwendung und Herkunft

Bakterienstamm Eigenschaft/Verwendung Referenz/Herkunft

Vibrio sp. AHL-Positivkontrolle Max-Planck-Institut, Bremen

Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) traG::lacZ traR (pZLR4) AHL-Sensorstamm FARRAND et al., 2002

Agrobacterium tumefaciens NT1 (pTiC58∆accR ) AHL-Positivkontrolle FARRAND et al., 2002

Agrobacterium tumefaciens NTL4 AHL-Negativkontrolle FARRAND et al., 2002

Chromobacterium violaceum CV026 mini Tn5 AHL-Sensorstamm McCLEAN et al., 1997

Stamm PCC 7105 (Geitlerinema sp. ) cyanobakterieller Referenzstamm

Pasteur-Culture-Collection(PCC, Paris, Frankreich)

2.2 Verwendete Kulturmedien Die Lagerung der Flüssigmedien erfolgte bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln, die

der Festmedien bei 4 °C im Dunkeln.

2.2.1 ASNIII/2-Medium (RIPPKA et al., 1979, modifiziert nach RETHMEIER, 1995) Zur Anzucht von Stamm Flo 1 wurde das „Artificial Seawater Nutrient“-Medium

(ASNIII/2-Medium) mit Nitrat (RIPPKA et al., 1979, modifiziert nach RETHMEIER,

1995) verwendet, welchem zur Anzucht der heterotrophen Bakterienstämme

Bo 53-33 und Bo 10-09 1,0% Fleischextrakt als Kohlenstoffquelle zugesetzt wurde.

In Tabelle 2.4 sind die Bestandteile des Mediums und in Tabelle 2.5 die

Zusammensetzung der Spurenelement-Lösung angegeben. Die Lösungen des

Mediums wurden mit Aqua bidest. angesetzt und mit Ausnahme der sterilfiltrierten

Vitamin B12-Lösung autoklaviert. Das Natriumcarbonat (Na2CO3) wurde zur

Vermeidung von Ausfällungen separat in Aqua bidest. angesetzt und autoklaviert.

Diese Komponente und die Zusätze wurden dem autoklavierten Grundmedium steril

zugegeben. Das ASNIII/2-Medium wies eine Salinität von 15‰ auf. Das Kulturmedium

hatte einen pH-Wert von 9,0, das mit 1% Fleischextrakt versetzte Kulturmedium

einen pH-Wert von 7,1. Zur Herstellung von ASNIII/2-Festmedium wurde dem

Grundmedium zusätzlich 1,5% (w/v) Agar zugesetzt.

13


Tab. 2.4: Zusammensetzung des ASNIII/2-Mediums (RIPPKA et al., 1979, modifiziert nach RETHMEIER, 1995)

Komponenten g/l oder ml/lGrundmedium

NaCl 12,5 gMgCl2 x 6 H2O 1,0 gKCl 0,25 gNaNO3 0,75 gMgSO4 x 7 H2O 1,75 g CaCl2 x 2 H2O 0,25 gFleischextrakta) 10,0 gAqua bidest. ad 900 ml Na2CO3 0,12 g/100 ml

ZusätzeKH2PO4 x 3 H2O-Stammlösung (4 g/l) 2,50 mlFe-NH4-Citrat-Lösung (6 g/l) 0,25 mlVitamin B12-Stammlösungb) (1 mg/100 ml) 0,50 mlSpurenelement-Lösung (Trace Metal Mix) 0,50 ml

a) Anzucht der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 b) sterilfiltriert

Tab. 2.5: Zusammensetzung der Spurenelement-Lösung (Trace Metall Mix) (RIPPKA et al., 1979, modifiziert nach RETHMEIER, 1995)

Komponenten g/lNa3-Citrat x 2 H2O 3,0Na2-EDTA x 2 H2O 5,5H3BO3 2,86MnCl2 x 4 H2O 1,81ZnSO4 0,222Na2MoO4 x 2 H2O 0,318CuSO4 x 5 H2O 0,079Co(NO3)2 x 6 H2O 0,0494Aqua bidest. ad 1000 ml

2.2.2 LB(Luria Bertani)-Medium (SAMBROOK et al., 1989) Die Anzucht von Chromobacterium violaceum CV026 erfolgte im LB-Flüssigmedium

(SAMBROOK et al., 1989). Die Zusammensetzung des Mediums ist in Tabelle 2.6

dargestellt. Vor dem Autoklavieren wurde der pH-Wert durch Zugabe von 1 M HCl

bzw. 1 M NaOH auf 7,0 eingestellt (Sartorius, PB-11). Durch Zugabe von 1,5% (w/v)

Agar wurde LB-Festmedium hergestellt.

14


Tab. 2.6: Zusammensetzung des LB-Flüssigmediums (SAMBROOK et al., 1989)

Komponenten g/lTryptone 10,0Hefeextrakt 5,0NaCl 10,0Aqua bidest. ad 1000 ml

2.2.2.1 LB(Luria Bertani)-Weichagar (SAMBROOK et al., 1989) In Tabelle 2.7 sind die Medienkomponenten des LB-Weichagars (SAMBROOK et al.,

1989) zusammengefasst, welcher nach Zugabe von 50 ml Sensorkultur (siehe

Kap. 2.7.5.2) bei 150 ml Gesamtvolumen 0,75% (w/v) Agar enthält.

Tab. 2.7: Zusammensetzung des LB-Weichagars (SAMBROOK et al., 1989)

Komponenten gAgar 1,12Tryptone 1,0Hefeextrakt 0,5NaCl 1,0Aqua bidest. ad 100 ml

2.2.3 Leuchtbakterien-Medium (Angaben lt. MPI, Bremen) Die Anzucht von Vibrio sp. erfolgte im Leuchtbakterien-Medium (Angaben lt. MPI,

Bremen). Die Medienkomponenten wurden getrennt in Aqua bidest. angesetzt und

anschließend autoklaviert. Die Zusammensetzung des Mediums ist in Tabelle 2.8

dargestellt.

Tab. 2.8: Zusammensetzung des Leuchtbakterien-Mediums (Angaben lt. MPI, Bremen)

Komponenten g/lCaCl2 x 2 H2O 1Glycerin 3Hefeextrakt 3KCI 0,5MgSO4 x 7 H2O 9NaCl 20Pepton 5Aqua bidest. 1000 ml

15


2.2.4 ABG-Medium (CHILTON et al., 1974) Die Anzucht der Agrobacterium tumefaciens-Stämme erfolgte im ABG-Medium

(CHILTON et al., 1974). In Tabelle 2.9 ist die Zusammensetzung des ABG-Mediums,

in den Tabellen 2.10 und 2.11 die der 20x AB-Salze und des 20x AB-Puffers

dargestellt. Vor dem Autoklavieren der 20x AB-Puffer-Stammlösung wurde der pH-

Wert durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf 7,0 eingestellt (Sartorius

PB-11). Der Puffer, die Salze und die Glucoselösung wurden dem autoklavierten

Aqua bidest. steril zugegeben. ABG-Festmedium wurde durch Zugabe von 1,5 %

(w/v) Agar hergestellt.

Tab. 2.9: Zusammensetzung des ABG-Mediums (CHILTON et al., 1974)

Komponenten ml20x AB-Salze 5020x AB-Puffer 50Glucose (Stammlösung 20%) 10Aqua bidest. 890

Tab. 2.10: Zusammensetzung der 20x AB-Salze-Stammlösung (CHILTON et al., 1974)

Komponenten g/lNH4Cl 20MgSO4 x 7 H2O 6KCl 3CaCl2 0,2FeSO4 x 7 H2O 0,05Aqua bidest. ad 1000 ml

Tab. 2.11: Zusammensetzung der 20x AB-Puffer-Stammlösung (CHILTON et al., 1974)

Komponenten g/lK2HPO4 60NaH2PO4 23Aqua bidest. ad 1000 ml

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2.2.4.1 ABG-Weichagar (CHILTON et al., 1974) In Tabelle 2.12 sind die Medienkomponenten des ABG-Weichagars (CHILTON et al.,

1974) zusammengefasst, welcher nach Zugabe von 50 ml Sensorkultur (siehe

Kap. 2.7.5.2) bei 150 ml Gesamtvolumen 0,75% (w/v) Agar enthält. Die

Zusammensetzung der 20x AB-Salze und des 20x AB-Puffers ist in Kapitel 2.2.4,

Tabelle 2.10 und 2.11 dargestellt. Der Puffer, die Salze und die Glucoselösung

wurden der autoklavierten Agar-Aqua bidest.-Mischung steril zugegeben.

Tab. 2.12: Zusammensetzung des ABG-Weichagar (CHILTON et al., 1974)

Komponenten g oder mlAgar 1,12 gAqua bidest. 89 ml20x AB-Salze 5 ml20x AB-Puffer 5 mlGlucose (Stammlsg. 20 %) 1 ml

2.3 Pufferlösungen Für die Pufferung von Kulturmedien wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene

Pufferlösungen (DAWSON et al. 1986) verwendet, deren Zusammensetzungen in

der nachfolgenden Tabelle 2.13 zusammengefasst sind. Dabei wird jeweils die

Pufferzusammensetzung für ein Endvolumen von 100 ml angegeben. Zur

Herstellung der verschiedenen Pufferlösungen wurden die Komponenten abhängig

von dem anzusetzenden pH-Wert in einem bestimmten Verhältnis miteinander

gemischt und nachfolgend gegebenfalls mit Aqua bidest. auf 100 ml aufgefüllt.

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Tab. 2.13: Zusammensetzung verschiedener Pufferlösungen im Bereich von pH 2,0 - 11,0 (DAWSON et al., 1986)

Pufferlösungen pH, 25 °C Aqua bidest. (ml)

0,2 M Kaliumchlorid-Lösung 0,2 M HCI2,0 25,0 6,5 68,5

0,1 M Citronensäure-Lösung 0,1 M tri-Natriumcitrat-Lösung3,0 82,0 18,0 --4,0 59,0 41,0 --5,0 35,0 65,0 --

0,2 M Tris-Maleat-Lösung 0,2 M NaOH 6,0 a) 25,0 13,0 62,07,0 a) 25,0 24,0 51,0

0,1 M Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung 0,1 M NaOH 6,0 50,0 5,6 44,47,0 50,0 29,1 20,9

0,1 M Tris-Lösung 0,1 M HCl 7,1 50,0 45,7 4,38,0 50,0 29,2 20,88,5 50,0 14,7 35,38,9 50,0 7,0 43,0

0,1 M Kaliumchlorid/Borsäure-Lösung 0,1 M NaOH 8,0 50,0 3,9 46,18,5 50,0 10,1 39,99,0 50,0 20,8 29,29,5 50,0 34,6 15,410,0 50,0 43,7 6,3

0,2 M Glycin-Lösung 0,2 M NaOH9,0 25,0 4,4 70,610,0 25,0 16,0 59,0

0,05 M di-Natriumhydrogenphosphat-Lösung 0,1 M NaOH 11,0 50,0 4,1 45,9

Tris-Pufferlösungen

Clark and Lubs-Pufferlösungen

Glycin-NaOH-Pufferlösungen

Phosphat-Pufferlösung

Komponenten (ml)

Tris-Maleat-Pufferlösungen

Clark and Lubs-Pufferlösungen

Citronensäure-Natriumcitrat-Pufferlösungen

Clark and Lubs-Pufferlösung

a) pH-Wert bei 23 °C

18


2.4 Lagerung der Bakterienstämme Zur langfristigen Lagerung der heterotrophen Bakterien wurden Glycerinstocks

angelegt. Die Bakterienstämme wurden hierzu im jeweiligen Medium angezogen und

in sterilen Eppendorfreaktionsgefäßen (ERG) in Glycerin (Bakterienkultur und steriles

87%iges Glycerin in 4:1 Volumenanteilen) bei -80 °C eingefroren. Für alle

nachfolgenden Untersuchungen wurde mit einer Impföse oder einer

Eppendorfpipette steril Bakterienmaterial entnommen und in das jeweilige

Flüssigmedium überführt. Die Kontrolle der Reinheit erfolgte über die jeweiligen

Agarplatten für das Bakterium mittels Drei-Ösen-Ausstrich und Inkubation bei 28 °C

im Brutschrank (Heraeus Instruments, kelvitron® t) unter aeroben Bedingungen für

2 - 4 Tage.

Parallel zu den Glycerinstocks wurden die heterotrophen Bakterienstämme auf den

jeweiligen festen Nährmedien ausgestrichen und bei 28 °C für 4 - 5 Tage inkubiert.

Anschließend wurden die Agarplatten im Kühlraum bei 4 °C gelagert und bildeten ein

zusätzliches Bakterienmateriallager.

2.5 Voranzucht der zu untersuchenden Bakterienstämme

2.5.1 Voranzucht der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 Die Anzucht der Vorkulturen erfolgte unter sterilen Bedingungen in mit 20 ml ASNIII/2-

Medium (siehe Kap. 2.2.1) gefüllten 50 ml Erlenmeyerkolben. Vorkulturen wurden

stets mit Bakterienmaterial aus den angelegten Glycerinstocks angeimpft (siehe

Kap. 2.4) und für 16 - 24 h bei 21 °C in einem Schüttelwasserbad (Julabo SW 21) bei

120 rpm unter aeroben Bedingungen inkubiert (= Übernachtkultur (ÜK)).

Zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens (siehe Kap. 2.6) als auch zur

Untersuchung auf AHL-Moleküle (siehe Kap. 2.7.2.1) wurden die Vorkulturen mit

einer O.D.600nm von 0,1 angesetzt, wobei diese aus einer Übernachtkultur (ÜK)

inokuliert wurden. Die Bakterienstämme wurden, wenn nicht anders beschrieben, für

12 - 16 h bei 21 °C in einem Schüttelwasserbad (Julabo SW 21) bei 120 rpm unter

aeroben Bedingungen im Dunkeln inkubiert.

19


2.5.2 Voranzucht der Cyanobakterienstämme Flo 1, Bo 10 und Bo 53 Die Hälterung der Flo 1-Kulturen erfolgte bei einer konstanten Temperatur von 21 °C

im Brutraum mit einem konstanten Photonenfluss von 1 µE m-2 s-1 PAR

(Photosynthetic Active Radiation). Die Kulturen wurden in einem Abstand von 4 - 5

Wochen in frisches ASNIII/2-Medium (siehe Kap. 2.2.1) überführt. Das Überimpfen

erfolgte unter sterilen Bedingungen in mit 40 ml Kulturmedium gefüllten 100 ml

Erlenmeyerkolben bzw. in mit 100 ml Kulturmedium gefüllten 250 ml

Erlenmeyerkolben.

Vor dem eigentlichen Versuch wurden Vorkulturen angesetzt, die an die jeweiligen

Versuchsbedingungen für 3 - 4 Wochen adaptiert wurden.

Die Voranzucht des Cyanobakteriums Stamm Bo 10 wurde von Dipl.-Biologin

A. Hube, die des Cyanobakteriums Bo 53 von Dr. B. Heyduck-Söller durchgeführt.

2.6 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09

Zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens der Stämme Bo 10-09 und Bo 53-33

wurden Wachstumskurven mit ungepufferten Kulturmedien sowie bei verschiedenen

pH-Werten generiert und das pH-Minimum, -Maximum und -Optimum der

heterotrophen Bakterien ermittelt. Des Weiteren wurden die Kulturen bei einer

Photonenflussdichte von 5 µE m-2 s-1 PAR (Photosynthetic Active Radiation) inkubiert

und Wachstumskurven aufgenommen. Da die Hälterung der Cyanobakterien in der

Stammsammlung der Abt. Marine Mikrobiologie bei einer konstanten Temperatur von

21 °C erfolgt, wurde diese Temperatur auch zur Anzucht der Bakterienstämme

Bo 10-09 und Bo 53-33 gewählt, um eine AHL-Produktion der ansonsten in

Assoziation lebenden heterotrophen Bakterien bezüglich einer interspezifischen

Kommunikation unter identischen Inkubationstemperaturen zu untersuchen.

Die Wachstumsmessungen wurden in der vorliegenden Arbeit über O.D.-Messungen

bei einer Wellenlänge von 600 nm mittels eines Spektralphotometers (biochrom Libra

S12) durchgeführt. Die photometrische Messung erfolgte in Plastikküvetten gegen

das jeweilige unbeimpfte Kulturmedium als Blindprobe. Für jeden Versuchsansatz

wurde eine Doppelbestimmung (n = 2) durchgeführt mit anschließender Berechnung

der Mittelwerte. Der Abbruch des Versuches erfolgte in der stationären Phase der

Kulturen. Während und nach Beendigung der Wachstumsmessungen wurde der pH-

Wert der Kulturüberstände kontrolliert (siehe Kap. 2.6.4).

20


2.6.1 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten in ungepuffertem ASNIII/2-Medium im Dunkeln

Die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wurden, wie in Kapitel

2.5.1 beschrieben, im ASNIII/2-Medium inkubiert. Nach Ermittlung der O.D.600nm der

Vorkultur wurden die ungepufferten Versuchskulturen mit einer Ausgangs-O.D.600nm

von 0,1 inokuliert und bei 21 °C im Dunkeln in einem Schüttelwasserbad (Julabo SW

21) bei 120 rpm im Doppelansatz inkubiert. Die Untersuchungen zum

Wachstumsverhalten wurden in 50 ml Erlenmeyerkolben mit 25 ml Endvolumen

durchgeführt. Die photometrische Messung erfolgte im Abstand von 4 h (siehe

Kap. 2.6).

2.6.2 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-Werten im Dunkeln

Zur Ermittlung des pH-Minimums, -Optimums und -Maximums der heterotrophen

Testorganismen Stamm Bo 53-33 und Stamm Bo 10-09 wurde das Wachstum in

gepuffertem ASNIII/2-Medium in Schritten von einer pH-Einheit im Bereich pH 2,0 -

10,0 getestet. Eine Ausnahme bildete der pH-Wert von 8,5. Die für diese

Versuchsreihe verwendeten Pufferlösungen sind in Tabelle 2.14 zusammengetragen

und wurden in Vorversuchen ausgewählt (siehe Kap. 2.3). Die Komponenten des

Grundmediums (siehe Kap. 2.2.1, Tab. 2.4) wurden dazu direkt dem jeweiligen

Puffer zugesetzt und autoklaviert. Das Natriumcarbonat (Na2CO3) wurde ungelöst

autoklaviert und dem autoklavierten Grundmedium zugegeben. Der pH-Wert wurde

nach Fertigstellung des gepufferten Kulturmediums kontrolliert und gegebenenfalls

durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf den jeweiligen pH-Wert eingestellt

(Sartorius PB-11). Mit steigendem pH-Wert der gepufferten Kulturmedien (pH-

Bereich von 8,5 - 10,0) konnte eine zunehmende Trübung des Mediums durch

Ausfall von Salzen (z.B. Mg2+- und Ca2+-Ionen) festgestellt werden.

21


Tab. 2.14: Verwendete Pufferlösungen im Bereich von pH 2 - 10 (siehe Kap. 2.3, Tab. 2.13) zur Anzucht der heterotrophen Bakterienstämme Bo 10-09 und Bo 53-33

Verwendete Pufferlösungen pH-Wert

Clark and Lubs-Pufferlösung pH 2,0

Citronensäure-Natriumcitrat-Pufferlösung pH 3,0 - 5,0

Clark and Lubs-Pufferlösung pH 6,0

Tris-Maleat-Pufferlösung pH 7,0

Tris-HCl-Pufferlösung pH 8,0 und pH 8,5

Glycin-NaOH-Pufferlösung pH 9,0 und pH 10,0

Die gepufferten Versuchsansätze wurden aus einer Vorkultur (siehe Kap. 2.5.1) mit

einer O.D.600nm von 0,1 inokuliert und anschließend, wie in Kapitel 2.6.1 beschrieben,

inkubiert. Die Anzucht der heterotrophen Bakterien wurde in 50 ml Erlenmeyerkolben

mit 25 ml Endvolumen durchgeführt. Die photometrische Messung erfolgte im

Abstand von 8 h bzw. 16 h (siehe Kap. 2.6).

2.6.3 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei einem Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR

Zur Untersuchung des Lichteinflusses auf das Wachstum der heterotrophen

Bakterien wurden ungepufferte Versuchsansätze und Versuchsansätze beim

jeweiligen pH-Optimum des heterotrophen Bakteriums bei einem Photonenfluss von

5 µE m-2 s-1 PAR auf einem Inkubationsschüttler (Heidolph UNIMAX 2010) kultiviert

(siehe Kap. 2.6.1). Die Vorkulturen (siehe Kap. 2.5.1) wurden ebenfalls bei einem

Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR auf dem gleichen Inkubationsschüttler

angezogen. Die Anzucht der heterotrophen Bakterien wurde in 50 ml

Erlenmeyerkolben mit 25 ml Endvolumen durchgeführt. Die photometrische Messung

erfolgte im Abstand von 8 h bzw. 16 h (siehe Kap. 2.6).

2.6.4 pH-Wert-Bestimmung in den Kulturüberständen Der pH-Wert der Versuchskulturen wurde parallel zu den photometrischen

Messungen sowie nach Beendigung der Wachstumsversuche bestimmt. Hierzu

wurden jeweils 200 µl Zellkultur aus den Parallelansätzen für 1 min bei 13.000 rpm

zentrifugiert (Heraeus Instruments, Biofuge pico) und der pH-Wert des Überstandes

mit einem pH-Streifen (Macherey-Nagel; pH 6,0 - 10,0) ermittelt. Die abschließende

22


pH-Bestimmung in den Kulturüberständen erfolgte nach Zentrifugation (Beckman,

AvantiTM J-25 Centrifuge) der gesamten Zellkultur bei 13.000 rpm für 10 min mittels

einer pH-Elektrode, gekoppelt an einem pH-Meter (Sartorius PB-11). Es wurde eine

Doppelbestimmung (n = 2) mit anschließender Berechnung der Mittelwerte

durchgeführt.

2.7 Nachweis von N-Acyl-L-Homoserinlactonen

2.7.1 Verwendete Sensorbakterienstämme zum Nachweis von AHL-Signalmolekülen

Die Detektion von AHL-Signalmolekülen erfolgte mit Hilfe der AHL-Sensorbakterien

Chromobacterium violaceum CV026 bzw. Agrobacterium tumefaciens NTL4

(pZLR4). Diese Indikatorbakterien synthetisieren durch gentechnische

Veränderungen keine AHL-Signalmoleküle, sind aber in der Lage diese

nachzuweisen (siehe Kap. 2.7.1.1 und 2.7.1.2). Die Sensorbakterien werden

nachfolgend näher beschrieben.

2.7.1.1 Chromobacterium violaceum CV026 (MCCLEAN et al., 1997) In Abhängigkeit von der Zelldichte wird in C. violaceum die Produktion von Violacein

reguliert. Dieses nicht-wasserlösliche, violette Pigment besitzt antimikrobielle

Eigenschaften. Die Doppelmutante C. violaceum CV026 wurde durch miniTn5

Transposonmutagenese generiert. Infolge der Insertion wurde die AHL-Produktion

unterbrochen, gekoppelt mit einem Verlust der Pigmentierung. Der C. violaceum

Wildtypstamm produziert N-hexanoyl-L-Homoserinlacton (C6-HSL) als einziges AHL-

Signalmolekül, demzufolge der Stamm C. violaceum CV026 besonders sensitiv auf

dieses Signalmolekül mit Violaceinproduktion reagiert. Der Sensorstamm eignet sich

besonders für den Nachweis von kurzkettigen, unsubstituierten AHL-Signalmolekülen

(vor allem C6-HSL) als Biosensor, wird hingegen von längerkettigen N-Acyl-L-

Homoserinlactonen (Acyl-Seitenketten länger als C8) sowie von N-Acyl-HSLs mit

3-Hydroxy-Substitution nicht zur Violaceinproduktion angeregt (STEINDLER und

VENTURI, 2007). AHL-Signalmoleküle mit einer C8-, C10-, C12- und C14-Seitenkette

sind jedoch fähig, bei vorheriger Zugabe von C6-HSL oder 3-oxo-C6-HSL in

angemessener Konzentration, die Pigmentierung der Mutante zu inhibieren.

23


Hierdurch kann mit diesem AHL-Biosensor ebenfalls ein Nachweis längerkettiger

AHLs erzielt werden.

2.7.1.2 Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) (FARRAND et al., 2002; SZENTHE und PAGE, 2003)

Der Wildtypstamm von A. tumefaciens ist ein pflanzenpathogenes Bakterium,

welches in seinen Wirtspflanzen Wurzeltumorwachstum induziert. Der Prozess der

Tumorbildung wird durch die Übertragung der T-DNA (oncogenic DNA) und ihrer

Integration in das Pflanzenchromosom verursacht. Die T-DNA ist ein kleiner

Abschnitt des Ti-Plasmids in A. tumefaciens. Auf dem Ti-Plasmid sind weitere Gene,

z.B. für den Transfer der T-DNA in die Wirtspflanze (vir-Gene) und den konjugativen

Transfer des Ti-Plasmids zwischen Stämmen von A. tumefaciens (tra-Gene),

lokalisiert. Die für einen konjugativen Transfer des Ti-Plamids nötigen Gene sind

dabei in einer Regulationseinheit (tra-Regulon) zusammengefasst. Bei

A. tumefaciens wird dieser Transfer über „Quorum Sensing“ gesteuert, wobei die

LuxI/LuxR-homologen Proteine TraI und TraR des A. tumefaciens-QS-Systems die

Zelldichte-abhängige Expression des tra-Regulons (tra-Operon, trb-Operon, traM)

regulieren. TraI ist eine Autoinducer-Synthase und synthetisiert das AHL-

Signalmolekül 3-oxo-C8-HSL. Das Protein TraR stellt den entsprechenden

Transkriptionsaktivator dar. Bei hoher Zelldichte und ebenfalls hoher intrazellulärer

N-Acyl-HSL-Konzentration bindet TraR das HSL-Molekül und aktiviert sowohl die

Transkription der tra-Gene als auch die Expression des traI-Gens, letzteres

resultierend in einer positiven Feedback-Schleife.

Der AHL-Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) besitzt kein Ti-Plasmid, aber

ein rekombinantes Plasmid (pZLR4). Dieses enthält Inserts von dem Plasmid pTIC58

mit traR und einem tra-Operon, welches eine traG::lacZ-Fusion aufweist. Neben

diesen Genen sind die Gene für Gentamycin- und Carbenicillin-Resistenz auf dem

Vektor kodiert, wobei Gentamycin das bestgeeignete Antibiotikum zur Selektion

darstellt. Der Stamm ist eine AHL-Synthase-Mutante und somit nicht in der Lage,

eigene AHL-Moleküle zu synthetisieren. Folglich reagiert der Stamm aufgrund der

traG::lacZ-Fusion erst bei Anwesenheit geeigneter exogener AHL-Moleküle über die

Aktivierung des TraR-Proteins mit der Expression der lacZ-kodierten

β-Galaktosidase. TraR aktiviert dabei die Transkription des traG-Gens, welches

jedoch durch die Insertion des lacZ-Gens nicht exprimiert wird. Dementsprechend

24


kann die Anwesenheit entsprechender AHL-Moleküle (bei ausreichender

Konzentration) über die β-Galaktosidase-Aktivität durch Umsetzung des Substrates

X-Gal zu einem hellblauen Farbstoff nachgewiesen werden.

Der A. tumefaciens-Sensorstamm detektiert ein breites Spektrum an AHL-

Signalmolekülen und weist unter den bisweilen konstruierten Biosensoren gegenüber

diesen Komponenten zudem mitunter die höchste Sensitivität auf (STEINDLER und

VENTURI, 2007). Entsprechend des eigenen QS-Systems zeigt der Indikatorstamm

eine höhere Sensitivität gegenüber 3-oxo-substituierten AHL-Signalmolekülen mit

C4- bis C12-Seitenketten, vor allem gegenüber 3-oxo-C8-HSL. Weiter eignet sich der

Sensorstamm, mit Ausnahme von C4-HSL, zum Nachweis unsubstituierter AHL-

Moleküle sowie von 3-hydroxy-Derivaten mit C6-, C8- und C10-Seitenketten

(STEINDLER und VENTURI, 2007).

Weitere A. tumefaciens-Stämme, welche in der vorliegenden Arbeit Verwendung

fanden, waren der A. tumefaciens-Stamm NTL4 und NT1 (pTIC58∆accR). Stamm

NTL4 fehlt ein Ti-Plasmid und ist demzufolge nicht fähig, AHL-Moleküle zu

synthetisieren. Neben dieser AHL-Negativkontrolle wurde der Stamm

NT1 (pTIC58∆accR) als AHL-Positivkontrolle eingesetzt, da dieser aufgrund eines

veränderten Ti-Plasmids (trac) konstitutiv die tra-Gene exprimiert und folglich auch

konstitutiv N-Acyl-HSLs synthetisiert.

2.7.2 Kultivierungsbedingungen und Inkubationsdauer der Versuchskulturen zur Untersuchung von AHL-Signalmolekülen

2.7.2.1 Kultivierungsbedingungen der AHL-Versuchskulturen mit den heterotrophen Bakterienstämmen Bo 53-33 und Bo 10-09

Zur Untersuchung der AHL-Produktion in Abhängigkeit von verschiedenen

Parametern variierten die Kultivierungsbedingungen für die Stämme Bo 53-33 und

Bo 10-09. Für die Extraktion von AHL-Molekülen (siehe Kap. 2.7.3) wurden die

Bakterienstämme in 500 ml Erlenmeyerkolben mit 250 ml Endvolumen angezogen.

Die Inokulation und Anzucht der jeweiligen Versuchsansätze wurden in den

jeweiligen unten genannten Kapiteln zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens

der heterotrophen Bakterienstämme beschrieben.

Zur Ermittlung des pH-Wert-Einflusses auf die AHL-Produktion wurden die AHL-

Gehalte bei dem jeweiligen pH-Minimum, pH-Optimum und pH-Maximum der

25


heterotrophen Bakterien im Dunkeln bei 21 °C verglichen (siehe Kap. 2.6.2). Des

Weiteren wurden ungepufferte Versuchsansätze im Dunkeln (siehe Kap. 2.6.1) und

bei einer Photonenflussdichte von 5 µE m-2 s-1 PAR (siehe Kap. 2.6.3) bei 21 °C

kultiviert und auf Signalmoleküle untersucht. Die Produktion von AHL-

Signalmolekülen wurde in der stationären Wachstumsphase, für die ungepufferten

und pH-optimalen Ansätze zudem in der logarithmischen Wachstumsphase

untersucht. Die generierten Wachstumskurven (siehe Kap. 3.2 und 3.3) dienten der

Anzucht als Referenz. Zur Überprüfung einer Korrelation des Zellwachstums

zwischen 250 ml und 25 ml Versuchsansätzen, wurde das Wachstum der Kulturen

stichprobenartig durch photometrische Messungen der O.D.600nm kontrolliert. Ferner

war die AHL-Produktion in Abhängigkeit von der Inkubationstemperatur und von der

Kohlenstoffquelle von Interesse. Hierzu wurden Versuchsansätze mit ungepuffertem

ASNIII/2-Medium (siehe Kap. 2.2.1) bei 28 °C im Dunkeln und zur Untersuchung des

Einflusses der Kohlenstoffquelle auf die AHL-Produktion im ASNIII/2-Medium mit 0,1%

Fleischextrakt bei 21 °C im Dunkeln kultiviert. Die Inokulation und Anzucht der

Versuchskulturen erfolgte wie in Kapitel 2.6.1 beschrieben, wobei die Vorkulturen für

die 28 °C Inkubation (Temperaturversuch) bei gleicher Temperatur angezogen

wurden. Die jeweilige Inkubationsdauer der Versuchskulturen ist im Anhang als

Tabelle 7.1 hinterlegt.

2.7.2.2 Anzucht und Kultivierungsbedingungen der AHL-Versuchskulturen mit dem Cyanobakterium Stamm Flo 1

Zur Untersuchung der AHL-Produktion durch Stamm Flo 1 wurden Versuchsansätze

mit ungepuffertem Kulturmedium (siehe Kap. 2.2.1) sowie gepufferten Kulturmedien

(pH 7,0, 8,0, 8,5 und 9,0) bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einem

konstanten Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR für 14 Tage (logarithmische Phase)

bzw. 21 Tage (stationäre Phase) kultiviert. Die Inkubationsdauer wurde auf

Grundlage der von SCHRÜBBERS (2007) erzielten Ergebnisse gewählt. Die

eingesetzten Vorkulturen wurden 3 - 4 Wochen an die Wachstumsbedingungen

adaptiert (siehe Kap. 2.5.2) und anschließend bei 8.000 rpm für 10 min zentrifugiert

(Beckman, AvantiTM J-25 Centrifuge). Der Kulturüberstand wurde verworfen, die

cyanobakterielle Biomasse vereinigt und homogenisiert. Mit Hilfe einer

Analysenwaage (Sartorius, MC 1 Research RC 210P) wurden jeweils 1000 mg

Homogenat in sterile ERG eingewogen und als Inokulum für die 250 ml AHL-

26


Versuchsansätze eingesetzt. Die Weiterbehandlung der Ansätze nach Beendigung

der Anzucht ist in Kapitel 2.7.3 beschrieben.

Für die Versuchsreihe wurden für pH 7,0 und 8,0 Tris-HCl-Pufferlösungen, für pH 8,5

und 9,0 Clark and Lubs-Pufferlösungen verwendet (siehe Kap. 2.3). Das Ansetzen

der gepufferten Kulturmedien erfolgte wie in Kapitel 2.6.2 beschrieben. Nach

Fertigstellung des gepufferten Kulturmediums wurde der pH-Wert kontrolliert und

gegebenenfalls durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M NaOH auf den jeweiligen pH-

Wert eingestellt (Sartorius PB-11).

2.7.3 Extraktion von N-Acyl-L-Homoserinlactonen der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo 1

2.7.3.1 Herstellung zellfreier Kulturüberstände Nach erfolgter Inkubation der 250 ml Zellkulturen der heterotrophen

Bakterienstämme Bo 10-09 und Bo 53-33 (siehe Kap. 2.7.2.1) sowie des

Cyanobakteriums Stamm Flo 1 (siehe Kap. 2.7.2.2) wurden diese bei 10.000 xg für

30 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert (Beckman, AvantiTM J-25 Centrifuge)

und der Zellkulturüberstand anschließend sterilfiltriert (sterilfiltriert; 0,2 µm

Porengröße). Die bakterielle Biomasse wurde entweder bei -20 °C gelagert oder

sofort für intrazelluläre AHL-Untersuchungen weiterverwendet (siehe Kap. 2.7.3.4).

2.7.3.2 Azidifizierung von Kulturüberständen (YATES et al., 2002) Eine Azidifizierung von ungepufferten Kulturüberständen der heterotrophen Stämme

Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie des cyanobakteriellen Stammes Flo 1 wurde nach

YATES und Mitarbeitern (2002) durchgeführt. Nach Gewinnung von zellfreien

Überständen (siehe Kap. 2.7.3.1) wurden diese mit konzentrierter HCl auf einen pH-

Wert < 2 eingestellt und anschließend für 24 h bei 21 °C inkubiert. Die

Weiterbehandlung erfolgte wie in Kapitel 2.7.3.3 beschrieben.

27


2.7.3.3 Extraktion von AHL-Molekülen aus Kulturüberständen (GEISENBERGER, 2000)

Die Extraktion von AHL-Signalmolekülen der heterotrophen Bakterienstämme

Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo 1 erfolgte aus

250 ml Zellkulturüberstand nach GEISENBERGER (2000). Hierzu wurde zellfreier

Kulturüberstand (siehe Kap. 2.7.3.1) in einen 1000 ml Scheidetrichter vorgelegt,

zweimal mit 100 ml Dichlormethan versetzt und für 10 min durch kräftiges Schütteln

gemischt. Ein ausreichender Druckausgleich wurde durch zwischenzeitliche

Belüftung des Scheidetrichters gewährleistet. Nach deutlicher Phasentrennung

wurde die untere Dichlormethan-Phase in einem 250 ml Erlenmeyerkolben

aufgefangen. Restliches Wasser in den vereinigten Dichlormethanextrakten wurde

vollständig durch Zugabe von wasserfreien Natriumsulfat und anschließendem

Rühren entfernt. Nachfolgend wurden die Extrakte gefiltert (Sartorius 3 hw) und im

Rotationsevaporator (Heidolph VV2000) bei einer Wasserbadtemperatur von

40 - 42 °C ohne Anlegen eines Vakuums eingetrocknet. Alternativ wurden die

gefilterten Extrakte unter dem Abzug offen stehen gelassen, wodurch diese

eindampften. Die Aufnahme des Rückstandes erfolgte in 250 µl Ethylacetat (versetzt

mit 0,01% (v/v) Essigsäure). Die Lagerung der Proben erfolgte bei -20 °C.

Vibrio sp. wurde für einen positiven Extraktionsnachweis bzw. als positive AHL-

Kontrolle im Leuchtbakterien-Medium (siehe Kap. 2.2.3) bei 4 °C im Dunkeln

angezogen, wobei Bakterienmaterial aus einer 24 h-Übernachtkultur (ÜK) als

Inokulum verwendet wurde. Die ÜK wurde mit Bakterienmaterial aus den angelegten

Glycerinstocks angeimpft (siehe Kap. 2.4). Die Kultivierung wurde nach Auftreten

deutlicher Lumineszenz abgebrochen.

2.7.3.4 Extraktion von AHL-Molekülen aus Bakterienzellen Für den Nachweis von intrazellulären AHL-Signalmolekülen wurde die AHL-

Extraktion aus Bakterienzellen nach BYERS und Mitarbeitern (2002) in abgeänderter

Form durchgeführt. Nach Zentrifugation einer 250 ml Zellkultur (siehe Kap. 2.7.3.1)

wurde das Zellpellet vollständig vom Überstand befreit und die gesamte bakterielle

Biomasse in 40 ml 4 °C kaltem Ethanol resuspendiert und anschließend für 72 h bei

4 °C inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wurde die Zellsuspension für 5 min bei

8.000 rpm und Raumtemperatur (RT) zentrifugiert, 30 ml der organischen Phase

ohne Aufnahme von Zellsediment entnommen und diese in einem

28


Rotationsevaporator (Heidolph VV2000) bei RT mit Anlegen eines Vakuums

eingetrocknet. Der Rückstand wurde in 1 - 1,5 ml 10 mM Ammoniumacetat (pH 6,5)

aufgenommen, erneut mit Hilfe des Rotationsevaporators auf ein Endvolumen von

250 µl eingeengt und anschließend bei -20 °C gelagert.

2.7.4 Dünnschichtchromatographische Auftrennung von AHL-Signal-molekülen

Die Dünnschichtchromatographie ist eine chromatographisches Trennmethode, bei

der ein Lösungsmittel oder eine Lösung eines Substanzgemisches (mobile Phase)

über ein Sorptionsmittel (stationäre Phase), meistens Silicagel (Kieselgel), geleitet

wird (LOTTSPEICH und ZORBAS, 1998). Bei dieser Adsorptionschromatographie

befindet sich letzteres als dünne Schicht auf einem Träger. Die in der mobilen Phase

gelösten Substanzen haben unterschiedliche Affinität zur mobilen bzw. stationären

Phase, resultierend in unterschiedlichen Laufstrecken der einzelnen gelösten

Substanzen. Bei der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Umkehrphasen-

Chromatographie (reversed phases chromatography) kommt es durch eine unpolare,

chemisch modifizierte stationäre Phase (Kieselgel lipophilisiert mit unpolaren C18-

Alkylresten) zu einer verbesserten Auftrennung hydrophober Substanzen in einem

stark polaren Laufmittelgemisch (mobile Phase), da unpolare Substanzen stärker

zurückgehalten werden (STADLBAUER, 2006).

Die Auftrennung der N-Acyl-L-Homoserinlacton-Extrakte wurde mit Umkehrphasen-

Dünnschichtchromatographie-Platten (RP-18 W/UV F254s, 20x20 cm, Macherey-

Nagel, Düren, Deutschland) nach Geisenberger (2000) mit geringfügiger Modifikation

durchgeführt. Die Ethylacetat- und Ammoniumacetatlösungen (siehe Kap. 2.7.3.3

und 2.7.3.4) wurden entlang einer Auftragslinie in einem Abstand von 2,0 cm auf die

DC-Platte aufgetragen. Der Abstand vom unteren Rand und von den beiden

Seitenrändern der DC-Platten betrug dabei 2,0 cm. Das Probenvolumen der

Ethylacetat- bzw. Ammoniumacetatlösungen variierte in Abhängigkeit von dem

Testorganismus und dem verwendeten Biosensor zwischen 2,0 µl und 100 µl, wobei

die Proben parallel zur Auftragung mit einem kalten Luftstrom eingetrocknet wurden.

Für die dünnschichtchromatographische Auftrennung der Extrakte wurden 110 ml

Laufmittelmischung aus Methanol und Aqua bidest (60:40 (v/v)) verwendet (ca.

0,7 cm Höhe) und die Seitenwände der DC-Kammer anschließend mit Filterpapier

(Sartorius 3 hw) ausgekleidet. Die DC-Platten wurden bei vollständiger Sättigung der

29


Kammer (24 h) in diese gestellt. Nach ca. vierstündigem Lauf lag die

Lösungsmittelfront ca. 2 cm unterhalb des oberen DC-Plattenrandes, und die DC-

Platten wurden aus der Kammer genommen. Nach Markierung der exakten Höhe der

Lösungsmittelfront erfolgte die Trocknung der DC-Platten mit kalter Luft eines Föns

für 1 h unter dem Abzug. Die DC-Platten konnten, eingewickelt in Frischhaltefolie,

zur Aufbewahrung bei -20 °C gelagert werden.

2.7.5 Visualisierung der DC-Signale

2.7.5.1 Anzucht der Indikatorbakterien und weiterer Referenzstämme Vorkulturen wurden stets mit Bakterienmaterial aus den angelegten Glycerinstocks

angeimpft (siehe Kap. 2.4). Die Voranzucht erfolgte in 50 ml, die Anzucht der

Versuchskulturen in 250 ml Erlenmeyerkolben auf einem Inkubationsschüttler (New

Brunswick Scientific innovaTM 4000 Incubator Shaker).

Eine A. tumefaciens-Vorkultur wurde als Übernachtkultur (ÜK) in 5 ml ABG-Medium

(siehe Kap. 2.2.4) bei 28 °C und 200 rpm angezogen. Als ÜK wurden Kulturen

definiert, welche 16 - 24 h inkubiert wurden. Die Vorkultur wurde anschließend mit

45 ml Kulturmedium versetzt und unter gleichbleibenden Bedingungen bis in die

spät-exponentielle Phase angezogen. Alternativ konnten 50 ml Kulturmedium mit

1 ml Vorkultur inokuliert werden. Die Anzucht erfolgte bei 28 °C und 200 rpm für

24 h. C. violaceum wurde zur Voranzucht als Übernachtkultur (ÜK) bei 30 °C und

120 rpm in 5 ml LB-Medium (siehe Kap. 2.2.2) angezogen. Anschließend wurden

50 ml LB-Medium mit 1 ml Vorkultur angeimpft und bei 30 °C und 120 rpm für 24 h

inkubiert.

Die Vorkulturen der verwendeten bakteriellen Biosensoren wurden unter

Selektionsdruck durch Zugabe verschiedener Antibiotika kultiviert. Hierzu wurde das

LB-Medium mit 50 µg/ml Kanamycin, das ABG-Medium mit 30 µg/ml Gentamycin

und 100 µg/ml Carbenicillin versetzt.

Die Anzucht der weiteren A. tumefaciens-Stämme NTL4 und NT1 (pTIC58∆accR)

erfolgte ebenfalls als ÜK in 5 ml ABG-Medium bei 28 °C und 200 rpm.

30


2.7.5.2 Überschichtung der DC-Platten mit Indikatorbakterien Zur Detektion der AHL-Signalmoleküle auf der DC-Platte wurde diese mit 150 ml

Indikatorbakterienkultur in Weichagar überschichtet. Hierzu wurden die DC-Platten in

einen Kunststoffrahmen, ausgekleidet mit Klarschichtfolie, eingesetzt. 50 ml

Biosensorkultur A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) bzw. C. violaceum CV026 wurden mit

100 ml ABG-Weichagar (siehe Kap. 2.2.4.1) bzw. LB-Weichagar (siehe Kap. 2.2.2.1)

bei einer Temperatur von ca. 42 °C versetzt und ohne Erzeugung von Luftblasen

gemischt. Vor Zugabe der A. tumefaciens-Kultur wurden dem ABG-Weichagar bei

einer Temperatur < 50 °C 90 µg/ml X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-

Galactopyranosid) zugesetzt, resultierend in einer Endkonzentration von 60 µg/ml.

Das X-Gal wurde als Stammlösung in N,N-Dimethylformamid (20 mg/ml) angesetzt

und bei - 20 °C gelagert. Nach Überschichtung der DC-Platten und Verfestigung des

Agars wurden die DC-Platten in einer luftdichten Kammer, ausgekleidet mit feuchtem

Küchenpapier, bei 28 °C (Heraeus Instruments, kelvitron® t) für 48 h inkubiert.

Durch Auftragung der AHL-Extrakte auf überschichtete Festagarplatten ohne den

jeweiligen Biosensor, wie in Kapitel 2.7.7.2 beschrieben, wurden Negativkontrollen

durchgeführt. Eine Extraktion des unbeimpften Kulturmediums (siehe Kap. 2.7.3.3)

und anschließender Auftragung auf A. tumefaciens-Indikatorplatten (siehe

Kap. 2.7.7.2) diente als weitere Negativkontrolle.

2.7.6 Auswertung und Dokumentation der DC-Platten Die Auswertung der überschichteten DC-Platten wurde nach einer Bebrütung bei

28 °C für 48 h durchgeführt. Aufgetrennte AHL-Moleküle konnten je nach

verwendetem Biosensor anhand violetter Spots bei C. violaceum CV026 bzw.

hellblauer Spots durch die β-Galaktosidase-Aktiviät von A. tumefaciens NTL4

(pZLR4) lokalisiert und identifiziert werden. Die Intensität und Größe der DC-Signale

konnte bei längerer Inkubationszeit leicht zunehmen. Durch einen Größenvergleich

der Flecken konnten halbquantitative Aussagen gemacht werden.

Als Referenz wurden synthetische AHL-Moleküle (C4-HSL, C6-HSL und C8-HSL),

gelöst in Ethylacetat (versetzt mit 0,01% (v/v) Essigsäure), auf die DC-Platten

aufgetragen. Die DC-Spots wurden mit den synthetischen Referenzmolekülen

(Standards) verglichen und somit eine Eingrenzung an potentiellen AHLs bzw. eine

Identifizierung von AHLs erreicht. Die Referenzmoleküle dienten des Weiteren dazu,

die Nachweisgrenzen des jeweiligen Sensorsystems einzuschätzen. Die Auftragung

31


der synthetischen AHLs wurde so bemessen, dass in etwa vergleichbare

Signalintensitäten erhalten werden sollten. Die aufgetragenen AHL-Mengen für die

verschiedenen Biosensoren sind in Tabelle 2.15 dargestellt und wurden durch

Agarplattentests (siehe Kap. 2.7.7.3 und 3.4.1) und dünnschichtchromatographische

Voruntersuchungen ermittelt.

Tab. 2.15: Eingesetzte Stoffmengen der synthetischen AHL-Moleküle zum dünnschichtchromato-graphischen Nachweis unter Verwendung der Biosensoren A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) und C. violaceum CV026

AHL-Molekül A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) C. violaceum CV026

eingesetzte Stoffmenge (in mol) eingesetzte Stoffmenge (in mol)C4-HSL 1,5 x 10-9 bis 2 x 10-9 1 x 10-8

C6-HSL 1,5 x 10-9 1 x 10-9

C8-HSL 2,5 x 10-10 3 x 10-9

Aufgrund einer begrenzten Anzahl zur Verfügung stehender Referenzmoleküle

wurden zudem die Rf-Werte (retention factor) der DC-Signale bestimmt. Ein Abgleich

der Rf-Werte der DC-Signale mit Literaturwerten zur Identifizierung der AHL-

Signalmoleküle konnte jedoch nicht durchgeführt werden, da die ermittelten Rf-Werte

der Referenzmoleküle nicht mit den bekannten Rf-Werten (SHAW et al., 1997)

übereinstimmten Der Rf-Wert errechnet sich als Quotient aus Laufstrecke der

Substanz zur Laufstrecke des Laufmittels vom Startpunkt aus (LOTTSPEICH und

ZORBAS, 1998).

Für die Dokumentation erfolgten alle Aufnahmen von DC-Platten in der vorliegenden

Arbeit mittels Digitalkamera.

2.7.7 Agarplattentests mit Sensorbakterien zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien

Zum schnellen Nachweis AHL-produzierender Bakterien wurden verschiedene

Screeningverfahren in einer Voruntersuchung getestet (siehe Kap. 2.7.7.1 und

2.7.7.2), wobei ein Nachweis über die Biosensoren Agrobacterium tumefaciens NTL4

(pZLR4) und Chromobacterium violaceum CV026 (siehe Kap. 2.7.1) erfolgen sollte.

Des Weiteren wurde ein Agarplattentest nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997)

durchgeführt (siehe Kap. 2.7.7.3). Alle Aufnahmen von Agarplatten in der

vorliegenden Arbeit erfolgten mittels Digitalkamera.

32


2.7.7.1 Agarplattentest nach RAVN und Mitarbeitern (2001) Zur Detektion von AHL-produzierenden Bakterien wurde ein Agarplattentest nach

RAVN und Mitarbeitern (2001) durchgeführt. Anstelle von LB-Agarplatten (siehe Kap.

2.2.2) wurden ASNIII/2-Agarplatten (siehe Kap. 2.2.1) verwendet, da die zu testenden

Bakterienstämme aufgrund zu geringer Salinität des LB-Mediums nicht auf diesem

Agarmedium wuchsen. Für einen Nachweis mit dem Indikatorstamm A. tumefaciens

NTL4 (pZLR4) wurde das Festmedium zusätzlich nach dem Autoklavieren bei einer

Temperatur < 50 °C mit 50 µg/ml X-Gal versetzt. 50 µl einer 24 h-Übernachtkultur

des auf AHL zu testenden Bakterienstammes (siehe Kap. 2.5.1) wurden auf einer

Agarplatte mit einer Impföse als Bakterienstreifen ausplattiert. In einem geringen

Abstand zum Testorganismus wurden anschließend parallel 50 µl des jeweiligen

Sensorstammes aus einer ÜK (siehe Kap. 2.7.5.1) auf der Agarplatte ausgestrichen.

Das jeweilige Sensorbakterium wurde als Negativkontrolle eingesetzt, wobei bei

Verwendung des Sensorstammes A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) zudem der

Ti-plasmidlose Stamm A. tumefaciens NTL4 als Negativkontrolle verwendet werden

konnte. Zur Untersuchung einer Temperatur-abhängigen Produktion von AHL-

Signalmolekülen erfolgte die Inkubation bei 21 °C (Brutraum), 28 °C und 37 °C

(Heraeus Instruments, kelvitron® t) für 24 h. Ein AHL-Nachweis wurde durch eine

violette Pigmentierung der Mutante C. violaceum CV026 bzw. einer Blaufärbung des

Indikatorstammes A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) erbracht. Eine Bewertung der AHL-

Produktion wurde über die Intensität der Färbung vorgenommen.

2.7.7.2 Agarplattentest nach FARRAND und Mitarbeitern (2002) Zum weiteren Nachweis AHL-produzierender Bakterien wurde ein Screeningtest

nach FARRAND und Mitarbeitern (2002) durchgeführt. Zur Herstellung der

verwendeten A. tumefaciens-Indikatorplatten wurden ABG-Agarplatten (siehe

Kap. 2.2.4) mit jeweils 4 - 5 ml ABG-Weichagar (siehe Kap. 2.2.4.1) überschichtet,

welcher zuvor mit A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) versetzt worden war. Die Anzucht

des Sensorstammes erfolgte wie in Kapitel 2.7.5.1, das Versetzen der Kultur mit dem

Weichagar wie in Kapitel 2.7.5.2 beschrieben. Die Fest- und Weichagar enthielten

zusätzlich 50 µg/ml X-Gal, welches nach dem Autoklavieren bei einer Temperatur

< 50 °C hinzugesetzt wurde. Nach Verfestigung des Weichagars wurden 30 µl einer

24 h-Übernachtkultur des zu untersuchenden heterotrophen Bakterienstammes

(siehe Kap. 2.5.1) oder 30 µl Kulturüberstand einer ungepufferten 14 Tage bzw.

33


21 Tage alten Geitlerinema Flo 1-Kultur (siehe Kap. 2.7.2.2) auf die A. tumefaciens-

Indikatorplatte aufgetragen. Eine ÜK des AHL-produzierenden Stammes

A. tumefaciens NT1 (pTiC58∆accR) (siehe Kap. 2.7.5.1) wurde mit gleichem

Auftragungsvolumen als Positivkontrolle eingesetzt. Überschichtete Agarplatten ohne

Biosensor, auf denen die Proben aufgetragen wurden, dienten als Negativkontrollen.

Zusätzliche Negativkontrollen mit A. tumefaciens-Indikatorplatten und unbeimpftem

Kulturmedium als Probe sollten eine Aktivierung des AHL-Reporters durch im

Medium enthaltene Komponenten ausschließen. Die Bebrütung der Indikatorplatten

und Negativkontrollen erfolgte bei 28 °C (Heraeus Instruments, kelvitron® t) für 24 h.

Bei der Auswertung der Indikatorplatten wurde eine diffuse blaue Zone im Bereich

der Auftragung als Nachweis einer AHL-Produktion gewertet.

2.7.7.3 Agarplattentest mit Chromobacterium violaceum CV026 zum Nachweis von AHL-Signalmolekülen nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997)

Zum Nachweis von kurzkettigen AHLs mit dem Sensorbakterium C. violaceum

CV026 wurde der Agarplattentest nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997)

durchgeführt. Als Kontrolle wurden synthetische AHL-Moleküle eingesetzt, wobei die

Sensitivitäten (Nachweisgrenzen) sowie Spezifitäten von Stamm C. violaceum

CV026 gegenüber bestimmten AHL-Molekülen untersucht wurden.

Zur Herstellung von C. violaceum-Indikatorplatten wurden LB-Agarplatten (siehe

Kap. 2.2.2) mit jeweils 4 - 5 ml LB-Weichagar (siehe Kap. 2.2.2.1) überschichtet,

versetzt mit C. violaceum CV026. Die Anzucht des Indikatorbakteriums erfolgte wie

in Kapitel 2.7.5.1, das Versetzen der C. violaceum CV026-Kultur mit dem Weichagar

wie in Kapitel 2.7.5.2 beschrieben. Nach Verfestigung des Weichagars wurden in

einem Abstand von ca. 2 cm steril Löcher (Ø 6 mm) in den Agar gestanzt.

In die Löcher wurden 5 x 10-9 mol und 5 x 10-8 mol synthetische AHL-Moleküle

(C4-HSL, C6-HSL und C8-HSL), gelöst in Ethylacetat (versetzt mit 0,01% (v/v)

Essigsäure), bzw. je 10 µl AHL-Extrakt (siehe Kap. 2.7.3.3) pipettiert und mit

LB-Medium (siehe Kap. 2.2.2) auf ein Endvolumen von 50 µl aufgefüllt. Als

Negativkontrolle wurden 10 µl Ethylacetat mit 40 µl LB-Medium versetzt und

eingesetzt. Die Agarplatten wurden 48 h bei 30 °C im Brutschrank (Heraeus

Instruments, kelvitron® t) inkubiert. Eine violette Pigmentierung des bakteriellen

Teppichs um die Auftragungspunkte wurde als ein Nachweis für intakte AHL-

34


Moleküle gewertet, wobei sich die AHL-Konzentration in der Spotgröße

widerspiegelte.

2.8 Molekularbiologische Untersuchungen In der vorliegenden Arbeit wurden des Weiteren die Cyanobakterienstämme Bo 53

und Bo 10 molekularbiologisch untersucht. Bei beiden Mikroorganismen wurden die

16S-rDNA und als weitere Möglichkeit zur Einordnung auf molekularer Ebene das

Gen gyrB mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert. Zudem erfolgte die

Amplifikation der ITS (internal transcribed spacer) von Stamm Bo 10. Diese nicht-

kodierenden intergenischen Regionen sind zwischen den 16S-rRNA-, 23S-rRNA-

und 5S-rRNA-Genen lokalisiert. Die Anzahl und Größe der amplifizierten ITS-

Regionen stellen einen zusätzlichen taxonomischen Marker zur phylogenetischen

Einordnung von Mikroorganismen dar (ITEMAN et al., 2002).

Für die heterotrophen Bakterienstämme Bo 10-09 und Bo 53-33 (HUBE, 2008) sowie

für das Cyanobakterium Stamm Flo 1 (SCHRÜBBERS, 2007) wurden in diesem

Zusammenhang von den genannten Autoren bereits 16S-rDNA-Sequenzierungen mit

anschließender phylogenetischer Einordnung durchgeführt. Ergänzend sollte in der

vorliegenden Arbeit eine Amplifikation der ITS von Stamm Flo 1 sowie eine

Amplifikation und Sequenzierung des gyrB-Gens der Stämme Bo 53-33 und

Bo 10-09 durchgeführt werden.

Auf Basis der erstellten Sequenzen sollten über die Erstellung von phylogenetischen

Stammbäumen Verwandtschaftsbeziehungen aufgezeigt werden. Stamm Bo 53

wurde freundlicherweise von Dr. B. Heyduck-Söller, Stamm Bo 10 von Dipl.-Biologin

A. Hube zur Verfügung gestellt. Chromosomale DNA vom Stamm Flo 1 und vom

Referenzstamm Geitlerinema PCC 7105 wurde von Dipl.-Biologen J. Schrübbers für

die Untersuchungen überlassen.

2.8.1 Extraktion der chromosomalen DNA nach NEILAN (1995) und SCHENK (1996)

Für die DNA-Extraktion nach NEILAN (1995) und SCHENK (1996) (modifiziert nach

HEYDUCK-SÖLLER, 2003) wurden 8 - 10 Tage alte Cyanobakterienkulturen von

Stamm Bo 53 und Stamm Bo 10 verwendet, die bei konstanten 21 °C und einer

konstanten Photonenflussdichte von 1 µE m-2 s-1 PAR gehältert wurden. Die Anzucht

der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 erfolgte als Übernachtkultur bei

35


einer konstanten Temperatur von 21 °C und 120 rpm im Schüttelwasserbad (Julabo

SW 21) (siehe Kap. 2.5.1).

1 ml der jeweiligen Kultur wurde für 5 min bei 8.000 rpm zentrifugiert (Heraeus

Instruments, Biofuge pico). Der Überstand wurde verworfen, die Kultur anschließend

mit 1 ml STE-Puffer (100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM Na2EDTA, pH

8,0) versetzt und wie oben beschrieben erneut zentrifugiert. Nach Dekantierung des

Überstandes wurde erneut 1 ml STE-Puffer auf den Ansatz pipettiert, wobei

cyanobakterielle Proben zum Ablösen der heterotrophen Begleitflora in einem

Ultraschallbad (Elma™, Transsonic Digital) bei 20 °C für 10 min bei maximaler

Stärke beschallt wurden. Die Ultraschallbad-Behandlung wurde bei nicht der DNA-

Extraktion aus den heterotrophen Bakterien durchgeführt. Nach Zentrifugation (5 min

und 8.000 rpm) und Dekantierung des Überstandes wurde nochmals 1 ml STE-Puffer

hinzugesetzt, anschließend zentrifugiert (siehe oben) und der Überstand vollständig

entfernt. Nachfolgend wurde der Ansatz mit 400 µl STE-Puffer überschichtet sowie

mit autoklavierten Glasperlen (Ø 0,1 - 0,2 µm; Fa. BIOmatik GmbH) im gleichen

Volumenanteil (des jeweiligen Pellets) und mit 1 ml 75 °C heißem Phenol versetzt.

Nach Vortexen auf einem Whirl-Mixer für 40 - 60 sec und anschließender Kühlung

auf Eis erfolgte zur Trennung von Phenol- und wässriger Phase eine Zentrifugation

(Beckman GS-15R) für 20 min bei 4 °C und 12.000 rpm. Die DNA-enthaltende obere

wässrige Phase wurde in ein steriles ERG überführt und das Volumen bestimmt.

Anschließend wurden 2 µl Poly A RNA (10 mg/ml) zugegeben. Zur Entfernung von

eventuell noch vorhandenen Proteinen wurde 1 Volumenanteil

Chloroform/Isoamylalkohol (24:1 (v/v)) hinzugesetzt, anschließend gevortext und für

5 min bei 12.000 rpm zentrifugiert. Ein Großteil der oberen wässrigen Phase (350 µl)

wurde in ein steriles ERG überführt und mit 0,1 Volumenanteil 3 M Natriumacetat

(pH 5,2) versetzt. Zur Fällung der DNA erfolgte die Überschichtung mit

0,8 Volumenanteilen eisgekühltem Isopropanol, anschließender Lagerung bei -80 °C

für 20 min und Zentrifugation bei 12.000 rpm für 30 min. Nach Dekantierung des

Überstandes wurde das Pellet zur vollständigen Entfernung von eventuell

vorhandenen Salzen mit 1 ml frisch angesetztem 70%igem Ethanol versetzt und

nach Durchmischung für 10 min bei 12.000 rpm zentrifugiert. Nach Entfernung des

Überstandes erfolgte die Zugabe von 1 ml Ethanol abs. und eine erneute

Zentrifugation (s.o.). Das vom Überstand befreite DNA-Pellet wurde bei

Raumtemperatur (RT) zum Trocknen für 1 h stehengelassen. Abhängig von der

36


DNA-Menge wurde das Pellet in 20 - 40 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM

Na2EDTA, pH 8,0) über Nacht bei RT resuspendiert. Die DNA wurde im Dunkeln bei

4 °C gelagert.

2.8.2 Bestimmung der DNA-Konzentration Die Konzentration und die Reinheit der extrahierten DNA wurden mit Hilfe eines

Spektralphotometers (Peqlab Biotechnologie, NanoDrop ND-1000) photometrisch bei

Wellenlängen von 260 und 280 nm ermittelt. Zur Quantifizierung der DNA wurde die

Absorption der eingesetzten DNA-Lösung bei einer Wellenlänge von 260 nm

gemessen. Die Reinheitsbestimmung der DNA erfolgte über das Verhältnis der

Absorptionen bei 260 und 280 nm (A260nm/A280nm).

2.8.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Zur Amplifikation der 16S-rDNA, des gyrB-Gens und der ITS (siehe Kap. 2.8) wurde

eine Standard-PCR durchgeführt. Hierzu wurde standardmäßig jeweils ein PCR-

Ansatz mit 50 µl Endvolumen pipettiert, dessen Zusammensetzung in Tabelle 2.16

dargestellt ist. Für die PCR wurde ein Vielfaches der angegebenen Mengen in Form

eines Mastermix (ohne DNA-Template) angesetzt und auf die PCR-Reaktionsgefäße

verteilt. Die Sequenzen der verwendeten Primer zur Amplifikation und

Sequenzierung der 16S-rDNA, des gyrB-Gens und der ITS sind in Tabelle 2.17

zusammengefasst.

37


Tab. 2.16: PCR-Ansatz zur Amplifikation der 16S-rDNA, des gyrB-Gens und der ITS

Reagenz Endkonzentration Menge/Ansatz (µl)

Nukleasefreies Wassera) 28,110 x PCR-Puffer 1x 5,0MgCl2 (25 mM) 2 mM 4,0dNTPs (10 mM) 200 µM 1,0Forward-Primer (10 µM) 0,8 µM 4,0Reverse-Primer (10 µM) 0,8 µM 4,0BSA (20 mg/ml) 1 mg/ml 2,5

DNA-Polymerase (5 U/µl)a) 2 U 0,4

DNA-Templateb) 1,0Summe ∑ 50,0

a) Platinum-Taq-Gold, Invitrogen b) Zur Amplifikation der ITS wurden 2 µl DNA-Template und dementsprechend 27,1 µl Nukleasefreies

Wasser pro PCR-Ansatz eingesetzt.

Tab. 2.17: Zusammenstellung der verwendeten Primer mit den jeweiligen Sequenzen

Primerbezeichnung 5`→ 3`-Sequenz Verwendung Referenz

8F (GM3F) (Forward-Primer) AGA GTT TGA TCC TGG C 16S-rDNA LANE (1991)

1494R (Reverse-Primer) GTA CGG CTA CCT TGT TAC GAC 16S-rDNA TATON et al. (2003)

380Fa) (Forward-Primer) TTT TCC GCA ATG GGC G 16S-rDNA YAN (2005)

GM4F (1507F) (Forward-Primer) GAA GTC GTA ACA AGG TA ITS LANE (1991)

23R23S (Reverse-Primer) GTG CCT AGG TAT CCA CC ITS YAN (2005)

GB/3MF (Forward-Primer) AAG CGH CCN GSN ATG TAY ATH GG gyrB SEO und YOKOTA(2003)

GB/CR-2 (Reverse-Primer) CCN GCN GAR TCN CCY TCN AC gyrB SEO und YOKOTA(2003)

a) Primer 380F wurde als interner Primer zur Sequenzierung der cyanobakteriellen 16S-rDNA eingesetzt

Die Ansätze wurden nach Zugabe des jeweiligen DNA-Templates mit 30 µl

sterilfiltriertem Paraffinöl als Verdunstungsschutz überschichtet. Die PCR-Reaktionen

wurden in einem Biometra Personal CyclerTM durchgeführt, wobei zur Amplifikation

der 16S-rDNA, des gyrB-Gens und der ITS unterschiedliche Cycler-Programme

verwendet wurden, dargestellt in den Tabellen 2.18 bis 2.20. Eine Negativkontrolle

mit nukleasefreiem Wasser anstelle des jeweiligen DNA-Templates wurde als

Blindprobe mitgeführt.

38


Tab. 2.18: PCR-Programm zur Amplifikation der 16S-rDNA aus den Cyanobakterienstämmen Bo 10 und Bo 53

Temperatur (°C) Dauer (sec)

1x Startdenaturierung 93,0 120Denaturierung 93,0 30

35x Annealing 45,0 35Elongation 72,0 120

1x Finale Elongation 72,0 3001x Kühlung 20,0 1

Programmschritte undAnzahl der Zyklen

Tab. 2.19: PCR-Programm zur Amplifikation der ITS aus den Cyanobakterienstämmen Bo 10, Flo 1 und PCC 7105






Tab. 2.20: PCR-Programm zur Amplifikation des gyrB-Gens aus den Cyanobakterienstämmen Bo 10 und Bo 53






2.8.4 Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte Zur Kontrolle der Standard-PCR wurden die 16S-rDNA- und gyrB-Amplifikate auf ein

1%iges, die ITS-Amplifikate auf ein 2%iges Agarosegel aufgetragen und

Gelelektrophoresen (peqlab-Elektrophoresekammer) durchgeführt. Dazu wurden 5 µl

16S-rDNA- bzw. gyrB-PCR-Produkt mit 1 µl 6x Loading Dye versetzt und in eine

Geltasche pipettiert. Für die Auftrennung der ITS-Amplifikate wurden je 20 µl PCR-

Produkt eingesetzt, versetzt mit 1/5 Volumenanteil 6x Loading-Dye. Als Referenz

wurde ein Molekulargewichtsmarker (Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder Plus, MBI

Fermentas) mitgeführt, wobei das eingesetzte Volumen dem des jeweiligen PCR-

39


Produktes entsprach. Bei einer angelegten Spannung von 70 V (Power Pac 300,

Biorad) betrug die Laufzeit der 16S-rDNA-Produkte und der gyrB-Amplifikate ca. 1 h,

die der ITS-Produkte ca. 3 h bei 50 V Spannung. Nach anschließender Gelfärbung

für 15 min in 0,1%iger Ethidiumbromid-Lösung erfolgte die Auswertung am

Transilluminator (Fluco-Link, Biometra) unter UV-Licht bei 254 nm. Die 16S-rDNA-

PCR-Produkte bzw. gyrB-PCR-Produkte sollten bei 1500 bp bzw. 1200 bp eine

deutliche Bande aufweisen, während die Bandenanzahl und die Fragmentgröße der

ITS-Amplifikate variieren konnten.

Die Amplifikate der 16S-rDNA von Stamm Bo 10 wurden durch Extraktion (siehe

Kap. 2.8.5) der 1500 bp-Bande aus dem Gel erhalten, da das PCR-Produkt mehrere

Banden im Gel aufwies. Hierzu erfolgte eine Auftrennung des gesamten PCR-

Produkts in einem 2%igen Agarosegel in mehreren Gelläufen. Die Laufzeit betrug

10 h bei einer angelegten Spannung von 50 V.

2.8.5 Elution und Aufreinigung von PCR-Produkten Die Aufreinigung von PCR-Produkten wurde mittels des „Qiagen QIAquick PCR

Purification“-Kits (Qiagen) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die DNA-Eluierung

erfolgte in 40 µl EB-Puffer.

Die Elution und Aufreinigung von PCR-Produkten aus Agarosegelen erfolgte unter

Verwendung des „QIAquick Gel Extraktion“-Kits (Qiagen) nach Angaben des

Herstellers. Die DNA wurde in 40 µl EB-Puffer eluiert.

Die Konzentration an PCR-Produkt wurde mit Hilfe eines Spektralphotometers

(Peqlab Biotechnologie, NanoDrop ND-1000) bestimmt (siehe Kap. 2.8.2).

2.8.6 Sequenzierung der 16S-rDNA und des gyrB-Gens Die Sequenzierung der 16S-rDNA und des gyrB-Gens mittels aufgereinigter PCR-

Produkte wurde von der Firma GATC Biotech AG (Konstanz) unter Verwendung der

in Kapitel 2.8.3, Tabelle 2.17 aufgeführten Primer durchgeführt.

2.8.7 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen Das Alignment der Teilsequenzen wurde mit dem Programm ChromasPro

durchgeführt. Die generierten Sequenzen der Cyanobakterienstämme Bo 53 und

Bo 10 wurden unter Anwendung von „nucleotide BLAST” mit den gegenwärtig

hinterlegten Sequenzen der öffentlichen NCBI-Datenbank

40


(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi; Stand: März 2008) verglichen. Basierend auf

den erzielten Ergebnissen erfolgte unter Abgleichung mit Sequenzen von

Referenzstämmen mit den größten Homologien aus der NCBI-Datenbank die

Erstellung eines phylogenetischen Stammbaumes. Das Alignment der ausgewählten

Sequenzen sowie das Zuschneiden der Alignmentsequenzen wurden mit den

Programmen Bioedit und GeneDoc durchgeführt. Die phylogenetischen

Stammbäume wurden mit der “Neighbor-Joining”-Methode (NJ) mit dem Programm

MEGA (Version 4.0) konstruiert. Die Berechnung der evolutionären Distanzen

zwischen den Sequenzen erfolgte nach der Methode von JUKES und CANTOR

(1969). Die evolutionäre Distanz ergbt sich aus dem Verhältnis zwischen

verschiedenen Basen zweier gleichlanger Sequenzen zu allen Basen der Sequenz.

Eine statistische Absicherung der Topologie der phylogenetischen Stammbäume

erfolgte durch 1000 Wiederholungen der Bootstrap-Analysen.

2.9 Herkunft der verwendeten Chemikalien Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Chemikalien wiesen p.A.-Qualität oder

HPLC-Grade auf und wurden von den folgenden Firmen bezogen: Acros Organics

(Geel, Belgien), AppliChem (Darmstadt, Deutschland), Fluka (Buchs, Schweiz),

Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland), Jannsen Chimica (Geel, Belgien), MBI

Fermentas (St. Leon-Rot, Deutschland), Merck (Darmstadt, Deutschland), Qiagen

(Hilden, Deutschland), Riedel de Haën (Seelze, Deutschland), Roche (Mannheim,

Deutschland), Roth (Karlsruhe, Deutschland), Serva (Heidelberg, Deutschland),

Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland) und VWR international (Leuven, Belgien).

41

3. Ergebnisse

3. Ergebnisse

3.1 Verwendete Puffersysteme Für die pH-Untersuchungen der Bakterienstämme Bo 53-33, Bo 10-09 und Flo 1

wurde eine große Bandbreite an Puffersystemen getestet (siehe Kap. 2.3), bevor die

in den generierten Wachstumskurven (siehe Kap. 3.2) und zur AHL-Untersuchung

(siehe Kap. 3.5.1) eingesetzten Puffer zum Einsatz kamen.

Erhebliche Schwierigkeiten traten vor allem durch den Ausfall von Salzen (z.B. Mg2+-

und Ca2+-Ionen) in pH-gepufferten ASNIII/2-Medien und durch starke pH-Wert-

Verschiebungen dieser (von dem jeweiligen eingestellten pH-Wert) nach

Autoklavieren auf, die ein Ansetzen von gepufferten Kulturmedien mit höheren pH-

Werten stark erschwerten (pH 8,5 - 10,0) bzw. unmöglich machten (pH 11,0). Die

Trübung des Nährmediums und die pH-Abweichungen nahmen dabei sukzessive mit

steigendem pH-Wert zu, wobei vor allem die mit Fleischextrakt versetzten

Kulturmedien zu Ausfällungen neigten. In diesem Zusammenhang waren

insbesondere die Clark & Lubs-Pufferlösungen im Bereich von pH 8,0 - 10,0

aufgrund oben genannter Probleme zur Kultivierung der heterotrophen

Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 lediglich bedingt verwendbar (pH 8,0 und

8,5) bzw. völlig ungeeignet gewesen (pH 9,0 und 10,0). Untersuchungen zum

Wachstumsverhalten mit Clark & Lubs-gepufferten Medien (pH 8,0 und 8,5) zeigten

bei Stamm Bo 53-33 kein und bei Stamm Bo 10-09 ein nur schwaches Wachstum

(Daten nicht gezeigt). Neben einem durch Mineralsalz-Ausfällungen bedingten

Nährstoffentzug könnte ebenfalls ein hemmender Einfluss des Puffers ein Grund für

ein nur schwaches Wachstum der heterotrophen Bakterien sein. Die letztlich

verwendeten Tris-HCl- und Glycin-Puffer in diesem pH-Bereich bedingten im

Kulturmedium ebenfalls leichte bis mittlere Ausfällungen und pH-Verschiebungen

nach dem Autoklavieren, welche aber tolerierbar waren. Der geforderte pH-Wert

wurde gegebenenfalls nachträglich durch Zugabe von 1 M HCl bzw. 1 M NaOH

eingestellt. Starke Ausfällungen in den Kulturmedien wurden zudem bei Verwendung

des Tris-HCl-Puffers pH 8,9 und des Clark & Lubs-Puffers pH 7,0 (Phosphat-Puffer)

beobachtet und erwiesen sich somit neben dem Tris-Maleat-Puffer pH 6,0 als

ungeeignet, bei dessen Anwesenheit kein Wachstum der heterotrophen Bakterien

erfolgte.

42

3. Ergebnisse

Weitere Probleme traten mit pH-Wert-Verschiebungen während des Wachstums auf,

die anhand der pH-Endwerte der Versuchskulturen deutlich werden (siehe Kap. 3.2.1

und 3.3.1). Durch die Erhöhung der Molarität und somit der Pufferkapazität (150 mM)

wurde versucht, diesem entgegenzuwirken, welches sich jedoch überwiegend

negativ auf ein Wachstum der Bakterien auswirkte (Daten nicht gezeigt) und zudem

mit stärkeren Ausfällungen im Nährmedium ab pH 8,5 einherging.

Das Ansetzen von getrennt autoklavierten Stammlösungen bestimmter ASNIII/2-

Komponenten (CaCl2 x 2 H2O, MgCl2 x 6 H2O und MgSO4 x 7 H2O), welche nach

Autoklavieren des restlichen gepufferten Grundmediums diesem bei RT hinzugesetzt

wurden, bewirkte sowohl bei schwächer als auch stärker gepufferten Kulturmedien

oberhalb von pH 8,0 hinsichtlich einer Minimierung der Ausfällungen keine Abhilfe.

3.2 Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 bei unterschiedlichen pH-Werten

Zur Ermittlung des pH-Toleranzbereiches (pH-Minimum und pH-Maximum) und pH-

Optimums für die heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wurde das

Wachstum im pH-Bereich von 2,0 - 10,0 untersucht (siehe Kap. 2.6.2). Als Referenz

wurden ungepufferte Versuchsansätze inkubiert (siehe Kap. 2.6.1). Wachstum wurde

definiert als Zunahme in der O.D.600nm von mindestens 0,1 nach 24 h Inkubation.

Gemäß dieser Definition konnte im Bereich von pH 2,0 - 5,0 sowie bei pH 10,0 kein

Wachstum der Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 beobachtet werden (Daten nicht

gezeigt). Die Ergebnisse zum Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme

Bo 53-33 und Bo 10-09 im Bereich von pH 6,0 - 9,0 sowie in ungepuffertem ASNIII/2-

Medium sind in den Abbildungen 3.1 und 3.3 dargestellt, wobei die Ergebnisse durch

Versuchswiederholungen abgesichert wurden (Daten nicht gezeigt).

43

3. Ergebnisse

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,05,56,0

0 24 48 72 96 120 144 168Zeit (h)

OD

(600

nm

)

pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0 pH 8,5 pH 9,0 ungepuffert

Abb. 3.1: Wachstumsverhalten des heterotrophen Bakterienstammes Bo 53-33 bei unterschiedlichen pH-Werten in gepufferten ASNIII/2-Medien und in ungepuffertem ASNIII/2-Medium, determiniert über Messungen der O.D.600nm. Die Anzucht erfolgte bei 21 °C und 120 rpm im Dunkeln bis in die stationäre Wachstumsphase. Es wurden Parallelansätze mit einer Start-O.D. von 0,1 inkubiert.

Abbildung 3.1 ist zu entnehmen, dass ein Wachstum von Stamm Bo 53-33 im

Bereich von pH 6,0 - 9,0 vorliegt. Dabei fiel das Zellwachstum beim pH-Minimum

(pH 6,0) mit einer O.D.600nm von 0,65 (nach 120 h) leicht stärker aus als das beim pH-

Maximum (pH 9,0) mit einer O.D.600nm von 0,50 (nach 80 h). Bei pH 6,0 bzw. pH 9,0

lag das Wachstum dabei auf einem nahezu konstant niedrigen Niveau und gelangte

nach 72 h bzw. 48 h in die stationäre Wachstumsphase, wobei über den gesamten

weiteren Messzeitraum eine leichte Zunahme in der Zelldichte zu verzeichnen war.

Morphologisch unterschieden sich die pH 6- und pH 9-gepufferten Kulturen von den

sonstigen Versuchskulturen durch Ausbildung von Zellagglomeraten, während das

Kulturmedium verhältnismäßig ungetrübt blieb (siehe Abb. 3.2 a - b).

Abb. 3.2 a - b: Wachstum der Kulturen von Stamm Bo 53-33 in ASNIII/2-Medium bei pH 6 (a) und in ungepuffertem ASNIII/2-Medium (b) bei 21 °C und 120 rpm nach 72 h Inkubation. Die Aufnahmen erfolgten mittels Digitalkamera.

44

3. Ergebnisse

Maximales Wachstum für Stamm Bo 53-33 wurde in gepufferten Versuchsansätzen

bei einem pH von 7,0 (maximale O.D.600nm: 4,24) detektiert, das damit deutlich über

dem der pH 8,0-gepufferten bzw. pH 8,5-gepufferten Versuchskulturen mit

maximalen O.D.600nm-Werten von 2,88 bzw. 2,23 lag. Das pH-Optimum des

Bakterienstammes liegt damit bei pH 7,0. Die gepufferten Versuchsansätze (pH 7,0,

8,0 und 8,5) traten nach 84 - 96 h in die stationäre Wachstumsphase ein, wobei die

O.D.600nm-Werte im weiteren Verlauf noch leicht zunahmen. Die ungepufferten

Referenzansätze wiesen mit einer maximalen O.D.600nm von 5,34 das deutlich

stärkste Zellwachstum auf.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0 24 48 72 96 120 144Zeit (h)

OD

(600

nm

)

pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0 pH 8,5 pH 9,0 ungepuffert

Abb. 3.3: Wachstumsverhalten des heterotrophen Bakterienstammes Bo 10-09 bei unterschiedlichen pH-Werten in gepufferten ASNIII/2-Medien und in ungepuffertem ASNIII/2-Medium, determiniert über Messungen der O.D.600nm. Die Anzucht erfolgte bei 21 °C und 120 rpm im Dunkeln bis in die stationäre Wachstumsphase. Es wurden Parallelansätze mit einer Start-O.D. von 0,1 inkubiert.

Aus Abbildung 3.3 geht hervor, dass der Bakterienstamm Bo 10-09 im pH-Bereich

von 6,0 - 9,0 wächst. Beim pH-Minimum des Toleranzbereiches wies Stamm

Bo 10-09 ein wesentlich stärkeres Wachstum auf (maximale O.D.600nm: 0,89) als bei

seinem pH-Maximum (maximale O.D.600nm: 0,37). Bei letzterem gingen die Kulturen

nach Erreichen der stationären Wachstumsphase umgehend in die Absterbephase

über. Maximales Wachstum für Stamm Bo 10-09 wurde in gepufferten

Versuchsansätzen bei pH 8,0 ermittelt (maximale O.D.600nm: 3,08) und ist damit

geringfügig höher als bei pH 7,0 (maximale O.D.600nm: 2,86) und pH 8,5 (maximale

45

3. Ergebnisse

O.D.600nm: 2,75). Die gepufferten Kulturen (pH 7,0, 8,0 und 8,5) erreichten nach etwa

64 h die stationäre Wachstumsphase, gefolgt von einer weiteren leichten Zunahme

der Zelldichten. Die ungepufferten Referenzkulturen wiesen mit einer maximalen

O.D.600nm von 3,39 ein leicht stärkeres Wachstum als die gepufferten Kulturen auf.

Die Referenzansätze traten nach etwa 48 h in die stationäre Wachstumsphase ein.

3.2.1 pH-Werte der Zellkulturüberstände Zu den photometrischen Messungen zum Wachstumsverhalten erfolgte parallel eine

pH-Messung der Kulturüberstände mittels pH-Indikatorpapier (Macherey-Nagel;

pH 6,0 - 10,0) (siehe Kap. 2.6.4) (Daten nicht gezeigt).

Nach Abschluss der Untersuchung zum Wachstumsverhalten der heterotrophen

Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wurden die pH-Endwerte der

Kulturüberstände mittels einer pH-Elektrode, gekoppelt an einem pH-Meter,

bestimmt. Die ermittelten pH-Endwerte sind in Tabelle 3.1 zusammengefasst.

Tab. 3.1: pH-Werte von unbeimpften Kulturmedien und Kulturüberständen der Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 nach Inkubation. Ungepuffertes ASNIII/2-Medium und gepuffertes ASNIII/2-Medium mit unterschiedlichen pH-Werten diente als Kulturmedium. Die Inkubation erfolgte bis in die stationäre Wachstumsphase (siehe Kap. 3.2) in einem Schüttelwasserbad (120 rpm) bei 21 °C im Dunkeln. n = 2

pH-Wert des Kulturmediums vor Inkubation

pH-Wert des Kulturüberstandesvon Bo 53-33 nach Inkubation


pH 7,1 (ungepuffert) pH 8,36 pH 8,37pH 6,0 pH 6,32 pH 6,27pH 7,0 pH 8,18 pH 8,31pH 8,0 pH 8,25 pH 8,40pH 8,5 pH 8,50 pH 8,55pH 9,0 pH 8,65 pH 8,80

In Tabelle 3.1 sind die pH-Werte vor und nach Inkubation der Versuchsansätze der

Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 dargestellt.

Bei beiden Bakterienstämmen ist, abgesehen von pH 8,5 und 9,0, ein Anstieg des

pH-Wertes sowohl in den ungepufferten als auch in den gepufferten

Versuchskulturen zu verzeichnen. Eine kontinuierliche Alkalisierung der Überstande

konnte dabei für die ungepufferten Versuchsansätze bereits nach 8 h Inkubation, für

die gepufferten Versuchsansätze hingegen erst nach 40 - 48 h Inkubation festgestellt

werden (Daten nicht gezeigt).

46

3. Ergebnisse

Der pH-Wert der pH 6-gepufferten Dunkelansätze verschob sich lediglich geringfügig

auf Werte von 6,35 (Stamm Bo 53-33) und 6,25 (Stamm Bo 10-09), während die

ungepufferten sowie die pH 7- und pH 8-gepufferten Dunkelansätze nach Inkubation

pH-Endwerte zwischen 8,05 und 8,36 (Stamm Bo 53-33) sowie zwischen 8,37 und

8,50 (Stamm Bo 10-09) aufwiesen. Eine Ausnahme bei beiden heterotrophen

Stämmen bildeten die pH 8,5-gepufferten Dunkelansätze mit gleich bleibenden und

die pH 9,0-gepufferten Dunkelansätze mit leicht abnehmenden pH-Endwerten in den

Kulturüberständen.

3.3 Wachstumsverhalten der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 bei einem Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR

Zur Untersuchung des Lichteinflusses auf das Wachstumsverhalten der

heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 erfolgte eine Inkubation bei einem

Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR (siehe Kap. 2.6.3). Hierzu wurden die

heterotrophen Bakterien bei ihrem ermittelten pH-Optimum und in ungepuffertem

Kulturmedium inkubiert. Als Kontrolle wurden ungepufferte Dunkelansätze

angezogen (siehe Kap. 2.6.1). Die Ergebnisse der Wachstumsmessungen sind in

den Abbildungen 3.4 und 3.5 dargestellt.

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,05,5

0 24 48 72 96 1

Zeit (h)

OD

(600

nm

)

20

pH 7,0; 5 µE PAR ungepuffert; 5 µE PAR ungepuffert; Dunkel

Abb. 3.4: Wachstumsverhalten des heterotrophen Bakterienstammes Bo 53-33 in gepuffertem (pH-Optimum) und ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei einem Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR, determiniert über Messungen der O.D.600nm. Ungepufferte Dunkelansätze wurden als Kontrolle mitgeführt. Die Anzucht erfolgte bei 21 °C und 120 rpm bis in die stationäre Wachstumsphase. Es wurden Parallelansätze mit einer Start-O.D. von 0,1 inkubiert.

47

3. Ergebnisse

Aus Abbildung 3.4 geht hervor, dass eine Photonenflussdichte von 5 µE m-2 s-1 PAR

keinen ersichtlichen Einfluss auf das Wachstumsverhalten von Stamm Bo 53-33

hatte. Das Wachstum ungepufferter Licht- und dunkel-inkubierter Kulturen wies einen

ähnlichen Verlauf auf, wobei die Kulturen der Dunkelansätze (maximale O.D.600nm:

5,04) ein leicht besseres Wachstum aufwiesen als die Licht-inkubierten Ansätze

(maximale O.D.600nm: 4,46). Nach einem zunächst logarithmischen Wachstumsverlauf

gingen die Kulturen nach etwa 48 h in die stationäre Wachstumsphase über. Der

Eintritt in die Absterbephase erfolgte nach 96 - 112 h. Bei ihrem ermittelten pH-

Optimum wiesen die Licht-inkubierten Kulturen ebenfalls ein ähnliches

Wachstumsverhalten auf, jedoch auf einem niedrigeren Wachstumsniveau

(maximale O.D.600nm: 3,57).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0 24 48 72 96 1

Zeit (h)

OD

(600

nm

)

20

pH 8,0; 5 µE PAR ungepuffert; 5 µE PAR ungepuffert; Dunkel

Abb. 3.5: Wachstumsverhalten des heterotrophen Bakterienstammes Bo 10-09 in gepuffertem (pH-Optimum) und ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei einem Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR, determiniert über Messungen der O.D.600nm. Ungepufferte Dunkelansätze wurden als Kontrolle mitgeführt. Die Anzucht erfolgte bei 21 °C und 120 rpm bis in die stationäre Wachstumsphase. Es wurden Parallelansätze mit einer Start-O.D. von 0,1 inkubiert.

Abbildung 3.5 ist zu entnehmen, dass das Wachstum von Stamm Bo 10-09 nicht

erkennbar durch eine Photonenflussdichte von 5 µE m-2 s-1 PAR beeinflusst wurde.

Das Wachstumsverhalten der ungepufferten, belichteten Versuchsansätze entsprach

in etwa dem der ungepufferten, dunkel-inkubierten Kulturen, wobei der

Wachstumsverlauf (maximale O.D.600nm: 3,44) leicht unter dem der Dunkelansätze

48

3. Ergebnisse

(maximale O.D.600nm: 3,63) lag. Die bei einem Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR

und pH-Optimum inkubierten Kulturen wiesen den gleichen Wachstumsverlauf auf

wie die ungepufferten Versuchsansätze, lediglich auf leicht geringerem

Wachstumsniveau (maximale O.D.600nm: 3,40).

3.3.1 pH-Werte der Zellkulturüberstände Zu den photometrischen Messungen zum Wachstumsverhalten wurden parallel die

pH-Werte der Kulturüberstände mittels pH-Indikatorpapier (Macherey-Nagel; pH 6,0 -

10,0) bestimmt (siehe Kap. 2.6.4) (Daten nicht gezeigt).

Nach Abschluss der Wachstumsversuche erfolgte eine Bestimmung der pH-

Endwerte der Kulturüberstände mittels einer pH-Elektrode, gekoppelt an einem pH-

Meter. Die ermittelten pH-Endwerte sind in Tabelle 3.2 zusammengefasst.

Tab. 3.2: pH-Werte von unbeimpften Kulturmedien und Kulturüberständen der Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 nach Inkubation. Ungepuffertes ASNIII/2-Medium und gepuffertes ASNIII/2-Medium mit optimalem pH-Wert für den jeweiligen Stamm diente als Kulturmedium. Die Inkubation erfolgte bis in die stationäre Wachstumsphase (siehe Kap. 3.3) auf einem Rotationsschüttler (120 rpm) bei 21 °C und einem Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR oder im Dunkeln. n = 2

pH-Wert des Kulturmediumsvor Inkubation


pH-Wert des Kulturüberstandes von Bo 10-09 nach Inkubation

pH 7,1 (ungepuffert) pH 8,78 pH 8,78 pH 7,0 (gepuffert) pH 8,50 -- pH 8,0 (gepuffert) -- pH 8,78 pH 7,1 (ungepuffert) pH 8,80a) pH 8,70a)

a) nach Inkubation im Dunkeln

In Tabelle 3.2 sind die pH-Werte von Kulturmedien vor und nach Inkubation der

Versuchsansätze der Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 dargestellt.

Bei beiden Bakterienstämmen konnte eine deutliche Alkalisierung der ungepufferten

sowie gepufferten Versuchsansätze nach der Inkubation festgestellt werden. Hierbei

wiesen die ungepufferten Kulturüberstände beider Stämme, unabhängig von einer

Licht- oder Dunkelinkubation, pH-Endwerte zwischen 8,7 - 8,8 auf. Bei ungepufferten

Kulturen konnte bereits nach 8 h, bei gepufferten Kulturen hingegen erst nach

32 - 40 h Inkubation eine pH-Verschiebung von dem Ausgangswert beobachtet

werden (Daten nicht gezeigt).

49

3. Ergebnisse

3.4 Screeningtests zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien

3.4.1 Nachweis von AHL-Molekülen mit Chromobacterium violaceum CV026 nach MCCLEAN und Mitarbeitern (1997)

Für einen AHL-Nachweis kurzkettiger AHL-Moleküle wurde der Agarplattentest nach

MCCLEAN und Mitarbeitern (1997) durchgeführt (siehe Kap. 2.7.7.3). Es wurden

synthetische AHL-Moleküle und AHL-Extrakte getestet. Letztere wurden aus

Versuchskulturen der Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 unter verschiedenen

Kultivierungsbedingungen gewonnen (siehe Kap. 2.7.2.1). Nach entsprechender

Inkubation konnten mit dem Biosensor C. violaceum CV026 für beide Stämme keine

AHL-Signalmoleküle über eine violette Pigmentierung der Indikatorplatten um die

jeweiligen Auftragungspunkte nachgewiesen werden (Ergebnisse nicht dargestellt).

In Abbildung 3.6 a - b ist exemplarisch eine C. violaceum-Indikatorplatte mit

synthetischen AHL-Molekülen in Abhängigkeit verschiedener Konzentrationen und

der Inkubationszeit dargestellt.

Abb. 3.6 a - b: Nachweis von synthetischen AHL-Molekülen mittels C. violaceum-Indikatorplatte nach 24 h (a) und 48 h (b) Inkubation bei 30 °C über eine violette Pigmentierung des Biosensors um die Auftragungspunkte. Auftragungsschema: 1: NK (10 µl Ethylacetat, verdünnt auf 50 µl mit LB-Medium); 2 - 3: C4-HSL; 4 - 5: C6-HSL; 6 - 7: C8-HSL. Die Auftragung der jeweiligen AHL-Moleküle und deren Konzentrationen (5 x 10-9 mol und 5 x 10-8 mol) erfolgte im Uhrzeigersinn.

Aus Abbildung 3.6 a - b wird ersichtlich, dass C. violaceum CV026 eine hohe

Sensitivität gegenüber C6-HSL aufweist, wobei 5 x 10-9 mol (Abb. 3.6 a, Nr. 4) noch

deutlich durch eine Violacein-Produktion nachgewiesen wurde. Für C4-HSL und

C8-HSL liegen die Nachweisgrenzen hingegen wesentlich höher. C8-HSL wurde von

C. violaceum CV026 nach längerer Inkubation (48 h) lediglich schwach

nachgewiesen (Abb. 3.6 b, Nr. 6 und 7), 5 x 10-9 mol C4-HSL gar nicht (Abb. 3.6 b,

Nr. 2).

50

3. Ergebnisse

3.4.2 Nachweis AHL-produzierender Bakterien nach RAVN und Mitarbeitern (2001)

Die „Screening“-Methode nach RAVN und Mitarbeitern (2001) zur Detektion von

AHL-Produzenten (siehe Kap. 2.7.7.1) wurde mit ASNIII/2-Agarplatten durchgeführt,

da die zu untersuchenden heterotrophen Bakterienstämme Bo 10-09 und Bo 53-33

auf den verwendeten LB-Agarplatten nicht wuchsen. Der Reporterstamm

C. violaceum CV026 wuchs nur unzureichend auf dem ASNIII/2-Agar, wodurch

Aussagen zu einer AHL-Produktion mit Hilfe dieses Biosensors nicht möglich waren

(Ergebnisse nicht dargestellt). In Abbildung 3.7 a - g sind exemplarisch die

Ergebnisse des Screeningtests mit dem Biosensor Agrobacterium tumefaciens NTL4

(pZLR4) dargestellt. Die Inkubation der Agarplatten erfolgte bei 21 °C, 28 °C und

37 °C für 24 h mit anschließender Auswertung der Agarplatten, wobei ein

Blauumschlag des Sensorbakteriums als AHL-Nachweis gewertet wurde.

Stamm Bo 10-09 Stamm Bo 53-33 NK (ASNIII/2-Medium) NK (AGB-Medium)

21 °C

28 °C

Abb. 3.7 a - g: Sreeningtest nach RAVN und Mitarbeitern (2001) mit dem Sensorstamm Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) zur Untersuchung einer AHL-Produktion durch die heterotrophen Stämme Bo 10-09 (a und d: linker Ausstrich) und Bo 53-33 (b und e: linker Ausstrich) nach 24 h Inkubation bei 21 °C und 28 °C über eine Blaufärbung des eingesetzten Sensorbakteriums A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) (jeweils rechter Ausstrich). Als Negativkontrolle (NK) wurde der Sensorstamm eingesetzt und unter gleichen Bedingungen (c und f) sowie bei 28 °C für 24 h auf ABG-Medium (g) bebrütet.

Aus Abbildung 3.7 a - g geht hervor, dass bei einer Inkubationstemperatur von 21 °C

für Stamm Bo 10-09 keine und für Stamm Bo 53-33 eine geringe AHL-Produktion

über die Mutante A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) nachgewiesen werden konnte. Nach

51

3. Ergebnisse

Inkubation bei 28 °C wies der Indikatorstamm auf den ASNIII/2-Agarplatten mit Stamm

Bo 53-33 und Stamm Bo 10-09, einschließlich der Negativkontrolle (Abb. 3.7 f), eine

Blaufärbung auf. Diese fiel in Gegenwart von Stamm Bo 10-09 wesentlich schwächer

aus als in Gegenwart von Stamm Bo 53-33. Aussagen über eine AHL-Produktion

waren aufgrund der positiven Negativkontrolle nicht bzw. kaum möglich.

Versuchswiederholungen bestätigten die Ergebnisse.

Eine weitere Bebrütung bei der jeweiligen Inkubationstemperatur führte bei allen

ASNIII/2-Agarplatten entweder zu einem Auftreten einer Blaufärbung des Biosensors

oder zu einer weiteren Signalverstärkung (Ergebnisse nicht dargestellt). Bei einer

Inkubationtemperatur von 37 °C wies der Sensorstamm nur ein unzureichendes

Wachstum auf, wodurch eine Auswertung unmöglich wurde (Ergebnisse nicht

dargestellt).

Ein Ausstrich des Biosensors auf ABG-Festagar als NK zeigte nach 24 h (Abb. 3.7 g)

und 48 h Inkubation (Ergebnisse nicht dargestellt) bei 28 °C hingegen keine

Blaufärbung auf.

Weiter konnte in Gegenwart von X-Gal oftmals beobachtet werden, dass der

ansonsten gelb-ockrige Stamm Bo 10-09 eine deutliche Grünblau-Färbung aufzeigte.

3.4.3 Nachweis AHL-produzierender Bakterien nach FARRAND und Mitarbeitern (2002)

Zur Detektion von AHL-Produzenten wurde eine weitere „Screening“-Methode nach

FARRAND und Mitarbeitern (2002) durchgeführt (siehe Kap. 2.7.7.2), da ein

eindeutiger Nachweis nach RAVN und Mitarbeitern (2001) nicht erbracht wurde. In

diesem Screeningtest wurde die AHL-Produktion der zu testenden heterotrophen

Stämme Bo 10-09 und Bo 53-33 sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo 1 bei 21 °C

untersucht. In Abbildung 3.8 a - c sind die A. tumefaciens-Indikatorplatten nach 24 h

Bebrütung bei 28 °C dargestellt.

52

3. Ergebnisse

Abb. 3.8 a - c: Sreeningtest nach FARRAND und Mitarbeitern (2002) mit dem Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) zur Untersuchung einer AHL-Produktion durch die Stämme Bo 53-33 (a), Bo 10-09 (b) und Flo 1 (c). Die Proben der zu untersuchenden Stämme wurden links, die der Positivkontrolle A. tumefaciens NT1 (pTiC58∆accR) rechts auf den Agarplatten aufgetragen. Nach einer Bebrütung der A. tumefaciens-Indikatorplatten bei 28 °C für 24 h wurden intakte AHL-Moleküle als blaue Spots sichtbar.

Wie aus Abbildung 3.8 a - c hervorgeht, konnte für den Stamm Bo 53-33 im

Gegensatz zu den Stämmen Bo 10-09 und Flo 1 ein deutlicher AHL-Nachweis mit

der Mutante A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) erzielt werden, sichtbar durch einen

blauen Farbumschlag im Auftragungsbereich. Ein schwacher Farbumschlag im Agar

deutete auf eine geringe AHL-Produktion durch Stamm Bo 10-09 hin, während für

das Cyanobakterium Stamm Flo 1 über das eingesetzte Sensorbakterium keine AHL-

Signalmoleküle nachgewiesen wurden. Die bebrüteten Agarplatten ohne Biosensor

(NK) waren negativ, wodurch eine Hydrolyse von X-Gal durch produzierte

Substanzen der Testorganismen ausgeschlossen werden konnte (Ergebnisse nicht

dargestellt). Eine unspezifische Aktivierung des Indikatorstammes durch

Medienkomponenten lag ebenfalls nicht vor, da eine Blaufärbung des Weichagars in

den Negativkontrollen mit unbeimpftem Kulturmedium nicht beobachtet wurde

(Ergebnisse nicht dargestellt). Eine Auswertung muss spätestens nach 48 h erfolgen,

da nach 48 - 72 h eine zunehmende Blaufärbung durch spontane Hydrolyse von

X-Gal auftrat. Aussagen über vorliegende AHL-Mengen konnten über diese Methode

nicht getätigt werden, da alle über den Biosensor detektierbaren AHL-Moleküle

nachgewiesen werden und die Sensitivitäten gegenüber diesen Signalmolekülen

unterschiedlich sind.

53

3. Ergebnisse

3.5 Untersuchungen des Einflusses verschiedener Kultivierungsbedingungen auf die AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1

Die Produktion von AHL-Signalmolekülen wurde unter verschiedenen

Kultivierungsbedingungen untersucht (siehe Kap. 2.7.2).

Zum Nachweis der verschiedenen AHL-Signalmoleküle wurde nach AHL-Extraktion

aus 250 ml Zellkulturüberständen (siehe Kap. 2.7.3.3) bzw. bakterieller Biomasse

(siehe Kap. 2.7.3.4) eine Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie (siehe

Kap. 2.7.4) mit anschließender Überschichtung mit dem Agrobacterium- bzw.

Chromobacterium-Sensor (siehe Kap. 2.7.5.2) zur Visualisierung der AHL-Moleküle

durchgeführt. Eine Identifikation der Signalmoleküle erfolgte, soweit möglich, mit Hilfe

von synthetischen AHL-Referenzmolekülen (siehe Kap. 2.7.6, Tab. 2.15). Aufgrund

der eingesetzten Standardmoleküle konnte, wie in Referenzarbeiten ebenso

(GEISENBERGER, 2000; YATES et al., 2002), auf eine Auswertung über die

ermittelten Rf-Werte verzichtet werden.

Für die DC-Untersuchungen mit dem Agrobacterium-Sensorstamm konnte eine

Hydrolyse von X-Gal durch extrahierte Substanzen (z.B. Enzyme) sowie durch eine

unspezifische Aktivierung des Biosensors durch das Ausbleiben einer Blaufärbung in

den Negativkontrollen nicht festgestellt werden (siehe Kap. 2.7.5.2) (Ergebnisse nicht

gezeigt).

3.5.1 Einfluss des pH-Wertes auf die AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1

Zur Ermittlung des pH-Wert-Einflusses auf die Signalmolekül-Produktion wurden die

AHL-Gehalte in den Kulturüberständen gepufferter Versuchskulturen miteinander

verglichen. Für die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 erfolgte

die Untersuchung bei ihrem jeweiligen pH-Minimum, -Optimum und -Maximum (siehe

Kap. 2.7.2.1), ermittelt aus den zuvor generierten Wachstumskurven (siehe

Kap. 3.2). Der pH-Wert 8,5 war das zunächst ermittelte pH-Maximum der

heterotrophen Stämme und fand daher ebenfalls in den AHL-Untersuchungen

Eingang. Eine Kultivierung unter pH-optimalen Bedingungen erfolgte bis in die

logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase. Die weiteren gepufferten

54

3. Ergebnisse

Versuchskulturen wurden bis in die stationäre Wachstumsphase inkubiert. Des

Weiteren wurden die AHL-Gehalte in ungepufferten dunkel-inkubierten Kulturen in

der logarithmischen und stationären Wachstumsphase ermittelt.

Die Ergebnisse für den Bakterienstamm Bo 53-33 mit dem Agrobacterium-

Sensorstamm sind in Abbildung 3.9 dargestellt. Mit dem Sensorstamm C. violaceum

CV026 wurden keine AHL-Signalmoleküle detektiert, wobei für die DC-Analysen bis

zu jeweils 50 µl der AHL-Extrakte aufgetragen wurden.

C4-HSL

C6-HSL

C8-HSL

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Probennummer

Abb. 3.9: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo 53-33 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem ASNIII/2-Medium (Probennr. 3 und 4) und bei unterschiedlichen pH-Werten in gepufferten ASNIII/2-Medien (Probennr. 5 - 9) bei 21 °C im Dunkeln bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 10 µl der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle; 2: Positivkontrolle (Vibrio sp.); 3: aus logarithmischer Phase; 4: aus stationärer Phase; 5: pH 6, aus stationärer Phase; 6: pH 7, aus logarithmischer Phase; 7: pH 7, aus stationärer Phase; 8: pH 8,5, aus stationärer Phase; 9: pH 9,0, aus stationärer Phase.

Das einheitliche Erscheinungsbild der AHL-Profile belegt, dass in allen Ansätzen von

Stamm Bo 53-33 unabhängig vom pH-Wert die Art der AHL-Moleküle sehr ähnlich

ist. Wie der Abbildung 3.9 zudem deutlich zu entnehmen ist, besteht ein

Zusammenhang zwischen dem pH-Wert des Kulturmediums und der AHL-Menge in

den Kulturüberständen. Die Größen der distinkten DC-Spots belegen, dass der

höchste AHL-Gehalt im Überstand der Kultur vorlag, welche bei einem pH 6,0

inkubiert worden war, und dass der AHL-Gehalt mit steigendem pH-Wert abnahm.

Ein DC-Signal lag unterhalb von C6-HSL, wobei bei pH 6-inkubierten Kulturen zwei

55

3. Ergebnisse

AHL-Moleküle detektiert wurden (Probennr. 5). Das zweite DC-Signal lag auf Höhe

von C4-HSL. Signifikante Unterschiede der AHL-Gehalte in den Kulturüberständen

von Stamm Bo 53-33 in der logarithmischen und stationären Wachstumsphase

wurden nicht beobachtet, wobei der Gehalt an AHL-Molekülen in der logarithmischen

Wachstumsphase (Probennr. 3) leicht höher war als in der stationären

Wachstumsphase (Probennr. 4). Die AHL-Positivkontrolle Vibrio sp. wies im

Kulturüberstand AHL-Signalmoleküle auf (Probennr. 2).

Für den Bakterienstamm Bo 10-09 wurde mit dem Agrobacterium-Sensorstamm DC-

Signale detektiert (Abb. 3.10). Mit dem Sensorstamm C. violaceum CV026 wurde

kein AHL-Nachweis erzielt, wobei bis zu jeweils 50 µl der AHL-Extrakte aufgetragen

wurden (Ergebnisse nicht dargestellt).

C4-HSL C6-HSL

C8-HSL

1 2 3 Probennummer

Abb. 3.10: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo 10-09 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden bei pH 6 in gepuffertem ASNIII/2-Medium bis in die stationäre Wachstumsphase bzw. in ungepuffertem ASNIII/2-Medium bis in die logarithmische Wachstumsphase bei 21 °C im Dunkeln inkubiert. Es wurden jeweils 30 µl der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle; 2: pH 6, aus stationärer Wachstumsphase; 3: aus logarithmischer Wachstumsphase.

In Abbildung 3.10 sind die AHL-Nachweise für Stamm Bo 10-09 dargestellt. Im

Überstand einer bei pH 6 kultivierten Kultur (Probennr. 2) wurden mindestens zwei

AHL-Signalmoleküle nachgewiesen. In Überständen aus Bo 10-09-Kulturen, welche

beim pH-Optimum (pH 8,0) bis in die logarithmische bzw. stationäre

56

3. Ergebnisse

Wachstumsphase sowie beim pH-Maximum (pH 9,0) bis in die stationäre

Wachstumsphase kultiviert wurden, konnten keine AHL-Signalmoleküle detektiert

werden (Ergebnisse nicht dargestellt). Des Weiteren wurde in Überständen

ungepufferter Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase ein AHL-Nachweis

erzielt (Probennr. 3), jedoch nicht in der stationären Wachstumsphase (Ergebnis

nicht dargestellt).

Bei Stamm Flo 1 erfolgte die Untersuchung auf AHL-Moleküle bei pH-Werten von

7,0, 8,0, 8,5 und 9,0 nach 14 bzw. 21 Tagen Kultivierung bei einem Photonenfluss

von 5 µE m-2 s-1 PAR (siehe Kap. 2.7.2.2). Für die DC-Analysen wurden jeweils 50 µl

der AHL-Extrakte eingesetzt. Ein AHL-Nachweis wurde mit keinem Indikatorstamm

erzielt.

3.5.1.1 Azidifizierung von Kulturüberständen der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09

Im Anschluss an die pH-Untersuchungen wurde eine Azidifizierung von

ungepufferten Kulturüberständen der Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 nach YATES

und Mitarbeitern (2002) durchgeführt (siehe Kap. 2.7.3.2). Eine Kultivierung der

ungepufferten Dunkelansätze erfolgte bis in die logarithmische bzw. stationäre

Wachstumsphase (siehe Kap. 2.7.2.1). Die Ergebnisse des Azidifizierungsversuches

für den Stamm Bo 53-33 mit dem Agrobacterium-Sensorstamm sind in Abbildung

3.11 a dargestellt, wobei ein Vergleich zwischen ungepufferten azidifizierten und

nicht-azidifizierten Kulturüberständen vorgenommen wurde. In der DC-Analyse mit

dem Chromobacterium-Sensor wurden lediglich die azidifizierten Kulturüberstände

untersucht (Abb. 3.11 b).

57

3. Ergebnisse

a C4-HSL C6-HSL

C8-HSL

1 2 3 4 5 6 7 8 Probennummer

C4-HSL b

C6-HSL

C8-HSL

1 2 3 4

Probennummer

Abb. 3.11: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus azidifizierten und nicht-azidifizierten Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo 53-33 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei 21 °C im Dunkeln bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert. a: Es wurden jeweils 2 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten (pH < 2) und nicht-azidifizierten Kulturüberständen (Probennr. 3 - 6) bzw. 20 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten Kulturüberständen (pH < 2) (Probennr. 7 und 8) auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL); 3: pH < 2, aus logarithmischer Phase; 4: pH < 2, aus stationärer Phase; 5: aus logarithmischer Phase; 6: aus stationärer Phase; 7: pH < 2, aus logarithmischer Phase; 8: pH < 2, aus stationärer Phase. b: Es wurden jeweils 100 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten Kulturüberständen (pH < 2) auf die DC-Platte aufgetragen (Probennr. 1 und 2). Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm C. violaceum CV026 verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: pH < 2, aus logarithmischer Phase; 2: pH < 2, aus stationärer Phase; 3: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 4: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL).

Aus Abbildung 3.11 a geht deutlich hervor, dass der nachgewiesene AHL-Gehalt in

azidifizierten Kulturüberständen aus Kulturen, inkubiert bis in die logarithmische bzw.

stationäre Wachstumsphase, wesentlich höher ist als in nicht-azidifizierten

58

3. Ergebnisse

Kulturüberständen. In der logarithmischen Wachstumsphase wurde ein AHL-Molekül

detektiert (DC-Signal unterhalb von C6-HSL) (Probennr. 3). Im Vergleich zur

stationären Wachstumsphase (Probennr. 4) lagen in beiden Wuchsphasen in etwa

gleiche AHL-Mengen vor. Ein weiteres AHL-Molekül wurde in der stationären

Wachstumsphase, dünnschichtchromatographisch auf der Höhe von C4-HSL,

nachgewiesen. Bei einem Auftragungsvolumen von 20 µl AHL-Extrakt konnte zudem

in der logarithmischen Wachstumsphase von Stamm Bo 53-33 noch ein drittes AHL-

Molekül in sehr geringer Menge (DC-Signal auf Höhe von C8-HSL) detektiert werden

(Probennr. 7).

Mit dem Sensorstamm C. violaceum CV026 wurde im azidifizierten Kulturüberstand

der Kultur, welche bis in die logarithmische Wachstumsphase inkubiert worden war,

ein kurzkettiges AHL-Molekül (DC-Spot etwas unterhalb von C4-HSL) nachgewiesen

(Abb. 3.11 b, Probennr. 1).

Ein Vergleich zwischen ungepufferten azidifizierten und nicht-azidifizierten

Kulturüberständen von Stamm Bo 10-09 mit dem Agrobacterium-Sensorstamm ist in

Abbildung 3.12 a dargestellt. Für die DC-Analysen mit dem Chromobacterium-

Sensor wurden lediglich AHL-Extrakte aufgetragen, welche aus azidifizierten

Kulturüberständen gewonnen wurden (Abb. 3.12 b).

59

3. Ergebnisse

Abb. 3.12: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus azidifizierten und nicht-azidifizierten Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo 10-09 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei 21 °C im Dunkeln bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert. a: Es wurden jeweils 30 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten (pH < 2) (Probennr. 3 und 4) und nicht-azidifizierten Kulturüberständen (Probennr. 5 und 6) auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL); 3: pH < 2, aus logarithmischer Phase; 4: pH < 2, aus stationärer Phase; 5: aus logarithmischer Phase; 6: aus stationärer Phase. b: Es wurden jeweils 100 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten Kulturüberständen (pH < 2) auf die DC-Platte aufgetragen (Probennr. 3 und 4). Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm C. violaceum CV026 verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL); 3: pH < 2, aus logarithmischer Phase; 4: pH < 2, aus stationärer Phase.

Wie aus Abbildung 3.12 a ersichtlich, ist der nachgewiesene AHL-Gehalt in

azidifizierten Kulturüberständen aus Kulturen, inkubiert bis in die logarithmische bzw.

stationäre Wachstumsphase, wesentlich höher als in nicht-azidifizierten

Kulturüberständen. In beiden azidifizierten Kulturüberständen befanden sich

mindestens zwei AHL-Signalmoleküle nach dünnschichtchromatographischer

Auftrennung auf Höhe von C8-HSL und im Bereich von C6-HSL (Probennr. 3 und 4).

Ein drittes AHL-Molekül im Bereich von C4-HSL konnte durch weitere DC-Analysen

nicht eindeutig bestätigt werden. Das Erscheinungsbild der beiden AHL-Profile

belegt, dass die gleichen AHL-Molekültypen in den verschiedenen

Wachstumsphasen vorkamen, die Mengen der produzierten AHL-Moleküle jedoch

variierten. Während das längerkettige AHL-Molekül in der stationären

Wachstumsphase in deutlich höherer Konzentration vorlag, nahm die Menge des

kurzkettigen AHL-Moleküls hingegen ab.

a b C4-HSL

C4-HSL C6-HSL C6-HSL

C8-HSL C8-HSL

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4

Probennummer Probennummer

60

3. Ergebnisse

Mit dem Sensorstamm C. violaceum CV026 wurde in den azidifizierten

Kulturüberständen der Kulturen, welche bis in die logarithmische bzw. stationäre

Wachstumsphase inkubiert worden waren, jeweils ein kurzkettiges AHL-

Signalmolekül (DC-Spot lag geringfügig unterhalb von C4-HSL) nachgewiesen

(Abb. 3.12 b, Probennr. 3 und 4).

3.5.2 Einfluss von Licht auf die Produktion von AHL-Molekülen durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09

Zur Ermittlung des Lichteinflusses auf die Signalmolekül-Produktion in den

heterotrophen Bakterienstämmen wurden die AHL-Gehalte in den Kulturüberständen

Licht-inkubierter und dunkel-inkubierter Kulturen, kultiviert bis in die logarithmische

bzw. stationäre Wachstumsphase, miteinander verglichen (siehe Kap. 2.7.2.1).

Die Ergebnisse für den Bakterienstamm Bo 53-33 mit dem Agrobacterium-

Sensorstamm sind in Abbildung 3.13 dargestellt. DC-Vorversuche mit dem

Chromobacterium-Sensorstamm hatten ergeben, dass trotz großer Auftragsvolumina

von bis zu 100 µl nur sehr schwache AHL-Nachweise mit Stamm Bo 53-33 zu

verzeichnen waren. Daher wurde auf eine weitere Untersuchung mit diesem

Sensorstamm verzichtet.

61

3. Ergebnisse

C4-HSL C6-HSL

C8-HSL

1 2 3 4 5 6

Probennummer

Abb. 3.13: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo 53-33 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden bei einem Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR (Probennr. 3 und 4) bzw. im Dunkeln (Probennr. 5 und 6) in ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei 21 °C bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 10 µl der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL); 3: 5 µE m-2 s-1 PAR, aus logarithmischer Phase; 4: 5 µE m-2 s-1 PAR, aus stationärer Phase; 5: dunkel, aus logarithmischer Phase; 6: dunkel, aus stationärer Phase.

Das einheitliche Erscheinungsbild der AHL-Profile in Abbildung 3.13 bestätigt, dass

die Art der AHL-Moleküle in den Licht-inkubierten und dunkel-inkubierten

Versuchsansätzen sehr ähnlich ist. In allen AHL-Extrakten wurde ein Signalmolekül

detektiert (DC-Spot lag geringfügig unterhalb von C6-HSL). Ein weiteres AHL-

Molekül (DC-Spot lag auf Höhe von C4-HSL) wurde eindeutig in der stationären

Wachstumsphase der Licht-inkubierten Versuchskultur nachgewiesen (Probennr. 4).

Des Weiteren belegen die Spotgrößen, dass in den Überständen der Licht-

inkubierten Versuchsansätze im Vergleich zu den jeweiligen Überständen der

Dunkelansätze aus der logarithmischen bzw. stationären Wachstumsphase keine

signifikanten Unterschiede in den AHL-Konzentrationen vorlagen.

Für den Bakterienstamm Bo 10-09 betrug das Auftragungsvolumen der AHL-Extrakte

jeweils 30 µl. Die Licht-inkubierten Versuchsansätze von Stamm Bo 10-09 wiesen

das gleiche AHL-Profil auf wie die dunkel-inkubierten Ansätze (siehe Kap. 3.5.1,

Abb. 3.10, Probennr. 3). Demnach wurde in der logarithmischen Wachstumsphase

Licht-inkubierter Versuchsansätze in ähnlicher Konzentration ein AHL-Molekül

62

3. Ergebnisse

nachgewiesen. In der stationären Wachstumsphase konnte kein AHL-Nachweis

erzielt werden.

3.5.3 Einfluss der Temperatur und der Kohlenstoffquelle auf die Produktion von AHL-Molekülen durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09

Die in Assoziation mit Cyanobakterien lebenden heterotrophen Bakterien existieren

unter Mangelbedingungen. Eine Auswirkung von verschiedenen

Nährstoffbedingungen auf die Produktion von AHL-Molekülen bei den zu

untersuchenden heterotrophen Bakterien ist dementsprechend von Interesse.

Daher wurden die Bakterienstämme im ASNIII/2-Medium mit nur 0,1% Fleischextrakt

bis zur stationären Phase angezogen (siehe Kap. 2.7.2.1). Die unter diesen

Bedingungen produzierten AHL-Moleküle wurden nach Extraktion mit den AHL-

Molekülen verglichen, welche aus Kulturen mit dem standardmäßig verwendeten

ASNIII/2-Medium mit 1% Fleischextrakt extrahiert worden waren. Zur Detektion der

AHL-Moleküle wurde der Agrobacterium-Sensorstamm eingesetzt. Die Ergebnisse

sind in Abbildung 3.14 dargestellt.

63

3. Ergebnisse

C6-HSL C4-HSL

C8-HSL

1 2 3 4 5 6

Probennummer

Abb. 3.14: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen der Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in 0,1% FE versetztem bzw. standardmäßig verwendetem (1% FE) ASNIII/2-Medium bei 21 °C im Dunkeln bis in die stationäre Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 10 µl (Stamm Bo 53-33) bzw. jeweils 40 µl (Stamm Bo 10-09) der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: Stamm Bo 53-33, 1% FE; 2: Stamm Bo 53-33, 0,1% FE; 3: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 4: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL); 5: Stamm Bo 10-09, 1% FE; 6: Stamm Bo 10-09, 0,1% FE. FE = Fleischextrakt.

Aus Abbildung 3.14 wird ersichtlich, dass der mit 0,1% Fleischextrakt kultivierte

Bo 53-33-Ansatz (Probennr. 2) eine leicht stärkere AHL-Produktion aufwies als der

mit 1% Fleischextrakt kultivierte (Probennr. 1), erkennbar durch den größeren DC-

Spotdurchmesser (DC-Spot geringfügig unterhalb von C6-HSL).

Ein schwacher AHL-Nachweis konnte für den Stamm Bo 10-09 in einer

Versuchskultur, kultiviert mit 0,1% Fleischextrakt, erzielt werden

(dünnschichtchromatographisch geringfügig unterhalb von C6-HSL) (Probennr. 6).

Mit dem Agrobacterium-Sensorstamm konnten indes im Überstand einer Kultur,

kultiviert mit 1% Fleischextrakt, keine AHL-Moleküle detektiert werden (Probennr. 5).

Zur Feststellung eines Temperatureinflusses auf die AHL-Menge in Überständen

bzw. auf die AHL-Produktion an sich wurden in einer weiteren Untersuchung

Versuchsansätze der Stämme Bo 10-09 und Bo 53-33 bei 28 °C bis in die stationäre

Wachstumsphase hin inkubiert (siehe Kap. 2.7.2.1). Anschließend wurden die AHL-

Gehalte der Überstände mit denen von Kulturen verglichen, welche bei 21 °C bis in

die stationäre Wachstumsphase inkubiert worden waren. Die Ergebnisse für den

64

3. Ergebnisse

Bakterienstamm Bo 53-33 unter Verwendung des Agrobacterium-Sensorstammes

sind in Abbildung 3.15 dargestellt.

Im Kulturüberstand von Stamm Bo 10-09 konnte auch bei einer

Inkubationstemperatur von 28 °C in der stationären Wachstumsphase kein AHL-

Nachweis erzielt werden (Ergebnisse nicht dargestellt). Für den Stamm Bo 10-09

betrug das Auftragungsvolumen der AHL-Extrakte jeweils 30 µl.

C4-HSL

C6-HSL

C8-HSL

1 2 3 4 Probennummer

Abb. 3.15: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des Bakterienstammes Bo 53-33 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei 21 °C (Probennr. 1) bzw. 28 °C (Probennr. 2) im Dunkeln bis in die stationäre Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 10 µl der AHL-Extrakte aus den Kulturüberständen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: 21 °C, aus stationärer Wachstumsphase; 2: 28 °C, aus stationärer Wachstumsphase; 3: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 4: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL).

Wie aus Abbildung 3.15 hervorgeht, wurden nach einer Kultivierung von Stamm

Bo 53-33 bei 28 °C bis in die stationäre Wachstumsphase zwei Signalmoleküle

detektiert (Probennr. 2). Bei einem Vergleich der Spotdurchmesser (DC-Spot

geringfügig unterhalb von C6-HSL) wird deutlich, dass der bei 28 °C kultivierte

Versuchsansatz eine wesentlich geringere AHL-Menge aufwies als der

Versuchsansatz, welcher bei 21 °C inkubiert wurde (siehe Probennr. 1 und 2).

65

3. Ergebnisse

3.5.4 Produktion von AHL-Molekülen durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1 Eine Anzucht von Stamm Flo 1 in ungepufferten Kulturmedien für 14 bzw. 21 Tage

bei einem Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR (siehe Kap. 2.7.2.2) und

anschließender Untersuchung von azidifizierten und nicht-azidifizierten

Kulturüberständen auf AHL-Moleküle mit dem Agrobacterium-Sensorstamm ergab

die in Abbildung 3.16 dargestellten Ergebnisse. Des Weiteren wurden AHL-Moleküle

aus 1000 ml Überstand extrahiert, wobei die Versuchskulturen zuvor für 8 Wochen

unter gleichen Kultivierungsbedingungen angezogen worden waren.

C4-HSL C6-HSL

C8-HSL

1 2 3 4 5 6 7 Probennummer

Abb. 3.16: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen des cyanobakteriellen Stammes Flo 1 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. Die Kulturen wurden in ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei 21 °C für 14 bzw. 21 Tage (Probennr. 3 - 6) bzw. für 8 Wochen (Probennr. 7) bei einem Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR inkubiert. Es wurden jeweils 50 µl der AHL-Extrakte aus den azidifizierten (pH < 2) und nicht-azidifizierten 250 ml Kulturüberständen (Probennr. 3 - 6) bzw. 50 µl AHL-Extrakt aus einem nicht-azidifizierten 1000 ml Kulturüberstand (Probennr. 7) auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL); 3: pH < 2, nach 14 Tagen; 4: pH < 2, nach 21 Tagen; 5: nach 14 Tagen; 6: nach 21 Tagen; 7: nach 8 Wochen.

Wie aus Abbildung 3.16 hervorgeht, wurden nach 14- bzw. 21-tägiger Kultivierung

der ungepufferten Flo 1-Kulturen in den Überständen AHL-Moleküle nachgewiesen

(Probennr. 5 und 6). Die kleinen Durchmesser der einzelnen DC-Spots weisen auf

einen geringen AHL-Gehalt in den Überständen hin. Es wurden zwei AHL-

Molekültypen (DC-Signale auf Höhe von C8-HSL und C6-HSL) mit ähnlichen

Konzentrationen in beiden Überständen gefunden. Eine Azidifizierung der

66

3. Ergebnisse

Kulturüberstände führte bei der 21 Tage lang inkubierten Flo 1-Kultur zu einem

stärkeren Nachweis des längerkettigen AHL-Moleküls (DC-Spot auf Höhe von C8-

HSL) (Probennr. 4). Aufgrund einer fehlerhaft durchgeführten Azidifizierung des

Überstandes der Flo 1-Kultur, angezogen für 14 Tage, konnten bezüglich einer AHL-

Produktion in dieser Kultur keine gesicherten Aussagen getätigt werden

(Probennr. 3).

In 1000 ml Überstand aus Flo 1-Kulturen, welche für 8 Wochen inkubiert wurden,

konnten drei AHL-Moleküle detektiert werden. Neben einem deutlich stärkeren Signal

für das längerkettige AHL-Molekül auf Höhe von C8-HSL war ein weiterer DC-Spot

auf Höhe von C4-HSL ein Beleg dafür, dass noch ein drittes AHL-Molekül im

Überstand von Flo 1-Kulturen vorkommt (Probennr. 7).

3.5.5 Intrazelluläre AHL-Untersuchungen mit den heterotrophen Bakterienstämmen Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie dem Cyanobakterium Stamm Flo 1

Sowohl die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 als auch der

Cyanobakterienstamm Flo 1 wurden intrazellulär auf AHL-Moleküle hin untersucht.

Der Stamm Flo 1 wurde dazu für 14 bzw. 21 Tage in ungepuffertem Nährmedium bei

einer Photonenflussdichte von 5 µE m-2 s-1 PAR kultiviert (siehe Kap. 2.7.2.2) Die

heterotrophen Stämme wurden, wie bereits in Kapitel 3.5.1 beschrieben, in

gepufferten und ungepufferten Nährmedien bis in die logarithmische bzw. stationäre

Wachstumsphase angezogen. Die Aufarbeitung der bakteriellen Biomasse wurde

nach BYERS und Mitarbeitern (2002) in veränderter Form durchgeführt (siehe

Kap. 2.7.3.4).

Für den heterotrophen Bakterienstamm Bo 10-09 wurde bei Auftragungsvolumina

zwischen 10 - 60 µl der Ammoniumacetat-Extrakte für keinen Versuchsansatz ein

intrazellulärer AHL-Nachweis mit dem Agrobacterium-Sensorstamm erzielt. Die

Ergebnisse der analytischen DC für den Stamm Bo 53-33 und Stamm Flo 1 sind in

Abbildung 3.17 dargestellt, wobei der AHL-Nachweis mit dem Agrobacterium-Sensor

erfolgte.

67

3. Ergebnisse

Abb. 3.17: Nachweis von AHL-Signalmolekülen aus bakterieller Biomasse des Bakterienstammes Bo 53-33 und des Cyanobakteriums Stamm Flo 1 nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung. a: Die Bo 53-33-Kulturen wurden in ungepuffertem ASNIII/2-Medium (Probennr. 3 und 4) und bei unterschiedlichen pH-Werten in gepufferten ASNIII/2-Medien (Probennr. 5 - 9) bei 21 °C im Dunkeln bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase inkubiert. Es wurden jeweils 30 µl der Extrakte aus den bakteriellen Biomassen auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 2: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL); 3: aus logarithmischer Phase; 4: aus stationärer Phase; 5: pH 6, aus stationärer Phase; 6: pH 7, aus logarithmischer Phase; 7: pH 7, aus stationärer Phase; 8: pH 8,5, aus stationärer Phase; 9: pH 9,0, aus stationärer Phase. b: Die Flo 1-Kultur wurde in ungepuffertem ASNIII/2-Medium bei 21 °C für 21 Tage bei einem Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR inkubiert. Es wurden 60 µl Extrakt aus der bakteriellen Biomasse auf die DC-Platte aufgetragen. Zum Nachweis der AHL-Moleküle wurde der Sensorstamm A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) verwendet. Als Referenzen wurden die synthetischen Signalmoleküle in den in Kapitel 2.7.6 (Tab. 2.15) angegebenen Mengen eingesetzt. Auftragungsschema: 1: cyanobakterieller Extrakt; 2: AHL-Referenzmoleküle (C6-HSL und C8-HSL); 3: AHL-Referenzmolekül (C4-HSL).

Abbildung 3.17 a ist zu entnehmen, dass im heterotrophen Stamm Bo 53-33,

abgesehen von einer Kultivierung bei pH 8,5 und pH 9,0, eine geringe AHL-Menge

nachgewiesen wurde (Probennr. 3 - 7). Die detektierten DC-Spots lagen dabei auf

gleicher Höhe (geringfügig unterhalb von C6-HSL) wie die jeweiligen AHL-Moleküle

in extrazellulären Untersuchungen (siehe Kap. 3.5.1, Abb. 3.9). Des Weiteren lassen

die Spotdurchmesser vermuten, dass der AHL-Gehalt in exponentiell wachsenden

Bakterienzellen höher war (Probennr. 3) als in Bakterienzellen in der Stationärphase

(Probennr. 4).

Für das Cyanobakterium Stamm Flo 1 wurde in der 21 Tage lang inkubierten

Versuchskultur ein intrazellulärer AHL-Nachweis erzielt (Abb. 3.17 b). Nach

dünnschichtchromatographischer Auftrennung der AHL-Extrakte wurden mit dem

a

b C4-HSL C6-HSL

C4-HSL C6-HSL

C8-HSL

C8-HSL

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3

Probennummer Probennummer

68

3. Ergebnisse

Agrobacterium-Sensor zwei DC-Spots erhalten. Ein DC-Signal lag auf Höhe der

Probenauftragung, das andere geringfügig oberhalb von C4-HSL (Abb. 3.17 b,

Probennr. 1).

3.6 Auswertung der molekularbiologischen Untersuchungen

3.6.1 Extraktion der chromosomalen DNA Aus den Cyanobakterienstämmen Bo 10 und Bo 53 sowie den heterotrophen

Stämmen Bo 53-33 und Bo 10-09 wurde deren chromosomale DNA extrahiert (siehe

Kap. 2.8.1) und bei 4 °C im Dunkeln gelagert. DNA-Menge und Reinheit der DNA

wurden mit einem Spektralphotometer (Peqlab Biotechnologie, NanoDrop ND-1000)

ermittelt (siehe Kap. 2.8.2). Die DNA-Ausbeuten sind in Tabelle 3.3

zusammengefasst.

Tab. 3.3: Ermittelte DNA-Ausbeute nach DNA-Extraktion aus den Cyanobakterien- stämmen Bo 10 und Bo 53 sowie den heterotrophen Stämmen Bo 53-33 und Bo 10-09

Bakterienstamm DNA-Ausbeute [ng/µl]

Bo 10 (Cyanobakterium) 740 Bo 53 (Cyanobakterium) 1153 Bo 10-09 (heterotrophes Bakterium) 5975 Bo 53-33 (heterotrophes Bakterium) 6014

3.6.2 Amplifikation der 16S-rDNA Durch die Amplifikation der 16S-rDNA von Cyanobakterium Stamm Bo 53 mittels

einer Standard-PCR (siehe Kap. 2.8.3) wurde ein ca. 1500 bp großes DNA-Fragment

erhalten (Gelbild nicht gezeigt). Für das Cyanobakterium Stamm Bo 10 wurde neben

einer ca. 1500 bp großen Bande noch weitere 1 - 2 Banden im Agarosegel detektiert.

Eine Separation der 16S-rDNA-Amplifikate aus dem Gel erfolgte durch Extraktion

(siehe Kap. 2.8.5).

3.6.3 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen auf Basis der 16S-rDNA-Sequenz

Die ermittelten 16S-rDNA-Sequenzen der Cyanobakterienstämme Bo 53 (1333 bp)

und Bo 10 (1336 bp) sind nach Alignment im Anhang dargestellt (siehe Tab. 7.2 und

Tab. 7.3). Die Sequenzen wurden mit Sequenzen aus der öffentlichen Datenbank

69

3. Ergebnisse

NCBI mittels BLAST (nucleotide blast) verglichen. Die kultivierten Stämme mit der

größten Sequenzübereinstimmung sind in den Tabellen 3.4 und 3.5 aufgeführt. Der

Stamm Bo 53 wurde bereits von LYRA und Mitarbeitern (2005) sequenziert und als

Nodularia harveyana eingeordnet. Ein Abgleich der ermittelten 16S-rDNA-Sequenz

mit der in der NCBI-Datenbank hinterlegten 16S-rDNA-Sequenz (Accession-Nr.:

AJ781143.1) zeigte eine Übereinstimmung von 99,85% auf. Der Stamm Bo 10 wurde

von RETHMEIER (1995) auf Grundlage von morphologischen Merkmalen als

Oscillatoria brevis klassifiziert. Für einen Vergleich von Stamm Bo 10 mit weiteren

Stämmen der Ordnung Oscillatoriales wurden die 16S-rDNA-Sequenzen der

Geitlerinema-Stämme Flo 1 (1372 bp) und PCC 7105 (Referenzstamm) (1378 bp)

zur Erstellung eines phylogenetischen Stammbaumes herangezogen

(SCHRÜBBERS, 2007).

Tab. 3.4: Vergleich der 16S-rDNA-Sequenz des Nodularia harveyana-Stammes Bo 53 mit den gegenwärtig verfügbaren Sequenzen der NCBI-Datenbank mit größter Sequenzübereinstimmung. Die Länge der hinterlegten Sequenzen, die Übereinstimmungen der Basenpaare mit Stamm Bo 53 in Prozent und die jeweilige Accession-Nummer der Stämme sind aufgeführt.

Stamm Sequenzlänge (bp) Identität (%) Accession-Nr. Nodularia harveyana BECID27 1435 99,70% AJ781145.1

Nodularia harveyana BECID29 1450 98,94% AJ781146.1

Nodularia spumigena BY1 1500 98,57% AF268004.1

Nodularia sphaerocarpa BECID36 1605 98,50% AJ781147.1

Nodularia spumigena HEM 1568 98,11% AJ781134.1

Nodularia spumigena Huebel 1987/311 1412 98,33% AJ781133.1 Nodularia baltica BY1 1445 98,42% AJ133177.1

Tabelle 3.4 ist zu entnehmen, dass der cyanobakterielle Stamm Bo 53 die größten

16S-rDNA-Sequenzhomologien mit Bakterienstämmen der Gattung Nodularia

aufweist, insbesondere mit Vertretern der Spezies Nodularia harveyana. Gegenüber

den Stämmen BECID27 bzw. BECID29 zeigt der zu untersuchende Stamm Bo 53

Sequenzübereinstimmungen von 99,70% bzw. 98,94% auf. Die ersten 50 16S-rDNA-

Sequenzen, ermittelt mittels BLAST aus der NCBI-Datenbank, sind ausschließlich

Sequenzen von Nodularia-Spezies mit mindestens 97%iger Sequenzhomologie.

70

3. Ergebnisse

Auf Basis der 16S-rDNA-Sequenz von Stamm Bo 53 und naheverwandten Stämmen

(siehe Tab. 3.4) erfolgte nach der „Neighbor-Joining“-Methode und dem Model von

JUKES und CANTOR (1969) die Konstruktion eines phylogenetischen

Stammbaumes (siehe Kap. 2.8.7) (siehe Abb. 3.18).

Nodularia spumigena HEM (AJ781134.1)

Nodularia spumigena Huebel 1987/311 (AJ781133.1)

Nodularia spumigena BY1 (AF268004.1)

Nodularia baltica BY1 (AJ133177.1)

Nodularia sphaerocarpa BECID36 (AJ781147.1)

Nodularia harveyana BECID29 (AJ781146.1)

Nodularia harveyana BECID27 (AJ781145.1)

Nodularia harveyana Bo 53

Gloeobacter violaceus PCC 8105 (AF132791.1)

100

71

99

86

67

0.01

Abb. 3.18: Phylogenetischer Stammbaum nach der „Neighbor-Joining“-Methode und dem Model von JUKES und CANTOR (1969) auf Grundlage der 16S-rDNA-Sequenzen von Stamm Bo 53 und naheverwandten Nodularia-Spezies. Gloeobacter violaceus PCC 8105 (AF132791.1) wurde als Außengruppe verwendet. Die Accession-Nummern der Referenz-Sequenzen sind in Klammern angegeben. An den Knotenpunkten des Stammbaumes sind die Bootstrap-Werte in Prozent dargestellt (1000 Wiederholungen). Skalierung: Anzahl an Substitutionen pro Nukleotid-Position.

Abbildung 3.18 zeigt, dass Stamm Bo 53 insbesondere eine enge

Verwandtschaftsbeziehung mit dem Nodularia harveyana-Stamm BECID27 aufweist.

Zu den weiteren Nodularia-Spezies ergab sich ein abgegrenztes Cluster. Der Stamm

Gloeobacter violaceus PCC 8105 grenzt sich als verwendete Außengruppe deutlich

von den Nodularia-Spezies ab.

Tab. 3.5: Vergleich der 16S-rDNA-Sequenz des Stammes Bo 10 mit den gegenwärtig verfügbaren Sequenzen der NCBI-Datenbank mit größter Sequenzübereinstimmung. Die Länge der hinterlegten Sequenzen, die Übereinstimmungen der Basenpaare mit Stamm Bo 10 in Prozent und die jeweilige Accession-Nummer der Stämme sind aufgeführt.

Stamm Sequenzlänge (bp) Identität (%) Accession-Nr.

Phormidium pseudopristleyi ANT.ACEV5.3 1463 99,32% AY493600.1

Phormidium lumbricale UTCC 476 1353 98,64% AF218375.1

Phormidium cf. terebriformis KR2003/25 1348 98,42% AY575936.1

Oscillatoria acuminata 1434 98,12% AB039014.1

71

3. Ergebnisse

Tabelle 3.5 ist zu entnehmen, dass Stamm Bo 10 die nahesten

Verwandtschaftsbeziehungen zu Vertretern der Gattung Phormidium und hier die

größte Übereinstimmung in der 16S-rDNA-Sequenz mit Phormidium pseudopristleyi

Stamm ANT.ACEV5.3 (99,32%) aufweist.

Auf Basis der 16S-rDNA-Sequenz von Stamm Bo 10 und naheverwandten Stämmen

(siehe Tab. 3.5) sowie der 16S-rDNA-Sequenz der Stämme Flo 1 und PCC 7105

erfolgte nach der „Neighbor-Joining“-Methode und dem Model von JUKES und

CANTOR (1969) die Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaumes (siehe

Kap. 2.8.7) (siehe Abb. 3.19).

Phormidium cf. terebriformis KR2003/25 (AY575936.1)

Oscillatoria acuminata (AB039014.1)

Oscillatoria brevis Bo 10

Phormidium pseudopristleyi ANT.ACEV5.3 (AY493600.1)

Phormidium lumbricale UTCC 476 (AF218375.1)

Geitlerinema sp. PCC 7105

Geitlerinema sp. Flo 1

Gloeobacter violaceus PCC 8105 (AF132791.1)

10078

66

100

100

0.01

Abb. 3.19: Phylogenetischer Stammbaum nach der „Neighbor-Joining“-Methode und dem Model von JUKES und CANTOR (1969) auf Grundlage der 16S-rDNA-Sequenzen von Stamm Bo 10, naheverwandten Bakterienspezies sowie der Stämme Flo 1 und PCC 7105. Gloeobacter violaceus PCC 8105 (AF132791.1) wurde als Außengruppe verwendet. Die Accession-Nummern der Referenz-Sequenzen sind in Klammern angegeben. An den Knotenpunkten des Stammbaumes sind die Bootstrap-Werte in Prozent dargestellt (1000 Wiederholungen). Skalierung: Anzahl an Substitutionen pro Nukleotid-Position.

Aus Abbildung 3.19 geht hervor, dass Stamm Bo 10 zwar

Verwandtschaftsbeziehungen mit verschiedenen Phormidium-Spezies und einer

Oscillatoria-Spezies aufweist, aber ein eigenes Cluster bildet. Die beiden

Geitlerinema-Stämme Flo 1 und PCC 7105 grenzen sich als Cluster, wie auch der

als Außengruppe verwendete Stamm Gloeobacter violaceus PCC 8105, deutlich von

den Vertretern der Gattungen Phormidium und Oscillatoria ab.

72

3. Ergebnisse

3.6.4 Amplifikation des gyrB-Gens

Durch die Amplifikation des gyrB-Gens der Cyanobakterienstämme Bo 53 und Bo 10

mittels einer Standard-PCR (siehe Kap. 2.8.3) wurde ein ca. 1200 bp großes DNA-

Fragment erhalten (Gelbild nicht gezeigt). Die Sequenzen des gyrB-Gens der

Cyanobakterienstämme Bo 53 und Bo 10 konnten für eine Erstellung von

phylogenetischen Stammbäumen auf Basis der gyrB-Sequenz aber nicht verwandt

werden. Für die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 konnten

nach einer Standard-PCR mit den gyrB-spezifischen Primern keine ca. 1200 bp

großen Banden im Agarosegel detektiert werden.

3.6.5 Internal Transcribed Spacer (ITS) Nach Amplifikation der ITS der cyanobakteriellen Stämme Bo 10, Flo 1 und PCC

7105 (siehe Kap. 2.8.3) wurden die PCR-Produkte gelelektrophoretisch aufgetrennt

(siehe Kap. 2.8.4). Das Gelbild ist in Abbildung 3.20 dargestellt.

AuM

A

F

P

F

Proben bp

− 3000 − 1500 − 1000 − 700 − 500 − 400

− 100

bb. 3.20: ITS-Bandenmuster der Cyanobakterienstämme Bo 10 (Probe 1 und 2), Flo 1 (Probe 3 nd 4) und PCC 7105 (Probe 5 und 6) nach Fragmentauftrennung in einem 2%igen Agarosegel. : Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder Plus; NK: Negativkontrolle ohne DNA-Template.

bbildung 3.20 zeigt das Gelbild der ITS-Amplifikate der cyanobakteriellen Stämme

lo 1, PCC 7105 und Bo 10. Für die beiden Geitlerinema-Stämme Flo 1 und

CC 7105 konnte im Bereich von 600 bp - 700 bp eine Bande dokumentiert werden.

ür Stamm Bo 10 wurden im Bereich von 500 bp - 700 bp drei Banden detektiert. Die

73

3. Ergebnisse

DNA-Fragmente wiesen Größen von ~500 bp, ~650 bp und ~700 bp auf. Das

unterschiedliche Bandenmuster bzw. die unterschiedliche Anzahl von amplifizierten

ITS-Regionen bei Stamm Bo 10 gegenüber den Geitlerinema-Stämmen zeigt auf,

dass Stamm Bo 10 nicht der Gattung Geitlerinema zugeordnet werden kann.

74

4. Diskussion

4. Diskussion

Im Mittelpunkt der vorliegenden Diplomarbeit standen sowohl der Nachweis von

AHL-Signalmolekülen bei den heterotrophen Bakterien Porphyrobacter Stamm

Bo 53-33 und Muricauda Stamm Bo 10-09 sowie dem Cyanobakterium Geitlerinema

Stamm Flo 1 als auch die Abhängigkeit der Signalmolekül-Produktion der oben

genannten Mikroorganismen bei verschiedenen Kultivierungsbedingungen.

Neben den Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der heterotrophen

Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 werden des Weiteren in diesem Kapitel die

Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchungen zur phylogenetischen

Einordnung der Cyanobakterienstämme Bo 53 und Bo 10 diskutiert.

4.1 Wachstumsverhalten der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen

4.1.1 Verwendete Puffersysteme Zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens der Bakterienstämme Bo 53-33 und

Bo 10-09 in Kulturmedien mit verschiedenen pH-Werten mussten zur Abdeckung des

pH-Bereiches von pH 2,0 - 10,0 verschiedene Puffersysteme eingesetzt werden

(siehe Kap. 2.6.2, Tab. 2.14). Jedes Puffersystem beeinflusst das Kulturmedium und

die im Nährmedium wachsenden Bakterien unterschiedlich. Folglich zeigten

bestimmte Puffersysteme einen inhibierenden Einfluss auf das Wachstum der

Bakterien und konnten nicht weiter verwendet werden (siehe Kap. 3.1). So hatte die

im Clark and Lubs(C&L)-Puffer enthaltene Borsäure wahrscheinlich einen toxischen

Einfluss auf die Bakterien (MORTIMER, 2007). Des Weiteren können organischen

Puffer-Komponenten (Citronensäure, Maleat und Glycin) als potentielle

Kohlenstoffquelle Einfluss auf das Wachstumverhalten bei einem bestimmten pH-

Wert nehmen. Wesentliche Probleme bei der Pufferung von mineralischen

Kulturmedien zeichnen sich vor allem im alkalischen Bereich ab, indem Kationen

(z.B. Mg2+- und Ca2+-Ionen) stark polarisierend auf Anionen wirken und kovalente

Bindungen eingehen. Dabei liegen starke Tendenzen zur Bildung von unlöslichen

Komplex-Ionen vor (MORTIMER, 2007). Diese Interaktionen von Puffer und

Kulturmedium sowie von verschiedenen Komponenten des Kulturmediums bei hohen

75

4. Diskussion

pH-Werten resultieren in Ausfällungen und gehen mit einem starken Nährstoffentzug

im Kulturmedium einher.

Die gewählten Puffersysteme stellen dementsprechend einen Kompromiss zwischen

der Pufferkapazität des jeweiligen Puffers sowie dessen Verträglichkeit für die

Testorganismen und den mit steigendem pH-Wert zunehmenden Mineralsalz-

Ausfällungen dar.

4.1.2 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-Werten Mikroorganismen können extreme Umgebungen besiedeln. Das mikrobielle

Wachstum kann dabei durch die Azidität und Alkalität eines Lebensraumes stark

beeinflusst werden (MADIGAN et al., 2001). Aufgrund ihres pH-Toleranzbereiches

können Mikroorganismen in verschiedene Gruppen unterteilt werden. Der Großteil

toleriert dabei als Neutrophile einen pH-Bereich von 5,0 bis 8,5 (zitiert aus RIUS und

LOREN, 1998). Azidophile wachsen in einem sauren pH-Bereich, wobei mikrobielles

Wachstum auch bei sehr niedrigen pH-Werten (pH < 3) vorliegt und oftmals selber

Ursache für die Azidität der Umgebung ist (z.B. bakterielle Oxidation von

Sulfidmineralien) (HALLBERG und JOHNSON, 2001). Alkaliphile können ein

optimales Wachstum bei pH-Werten oberhalb von 9,0, oft zwischen 10,0 - 12,0

aufweisen, wachsen aber nicht oder lediglich langsam bei neutralem pH-Wert

(HORIKOSHI, 1999).

Der heterotrophe Bakterienstamm Porphyrobacter Bo 53-33 wächst in einem pH-

Bereich von 6,0 - 9,0 (siehe Kap. 3.2). Das beste Wachstum konnte bei pH 7,0

festgestellt werden, was nahezu dem standardmäßig eingesetzten ASNIII/2-Medium

(pH 7,1) entspricht. Ein geringes Wachstum wurde bei pH-Werten von 6,0 und 9,0

verzeichnet. Bei diesen pH-Werten bildete der Porphyrobacter-Stamm,

wahrscheinlich zur Schaffung eines eigenen pH-Milieus, deutlich abgegrenzte

Zellagglomerate aus. Aufgrund des relativ großen pH-Toleranzbereiches sowie des

pH-Optimums ist Porphyrobacter Stamm Bo 53-33 als pH-tolerantes, neutrophiles

Bakterium einzuordnen, was sich mit dem natürlichen Habitat mariner Bakterien

deckt (pH 7,8 - 8,2: HAWLEY, 1981).

Im Genus Porphyrobacter, mit mittlerweile 7 klassifizierten Stämmen auf Spezies-

Ebene, wurden identische pH-Toleranzbereiche (6,0 - 9,0) bei den Vertretern

P. sanguineus (HIRAISHI et al., 2002) und P. tepidarius (HANADA et al., 1997)

ermittelt, mit einem langsamen Wachstum bei pH-Werten von 6,0 und 9,0. Einen

76

4. Diskussion

deutlich größeren pH-Toleranzbereich von 5,5 - 10,0 weist dagegen das vor kurzem

beschriebene Bakterium P. meromictius auf (RATHGEBER et al., 2007), für aerobe

anoxygen phototrophe Bakterien (α-4-Unterklasse der Proteobakterien) der bisweilen

maximal tolerierbare pH-Bereich. Das potentielle Wachstum dieses Bakteriums in

diesem großen pH-Bereich ist wahrscheinlich auf dessen natürliche Umgebung,

einem stark Natriumsulfat-haltigen Gewässer, zurückzuführen. Der optimale pH-Wert

für das Wachstum einiger Porphyrobacter-Spezies wurde im Bereich 7,0 - 8,0

detektiert, wobei zwischen den einzelnen Spezies geringfügige Unterschiede

bestehen (HIRAISHI et al., 2002; RAINEY et al., 2003; YOON et al., 2004, 2006)

Der Bakterienstamm Muricauda Bo 10-09 ist aufgrund des pH-Toleranzbereiches

von 6,0 - 9,0, mit einem schwachen Wachstum bei pH 9,0 und einem ermittelten pH-

Optimum bei 8,0 (siehe Kap. 3.2), ebenfalls als neutrophiles Bakterium einzuordnen.

Weitere Untersuchungen mit einem anderen Puffersystem (Tris-HCl-Puffer, pH 7,1)

zeigten auf, dass das pH-Optimum für Stamm Bo 10-09 wahrscheinlich im Bereich

von pH 7,0 liegt (Daten nicht gezeigt).

Das Genus Muricauda (Flavobacteriaceae) ist der Ordnung Cytophagales zugehörig.

Deren Vertreter sind ubiquitär anzutreffen und bilden in marinen Gewässern und

Umgebungen die größte Bakteriengruppe (BRUNS et al., 2001). GLÖCKNER und

Mitarbeiter (1999) konnten dabei in allen untersuchten marinen Proben sowie

Süßwasser-Proben Bakterien der Ordnung Cytophagales nachweisen.

Für die bisher bekannten Arten der Gattung Muricauda (M. ruestringensis,

M. flavescens und M. aquimarina) wurden pH-Optima im Bereich von 6,5 - 7,5 bzw.

um 7,0 dokumentiert (BRUNS et al., 2001; YOON et al., 2005). Mit einem Wachstum

im Bereich von pH 6,0 - 8,0 wurde für das Bakterium M. ruestringensis ein relativ

kleiner pH-Toleranzbereich festgestellt (BRUNS et al., 2001), während für die beiden

anderen Spezies der Gattung noch ein schwaches Wachstum bei einem pH-Wert

von 5,0 nachgewiesen wurde (YOON et al., 2005).

Die lange Kultivierungszeit der heterotrophen Stämme Bo 53-33 und Bo 10-09 bis

zum Eintritt in die stationäre Wachstumsphase ist bei einer gewählten

Inkubationstemperatur von 21 °C primär auf die Anzuchtsbedingungen

zurückzuführen. Ein optimales Wachstum wurde für die Vertreter der Gattung

Porphyrobacter im Bereich von 30 - 37 °C (YOON et al., 2004, 2006) bzw. weit

77

4. Diskussion

oberhalb dessen (HANADA et al., 1997; RAINEY et al., 2003) festgestellt. Für die

von YOON und Mitarbeitern (2005) beschriebene Spezies Muricauda aquimarina

wurde ein Temperatur-Optimum von 30 - 37 °C berichtet.

Das Wachstum der heterotrophen Bakterienstämme war überwiegend durch eine

deutliche Alkalisierung der gepufferten und ungepufferten Kulturmedien

gekennzeichnet (siehe Kap. 3.2.1). Diese pH-Verschiebungen sind wahrscheinlich in

erster Linie auf die Freisetzung von Ammonium-Ionen sowie Kohlendioxid aus

Proteinen und Peptiden des im ASNIII/2-Medium enthaltenen Fleischextraktes

zurückzuführen. Eine längerfristige Pufferung von Versuchskulturen ist demnach bei

Verwendung eines Vollmediums nicht möglich, da zu viele Stoffwechselreaktionen

die Pufferkapazität reduzieren. Des Weiteren kann eine aktive pH-Wert-Einstellung

durch die heterotrophen Bakterien vermutet werden, da bei pH 8,5- bzw. pH 9,0-

gepufferten Kulturen der pH-Wert konstant blieb bzw. sich leicht erniedrigte.

4.1.3 Wachstumsverhalten unter Lichteinfluss Die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wurden aus nicht-

axenischen Cyanobakterienkulturen isoliert (HUBE, 2008) und können in engen

assoziierten Lebensgemeinschaften mit Cyanobakterien auftreten (TUOMAINEN et

al., 2006; STEVENSON und WATERBURY, 2006). Cyanobakterien nutzen als

photosynthetische Bakterien das Licht als primäre Energiequelle zur CO2-Fixierung

(FUCHS, 2007). Die Porphyrobacter-Spezies (α-Proteobakterien) zeichnen sich

durch die Synthese von Photopigmenten (Bakteriochlorophyll a (Bchl a)) und von

großen Mengen an Carotinoiden aus (YURKOV und BEATTY, 1998). Im Gegensatz

zu den anaeroben anoxygenen phototrophen Proteobakterien besitzen diese

Bakterien aber nicht die Fähigkeit, die Photopigmente zur anoxygenen

Photosynthese für ein phototrophes Wachstum unter anaeroben Bedingungen zu

nutzen (YURKOV und BEATTY, 1998; RATHGEBER et al., 2004) und wurden daher

als aerobe anoxygene phototrophe Bakterien beschrieben. Die

membrangebundenen Photopigmente und akzessorischen Proteine dienen dabei

dem Aufbau eines elektrochemischen Membranpotentials, wobei letztlich ATP-

Äquivalente aus der protonenmotorischen Kraft generiert werden (WAGNER-

DÖBLER und BIEBL, 2006). Geringe Lichtintensitäten führen bei aeroben

anoxygenen Phototrophen zu einer vollständigen Inhibierung der Bchl a-Synthese

(WAGNER und BIEBL, 2006). Dabei wirken bereits Lichtintensitäten von

78

4. Diskussion

20 µE m-2 s-1 PAR auf die Photopigment-Synthese stark inhibierend (zitiert aus

YURKOV und BEATTY, 1998).

Der Porphyrobacter-Stamm Bo 53-33 zeigte bei einem Photonenfluss von

5 µE m-2 s-1 PAR kein sichtlich verändertes Wachstum gegenüber einer

Dunkelinkubation auf (siehe Kap. 3.3). Dementsprechend hatte das Licht als

zusätzliche Energiequelle anscheinend keinen stimulierenden Einfluss auf das

heterotrophe Wachstum der Versuchskulturen. Ein hemmender Einfluss konnte

ebenso nicht festgestellt werden, da die Carotinoide wahrscheinlich einen Schutz vor

photooxidativen Schaden vermitteln und toxische Sauerstoffderivate quenchen

(MADIGAN et al., 2001; WAGNER und BIEBL, 2006). Für den Stamm Bo 10-09

wurde ebenfalls kein verändertes Wachstumsverhalten bei einem Photonenfluss von

5 µE m-2 s-1 PAR festgestellt (siehe Kap. 3.3). Ein Vorkommen von Carotinoiden

wurde in Studien mit verschiedenen Muricauda-Spezies nicht dokumentiert, sind

aber aufgrund eines großen Vorkommens in nicht photosynthetisch aktiven Bakterien

(YURKOV und BEATTY, 1998) auch für den Stamm Bo 10-09 nicht auszuschließen.

4.2 „Quorum Sensing“(QS) bei verschiedenen Gram-negativen Bakterien Interzelluläre Kommunikationsysteme werden in vielen Bakterien zur Regulation der

Expression bestimmter Gene und dementsprechend zur Steuerung physiologischer

Aktivitäten in Abhängigkeit von der eigenen Populationsdichte verwendet. Diese

Anpassung von Aktivitäten können dabei in einer sich verändernden Umgebung

einen deutlichen Vorteil bringen (SZENTHE und PAGE, 2003; CASE et al., 2008)

und z.B. andere Bakterienspezies in einer ökologischen Nische verdrängen. Unter

Gram-negativen Bakterien ist dabei ein AHL-abhängiges „Quorum Sensing“ ein weit

verbreitetes Kommunikationssystem (FUQUA et al., 2001). In den letzten Jahren

wurde zunehmend in Gram-negativen Bakterien zudem ein weiteres QS-System

nachgewiesen, in dem Furanon-Derivate als QS-Signalmoleküle agieren (z.B.

Yersinia pestis: BOBROV et al., 2007) und wahrscheinlich überwiegend an einer

interspezifischen Kommunikation beteiligt sind (FEDERLE und BASSLER, 2003).

79

4. Diskussion

4.2.1 AHL-Nachweis mit bakteriellen Biosensoren Eine Möglichkeit zum Nachweis verschiedener AHL-Signalmoleküle ist der Einsatz

von bakteriellen Biosensoren. Die chemischen Strukturunterschiede der N-Acyl-

Seitenkette der AHL-Moleküle führen bei den einzelnen Biosensoren zu

unterschiedlichen Sensitivitäten gegenüber den verschiedenen AHL-Molekülen,

wobei viele Biosensoren lediglich eine kleine Bandbreite an AHL-Molekülen

detektieren (STEINDLER und VENTURI, 2007). Der Nachweis ist dementsprechend

auf die AHL-Moleküle beschränkt, auf welche der jeweilige Biosensor ab einer

bestimmten AHL-Konzentration reagiert (SHAW et al., 1997). Generell nimmt die

Affinität gegenüber einem AHL-Molekül dabei in der Stärke ab, je mehr sich die

Seitenkette des Moleküls von der des ursprünglich eigenen AHL-Signalmoleküls

unterscheidet. Die große AHL-Diversität bedingt dementsprechend zur Abdeckung

eines breiten AHL-Spektrums den Einsatz mehrerer Biosensoren, welche auf

verschiedene AHL-Moleküle reagieren. Eine AHL-Produktion kann von den

Kultivierungsbedingungen und dem Nährmedium abhängen (FARRAND et al., 2002)

bzw. durch bestimmte Umweltbedingungen reguliert werden (MOHAMMED et al.,

2008) und liegt folglich unter bestimmten Laborbedingungen vielleicht gar nicht vor.

Demzufolge schließt kein AHL-Nachweis die Produktion von AHL-Signalmolekülen

bzw. eines bestimmten AHL-Moleküls im jeweiligen untersuchten Bakterienstamm

grundsätzlich nicht aus.

Die in der vorliegenden Arbeit eingesetzten AHL-Biosensoren Agrobacterium

tumefaciens NTL4 (pZLR4) und Chromobacterium violaceum CV026 weisen

aufgrund ihres eigenen natürlichen AHL-QS-Systems unterschiedliche Sensitivitäten

gegenüber AHL-Signalmolekülen auf. In dünnschichtchromatographischen

Voruntersuchungen und Agarplattentests wurden Spezifitäten und Sensitivitäten der

AHL-Sensoren gegenüber zur Verfügung stehenden synthetischen

Referenzmolekülen (C4-HSL, C6-HSL und C8-HSL) ermittelt. Der Biosensor

C. violaceum CV026 zeigte mit Abstand die höchste Sensitivität gegenüber C6-HSL,

gefolgt von C8-HSL und C4-HSL (siehe Kap. 2.7.6 und 3.4.1). Der A. tumefaciens-

Sensorstamm wies eine sehr hohe Affinität für C8-HSL auf (siehe Kap. 2.7.6).

Gegenüber C6-HSL war der Sensorstamm leicht sensitiver als gegenüber C4-HSL.

Ähnliche Ergebnisse erzielten MCCLEAN und Mitarbeiter (1997) für C. violaceum

CV026 sowie FARRAND und Mitarbeiter (2002) für A. tumefaciens NTL4 (pZLR4). Im

Vergleich mit C. violaceum CV026 wies der Agrobacterium-Sensorstamm wesentlich

80

4. Diskussion

höhere Sensitivitäten gegenüber C8-HSL und C4-HSL und gleiche Affinität

gegenüber C6-HSL auf. Aufgrund der hohen nachgewiesenen Sensitivitäten und des

dokumentierten breiten Nachweisspektrums (STEINDLER und VENTURI, 2007)

erfolgten die weiteren Untersuchungen überwiegend mit dem Agrobacterium-

Sensorstamm.

4.2.2 Screeningtests zum Nachweis AHL-produzierender Bakterien Zum schnellen Nachweis von AHL-produzierenden Bakterien fanden zwei Methoden

in der vorliegenden Arbeit Anwendung. Im Screeningverfahren nach FARRAND und

Mitarbeitern (2002) wurden Bakterienkulturen oder Kulturüberstände direkt auf AHL-

Signalmoleküle untersucht, während RAVN und Mitarbeiter (2001) ausschließlich

Bakterienkulturen einsetzten. Die Methoden ermöglichen jedoch keine

Unterscheidung zwischen verschiedenen AHL-Molekülen. Des Weiteren können die

AHL-Signalmoleküle in den Bakterienkulturen bzw. Kulturüberständen aufgrund einer

fehlenden Aufkonzentrierung für eine Detektion in nicht ausreichender Menge

vorliegen.

In beiden AHL-Screeningsystemen konnte für Stamm Bo 53-33 ein AHL-Nachweis

unter Verwendung des Agrobacterium-Sensors erzielt werden (siehe Kap. 3.4.2 und

3.4.3). Ein schwacher Nachweis auf AHL-Moleküle konnte für Stamm Bo 10-09

lediglich über die Methode von FARRAND und Mitarbeitern (2002) dokumentiert

werden, während eine AHL-Produktion durch das Cyanobakterium Stamm Flo 1 nicht

nachgewiesen wurde.

Im Screeningtest nach RAVN und Mitarbeitern (2001) stellte das verwendete

Nährmedium einen limitierenden Faktor für diesen Assay dar, da sowohl das zu

testende Bakterium als auch der Biosensor auf diesem wachsen müssen. Ein

schwaches Wachstum, z.B. aufgrund unterschiedlicher Mineralsalz- bzw.

Salinitätsansprüche der Bakterien, schränkten Aussagen über eine AHL-Produktion

ein. Ein Kompromiss wurde mit dem ASNIII/2-Medium erzielt, wodurch aber auf eine

AHL-Untersuchung mit dem Biosensor C. violaceum CV026 verzichtet werden

musste. Die stärkeren Nachweisreaktionen über den Screeningtest nach FARRAND

und Mitarbeitern (2002) im Vergleich zum zweiten Assay zeigten die wesentlich

höhere Sensitivität dieses Assays gegenüber QS-Signalmolekülen auf. Eine in

mehreren Untersuchungen aufgetretene Blaugrün-Färbung des Bakterienstammes

Bo 10-09 im Screeningverfahren nach RAVN und Mitarbeitern (2001) ließ annehmen,

81

4. Diskussion

dass dieser X-Gal wahrscheinlich enzymatisch spalten kann. Neben dieser durch

Testorganismen enzymatisch bedingten X-Gal-Hydrolyse wurde des Weiteren von

FARRAND und Mitarbeitern (2002) von einer möglichen schwachen Aktivierung des

Agrobacterium-Biosensors durch Medienkomponenten berichtet, welche zu falsch-

positiven Ergebnissen führen kann. Eine unspezifische Aktivierung des Sensors

durch ASNIII/2-Medienkomponenten könnte auch Ursache für die Blaufärbung des

Sensorstammes bei der Nachweismethode von RAVN und Mitarbeitern (2001) in den

Negativkontrollen gewesen sein (siehe Kap. 3.4.2). Unspezifische

Nachweisreaktionen verdeutlichen, dass bei Untersuchungen mit Biosensoren eine

Durchführung von Negativkontrollen essentiell ist. Eine mögliche spontane Hydrolyse

von X-Gal erfordert zudem zur Vermeidung von Fehlinterpretationen eine

Auswertung beider Assays nach 24 h.

4.2.3 Extraktion und Nachweis von N-Acyl-L-Homoserinlactonen Die Extraktion von AHL-Signalmolekülen aus Kulturüberständen erfolgte in der

vorliegenden Arbeit mittels einer Dichlormethanextraktion nach GEISENBERGER

(2000) (siehe Kap. 2.7.3.3). Die aufwendige Herstellung von AHL-Extrakten war mit

einer Anzucht großer Mengen bakterieller Biomasse verbunden, da für die Extraktion

große Volumina an Kulturüberständen zur Ausschüttelung der AHL-Moleküle mit

dem organischen Lösungsmittel benötigt werden (WAGNER-DÖBLER et al., 2005).

FROMMBERGER (2005) bestimmte die Extraktionsausbeute mit Dichlormethan mit

etwa 60%. Nachfolgend wurde die organische Phase eingeengt. Problematisch

erwies sich hierbei nach Eintrocknung der organischen Phase die vollständige

Aufnahme der Rückstände in einem relativ geringen Volumen an flüchtigem

Ethylacetat. Aufnahmen in unterschiedlichen Ethylacetatvolumen in Abhängigkeit von

der Menge des Rückstandes würden einen AHL-Vergleich zwischen den jeweiligen

Kulturüberständen nicht mehr zulassen. Andere Studien verwendeten Ethylacetat als

Extraktionsmittel (CHA et al., 1998; RAVN et al., 2001; GRAM et al., 2002), wobei

RAVN und Mitarbeiter (2001) erstmals durch Azidifizierung des Ethylacetats die

Effizienz der AHL-Extraktion (75%) deutlich gegenüber nicht-azidifiziertem

Ethylacetat (35%) steigern konnten. Dabei wurde eine abnehmende Polarität der

AHL-Moleküle durch eine Protonierung in der N-Acyl-Seitenkette vermutet,

resultierend in einer leichteren AHL-Extraktion. Aus diesem Grund wurde in der

vorliegenden Arbeit eine Ansäuerung des Ethylacetats mit 0,01% (v/v) Essigsäure

82

4. Diskussion

durchgeführt, um eine maximale Aufnahme des Rückstandes bzw. der extrahierten

AHL-Moleküle zu erreichen.

Die in der vorliegenden Arbeit verwendete Methode zum Nachweis verschiedener

AHL-Moleküle geht ursprünglich auf SHAW und Mitarbeiter (1997) zurück. Dabei

erfolgte im Anschluss an eine Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie zur

Auftrennung der AHL-Moleküle die Detektion der Signalmoleküle mit bakteriellen

Reportersystemen.

In DC-Voruntersuchungen konnte festgestellt werden, dass mit Agrobacterium-

Sensorkulturen in der spät-exponentiellen Wachstumsphase, gekoppelt mit einer

guten Belüftung (200 rpm) während der Anzucht, die besten AHL-Nachweise erzielt

wurden. Des Weiteren ist das spezielle ABG-Kulturmedium für einen optimalen

Nachweis essentiell. Mit LB(Luria Bertani)-Medium konnten diese Ergebnisse nicht

auf diesem Niveau reproduziert werden. Eine unspezifische Aktivierung des

Biosensors durch LB-Medienkomponenten wurde zudem nicht sicher

ausgeschlossen. Ein weiterer Vorteil des ABG-Mediums ist eine Detektion blauer

DC-Spots auf einem hellen Hintergrund. Für eine optimale Visualisierung der AHL-

Moleküle wurde hierzu das X-Gal in N,N-Dimethylformamid gelöst.

Im Laufe der Untersuchungen zeichnete sich ab, dass der angewandten DC-Analytik

sowohl für physiologische Untersuchungen als auch für quantitative Aussagen

Grenzen gesetzt sind, da viele Parameter Einfluss auf die

dünnschichtchromatographischen Ergebnisse nehmen können. Hierbei spielen vor

allem die Herstellung der AHL-Extrakte, die Anzucht des Biosensors, die

Überschichtung der DC-Platten und deren Inkubation eine wesentliche Rolle. Des

Weiteren können Biosensoren geringe AHL-Mengenunterschiede in Form von

geringen Intensitätsabnahmen der DC-Spots kaum detektieren, und AHL-Reporter

sind zudem nicht fähig, die strukturelle Diversität von AHL-Molekülen nachzuweisen

(WAGNER-DÖBLER et al., 2005; CASE et al., 2008). Dementsprechend konnten nur

Tendenzen aufgezeigt, absolute Aussagen aber nicht getroffen werden.

83

4. Diskussion

4.2.4 AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss verschiedener

Kultivierungsbedingungen auf die AHL-Molekül-Produktion bei verschiedenen Gram-

negativen Bakterien mittels dünnschichtchromatographischer Methode untersucht

werden. Im Mittelpunkt der Untersuchungen standen dabei die AHL-Produktion und

das Vorkommen verschiedener AHL-Molekültypen in Abhängigkeit vom pH-Wert der

Kulturmedien.

QS ist ein Zelldichte-abhängiger Prozess. Die Konzentration der produzierten und in

die Umwelt freigesetzten Signalmoleküle steigt mit Zunahme der Bakterienpopulation

proportional an (CHA et al., 1998; WILLIAMS, 2007). In der vorliegenden Arbeit

wurden oftmals Proben miteinander verglichen, die aus Kulturen mit

unterschiedlichen Zelldichten gewonnen wurden. Weitere vergleichende AHL-

Untersuchungen sollten dementsprechend mit Kulturen gleicher Populationsdichte

durchgeführt werden, um den Einfluss von verschiedenen Kultivierungsbedingungen

besser bewerten zu können.

4.2.4.1 Einfluss des pH-Wertes auf die AHL-Signalmoleküle Die dünnschichtchromatographischen Ergebnisse zeigten, dass ein unmittelbarer

Zusammenhang zwischen dem pH-Wert des Kulturmediums und der AHL-Menge in

den Zellkulturüberständen besteht (siehe Kap. 3.5.1). Dabei nahm die über den

Agrobacterium-Sensorstamm nachgewiesene AHL-Menge in Kulturüberständen von

Stamm Bo 53-33 mit zunehmendem pH-Wert von pH 6,0 - 8,5 kontinuierlich ab und

wies bei pH 8,5 und 9,0 in etwa gleich große AHL-Mengen auf. Für den

heterotrophen Stamm Bo 10-09 konnte der gleiche Zusammenhang festgestellt

werden, wobei für einen Nachweis von AHL-Molekülen wesentlich größere Mengen

an AHL-Extrakt eingesetzt werden mussten und lediglich in den pH 6-gepufferten

Kulturen Signalmoleküle nachgewiesen wurden. Aufgrund der sehr schwachen AHL-

Nachweise bei Stamm Bo 10-09 erwies sich dieser mit der zur Verfügung stehenden

Methode für weitere physiologische Untersuchungen als ungeeignet. Die Ursachen

einer schwachen Nachweisreaktion könnten in einer fehlenden Sensitivität des

Biosensors gegenüber den AHL-Molekülen und in einer für eine AHL-Produktion

nicht gegebenen Kultivierungsbedingung liegen.

84

4. Diskussion

YATES und Mitarbeiter (2002) führten diesen Befund in Studien mit Yersinia

pseudotuberculosis und Pseudomonas aeruginosa auf eine nicht-enzymatische

Hydrolyse der AHL-Moleküle unter basischen Anzuchtsbedingungen zurück. Die

Hydrolyse der Esterbindung des Homoserinlactonrings führt dabei zu einer

Inaktivierung und somit zu einem Funktionsverlust des jeweiligen N-Acyl-L-

Homoserinlactons. Ein weiterer Angriffspunkt ist die Amidbindung zwischen dem

Homoserinlacton und der N-Acyl-Seitenkette. Die degradierten AHL-Moleküle

werden von dem LuxR-homologen Protein des jeweiligen AHL-Biosensors nicht mehr

erkannt, und ein AHL-Nachweis bleibt aus (STEINDLER und VENTURI, 2007).

In Anbetracht einer pH-abhängigen Instabilität der AHL-Moleküle könnte ein

kontinuierlich zunehmender pH-Wert während der Anzucht zudem Grund für die

leicht niedrigeren nachgewiesenen AHL-Mengen in der stationären

Wachstumsphase gegenüber der logarithmischen Wachstumsphase ungepufferter

Kulturen von Stamm Bo 53-33 sein. Damit ließe sich ebenfalls ein AHL-Nachweis in

der logarithmischen Wachstumsphase und das Fehlen von AHL-Molekülen in der

stationären Wachstumsphase in ungepufferten Kulturen von Stamm Bo 10-09

erklären. Eine Abnahme des AHL-Gehaltes in der stationären Wachstumsphase

durch eine nicht-enzymatische, pH-abhängige Spaltung von AHL-Molekülen wurde in

einer Studie von BYERS und Mitarbeitern (2002) bei Erwinia carotovora

dokumentiert.

Nach einer Azidifizierung ungepufferter Kulturüberstände der Stämme Bo 53-33 und

Bo 10-09 konnte der nachgewiesene AHL-Gehalt für beide Stämme deutlich

gegenüber nicht-azidifizierten Kulturüberständen erhöht werden (siehe Kap. 3.5.1.1),

da die inaktiven AHL-Signalmoleküle durch einen reversiblen Ringschluss des

Homoserins in ihre aktive Struktur überführt wurden und somit über AHL-

Biosensoren nachgewiesen werden konnten (YATES et al., 2002). Der

Azidifizierungsversuch und die vorangegangene pH-Wert-Untersuchung (siehe Kap.

3.5.1) zeigten insbesondere beim Stamm Bo 53-33 auf, dass, wie von YATES und

Mitarbeitern (2002) dokumentiert, ein Zusammenhang zwischen der Stabilität des

Moleküls und der Länge der N-Acyl-Seitenkette besteht. Dementsprechend wurde

ein weiteres, kurzkettigeres AHL-Molekül lediglich in azidifizierten und pH 6-

gepufferten Kulturüberständen über den Agrobacterium-Sensorstamm deutlich

nachgewiesen, während ein längerkettiges AHL-Molekül auch bei höheren pH-

Werten detektiert wurde.

85

4. Diskussion

Bei der Expression QS-gesteuerter Gene verstärken die QS-Signalmoleküle

gleichzeitig ihre eigene Signalmolekül-Produktion (Autoinduktion) (EBERHARD et al.,

1981). Folglich wären in AHL-stabilen Umgebungen (sauer bis leicht-alkalisch) ein

kontinuierlicher Anstieg der AHL-Konzentration und damit eine fortwährende

Genexpression zu erwarten. Eine AHL-Akkumulation in AHL-stabilen Umgebungen

wurde nicht beobachtet (LEADBETTER und GREENBERG, 2000), was auf einen

enzymatischen AHL-Abbau schließen ließ. In den letzten Jahren wurden verstärkt

AHL-degradierende Enzyme, AHL-Lactonasen und AHL-Acylasen, in verschiedenen

Bakterienspezies nachgewiesen, welche wahrscheinlich in der Regulation von QS-

gesteuerten Prozessen eine wichtige Rolle spielen (DONG und ZHANG, 2005).

ZHANG und Mitarbeiter (2002b, 2004) konnten einen schnellen Abbau von 3-oxo-

C8-HSL in der stationären Wachstumsphase von A. tumefaciens auf eine AHL-

Lactonase (AttM) zurückführen. Die Expression dieses Enzyms wird dabei durch

Hunger- und Stresssignale induziert und führte zu einer Beendigung des QS-

gesteuerten konjugativen Ti-Plasmid-Transfers.

Die hohen pH-Werte der Kulturüberstände nach Inkubation der Stämme Bo 53-33

und Bo 10-09 lassen Rückschlüsse auf eine enzymatische AHL-Degradation nicht

zu. Der Azidifizierungsversuch zeigte aber auf, dass die nach Azidifizierung wieder

intakten AHL-Moleküle zuvor nicht durch AHL-Acylasen gespalten werden konnten,

da diese enzymatische Reaktion an der Amidbindung des Moleküls irreversibel ist

(ROMERO et al., 2008).

Aufgrund einer freien Diffusion der Signalmoleküle durch biologische Membranen

und die Zellwand steigt die Konzentration der AHL-Moleküle proportional mit

Zunahme der Populationsdichte intrazellulär und extrazellulär gleichermaßen an

(KAPLAN und GREENBERG, 1985). Dementsprechend wurde in den

Versuchsansätzen mit Stamm Bo 53-33 intrazellulär aufgrund geringerer extrahierter

Volumina an Biomasse gegenüber den Kulturüberständen eine wesentlich kleinere

AHL-Menge nachgewiesen als extrazellulär (siehe Kap. 3.5.5). Für Stamm Bo 10-09

konnte kein AHL-Nachweis erzielt werden. Der ausgebliebene AHL-Nachweis bei

höheren pH-Werten (pH 8,5 und 9,0) in Versuchsansätzen mit Stamm Bo 53-33 ist

wahrscheinlich auf nicht-enzymatisch degradierte AHL-Moleküle zurückzuführen. Der

höhere nachgewiesene AHL-Gehalt in der logarithmischen Wachstumsphase kann

ebenfalls durch eine nicht-enzymatische, pH-abhängige Hydrolyse in der

Stationärphase erklärt werden. Eine enzymatische Degradation von AHL-Molekülen

86

4. Diskussion

ist in der Stationärphase aber nicht ausgeschlossen. Über eine QS-regulierte

Expression von Genen in verschiedenen Wuchsphasen wurde z.B. für Pseudomonas

aeruginosa berichtet (SCHUSTER et al., 2003).

4.2.4.2 Einfluss der Temperatur auf die AHL-Signalmoleküle Die Temperatur hat generell einen wesentlichen Einfluss auf die Stabilität der

gebildeten AHL-Moleküle. Bei höheren Temperaturen wie 30 °C (YATES et al., 2002)

bzw. 37 °C (BYERS et al., 2002) konnte bereits bei mild-alkalischen Bedingungen

(oberhalb von pH 7,0 bis pH 8,0) eine deutliche Instabilität der AHL-Moleküle

dokumentiert werden, wobei oberhalb von ~ pH 8,2 keine AHL-Moleküle mehr

nachgewiesen wurden. Folglich wird die Verwendung von Furanon-Derivaten als QS-

Signalmoleküle beim Gram-negativen Bakterium Escherichia coli auf die im Darm

herrschenden Bedingungen (pH 7,6; 37 °C) zurückgeführt (SCHAUDER et al., 2001).

Dem gegenüber wird bei GRAM und Mitarbeitern (2002) für marine Roseobacter-

Stämme bei einer Anzuchtstemperatur von 15 °C erst oberhalb eines pH-Wertes von

8,0 auf eine AHL-Instabilität hingewiesen. Die AHL-Stabilität ist bei niedrigeren

Temperaturen um ein Vielfaches erhöht (BYERS et al., 2002), was für eine

interzelluläre Kommunikation mariner, Gram-negativer Bakterien über AHL-

Signalmoleküle hinsichtlich der pH-Werte mariner Gewässer (Meerwasser, pH 7,8 -

8,2: HAWLEY, 1981) essentiell ist. Eine Kommunikation ist demnach auch noch bei

höheren pH-Werten über AHL-Moleküle möglich.

Bei Stamm Bo 53-33 konnten bei einer Inkubationstemperatur von 21 °C noch bei

pH-Endwerten von ~8,5 AHL-Signalmoleküle nachgewiesen werden (siehe

Kap. 3.5.1). Bei einem Vergleich von Kulturüberständen ungepufferter

Versuchsansätze von Stamm Bo 53-33 wurde ein geringerer AHL-Gehalt nach 28 °C

Inkubation gegenüber einer 21 °C-Inkubation für den Bakterienstamm festgestellt

(siehe Kap. 3.5.3).

Physiologische Experimente sollten zukünftig im pH-neutralen Bereich und bei

niedrigen Inkubationstemperaturen durchgeführt werden bzw., wenn dieses nicht

möglich ist, mit einer anschließenden Azidifizierung der Kulturüberstände gekoppelt

werden.

87

4. Diskussion

4.2.4.3 Einfluss von Licht und Nährstoffen auf die Produktion von AHL-Signalmolekülen

Die Expression von QS-regulierten Genen bei Bakterien kann neben der

Populationsdichte von einer Vielzahl von Umweltstimuli (Stressinduktoren) abhängen

bzw. beeinflusst werden, z.B. der Verfügbarkeit von Nährstoffen (WITHERS et al.,

2001). Ein in Wechselbeziehung mit äußeren Umwelteinflüssen stehendes QS,

involviert in phänotypischen Veränderungen der Bakterienzelle, erhöht dabei für eine

Bakterienzelle die Wahrscheinlichkeit z.B. unter nährstoffarmen Bedingungen oder

anderen Stressbedingungen zu überleben. DAVIES und Mitarbeiter (1998) konnten

in diesem Zusammenhang aufzeigen, dass die Biofilmbildung sowohl vom QS als

auch von externen Umweltstimuli (z.B. pH-Wert und Nährstoffe) abhängig ist.

Studien an Escherichia coli zeigten eine unterschiedliche AI-2-Signalmolekül-

Produktion in Abhängigkeit von umweltbedingten Stressfaktoren auf, was auf die

Fähigkeit einer stressbedingten Anpassung durch QS an sich ändernde

Umweltbedingungen schließen ließ (DE LISA et al., 2001). AHMED und Mitarbeiter

(2007) konnten bei Streptococcus anginosus ebenfalls einen Zusammenhang

zwischen der AI-2-Signalmolekül-Produktion und antibiotischem Stress aufzeigen.

Die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wurden in den in der

vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen möglichen Stressfaktoren

ausgesetzt.

Bei einer Erhöhung der Photonenflussdichte von 0 auf 5 µE m-2 s-1 PAR wurden

dabei keine signifikanten Unterschiede in der AHL-Menge gegenüber einer

Dunkelinkubation der Kulturen nachgewiesen (siehe Kap. 3.5.2). Folglich hat ein

Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR keinen Einfluss auf die AHL-Produktion bzw. auf

QS-gesteuerte Vorgänge bei den heterotrophen Bakterien. Des Weiteren steht

anscheinend eine Hemmung der Bchl a-Synthese bei Stamm Bo 53-33 bei geringen

Lichtintensitäten ebenfalls in keinem Zusammenhang mit „Quorum Sensing“.

Durch eine deutliche Reduzierung der Kohlenstoffquelle im verwendeten

Nährmedium sollten die Kulturen einem Nährstoffmangel ausgesetzt werden. Unter

den nährstofflimitierten Bedingungen (0,1% Fleischextrakt) konnte im Vergleich zu

den standardmäßigen Nährstoffbedingungen (1% Fleischextrakt) ein leicht stärkerer

AHL-Nachweis mit dem Agrobacterium-Sensorstamm für Stamm Bo 53-33

dokumentiert werden (siehe Kap. 3.5.3). Mit dem standardmäßig verwendeten

Nährmedium blieb ein AHL-Nachweis bei Stamm Bo 10-09 in den Kulturüberständen

88

4. Diskussion

aus, unter nährstofflimitierten Bedingungen wurde hingegen ein geringer AHL-Gehalt

in den Überständen nachgewiesen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass das

Nährmedium einen Einfluss auf die AHL-Produktion durch die heterotrophen Stämme

hat, also eine Abhängigkeit der AHL-Menge von der Verfügbarkeit der

Kohlenstoffquelle vorliegt.

QS ist an einer Vielzahl von phänotypischen Veränderungen und physiologischen

Anpassungen beteiligt (WILLIAMS, 2007), welche insbesondere bei

nährstofflimitierten Bedingungen und Stressbedingungen eine wesentliche Rolle

spielen (WITHERS et al., 2001). Die leicht erhöhten AHL-Gehalte könnten mit einer

verstärkten Expression QS-regulierter Gene zusammenhängen, welche bei einer

geringen Verfügbarkeit von Nährstoffen eine Adaptation an sich ändernde

Umweltbedingungen ermöglichen. Ein Einfluss von Nährmedien bzw. der

Medienzusammensetzung auf die Expression von QS-regulierten Genen wurde für

Pseudomonas aeruginosa beschrieben (WAGNER et al., 2003). In Vollmedien

konnte dabei eine deutliche Senkung der Expression von QS-regulierenden Genen

beobachtet werden. TEPLITSKI und Mitarbeiter (2003) zeigten ebenfalls eine starke

Abhängigkeit des produzierten AHL-Profils von dem Nährmedium auf. Dennoch

konnten QS-Mutanten in LB(Luria Bertani)-Medium zu höheren Zelldichten

heranwachsen als QS-fähige Wildtypstämme von Pseudomonas aeruginosa, da die

QS-regulierte Produktion von diversen Exoprodukten neben den QS-

Signalmolekülen in diesem Nährmedium lediglich einen unnötigen Energieverbrauch

darstellten (DIGGLE et al., 2007b).

4.2.5 Identifizierung der AHL-Signalmoleküle der heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 sowie des Cyanobakteriums Stamm Flo 1

Die Identifizierung der AHL-Moleküle erfolgte nach dünnschichtchromatographischer

Auftrennung durch einen Vergleich mit synthetischen Referenzmolekülen. Die

beschränkte Anzahl kommerzieller Standardmoleküle decken bei weitem nicht die

Bandbreite der in der Umwelt vorkommenden AHL-Signalmoleküle ab und ließen

oftmals eine Zuordnung nicht zu. Eine Zuordnung der DC-Signale über einen

Abgleich der Rf-Werte mit Rf-Werten aus der Literatur konnte nicht durchgeführt

werden, da die Referenzmoleküle von der Literatur abweichende Rf-Werte

aufzeigten. Dieses ist mit großer Wahrscheinlichkeit auf unterschiedlich verwendete

89

4. Diskussion

DC-Platten zurückzuführen. Ein abweichendes Laufverhalten hatte zur Folge, dass

sich die Anzahl der potentiellen AHL-Moleküle für einen detektierten DC-Spot

erhöhte. Des Weiteren weisen 3-oxo- und 3-hydroxy-Derivate mit gleicher

Seitenkettenlänge das gleiche dünnschichtchromatographische Laufverhalten auf, so

dass bei Auftreten beider Derivate eine Überlagerung der Signalmoleküle vorliegt

(SHAW et al., 1997).

Viele terrestrische Gram-negative Bakterien produzieren AHL-Moleküle. Im

Gegensatz dazu ist über das Vorkommen von AHL-Molekülen bei marinen Bakterien,

abgesehen von der Zelldichte-abhängigen Regulation der Lumineszenz bei Vibrio

fischeri und weiteren Vibrio-Spezies, noch relativ wenig bekannt (WAGNER-

DÖBLER et al., 2005; MOHAMMED et al., 2008). Bei marinen heterotrophen

Bakterien aus der Ostsee konnten BRUNS und Mitarbeiter (2002) einen

stimulierenden Effekt von AHL-Signalmolekülen auf die Kultivierung von

Laborkulturen aufzeigen. Es wurde daher eine wesentliche Rolle der AHLs bei der

Anpassung der marinen Bakterien an die Laborbedingungen vermutet. Des Weiteren

wurden AHL-Moleküle (C6-HSL, C8-HSL und 3-oxo-Derivate) bei Untersuchungen

mit einem Agrobacterium-Sensor bei 3 Roseobacter-Isolaten (Roseobacter-

Ruegeria-Untergruppe der α-Proteobakterien) aus “Marine Snow“ nachgewiesen

(GRAM et al., 2002). Eine AHL-Produktion in marinen Schwämmen durch assoziierte

Bakterien wurde ebenfalls auf einen Vertreter der Roseobacter-Ruegeria-

Untergruppe zurückgeführt (TAYLOR et al., 2004). Eine weite Verbreitung von AHL-

QS-Systemen bei marinen α-Proteobakterien, insbesondere aus der Roseobacter-

Gruppe, wurde durch Studien an bakteriellen Isolaten aus verschiedenen marinen

Habitaten (WAGNER-DÖBLER et al., 2005) und an marinen Schwämmen

(MOHAMMED et al., 2008) aufgezeigt, während letztere Arbeitsgruppe zudem für

zwei Isolate der Gattung Erythrobacter eine AHL-Produktion dokumentierte. Durch

Einsatz von verschiedenen bakteriellen Biosensoren konnten MOHAMMED und

Mitarbeiter (2008) für die α-Proteobakterien ein breites AHL-Spektrum, WAGNER-

DÖBLER und Mitarbeiter (2005) bei zusätzlicher Verwendung der GC-MS-Analyse

hingegen überwiegend langkettige AHL-Moleküle (C14, C16 und C18) nachweisen.

C8-HSL wurde zudem von letztgenannter Arbeitsgruppe bei zwei aeroben

anoxygenen phototrophen Bakterien der Gattungen Dinoroseobacter und

Roseobacter detektiert.

90

4. Diskussion

Das weitverbreitete Vorkommen von QS-Systemen in marinen α-Proteobakterien

weist auf eine große Bedeutung dieser Regulationssysteme zur Anpassung der

Organismen in ihren ökologischen Nischen hin. Für einige Proteobakterien wurde

dabei eine QS-regulierte Biofilmbildung vermutet, welche z.B. der Kolonisierung von

pflanzlichen und tierischen Oberflächen oder zur Bildung von “Marine Snow“ dient

(WAGNER-DÖBLER et al., 2005). Des Weiteren wurde z.B. für die aus

Dinoflagellaten isolierten Proteobakterien angenommen, dass QS in einer Regulation

symbiotischer Interaktionen involviert ist. Eine wesentliche Rolle wird den AHL-

Signalmolekülen bei Assoziationen zwischen Proteobakterien und höheren marinen

Organismen zugewiesen, wobei AHL-QS-Systeme wahrscheinlich der Etablierung

und Aufrechterhaltung solcher Assoziationen dienen. Die erhöhte

Nährstoffverfügbarkeit durch das Schwammgewebe ermöglicht dabei im Gegensatz

zum relativ nährstoffarmen Meerwasser das Erreichen hoher Populationsdichten und

somit das Einsetzen QS-regulierter Prozesse (MOHAMMED et al., 2008). Die

Bedeutung des QS in Proteobakterien zeigten CASE und Mitarbeiter (2008) in

Untersuchungen an einer Vielzahl bakterieller Genome auf, die ausschließlich für

eine große Anzahl von Proteobakterien luxI- und luxR-homologe Gene nachwiesen.

Für das heterotrophe marine α-Proteobakterium Porphyrobacter Stamm Bo 53-33,

nahe verwandt mit der Roseobacter-Gruppe, konnten mit dem Agrobacterium-

Sensorstamm zwei AHL-Moleküle nachgewiesen werden (siehe Kap. 3.5.1.1). Nach

Abgleich anhand mitgeführter Referenzmoleküle wurde ein AHL-Molekül mit kurzer

Seitenkette (C4 - C6) und ein weiteres mit kurzer bis mittellanger Seitenkette (C6 -

C8) bestätigt. Damit zeigt der Stamm Bo 53-33 im Vergleich zu anderen AHL-

produzierenden α-Proteobakterien (oftmals 4 - 6 verschiedene AHL-Moleküle)

(MOHAMMED et al., 2008) ein relativ einfaches AHL-Profil auf. Die nachgewiesenen

DC-Spots wiesen eine runde, distinkte Form auf und unterschieden sich damit von

den „tailing spots“, welche von 3-oxo-Derivaten gebildet werden (SHAW et al., 1997).

Da C6-HSL-Moleküle über den Chromobacterium-Sensorstamm nicht nachgewiesen

wurden, kann dieses AHL-Molekül für Stamm Bo 53-33 zudem mit großer

Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden. Ein zusätzlicher Vergleich mit

Referenzdaten (SHAW et al., 1997; GEISENBERGER, 2000) lässt für das

längerkettige Molekül auf C7-HSL oder 3-hydroxy-C8-HSL und für das kurzkettige

Molekül auf C4-HSL oder 3-hydroxy-C6-HSL schließen. Diese AHL-Moleküle sind mit

91

4. Diskussion

Ausnahme von C4-HSL bei AHL-produzierenden Bakterienspezies selten

vorzufinden. Das 3-hydroxy-C8-HSL wurde bisweilen in Pseudomonas fluorescence

(SHAW et al., 1997) und Photobacterium phosphoreum (FLODGAARD et al., 2005)

detektiert.

Die Azidifizierung der Kulturüberstände zeigte des Weiteren auf, dass das

längerkettigere AHL-Molekül in etwa gleich großen Mengen in der logarithmischen

und stationären Wachstumsphase vorlag. Die geringen Auftragungsvolumina in den

DC-Analysen sprechen für eine hohe Sensitivität des Agrobacterium-Sensorstammes

gegenüber diesem AHL-Molekül. Für das kurzkettige AHL-Molekül konnte ein

deutlicher Nachweis mit dem Agrobacterium-Sensorstamm in der stationären

Wachstumsphase gezeigt werden. In der logarithmischen Wachstumsphase lag das

Signalmolekül hingegen lediglich in geringen Mengen vor. Dieses Molekül konnte

durch den C. violaceum-Sensorstamm weder bestätigt noch ausgeschlossen

werden, da ein Nachweis eines kurzkettigen AHL-Moleküls lediglich in der

logarithmischen Wachstumsphase dokumentiert wurde.

QS könnte bei Porphyrobacter Stamm Bo 53-33 vielleicht, wie bereits für

verschiedene Roseobacter-Stämme vermutet (GRAM et al., 2002), bei hohen

Zelldichten die Produktion von Exoenzymen, eine Antibiotika-Produktion oder eine

Biofilmbildung regulieren. Da die Aggregation bei verschiedenen Bakterienspezies

ein QS-regulierter Prozess ist (WILLIAMS, 2007), könnte die beobachtete Bildung

von Zellagglomeraten bei einem pH-Wert von 6,0 (siehe Kap. 3.2) vielleicht ebenfalls

auf eine AHL-abhängige Regulation zurückgeführt werden. Bei niedrigen Zelldichten

bzw. für Bakterien in einer freilebenden, planktonischen Form sind diese

phänotypischen Veränderungen hingegen kaum von Vorteil für die Population bzw.

das einzelne Bakterium und mit einem unnötigen Verbrauch an Energie verbunden.

Der heterotrophe Bakterienstamm Bo 10-09 wurde nach 16S-rDNA-Sequenzierung

der Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides-Gruppe (CFB-Gruppe) zugeordnet

(HUBE, 2008). In dieser Gruppe sind bisweilen kaum AHL-Produzenten bekannt.

BRUNS und Mitarbeiter (2003) konnten in Kultivierungsversuchen keinen

stimulierenden Einfluss auf das Wachstum von Isolaten der CFB-Gruppe durch

synthetische AHL-Moleküle (C4-HSL und 3-oxo-C6-HSL) dokumentieren. In diesem

Zusammenhang konnten GRAM und Mitarbeiter (2002) ebenfalls bei keinem

kultivierten Isolat der CFB-Gruppe einen AHL-Nachweis über einen Agrobacterium-

92

4. Diskussion

Sensor erzielen, obwohl Bakterien der CFB-Gruppe neben den Proteobakterien eine

dominierende Gruppe in marinen Partikeln darstellen (GRAM et al., 2002). Das

Erreichen hoher Zellpopulationsdichten könnte das Einleiten QS-regulierter Prozesse

ermöglichen. Lediglich WAGNER-DÖBLER und Mitarbeiter (2005) dokumentierten

für einen Flavobacterium-Stamm einen positiven AHL-Nachweis mit einem

Biosensor, sensitiv für kurzkettige AHL-Moleküle. DOBRETSOV und Mitarbeiter

(2007) konnten jedoch durch Einsatz sogenannter QS-Blocker (Derivate des

Furanons) aufzeigen, dass die Signalmoleküle bei Vertretern der CFB-Gruppe eine

Erniedrigung der Zelldichten in bakteriellen Biofilmen auslösten bzw. eine Bildung

von Biofilmen inhibierten und dementsprechend Einfluss auf die Zusammensetzung

bakterieller Gemeinschaften nehmen. Dieses lässt schlussfolgern, dass AHL-

Signalmoleküle bzw. QS-gesteuerte Prozesse in der CFB-Gruppe keine Ausnahmen

darstellen.

In der vorliegenden Arbeit konnten mit dem Agrobacterium-Sensorstamm für

Muricauda Stamm Bo 10-09 mehrere AHL-Signalmoleküle detektiert werden. Dieses

erforderte aber eine Azidifizierung der Kulturüberstände und ein Auftragen sehr

hoher Volumina an AHL-Extrakten für die DC-Analysen (siehe Kap. 3.5.1.1). Dieses

lässt sich entweder auf eine geringe AHL-Produktion durch Stamm Bo 10-09 oder

auf eine geringe Sensitivität des Biosensors gegenüber diesen Molekülen

zurückführen. Nach Abgleich anhand der mitgeführten Referenzmoleküle wurde ein

nachgewiesenes AHL-Molekül als C8-HSL identifiziert. Neben diesem Molekül

konnten wahrscheinlich zwei weitere kurzkettigere AHL-Moleküle mit C6 - C8- bzw.

C4-Seitenketten für den Stamm Bo 10-09 dokumentiert werden, wobei das Fehlen

distinkter DC-Spots eine Zuordnung über einen Abgleich mit den Standards nur

bedingt zuließ. Der wesentlich höhere Gehalt an potentiellen C8-HSL in der

Stationärphase ist auf die höheren Zelldichten in dieser Wuchsphase

zurückzuführen, die Abnahme an kurzkettigen AHL-Molekülen in dieser Phase ist

jedoch zu hinterfragen. Eine QS-Regulation in verschiedenen Wuchsphasen kann für

Stamm Bo 10-09 nur vermutet werden. Ein über den Chromobacterium-

Sensorstamm nachgewiesenes kurzkettiges AHL-Molekül scheint nach Abgleich mit

den Referenzmolekülen keines der AHL-Moleküle zu entsprechen, welche mit dem

Agrobacterium-Sensor nachgewiesen wurden.

93

4. Diskussion

Cyanobakterien stehen im Gegensatz zu den heterotrophen Bakterien kaum im

Fokus von AHL-Untersuchungen. Dennoch konnten AHL-Moleküle in natürlichen

mikrobiellen Gemeinschaften nachgewiesen werden, in denen Cyanobakterien

auftreten bzw. diese sogar dominieren (mikrobielle Matten, cyanobakterielle Blüten)

(MCLEAN et al., 1997; BRAUN und BACHOFEN, 2004). Einen Zusammenhang

zwischen einer Microcystin-Synthese bei Cyanobakterien und AHL-Molekülen

konnten BRAUN und BACHOFEN (2004) jedoch nicht eindeutig aufzeigen.

ROMERO und Mitarbeiter (2006) dokumentierten eine AHL-Produktion durch den

axenischen Anabaena sp.-Stamm PCC 7120, wobei ausschließlich in der

cyanobakteriellen Biomasse AHL-Moleküle detektiert wurden. Es wurde basierend

auf einer Studie von YOON und GOLDEN (1998) angenommen, dass die AHL-

Moleküle (überwiegend 3-hydroxy-C12-HSL) an der Heterocystenbildung oder an

Prozessen der Stickstofffixierung beteiligt sind. Ein Ausbleiben von AHL-Molekülen in

der stationären Wuchsphase führten ROMERO und Mitarbeiter (2008)

wahrscheinlich auf eine enzymatische Degradation durch die AHL-Acylase AiiC

(auto-inducer inhibitor from Cyanobacteria) zurück. Des Weiteren wird zur

Vermeidung von Interferenzen eine intrazelluläre Degradation Spezies-fremder AHL-

Moleküle durch AiiC angenommen.

Bei Untersuchungen cyanobakterieller Kulturen von Stamm Flo 1 konnten zwei sehr

schwache AHL-Nachweise in Kulturüberständen nach 14 bzw. 21 Tagen Inkubation

mit dem Agrobacterium-Sensorstamm dokumentiert werden, wobei ähnliche AHL-

Gehalte in beiden Wuchsphasen vorlagen (siehe Kap. 1.1.1). Nach Abgleich mit

Referenzmolekülen wurde ein längerkettiges AHL-Molekül als C8-HSL und ein

substituiertes oder nicht-substituiertes AHL-Molekül mit einer C6- - C8-Seitenkette

identifiziert. Eine Azidifizierung von Stamm Flo 1-Kulturüberständen führte zu einem

stärkeren Nachweis des potentiellen C8-HSL und des kurzkettigeren Moleküls durch

Rückführung in die aktive Form der AHL-Moleküle (YATES et al., 2002). Die

geringen AHL-Gehalte ließen sich teilweise durch den hohen pH-Wert des

standardmäßig verwendeten Kulturmediums und der Flo 1-Kulturen (pH 9,0)

erklären. Ein zu geringer Einsatz cyanobakterieller Biomasse kann zudem nicht

ausgeschlossen werden. Durch eine Aufkonzentrierung von AHL-Molekülen aus

größeren Volumina an Kulturüberständen von Stamm Flo 1 wurde ein deutlich

stärkerer Nachweis für das potentielle C8-HSL erzielt und zudem ein drittes AHL-

Molekül, vermutlich C4-HSL, nachgewiesen. Die Inkubation von Flo 1-Kulturen für

94

4. Diskussion

8 Wochen und die Verwendung von nicht-axenischen Kulturen lassen jedoch

vermuten, dass die AHL-Produktion nicht auf Stamm Flo 1 sondern auf heterotrophe

Begleitorganismen zurückzuführen ist. Der cyanobakterielle Detritus bildet dabei

vielleicht die Grundlage für ein stärkeres heterotrophes Wachstum und das Erreichen

höherer Zelldichten der heterotrophen Bakterien. Gestützt könnte diese Annahme

durch intrazelluläre, aber nicht gesicherte AHL-Nachweise einer

21 Tage lang inkubierten Flo 1-Kultur werden (siehe Kap. 3.5.5). Nach Abgleich mit

den Referenzmolekülen und in Anbetracht des AHL-Nachweisspektrums von

Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) (FARRAND et al., 2002) weisen die DC-

Signale auf ein langkettiges AHL-Molekül (mindestens eine C12-Seitenkette) und ein

kurzkettiges AHL-Molekül, vermutlich 3-oxo-C4-HSL oder 3-hydroxy-C4-HSL, hin.

Das Ausbleiben dieser AHL-Moleküle in den Kulturüberständen von Stamm Flo 1

entspräche den bereits geschilderten Beobachtungen von ROMERO und

Mitarbeitern (2006, 2008) bei einem Anabaena sp.-Stamm.

Aussagen über mögliche Interspezies-Kommunikationen in assozzierten

Lebensgemeinschaften von Cyanobakterien und heterotrophen Bakterien können

anhand der erzielten Ergebnisse kaum getroffen werden. Zum einen bringt der

Nachweis von AHL-Molekülen in Überständen aus nicht-axenischen

Cyanobakterienkulturen keinen Aufschluss über den eigentlichen AHL-Produzenten

und zum anderen sind die untersuchten heterotrophen Stämme nicht wesentlicher

Bestandteil der heterotrophen Begleitflora von Stamm Flo 1 (HUBE, 2008,

persönliche Mitteilung). Dennoch ist vorstellbar, dass die produzierten

Signalmoleküle heterotropher Bakterien Einfluss auf physiologische Prozesse von

Stamm Flo 1 nehmen können (unidirektionale Interspezies-Kommunikation). CASE

und Mitarbeiter (2008) konnten bei einer Vielzahl proteobakterieller Genome

unvollständige QS-Systeme (Fehlen des luxI-homologen Gens) bzw. eine höhere

Anzahl von luxR-Homologen gegenüber luxI-Homologen dokumentieren. Diese

„zusätzlichen“ LuxR-homologen Proteine ermöglichen Bakterien (z.B. Brucella

melitensis, Salmonella typhimurium und Escherichia coli) Spezies-fremde QS-

Signale wahrzunehmen und in Abhängigkeit dieser Signalmoleküle physiologische

Prozesse zu modulieren. Eine soziale Intelligenz wurde unter Bakterien auf diesem

Niveau bis vor kurzem noch nicht vermutet.

Die hohen pH-Werte in Kulturen von Stamm Flo 1 (SCHRÜBBERS, 2007) sprechen

indes gegen eine interspezifische Kommunikation über AHL-Moleküle aufgrund der

95

4. Diskussion

Instabilität der Moleküle im alkalischen Bereich. Des Weiteren erreichen heterotrophe

Bakterienspezies in (vitalen) nicht-axenischen Cyanobakterienkulturen lediglich

geringe Zelldichten. QS-gesteuerte Prozesse werden dementsprechend aufgrund

einer zu niedrigen „Autoinducer“-Konzentration nicht eingeleitet.

4.3 Molekularbiologie Die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wurden aus nicht-

axenischen Cyanobakterienkulturen isoliert. Diese Cyanobakterienstämme Bo 53

und Bo 10 wurden in der vorliegenden Arbeit zur phylogenetischen Einordnung

molekularbiologisch untersucht und auf eine bereits vorgenommene taxonomische

Einordnung überprüft.

Basierte die Klassifizierung von Cyanobakterien hauptsächlich auf morphologischen

Kriterien, sind mittlerweile neben phänotypischen, physiologischen sowie

biochemischen Analysen insbesondere molekularbiologische grundlegend für eine

taxonomische Einordnung von Cyanobakterien und dem Aufzeigen evolutionärer

Verbindungen. Zur Identifikation von Bakterien und Erstellung von phylogenetischen

Stammbäumen wird standardmäßig die 16S-rDNA-Sequenz der Mikroorganismen

herangezogen (SEO und YOKOTA, 2003).

Die 16S-rDNA-Analyse des Cyanobakterienstammes Bo 53 belegte eine

Übereinstimmung von 99,85% mit der bereits in der NCBI-Datenbank hinterlegten

16S-rDNA-Sequenz des Stammes Nodularia harveyana Bo 53 (LYRA et al., 2005).

16S-rDNA-Sequenzen mit einer Homologie von mindestens 97% weisen

Organismen gewöhnlich einer Spezies zu (STACKEBRANDT und GÖBEL, 1994).

Eine Einordnung auf Speziesebene sollte über eine DNA-DNA-Hybridisierung

abgesichert werden, da die 16S-rDNA aufgrund zu geringer Sequenz-Variabilität

hierfür unzureichend ist (FOX et al., 1992; STACKEBRANDT und GÖBEL, 1994).

Eine Verwandtschaftsbeziehung auf Speziesebene setzt dabei eine DNA-

Reassoziation von mindestens 70% voraus (WAYNE et al., 1987). In diesem

Zusammenhang empfehlen STACKEBRANDT und EBERS (2006), basierend auf

publizierten Daten von 16S-rDNA-Analysen und DNA-DNA-Hybridisierungen, eine

Revidierung der Spezies-Grenze auf 98,7 - 99% bzw. definieren diesen Bereich als

denjenigen, welcher DNA-DNA-Hybridisierungsversuche zur Einordnung auf

Spezies-Ebene zwingend erforderlich macht. Demzufolge kann Stamm Bo 53 mit

einer Sequenzhomologie von 98,94 bzw. 99,70 % zu Stämmen von Nodularia

96

4. Diskussion

harveyana dieser Spezies zugeordnet werden (siehe Kap. 3.6.3). Die beiden in sehr

enger Verwandtschaftsbeziehung stehenden Stämme Bo 53 und BECID27 bilden

dabei in dem phylogenetischen Stammbaum ein abgegrenztes Cluster. Eine

Zuweisung auf Speziesebene von Stamm Bo 53 sollte dennoch über eine DNA-DNA-

Hybridisierung zwischen Stamm Bo 53 und Nodularia harveyana Stamm BECID27

bestätigt werden.

Generell werden Unterschiede von 5 - 7% (93 - 95% Identität) in den 16S-rDNA-

Sequenzen zur Unterstützung für neue Gattungen herangezogen (MADIGAN et al.,

2001). Der Cyanobakterienstamm Bo 10 wurde ursprünglich ausschließlich auf

Grundlage morphologischer Merkmale als Oscillatoria brevis klassifiziert

(RETHMEIER, 1995). Die aufgezeigten nahen Verwandtschaftsbeziehungen zu

diversen Phormidium-Spezies über 16S-rDNA-Analysen machen jedoch eine

Einordnung in die Gattung Phormidium wahrscheinlich, obwohl auch 98%

Sequenzhomologie mit einer Oscillatoria-Spezies vorlagen (siehe Kap. 3.6.3). Der

phylogenetische Stammbaum zeigte indes keine nahe Verwandtschaftsbeziehung

von Stamm Bo 10 zu den Geitlerinema-Stämmen Flo 1 und PCC 7105 auf.

Unterstützend zur 16S-rDNA-Sequenzanalyse sollten weitere molekulare Marker wie

das Gen gyrB und die ITS (internal transcribed spacer) untersucht werden. Die ITS-

Sequenzen sind zwischen den rRNA-Genen (16S-rRNA-, 23S-rRNA- und 5S-rRNA-

Gen) lokalisiert (ITEMAN et al., 2000), wobei molekularbiologische Untersuchungen

sich überwiegend auf die intergenische 16S-rRNA-23S-rRNA-Region beschränken.

Anzahl und Größe der ITS-Regionen stellen einen zusätzlichen taxonomischen

Marker für die phylogenetische Klassifizierung cyanobakterieller Stämme dar

(ITEMAN et al., 2002). Ein identisches ITS-Bandenmuster bei nicht-verwandten

Organismen ermöglicht jedoch keine Unterscheidung. Die im Vergleich zu den

Geitlerinema-Stämmen unterschiedliche Anzahl von ITS-Amplifikaten bei Stamm

Bo 10 schloss eine Einordnung in die Gattung Geitlerinema aus (siehe Kap. 3.6.5).

Eine ITS-Sequenzanalyse kann des Weiteren eine Unterscheidung von

Cyanobakterienstämmen auf intra- oder interspezifischer Ebene ermöglichen

(TATON et al., 2003). Die ITS-Sequenz weist dabei gegenüber funktionellen Genen

(z.B. das 16S-rRNA-Gen) eine wesentlich höhere molekulare Evolutionsrate auf

(LEBLOND-BOURGET et al., 1996).

97

5. Ausblick

5. Ausblick

In der vorliegenden Arbeit sind einige Fragen bezüglich des „Quorum Sensing“ bei

Gram-negativen Bakterien offen geblieben, deren Beantwortung teilweise weiterer

Methoden bedarf. Die erzielten Ergebnisse führten zu einer Vielzahl neuer

Fragestellungen und bieten gleichermaßen die Grundlage für weitere QS-

Untersuchungen.

Eine AHL-Produktion in Stamm Flo 1-Kulturen konnte nicht gesichert auf das

Cyanobakterium zurückgeführt werden. Fortführende QS-Untersuchungen an Stamm

Flo 1 sollten mit axenischen Kulturen und ausschließlich intrazellulär durchgeführt

werden. Mit dem Hintergrund der sehr schwachen AHL-Nachweise in Flo 1-Kulturen

ist des Weiteren eine Anzucht im größeren Maßstab erforderlich.

Unter den heterotrophen Bakterien zeichnet sich insbesondere der Porphyrobacter-

Stamm aufgrund der deutlichen AHL-Nachweise für weitere QS-Untersuchungen

aus. Die erzielten Ergebnisse bauen nahezu ausschließlich auf Grundlage eines

Biosensors (Agrobacterium-Sensorstamm) auf. Dementsprechend sollten zusätzlich

spezifischere Biosensoren wie Pseudomonas fluorescens 1855 (pSF105, pSF107)

eingesetzt werden. Dieser Sensorstamm reagiert ausschließlich auf

3-hydroxy-Derivate, welche bei Stamm Bo 53-33 vermutet wurden. Des Weiteren

sollte bezüglich einer Interspezies-Kommunikation in assoziierten

Lebensgemeinschaften von Cyanobakterien und heterotrophen Bakterien eine

Untersuchung auf AI-2-Signalmoleküle erfolgen.

Die Bandbreite der Verfahren zur Untersuchung von AHL-Signalmolekülen ist relativ

eingeschränkt. In den letzten Jahren fanden aber verstärkt MS-gekoppelte

Kapillartechniken in der AHL-Analytik Anwendung. Zur Identifizierung und

strukturchemischen Charakterisierung von AHL-Signalmolekülen sind analytische

Verfahren wie die hochauflösende GC-MS erforderlich, deren Detektionsgrenzen im

nmolaren bis pmolaren Bereich liegen. Alternativ ist eine Strukturanalyse auch mit

der HPLC-MS möglich, wobei das Trennverfahren, die Sensitivität und die

strukturelle Aufklärung nicht dem Niveau der GC-MS entspricht.

Neben der AHL-Produktion ist eine Hinterfragung der AHL-QS-regulierten

Phänotypen bzw. physiologischen Prozesse von großem Interesse. In diesem

Zusammenhang könnte eine Möglichkeit in der Koppelung von

Kultivierungsversuchen mit molekularbiologischen Analysen liegen. Die

98

5. Ausblick

Heterogenität der AHL-Synthase-Gene ermöglicht aber keine Entwicklung von PCR-

Standardprotokollen zur direkten Bestimmung der AHL-Produktionsfähigkeit bei

Mikroorganismen auf molekularer Ebene. Ein Vergleich der Proteinmuster in

verschiedenen Wuchsphasen der Bakterien mittels 2D-PAGE könnte einen Ansatz

bieten, wobei Rückschlüsse auf QS-regulierte Proteine möglich wären. Auf

Transkriptionsebene wurde des Weiteren eine Expression QS-gesteuerter Gene über

eine unterschiedlich stark exprimierte mRNA aufgezeigt (SHIN et al., 2007).

Für eine gesicherte Einordnung des Cyanobakterienstammes Bo 10 in das Genus

Phormidium sollten unterstützend zu den bisherigen phylogenetischen

Untersuchungen eine Sequenzanalyse der ITS-Regionen, eine nochmalige gyrB-

Gen-Analyse und eine Analyse des Fettsäuremusters erfolgen.

99

6. Zusammenfassung

6. Zusammenfassung

1. Die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und Bo 10-09 wachsen in einem

pH-Bereich von 6,0 - 9,0 und können daher als neutrophile Bakterien beschrieben

werden. Der zum Wachstum optimale pH-Wert liegt für Stamm Bo 53-33 bei 7,0 und

für Stamm Bo 10-09 bei 8,0. Bei einem Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR wiesen

die heterotrophen Bakterienstämme kein verändertes Wachstumsverhalten

gegenüber einer Dunkelinkubation auf. Die gepufferten und ungepufferten

Versuchskulturen waren nach Beendigung der Inkubation durch eine Alkalisierung

des Kulturmediums gekennzeichnet.

2. Der Agrobacterium-Sensorstamm erwies sich im Vergleich zum Chromobacterium-

Sensorstamm aufgrund deutlich höherer Sensitivitäten gegenüber den synthetischen

Referenzmolekülen C8-HSL und C4-HSL für den Nachweis von AHL-

Signalmolekülen als wesentlich geeigneter.

3. Die Screeningtests mit dem Agrobacterium-Sensorstamm zum Nachweis AHL-

produzierender Bakterien wiesen Stamm Bo 53-33 als deutlichen AHL-Produzenten

aus. Für den Stamm Bo 10-09 wurde ein schwacher AHL-Nachweis erzielt, für das

Cyanobakterium Stamm Flo 1 wurden hingegen keine AHL-Signalmoleküle

nachgewiesen.

4. Auf Grundlage bereits bestehender Methoden wurde eine dünnschicht-

chromatographische Methode zum Nachweis von AHL-Signalmolekülen mit den

Biosensor Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) etabliert.

5. Mit zunehmendem pH-Wert (von pH 6,0 bis 9,0) oder bei einer

Temperaturerhöhung von 21 °C auf 28 °C nahm die mit dem Agrobacterium-

Sensorstamm nachgewiesene AHL-Menge in Kulturüberständen von Stamm

Bo 53-33 ab. Bei Stamm Bo 10-09 konnte in gepufferten Versuchskulturen lediglich

bei pH 6,0 ein AHL-Nachweis mit dem Agrobacterium-Sensorstamm erzielt werden.

Die Azidifizierung (pH < 2) von Kulturüberständen der Gram-negativen Bakterien

führte zu einem deutlich stärkeren Nachweis an AHL-Molekülen. Die Stabilität der

AHL-Signalmoleküle ist demnach abhängig vom pH-Wert des Kulturmediums und

100

6. Zusammenfassung

der Temperatur. Der Azidifizierungsversuch konnte insbesondere für Stamm

Bo 53-33 zeigen, dass sich die AHL-Stabilität wahrscheinlich mit abnehmender Acyl-

Seitenkettenlänge verringert.

6. Ein Photonenfluss von 5 µE m-2 s-1 PAR hatte keinen nachweisbaren Einfluss auf

die AHL-Produktion durch die heterotrophen Bakterienstämme Bo 53-33 und

Bo 10-09. Eine Reduzierung der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium führte

wahrscheinlich zu einer veränderten AHL-Produktion durch die heterotrophen

Bakterienstämme.

7. Ein intrazellulärer AHL-Nachweis für die heterotrophen Bakterien wurde bei

Stamm Bo 53-33 erzielt, wobei das detektierte AHL-Molekül

dünnschichtchromatographisch identisch ist mit einem nachgewiesenen AHL-Molekül

in den Kulturüberständen. Bei Stamm Bo 10-09 konnten intrazellulär keine AHL-

Moleküle nachgewiesen werden.

8. Für Stamm Bo 53-33 konnte ein AHL-Signalmolekül mit kurzer Acyl-Seitenkette

(C4 - C6) und ein weiteres mit kurzer bis mittellanger Acyl-Seitenkette (C6 - C8)

dokumentiert werden. Für den schwachen AHL-Produzenten Stamm Bo 10-09

wurden neben C8-HSL vermutlich zwei weitere AHL-Signalmoleküle mit einer

C6 - C8-Seitenkette bzw. C4-Seitenkette nachgewiesen. 3-oxo-Derivate konnten

aufgrund fehlender „tailing spots“ der DC-Signale ausgeschlossen werden.

9. In Kulturüberständen des Cyanobakteriums Stamm Flo 1 wurden sehr geringe

AHL-Mengen mit dem Agrobacterium-Sensorstamm nachgewiesen, wobei vermutlich

drei verschiedene Signalmoleküle mit kurzer bzw. mittellanger Acyl-Seitenkette

vorlagen. Die Ergebnisse konnten durch zwei intrazellulär erzielte AHL-Nachweise

nicht bestätigt werden. Der Stamm Flo 1 konnte nicht gesichert als AHL-Produzent

beschrieben werden, da eine AHL-Produktion durch heterotrophe Begleitflora (nicht-

axenische Kulturen) nicht ausgeschlossen werden kann.

101

6. Zusammenfassung

10. Die 16S-rDNA-Sequenz des Cyanobakterienstammes Bo 53 zeigte durch

Vergleich mit Referenzsequenzen aus der NCBI-Datenbank eine Sequenzhomologie

von 99,70% mit Nodularia harveyana Stamm BECID27 auf. Die bereits

vorgenommene Einordnung zu Nodularia harveyana konnte damit bestätigt werden.

11. Der Cyanobakterienstamm Bo 10 wurde bisher auf Grundlage von

morphologischen Merkmalen als Oscillatoria brevis klassifiziert (RETHMEIER, 1995).

Nach 16S-rDNA-Analyse wurden die größten Übereinstimmungen mit Vertretern der

Gattung Phormidium und hier mit Phormidium pseudopristleyi Stamm ANT.ACEV5.3

(99,32%) dokumentiert. Folglich kann Stamm Bo 10 der Gattung Phormidium

zugeordnet werden. Nach einer Amplifikation der ITS konnte für Stamm Bo 10

gegenüber den Geitlerinema-Stämmen Flo 1 und PCC 7105 eine höhere Anzahl an

ITS-Regionen dokumentiert werden, welches eine Einordnung in das Genus

Geitlerinema ausschloss.

102

7. Anhang

7. Anhang

Tab. 7.1: Inkubationsdauer der AHL-Versuchsansätze mit den heterotrophen Bakterienstämmen Bo 53-33 und Bo 10-09 unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen bis in die logarithmische bzw. stationäre Wachstumsphase in h.

Wachstums-bedingungen

ASNIII/2 - Medium

Wachstums-phase

Inkubationsdauer (h)von Stamm Bo 53-33

Inkubationsdauer (h)von Stamm Bo 10-09

logarithmisch 27a) 24a)

stationär 124a) 72a)

pH 6,0 stationär 138 64

logarithmisch 40 --stationär 108 --

logarithmisch -- 40stationär -- 108



logarithmisch 22 18

stationär 66 48

28 °C, Dunkel ungepuffert stationärb) 96b) 60b)

21 °C, Dunkel, Minimalmedium ungepuffert stationärb) 46b) 46b)

21 °C, Dunkel

21 °C, 5 µE m² s-1 PAR

pH 7,0

pH 8,0

ungepuffert

ungepuffert

a) Nach Inkubation der Zellkulturen konnte eine Azidifizierung der Zellkulturüberstände nach YATES und Mitarbeitern (2002) erfolgen.

b) Die stationäre Wachstumsphase und Inkubationsdauer wurden nicht über zuvor generierte Wachs-tumskurven abgeleitet, sondern über photometrische Messungen der 250 ml Ansätze bei einer O.D.600nm

103

7. Anhang

Tab. 7.2: Sequenzausschnitt der 16S-rDNA des Nodularia harveyana-Stammes Bo 53 (1333 bp)

AGTAACGCGTGAGAATCTAGCTTCAGGTCGGGGACAACCACGGGAAACTGTGGCTAATACCGGATATGCC GAGAGGTGAAAGGCTTGCTGCCTGAAGATGAGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAGAGCGCA CCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACT CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGG AGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGAAAAAAATGACGGTACCTGAGGAATAAGCA TCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTA AAGGGTCCGCAGGTGGCCATGTAAGTCTGCTGTTAAAGAATCTAGCTCAACTAGATAAAAGCAGTGGAAA CTACACGGCTAGAGTGCGTTCGGGGTAGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGA AGAACACCAGTGGCGAAGGCGCTCTACTAGGCCGCAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAA TGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGC CGTGCCGTAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATT GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACT TGACATGTCGCGAATCTTTCTGAAAGGAGAGAGTGCCTTAGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTG TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTTTTAGTTGCCAG CATTAAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAG CATGCCCCTTACGTCTTGGGCTACACACGTACTACAATGCTACGGACAAAGGGCAGCTACACAGCAATGT GATGCAAATCTCAGAAACCGTAGCTCAGTTCAGATCGCAGGCTGCAACTCGCCTGCGTGAAGTAGGAATC GCTAGTAATTGCAGGTCAGCATACTGCAGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC ATGGAAGCTGATCACGCCCGAAGTCGTTACCCCAACTTTTAGGAGAGGGGGATGCCGAAG

Tab. 7.3: Sequenzausschnitt der 16S-rDNA der Oscillatoria brevis Stamm Bo 10 (1336 bp)

GGGTGAGTAACACGTGAGAATCTGCCTCCAGGTCGGGGACAACAGCGGGAAACTGCTGCTAATACCCGAT GTGCCTAAGGGTGAAAGATTAATTGCCTGGAGATGAGCTCGCGTCCGATTAGCTAGTTGGTAGAGTAAAA GCCTACCAAGGCTCCGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAAGACCGCGT GGGGGATGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCCCTTTTCTCAGGGAAGAATAACTGACGGTACCTGAGGAATA AGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGG CGTAAAGCGTTCGTAGGTGGCTGTTCAAGTCTGCCGTTAAAGACCGGGGCTTAACTCCGGAAAAACTGTG GAAACTGAACAGCTAGAGTATGGTAGGGGTAAGGGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATC GGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGCCTTACTGGGCCATAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAG CGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCTGTAAACGATGGATACTAGGTGTTGCCCGTATCGACCC GGGCAGTGCCGTAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGG AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAG GGCTTGACATGTCCAGAATCTTGGGGAAACTTGAGAGTGCCTTCGGGAGCTGGAACACAGGTGGTGCATG GCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTCCTTAGTTG CCATCATTAAGTTGGGCACTTTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAG TCAGCATGCCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTACTACAATGGGAAGGACAGAGGGTAGCAAGCGCGCG AGTGCAAGCCAATCCCATAAACCTTTCCTCAGTTCAGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGGCGG AATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACCCCGCCCGTCA CACCATGGAAGTTGGCCATGCCCGAAGTCATTACCCTAACCGCAAGGAGGGGGATGCCGAAGGCAGGCTA GTACGT

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Erklärung gemäß § 21, Absatz 6 der Diplomprüfungsordnung für den Studiengang Biologie (vom 7. Dezember 1994) Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst und dabei

keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe.

Bremen, im April 2008 ____________________________

(Peter Orszag)

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