Untersuchungen zur direkten und indirekten Genotoxizität von Natriumselenit und ... · 2017. 10....

Untersuchungen zur direkten und indirekten Genotoxizität von

Natriumselenit und Selenomethionin

vorgelegt von CAROLINE HALL

Staatlich geprüfte Diplom-Lebensmittelchemikerin

aus Bad Hönningen

von der Fakultät III – Prozesswissenschaften

der Technischen Universität Berlin (TU)

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat.-

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. W. Rotard

Berichter: Prof. Dr. A. Hartwig

Berichter: Prof. Dr. L. W. Kroh

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 03. November 2008

Berlin 2008

D83

Inhaltverzeichnis I

INHALTSVERZEICHNIS

1 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................. 1

2 EINLEITUNG.......................................................................................................... 3

2.1 Selen ............................................................................................................ 3

2.1.1 Vorkommen und Exposition .................................................................. 4

2.1.2 Resorption und Metabolismus............................................................... 5

2.1.3 Selenoproteine ...................................................................................... 6

2.1.4 Toxikologie ............................................................................................ 9

2.1.5 Untersuchte Selenverbindungen ......................................................... 10

2.2 DNA-Schäden und ihre Reparatur ............................................................. 11

2.2.1 Oxidative DNA-Schäden und die Basenexzisionsreparatur ................ 11

2.2.2 Helixverzerrende DNA-Schäden und die Nukleotidexzisions-

reparatur ............................................................................................. 13

2.2.2.1 BPDE-induzierte DNA-Schäden................................................... 13

2.2.2.2 UV-induzierte DNA-Schäden ....................................................... 15

2.2.2.3 Nukleotidexzisionsreparatur......................................................... 16

2.2.2.4 Das Xeroderma Pigmentosum Protein A ..................................... 18

2.3 Glutathion................................................................................................... 20

3 FRAGESTELLUNG ................................................................................................ 24

4 MATERIAL UND METHODEN .................................................................................. 25

4.1 Zellkultur und Behandlung der Zellen......................................................... 25

4.1.1 Zelllinien.............................................................................................. 25

4.1.2 Zellkultur ............................................................................................. 25

4.1.3 Inkubationslösungen ........................................................................... 26

4.2 Bestimmung der Aktivität der Glutathion-Peroxidase ................................. 26

4.2.1 Versuchsdurchführung ........................................................................ 27

4.2.2 Proteinbestimmung nach Bradford...................................................... 27

4.3 Bestimmung der Koloniebildungsfähigkeit.................................................. 28

4.4 Nachweis oxidativer DNA-Schäden............................................................ 29

4.4.1 Versuchsansatz................................................................................... 30

4.4.2 Alkalische Entwindung ........................................................................ 30

4.4.3 Chromatographie und fluorimetrische Quantifizierung ........................ 30

4.5 Quantifizierung von Gesamtglutathion und Glutathiondisulfid .................... 31

INHALTSVERZEICHNIS II

4.5.1 Versuchsansatz................................................................................... 32

4.5.2 Probenaufarbeitung............................................................................. 33

4.5.3 Durchführung des Recycling-Assays .................................................. 33

4.5.4 Bestimmung des Proteingehaltes nach der BCA-Methode ................. 34

4.6 Nachweis UVC-induzierter DNA-Schäden ................................................. 34

4.6.1 Versuchsansatz................................................................................... 35


4.7 Bestimmung der Glutathion-S-transferase-Aktivität.................................... 36


4.8 Nachweis BPDE-induzierter DNA-Addukte ................................................ 37

4.8.1 Versuchsansatz................................................................................... 38

4.8.2 DNA-Isolierung und -Quantifizierung................................................... 39

4.8.3 DNA-Hydrolyse ................................................................................... 39

4.8.4 HPLC-Analyse..................................................................................... 40

4.9 Immunologischer Nachweis des XPA-Proteins .......................................... 40

4.9.1 Zelllyse................................................................................................ 41

4.9.2 Elektrophorese und Westernblot ......................................................... 41

4.9.3 Chemilumineszenz-Detektion.............................................................. 41

4.10 Freisetzung von Zink aus XPAzf ................................................................ 42


5 ERGEBNISSE UND DISKUSSION............................................................................. 44

5.1 Bioverfügbarkeit der Selenverbindungen ................................................... 44

5.2 Zytotoxizität der Selenverbindungen .......................................................... 47

5.3 Untersuchungen zur prooxidativen Wirkung der Selenverbindungen......... 49

5.3.1 Induktion von oxidativen DNA-Schäden.............................................. 49

5.3.2 Untersuchung des Glutathionhaushaltes ............................................ 51

5.4 Induktion und Reparatur von UVC-induzierten DNA-Schäden ................... 54

5.4.1 Induktion von UVC-induzierten DNA-Schäden.................................... 54

5.4.2 Reparatur der Photoläsionen .............................................................. 55

5.4.3 Beeinflussung der Reparatur UVC-induzierter DNA-Schäden

durch Selenverbindungen ................................................................... 58

5.5 Modulierung der Toxizität von BPDE durch die Selenverbindungen .......... 62

5.5.1 Untersuchungen zur Detoxifizierung von Benzo[α]pyrendiolepoxid .... 62

5.5.1.1 Beeinflussung des Glutathionhaushaltes ..................................... 62

INHALTSVERZEICHNIS III

5.5.1.2 Untersuchung der Aktivität der Glutathion-S-transferase............. 65

5.5.2 Einfluss auf die Bildung und Reparatur BPDE-induzierter

DNA-Addukte ...................................................................................... 69

5.5.3 Beeinflussung der BPDE-induzierten Zytotoxizität .............................. 74

5.5.4 Untersuchungen in XPA knock-in und XPA-defizienten Zellen ........... 76

5.5.4.1 Charakterisierung der Zellen........................................................ 76

5.5.4.2 Reparatur von BPDE-induzierten DNA-Addukten ........................ 78

5.5.4.3 Beeinflussung der Induktion von BPDE-induzierten

DNA-Addukten durch Selenverbindungen ................................... 81

5.6 Zinkfreisetzung aus XPAzf ......................................................................... 84

6 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION....................................................................... 86

7 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................... 100

8 ANHANG........................................................................................................... 115

8.1 Abkürzungsverzeichnis ............................................................................ 115

8.2 Geräte ...................................................................................................... 117

8.3 Verbrauchsmaterialien ............................................................................. 119

8.4 Zelllinien ................................................................................................... 120

8.5 Chemikalien ............................................................................................. 120

8.6 Lösungen und Puffer ................................................................................ 124

8.7 HPLC-Analyse.......................................................................................... 130

8.8 „Recycling Assay“..................................................................................... 132

PUBLIKATIONSLISTE .................................................................................................. 133

DANKSAGUNG........................................................................................................... 136

ZUSAMMENFASSUNG 1

1 ZUSAMMENFASSUNG Das für den Menschen essentielle Spurenelement Selen ist Bestandteil von

Selenoproteinen, von denen insbesondere die Glutathion-Peroxidasen und die

Thioredoxin-Reduktasen am Abbau von Peroxiden in der Zelle beteiligt sind. Neben

den unumstrittenen antioxidativen Eigenschaften der Selenoproteine werden eine

Stimulierung von DNA-Reparaturprozessen und eine Induktion von Phase II-

Enzymen des Fremdstoffmetabolismus als weitere chemopräventive

Wirkmechanismen von Selen diskutiert. Epidemiologische Studien und

Untersuchungen zur Krebshäufigkeit in Korrelation zur Selenaufnahme sind jedoch

uneinheitlich und deuten auf komplexe biologische Wirkmechanismen der

Selenverbindungen hin, darunter auch prooxidative Eigenschaften. Das Ziel dieser

Arbeit war es, Natriumselenit und Selenomethionin hinsichtlich ihrer direkten und

indirekten genotoxischen Effekte zu vergleichen. Beide Selenverbindungen sind für

die Selenversorgung des Menschen als Bestandteil von Lebensmitteln und

Nahrungsergänzungsmitteln von Bedeutung. Während es sich bei Selenomethionin

um eine organische, vollständig reduzierte Verbindung handelt, gehört Natriumselenit

zu den anorganischen, reduzierbaren Selenverbindungen. Infolge dessen unterliegen

sie einem unterschiedlichen zellulären Metabolismus.

In der vorliegenden Arbeit konnte anhand der Enzymaktivität der Selen-abhängigen

Glutathion-Peroxidase die Aufnahme und Metabolisierung beider Verbindungen in

A549 Zellen nachgewiesen werden. In anschließenden Untersuchungen konnte

gezeigt werden, dass Natriumselenit bereits ab einer Konzentration von 4 µM

zytotoxische Effekte hervorrief und somit ca. 100fach stärker zytotoxisch war als

Selenomethionin. Die Untersuchung der direkten Genotoxizität der

Selenverbindungen erfolgte anhand der Induktion oxidativer DNA-Schäden und des

Einflusses auf den Glutathionhaushalt. Selenomethionin führte weder zu einer

Induktion oxidativer DNA-Schäden, noch zu einer Verschiebung des

Redoxhaushaltes. Hingegen führte Natriumselenit in zytotoxischen Konzentrationen

sowohl zu einer konzentrationsabhängigen und signifikanten Induktion oxidativer

DNA-Basenmodifikationen als auch zu einer signifikanten Bildung von oxidiertem

Glutathiondisulfid.

Die Untersuchungen zur indirekten Genotoxizität der Selenverbindungen erfolgte

anhand der Modulierung der Genotoxizität von UVC-Strahlung und

ZUSAMMENFASSUNG 2

(+)-anti-Benzo[α]pyrendiolepoxid (BPDE), dem ultimalen genotoxischen Metabolit

von Benzo[α]pyren. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Natriumselenit als auch

Selenomethionin in hohen Konzentrationen die Reparatur UVC-induzierter

Photoläsionen hemmen können. Die Untersuchungen zur Beeinflussung der

Genotoxizität von BPDE ergaben keine Anzeichen einer verminderten

Detoxifizierung von BPDE. Der Hauptweg der enzymatischen Detoxifizierung von

BPDE, die Glutathion-S-transferase katalysierte Konjugation an Glutathion, war von

den Selenverbindungen unbeeinflusst. Beide Selenverbindungen führten bereits im

nicht-zytotoxischen Konzentrationsbereich zu einer erhöhten Anzahl BPDE-

induzierter DNA-Addukte und zu einer Hemmung der Nukleotidexzisionsreparatur.

Während die durch Selenomethionin hervorgerufene Reparaturhemmung nach 24-

stündiger Reparaturzeit aufgehoben war, war sie nach Inkubation mit Natriumselenit

sowohl nach acht als auch nach 24 Stunden Reparatur nachweisbar. Zudem konnte

gezeigt werden, dass sich die Reparaturhemmung durch Natriumselenit in einer

Verstärkung der BPDE-induzierten Zytotoxizität auswirkt. Abschließend wurde mit

Hilfe eines subzellulären Testsystems gezeigt, dass Natriumselenit Zink aus der

Zinkfingerdomäne des Xeroderma Pigmentosum Protein A (XPA) herauslösen kann,

während Selenomethionin dazu nicht in der Lage war. Da das XPA-Protein für die

Nukleotidexzisionsreparatur von essentieller Bedeutung ist, kann dies der Grund für

die Reparaturhemmung durch Natriumselenit sein. Demgegenüber sind weitere

Versuche zur Aufklärung der Reparaturhemmung durch Selenomethionin nötig.

Somit konnten im Verlauf dieser Arbeit direkte genotoxische Effekte von

Natriumselenit gezeigt werden, die die genomische Stabilität beeinträchtigen können.

Außerdem wurden erstmals indirekte genotoxische Effekte von Selenverbindungen

nachgewiesen. Die Hemmung der DNA-Reparatur resultierte im Fall von

Natriumselenit wahrscheinlich aus einer Interaktion mit dem DNA-Reparaturprotein

XPA. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die Relevanz der Ergebnisse für

den intakten Organismus abzuklären.

EINLEITUNG 3

2 EINLEITUNG

2.1 Selen

Das Spurenelement Selen wurde 1817 von dem schwedischen Chemiker Jöns Jacob

Berzelius entdeckt und nach der griechischen Mondgöttin Selene benannt. Selen mit

der Ordnungszahl 34 ist ein Halbmetall und gehört in die VI. Hauptgruppe des

Periodensystems der Elemente. Somit hat es ähnliche chemische Eigenschaften wie

Schwefel und Tellur und wird zu den Chalkogenen gezählt. Dennoch unterscheiden

sich seine biochemischen Eigenschaften von denen des Schwefels. Unter

physiologischen Bedingungen ist der Säurecharakter von Selenolen (-SeH) deutlich

stärker ausgebildet als der von Thiolen (-SH), so dass Selenole in biologischen

Systemen fast vollständig dissoziiert vorliegen (Barceloux, 1999).

Nachdem lange Zeit von einer toxischen Wirkung von Selen ausgegangen wurde,

konnten Schwarz und Foltz (1957) die Essentialität für Säugetiere nachweisen. 1973

folgte die Entdeckung von Selen als Komponente der Glutathion-Peroxidase (Flohé

et al., 1973; Rotruck et al., 1973). Als Bestandteil von Glutathion-Peroxidasen ist

Selen für den Abbau von Peroxiden von zentraler Bedeutung und seine antioxidative

Wirkung anerkannt. Als weitere chemopräventive Wirkung werden die Induktion von

Phase II-Enzymen des Fremdstoffmetabolismus und eine Steigerung von DNA-

Reparaturmechanismen diskutiert (Seo et al., 2002; Fischer et al., 2007; Brigelius-

Flohé, 2008). Aufgrund dieser Eigenschaften wurden Selen-Präparate als

Nahrungsergänzungsmittel in den vergangenen Jahren verstärkt angeboten.

Demgegenüber besitzen einige Selenverbindungen ebenso prooxidative

Eigenschaften und die Fähigkeit, mit Thiolgruppen von Proteinen und Peptiden zu

reagieren. Epidemiologischen Studien und Daten zur Krebsinzidenz in Korrelation

der Selenaufnahme sind uneinheitlich, deuteten aber zunächst darauf hin, dass ein

niedriger Selenspiegel im Serum bzw. eine geringe tägliche Aufnahme mit einem

erhöhten Risiko an Leber-, Lungen-, Prostata- und Dickdarmkrebs verbunden ist

(Clark et al., 1996; Yu et al., 1997). In der bislang umfassendsten

placebokontrollierten Interventionsstudie, der Nutritional Prevention of Cancer Studie

(NPC), wurde der Effekt einer täglichen Gabe von 200 µg Selenomethionin in Form

von angereicherter Bäckerhefe auf das Auftreten von Hautkrebsrezidiven in einem

Hautkrebsrisikokollektiv untersucht. Obwohl sich keine Effekte auf das primäre

EINLEITUNG 4

Studienziel ergaben, waren die Prostata-, Lungen- und Dickdarmkrebsraten ebenso

reduziert, wie die krebsbedingte Mortalität. Allerdings zeigten sich in der gleichen

Studie auch gesteigerte Krebshäufigkeiten, von z.B. Brust- und Blasenkrebs. Des

Weiteren wurde die präventive Wirkung nur bei Patienten mit niedrigem initialen

Selenspiegel deutlich (Clark et al., 1996; Duffield-Lillico et al., 2002; Duffield-Lillico et

al., 2003). Dahingegen konnten im finnischen Interventionsprogramm, in welchem

die Selenversorgung der Bevölkerung durch Anreicherung der landwirtschaftlichen

Düngemittel mit Selenat erhöht wurde, keine signifikante Veränderung der

Krebsinzidenz festgestellt werden (Vinceti et al., 2000).

2.1.1 Vorkommen und Exposition

Aufgrund seines Durchschnittsgehaltes in der Erdkruste von 90 µg/kg gehört Selen

zu den seltenen Elementen. Es ist ubiquitär verbreitet. Durch die Verwitterung

sulfidischer Eisenerze wird es in anorganischer Form als Selenit oder Selenat

freigesetzt und von Pflanzen aufgenommen. Nach der Reduktion zu

Hydrogenselenid kann dieses methyliert, zur Biosynthese von Selenoproteinen

genutzt oder zu verschiedenen niedermolekularen Selenverbindungen metabolisiert

werden. Durch Methylierung ist es einigen Pflanzenarten möglich, auf selenreichen

Böden zu wachsen. Diese so genannten „Akkumulatorpflanzen“ speichern Selen

überwiegend in Form methylierter Metabolite wie Methylselenocystein oder

y-Glutamyl-Se-methylselenocystein. Zu ihnen zählen vorwiegend Astralagus-

(Tragant), Brassic-a (Kohl) und Allium- (Zwiebel) Spezies. Demgegenüber speichern

Hefen Selen fast ausschließlich als Selenomethionin (zusammengefasst in

Barceloux, 1999; Birringer et al., 2002; Rayman, 2008).

Mit Ausnahme der beruflich bedingten Exposition, wie z. B. in der Halbleiter- oder

Kupferherstellung und der Keramikindustrie, nimmt der Mensch Selen fast

ausschließlich mit der Nahrung auf. Der Selengehalt in Lebensmitteln ist von der

Selenaufnahme der Pflanzen und Tiere abhängig und kann deshalb je nach

Bodenbeschaffenheit stark variieren. In Lebensmitteln treten überwiegend

Selenomethionin und Selenocystein auf, deren Bioverfügbarkeit aus pflanzlichen

Lebensmitteln besser ist als aus tierischen Lebensmitteln (Navarro-Alarcon und

Lopez-Martinez, 2000). In Deutschland wird die tägliche Selenaufnahme

überwiegend in Form der eiweißreichen Lebensmittel Fleisch, Wurst, Fisch und Eier

gedeckt. Backwaren tragen zu ca. 10 % zur täglichen Selenaufnahme bei (Anke,

EINLEITUNG 5

2002). In Nahrungsergänzungsmitteln werden Selenhefen, welche überwiegend

Selenomethionin enthalten, oder anorganisches Natriumselenit oder -selenat

eingesetzt (Rayman et al., 2008). Der tägliche Bedarf an Selen ist derzeit nicht

ausreichend geklärt, da die zugrunde liegenden Kriterien der Beurteilung unklar sind.

Die Deutsche Gesellschaft für Ernährung empfiehlt eine tägliche Zufuhr von 30 bis

70 µg (DGE/ÖGE/SGE/SVE, 2000) für Erwachsene.

2.1.2 Resorption und Metabolismus

Mit Ausnahme der inhalativen Aufnahme nach Exposition am Arbeitsplatz erfolgt die

Resorption von Selenverbindungen nach oraler Aufnahme im Duodenum des

Gastrointestinaltraktes ohne homöostatische Kontrolle (zusammengefasst in

Barceloux, 1999). Selenomethionin wird über den gleichen Na+ Ionen-abhänhigen

Aminosäurecarrier wie Methionin absorbiert. Selenocystein wird wie Cystein über

den Carrier für basische Aminosäuren transportiert (Wolffram et al., 1989). Während

Selenat mittels eines aktiven Natrium-Cotransportes transportiert wird, konnten für

die Absorption von Selenit keine aktiven Transportmechanismen identifiziert werden.

Daher wird im Fall von Selenit von eine passiven Diffusion ausgegangen. Dies wird

als Grund dafür angesehen, dass Selenit langsamer absorbiert wird als Selenat

(Wolffram et al., 1986; Mykkanen und Wasserman, 1989). Nach der Resorption

können organische sowie anorganische Selenverbindungen zu Hydrogenselenid

(H2Se) umgesetzt werden, welches nach ATP-abhängiger Phosphorylierung dem

Aufbau von Selenoproteinen dienen kann. Selenit unterliegt dem reduktiven

Metabolismus und wird zunächst durch Glutathion reduziert. Das dabei entstehende

gemischte Disulfid wird nachfolgend durch die Glutathion-Reduktase oder

Thioredoxin-Reduktase unter NADPH-Verbrauch zu Hydrogenselenid, dem zentralen

Metabolit, reduziert. Im Gegensatz dazu kann Selenomethionin entweder ohne

vorherige Metabolisierung unspezifisch anstelle von Methionin in Proteine eingebaut

werden oder durch enzymatische Reaktion dem zellulären Selenpool zugeführt

werden. Nach der Transselenierung von Selenomethionin katalysiert die ß-Lyase die

Freisetzung von Hydrogenselenid aus Selenocystein. Dieses kann in

Folgereaktionen entweder zur Biosynthese von Selenoproteinen eingesetzt werden

oder in Form methylierter Produkte oder als Selenozucker ausgeschieden werden.

Des Weiteren wird eine Oxidation von Hydrogenselenid mit gleichzeitiger Bildung von

EINLEITUNG 6

Superoxidradikalen diskutiert (Whanger, 2004; Rayman et al., 2008; Brigelius-Flohé,

2008). Abbildung 1 zeigt den Metabolismus von Selenomethionin und Selenit.

Se0 + 2 O2• -

Selenomethionin

Körperproteine

CH3SeH(CH3)3Se+

Urin

(CH3)2SeH

Selenit

GS-Se-SG

H3SePO3

H2Se

Selenoproteine

2 O2 + 2 OH-

4 GSHGSSG

ATPADP+Pi

Selenocystein

12 3

AusscheidungSelenozucker

Urin

Selenoproteinbiosynthese

Unspezifischer Einbau in Proteine

Toxizität

partielle Abatmung

2 H2O

Se0 + 2 O2• -

Selenomethionin

Körperproteine

CH3SeH(CH3)3Se+

Urin

(CH3)2SeH

Selenit

GS-Se-SG

H3SePO3

H2Se

Selenoproteine

2 O2 + 2 OH-

4 GSHGSSG

ATPADP+Pi

Selenocystein

12 3

AusscheidungSelenozucker

Urin

Selenoproteinbiosynthese

Unspezifischer Einbau in Proteine

Toxizität

partielle Abatmung

2 H2O

Abbildung 1: Metabolismus von Selenomethionin und Selenit. 1: Glutathion-Reduktase und Thioredoxin-Reduktase, 2: γ-Lyase, 3: ß-Lyase; GSH: Glutathion, GSSG:

Glutathiondisulfid (zusammengefasst aus Yan und Spallholz, 1993; Rayman et al., 2008;

Brigelius-Flohé, 2008).

2.1.3 Selenoproteine

Im Gegensatz zu anderen essentiellen Metallionen, die als Cofaktoren mit Proteinen

in Wechselwirkung treten, wird Selen in Form der 21sten genetisch codierten

Aminosäure Selenocystein cotranslational in so genannte Selenoproteine eingebaut.

Bekannt sind außerdem Selen-bindende Proteine, deren Funktion weitgehend

ungeklärt ist, und selenomethioninhaltige Proteine, die keine besondere biologische

Bedeutung ausüben (Behne und Kyriakopoulos, 2001). Proteomanalysen ergaben

eine Anzahl von 25 humanen Selenoproteinen, die mindestens ein Selenocystein im

aktiven Zentrum enthalten, welches für die Enzymaktivität von essentieller

Bedeutung ist (Kryukov et al., 2003). Die Synthese von Selenoproteinen bedarf zum

einen spezieller Enzyme zur Ausbildung der Selenocysteinyl-tRNA, dem

Grundbaustein für Selenoproteine. Des Weiteren wird eine von der gewöhnlichen

Transkription abweichende Proteinsynthesemaschinerie benötigt, die das UGA-

EINLEITUNG 7

Codon nicht wie üblich als Stoppcodon, sondern als Selenocystein-Insertionssignal

decodiert. Zentrales Element für die korrekte Decodierung ist die Selenocystein-

Insertions-Sequenz (SECIS), eine Haarnadelstruktur im 3’-untranslatierten Bereich

der mRNA. Dieses Strukturelement wird durch SECIS-bindende Proteine erkannt, die

infolgedessen spezifische Elongationsfaktoren rekrutieren. Als weiteres an der

Synthese einiger Selenoproteinen beteiligtes Element wurde das selenocystein

redefinition element entdeckt, welches sich in 5’-Richtung in unmittelbarer Nähe des

UGA-Codons befindet. Dessen Funktion bedarf jedoch noch der Aufklärung (Behne

und Kyriakopoulos, 2001; Schomburg et al., 2004; Papp et al., 2007).

Die Biosynthese der Selenoproteine und die Selenversorgung der Organe

unterliegen einer Hierarchie mit bislang teilweise unklaren molekularbiologischen

Grundlagen. Dies bedeutet, dass einzelne Gewebe bevorzugt versorgt werden und

Selenoproteine mit besonderer Bedeutung für den Organismus auch unter

Mangelzuständen präferentiell synthetisiert werden (Allan et al., 1999).

Zu den Selenoproteinen mit bekannter biologischer Funktion gehören die

Enzymfamilien der Glutathion-Peroxidasen (GPx), Thioredoxin-Reduktasen und

Thyroxin-Deiodinasen sowie das Selenoprotein P. Es sind vier Enzyme aus der

Familie der Glutathion-Peroxidasen bekannt. Diese sind die zytosolische (GPx-1), die gastrointestinale (GPx-2) Glutathion-Peroxidase, die Plasma-GPx (GPx-3, pGPx)

und die Phospholipidhydroperoxid-GPx (GPx-4, PHGPx). Sie katalysieren die

Reduktion von Wasserstoffperoxid und organischen Hydroperoxiden, einschließlich

Lipidhydroperoxiden, zu den entsprechenden Alkoholen (Abbildung 2). Auf diese

Weise schützen sie die Zelle vor oxidativen Schäden durch reaktive

Sauerstoffverbindungen. Sie weisen ein breites Substratspektrum bezüglich der

Peroxide auf. Alle GPx haben Selenocystein in ihrem aktiven Zentrum, welches aus

einer katalytischen Triade aus Selenocystein, Glutamin und Tryptophan besteht

(Arthur, 2000; Brigelius-Flohé et al., 2002).

EINLEITUNG 8

E-Se- E-SeOH

E-Se-SGH2O

GSH

GSH

GSSG + H+

ROHROOH

E-Se- E-SeOH

E-Se-SGH2O

GSH

GSH

GSSG + H+

ROHROOH

Abbildung 2: Allgemeiner Reaktionsmechanismus von Glutathion-Peroxiden. GSH: reduziertes Glutathion, GSSG: oxidiertes Glutathion (modifiziert nach Birringer et al., 2002)

Thioredoxin-Reduktasen katalysieren die NADPH-abhängige Reduktion von Thioredoxin, welches an zahlreichen Redoxreaktionen der Zelle beteiligt ist.

Thioredoxine enthalten in ihrem aktiven Zentrum zwei Cystein-Gruppen, die in der

Disulfid- oder Thiolform vorliegen können. Außerdem können sie weitere Stoffe, wie

z.B. Wasserstoffperoxid, Selenit und Hydroperoxide reduzieren. Durch ihre

reduzierenden Eigenschaften haben sie Auswirkungen auf die Faltung von

Proteinen, die Redoxregulation von Transkriptionsfaktoren und die Steuerung der

Proliferation (Behne und Kyriakopoulos, 2001). Die Familie der Thyroxin-Deiodinasen enthält drei verschiedene Deiodinasen (Typ 1-3) und ist für die Aktivierung und den Abbau von Schilddrüsenhormonen von zentraler Bedeutung. Sie

katalysieren die Deiodierung von Thyroxin und Iodothyroninen, wobei der molekulare

Mechanismus nicht vollständig aufgeklärt ist (Köhrle, 2000). Das menschliche

Selenoprotein P enthält 10 Selenocysteine und es wird geschätzt, dass es ca. 50 % des im Plasma enthaltenen Selens enthält. Es wird vermutet, dass Selenoprotein P

für die Verteilung von Selen aus der Leber in Zielorgane und als extrazelluläres

Antioxidans von Bedeutung ist. Des Weiteren wird seine Beteiligung an der

Komplexierung von Schwermetallionen diskutiert (Burk et al., 2003; Papp et al.,

2007).

EINLEITUNG 9

2.1.4 Toxikologie

Die Toxizität von Selen hängt von der entsprechenden Selenverbindung ab und ist

im Allgemeinen eher gering. Anorganische Selenverbindungen gelten als toxischer

als organische Verbindungen (Barceloux, 1999). Die auftretenden toxischen Effekte

werden auf die Reaktivität des Selens gegenüber SH-Gruppen und die Induktion von

reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zurückgeführt (Yan und Spallholz, 1993; Stewart

et al., 1999; Vinceti et al., 2001). Obwohl die molekularen Mechanismen der

Selentoxizität noch unklar sind, scheint die Reaktion einiger Selenverbindungen mit

Glutathion, die zur Bildung von Selenotrisulfiden führt, eine wesentliche Rolle zu

spielen. Dies kann eine Depletion von Glutathion und somit eine Störung des

Redoxhaushaltes zur Folge haben (Vernie et al., 1979; Caffrey und Frenkel, 1991;

Yan und Spallholz, 1993; Shen et al., 2000). Des Weiteren wird die Bildung reaktiver

Sauerstoffspezies und damit verbunden oxidativer Stress als Ursache für die durch

Selen hervorgerufene Apoptose diskutiert (Kim et al., 2004; Drake, 2006). In-vitro

Untersuchungen zeigten eine Bildung von Superoxidradikal-Anionen durch

Selenverbindungen, die reduktiv unter Beteiligung von Glutathion zu

Hydrogenselenid umgesetzt werden (Spallholz et al., 2004). Durch die Reaktivität

anorganischer Selenverbindungen gegenüber Thiolen, wie z. B. Glutathion, werden

die Selenverbindungen in Hydrogenselenid überführt, welches mit Sauerstoff

reagieren und zur ROS-Produktion beitragen kann (Abbildung 3) (Seko et al., 1989;

Spallholz, 1997). Während die Reduktion von Selenit zu Selenodiglutathion ohne

enzymatische Katalyse stattfindet, werden die weiteren Reaktionen zur Bildung von

Selenid durch Glutathion-Reduktasen oder Thioredoxin-Reduktasen katalysiert

(Birringer et al., 2002).

SeO32- GSSeSG GSSeH H2Se Se0

2 O2•- + 2 H2O2 O2 + 2 OH-GSSGGSHGSSGGSHGSSG4 GSH

SeO32- GSSeSG GSSeH H2Se Se0

2 O2•- + 2 H2O2 O2 + 2 OH-GSSGGSHGSSGGSHGSSG4 GSH

Abbildung 3: Mögliche Bildung von Superoxidradikal-Anionen aus Selenit. (modifiziert nach Seko et al., 1989; Spallholz, 1997). SeO32-: Selenit, GSH: reduziertes Glutathion, GSSG: oxidiertes Glutathiondisulfid, H2Se: Hydrogenselenid, O2-•: Superoxidradikal-Anion,

Se0: elementares Selen.

EINLEITUNG 10

Außerdem können einige Selenverbindungen Thiole in Proteinen oxidieren und auf

diese Weise zu einer Inaktivierung von Enzymen führen (Kim et al., 2003). Neben

den beschriebenen Mechanismen werden zusätzlich toxische Wirkungen

beispielsweise auf das Immun- und Nervensystem, das endokrine System, die Haut

und die Leber beschrieben (zusammengefasst in Vinceti et al., 2001).

2.1.5 Untersuchte Selenverbindungen

Mit dem Ziel der Untersuchung direkter und indirekter genotoxischer Effekte wurden

in dieser Arbeit reduzierbares, anorganisches Natriumselenit und vollständig

reduziertes, organisches Selenomethionin eingesetzt (Abbildung 4). Wie in Kapitel

2.1.1 beschrieben, sind beide Selenverbindungen als Bestandteil von Lebensmitteln

oder Nahrungsergänzungsmitteln für die Ernährung des Menschen von Bedeutung.

Aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften wird Natriumselenit unter Beteiligung von

Glutathion zu Hydrogenselenid reduziert, während Selenomethionin enzymatisch,

ohne Beteiligung von Redoxreaktionen in den Zentralmetabolit überführt wird. Die

unterschiedlichen Redoxeigenschaften von Selenverbindungen spiegeln sich ebenso

in ihrer Interaktion mit Thiolen wider. Reduzierbare Selenverbindungen können Zink

aus Zinkfingerstrukturen freisetzen, während vollständig reduzierte

Selenverbindungen dazu nicht in der Lage sind (Blessing et al., 2004). Sowohl eine

Interaktion mit Zinkfingerstrukturen, eine Störung des vorwiegend durch Glutathion

bedingten Redoxstatus als auch eine verstärkte Bildung von reaktiven

Sauerstoffspezies können wesentliche zelluläre Mechanismen beeinflussen. Dazu

zählen die genomische Stabilität, die Zellzykluskontrolle, die Genexpression und die

Apoptose.

Natriumselenit Selenomethionin

-II+IVNa

NaSe

O

OO-

-

+

+

H3N

COO

Se

-

+

Natriumselenit Selenomethionin

-II+IVNa

NaSe

O

OO-

-

+

+

H3N

COO

Se

-

+

Abbildung 4: Strukturformeln von Natriumselenit und Selenomethionin.

EINLEITUNG 11

2.2 DNA-Schäden und ihre Reparatur

Nach Schätzungen finden pro Tag in einer menschlichen Zelle ca. 104 - 106 DNA-

Schadensereignisse statt. Ihre Ursachen können endogenen Ursprungs, wie z.B.

Replikationsfehler oder reaktive Sauerstoffspezies, sein. Oder sie können exogen

durch DNA-schädigende Agenzien aus der Umwelt verursacht werden. Das

Netzwerk der zellulären Antwort besteht im Wesentlichen aus der Schadenstoleranz,

dem Einleiten von Zellzyklusarresten und Apoptose sowie in Abhängigkeit des

Schadenstyps der Aktivierung verschiedener DNA-Reparaturwege. Somit stellen

DNA-Reparaturprozesse einen wichtigen Mechanismus der Aufrechterhaltung der

genomischen Stabilität dar und wirken der Entstehung von Mutationen entgegen. Die

Mechanismen der Doppelstrangbruchreparatur, das nichthomologe End-Joining und

die homologe Rekombination beseitigen DNA-Doppelstrangbrüche, die unter

anderem durch ionisierende Strahlung entstehen. Die Basenexzisionsreparatur

(BER) dient der Reparatur von Schäden an DNA-Basen als Folge von Alkylierung,

Desaminierung oder Oxidation. Durch Umweltmutagene, wie z.B. Benzo[α]pyren,

verursachte großräumige DNA-Addukte und UV-induzierte Photoläsionen werden

über den Weg der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) beseitigt. Zur Reparatur von

Basenfehlpaarungen sowie von Polymerasen eingefügte Nukleotid-Insertionen und

-Deletionen, wie sie bei der Replikation entstehen können, dient die Fehlpaarungs-

oder Mismatchreparatur (zusammengefasst in Friedberg, 2001, 2003). Dem Fokus

dieser Arbeit entsprechend werden im Folgenden einzelne Aspekte der DNA-

Schadensinduktion und der DNA-Reparatur eingehender erläutert.

2.2.1 Oxidative DNA-Schäden und die Basenexzisionsreparatur

Oxidative Schäden an zellulären Makromolekülen, wie Lipiden, Proteinen und der

DNA, werden in der Zelle durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) verursacht. Sie

können durch entzündliche Prozesse in der Zelle, ionisierende Strahlung,

langwelliges UV-Licht oder kontinuierlich als Nebenprodukte der aeroben Zellatmung

entstehen und werden über ein fein reguliertes Abwehrsystem abgebaut.

Enzymatische Abwehrmechanismen, wie Superoxiddismutasen, Peroxidasen und

Reduktasen sowie nicht-enzymatische Antioxidantien, wie Glutathion, Ascorbinsäure

und Carotinoide stellen die wesentlichen Bestandteile der zellulären Abwehr gegen

ROS dar, welche jedoch unvollständig ist. Durch das Gleichgewicht zwischen der

EINLEITUNG 12

chronischen ROS-vermittelten Induktion und Reparatur oxidativer DNA-Schäden

existiert in Zellen ein Grundschaden der zellulären DNA (Epe, 2002). Die Exposition

gegenüber exogenen Noxen, wie UVA-Strahlung oder redoxaktiven Chemikalien,

kann zu einer erhöhten Bildung von ROS oder zu einer Deaktivierung zellulärer

Detoxifizierungsmechanismen führen und in Folge dessen oxidativen Stress und

vermehrt auftretende oxidative Schäden von Makromolekülen hervorrufen. Durch

Interaktion von reaktiven Sauerstoffspezies mit der DNA entsteht ein vielfältiges

Spektrum an DNA-Schäden. Dabei stellt das prämutagene 8-Oxoguanin einen der

schwerwiegendsten oxidativen DNA-Basenschäden dar, da es sich bei der

Replikation mit Adenin paaren und somit Mutationen hervorrufen kann

(zusammengefasst in Friedberg, 2006).

Die Basenexzisionsreparatur dient der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität

und repariert oxidative DNA-Schäden, alkylierte DNA-Basen, Uracil und abasische

Stellen. Die BER besteht im Wesentlichen aus drei Schritten und wird durch Enzyme

der Familie der DNA-Glykosylasen eingeleitet. Substratspezifische Glykosylasen

erkennen die geschädigte Base und entfernen diese durch Hydrolyse der

N-glycosidischen Bindung zwischen Base und Zucker-Posphat-Rückgrat.

Anschließend hydrolysiert eine AP-Endonuklease die Phosphodiesterbrücke an der

5’-Position zur abasischen Stelle und das Desoxyribosephosphat wird an der 3’-

Position zur AP-Stelle durch eine Desoxyribosephosphatdiesterase abgespalten.

Dadurch entsteht eine Lücke von einem Nukleotid in 5’-Position zur abasischen

Stelle. Alternativ existieren Glykosylasen, welche die Glykosylaseaktivität mit einer

Endonuklease- oder 3’-Lyase-Aktivität vereinen. In der short-patch BER wird ein

Nukleotid durch die Polymerase ß eingefügt und ein Enzymkomplex aus DNA-Ligase

III, Pol ß und XRCC1 katalysiert die Ligation. Bei der long-patch BER werden durch

die Polymerase δ und ε bis zu 10 Nukleotide synthetisiert. Nachfolgend werden die

überschüssigen Desoxyriboseeinheiten durch das Zusammenspiel der Flap-

Endonuklease-1 und PCNA entfernt und die Reparatur durch die Ligase I vollendet

(zusammengefasst in Friedberg, 2006; Wilson und Bohr, 2007).

EINLEITUNG 13

2.2.2 Helixverzerrende DNA-Schäden und die Nukleotidexzisions-reparatur

Durch Umweltmutagene oder deren Metabolite verursachte großräumige bzw.

helixverzerrende DNA-Schäden werden durch die Nukleotidexzisionsreparatur aus

der DNA entfernt. In dieser Arbeit wurden zur Schädigung der DNA

(+)-anti-Benzo[α]pyrendiolepoxid, der reaktive Metabolit von Benzo[a]pyren, und

UVC-Strahlung eingesetzt. Aus diesem Grund werden im Folgenden zunächst

Benzo[α]pyrendiolepoxid (BPDE)- und UVC-induzierte DNA-Schäden beschrieben,

um anschließend auf den Mechanismus der Nukleotidexzisionsreparatur einzugehen.

2.2.2.1 BPDE-induzierte DNA-Schäden

Wegen ihrer Persistenz, Toxizität und ihrer ubiquitären Verbreitung zählen

Polyaromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) zu den bedeutendsten

Umweltschadstoffen. Sie entstehen durch unvollständige Verbrennungsprozesse

organischer Materialien und umfassen Verbindungen mit maximal sechs

kondensierten, meist aromatischen Ringen. Im Körper werden sie zu aromatischen

Elektrophilen metabolisiert, welche mit Purinbasen der DNA stabile Addukte bilden

können. Die Kanzerogenität vieler PAK ist bekannt, wobei Benzo[α]pyren (B[α]P) zu

den stärksten Kanzerogenen aus dieser Gruppe gehört und von der International

Agency for Research on Cancer als krebserregend für den Menschen eingestuft

wurde (IARC, 2008). Mit Ausnahme der beruflichen Expositionen stellen Tabakrauch

und Lebensmittel die Hauptexpositionsquellen für den Menschen dar. Dabei

stammen ca. 70 % der täglichen B[α]P-Aufnahme aus Lebensmitteln, wie Gemüse,

Fisch und Fleisch (Phillips, 1999). Die berufliche Exposition ist insbesondere bei

Schornsteinfegern und Arbeitern in Kokereien und Gasfabriken, bei der

Aluminiumherstellung, der Eisen- und Stahlerzeugung und in Gießereien besonders

hoch (Praml und Nowak, 1998).

B[α]P ist gut über den Magen-Darmtrakt, die Haut und die Lunge resorbierbar und

wird im Verlauf des menschlichen Fremdstoffmetabolismus zu einer Vielzahl

Metabolite umgesetzt (Abbildung 5). Der wahrscheinlich relevanteste Reaktionsweg

für die kanzerogene Wirkung von B[α]P ist die Bildung des ultimalen Kanzerogens

(+)-anti-BPDE ((+)-r-7,t-8-dihydroxy-t-9,10-epoxy-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyren)

und dessen Interaktion mit der DNA. BPDE bildet vor allem stabile DNA-Addukte an

EINLEITUNG 14

der N2-Position von Guanin. Infolge der damit verbundenen Helixverzerrung der DNA

werden die Replikation und Transkription inhibiert und Mutationen hervorgerufen

(Conney et al., 1994; Melendez-Colon et al., 1999). Als weitere Ursache für die

zytotoxische und potentiell mutagene Wirkung des B[α]P gilt weiterhin die Induktion

reaktiver Sauerstoffspezies über die Bildung von Chinonen. Aus B[α]P gebildete

Dihydrodiole werden durch eine Dehydrogenase in Katechole umgewandelt, die zu

Semichinonradikalen und o-Chinon autoxidieren und dabei ROS freisetzen.

o-Chinone können instabile DNA-Addukte bilden oder werden durch nicht-

enzymatische Reduktion in Katechole überführt, welche durch Oxidation erneut zur

Produktion von ROS beitragen können (zusammengefasst in Bolton et al., 2000).

Des Weiteren wird angenommen, dass an der C6-Position des B[α]P Radikal-

Kationen gebildet werden, die instabile DNA-Addukte und infolgedessen potentiell

mutagene AP-Stellen hervorrufen (zusammengefasst in Cavalieri und Rogan, 1995).

Über die Bildung von Semichinonen können diese Radikal-Kationen außerdem zur

ROS-Produktion beitragen (Joseph und Jaiswal, 1994).

instabile DNA-Addukte

ROS


ROS

Cytochrom P450

Benzo[a]pyren

erweiterteChinone

Semichinone

Autoxidation

Reduktion

HydrolyseAutoxidation

Cytochrom P450(Ein-Elektronen-Oxidation)

•+

8

10

12 1

3

7 6

9 Cytochrom P450Epoxidhydrolasen

Benzo[a]pyren

erweiterteChinone

Semichinone

Autoxidation

Reduktion



•+ ••+

8

10

12 1

3

7 6

9

8

10

12 1

3

7 6

910

12 1

3

7 6

9

12 1

3

7 6

9

ROS

2

45

11

SemichinonradikalanionSemichinonradikalanion

HO

OH

OO

Cytochrom P450

(+)-anti-BPDE

O2

Katechol

o-Chinon

HOHO

O

HOHO

HO

NHN

NHN

N

O

DNA

HO

HO

O2-•

O2-•

H2O2

O

O

-

HO

OH

HO

OH

OO

Cytochrom P450

(+)-anti-BPDE

O2

Dihydrodiol-Dehydrogenase

Katechol

o-Chinon

HOHO

HOHOHO

O

HOHO

HO

NHN

NHN

N

O

DNA

HO

HO

O2-•O2-•

O2-•O2-•

H2O2

O

O

- O

O

- O

O

O

O

-

N2-Guaninaddukt

NADPH

NADP+

OH

HO

OH

GS

GSH-Konjugat

GSTGSH


ROS


ROS

Cytochrom P450

Benzo[a]pyren

erweiterteChinone

Semichinone

Autoxidation

Reduktion



•+ ••+

8

10

12 1

3

7 6

9

8

10

12 1

3

7 6

9 Cytochrom P450Epoxidhydrolasen

Benzo[a]pyren

erweiterteChinone

Semichinone

Autoxidation

Reduktion



••+ ••+

8

10

12 1

3

7 6

910

12 1

3

7 6

9

8

10

12 1

3

7 6

9

12 1

3

7 6

910

12 1

3

7 6

9

12 1

3

7 6

9

ROS

2

45

11

SemichinonradikalanionSemichinonradikalanion

HO

OH

HO

OH

OO

Cytochrom P450

(+)-anti-BPDE

O2

Katechol

o-Chinon

HOHO

HOHOHO

O

HOHO

HO

NHN

NHN

N

O

DNA

HO

HO

O2-•O2-•

O2-•O2-•

H2O2

O

O

- O

O

- O

O

O

O

-

HO

OH

HO

OH

OO

Cytochrom P450

(+)-anti-BPDE

O2

Dihydrodiol-Dehydrogenase

Katechol

o-Chinon

HOHOHO

HOHOHO

O

HOHO

HO

NHN

NHN

N

O

DNA

HO

HO

O2-•O2-•

O2-•O2-•

H2O2

O

O

- O

O

O

O

- O

O

O

O

- O

O

O

O

-

N2-Guaninaddukt

NADPH

NADP+

OH

HO

OH

GS

OH

HO

OH

GS

GSH-Konjugat

GSTGSH

Abbildung 5: Metabolismus von Benzo[α]pyren (modifiziert nach Conney et al., 1994; Joseph und Jaiswal, 1994; Cavalieri und Rogan, 1995; Bolton et al., 2000).

EINLEITUNG 15

An der Detoxifizierung von (+)-anti-BPDE und seinen Metaboliten sind vor allem

Glutathion-S-transferasen (GST), UDP-Glucuronosyltransferasen und

Sulfotransferasen beteiligt. Die GST-katalysierte Konjugation an Glutathion als

Hauptweg der metabolischen Inaktivierung von (+)-anti-BPDE wird in Kapitel 2.3

beschrieben.

2.2.2.2 UV-induzierte DNA-Schäden

UV-Strahlung, deren Hauptquelle für die menschliche Exposition die Sonne ist, wird

in die drei Wellenlängenbereiche UVA (315 bis 400 nm), UVB (280 bis 315 nm) und

UVC (100 bis 280 nm) unterteilt. Für die Exposition des Menschen sind

ausschließlich UVA- und UVB-Strahlung relevant, die mit einem Anteil von 95 bzw.

5 % die Erde erreichen. UVC-Strahlung wird dagegen von der Ozonschicht

vollständig resorbiert. Das verursachte Schadensspektrum variiert mit der

Wellenlänge. UVA-Strahlung führt hauptsächlich zu oxidativen Basenschäden,

während UVB überwiegend und UVC-Strahlung fast ausschließlich DNA-

Photoprodukte induziert. UVC-Strahlung führt hauptsächlich durch [2+2]-Zyklo-

addition zur Bildung von DNA-helixverzerrenden Cyclobutanpyrimidindimeren (CPD)

und 6-4-Photoprodukten (6-4-PP). Dabei werden durchschnittlich dreimal mehr CPD

als 6-4-PP induziert (Ravanat et al., 2001). Beide Verbindungen sind zytotoxisch und

können zu Mutationen führen. Obwohl 6-4-PP in geringerem Maße auftreten, sind sie

aufgrund ihres höheren mutagenen Potentials von großer biologischer Bedeutung.

Die eingesetzte Wellenlänge von 254 nm stimmt nahezu mit dem

Absorptionsmaximum der DNA überein, wird nur ineffizient von Proteinen absorbiert

und führt infolgedessen zu einer relativ spezifischen Photoreaktion mit der DNA

(IARC, 1992; Brendler-Schwaab et al., 2004; Friedberg, 2006).

N

NH

O

O

N

NH

O

O

DNA DNA

N

NH

O

O

N

NH

O

O

DNA DNA

N

NH

O

O

OH

N

NH

O

DNADNA

UVC UVC

CPD 6-4-PP

N

NH

O

O

N

NH

O

O

DNA DNA

N

NH

O

O

N

NH

O

O

DNA DNA

N

NH

O

O

OH

N

NH

O

DNADNA

UVC UVC

CPD 6-4-PP

Abbildung 6: Bildung von Cyclobutanpyrimidindimeren (CPD) und 6-4-Photoprodukten (6-4-PP) am Beispiel zweier benachbarter Thyminbasen (Ravanat et al., 2001).

EINLEITUNG 16

2.2.2.3 Nukleotidexzisionsreparatur

Die Nukleotidexzisionsreparatur ist ein komplexer Reparaturmechanismus mit einer

breiten Substratspezifität, die sowohl UV-induzierte DNA-Läsionen als auch durch

andere Umweltmutagene induzierte Schäden einschließt. Die biologische Bedeutung

der NER wird anhand der autosomal rezessiven Krankheiten Xeroderma

Pigmentosum (XP), Cockayne-Syndrom (CS) und der Trichothiodystrophie deutlich.

Die NER wird in zwei Reparaturpfade unterteilt, die sich vor allem in der

Schadenserkennung unterscheiden. Die globale genomische Reparatur (GGR)

bezieht sich auf die Reparatur von nichttranskribierter DNA und umfasst somit den

Großteil der genomischen DNA. Bei aktiv transkribierten Genen werden Schäden

durch die transkriptionsgekoppelte Reparatur (TCR) aus der DNA entfernt. Im Ablauf

der NER folgen auf die Schadenserkennung die Schritte der DNA-Entwindung, der

Inzision und Schadensentfernung sowie der Reparatursynthese. Vollendet wird die

Reparatur durch die Ligation. Der in die GGR und TCR unterteilte Ablauf der

Nukleotidexzisionsreparatur ist in Abbildung 7 dargestellt.

EINLEITUNG 17

Globale genomische Reparatur Transkriptionsgekoppelte Reparatur

DNA-Ligase I

Schadenserkennung

Reparatursynthese

Schadensentfernung

DNA-Entwindung

XPC-hHR23B

RNA-Polyerase II

PCNA, RFC DNA-Polymerase ε/δ

ERCC1-XPF XPG

TFIIH (XPB, XPD)

XPG

RPA

XPA

CSB

CSA, DDB1

DDB2 (XPE)

DDB1

Globale genomische Reparatur Transkriptionsgekoppelte Reparatur

DNA-Ligase I

Schadenserkennung

Reparatursynthese

Schadensentfernung

DNA-Entwindung

XPC-hHR23B

RNA-Polyerase II

PCNA, RFC DNA-Polymerase ε/δ

ERCC1-XPF XPG

TFIIH (XPB, XPD)

XPG

RPA

XPA

CSB

CSA, DDB1

DDB2 (XPE)

DDB1

Abbildung 7: Mechanismus der humanen Nukleotidexzisionsreparatur (modifiziert nach Volker et al., 2001; Sugasawa, 2008). Dargestellt sind die Proteine mit bekannter Funktion für die NER.

In-vitro Versuche zeigten eine Beteiligung von mindestens 30 Proteinen, wobei der

Mechanismus der NER in Säugerzellen weitere Faktoren benötigt und noch nicht

vollständig aufgeklärt ist (Friedberg, 2006; Thoms et al., 2007). Zur

Schadenserkennung während der GGR bildet XPC einen heterotrimeren Komplex

mit dem humanen Homolog von RAD23B (hHR23B) und Centrin 2. Dies stabilisiert

die Bindung an partiell verzerrte, teilweise einzelsträngige DNA. Es wird

angenommen, dass aufgrund der schwächeren Helixverzerrung durch CPD diese

weniger gut von XPC erkannt werden und ihre Reparatur langsamer ist, als die von

EINLEITUNG 18

6-4-PP. Zur Erkennung von CPD dient zusätzlich das UV-damaged DNA-binding

protein (UV-DDB) mit seinen Untereinheiten DDB1 und DDB2. Dabei ersetzt

UV-DDB nicht die Schadenserkennung durch XPC, sondern begünstigt diese

(zusammengefasst in Sugasawa, 2008). UV-DDB ist nicht nur an der Erkennung von

CPD, sondern auch 6-4-PP, AP-Stellen und fehlgepaarter DNA beteiligt (Moser et al.,

2005; Wittschieben et al., 2005). Die Schadenserkennung während der TCR verläuft

unabhängig von XPC und UV-DDB. Stattdessen erfolgt die Erkennung des Schadens

durch eine Transkriptionshemmung der RNA-Polymerase II aufgrund der Verzerrung

der DNA-Helix. Infolge dessen kommt es zur Assoziation weiterer Reparaturproteine,

wie CSA, CSB und DDB1.

Nach der Schadenserkennung erfolgt um den Schaden eine initiale, lokale

Entwindung der DNA durch den basalen Transkriptionsfaktors IIH (TFIIH), der aus

zehn Untereinheiten, darunter die Helikasen XPB und XPD, besteht. An der

Rekrutierung des TFIIH sind einerseits XPC und andererseits die RNA-Polymerase

II, CSA und CSB beteiligt. Zur Bildung des Präinzisionskomplexes, der partiell

entwundene DNA enthält, lagern sich weitere Proteine an. Darunter befinden sich die

3’-Endonuklease XPG, der XPA-RPA Proteinkomplex und die 5’-Endonuklease XPF-

ERCC1. Das Zinkfingerprotein XPA bindet an DNA, ist an der Protein-Protein-

Interaktion zu TFIIH und RPA beteiligt und ist für die Endonukleaseaktivität von

ERCC1 unerlässlich. Anschließend erfolgt die Exzision eines Oligonukleotids mit der

Länge von 24 bis 32 Nukleotiden durch XPG und XPF-ERCC1. Die DNA-

Neusynthese in der entstandenen Lücke wird durch die Polymerasen δ und ε in

Gegenwart von PCNA und RPA katalysiert, bevor die DNA-Ligase I den

Reparaturprozess beendet (zusammengefasst in Sugasawa, 2008). Obwohl Details

des molekularen Mechanismus der TCR noch unklar sind, gilt die TCR als der

schnellere und effizientere Reparaturpfad der NER, welcher zu einer schnellen

Wiedererlangung der transkriptionellen Aktivität führt (zusammengefasst in Mellon,

2005).

2.2.2.4 Das Xeroderma Pigmentosum Protein A

Xeroderma Pigmentosum-Patienten zeigen eine gesteigerte Sensitivität gegenüber

UV-Licht sowie eine um mehr als 1000fach gesteigerte Prädisposition gegenüber

Hautkrebs. Ursache dafür ist ein Defekt in einem Gen der XP-Komplementations-

gruppen A bis G oder V (Thoms et al., 2007). Bei dem 273 Aminosäuren langen

EINLEITUNG 19

XPA-Protein handelt es sich um ein Zinkfingerprotein, in dessen Zinkfingerdomäne

Zink durch vier Cysteine (Cys105, Cys108, Cys126 und Cys129) komplexiert wird

(Buchko et al., 1998). Die Substitution eines der vier an der Zinkbindung beteiligten

Cysteine führt zu einem Funktionsverlust von XPA und einem fast vollständigem

Erliegen der NER (Miyamoto et al., 1992).

Abbildung 8: Minimale Bindungsdomäne (98-210) und Zinkfingerdomäne (XPAzf, AS 101-137) von XPA (Ikegami et al., 1998; Bal et al., 2003).

XPA-defiziente Zellen zeigen im Gegensatz zu XPA-profizienten Zellen keine NER

Kapazität und infolge dessen eine hohe Sensitivität gegenüber UV-induzierten DNA-

Schäden (siehe Abbildung 9) (Tanaka et al., 1990; Satokata et al., 1993). In der

Vergangenheit wurden XPA-defizienten Zelllinien aus verschiedenen Spendern

isoliert, von denen vor allem die drei Zelllinien XP12RO, XP2OS und XP12BE in

Studien eingesetzt werden. XPA-/- Mausmodelle bestätigen die hohe Sensitivität

gegenüber UV-Strahlung und chemischen Mutagenen (de Vries et al., 1997a; de

Vries et al., 1997b; Bol et al., 1998; Ide et al., 2000; Tanaka et al., 2001). Dies

verdeutlicht die für die Nukleotidexzisionsreparatur essentielle Bedeutung des XPA-

Proteins. Wie bereits beschrieben ist XPA im Verlauf der NER an der Bildung des

Präinzisionskomplexes beteiligt (Volker et al., 2001; Sugasawa, 2008).

EINLEITUNG 20

XPA knock-in Zellen (XPA+):

• Überexpression von XPA

• NER profizient: Reparatur UV-induzierter DNA-Schäden

• normale Sensitivität gegenüber UV-Strahlung

XPA-defiziente Zellen (XPA-):

• G-zu-C-Transversion im XPA-Gen führt zum vorzeitigen Transkriptionsstopp

• NER-defizient: keine Reparatur UV-induzierter DNA-Schäden

• hohe Sensitivität gegenüber UV-Strahlung

SV40-

Knock-in von XPAC

Transformation

XPA knock-in Zellen (XPA+):

• Überexpression von XPA

• NER profizient: Reparatur UV-induzierter DNA-Schäden

• normale Sensitivität gegenüber UV-Strahlung

XPA-defiziente Zellen (XPA-):

• G-zu-C-Transversion im XPA-Gen führt zum vorzeitigen Transkriptionsstopp

• NER-defizient: keine Reparatur UV-induzierter DNA-Schäden

• hohe Sensitivität gegenüber UV-Strahlung

SV40-

Knock-in von XPAC

Transformation

Abbildung 9: Ursprung und Eigenschaften XPA-defizienter und XPA knock-in Zellen (modifiziert nach Tanaka et al., 1990; Satokata et al., 1993; Camenisch et al., 2006). XPAC:

Xeroderma pigmentosum complementation group A correcting gene.

2.3 Glutathion

Glutathion (GSH) ist ein in allen Organismen ubiquitär vorkommendes Tripeptid,

γ-L-Glutamyl-L-Cysteinyl-L-Glycin, welches an einer Vielzahl zellulärer Funktionen

beteiligt ist (Abbildung 10). Die Synthese erfolgt intrazellulär aus den entsprechenden

Aminosäuren in zwei aufeinander folgenden ATP-abhängigen Reaktionen. Zunächst

erfolgt die Peptidbindung zwischen Glutamat und Cystein, welche durch die

γ-Glutamylcystein-Synthetase katalysiert wird. Anschließend katalysiert die

Glutathionsynthetase die Kondensation der Carboxylgruppe des Cysteins mit der

Aminogruppe des Glycins. Die erste Reaktion stellt den limitierenden Syntheseschritt

dar, der durch GSH rückkoppelnd gehemmt und durch die Verfügbarkeit der

Aminosäuren limitiert wird (zusammengefasst in Sies, 1999; Lu, 2000).

EINLEITUNG 21

γ-Glu Cys Gly

NO

O

HH

O

NH

OH

OSH

NH2

O

NO

O

HH

O

NH

OH

OS

NH2

O

S

O

NH

HO

O

NH

O O

OH

NH2

GlutathiondisulfidGlutathion

γ-Glu Cys Gly

NO

O

HH

O

NH

OH

OSH

NH2

O

NO

O

HH

O

NH

OH

OS

NH2

O

S

O

NH

HO

O

NH

O O

OH

NH2

GlutathiondisulfidGlutathion Abbildung 10: Struktur von Glutathion und Glutathiondisulfid. γ-Glu: Glutaminsäure; Cyc: Cystein, Gly: Glycin.

Das niedermolekulare Tripeptid ist das vorherrschende zelluläre Thiol und kommt in

millimolaren Konzentrationen vor. Gemeinsam mit dem oxidierten Glutathiondisulfid

(GSSG), welches durch Oxidation und Ausbildung einer Disulfidbrückenbindung

gebildet wird, stellt es das wichtigste Redox-Puffersystem der Zelle dar. Die

intrazelluläre Konzentration an oxidiertem Glutathiondisulfid beträgt in der Regel

maximal 1 % des reduzierten Glutathions (Meister und Anderson, 1983; Deneke und

Fanburg, 1989). Glutathion ist an der Metabolisierung von Fremdstoffen beteiligt und

beeinflusst den Redoxstatus der Zelle. Somit beeinflusst es weitere wichtige

Prozesse, wie die Signaltransduktion, die Genexpression, die Zellproliferation und

die Apoptose (zusammengefasst in Sies, 1999). Im Folgenden wird die Bedeutung

von Glutathion im Fremdstoffmetabolismus und als Elektronendonator bei der

enzymatischen Reduktion von Peroxiden näher beschrieben (Abbildung 11).

Glutathion ist für den Abbau von reaktiven Sauerstoffspezies endogenen oder

exogenen Ursprungs von großer Bedeutung. Es fungiert als Elektronendonator bei

der enzymatischen Reduktion von Peroxiden, welche durch die Glutathion-

Peroxidase (GPx) katalysiert wird. Dabei kommt es als Folge der Oxidation von GSH

zur Bildung von GSSG. Unter physiologischen Bedingungen ist das Verhältnis von

GSH zu GSSG fein reguliert. Glutathiondisulfid wird in einer durch

Glutathionreduktasen katalysierten Reaktion unter Verbrauch von NADPH zu

reduziertem Glutathion regeneriert. Die Aufrechterhaltung eines optimalen

Verhältnisses von GSH zu GSSG ist für die Zelle von essentieller Bedeutung, da

eine Verschiebung des Gleichgewichtes zu Gunsten von GSSG die Gefahr der

oxidativen Schädigung von Proteinen, Lipiden und der DNA erhöht (Townsend et al.,

2003).

EINLEITUNG 22

Xenobiotika (X)

GSH-X-Konjugat

2 GSH

H2O + ROH

ROOH

GSSG NADPH/H+

NADP+

GSTGSH GRGPx

Abbau von Peroxiden:Fremdstoffmetabolismus:

Xenobiotika (X)

GSH-X-Konjugat

2 GSH

H2O + ROH

ROOH

GSSG NADPH/H+

NADP+

GSTGSH GRGPx

Abbau von Peroxiden:Fremdstoffmetabolismus:

Abbildung 11: Rolle von Glutathion im Fremdstoffmetabolismus und als Antioxidans (Sies, 1999). GSH: reduziertes Glutathion, GSSG: Glutathiondisulfid, GST: Glutathion-S-transferase, GPx: Glutathion-Peroxidase, GR: Glutathionreduktase, NADPH/H+:

Nicotinamidadenin-dinucleotidphosphat (reduzierte Form); NADP+: Nicotinamidadenin-

dinucleotidphosphat (oxidierte Form).

Im Zuge der Metabolisierung von Fremdstoffen erfolgt unter anderem in der Phase II

Reaktion eine Konjugation von unpolaren und elektrophilen Xenobiotika an

Glutathion. Diese Reaktion wird durch Enzyme der Glutathion-S-Transferase (GST)

Familie katalysiert und entspricht in der überwiegenden Anzahl der Fälle einer

Detoxifizierung der Fremdstoffe. Für die Inaktivierung von

(+)-anti-Benzo[α]pyrendiolepoxid gilt die GST-katalysierte Konjugation an reduziertes

Glutathion als wichtigster enzymatischer Mechanismus. Sie wirkt der toxischen

Wirkung von BPDE entgegen (Abbildung 12) (Robertson et al., 1986; Hu et al.,

1996).

EINLEITUNG 23

OH

HO

HO

N N

N N

O

NH

DNA

OH

O

OH

OH

GS

OH

OH

GSH, GST

Bildung eines N2-Guanin-Adduktes Konjugation an Glutathion

BPDE-DNA-Addukt BPDE-GSH-Konjugat

(+)-anti-BPDE

DNA

weitere Reaktionswege

OH

HO

HO

N N

N N

O

NH

DNA

OH

O

OH

OH

GS

OH

OH

OH

HO

HO

N N

N N

O

NH

DNA

OH

O

OH

OH

GS

OH

OH

GSH, GST

Bildung eines N2-Guanin-Adduktes Konjugation an Glutathion

BPDE-DNA-Addukt BPDE-GSH-Konjugat

(+)-anti-BPDE

DNA

weitere Reaktionswege

Abbildung 12: (+)-anti-Benzo[α]pyrendiolepoxid - Bildung von BPDE-DNA-Addukten und enzymatische Detoxifizierung. GSH: reduziertes Glutathion, GST: Glutathion-S-transferase.

Glutathion-S-transferasen katalysieren die Konjugation von reduziertem Glutathion

an eine Vielzahl von Elektrophilen endogenen oder exogenen Ursprungs. Die Familie

der GST wird in sieben Klassen unterteilt, von denen in Säugerzellen die Alpha

(GSTA), Mu (GSTM) und Pi (GSTP) Klassen am häufigsten exprimiert werden

(Sheehan et al., 2001). Die humanen Isoenzyme GSTM-1, GSTP1 und GSTA1

besitzen die höchste katalytische Aktivität zur Konjugation von (+)-anti-BPDE

(Sundberg et al., 2002). Ein wichtiger Transkriptionsfaktor für die basale und

induzierbare Genexpression der Glutathion-S-transferasen ist Nrf2 (nuclear factor

E2-related factor) (Hayes et al., 2000; Ramos-Gomez et al., 2001). Nrf2 wird von

keap1 (kelch-like ECH-associated protein 1) im Cytosol verankert und translokalisiert

nach Einwirkung elektrophiler oder oxidativer Stimuli in den Kern. Dort bindet Nrf2 an

antioxidativ-responsive Elemente (ARE), welche sich in der regulatorischen Region

der Zielgene befinden. Daneben wurden weitere Bindungsstellen für

Transkriptionsfaktoren, wie z.B. C/EBPß, NF-κB und AP-1, identifiziert. Deren

Funktionen sowie die transkriptionelle Regulation der einzelnen Klassen der

Glutathion-S-transferasen sind noch nicht vollständig aufgeklärt (zusammengefasst

in Coles und Ketterer, 1990; Hayes et al., 2005; Pool-Zobel et al., 2005).

FRAGESTELLUNG 24

3 FRAGESTELLUNG Selen ist für den Menschen ein essentielles Spurenelement, welches mit der

Nahrung und in Form von Nahrungsergänzungsmitteln aufgenommen wird. Aufgrund

der antioxidativen Eigenschaften der Selenoproteine, insbesondere der Glutathion-

Peroxidasen und der Thioredoxin-Reduktasen, wird Selen eine antikanzerogene

Wirkung zugesprochen (Whanger, 2004; Letavayova et al., 2006). Außerdem wurde

als Mechanismus der Steigerung der genomischen Stabilität eine Stimulation von

DNA-Reparaturprozessen postuliert (Seo et al., 2002; Fischer et al., 2007).

Epidemiologische Studien zur Auswirkung einer erhöhten Selenversorgung auf die

Tumorinzidenz zeigen bisweilen ein uneinheitliches Bild. Insbesondere die

umfangreichste Nutritional Prevention of Cancer Studie zeigte sowohl inverse als

auch direkte Korrelationen einiger Tumorarten (Clark et al., 1996; Duffield-Lillico et

al., 2002). Neben den antioxidativen Eigenschaften sind prooxidative Effekte einiger

Selenverbindungen bekannt. Diese scheinen von der chemischen Struktur und dem

daraus resultierenden zellulären Metabolismus der Verbindungen abhängig zu sein.

Anhand von reduzierbarem Natriumselenit und vollständig reduziertem

Selenomethionin, die einem unterschiedlichen zellulären Metabolismus unterliegen,

soll zum einen deren direkte Genotoxizität anhand der Induktion oxidativer DNA-

Schäden und der Beeinflussung des Redoxhaushaltes in A549 Zellen untersucht

werden. Außerdem sollen die indirekten genotoxischen Wirkungen der beiden

Selenverbindungen anhand der Interaktion mit Umweltmutagenen in intakten Zellen

aufgeklärt werden. Dabei soll einerseits die Reparatur UVC-induzierter DNA-

Photoläsionen untersucht werden. Andererseits steht die Induktion und Reparatur

von (+)anti-Benzo[α]pyrendiolepoxid (BPDE), dem ultimalen Kanzerogen von

Benzo[α]pyren, sowie die Beeinflussung der Detoxifizierung von BPDE im

Vordergrund. Als mögliche Ursache der indirekten Genotoxizität soll die Interaktion

von Natriumselenit und Selenomethionin mit der Zinkfingerdomäne des DNA-

Reparaturproteins Xeroderma Pigmentosum Proteins A (XPA) untersucht werden.

Die Ausbildung des Zinkfingers und demzufolge die Aktivität des XPA- Proteins ist für

die Nukleotidexzisionsreparatur von essentieller Bedeutung. Sowohl die

Zinkfreisetzung als auch die Verminderung der DNA-Bindungsfähigkeit von XPA wird

durch die Redoxeigenschaften einiger Selenverbindungen hervorgerufen (Blessing et

al., 2004).

MATERIAL UND METHODEN 25

4 MATERIAL UND METHODEN Eine Zusammenstellung aller verwendeten Chemikalien, Lösungen und Puffer sowie

der benutzten Geräte und Verbrauchsmaterialien befindet sich im Anhang.

4.1 Zellkultur und Behandlung der Zellen

4.1.1 Zelllinien

Bei den in dieser Arbeit eingesetzten adhärent wachsenden Zelllinien handelte es

sich um die humane Lungenadenokarzinomzellen der Linie A549, humane XPA-

defiziente SV40-transformierte Fibroblasten (XPA-) und daraus entstandene XPA

knock-in Fibroblasten (XPA+). Die XPA- Zellen, genauer XP2OS, entstammen einem

weiblichen asiatischen Spender mit einem Gendefekt im XPA-Gen und daraus

resultierender schwerwiegender Xeroderma Pigmentosum Erkrankung. Es liegt eine

G zu C Transformation vor, die zur frühzeitigen Beendigung der Translation führt

(Satokata et al., 1990; Tanaka et al., 1990). Die XPA+ Zellen, genauer XP2OS-

pCAH19WS, sind durch Transfektion der cDNA des XPAC Gens (Xeroderma

Pigmentosum complementation group A Correcting gene) aus XPA- Zellen

entstanden und zeigen dadurch im Gegensatz zu den XPA- Zellen eine normale

Sensitivität gegenüber UV-Licht (Levy et al., 1995) (siehe Abbildung 9).

Die Zellen wachsen als Monolayer in Zellkulturschalen bei 37 °C, 5 % CO2 und 100

% Luftfeuchtigkeit. Als Kulturmedium für die A549 Zellen wurde DMEM (1000 mg/l)

mit einem Zusatz von 10 % FKS, Penizillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 µg/ml)

verwendet. XPA- und XPA+ Zellen wurden in DMEM mit 4500 mg/l Glukose mit

einem Zusatz von 15 % FKS, 100 µM nicht-essentielle Aminosäuren, Penizillin

(100 U/ml) und Streptomycin (100 µg/ml) kultiviert. Die Zellen wurden regelmäßig

mittels PCR auf Mykoplasmenkontamination untersucht. Die Lagerung der Zellen

erfolgte in flüssigem Stickstoff bei –196 °C in einem Einfriermedium aus 90 % FKS

und 10 % DMSO.

4.1.2 Zellkultur

Sämtliche Zellkulturarbeiten wurden unter einer Sicherheitswerkbank durchgeführt.

Mediumflaschen wurden nach dem Erwärmen im Wasserbad auf 37 °C mit 70%igem


Ethanol abgewischt und nach dem Öffnen unter der Sterilbank abgeflammt. Die

verwendeten Glaspipetten wurden bei 180 °C für 4 Stunden heißsterilisiert.

Kunststoffpipettenspitzen und Flaschen wurden bei 120 °C für 20 Minuten bei 3 atm

autoklaviert.

Alle 3 bis 4 Tage wurden die Zellen in eine neue Zellkulturschale oder -flasche mit

frischem Medium überführt (Passagieren). Dazu wurde das Kulturmedium abgesaugt

und die Schale zunächst mit Trypsin gewaschen. Nach dem Absaugen wurde erneut

Trypsin hinzu pipettiert, 30 Sekunden geschwenkt, das Trypsin abgesaugt und die

Schale für 2-3 Minuten in den Brutschrank gestellt. Nach Zugabe von frischem

Medium wurden die Zellen mit einer Pipette vereinzelt. Die Bestimmung der Zellzahl

erfolgte mit dem automatischen Zellzählgerät (Casy). Eine entsprechende Menge der

Zellsuspension wurde in eine neue Zellkulturschale mit frischem Medium gegeben,

die Schale zur Verteilung der Zellen hin und her bewegt und im Brutschrank

aufbewahrt.

4.1.3 Inkubationslösungen

Zur Inkubation der Zellen mit Natriumselenit, Selenomethionin oder

Buthioninsulfoximin (BSO) wurden aus sterilfiltrierten Stammlösungen (10 bzw. 100

mM) durch Verdünnen geeignete Arbeitslösungen hergestellt und diese in

entsprechender Menge in das Kulturmedium pipettiert. Zur Behandlung mit Menadion

wurde eine 10 mM Stammlösung in DMSO hergestellt und diese in entsprechender

Menge ins Medium pipettiert. Als Kontrolle diente in diesem Fall Dimethylsulfoxid.

Zur Inkubation der Zellen mit dem reaktiven Metaboliten (+)-anti-BPDE

((+)-anti-Benzo[α]pyren-7,8-diol-9,10-epoxid) wurde die bei -80 °C gelagerte

Stammlösung (1 mg/ml in THF/5 % Triethylamin) unmittelbar vor der Verwendung in

THF/0,5 % Triethylamin verdünnt und im Verhältnis 1:1000 in das Medium pipettiert,

so dass die Lösungsmittelkonzentration immer 0,1 % beträgt. Nach 1 h wurde die

Inkubation durch Waschen mit FKS-freiem Medium beendet.

4.2 Bestimmung der Aktivität der Glutathion-Peroxidase

Die Aktivität der Glutathion-Peroxidase (GPx) wurde nach einer von Paglia et al.

(1967) entwickelten Methode bestimmt. Die Glutathion-Peroxidase katalysiert die


Reaktion zwischen Kumolhydroperoxid und GSH. Das dabei freigesetzte GSSG wird

durch im Reaktionsansatz enthaltene Glutathion-Reduktase zu GSH reduziert.

Gleichzeitig wird NADPH zu NADP+ oxidiert, was mit einer Verminderung der

Absorption bei 412 nm verbunden ist (Abbildung 13). Der Abfall der Absorption ist

dabei proportional zur GPx-Aktivität.

GSHOH2

CH3OOH

CH3

CH3

CH3

OH GSSG

GSSG NADPH H+ GR

GSH NADP

GPx2+

-+

+ ++ + Abbildung 13: Bestimmung der GPx-Aktivität anhand der Reduktion von Kumolhydroperoxid (Paglia und Valentine, 1967). GSH: Glutathion; GSSG: Glutathiondisulfid; GPx: Glutathion-Peroxidase; NADPH/H+: Nicotinamidadenin-

dinucleotidphosphat (reduzierte Form); NADP+: Nicotinamidadenindinucleotidphosphat

(oxidierte Form); GR: Glutathionreduktase.

4.2.1 Versuchsdurchführung

In 100 mm Zellkulturschalen wurden 2x106 A549 Zellen ausgesät und nach 24 h mit

Natriumselenit oder Selenomethionin inkubiert. Nach weiteren 24 h wurden die

Zellen zur Entfernung von Mediumresten mit Lysepuffer gespült und durch

Abschaben in 100 µl Lysepuffer geerntet. Nach 20minütiger Inkubation auf Eis

wurden die Lysate 15 min bei 10000 g (4 ºC) zentrifugiert und die Überstände zur

Enzymaktivitätsbestimmung eingesetzt. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte nach den

Herstellerangaben des Glutathion-Peroxidase Test Kits (Cayman Chemical) als

Doppelbestimmung in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte. Die Angabe der mit Hilfe des

molaren Extinktionskoeffizienten von NADPH (6,22 nM-1•cm-1) errechneten GPx-

Aktivität erfolgt in Bezug zur Proteinmenge. Diese wurde nach Bradford (1976)

quantifiziert.

4.2.2 Proteinbestimmung nach Bradford

Die Proteinbestimmung nach Bradford (1976) beruht auf der Verschiebung des

Absorptionsmaximas des im Bradfordreagenz enthaltenen Farbstoffes Coomasie

Brilliant Blau G 250 durch Bindung an Proteine bei saurem pH von 465 auf 595 nm.


20 µl einer geeigneten Probenverdünnung wurden als Doppelbestimmung in eine

96-Loch-Mikrotiterplatte pipettiert. Nach Zugabe von 180 µl Bradfordfärbelösung

(BioRad-Reagenz) wurde die Absorption bei 595 nm nach genau fünf Minuten in

einem Mikrotiterplattenlesegerät (TECAN SpectraFluor) bestimmt. Die Berechnung

der Proteinkonzentration erfolgte anhand einer externen Kalibriergerade mit

Rinderserumalbumin (BSA) im Bereich von 0-150 µg/ml, welche auf jeder Lochplatte

mitgeführt wurde.

4.3 Bestimmung der Koloniebildungsfähigkeit

Zur Untersuchung der Koloniebildungsfähigkeit wurden jeweils 1x106 Zellen in eine

100 mm Zellkulturschale ausgesät. Nach einer Adhäsionsszeit von 24 h folgte die

Inkubation mit den jeweiligen Selenverbindungen. Nach weiteren 24 h wurden die

Zellen abtrypsiniert. Gegebenenfalls wurde nach 23-stündiger Inkubation der

jeweiligen Selenverbindung mit 50 nM BPDE für eine Stunde koinkubiert und

abtrypsiniert. Nach dem Vereinzeln wurden die Zellen entsprechend einer 1:20

Verdünnung in ein Eppendorfgefäß mit Medium pipettiert und die Zellzahl am

automatischen Zellzählgerät (CASY) ermittelt. Aus der 1:20 Verdünnung wurden

anschließend jeweils 300 Zellen in 60 mm Zellkulturschalen mit 5 ml Medium

ausgesät und die Schalen für weitere 9 Tage im Brutschrank aufbewahrt. In dieser

Zeit wuchsen aus den einzelnen Zellen deutlich sichtbare Kolonien heran, die im

Anschluss gefärbt werden. Dazu wurde das Medium abgesaugt und die Schalen

wurden mit kaltem PBS einmal gewaschen, bevor die Kolonien 5 Minuten mit

eiskaltem Ethanol (96 %) fixiert und 30 Minuten mit Giemsalösung (5 % in Wasser)

gefärbt wurden. Schließlich wurden die Zellkulturschalen mit Wasser gewaschen.

Nach dem Trocknen wurden die Kolonien pro Zellkulturschale ausgezählt. Durch

Vergleich der Anzahl der Kolonien der verschiedenen Konzentrationsstufen mit der

Anzahl der unbehandelten Kontrolle wurden die längerfristigen zytotoxischen Effekte

der jeweiligen Verbindungen sichtbar.


4.4 Nachweis oxidativer DNA-Schäden

Die Induktion von oxidativen DNA Schäden durch Selenverbindungen wurde mit Hilfe

der Methode der Alkalischen Entwindung zum Nachweis von DNA-Strangbrüchen

untersucht. Diese wurde mit dem Einsatz der bakteriellen Formamidopyrimidin-DNA-

Glykosylase (Fpg) kombiniert, wodurch zusätzlich der Nachweis oxidativer DNA-

Basenmodifikationen, die durch Fpg erkannt werden, möglich war. Dabei stellen

8-Oxoguanin, imidazolringoffene Purine und AP-Stellen Substrate für Fpg dar (Tchou

et al., 1991; Boiteux et al., 1992; Haring et al., 1994). Der DNA-Entwindung im

alkalischen Milieu folgte die chromatographische Trennung von einzel- und

doppelsträngiger DNA an Hydroxylapatit und die fluorimetrische Quantifizierung

(Abbildung 14). Aus dem Verhältnis von einzel- und doppelsträngiger DNA erfolgte

im Anschluss die Berechnung der Anzahl von DNA-Strangbrüchen und oxidativer

DNA-Basenmodifikationen. Hierbei ist die Entwindung der DNA umso stärker

ausgeprägt, je größer die Anzahl an oxidativen DNA-Schäden ist.

Fluoreszenzdetektion von einzel- und doppelsträngiger DNA(Kalibrierung mit Röntgenstrahlung)

Behandlung mit Fpg

Entfernung der Histone (2 M NaCl)

Lyse

oxidative DNA-Basenmodifikation, AP-Stelle

Alkalische Entwindung (pH 12,3)

Neutralisation (pH 6,8), Ultraschallbehandlung

Trennung von einzel- und doppelsträngiger DNA(Hydroxylapatit-Chromatographie)

Inkubation mit Natriumselenit oder

Selenomethionin

DNA-Strangbruch

A549 Zellen Chromatin

Fluoreszenzdetektion von einzel- und doppelsträngiger DNA(Kalibrierung mit Röntgenstrahlung)

Behandlung mit Fpg

Entfernung der Histone (2 M NaCl)

Lyse

oxidative DNA-Basenmodifikation, AP-Stelle

Alkalische Entwindung (pH 12,3)

Neutralisation (pH 6,8), Ultraschallbehandlung

Trennung von einzel- und doppelsträngiger DNA(Hydroxylapatit-Chromatographie)

Inkubation mit Natriumselenit oder

Selenomethionin

DNA-Strangbruch

A549 Zellen Chromatin

Abbildung 14: Prinzip der Alkalischen Entwindung.


4.4.1 Versuchsansatz


Natriumselenit oder Selenomethionin inkubiert. Nach Beendigung der Adhäsions-

bzw. Inkubationszeit wurden das Kulturmedium nach weiteren 24 h entfernt, 2 ml

eiskaltes PBS zugegeben und die Zellkulturschalen bis zur Lyse auf Eis gelagert.

Dabei wurden pro Inkubationskonzentration jeweils drei Schalen für die Bestimmung

von DNA-Strangbrüchen und die Quantifizierung Fpg-sensitiver Stellen angesetzt.

Alle folgenden Arbeiten wurden zur Vermeidung von durch Licht induzierten DNA-

Schäden in einem abgedunkelten Raum durchgeführt.

4.4.2 Alkalische Entwindung

Zunächst wurde das PBS durch je 500 µl Lysepuffer ersetzt. Nach 5 min wurde

dieser entfernt und es folgten eine 2minütige Inkubation mit je 500 µl Salzlösung und

nach dem Absaugen eine 8minütige Nachinkubation auf Eis. Dies gewährleistet die

Zugänglichkeit der Fpg zum DNA-Schaden. Innerhalb der folgenden 30minütigen

Inkubation mit 760 µl Fpg-Puffer mit Fpg (1 µg/ml) bzw. ohne Fpg bei 37 ºC wurden

oxidative DNA-Basenmodifikation durch Fpg in DNA-Strangbrüche umgewandelt.

Anschließend erfolgte die Entwindung der DNA im alkalischen Milieu bei pH 12,3

durch Zugabe von 775 µl alkalischer Lösung. Nach exakt 30 min wurde die

Entwindung durch Rückneutralisation auf pH 6,8 abgebrochen. Das dafür

notwendige Volumen 0,1 M HCl wurde vorher ermittelt. Nach dem Durchmischen der

Probe wurde diese auf Eis mit einer Ultraschallspitze für 15 s bei 30 Watt sonifiziert.

Um einer Renaturierung der DNA-Fragmente vorzubeugen wurden anschließend

15 µl SDS-Lösung (10%ig) zugegeben. Die Proben wurden bis zur Chromatographie

bei -18 ºC gelagert.

4.4.3 Chromatographie und fluorimetrische Quantifizierung

Zunächst wurden alle benötigten Puffer und die Proben auf 60 ºC temperiert. Zur

Präparation der Chromatographiesäulen wurden je 1 ml Hydroxylapatit-Suspension

(0,1 g/ml in 0,01 M Natriumphosphatpuffer, 30 min bei 60 ºC gequollen) in eine 2 ml

Einwegspritze gefüllt. Dabei stellen Glasfilterfritten ober- und unterhalb des

Säulenmaterials deren Abschluss dar. Die vorbereiteten Säulen wurden mit 1,5 ml


0,5 M Kaliumphosphatpuffer gewaschen und mit 1,5 ml 0,01 M

Natriumphosphatpuffer konditioniert, bevor die Proben aufgegeben wurden und mit

2,5 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer gespült wurden. Danach wurden zunächst die

einzelsträngige DNA mit 1,5 ml Kaliumphosphatpuffer (0,15 M) und anschließend die

doppelsträngige DNA mit 1,5 ml Kaliumphosphatpuffer (0,35 M) getrennt

voneinander in 24-Lochplatten eluiert. Abschließend erfolgt die fluorimetrische

Quantifizierung am Mikrotiterplattenlesegerät (Tecan, Emission 360 nm, Extinktion

455 nm) durch Zugabe von 3,75 µl Höchst-Farbstoff 33258 (0,3 mM). Abbildung 15

zeigt die Berechnung der Anzahl der induzierten DNA-Schäden anhand der

Fluoreszenzwerte.

relative Fluoreszenz (Doppelstrang)

relative Fluoreszenz (Doppelstrang) + 2,1 x relative Fluoreszenz (Einzelstrang) ds DNA =

Anzahl der DNA-Strangbrüche = -lnds DNA (Probe ohne Fpg)

ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)x 16666

Anzahl der Fpg-sensitiven Stellen = -lnds DNA (Probe ohne Fpg)













ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)x 16666Anzahl der DNA-Strangbrüche = -ln

ds DNA (Probe ohne Fpg)





ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)x 16666Anzahl der Fpg-sensitiven Stellen = -ln





Abbildung 15: Berechnung der induzierten DNA-Schäden pro Zelle. ds DNA: Anteil der doppelsträngigen DNA, relative Fluoreszenz: Fluoreszenz der Probe abzüglich der

Fluoreszenz des Pufferblindwertes.

Der Korrekturfaktor von 2,1 zur Berechnung des Anteils an doppelsträngiger DNA

berücksichtigt die stärkere Bindung des Höchstfarbstoffes an doppelsträngige DNA

(Hartwig et al., 1993). Der Korrekturfaktor 16666 ergibt sich aus der Kalibrierung mit

Röntgenstrahlung und errechnet sich aus dem Quotienten D/c. D steht dabei für die

Dosis in Gray und c für die Steigung der Kalibriergeraden (Hartwig et al., 1996).

Durch Division durch 6000 werden die errechneten DNA-Schäden pro Zelle auf 106

Basenpaare bezogen angegeben.

4.5 Quantifizierung von Gesamtglutathion und Glutathiondisulfid

Nach Anderson (1985) erfolgt die Quantifizierung von Gesamtglutathion (Summe von

GSH und GSSG) und Glutathiondisulfid (GSSG) mit Hilfe von


5,5’-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) und des durch die Glutathionreduktase

getriebenen GSSG-Recyclings (Abbildung 16). Die Kombination der Quantifizierung

des Thiolgehaltes durch DTNB mit der Verwendung der Glutathionreduktase

ermöglicht die selektive Bestimmung von Glutathion; das am häufigsten in der Zelle

vorkommende Thiol. Zur Bestimmung der GSSG-Konzentration wurde GSH selektiv

durch Zugabe von 2-Vinylpyridin derivatisiert. Die so ermittelten GSSG-Gehalte

wurden zur Berechnung des GSH-Gehaltes von der Gesamtglutathionkonzentration

subtrahiert (Anderson, 1985; Abdelmohsen et al., 2003; Rahman et al., 2006).

O2N

HOOC SS

NO2

COOH

SH

O2N

HOOC

NADPH H+

2

TNBDTNB

NADP+

GR

2 GSH GSSG

+ Abbildung 16: DTNB-Methode zur Bestimmung von Glutathion (Anderson, 1985; Rahman et al., 2006); DTNB: 5,5’-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure), TNB: 5-Thio-2-nitrobenzoesäure, GSH: Glutathion, GSSG: Glutathiondisulfid, NADP+:

Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (oxidierte Form), NADPH/H+: Nicotinamidadenin-

dinucleotidphosphat (reduzierte Form)

4.5.1 Versuchsansatz


Natriumselenit, Selenomethionin, Menadion oder BSO inkubiert. Nach Beendigung

der Adhäsions- bzw. Inkubationszeit wurde das Kulturmedium entfernt. Nach

einmaligem Spülen mit eiskalter HCl (0,01 N) wurden die Zellen durch Abschaben in

250 µl HCl (0,01 N) geerntet und bis zur Quantifizierung bei -80 ºC gelagert.


4.5.2 Probenaufarbeitung

Die Proben wurden aufgetaut und nach zweimaligem freeze-thaw-Zyklus für 2 min

bei 14000 g und 4 ºC zentrifugiert, um Zelltrümmer aus dem Extrakt zu entfernen.

Der pH-Wert der Extrakte sollte ≤ 6 sein. Zur Proteinfällung wurden 200 µl des

Extraktes mit 68 µl Sulfosalicylsäure (20 %) versetzt, 5 min auf Eis inkubiert und

anschließend 5 min bei 14000 g und 4 ºC zentrifugiert. Die restliche Extraktmenge

wurde zur Proteinbestimmung verwendet. Aus dem nach der Proteinfällung im

Überstand befindlichen Zellextrakt wurden 40 µl direkt zur enzymatischen

Gesamtglutathionbestimmung eingesetzt und 200 µl zur Derivatisierung des GSH

verwendet. Hierzu wurden 200 µl des proteinfreien Extraktes mit 12 µl Triethanolamin

und 4 µl 2-Vinylpyridin versetzt und 60 min bei RT inkubiert. 200 µl dieser

Reaktionslösungen, deren pH-Wert nicht über 7-8 liegen sollte, wurden zur

enzymatischen GSSG-Bestimmung eingesetzt. Kalibrierlösungen für GSH (1000,

500, 100, 50, 10, 5 und 0 µM GSH in 0,01 N HCl) und GSSG (500, 100, 50, 10, 5, 1,

0,5, 0,2 und 0 µM GSSG in 0,01 N HCl) wurden auf die gleiche Weise behandelt.

4.5.3 Durchführung des Recycling-Assays

Zur enzymatischen Bestimmung von Gesamtglutathion wurden 40 µl des

proteinfreien Zellextraktes bzw. der GSH-Kalibrierlösungen mit 360 µl GSH-

Reaktionspuffer versetzt. Aus diesen Reaktionsansätzen wurden jeweils drei

Kavitäten einer 96-Lochplatte mit 100 µl beladen. Anschließend erfolgte der Start der

Enzymreaktion durch Zugabe von 10 µl Glutathionreduktaselösung (aus Bäckerhefe,

10 - 20 U/ml). Nach dem Durchmischen wurde die zeitabhängige Veränderung der

Extinktion bei 412 nm mit Hilfe eines Mikrotiterplattenlesegeräts (Labsystems) in

Untersuchungen zur direkten und indirekten Genotoxizität von Natriumselenit und ... · 2017. 10....

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