Untersuchungen zur Funktion des Nitrit-Transporters NirC ... Wei... · Mitochondrien vorhanden und...

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Diplomarbeit vorgelegt von

Wei Lü

aus

Jiangsu, China

angefertigt im Institut für Mikrobiologie und Genetik

Abteilung Molekulare Strukturbiologie an der Biologischen Fakultät der Georg-August-Universität zu Göttingen

2007

Referent: Prof. Dr. Oliver Einsle Korreferent: Prof. Dr. Ralf Ficner Abgabedatum der Diplomarbeit: 13.04.2007 Letzter mündlicher Prüfungstermin: 14.07.2006

IINNHHAALLTTSSVVEERRZZEEIICCHHNNIISS

1

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG .................................................................................................... 4

1.1 Biologische Membran .................................................................................. 4 1.1.1 Aufbau biologischer Membranen............................................................. 4 1.1.2 Funktionen biologischer Membranen ...................................................... 7

1.2 Membranproteine ......................................................................................... 7 1.2.1 Klassifizierung ......................................................................................... 8 1.2.2 Funktionen von Membranproteinen......................................................... 9

1.3 Detergenzien .............................................................................................. 10 1.3.1 Klassifizierung ....................................................................................... 11 1.3.2 Wichtige Parameter von Detergenzien................................................... 12 1.3.3 Solubilisierung von Membranproteinen mit Detergenzien.................... 13 1.3.4 Delipidierung ......................................................................................... 15 1.3.5 Detergenz-Membranprotein-Interaktion und Kristallisation.................. 15

1.4 Stickstoffkreislauf ...................................................................................... 17

1.5 Bedeutung von Nitrat und Nitrit ................................................................ 19

1.6 Das Nitratreduktasesystem in E. coli ......................................................... 20

1.7 Das Nitritreduktasesystem in E. coli .......................................................... 21

1.8 Transport von Nitrat und Nitrit in E. coli................................................... 22

1.9 Daten von NirC aus E. coli ........................................................................ 24

1.10 Aufgabenstellung und Zielsetzung............................................................. 25

2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................... 26

2.1 Primer-Design ............................................................................................ 26

2.2 PCR-Amplifikation .................................................................................... 26

2.3 Klonierung und Transformation................................................................. 28

2.4 Überexpression in E. coli ........................................................................... 31

2.5 Reinigung von NirC ................................................................................... 31 2.5.1 Zellernte ................................................................................................. 32 2.5.2 Zellaufschluss......................................................................................... 32 2.5.3 Isolierung der Membranen ..................................................................... 33 2.5.4 Solubilisierung mit Detergenz ............................................................... 33 2.5.5 His-Tag Affinitätschromatographie ....................................................... 34 2.5.6 Größenausschlußchromatographie......................................................... 34 2.5.7 Austausch von Detergenz....................................................................... 35


2

2.6 Analytische Methoden ............................................................................... 36 2.6.1 Agarosegelelektrophoresen .................................................................... 36 2.6.2 Gelextraktion.......................................................................................... 37 2.6.3 SDS-PAGE............................................................................................. 37 2.6.4 Western Blot .......................................................................................... 39 2.6.5 Dünnschichtchromatographie (DC) ....................................................... 39 2.6.6 Lipidextraktion....................................................................................... 40 2.6.7 Saure Methylierung................................................................................ 41 2.6.8 Gaschromatographie .............................................................................. 42 2.6.9 GC/ MS .................................................................................................. 42 2.6.10 Aggregationstest................................................................................. 43

2.7 Kristallisation von gereinigtem NirC......................................................... 44 2.7.1 Vorgefertigte und kommerziell erhältliche Screens............................... 45 2.7.2 Feinscreen, Additive Screen und Detergent Screen............................... 46 2.7.3 Microseeding.......................................................................................... 46 2.7.4 Kryobedingungen................................................................................... 47 2.7.5 Kristall Annealing .................................................................................. 47 2.7.6 Kristall Dehydrierung ............................................................................ 48 2.7.7 Röntgenbeugungsexperimente ............................................................... 48

2.8 ITC (engl. Isothermal Titration Calorimetry) ............................................ 49

3 ERGEBNISSE .................................................................................................. 50



3.3 Überexpression in E. coli C43 ................................................................... 53

3.4 Wachstumskurven...................................................................................... 54

3.5 Reinigung von NirC ................................................................................... 55 3.5.1 Zellernte, Aufschluss und Isolierung de Membranen ............................ 55 3.5.2 Solubilisierung mit Detergenz ............................................................... 56 3.5.3 Affinitätschromatographie ..................................................................... 56 3.5.4 Größenausschlußchromatographie......................................................... 59 3.5.5 Bestimmung der Proteinkonzentration................................................... 60

3.6 Quantitative Bestimmung der Zusammensetzung von Detergenzien und Lipiden im Protein-Detergenz-Komplex (PDK).................................................... 61

3.6.1 Bestimmung des Detergenz-Protein-Verhältnisses im PDK.................. 61 3.6.2 Bestimmung der Lipidzusammensetzung im PDK................................ 63

3.7 Aggregationstest......................................................................................... 64

3.8 Austausch von Detergenz........................................................................... 65

3.9 Kristallisation von NirC ............................................................................. 69

3.10 Röntgenbeugungsexperimente ................................................................... 71



3

4 DISKUSSION ................................................................................................... 74

4.1 Solubilisierung und Aufreinigungen von NirC.......................................... 74

4.2 Bestimmung der Detergenz-/Phospholipidzusammensetzung im PDK..... 77

4.3 Kristallisation ............................................................................................. 78

4.4 ITC ............................................................................................................. 80

5 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................. 82

6 LITERATURVERZEICHNIS........................................................................ 83

7 ANHANG.......................................................................................................... 92

7.1 Abkürzungsverzeichnis .............................................................................. 92

7.2 Basensequenz von NirC ............................................................................. 94

7.3 Aminosäuresequenz von NirC ................................................................... 94

EEIINNLLEEIITTUUNNGG

4

1 EINLEITUNG

1.1 Biologische Membran

Alle Lebewesen, sowohl Pro- als auch Eukaryonten, besitzen eine Plasmamembran (Abb.

1.1). Sie trennt das Zytoplasma von der Umgebung ab und hält somit die Zellen von

Gleichgewicht fern, was die Voraussetzung für das Leben ist. Mit einem Wort, die

biologische Membran ist die Grundlage der Entwicklung komplexen biologischen Systems.

1.1.1 Aufbau biologischer Membranen

Biologische Membranen unterscheiden sich je nach ihren Funktionen in ihrer chemischen

Zusammensetzung, ihrer Morphologie und ihren enzymatischen Funktionen sehr stark

voneinander. Jedoch sind sie nach einem gemeinsamen Prinzip aufgebaut:

Lipiddoppelschichten bilden die Permeabilitätsschranke und enthalten Membranproteine,

Abb. 1.1 Biologische Membran. Links: Plasmamembran im Elektronenmikroskop. Rechts: schematische Darstellung einer Plasmamembran (aus dem Internet).


5

die entweder als Transportsystem, bestehend aus Pumpen und Kanälen, wirken, oder

enzymatische Funktionen übernehmen. Zusätzlich sind noch andere Moleküle wie z.B.

Cholesterin vorhanden, die bestimmte biologische Funktionen haben. Biologische

Membranen sind asymmetrisch, d.h. die verschiedenen Phospho- und Glycolipide sind

stark ungleich verteilt. In der äußeren Schicht überwiegen Phosphatidylcholin,

Sphingomyelin, Cholesterin und Glycolipide. In der inneren Schicht überwiegen

Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol und Phosphatidylethanolamin (Biochemie Stryer,

5. Auflage).

Membranen weisen eine hoch dynamische Struktur auf. Das Flüssigmosaikmodell (Singer

und Nicolson, 1972) beschreibt die biologische Membran folgendermaßen: Membranen

sind zweidimensionale Lösungen gerichteter Lipide und globulärer Proteine. In anderen

Worten, die Lipidkomponente bewegt sich ständig, sowohl durch laterale Diffusion

(spontan, schnell) als auch durch transversale Diffusion (mit Hilfe von Flippase, langsam).

Membranproteine können ebenfalls lateral in der Lipidmatrix diffundieren.

Die Lipidzusammensetzungen einiger Tiere- bzw. Bakterienzellmembranen werden in

Tabelle 1.1 dargestellt.

Tabelle 1.1 Lipidzusammensetzung einiger Tier- bzw. Bakterienzellmembranen. PC: Phosphatidylcholin; PE: Phosphatidylethanolamin; PG: Phosphatidylglycerin; PS: Phosphatidylserin; CL: Cardiolipin; SM: Sphingomyelin.

Lipidzusammensetzung

Membran PC PE PG PI PS CL SM Cholesterin Gangliosid

Myelin (Mensch) 10% 20% - - 8,5% - 8,5% 27% 26%

Erythrozyt (Mensch) 25% 22% - - 10% - 18% 25% -

Mitochondrium 40% 39% - 2% - 17% - in Spuren -

E. coli - 74% 19% - - 3% - - -

Zur den biologisch wichtigsten Eigenschaften der Lipide gehört ihr amphiphiles Verhalten.

Diese Eigenschaft ist im Wesentlichen auf ihren besonderen Aufbau zurückzuführen: alle

Lipide haben einen hydrophilen Kopf, der am häufigsten aus Glycerin oder Sphingosin

besteht, und einen hydrophoben Schwanz aus Fettsäuren. Ein schematischer Aufbau

verschiedener Lipide wird in Abb. 1.2 dargestellt.


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Tabelle 1.2 Einige natürlich vorkommende Fettsäuren (Biochemie Stryer, 5. Auflage).

Anzahl der C-Atome

Anzahl der Doppelbindungen

Trivialname systematischer Name

12 0 Laurat n-Dodecanat

14 0 Myristat n-Tetradecanat

16 0 Palmitat n-Hexandecanat

18 0 Stearat n-Octadecanat

20 0 Arachinat n-Eicosanat

22 0 Behenat n-Docosanat

24 0 Lignocerat n-Tetracosanat

16 1 Palmitoleat cis-Δ9-Hexadecenat

18 1 Oleat cis-Δ9-Octadecenat

18 2 Linoleat cis,cis-Δ9-Δ12-Octadecadienat

18 3 Linolenat all-cis-Δ9,Δ12,Δ15-Octadecatrienat

20 4 Arachidonat all-cis-Δ5,Δ8,Δ11,Δ14-Eicosatetraenat

Abb. 1.2 Schematischer Aufbau verschiedener Lipide (http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-2/ch11_lipid-struct.jpg).


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Fettsäuren in biologischen Systemen besitzen gewöhnlich eine gerade Anzahl von

Kohlenstoffatomen, typischerweise zwischen 14 und 24 (Tabelle 1.2). Dabei kommen

Fettsäuren mit 16 und 18 C-Atome am häufigsten vor. Die Alkylkette kann gesättigt sein

oder eine bzw. mehrere Doppelbindungen enthalten, die meistens eine cis-Konfiguration

haben.

1.1.2 Funktionen biologischer Membranen

Die Lipidkomponenten bilden eine Permeabilitätsbarriere, so dass Membranen für Ionen

und die meisten polaren Moleküle sehr gering durchlässig sind. Ausnahme sind einige

unpolare kleine Moleküle wie z.B. Sauerstoff bzw. Wasser (zwar polar, aber klein, hohe

Konzentration und keine komplette Ladung). Damit wird die Zelle von der Umgebung

getrennt. Dies ist die wichtigste Funktion biologischer Membranen. Die zweite wichtige

Funktion ist die Energiespeicherung, da Fettsäuren hochkonzentrierte Energiespeicher sind.

Weitere Funktionen der Membran werden hauptsächlich mittels Membranproteinen erfüllt,

wie z.B. Transport, Signalübertragung, enzymatische Funktionen. Sie werden im nächsten

Abschnitt (1.2) genauer erläutert.

1.2 Membranproteine

Ein Membranprotein ist ein in die Lipidschicht einer Biomembran eingelagertes oder

dieser aufgelagertes Protein. Gemäß der Analyse von genomischen Sequenzen sind 30 %

der gesamten Proteine bei E. coli Membranproteine.


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1.2.1 Klassifizierung

Membranprotein werden in zwei große Klassen unterteilt: Intergrale Membranproteine und

membranständige Proteine.

Als intergrale Membranproteine werden die Proteine bezeichnet, die die

Lipiddoppelschicht einer Membran durchspannen. Sie werden wiederum in zwei Gruppen

unterschieden. Die erste sind aus α-Helices bestehende Transmembranproteine, zu denen

sowohl die sogenannten „singlepass“ Transmembranproteine (engl. bitopic membrane

proteins) gehören, die die Membran nur einmal durchqueren, wie z.B. T-Zell-Rezeptoren,

als auch die „multipass“ Transmembranproteine (entl. polytopic membrane proteins) wie

z.B. Membrantransporter und Ionenkanäle. Die zweite sind Transmembranproteine, die aus

β-Faltblättern aufgebaut sind. Solche Proteine sind nur in der äußeren Membran Gram-

negativer Bakterien, der Zellwand Gram-positiver Bakterien und äußeren Membran von

Mitochondrien vorhanden und haben eine zylinderförmige Transmembran-β-

Faltblattstruktur, wie z.B. LamB, eine Maltoseporin (Van Gelder et al., 2002).

Als membranständige Proteine (engl. monotopic membrane proteins) werden Proteine

bezeichnet, die zwar in der Membran verankert sind, diese jedoch nicht durchqueren. In

der Abb. 1.3 werden einige verschiedene membranständige Proteine schematisch

dargestellt.

Abb. 1.3 Intergrale Membranproteine. 1: singlepass Transmembranprotein mit einer Transmembranhelix. 2: multipass Transmembranprotein mit mehreren Transmembranhelices. 3: Transmembranprotein aus β-Faltblättern (http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_proteins).


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1.2.2 Funktionen von Membranproteinen

Fast alle Membranfunktionen werden

von Membranproteinen vermittelt. Sie

fungieren vor allem als

Membrantransporter bzw. Ionenkanäle,

die bestimmte Moleküle bzw. Ionen

durch die Membran transportieren. Ein

Beispiel ist LacY (Abb. 1.4), ein

Laktosetransporter in E. coli, der zur

MFS (engl. Major Facilitator

Superfamiliy) gehört. Die zweite

wichtige Funktion von

Membranproteinen ist die

Signaltransduktion. In den Membranen

Abb. 1.3 Verschiedene membranständige Proteine. 1: Das Protein wird in der Membran mittels einer α-Helix verankert, die parallel zur Membranebene ist. 2: Das Protein wird in der Membran mittels eines hydrophoben Loops verankert. 3: Das Protein bindet an der Membran mittels kovalenten Wechselwirkungen mit den Lipiden. 4: Das Protein bindet an der Membran durch elektrostatische Wechselwirkungen mit den Lipiden (http://en.wikipedia.org/wiki/Peripheral_membrane_protein).

Abb. 1.4 LacY aus E. coli, ein Laktosetransporter. Die schwarzen Kugeln stellen das Substrathomolge TDG (ß-D-galactopyranosyl-1-thio-ß-D-galactopyranoside) dar (Abramson et al., 2003).


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befinden sich viele Signalrezeptoren, die bestimmte Signalmoleküle wie z.B. Hormone

oder Neurotransmitter spezifisch erkennen und das Signal weiter übertragen. Zum Beispiel

die 7TM-Rezeptoren (die Rezeptoren mit sieben Transmembranhelices) sind für Geruch,

Geschmack, Sehen und viele anderen biologische Funktionen verantwortlich.

1.3 Detergenzien Um mit Membranproteinen arbeiten zu können, d.h. sie zu reinigen, zu kristallisieren und

um enzymatische Tests durchführen zu können, ist es notwendig, sie in Lösung zu bringen.

Bei einigen Proteinen, die über elektrostatische Wechselwirkungen an die Membran

gebunden sind, gelingt dies einfach durch Erhöhung der Salzkonzentration. Der Großteil

der Transmembranproteine erfordert jedoch die Zugabe von Detergenzien, da ihre

Transmembranhelices stark mit der Lipiddoppelschicht hydrophob wechselwirken (Wiener

2004; Caffrey 2003; Garavito et al., 2001).

Detergenzien sind amphiphile Moleküle ähnlich den Lipiden, die einen hydrophoben und

einen hydrophilen Anteil besitzen (Abb. 1.5.A). Deshalb bilden sie wie Lipide in wässriger

Lösung spontan Mizellenstrukturen (Abb. 1.5.B).

HydrophoberSchwanz

HydrophileKopf

A. B.

Abb. 1.5 Detergenz. A: schematische Darstellung eines Detergenzmoleküls. B: schematische Darstellung einer Detergenzmizelle.


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Je nach der Ladung werden Detergenzien in drei Gruppen eingeteilt: ionische Detergenzien,

nichtionische Detergenzien und zwitterionische Detergenzien (Abb. 1.6, Seddon et al.,

2004).

A. B.

C.

Ionische Detergenzien besitzen eine Kopfgruppe mit einer Nettoladung, die entweder

anionisch oder kationisch sein kann，wie z.B. SDS (engl. sodium dodecylsulfate). Solche

Detergenzien können Membranproteine sehr effektiv solubilisieren, sehr häufig tritt jedoch

dabei eine gleichzeitige (teilweise) Denatuierung auf.

Nichtionische Detergenzien enthalten eine ungeladene hydrophile Kopfgruppe, die

meistens entweder eine Zuckergruppe oder Polyoxyethylen ist. Sie sind meistens milder als

ionische Detergenzien, deshalb können sie viele Membranproteine solubilisieren, ohne

deren Proteinstruktur zu verändern. Das heißt, Membranproteine können mit Hilfe solcher

Detergenzien in biologisch aktiver Form aufgereinigt werden. Als eine Ausnahme sind

nichtionische Detergenzien mit kurzen hydrophoben Ketten (C7-10) wie z.B. OG (engl. n-

octyl-β-D-glucopyranoside), die oft zur Deaktivierung von Membranproteinen führen

Abb. 1.6 Einige typische Detergenzien. A: Ionisch; B: Nichtionisch; C: Zwitterionisch.


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(Seddon et al., 2004). DDM (engl. n-dodecyl-β-D-maltoside) ist ein häufig benutztes

nichtionische Detergenz.

Zwitterionische Detergenzien kombinieren die Eigenschaften ionischer und nichtionischer

Detergenzien, da sie zwar Ladungen enthalten, ihre Nettoladung jedoch Null ist. Sie

wirken im Allgemeinen deaktivierender als ionische Detergenzien, jedoch schwächer als

ionische. Normalerweise werden sie bei strukturellen Studien eingesetzt. Zum Beispiel

wurde LDAO (engl. n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide) bei der Kristallisation von

Ammoniumtransporter Amt-1 (Andrade et al., 2005) verwendet.

1.3.2 Wichtige Parameter von Detergenzien

Der wichtigste Parameter von Detergenz ist die CMC (engl. critical micelle concentration).

Sie beschreibt die minimale Konzentration an Detergenz, bei der Mizellen gebildet werden.

Die CMC steigt mit der Länge der Alkylgruppe und umgekehrt. Doppelbindungen und

Verzweigungen der Alkylgruppe bewirken eine Abnahme der CMC. Je länger die

Alkylkette ist und je weniger Doppelbindungen und Verzweigungen vorhanden sind, desto

stärker ist die Wechselwirkung zwischen den Detergenzmolekülen. Außerdem hängt die

CMC noch von vielen äußeren Faktoren ab, wie z.B. pH-Wert, Ionenstärke, Temperatur

und Vorhandensein von Proteinen, Lipiden bzw. anderen Detergenzien (Seddon et al.,

2004).

Der zweite wichtige Parameter, CMT (engl. critical micelle temperature) beschreibt die

Veränderung der Eigenschaften eines Detergenz mit der Temperatur. Bei niedriger

Temperatur liegen Detergenzien hauptsächlich in kristalliner Form vor, die mit gelösten

Detergenzmonomeren im Gleichgewicht steht. Steigt die Temperatur, werden immer mehr

Detergenzmoleküle gelöst, bis die CMC erreicht wird. Die Temperatur an diesem Punkt

wird als CMT bezeichnet. Ist die Temperatur höher als die CMT, wird die detergenzhaltige

Lösung mit Steigung der Temperatur immer trüber, bis die sogenannte Phasenseparation

auftritt: die detergenzreiche Phase und die wässrige Phase. Die Temperatur an diesem

Punkt wird als „cloud point“ bezeichnet (Seddon et al., 2004).

Der letzte wichtige Parameter von Detergenzien ist die Aggregationszahl, die die mittlere

Anzahl an Detergenzmonomeren in einer einzigen Mizelle beschreibt.


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In Tabelle 1.3 werden die in dieser Arbeit verwendeten Detergenzien zusammengefasst.

Tabelle 1.3 Die in dieser Arbeit verwendeten Detergenzien. N: Nichtionische Detergenz; Z: Zwitterionische Detergenz. D9M: n-Nonyl-ß-D-Maltopyranosid; D10M: n-Decyl-ß-D-Maltopyranosid; D11M: n-Undecyl-ß-D-Maltopyranosid; DDM: n-Dodecyl-ß-D-Maltopyranosid; DDPO: Dimethyl-Decylphosphin Oxid; LDAO: n-Dodecyl-N,N-Dimethylamin-N-Oxid (Daten von Anatrace).

1.3.3 Solubilisierung von Membranproteinen mit Detergenzien

Die Fähigkeit von Detergenzien, Membranprotein aus der Lipiddoppelschicht zu

extrahieren, beruht im Wesentlichen auf ihrer Fähigkeit, Lipide zu solubilisieren.

Begleitend zur Entfernung (Solubilisierung) von Lipiden durch Detergenzien werden die

hydrophoben Teile von Membranproteinen ebenfalls durch Detergenzien umschlossen. In

diesem Stadium werden Membranproteine als gelöste (solubilisierte) Form betrachtet (le

Maire et al., 2000). Der Solubilisierungsprozess wird in der Abb. 1.7 dargestellt.

Detergenz Typ MW CMC (w/v) (in Wasser)

Aggregationszahl (in Wasser)

Struktur

D9M N 468,5 0,28 % 55

D10M N 482,6 0,0869 % 69

D11M N 496,6 0,0292 % 71

DDM N 510,6 0,0087 % 78-92

DDPO N 218,3 0,1 % 31

LDAO Z 229,4 0,0344 % 76


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In der ersten Phase liegen Detergetien als Nichtmizellen-Form vor. Einige davon dringen

in die Lipiddoppelschicht ein. Mit Erhöhung der Konzentration an Detergenz werden

immer mehr Lipide durch Detergenzmoleküle ausgetauscht und die Membran wird

dadurch destabilisiert. Dies führt endlich zur Fragmentierung der Membrandoppelschicht.

Ist die Konzentration an Detergenz höher als die CSC (engl. critical solubilization

concentration), werden die großen, wasserunlöslichen Lipiddoppelschichtfragmente zur

sehr kleinen Membranfragmenten abgebaut. Schließlich sind nur gemischte Mizellen

Abb. 1.7 Schematische Darstellung des Solubilisierungsprozesses als eine Funktion der Konzentration an freien Detergenzien. In der Phase a: Detergenzien dringen in die Lipiddoppelschicht ein, aber Lipide überwiegen noch. In der Phase b: oberhalb der Konzentration Csat dringen immer mehr Detergenzmoleküle in die Lipiddoppelschicht ein. Dies führt zur Destabilisierung der Membran und anschließend werden große Membranfragmente, die mit Detergenzien am Rand abgeschlossen werden, gebildet. In der Phase c: oberhalb der CSC (engl. critical solubilization concentration) werden die großen Membranfragmente zur sehr kleinen Membranstücke umgesetzt, die wasserlöslich sind. In der Phase d sind nur gemischte Mizellen (Detergenz-Lipid und Detergenz-Lipid-Protein) vorhanden. Die Membranproteine sind vollständig solubilisiert. (Kragh-Hansen et al., 1993)


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(Detergenz-Lipid und Detergenz-Lipid-Protein) vorhanden und die Membranproteine sind

vollständig solubilisiert.

1.3.4 Delipidierung

Begleitend zur Solubilisierung werden Membranproteine delipidiert. Aber inwiefern sie

delipidiert werden, muss kontrolliert werden.

Einerseits bewirkt eine vollständige Delipidierung häufig die Deaktivierung des Proteins,

da Lipide oft eine wichtige Rolle bei der Interaktion zwischen Proteinuntereinheiten

spielen, die die Voraussetzung für die Funktionen einiger Enzyme wie z.B. Cytrochrom b6f

Komplex sind. Lipide sind auch entscheidend für die richtige Konformation einiger

Membranproteine (le Maire et al., 2000; Esmann et al., 1979; Esmann et al., 1984; Breyton

et al., 1997; Palsdottir et al., 2004).

Andererseits werden die Membranproteine, die erfolgreich kristallisiert werden, meistens

komplett oder fast komplett delipidiert. Als Ausnahme benötigen manche

Membranproteine Lipide für die Kristallisation oder eine bessere Beugungsqualität (Guan

et al., 2005; Deisenhofer et al., 1985; Palsdottir et al., 2004).

Der Delipidierungsgrad wird durch mehrere Faktoren beeinflusst wie z.B. den Typ und die

Menge des verwendeten Detergenz.

1.3.5 Detergenz-Membranprotein-Interaktion und Kristallisation

Drei Bindungsmodelle von Detergenz und Membranprotein werden vorgeschlagen (le

Maire et al., 2000). Das erste ist die mizellenartige Bindung (Abb. 1.8.A), bei der

Membranprotein im Inneren der Mizelle beachtet wird. Das zweite ist die Monoschicht-

Bindung (Abb. 1.8.B), bei der weniger Detergenzmoleküle benötigt werden, da sie den

hydrophoben Teil des Membranproteins als eine Monoschicht umgeben. Dieses Modell

lässt sich noch diskutieren, da die hydrophoben Anteile der Detergenzmoleküle, die am

Ende des Transmembranbereichs des Proteins liegen, der hydrophilen wässrigen


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Umgebung ausgesetzt wären. Dieses Problem wird in dem dritten Modell, der

modifizierten Monoschicht-Bindung (Abb. 1.8.C), korrigiert. Dabei werden nur die

Detergenzmoleküle im mittleren Bereich als Monoschicht angeordnet und die

Detergenzmoleküle an den beiden Enden sind mehr oder weniger parallel zu der

Proteinoberfläche.

Da die Membranproteine mit Detergenzmolekülen umhüllt werden, spielt die

Wechselwirkung zwischen Detergenzmolekülen eine entscheidende Rolle bei der

Kristallisation. Selbst ein winziger chemischer Unterschied im Detergenz kann ein

komplett anderes Kristallisationsverhalten verursachen (Ostermeier et al., 1997).

Allgemein gesagt, die Auswahl von Detergenz ist ein kritische Faktor bei der Arbeit mit

Membranproteinen, der nur durch Versuch und Irrtum bestimmt werden kann.

Abb. 1.8 Bindungsmodelle von Detergenz zum Membranprotein. A: Detergenzmoleküle und Protein werden als eine gemischte Mizelle gepackt. B: Die Detergenzmoleküle bedecken den hydrophoben Bereich des Proteins als Monoschicht. C: Nur die Detergenzmoleküle im mittleren Anteil werden als Monoschicht angeordnet, während die Moleküle an den beiden Enden parallel zur Proteinoberfläche liegen (le Maire et al., 2000).

A. mizellenartig B. Monoschicht C. modifizierte Monoschicht


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1.4 Stickstoffkreislauf

Stickstoff ist, neben Sauerstoff, Kohlenstoff und Wasserstoff, eines der vier wichtigsten

Elemente in Leberwesen und gleichzeitig das häufigste Element in der Atmosphäre. Die

Bindung innerhalb des Stickstoffmoleküls ist chemisch sehr stabil und besitzt eine

Dissoziationsenergie von 940 kJ/Mol N2 im Vergleich zu 493 kJ/Mol O2 der O2-

Doppelbindung. Daher ist nur eine relativ kleine Anzahl von Mikroorganismen in der Lage,

Stickstoff direkt zu verwerten. Andererseits besitzt Stickstoff sechs verschiedene

Oxidationsstufen, die eine Energiegewinnung bzw. Elektronenlieferung ermöglichen.

Zusätzlich ist Distickstoff die einzige N-Quelle für Aminosäuren, Nukleinsäuren und

zahlreiche andere Verbindungen, die für Organismen essentiell sind. Die in der Natur

vorhandenen Umsetzungen verschiedener Oxidationsstufe von Stickstoff werden im

Stickstoffkreislauf zusammengefasst (Abb. 1.9).

Abb. 1.9 Der Stickstoffkreislauf. Der Kreislauf wird in fünf Bereiche (1-5) gegliedert (Einsle et al. 2004).


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Der Stickstoffkreislauf wird in einzelne Bereiche gegliedert: Stickstofffixierung,

Nitrifikation, Denitrifikation, Nitratammonifikation und Anammox (anaerobe

Ammoniumoxidation).

Stickstofffixierung: Aufgrund der chemischen Stabilität sind nur einige spezielle

Prokaryoten in der Lage, Stickstoff zu reduzieren. Diese Bakterien können in zwei Klassen

eingeteilt werden: freilebende stickstofffixierende Bakterien wie z.B. Cyanobakterien und

symbiotische stickstofffixierende Bakterien wie z.B. Rhizobium. Der Fixierungsprozess

wird durch die Nitrogenase unter Verbrauch von ATP katalysiert. Die Nitrogenase besteht

aus zwei Untereinheiten, eine mit einem 4Fe-4S-Cluster und Bindungsstellen für

Mg2+/ATP (Fe-Protein), die andere mit einem α2ß2-Tetramer aus zwei P-Clustern und zwei

M-Clustern. Die Fixierung findet am M-Cluster statt, der in drei Varianten auftritt: Fe/Mo-

Cluster, Fe/V-Cluster und Fe/Fe-Cluster (Einsle et al., 2002; Tsai et al., 1995; Rees et al.,

2000). Neben der mikrobiologischen Fixierung kann Stickstoff auch durch das Haber-

Bosch-Verfahren industriell reduziert werden.

Nitrifikation: Bei der Nitrifikation werden Ammoniak bzw. Nitrit als Elektronendonoren

verwendet, die schrittweise zu Nitrat oxidiert werden. Ammoniak (oder Ammonium) wird,

zuerst katalysiert durch die Ammonium-Monooxygenase, zu Hydroxylamin umgesetzt, das

anschließend durch die Hydoxylamin-Oxidoreduktase zu Nitrit oxidiert wird. Schließlich

wird Nitrit mit Hilfe der Nitritoxidase zu Nitrat oxidiert. Nitrosomonas (ein

Ammoniakoxidierer) und Nitrobacter (ein Nitritoxidierer) sind typische nitrifizierende

Bakterien (King 1966).

Denitrifikation: Im Gegensatz zur Nitrifikation wird als Denitrifikation die schrittweise

Umwandlung von Nitrat zu Stickstoff bezeichnet. Dieser Vorgang ist der Hauptweg, auf

dem gasförmiger Stickstoff biologisch gebildet wird. Ein alternativer Weg hierfür ist

Anammox. Im ersten Schritt wird Nitrat durch die Nitrat-Reduktase in Nitrit umgesetzt,

das wiederum mit Hilfe der Nitrit-Reduktase zu Stickstoffmonoxid reduziert wird.

Distickstoffoxid (Lachgas) entsteht dann durch Reduktion von NO durch die

Stickstoffmonoxid-Reduktase. Schließlich wird es unter der Wirkung der Distickstoffoxid-

Reduktase zu freiem Stickstoff umgesetzt. Denitrifizierende Bakterien wie z.B.

Pseudomonas können bei diesem Prozess Energie gewinnen. Daher wird Denitrifikation

auch als Nitratatmung bezeichnet (Ferguson 1994).

Nitratammonifikation: Die Nitratammonifikation ist eine Variante der Nitratatmung. Nitrat

wirkt dabei auch als Elektronenakzeptor und wird zu Nitrit reduziert, ohne dass Stickstoff

gebildet wird. Die assimilatorische Reduktion von Nitrit zu Ammonium liefert keine


19

nutzbare Energie für Bakterien, vielmehr handelt es sich um einen Gärungsprozess, bei

dem Nitrit als exogener Elektronenakzeptor fungiert. Die Organismen ziehen aus der

Nitritreduktion letztlich doch einen Vorteil, indem sie während der Vergärung einen Teil

der Reduktionsäquivalente wieder gewinnen. Viele fakultativ anaerobe Bakterien

vermögen diesen Prozess durchzuführen, ein Beilspiel hierfür ist Enterobacter aerogenes

(Ward 1996).

Anammox: Anammox ist die Abkürzung für die anaerobe Ammoniakoxidation, ein

Prozess mit großer Bedeutung für die Abwasserreinigung, da die beiden

umweltschädigenden chemischen Verbindungen Nitrit und Ammoniak unter anaeroben

Bedingungen zu Stickstoff umgewandelt werden. Bakterien wie. z.B. Brocadia

anammoxidans sind für diese Prozesse verantwortlich. Das Schlüsselenzym der Reaktion

ist Hydroxylaminoxidoreduktase (Jetten et al., 1998).

1.5 Bedeutung von Nitrat und Nitrit

Es ist sehr eindeutig, dass Nitrat und Nitrit eine zentrale Bedeutung im Stickstoffkreislauf

haben. Sie spielen sowohl beim assimilatorischen als auch bei dem dissimilatorischen

Stickstoffmetabolismus eine wichtige Rolle. Beim dissimilatorischen Stoffwechsel

(Denitrifikation) dient Nitrat (Nitrit) als Elektronenakzeptor und Energie wird gewonnen.

Beim assimilatorischen Stoffwechsel (Nitratammonifikation) wirkt Nitrat (Nitrit) ebenfalls

als Elektronenakzeptor und obwohl dabei keine Energiegewinnung ermöglicht wird, ist das

Endprodukt Ammoniak eine bedeutende Stickstoffquelle für die Aminosäure- und

Nukleinsäurebiosynthese.


20

1.6 Das Nitratreduktasesystem in E. coli

Unter verschiedenen Wachstumbedingungen exprimiert E. coli drei unterschiedliche

Nitratreduktasen (Abb. 1.12).

Die erste ist die Nitratreduktase A (NRA, Abb. 10), die durch das Operon narGHJI codiert

wird. Dieses wird durch den Transkriptionsfactor FNR während anaeroben Wachstums

induziert und ermöglicht so die Verwendung von Nitrat als alternativem

Elektronenakzeptor. Die Synthese der Nitratreduktase A wird zusätzlich stark durch hohe

Konzentration von Nitrat induziert. Die zweite Reduktase ist die Nitratreduktase Z (NRZ),

codiert durch das Operon narZYWV. Sie wird unter verschiedenen Stressbedingungen wie

z.B. Nahrungsmangel oder bei saurem pH-Wert exprimiert und ermöglicht den

Abb. 1.10 Struktur der Nitratreduktase A (NRA) aus E. coli. a: Die Struktur vom NarGHI-Komplex mit zwei gebundenen Phospholipiden. b: Redoxkofaktoren von NarGHI mit der gleichen Orientierung wie in a. (Bertero et al., 2003)


21

Mikroorganismen, mit Nitrat zu überleben. Die dritte Reduktase ist die periplasmatische

Nap, die durch das Operon napFDAGHBC codiert wird und nur während anaeroben

Wachstums exprimiert wird. Die Synthese von Nap wird durch eine niedrige

Konzentration an Nitrat optimal und durch Nitrit schwach induziert. Aufgrund ihrer hohen

Affinität zur Nitrat ist Nap bei niedriger Konzentration an Nitrat physiologisch wichtiger

als die NRA. Im Gegensatz zu den Nitratreduktase A und Z, die membrangebunden sind

und an der Cytoplasmaseite liegen, ist Nap im Periplasma lokalisiert (Jia et al., 2004;

Clegg et al., 2002).

1.7 Das Nitritreduktasesystem in E. coli

Die Reduktion von Nitrat führt zur Produktion großer Mengen Nitrit, welches sehr toxisch

für Mikroorganismen ist. Daher muss Nitrit entweder ausgestoßen oder zu unschädlichen

Produkten reduziert werden. Zu disem Zweck exprimiert E. coli zwei Nitritreduktasen

(Abb. 1.12): die cytoplasmatische NADH-abhängige Nitritreduktase Nir und die

periplasmatische formiat-abhängige Nitrit Reduktase Nrf, die das Nitrat zu Ammoniak

reduzieren.

Abb. 1.11 Struktur von Cytochrom c Nitrit Reduktase aus Wolinella succinogenes. A: Die Dimerstruktur von NrfA. B: Die Anordnung der fünf Hämgruppen. (Einsle et al. 2000)


22

Nir wird durch das Operon nirBDECcysG codiert, wobei nirB und nirD für die beiden

Untereinheiten des Enzyms codieren. Das Gen cysG wird für die Synthese einer als

Sirohäm bezeichnete Häm-Gruppe, die als Bindungsstelle für Nitrit in der Nitritreduktase

fungiert, benötigt. In Übereinstimmung mit ihrer Funktion in der Nitritreduktion bei

anaerobem Wachstum auf Nirtit, wird der nirB Promoter koordiniert mit dem narG

Promoter reguliert. Nir ist in der Lage, unter Verwendung von NADH als Elektronendonor,

das Nitrit sofort nach der Entstehung zu Ammoniak zu reduzieren. Bei diesem Prozess

wird keine Energie konserviert.

Nrf, die durch das Operon nrfABCDEFG (Abb. 1.11) codiert wird, ist ebenfalls in der Lage,

das Nitrit im Periplasma zu Ammoniak zu reduzieren. NrfA und NrfB sind beides

Pentahäm c-Typ Cytochrome, während NrfC ein nicht-Häm Fe-S Protein und NrfD eine

membrangebundene Chinoldehydrogenase sind. Die anderen drei Proteine NrfE, NrfF und

NrfG sind für die Reduktaseaktivität notwendig. Bei der Reduktion werden Elektronen von

NrfD über NrfC und NrfB auf NrfA und schließlich zum Nitrit übertragen. Energie wird in

diesem Prozess durch Elektronentransport mittels einer membrangebundenen

Elektronentransportkette konserviert (Clegg et al., 2002; Jia et al., 2004; Wang et al., 2000).

1.8 Transport von Nitrat und Nitrit in E. coli

Da sich zwei der drei Nitratreduktasen (NRA und NRZ) im Cytoplasma befinden, kann

Nitrat nur reduziert werden, wenn es durch die Cytoplasmamembran in die Zelle

transportiert wird. Die Cytoplasmamembran ist aber im Inneren relativ zur Außenseite

negativ geladen, während Nitrat bei physiologischem pH-Wert (ca. 7.4) vollständig

deprotoniert ist. Es muss daher ein spezieller Mechanismus vorhanden sein, der das negativ

geladene Ion gegen die Membranbarriere transportieren kann. Während anaeroben

Nitratwachstums werden Nitritionen im Cytoplasma akkumuliert, die toxisch auf die Zelle

wirken. Sie müssen entweder nach außen transportiert oder zu Ammoniak reduziert werden.

E. coli exprimiert drei Membrantransporter, NarK, NarU und NirC (Abb. 1.12), die die

oben genannten Probleme lösen.


23

NapA

NapB

NapG

NapC

NapH NapFNarI/V

NarG/Z

NarH/Y

NrfA

NrfB

NirBNirD

NarK / NarU NirC

NrfC NrfD

NO3-

NO2-

NO2-

NH4+

NO2-

NH4+

NO2-

NO3- H+

NO3-

NO2-

Periplasm

Cytoplasm

Membrane AmtB

NarK ist ein Membranprotein mit 12 Transmembranhelices und spielt eine Rolle bei das

Aufnahme von Nitrat und Nitrit bzw. der Extrusion von Nitrit (Clegg et al., 2002; Jia et al.,

2004).

NarU ist homolog zu NarK und weist eine 75 %ige Identität in der Aminosäuresequenz auf.

Die physiologische Funktion ist ebenfalls ähnlich zu NarK, Jedoch ist die Expression von

NarK sowohl in der exponentiellen als auch stationären Phase deutlich stärker als bei NarU

(Jia et al., 2004; Clegg et al., 2006).

NirC wird als ein Nitrit/Proton Symporter vorgeschlagen (Clegg. et al., 2002) und ist in der

Lage, Nitrit aus dem Periplasma in die Zelle zu transportieren. Desweiteren wird über eine

mögliche Interaktion zwischen NirC und der cytoplasmatischen Nitritreduktase Nir

diskutiert, da die Geschwindigkeit der Aufnahme bzw. Reduktion von Nitrit in dem E. coli

Stamm, in dem nur NirC exprimiert wird (NarK-NarU-NirC+), sehr ähnlich ist (Clegg et al.,

2002; Jia et al., 2004).

Abb. 1.12 Nitrat-/ Nitritreduktasesystem und Nitrat-/ Nitrittransporter System in E. coli. Es werden drei Nitratreduktasen exprimiert: zwei membrangebundene Nitratreduktasen (NarA und NarZ) und eine periplasmatische Nitratreduktase (Nap). Zwei Nitritreduktasen werden ebenfalls von E. coli synthetisiert: die cytoplasmatische Nitritreduktase Nir und die periplasmatische Nitritreduktase Nrf. Das Nitrat-/ Nitrittransportsystem von E. coli besteht aus drei Membranproteinen: NarK, NarU und NirC. NarK und NarU fungieren hautsächlich als Nitrat/ Nitrit-Antiporter und NirC ist ein Nitrit/Protonen-Symporter. AmtB ist ein Ammoniumtransporter.


24

1.9 Daten von NirC aus E. coli

Anders als NarK und NarU, die zur MFS gehört, ist NirC ein Mitglied der FNT-Familie

(Formiat/Nitrat-Transporter). NirC wird durch das dritte Gen des nir Operons codiert und

ist ein integrales Membranprotein mit 6 Transmembranhelices, bestehend aus 268

Aminosäuren und mit einer theoretischen Größe von 28562,52 Da (ExPASy).

Abb. 1.13 Organisation des Operons nirBDEC (aus NCBI).


25

1.10 Aufgabenstellung und Zielsetzung

Ziel dieser Arbeit war vor allem Expression und Aufreinigung des Nitrittransporters NirC

aus E. coli. Das gereinigte NirC sollte kristallisiert werden. Die Kristalle sollten zur

Aufklärung der Struktur über Röntgenbeugungsexperimente genutzt werden. Für

biochemische Charakterisierung sollten ITC-Experiment durchgeführt werden und somit

die Bindungsparameter (ΔH, ΔG, ΔS und n) von NirC mit Ihrem Substrat Nitrit ermittelt

werden.

MMAATTEERRIIAALL UUNNDD MMEETTHHOODDEENN

26

2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 Primer-Design

Um die Sequenz von NirC durch PCR (Polymerasekettenreaktion) amplifizieren zu können,

wurden Primer erstellt (MWG-Biotech, Ebersberg). Die Primer wurden für den Vektor

pET-21a(+) (Merck Biosciences, Nottingham, UK) erstellt und enthielten Schnittstellen für

das 5’-Restriktionsenzym NdeI und das 3’-Restriktionsenzym XhoI bzw. EcoRI, wodurch

die Nutzung des His-Tags im Vektors pET-21a(+) möglich wurde (Lichty et al., 2005).

nirC_NdeI

5'- CAT ATG TTT ACA GAC ACT ATT AAT AAG TGT GCG GCT AAC GC -

3'

nirC_XhoI

5’- T CTC GAG ACC GGC AGC CGT TTC AGT TTG ATT -3’

nirC_EcoRI

5’- T GAA TTC CC GGC AGC CGT TTC AGT TTG ATT -3’

2.2 PCR-Amplifikation

Die Polymerasekettenreaktion (Mullis et al., 1986) zur exponentiellen Amplifikation des

linearen nirC-Fragments wurde mit oben beschriebenen Primern durchgeführt (Tab. 2.1

und 2.2). Die Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese überprüft. In dieser Arbeit

Abb. 2.1 Primer für die Amplifikation von nirC.


27

wurde der Thermocycler Whatman BIOMETRA Tpersonal zur PCR-Amplifikation

verwendet.

Tabelle 2.1 PCR-Reaktionsansatz.

Vol.

5' - Primer (100 µmol) 1 µl


5X Phusion Puffer (New England BioLabs) 2 µl

Phusion DNA Polymerase (New England BioLabs) 2 units/μl 0,5 µl

dNTPs (10 mM) 1 µl

DMSO (100 %) 0,5 µl

H2O 4 µl

Tabelle 2.2 Thermocycleprogramm

Temp. (°C) Dauer (sek.)

98 180

60 120

72 180

98 30

59 30 2x

72 40

98 30

56 30 25x

72 40

72 600

8 Pause


28

2.3 Klonierung und Transformation

Die Reinigung des PCR-Produkts erfolgte durch das QIAquick PCR Purification-Kit

(Qiagen, Hilden) gemäß dem vorgegebenen Standardprotokoll.

Die blunt-end PCR Produkte wurden zuerst in dem Vektor pPCR-Script Amp SK(+)

(Stratagene, La Jolla, USA) ligiert, weil die direkte Ligation des Inserts im pET-21a(+)

nicht funktioniert hat. Der Ansatz nach folgendem Protokoll wurde für 1 h bei

Raumtemperatur inkubiert und die Hitzeinaktivierung der T4 DNA Ligase erfolgte danach

durch zehnminütige Inkubation der Ansätze bei 65°C.

Tabelle 2.3 Ligationsansatz von PCR-Produkt mit dem pPCR-Script Amp SK(+) cloning Vektor.

Vol.

pPCR-Script Amp SK(+) cloning Vektor 1 μl

PCR-Script 10X Reaktionspuffer 1 μl

10 mM rATP 0,5 μl

geschnittenes Insert 4 μl

SrfI Restriktionsenzym 1 μl

T4 Ligase 1 μl

Wasser 1,5 μl

Das ligierte Plasmid pPCR-Script Amp SK(+)::nirC wurde in E. coli XL10(gold)

transformiert und auf XGal-IPTG-LB-Agarplatten ausgestrichen. Daraufhin erfolgte die

Selektion auf erfolgreich transformierte Zellen durch Zugabe der Antibiotika Kanamycin

(Kan) und Ampicillin (Amp) in das Agarplattenmedium, da Zellen, die mit dem

Plasmidkonstrukt erfolgreich transformiert wurden, einer positiven Selektion durch eine

genomcodierte Kan-, sowie plasmidcodierte Amp-Resistenz unterlagen. Darüber hinaus

wurden die Zellen durch eine Weiss-Blau-Färbe-Methode selektiert: Der Vektor pPCR-

Script Amp SK(+) codiert β-Galactosidase und in der Methode wird X-Gal (5-bromo-4-

chloro-3-indolyl-β-Dgalactopyronoside) als Substrat genutzt. Durch den gleichen

Mechanismus kann X-Gal wie auch Lactose durch die β-Galactosidase zu zwei Molekülen

gespalten werden, eines dieser Spaltprodukte wird durch Sauerstoff zu 5,5’-Dibrom-4,4’-


29

Dichlorindigo (blau) oxidiert. Deshalb können nur Zellen, die mit dem Plasmidkonstrukt

erfolgreich transformiert wurden, sich nicht färben, da das die ß-Galactosidase codierende

Gen durch das Insert kaputt gemacht wird.

Die positiven Kolonien wurden aufgenommen und in LB-Medium (5 ml) über Nacht bei

30 °C und unter ständigem Schütteln inkubiert.

Standard-Transformationsprotokoll

- 1µl Plasmidlösung zu 100 µl kompetenten Zellen des gewünschten Typs

- 30 min auf Eis inkubieren

- 10 min bei 37°C inkubieren (Hitzeschock)


- 200 µl LB-Medium zufügen

- 60 min bei 37°C und 300 rpm (Resistenzbildung)

- Plattierung bzw. Flüssigkultur

Der korrekte Einbau des nirC-Fragments wurde durch Agarosegelelektrophorese auf

gereinigte Plasmide überprüft, wobei zur Plasmidreinigung das Machery–Nagel Kit

NucleoSpinPlasmid verwendet wurde.

Das positive Plasmid pPCR-Script Amp SK(+)::nirC und der Vektor pET-21a(+) wurden

mit den Restriktionsenzymen NdeI/ XhoI bzw. NdeI/ EcoRI für zwei Stunden bei 37°C

verdaut. Die Hitzeinaktivierung der Enzyme erfolgte danach durch zehnminütige

Inkubation der Ansätze bei 65°C.

Tabelle 2.4 Restriktionsverdausansätze von Amp SK(+)::nirC und Vektor pET-21a(+).

Insert Vol. Vektor Vol.

NdeI 1 μl NdeI 1 μl

XhoI od. EcoRI 1 μl XhoI od. EcoRI 1 μl

Buffer O 1,5 μl Buffer O 1 μl

pPCR-Script Amp SK(+)::nirC 11,5 μl pET-21a(+) 7 μl


30

Um die Religierung des geschnittenen Vektors zu vermeiden, wurden die 5’-Enden des

linearisierten pET-21a(+) durch Calf Intestine Alkaline Phosphatase (CIAP)

dephosphoryliert. Der linearisierte Vektor wurde mit CIAP für 30 min bei 37 °C inkubiert.

Die Reaktion wurde durch fünfzehnminütige Inkubation bei 85 °C gestoppt.

Tabelle 2.5 Dephosphorylierungsansatz des geschnittenen Vektor pET-21a(+).

Vol.

Plasmid 10 μl

10X Reaktionspuffer 2 μl

Calf Intestine Alkaline Phosphatase 0,5 μl

Wasser 7,5 μl

Die dadurch entstandene nirC Fragmente und der dephosphorylierte pET-21a(+) wurden

auf Aagarosegel aufgetragen und anschließend durch Gel-Extraktion aufgereinigt. Danach

wurden sie zusammen ligiert. Die Ansätze wurden über Nacht bei Raumtemperatur

inkubiert.

Tabelle 2.6 Ligationsansatz.

Vol.

T4 Ligase Puffer 1 μl

T4 Ligase 1 μl

Vektor pET-21a(+) 2 μl

Insert nirC 6 μl

Die Ligationsprodukte wurden in E. coli XL10(gold) transformiert und dann auf LB-

Agarplatten ausgestrichen. Die Selektion erfolgte durch Zugabe der Antibiotika Ampicillin

in das Agarplatten bzw. die Flüssigkulturen. Die Flüssigkulturen (5 ml) vereinzelter Zellen

wurden über Nacht bei 30 °C inkubiert.

Nach der Aufreinigung wurde das Plasmid durch ein Agarosegel überprüft. Anschließend

wurde eine DNA-Sequenzierung zur Überprüfung der Basensequenz des

Plasmidkonstrukts eingesetzt.


31

2.4 Überexpression in E. coli

Um die Überproduktion einer großen Menge NirC zu erreichen, wurde pET21a-(+):nirC in

E. coli C43(DE3) transformiert. E. coli C43(DE3) ist eine Doppelmutante von E. coli

BL21(DE3). Die beiden Mutationspositionen sind noch unbekannt, aber sie beeinflussen

entweder die Aktivität oder die Menge der T7 RNA Polymerase. Beide Effekte verhindern

die Abkopplung von Transkription und Translation (Miroux and Walker, 1996; Terp 2006;

Arechaga 2000; Dumon-Seignovert et al., 2004).

Der 200 µl Transformationsansatz wurde in 100 ml LB-Medium gegeben und bei 30 °C

und ständigem Schütteln über Nacht inkubiert. Zur Gewinnung großer Proteinmengen

wurde Autoinduktionsmedium verwendet: 400 ml Autoinduktionsmedium wurde

zusammen mit 10 ml Vorkultur in einem 2 L Kolben für 22 – 24 Stunden bei 18 °C und

ständigem Schütteln inkubiert (Studier 2005; Eshaghi et al., 2005; Wang et al., 2002).

2.5 Reinigung von NirC

Ein effektiver Ansatz zur Reinigung eines Proteins besteht in der Nutzung von spezifischen

Polypeptidfusionen, die dem eigentlichen Proteinfragment weitere Aminosäuren

hinzufügen und so ein zur Reinigung verwendbares chemisches Charakteristikum zur

Verfügung stellen. Diese Affinitäts-Marker werden am Anfang (N-terminal) oder am Ende

(C-terminal) an das Proteinfragment angefügt.

Für die Reinigung von NirC wurde ein C-terminales 6-His-Tag-Fusionspeptid gewählt, so

dass NirC mit zwei Chromatographieverfahren aufgereinigt wurde:

Affinitätschromotographie und Gelfiltration.


32

Überexpression in E. coli C43

Zellernte

Zellaufschluss

Isolierung der Membranen

Solubilisierung mit Detergenz

Affinitätschromatographie

Gelfiltration

(Detergenzaustausch)

2.5.1 Zellernte

Die Zellen wurden durch Zentrifugation (4.000 g, 15 min, 4°C, Avanti J-20XP Series

High-Performance Centrifuge (Beckman Coulter, Harbor Boulevard, USA)) in 1l-Bechern

sedimentiert. Das Zellpellet wurde dann in steril filtriertem Aufschlusspuffer (50 mM

HEPES pH 8.0, 500 mM NaCl, 10 % Glycerol) resuspendiert: 1g Pellet ~ 2 ml Puffer.

2.5.2 Zellaufschluss

Zur Isolierung der Membranfraktion wurden die Zellen mittels Microfluidizer

(Microfluidics European Headquarters, Lampertheim) aufgeschlossen. Bei dieser Methode

ermöglichen grossen Scherkräfte, die beim Aufeinandertreffen zweier Flüssigkeitsstrahlen

Abb. 2.2 Methodenschema. Aufreinigung von NirC.


33

unter hohem Druck auftreten, einen effizienten Aufschluss der Zellen. Die Zelllyse mittels

Microfluidizer wurde bei einem Druck von ca. 80 psi durchgeführt und 5-7mal wiederholt.

2.5.3 Isolierung der Membranen

Um unlösliche Zelltrümmer aus dem Zellaufschluss zu entfernen, wurde die Suspension

bei einer Geschwindigkeit von 20.000 g zentrifugiert (30 min, 4 °C, Avanti J-30I High-

Performance Centrifuge (Beckman Coulter Harbor Boulevard, USA)) und das Pellet

verworfen. Der Überstand wurde noch einmal durch eine Ultrazentrifugation (100.000 g, 3

Stunden, 4 °C, Avanti J-30I High-Performance Centrifuge (Beckman Coulter Harbor

Boulevard, USA)) zentrifugiert, so dass die unlösliche Membranfraktion sedimentierte.

Nach Entfernung des Überstands wurde das Pellet (Membran) gewogen und anschließend

mit Aufschlusspuffer resuspendiert: 1g Membran ~ 10 ml Puffer.

2.5.4 Solubilisierung mit Detergenz

Um die Membranproteine zu reinigen sowie weiter verarbeiten zu können, müssen sie

zuerst „in Lösung“ gebracht werden. Dies wird durch Zugabe von Detergenz erreicht.

Detergenzien sind chemische Verbindungen, die ein polares Ende und ein unpolares Ende

besitzen. Sie können Membranprotein aus Membranen herauslösen und einen so genannten

Detergenz-Protein-Komplex bilden. Dieser ist wasserlöslich. Es gibt zwei wichtige

Parameter für Detergenzien: CMC (kritische mizelläre Konzentration) und die

Aggregationsnummer. Als kritische mizelläre Konzentration bezeichnet man die

Grenzkonzentration, bei der Detergenzien Mizellen bilden. Die Aggregationsnummer ist

die mittlere Anzahl an Detergenzmolekülen in einer Mizelle.

NirC wurde mit LDAO (n-Dodecyl-N,N-dimethylamin-N-Oxide) solubilisiert: 10 ml 10 %

LDAO-Lösung (in dem selben Puffer wie die Membranen) wurde tropfenweise unter

ständigem Rühren zu der Membransuspension (40 ml) titriert. Die Lösung wurde dann

weiter für weitere 30 Minuten gerührt. Die unlöslichen Fette und Lipide wurden durch eine

Zentrifugation (100.000 g, 45 Minuten, 4°C) sedimentiert. Der Überstand, der Detergenz-

Protein-Komplexe enthielt, wurde zur weiteren Aufreinigung benutzt.


34

2.5.5 His-Tag Affinitätschromatographie

Da NirC zusammen mit 6 C-terminalen Histidinen exprimiert wurde und die Imidazolringe

von Histidin Nickelionen chelatieren, wurde NirC durch Affinitätschromatographie mit

einer His-Trap Säule als erstem Reinigungsschritt aufgereinigt. Der Säulenlauf selbst

wurde mit Hilfe eines Äktaprime-Chromatographiesystems (GE Healthcare, München)

kotrolliert. Die Verlaufsdiagramme der Reinigung wurden mit dem Programm PrimeView

erstellt. Die verwendeten Puffer wurden entgast und sterilfiltriert. Die HisTrap Säule

wurde zuerst mit 5 Volumina ddH2O gewaschen. Eine Äquilibrierung erfolgte mit

mehreren Volumina Puffer A (50 mM HEPES pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, 0,1

% LDAO). Anschließend wurde die Proteinfraktion über einen 50 ml Superloop auf die

Säule geladen. Um die Spezifität der His-Tag-Bindung zu gewährleisten, wurden 30 mM

Imidazol vor Ladung zu der Proteinfraktion zugegeben. Verunreinigungen wurden durch

schrittweises Erhöhen der Konzentration an Imidazol (bis zu 150 mM) im Puffersystem

entfernt. Danach wurde NirC durch einen Konzentrationsgradienten von Imidazol (150

mM zu 300 mM über 40 ml) eluiert. Die Proteinfraktionen wurden mittels SDS-PAGE auf

ihre Zusammensetzung analysiert. Die Fraktionen mit NirC wurden gesammelt. Zur

weiteren Verwendung für die Gelfiltration wurde die Proteinlösung mittels einer

Ultrazentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 50 kDa und Zentrifugation

(3000 g, 4 °C) auf ein Volumen von ca. 1 ml ankonzentriert.

2.5.6 Größenausschlußchromatographie

Das Protein NirC war nach der His-Tag-Reinigung schon sehr sauber. Um die

verschiedenen Polymerformen zu trennen, wurden sie auf eine Gelfiltrationssäule

aufgetragen. Das Prinzip der Gelfiltrationschromatographie ist die Separation von

Molekülen unterschiedlicher molekularer Größe. Abhängig von der Porengröße wird

Molekülen bis zu einem bestimmten Stokes-Radius das Eindringen in den Innenraum

spezieller Gelkugeln erlaubt. Die Häufigkeit eines solchen Ereignisses ist umgekehrt

proportional zur molaren Größe der über die Säule gepumpten Teilchen. Deshalb besitzen


35

Proteine höherer molekularer Größe eine geringere Retentionszeit als Proteine niedrigerer

Größe. Damit können die Proteine nach ihren Größen getrennt werden.

Zur Reinigung von NirC wurde eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule verwendet. Die

Säule wurde mit drei Säulenvolumen Wasser und anschließend mit drei Säulenvolumen

Aufreinigungspuffer (50 mM HEPES pH 8, 200 mM NaCl, 10 % Glycerol, und

entsprechende Detergenz) äquilibriert. 1 ml ankonzentrierte Proteinprobe wurde auf die

Säule bei einer Flussrate von 1 ml/min aufgetragen. Der Durchlauf der Säule wurde

fraktioniert und durch SDS-PAGE analysiert. Fraktionen, die NirC enthielten, wurden

mittels einer Ultrazentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 50 kDa und

Zentrifugation (3000 g, 4 °C) ankonzentriert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem

colorimetrischen BCA-Test bestimmt.

2.5.7 Austausch von Detergenz

Das mit einem Detergenz aufreinigte Protein wurde erneut auf eine 1 ml HisTrap FF Säule

geladen. Anschließend wurde die Säule mit ca. 30 ml Puffer, welcher das zweite Detergenz

enthielt, gewaschen. Am Ende wurde das Protein mit Elutionspuffer eluiert.


36

2.6 Analytische Methoden

2.6.1 Agarosegelelektrophoresen

Die Agarosegelelektrophorese ist eine Methode, um Nukleinsäure-Fragemente (RNA oder

DNA) nach ihrer Größe zu trennen und diese durch Vergleich mit Markern bekannter

Größe (GeneRuler DNA Ladder Mix, Fermentas, St. Leon-Rot) zu bestimmen. Lange

Fäden aus Agarosepolymeren werden zu einem Gel vernetzt. Je höher die Agarose

konzentriert ist, desto kleiner sind die Poren, die sich in dem Gel befinden. Die

Gelelektrophorese funktioniert wie ein Sieb für Moleküle. Ein elektrisches Feld wird

verwendet, um die negativ geladenen Nukleinsäure-Moleküle durch die Gelmatrix zu

ziehen, wobei die kleineren Fragmente sich schneller durch das Gel bewegen können und

somit eine Auftrennung der Stränge nach ihrer Größe ermöglicht wird.

Zur Fertigung des Gels wurde TAE-Puffer (Tris-Acetat-EDTA) mit 1 % Agarose (w/v)

versetzt, aufgekocht und polymerisiert. Die DNA-Proben wurden zusammen mit

Ladepuffer in die Gelmatrix aufgetragen. Das Auftrennen wurde mit einer Spannung von

60 V in TAE-Puffer erreicht. Nach dem Lauf wurde das Gel für 15 min in Ethidiumbromid

(5 mg/ml in Wasser) unter ständigem Schütteln inkubiert. Da sich Ethidiumbromid in die

DNA einlagert und im UV-Licht fluoreszieren kann, sind die DNA-Moleküle unter einer

UV-Lampe (Gel Doc EQ System, BIORAD, Müchen) sichtbar.

Tabelle 2.7 Zusammensetzung von TAE-Puffer.

TAE-Puffer Vol.

Tris 40 mM

Borsäure 20 mM

EDTA 1 mM


37

Tabelle 2.8 Zusammensetzung von Fermentas 6x Ladepuffer für Agarosegelelektrophores.

Fermentas 6x Ladepuffer Vol.

Tris-HCl (pH 7,6) 10 mM

Bromphenolblau 0,03 %

Xylen cyanol FF 0,03 %

Glycerol 60 %

EDTA 60 mM

Tabelle 2.9 Probe für Auftragung.

Probe für Gelauftrag Vol.

Probe 3 µl

Fermentas 6x Ladepuffer 1 µl

ddH2O 2 µl

2.6.2 Gelextraktion

Gelextraktion ist eine sehr effiziente Methode zur Reinigung von DNA-Fragmenten und

Plasmid-DNA aus Agarosegelen. Nach dem Agarosegelektrophorese wurden die DNA-

Banden aus dem Gel unter UV-Licht ausgeschnitten. Dann wurde die DNA nach dem

Protokoll des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) aufgereinigt.

2.6.3 SDS-PAGE

SDS-PAGE (Abkürzung für engl. Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel

electrophoresis) ist eine analytische Methode zur Trennung von Polypeptiden im

elektrischen Feld. Als Trennmedium dient ein Gel auf Polyacrylamidbasis. Zusätzlich

kommt SDS zum Einsatz. Dieses anionische Detergenz überdeckt die Eigenladung von

Proteinen, so dass die Proteine eine konstante Ladungsverteilung aufweisen. Außerdem


38

kann SDS die Sekundär- und Tertiärstrukturen von Proteinen (teilweise) aufbrechen.

Damit erfolgt die Auftrennung im elektrischen Feld nur anhand der Molekülgröße.

Zur Bestimmung der Reinheit des NirC wurden die Proteinproben zusammen mit nicht

reduzierendem Ladepuffer (Fermentas) auf das Gel (Trenngel: 12,5 % Bis-acrylamid;

Sammelgel: 5 % Bis-acrylamid) aufgetragen. Die SDS-PAGE wurde mit Stromstärken von

20 mA durchgeführt. Als Größenstandard wurde der „Protein Molecular Weight

Marker“ von Fermentas verwendet.

Tabelle 2.10 Zusammensetzung von Trenngel und Sammelgel für SDS-PAGE.

Trenngel 1x [ml] 12,50 % Sammelgel 1x [ml] 5 %

Bis-acrylamid 30% 3 Bis-acrylamid 30% 0,5

1,88 M Tris/HCl, pH 8.8 1,8 1,88 M Tris/HCl, pH 8,8 0,6

0,5% SDS 1,8 0,5 % SDS 0,6

ddH2O 2,4 ddH2O 1,3

TEMED [µl] 8 TEMED [µl] 3

10% APS [µl] 45 10 % APS [µl] 15

Nach dem Lauf wurden die Gele mit ca. 50 ml Coomassie-Lösung gefärbt. Dafür wurden

die Gele 30-60 min in der Färbelösung inkubiert, bis die Markerbanden zu erkennen waren.

Dann wurden die Gele mit 10 % Ethanol entfärbt.

Tabelle 2.11 Coomassie Färbung.

Coomassie-Lösung (50 ml)

Ethanol 10 %

Essigsäure 5 %

1 % (w/v) Coomassie Brillant Blue G 40 µl

1 % (w/v) Coomassie Brillant Blue R 160 µl


39

2.6.4 Western Blot

Ein Western Blot bezeichnet den Transfer von Proteinen auf eine Trägermembran, welche

anschließend über unterschiedliche Reaktionen nachgewiesen werden können. Vor dem

eigentlichen Western Blot wird ein Proteingemisch mit Hilfe einer SDS-PAGE aufgetrennt.

Dann werden die Proteine vom Polyacrylamid-Gel durch ein senkrecht zum Gel angelegtes

elektrisches Feld eluiert und auf eine Membran transferiert. An der Membranoberfläche

bleiben die Proteine aufgrund hydrophober Wechselwirkungen haften. Dann können die

Proteine über eine Immunodetektion visualisiert werden. Dabei bindet ein

antigenspezifischer Primär-Antikörper an Epitope des gesuchten Proteins. An den primären

Antikörper bindet wiederum ein sekundärer Antikörper, über welchen die Detektion erfolgt.

In dieser Arbeit wurden Anti-PentaHis Antikörper als primärer, AP-gekoppelte Anti-Maus-

Antikörper als sekundärer Antikörper benutzt. Der Nachweis erfolgt dabei durch eine

Färbreaktion mit dem artifiziellen Substrat BCIP und NBT, die durch AP katalysiert wird.

Der Ablauf wurde nach dem Protokoll von QIAexpress durchgeführt.

2.6.5 Dünnschichtchromatographie (DC)

Um das Detergenz und Phospholipid in NirC quantitativ zu bestimmen, wurde eine

Dünnschichtchromatographie durchgeführt. Dieses Trennsystem besteht aus zwei Phasen:

einer stationären und einer mobilen Phase. Als stationäre Phase wird die Kieselgelschicht

an der Glasoberfläche bezeichnet. Die mobile Phase ist ein Lösungsmittel mit definierter

Zusammensetzung. Auf der Startlinie der DC-Platte wird das zu untersuchende Gemisch

aufgetragen. Dann wird die DC-Platte senkrecht in eine mit Laufmittel (mobile Phase) für

mindesten 30 Minuten äquilibrierte DC-Kammer gestellt, in die die DC-Platte zu einem

geringen Teil eintaucht. Das ganze System wird dann verschlossen. Das Laufmittel saugt

sich nun über Kapillarkräfte in die stationäre Phase nach oben. Sobald die Flüssigkeit die

Probe erreicht, werden seine Komponenten gelöst. Die Moleküle in der Probe sind nun den

Anziehungskräften der stationären Phase einerseits und den Anziehungskräften der

mobilen Phase andererseits ausgesetzt. Je nach Kräfteverhältnis wandern die Moleküle


40

unterschiedlich weit nach oben. So werden sie aufgetrennt. Da das Kieselgel selbst polar

(Si-O Bindung) ist, laufen polarere Moleküle aufgrund der Dipol-Dipol-Kräfte weniger

weit. Für die mobile Phase gilt allgemein: Je polarer das Laufmittel ist, desto weiter

wandern polare Substanzen, und umgekehrt (Peterson et al., 2006).

Nach der Trennung wurden die DC-Platten für ca. 8 Sekunden in eine CuSO4 Lösung

eingetaucht und bei 110 °C getrocknet. Anschließend wurden die Platten bei 170 °C

gebacken und die Detergenzien oder Phospholipide wurden verascht, so dass sie sichtbar

wurden. Die Flächen der Banden wurden mit der Software „Aida Image

Analyzer“ bestimmt. Eine Eichgrade wurde mit verschiedenen Detergenzien bekannter

Menge erstellt. Dann wurde das Detergenz in der Proteinprobe durch Vergleich zur

Eichgrade quantifiziert.

Das Laufmittel für die Quantifizierung des Detergenz bestand aus Chloroform/ Methanol /

Ammonium Hydroxid (63 / 35 / 5)

Für die Bestimmung des Phospholipids wurde: Chloroform/ Methanol / Essigsäure (65 / 25

/ 8) als Laufmittel verwendet.

2.6.6 Lipidextraktion

Für die (quantitative) Bestimmung von Phospholipiden im NirC wurde das Lipid aus dem

Protein nach dem Protokoll von Bligh und Dyer (1959) extrahiert. Zur Extraktion wurde

die Proteinprobe mit 0,8 ml Wasser, 2 ml Methanol und 1 ml Chloroform in einem 8 ml

Glasgefäß (Kimble) gemischt. Die Mischung wurde kräftig gevortext und anschließend

wurden 1 ml Chloroform und 1 ml Wasser dazugegeben. Nach weiterem kräftigem

Vortexen wurden die Mischung für 10 Minuten bei 1500 rpm und 4 °C zentrifugiert. Die

untere Phase (Chloroform mit Lipid) wurde in ein sauberes 8 ml Glasgefäß (Kimble)

transferiert und unter Stickstoffbegasung eingedampft. Der Rückstand (Lipid) wurde für

die weitere Verwendung in Chloroform (DC oder saure Methylierung) gelöst.


41

2.6.7 Saure Methylierung

Für die Quantifizierung der Fettsäuren wurden die Phospholipide zuerst nach Protokoll

(Miquel und Browse 1992) transmethyliert. Die extrahierten Phospholipide wurden in

kleinen Pyrex-Gläschen mit 1 ml FAME-Lösung und 0,4 μg internem Standard (Tri-

Heptadecanoat) gemischt. Die Gläschen wurden mit Argon überschichtet, um eine

mögliche Oxidation durch Sauerstoff zu vermeiden. Das Reaktionsgemisch wurde für 60

Minuten bei 80 °C inkubiert. Anschließend wurden 200 μl gesättigte NaCl-Lösung und 2

ml n-Hexan zugegeben. Nach kräftigem Vortexen wurde die Mischung für 10 Minuten bei

1500 rpm zentrifugiert. Die obere Phase (n-Hexan mit Fettsäure) wurde in neues Pyrex-

Gläschen transferiert und unter einem Stickstoffstrom eingedampft. Die untere Phase

wurde noch einmal mit 2 ml n-Hexan nach oben genanntem Prozess extrahiert. Die obere

Phase wurde dann in das mit Stickstoff begaste Gläschen gegeben. Der Rückstand wurde

in 2 ml n-Hexan aufgenommen. Zur Entfernung der sauren Reste wurden 2 ml tridest.

Wasser hinzugefügt. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 1500 rpm wurde die obere

Phase durch eine mit Watte und Natriumsulfat befüllte Pasteur-Pipette (Abb. 2.3) laufen

gelassen. Anschließend wurde die restliche Probe durch die Pipette gedrückt. Nach

Eindampfen unter einem Stickstoffstrom wurde der Rückstand (Fettsäure) in 10 μl

Acetonitril resuspendiert, gevortext und kurz zentrifugiert. Danach wurde die Lösung in

Gaschromatographie-Gläschen mit Einsatz abgefüllt, der entweder zur GC-Analyse

verwendet oder bei – 20 °C aufbewahrt wurden.

FAME-Lösung - 2,5 % H2SO4 - 2 % Dimethoxipropan - in Methanol lösen

Abb. 2.3 Pasteurpipette mit Na2SO4 und Watte.


42

2.6.8 Gaschromatographie

Die Gaschromatographie (GC) ist eine sehr empfindliche Methode zur Analyse von

Stoffgemischen, bei der als mobile Phase ein Inertgas mit guten Strömungseigenschaften,

meist Stickstoff, Helium oder Wasserstoff verwendet wird. Dieses Trägergas wird durch

eine Säule geleitet. Die Säule wird mit einem bestimmten Material ausgekleidet, der

stationären Phase. Das Messprinzip beruht auf zwei Prinzipien. Das erste bezieht sich auf

die unterschiedlichen Siedepunkte der Einzelsubstanzen in dem Gemisch. Das zweite ist

die spezielle Wechselwirkung des zu analysierenden Stoffes mit der stationären Phase. Die

Stärke der Wechselwirkung zwischen den Probenkomponenten und der stationären Phase

wird sowohl von deren Struktur als auch von deren funktionellen Gruppen bestimmt

(Eiceman 2000).

2.6.9 GC/ MS

Durch Vergleich der Retentionszeit bei der GC mit dem Standard konnten bereits die

Fettsäuren in der Probe (quantitativ) identifiziert werden. Um das Ergebnis zu bestätigen,

wurde eine sogenannte GC/MS-Kopplung durchgeführt, das heißt eine Kombination von

Gaschromatographie und Massenspektrometrie.

Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren zum Messen des Masse-Ladung Verhältnisses

(m/q) von Teilchen. Bei bekannter Ladung q kann die Masse m der Teilchen ermittelt

werden. Die zu untersuchende Probe wird in das MS eingebracht, verdampft und ionisiert.

Abb. 2.4 Schematische Darstellung eines GC. 1:

Trägergas 2: Injektion 3: Säule im GC-Ofen 4:

Detektor 5: Signalaufzeichung

(http://de.wikipedia.org/wiki/Gaschromatographie).


43

Als bewegte geladene Teilchen lassen sich die Ionen in einem Analysator nach ihrem

Masse-Ladungs-Verhältnis auftrennen und anschließend detektieren. Dies ermöglicht

Aussagen über das Vorhandensein und die Menge der Teilchen. Der Aufbau eines MS lässt

sich somit in vier Hauptkomponenten gliedern: Probenaufnahmesystem, Ionisierung,

Massentrennung und Detektion (Watson et al., 1965).

2.6.10 Aggregationstest

Um zu bestimmen, welche Detergenzien geeignet sind für NirC, wurde ein

Aggregationstest durchgeführt. Das Prinzip beruht darauf, dass aggregierte Proteine das

Licht bei einer Wellenlänge von 320 nm absorbieren. Sinkt die Absorption, bedeutet das,

dass ein neues Detergenz die Proteine besser solubilisieren kann, und umgekehrt (Wiener

2004). Die mit DDM gereinigte Proteinprobe, wurde mit verschiedenem Detergenz bis zu

einem Volumen von 300 μl gemischt, wobei die Konzentration an Protein 1 mg/ml betrug

und die Konzentration an dem neuen Detergenz das 10 Fache seines CMC ausmachte. Die

Absorbtion der Mischung bei 320 nm wurde mit einem Zeitabstand von 20 Sekunden für

30 Minuten gemessen.

Abb. 2.5 Schematischer Aufbau eines GC/MS-Systems.


44

2.7 Kristallisation von gereinigtem NirC

Um die dreidimensionale Struktur von NirC durch Röntgenbeugungsexperimente zu lösen,

muss NirC zuerst kristallisiert werden. Im kristallinen Zustand sind die atomaren Bausteine

(Atome, Ionen, Moleküle) in dreidimensional periodischer Weise angeordnet. Die

Kristallisation wird sowohl thermodynamisch als auch kinetisch reguliert.

Thermodynamik: Eine chemische Reaktion kann ohne Energiezufuhr ablaufen, wenn

dadurch die freie Energie G des Systems abnimmt. Die Änderung der freien Energie ΔG

bei der Keimbildung setzt sich aus zwei Termen zusammen. Ein Term spiegelt die

Grenzflächenenergie des Keims wider, der kugelförmig zur umgebenden Lösung

angenommen wird. Er ist proportional zur Oberfläche (r2) des Keims und stets positiv. Der

zweite Term ist immer negativ und proportional zur Stoffmenge (Volumen, r3), die in die

kristalline Phase übergeht. Verfolgt man ΔG als Funktion des Keimradius r, so überwiegt

bei kleinem r der Oberflächenterm, d.h. bei der Bildung eines kleinen Keims wird die freie

Energie des Systems erhöht, und es muß Arbeit - die Keimbildungsarbeit - geleistet werden.

Die Funktion durchläuft ein Maximum bei r*, dem kritischen Keimradius. Erst wenn ein

Keim unter Aufwendung der Keimbildungsarbeit ΔG* diese kritische Größe erreicht hat,

wird durch sein weiteres Wachstum die freie Energie des Systems wieder verringert, der

Keim ist stabil und wird weiter wachsen. Zur Keimbildung muß das thermodynamische

Gleichgewicht überschritten werden. Eine Potentialdifferenz muß als Triebkraft aufgebaut

werden, um Energie für die Formierung der Phasengrenzfläche zu gewinnen.

Kinetik: In den meisten Fällen, selbst wenn es thermodynamisch günstig ist, kristallisiert

das Protein nicht, da die Kristallisation zusätzlich kinetisch kontrolliert wird. Eine zu

schnelle Aggregation der Proteine führt nicht zu geordneten Kristalle, sondern zu

ungeordnetem Proteinpräzipitat. Ist der Prozess zu langsam, dann ist die Kristallisation

zwar theoretisch realisierbar, der Kristall entsteht jedoch praktisch nicht oder erst nach

einem Zeitraum von Monaten oder Jahren.

Allgemein gesagt, sind es viele Faktoren, wie z. B. Temperatur, pH-Wert, Art und

Konzentration von Fällungsmittel, Ionstärke, Additive usw., die die Kristallisation von

Protein beeinflussen können.

In dieser Arbeit wurde Dampfdiffusion zur Kristallzüchtung eingesetzt. Bei diesem

Verfahren wird versucht, die Keimbildungszone durch Äquilibrieren eines Tropfens gegen


45

ein größeres Volumen (Reservoir) zu erreichen. Der Tropfen ist ein Gemisch von

Reservoir- und konzentrierter Proteinlösung in einem Verhältnis von in der Regel 1:1. Das

Reservoir enthält das Fällungsmittel. Die Triebkraft für die Äquilibrierung stammt aus dem

Konzentrationsgradienten zwischen Reservoir und Tropfen und wird über die Dampfphase

ausgeglichen. Die geeignete Kristallisationsbedingung wird durch eine große Zahl von

Screens gesucht.

2.7.1 Vorgefertigte und kommerziell erhältliche Screens

Die Kristallisationsansätze wurden nach der „sitting drop“-Methode angefertigt. Die

Screens wurden in „Cryschem Plate“- (Hampton Research, Aliso Viejo, USA)

Kristallplatten auf Eis mit jeweils 1µl Protein (10 mg/ml) zu 1µl Reservoirlösung (400 µl)

pipettiert und mit Crystal Clear Sealing Tape (Hampton Research) verschlossen. Die

Platten wurden dann bei 4 °C gelagert.

Tabelle 2.12 Liste eingesetzter Kristallisierungsscreens

Name Bedingungen Quelle

Crystal Screen I 48 Hampton Research

Crystal Screen II 48 Hampton Research

MemStart Screen 48 Hampton Research

MemSys Screen 48 Hampton Research

Natrix Screen 48 Hampton Research

PEG/Ion Screen 48 Hampton Research

Structure Screen 48 Hampton Research

Footprint Screen I 24 Stura

Footprint Screen II 24 Stura

Footprint Screen III 24 Stura

JB Membrane Protein Screen I 24 Jena Bioscience

JB Membrane Protein Screen II 24 Jena Bioscience

JB Membrane Protein Screen III 24 Jena Bioscience

Sigma Membrane protein Screen 50 Sigma


46

2.7.2 Feinscreen, Additive Screen und Detergent Screen

Die Kristalle wurden in drei initialen Bedingungen gefunden.

1). 0,1 M Natriumcitrat pH 3,5, 0,1 M Li2SO4, 30 % PEG 400)

2). 0,2 M Imidazolmalat pH 5,5, 33 % PEG 600

3). 0,05 M Cacodylat/HAc pH 6,5, 0,12 M Natriumbenzoat

Eine Serie von Feinscreens wurde pipettiert, um die pH-Werte, Ionstärke,

Proteinkonzentration, Präzipitantkonzentration und die Tropengröße zu variieren. Die sich

daraufhin anschließende Verfeinerung der Kristallformen wurde durch die Nutzung des

Additive Screen I-IV, Detergent Screen I-III (Hampton Research) und Detergent Screen 1-

2 (Sigma) versucht.

2.7.3 Microseeding

Um größere Kristalle mit besserer Streuungsqualität zu bekommen, wurde Mikroseeding

durchgeführt. Dafür wurden gut gewachsene Kristalle mit einem Plastikhomogenisierer

zerstört und anschließend in Stabilisierungslösung (Reservoir mit 20 % mehr Präzipitant)

resuspendiert. Die Mikrokristalle wurden dann durch eine Verdünnungsreihe von 10 bis

106 verdünnt und bei 4 °C gelagert. Screens mit denselben Bedingungen, in denen die

Kristalle gewachsen waren, wurden mit niedrigeren Präzipitantkonzentrationen pipettiert

und für ca. 2 Stunden äquilibriert. Dann wurden jeweils 0,3 μl Keime aus verschiedenen

Verdünnungsstufen dazu gegeben. Die Platten wurden anschließend bei 4 °C gelagert

(Bergfors 2003; Saridakis et al., 2000).


47

2.7.4 Kryobedingungen

Bei der klassischen Methode wird der Kristall mit etwas Reservoirlösung in eine Kapillare

aufgenommen. Anschließend wird der Kristall “trocken“ gelegt, d.h. die den Kristall

umgebende Lösung wird mit Kapillaren und Filterpapier entfernt. Danach wird die

Kapillare luftdicht mit Wachs verschlossen, so dass der Kristall nicht austrocknen kann.

Um die Strahlenschäden durch Röntgenstrahlung zu verringern, werden Kryotechniken

angewendet, da die Kühlung die Immobilisierung von OH-Radikal bewirkt, welches durch

Röntgenstrahlung aus dem Wasser erzeugt wird und schädlich für das Proteinkristall ist.

Dafür muss eine geeignete Kryobedingung herausgefunden werden. Normalerweise

werden höhere Konzentrationen an Präzipitanz oder ein zusätzliches Kryoprotektant

verwendet. In dieser Arbeit wurde dieselbe Lösung aus dem Reservoir, jedoch mit 35 %

PEG 400, als Kryobedingung benutzt.

2.7.5 Kristall Annealing

Die Kryotechnik kann die Kristalle vor Ausbildung von Eis schützen, bringt aber auch

Probleme mit: Sie führt manchmal Gitterunordnung ein, die wieder zur erhöhter Mosaizität

und reduzierter Beugungsauflösung führt.

Kristall Annealing ist eine einfache Methode, die machmal die Streuungsqualität nach

Kryobehandlung verbessern kann. Denn das ungeordnete Gitter kann möglich dadurch

wieder geordnet werden.

In dieser Arbeit wurde dieser Prozess folgendermaßen durchgeführt: Die Kristalle wurden

aufgenommen, sofort in flüssigen Stickstoff eingefroren und anschließend unter dem

kalten Stickstoffstrom von Diffraktormeter platziert. Dann wurde der kalte Strom für ca. 2

Sekunden dreimal mit einem Zeitabstand von 6 Sekunden blokiert. Nun waren die Kristalle

bereit für das Röntgenbeugungsexperiment (Harp et al., 1998; Heras et al., 2005; Newman

2005).


48

2.7.6 Kristall Dehydrierung

Proteinkristalle enthalten typischerweis mehr als 50 % Wasser (Masse) und es ist bekannt,

dass die Reduzierung des Wassergehalts zu enger gepackten und besser geordneten Kristall

führen kann (Salunke et al., 1985; Frey, 1994). Kristalldehydrierung ist ein sehr wertvolles

Verfahren für diese Absicht. In dieser Arbeit wurde der Kristalle enthaltende

Kristallisationsansatz gegen Reservoirs, die jeweils 5 % mehr Präzipitanz als die

vorherigen enthielten, über Nacht äquilibriert. Dieser Prozess wurde 5- bis 6-mal

wiederholt (Heras et al., 2005; Newman 2005).

2.7.7 Röntgenbeugungsexperimente

Das Ziel von Röntgenbeugungsexperimenten an Proteinkristallen ist der Erhalt einer

Elektronendichteverteilung in der dreidimensionalen Einheitszelle des Kristalls. Grundlage

aller Röntgenbeugungsexperimente an einem Kristall ist das Gesetz von Bragg.

λθ ⋅=⋅ nd )sin(2 1)

(λ = Wellenlänge, d = Abstand der Ebenenschar im Kristall, θ = halber Winkel zwischen eintretendem und austretendem Strahl)

Die Datensammlung erfolgte ausschließlich nach dem Prinzip der Rotationsmethode bei

Verwendung monochromatischer Röntgenstrahlung. Dabei wird der Kristall um eine

Achse senkrecht zum einfallenden Röntgenstrahl um den Winkel φ gedreht. Die Reflexe

der durch die Drehbewegung in Reflexion gebrachten Netzebenen werden von einem

Flächendetektor aufgenommen, der Intensität und Lage des Reflexes registriert. Um einen

vollständigen, redundanten Datensatz zu erhalten, muss der Kristall um einen seiner

Symmetrie entsprechenden Betrag gedreht werden.


49

2.8 ITC (engl. Isothermal Titration Calorimetry)

ITC ist eine biophysikalische Technik, welche die Bindungsaffinität (Ka), Änderung der

Enthalpie (ΔH) und Bindungsstöchiometrie (n) der Interaktion zwischen zwei oder mehr

Molekülen messen kann. Der Gibbs’sche freie Energie (ΔG) und die Änderung der

Entropie (ΔS) können weiterhin nach Gleichung 2) ermittelt werden (Perozzo et al., 2004;

Leavitt et al., 2001; Velazque-Campoy et al., 2006).

ΔG = -RTlnKa = ΔH-TΔS 2)

R: Gaskonstante, T: absolute Temperatur

Bei ITC-Experiment wird ein Ligand mittels einer Spitze in die Zelle, welche die

Makromoleküllösung enthält, bei konstanter Temperatur pipettiert. Die freigesetzte oder

absorbierte Wärme wird gegen eine Referenzzelle angemessen. Die Daten werden dann

mit Hilfe der Software Origin analysiert (Tellinghuisen 2005).

In dieser Arbeit wird ein VP-IPC Gerät von MicroCal (Northampton, USA) verwendet.

Der Aufbau des Geräts ist in Abb. 2.6 schematisch dargestellt.

Abb. 2.6 Schematische Darstellung eines ITC-Geräts. A: Allgemeiner Aufbau eines ITC-Geräts. B: Referenzzelle und Probenzelle (MicroCal).

EERRGGEEBBNNIISSSSEE

50

3 ERGEBNISSE


Die Produkte der Polymerasekettenreaktion zur Amplifikation des nirC-Fragments wurden

mittels Agarosegelelektrophorese auf ihre Länge überprüft.

M 1 2 3 4

~ 830 bp900 bp

800 bp

In der ersten Bahn wurde ein DNA-Marker mit einem Größenbereich von 100 bp bis

10000 bp aufgetragen. In den Bahnen 1 und 2 wurden jeweils die PCR-Produkte von nirC

mit den Schnittstellen NdeI/EcoRI aufgetragen (1: genomische DNA von E. coli K12 als

Matrize, 2: E. coli XL10 Gold Zellen als Matrize). In den Bahnen 3 und 4 wurden jeweils

die PCR-Produkte nirC mit den Schnittstellen NdeI/XhoI aufgetragen (3: genomische

DNA von E. coli K12 als Matrize, 4: E. coli XL10 Gold Zellen als Matrize).

Die PCR-Produkte der vier Ansätze liefen alle bei einer Größe von ca. 830 bp, was der

Größe des nirC-Fragments entspricht. Die Amplifikation war somit erfolgreich.

Abb. 3.1 PCR-Amplifikation des nirC-Fragments. Die Banden in Bahn 1 und 2 sind nirC mit den Schnittstellen NdeI/EcoRI, die Banden in Bahn 3 und 4 sind nirC mit den Schnittstellen NdeI/XhoI. Als Matrize: genomische DNA von E. coli K12 (ungerade Zahl), E. coli XL10 Gold Zelle (gerade Zahl). M: GeneRuler DNA Ladder Mix.


51


Die PCR-Produkte wurden zuerst in den Vektor pPCR-Script Amp SK(+) ligiert und dann

über einen Weiss-Blau-Färbetest selektiert. Um zu überprüfen, ob die Ligation richtig

funktioniert hat, wurden die Plasmide einiger positiver Kolonien aufgereinigt und mit den

Restriktionsenzympaaren NdeI/ EcoRI oder NdeI/ XhoI verdaut. Anschließend wurden die

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M

3000 bp

1000 bp

750 bp

ungeschnittenen und geschnittenen Plasmide jeweils mit einem Agarosegel analysiert. Der

Vektor pPCR-Script Amp SK(+) selbst hat eine Größe von ca. 3000 bp. Die Abbildung 3.2

zeigt, dass die Proben 3, 5-8 und 10-12 positiv waren, da sie nach dem Restriktionsverdau

zwei Banden mit einer Größe von ca. 3000 bp (pPCR-Script Amp SK(+)) bzw. 830 bp

(nirC-Fragment) hatten. Im Gegensatz dazu waren die Proben 1, 2, 4 und 9 negativ, da hier

die Banden vor dem Restriktionsverdau bei ca. 2000 bp und nach dem Restriktionsverdau

bei ca. 3000 bp liefen. Das bedeutet, dass die vier Proben den Vektor pPCR-Script Amp

SK(+) ohne nirC-Fragment enthielten. Da die Plasmide vor dem Verdau ringförmig waren,

konnten sie im Gel weiter wandern.

Abb. 3.2 Das ligierte Plasmid pPCR-Script Amp SK(+)::nirC nach Restriktionsverdau. 1-6: Plasmid mit Schnittstelle NdeI/EcoRI; 7-12: Plasmid mit Schnittstelle NdeI/XhoI. M: GeneRuler 1kb DNA Ladder.


52

Die durch Agarosegelextraktion aufgereinigten nirC-Fragemente wurden in den zuvor mit

den Restriktionsenzympaaren NdeI/EcoRI bzw. NdeI/XhoI geschnittenen Vektor pET-

21a(+) ligiert und in E. coli XL10 Gold transformiert. Um die Klonierung zu überprüfen,

wurden die gereinigten Plasmide mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut und

mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. Es zeigte sich, dass alle 24 Proben, die jeweils

aus verschiedenen Bakterienkolonien aufgereinigt wurden, zwei Banden aufweisen, von

denen die eine, entsprechend der Größe des linearisierten pET-21a(+)-Vektors, bei ca.

5500 bp und die andere, mit Ausnahme der Probe 24, bei einer Größe von ca. 830 bp lief.

Dies entspricht genau der Größe von nirC. Die nirC-Fragmente der Proben 1-23 wurden

somit erfolgreich in den pET-21a(+) Vektor kloniert.

Die Sequenzierung der Plasmidinsertionsbereiche offenbarte, dass das nirC-Fragement in

vollständiger Weise und korrekter Anordnung (Leseraster) in den Vektor integriert wurde,

daher wurde es in den weiteren Experimenten für die Expression von NirC verwendet.

Abb. 3.3 Das ligierte Plasmid pET-21a(+)::nirC nach Restriktionsverdau mit NdeI/EcoRI (1-12) bzw. NdeI/XhoI (13-24). 1-12: Plasmid mit Schnittstelle NdeI/EcoRI, 13-24: Plasmid mit Schnittstelle NdeI/XhoI. M: GeneRuler DNA Ladder Mix.


53

3.3 Überexpression in E. coli C43

Um eine starke Überproduktion von NirC und ein gleichzeitig gutes Wachstum der E. coli

C43 Zellen mit dem pET-21a(+)::nirC Konstrukt in dem normalen LB-Medium zu

gewährleisten, wurde ein Induktionstest mit verschiedenen IPTG-Konzentrationen

durchgeführt. Der Expressionslevel wurde mittels 10 % SDS-PAGE und anschließend mit

einem Western Blot analysiert.

E4 E3 E2 E1 M X1 X2 X3 X4

Trimer

Dimer

Monomer

45 kDa

35 kDa

18.4 kDa

Als Größenstandard wurde der Protein Molecular Weight Marker (Fermentas) verwendet.

In die Geltaschen E1 und X1 wurden Zellen der uninduzierten Kulturen aufgetragen. In

Bahn E2-4 und X2-4 wurden Zellkulturen aufgetragen, die bei einer optischen Dichte von

0.8 (600 nm Wellenlänge) mit jeweils 0,1 mM, 0,5 mM und 1 mM IPTG induziert wurden

(E steht für NirC mit Konstrukt NdeI/EcoRI, X steht für NirC mit Konstrukt NdeI/XhoI.).

Während in Bahn E1 und X1 kein Protein detektiert wurde, zeigen die anderen 6 Ansätze

zeigten eine sehr starke Induktion. Bei diesen Ansätzen wurden 3 Banden sichtbar, die

jeweils bei einer Höhe von ca. 15 kDa, 30 kDa und 45 kDa (schwach erkennbar) liefen.

Nach der Molekulargrößenvorhersage des ExPASy-Webservice (http://www.expasy.org/,

Gasteiger et al.) hat NirC eine Größe von 28,562 kDa. Berücksichtigt man, dass

Membranproteine eine sehr stark hydrophobe Wechselwirkung im Inneren besitzen, ist es

unwahrscheinlich, dass sie durch SDS vollständig entfaltet werden können. Deshalb laufen

Abb. 3.4 Western Blot der acht Proben des IPTG-Induktionstest von E. coli C43 Zellen, die mit dem pET-21a(+)::nirC Konstrukt transformiert wurden. In Ansatz E1 und X1 wurde keine Induktion durchgeführt und dient somit als Kontrollansatz. Ansätze E2-E4 und X2-X4 wurde jeweils mit 0.1 mM, 0.5 mM und 1 mM IPTG bei oD600 = 0.8 induziert. Als Standard wurde der Protein Molecular Weight Marker (Fermentas) verwendet. Das Monomer, Dimer und Trimer wurden jeweils bei einer Höhe von 15 kDa, 30 kDa und 45 kDa beobachtet.

http://www.expasy.org/


54

Membranproteine in einem SDS-Gel normalerweise tiefer als ihre reale Größe, da die

Protein Marker lösliche Proteine enthalten. Daher sollte die Banden bei 15 kDa dem

Monomer von NirC, die Banden bei 30 kDa dem Dimer und die Banden bei 45 kDa dem

Trimer entsprechen.

Die Überexpression von NirC durch Induktion mit IPTG behinderte das Wachstum der E.

coli C43 Zellen, dieser Effekt war umso stärker, je höher die Konzentration an IPTG war.

Die Messwerte für die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm 4 Stunden nach

der Induktion waren jeweils 2,9, 2,7, 2,3, 2,3 für E1-4 und 2,8, 2,7, 2,6, 2,2 für X1-4. Um

das Gleichgewicht zwischen einer starken Überproduktion von NirC und einem starken

Wachstum von E. coli C43 zu gewährleisten, wurden 0,5 mM IPTG zur Induktion in dieser

Arbeit verwendet.

3.4 Wachstumskurven

Um den optimalen Zeitpunkt für die Expression von NirC und das Wachstum der Zelle

herauszufinden, wurde das Wachstum in LB-Medium und Autoinduktionsmedium (ZYM

5052, Studier 2005) verfolgt.

Die Wachstumskurve von E. coli C43 mit dem pET-21a(+)::nirC Konstrukt in LB-

Medium wurde bei 30 °C erstellt. Die Kultur wurde durch Zugabe von 0,5 mM IPTG bei

oD600 = 0,6 induziert. Ungefähr zwei Stunden nach der Induktion erreichten die Zellen

kurz vor der stationären Phase eine oD600 von ca. 1,5. welches der optimale Zeitpunkt für

die Zellernte war.

Die Wachstumskurve von E. coli C43 mit dem pET-21a(+) Konstrukt in

Autoinduktionsmedium ZYM 5052 wurde bei 18 °C erstellt. Der beste Zeitpunkt für die

Zellernte war nach etwa 24 h bei einer oD600 von ca. 11 erreicht, da das Wachstum

anschließend in die die stationäre Phase überging.

Das Vergleich beider Wachstumskurven zeigt, dass das Autoinduktionsmedium deutlich

effektiver als normales LB-Medium ist, da bei geringerem Verbrauch an Rohstoffen mehr

Biomasse produziert wird. Deswegen wurde Autoinduktionsmedium ZYM 5052 für die

weitere Überexpression von NirC in dieser Arbeit verwendet.


55


3.5.1 Zellernte, Aufschluss und Isolierung de Membranen

Bei Zellernte und Aufschluss wurden die Bakterienkulturen, wie unter 2.5.1 und 2.5.2

angegeben, behandelt. Die Ausbeute von E. coli C 43 Zellen mit dem pET-21a(+)

Konstrukt war normalerweise ca. 20 g pro Liter Autoinduktionsmedium. Nach zwei

Zentrifugationen (2.5.3) wurden ca. 0,17 g Membranen pro Gramm Zelle geerntet.

Abb. 3.5.B Wachstumskurve von E. coli C43 mit pET-21a(+)::nirC Konstrukt bei 18°C in Autoinduktionsmedium ZYM 5052. Die beste Inkubationszeit ist ca. 24 Stunden mit einer oD600 von ca. 11.

Abb. 3.5.A Wachstumskurve von E. coli C43 mit pET-21a(+)::nirC Konstrukt bei 30°C in LB-Medium. Die Kultur wurde durch Zugabe von 0.5 mM IPTG bei oD600 = 0.6 induziert. Ungefähr zwei Stunden nach der Induktion erreichten die Zellen kurz vor der stationären Phase eine oD600 von ca. 1.5.

Wachstumskurve (E. coli C43 mit NirC in ZYM 5052 @18 °C)

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50

time (h)

oD60

0

Wachstumskurve (E. coli C43 mit NirC in LB-Amp@ 30 °C)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 5 10 15 20 25 30

time (h)

oD60

0

Zugabe von 0.5 mM IPTG


56


Die Membranen wurden in Aufschlusspuffer resuspendiert. Die Suspension war trüb, da

Membranen schwer wasserlöslich sind. Nach der Solubilisierung mit 2 % LDAO (2.5.4)

wurde die Lösung klar. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (100.000 x g, 4 °C) gab

es nur eine kleine Menge von weißem Pellet, welches darauf hindeutert, dass die meisten

Membranproteine bereits solubilisiert wurden und das weiße Pellet aus wasserunlöslichen

Lipiden besteht.

3.5.3 Affinitätschromatographie

Der Überstand der Zentrifugation wurde über eine 5 ml HisTrap FF Säule gereinigt (2.5.5).

In der Abb. 3.7.A (aufgereinigt mit LDAO) ist ein typischer Säulenlauf gezeigt. Der

Überstand enthielt 20 mM Imidazol, um die unspezifischen Bindungen durch die

Verunreinigungen an der Säule zu verhindern. Da das der erste Aufreinigungsversuch war,

wurden fünf aufeinanderfolgende Waschschritte mit einer Konzentration an Imidazol von

30 mM, 50 mM, 100 mM, 110 mM und 125 mM durchgeführt, um den Waschprozess für

weitere Aufreinigungsexperimente in dieser Arbeit zu optimieren. Anschließend wurde die

Säule mit einem linearen Gradienten von 25-100 % Elutionspuffer eluiert, dabei wurde ein

scharfer Peak beobachtet.


57

0

500

1000

1500

2000

mAu

0 50 100 150 200 250 300 min

Method Run 17.11.2006, 11:13:11, Method : , Result : C:\...\prime\Manual Injection Valve Load Flow 1.5 ml/min Flow 1.0 ml/min Manual Set, Concentration 6 %B Manual Set, Concentration 18 %B Error: 69 ERROR Stop grad. set HOLD or PAUSE

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 65687

30 mMImidazol

50 mMImidazol

100 mMImidazol

110 mMImidazol

125 mMImidazol

500 mMImidazol

20 mMImidazol

Die gesammelten Fraktionen der Affinitätschromatographie wurden durch SDS-PAGE

analysiert (Abb. 3.7.B).

Das SDS-Gel zeigte, dass sämtliches NirC an der Säule gebunden hatte, da in den

Durchfluss-Ansätzen 1-5 kein NirC beobachtet wurde. Desweiteren konnten durch die fünf

Waschschritte fast alle Verunreinigungen ausgewaschen werden. Die Elutionsfraktionen

waren bereits relativ sauber. Jedoch wurden vier verschiedene Polymerformen in dem Gel

sichtbar: Monomer (ca. 24 kDa), Dimer (ca. 45 kDa), Trimer (ca. 70 kDa) und Tetramer

(ca. 100 kDa). Dies bedeutet aber nicht unbedingt, dass die Proteine tatsächlich vier

Polymerformen hatten, denn NirC ist ein Membranprotein und wird durch Detergenz

eingeschlossen. Die Transmembranhelices besitzen untereinander sehr starke hydrophobe

Abb. 3.7.A: Chromatogramm der Affinitätschromatographie von NirC mittels einer 5 ml HisTrap FF Säule. Die Proteinlösung wurde mit 20 mM Imidazol auf die Säule geladen, um unspezifische Bindungen zu vermeiden (Siehe Pfeil). Anschließend folgten fünf Waschschritte mit Imidazolkonzentration von 30 mM, 50 mM, 100 mM, 110 mM und 125 mM. Schließlich wurde NirC mit einem linearen Gradienten von 25-100% Elutionspuffer eluiert (100% Elutionspuffer entsprach 500 mM Imidazol), ein großer scharfer Peak ist zu erkennen.


58

Wechselwirkungen, daher ist es für SDS-Moleküle schwierig, sich in die Detergenz-

Protein-Komplexe einzulagern und die quartären Strukturen vollständig zu zerstören. Diese

Vermutung wurde durch die Ankonzentrierung von NirC unterstützt: Die Fraktionen, die

NirC enthielten, wurden mittels einer Ultrazentrifugationsmembran mit einer

Ausschlussgröße von 50 kDa und Zentrifugation (3000 x g, 4 °C) ankonzentriert. Wenn

NirC wirklich vier verschiedene Polymerformen gebildet hätte, sollten im Durchfluss des

Konzentrators ebenfalls Proteine vorhanden sein, da die Größe von Monomer kleiner als

50 kDa wäre. Dies wurde jedoch nicht beobachtet, daher kann angenommen werden, dass

NirC als Tetramer vorliegt.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Monomer

Tetramer

Trimer

Dimer

116

66.2

45.0

35.0

25.0

18.4

14.4

kDa

Auffällig in diesem Gel ist, dass die Proteine im Vergleich zu Abb. 3.4 kürzer gelaufen

sind, was auf den unterschiedlichen Anteil an Acrylaimd im SDS-Gel zurückzuführen ist.

Um eine bessere Auftrennung zu erreichen, enthielten alle SDS-Gel in dieser Arbeit 12,5

% Acrylamid,.

NirC wurde auch mittels D10M erfolgreich aufgereinigt.

Abb. 3.7.B: SDS-PAGE (12,5% Acrylamid) zur Kontrolle der Affinitätschromatographie (HisTrap). M: Protein Molecular Weight Marker von Fermentas. 1-5: Durchfluss (Fraktionen 1-5 in der Abb. 3.7.A). 6-9: Waschfraktionen (entsprachen jeweils den Waschschritten 30 mM, 50 mM, 100 mM, 125 mM Imidazol). 10-18: Elutionsfraktionen. Vier Banden für NirC wurden in Ansätze 10-18 deutlich beobachtet. Sie entsprachen jeweils Monomer (ca. 24 kDa), Dimer (ca. 45 kDa), Trimer (ca. 70 kDa) und Tetramer (ca. 100 kDa).


59


Das konzentrierte Protein wurde auf eine HiLoad 16/60 Superdex 200 geladen, da NirC

wahrscheinlich Tetramere bildet. In der Abb. 3.8 ist das Chromatogramm von NirC/D10M

gezeigt. Der Aufreinigungspuffer bestand aus: 50 mM HEPES pH 8, 200 mM NaCl, 10 %

Glycerol und 0,2 % D10M. Drei Peaks, die jeweils einer Größe von 1400 kDa, 460 kDa

und 200 kDa entsprachen, waren zu beobachten. Die gesammelten Fraktionen wurden

mittels SDS-PAGE analysiert. Die Abb. 3.8.B zeigt, dass alle drei Peaks nur NirC

enthielten. Dies bedeutete, dass die ersten beiden Peaks Aggregationen von NirC sein

sollten. Deswegen wurden nur die Fraktionen im dritten Peak gesammelt und bis ca. 1 ml

konzentriert.

Manual Run 3:10_UV Manual Run 3:10_Conc Manual Run 3:10_Fractions

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

mAu

0 50 100 150 min1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41

Abb. 3.8.A Chromatogramm der Gelfiltrationschromatographie von NirC/D10M mittels einer HiLoad 16/60 Superdex 200 Säule. Drei Peaks waren zu erkennen, die jeweils eine Größe von 1400 kDa, 460 kDa und 200 kDa nach Reihenfolge entsprachen. Die ersten beiden Peaks sollten Aggregation von NirC sein. Der dritte Peak entspricht ungefähr der Größe von Tetramer mit Detergenz.


60

3.5.5 Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Konzentration des aufgereinigten NirC wurde mit einem BCA-Test und zusätzlich mit

der Ehresmann-Methode bestimmt (Ehresmann et al., 1973).

In Abb. 3.9 ist eine Eichgerade BSA-Standards dargestellt. Anhand dieser wurde die

Konzentration von NirC mit 50,8 ± 0,4 mg/ml (1,45 ml) gerechnet. Dies entspricht einer

Ausbeute von 2,7 mg NirC/ 1 g Zellen.

Die Ehresman-Methode lieferte ein ähnliches Ergebnis wie der BCA-Test.

BCA Protein Assay

y = 273.25x - 6.6458

0

50

100

150

200

250

300

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Absorbtion (562 nm)

Con

cent

ratio

n ( μ

g/m

l)

Abb. 3.9 Eichgrade von BSA zur Bestimmung der Konzentration von NirC.

Abb. 3.8.B SDS-PAGE (12,5% Acrylamid) der Gelfiltration. M: Protein Molecular Weight Marker von Fermentas. 1-2: Peak 1; 3-5: Peak 2; 6-11: Peak 3. Vier Banden für NirC wurden in den Ansätzen 10-18 deutlich beobachtet. Sie entsprachen jeweils Monomer (ca. 24 kDa), Dimer (ca. 45 kDa), Trimer (ca. 70 kDa) und Tetramer (ca. 100 kDa).


61

3.6 Quantitative Bestimmung der Zusammensetzung von Detergenzien und Lipiden im Protein-Detergenz-Komplex (PDK)

3.6.1 Bestimmung des Detergenz-Protein-Verhältnisses im PDK

Die Konzentration an Detergenz in der Proteinlösung spielt eine wichtige Rolle sowohl bei

der Solubilisierung (Stabilität und Solubilität des PDK) als auch bei der Kristallisation

(Wechselwirkung zwischen PDK) von Membranproteinen. Daher wurde die

Detergenzkonzentration nach Ankonzentrierung mittels Dünnschichtchromatographie

quantifiziert. Gleichzeitig wurde das Detergenz-Protein-Verhältnis inm PDK berechnet

(Eriks et al., 2003; daCosta et al., 2002).

In Abb. 3.10 sind die unterschiedlichen Laufhöhen verschiedener Detergenzien in einer

DC-Platte gezeigt.

Eine Eichgerade wurde mit einer Serie bekannter LDAO-Mengen erstellt (Abb. 3.11),

deren Daten die gemittelten Werte von drei unabhängigen Versuchen entsprechen. Nur vier

Banden (0,01-0,15 mg) wurden für die Eichgerade eingesetzt, da die Kurve in diesem

Bereich linear war und die Menge an LDAO in der Proteinprobe ebenfalls in diesem

Bereich lag. Die Menge an Detergenz in der Proteinprobe sowie in dem Durchfluss wurde

Abb. 3.10 Charakteristische Laufhöhe einiger Detergenzien. NirC/LDAO und NirC/D10M entsprechen NirC, das jeweils mit LDAO bzw. D10M aufgereinigt wurde. Das Laufmittel: Chloroform/ Methanol/ Ammonium Hydroxid (63/ 35/ 5).


62

durch Vergleich mit der Eichgerade bestimmt. Die Konzentration von LDAO im

Durchfluss war 0,12 %±0,02 %, d.h. LDAO wurde während der Ankonzentrierung von

NirC nicht ankonzentriert. Daher konnte das Detergenz-Protein-Verhältnis in dem PDK

berechnet werden: (58,4±0,6)-LDAO Moleküle binden an ein NirC.

Abb. 3.11 Quantitative Bestimmung des Detergenz-Protein-Verhältnisses in dem PDK mittels DC. A: Die Banden von LDAO mit verschiedenen Mengen. Die ersten zwei Banden waren zu schwach und nicht quantifizierbar. B: Das mittels einer Ultrazentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 50 kDa und Zentrifugation (3000 x g, 4 °C) ankonzentrierte NirC/LDAO wurde in drei verschiedenen Verdünnungen auf die Platte aufgetragen. Der Durchfluss war die untere Flüssigkeit bei Ankonzentrierung. C: Eichgerade für 0,01 – 0,15 mg. Die Intensität jeder Band im A wurde als die Funktion von der Menge an LDAO gezeichnet. Nur vier Banden wurden genommen, da die Kurve in diesem Bereich linear war.


63

3.6.2 Bestimmung der Lipidzusammensetzung im PDK

Der Lipidgehalt im PDK kann ebenfalls wichtig für die Kristallisation von

Membranproteinen sein, da die Lipide sich auch an der Interaktion zwischen den PDK-

Molekülen beteiligen. Da bereits bekannt ist, dass Gelfiltrationschromatographie eine

Delipidierung verursachen kann, wurde die Lipidzusammensetzung im PDK quantitativ

bestimmt.

Eine qualitative Untersuchung wurde zuerst mittels DC durchgeführt und die extrahierten

Lipide wurden anhand der Laufhöhe im Vergleich zu dem Standard identifiziert (Abb.

3.12). Die Ergebnisse zeigten, dass PE, PG und CL die Hauptphospholipide in der

Membran von E. coli waren, die NirC überexprimierten. Desweiteren deuten die

Ergebnisse an, dass in NirC/LDAO noch PE vorhanden war. Zudem kann das

Vorhandensein von PG nicht ausgeschlossen werden, da es möglicherweise von der

starken Bande von LDAOH+ verdeckt wurde.

Abb. 3.12 Qualitative Analyse der Lipide in NirC/LDAO vor und nach der Gelfiltration. PC: Phosphatidylcholin; PI: Phosphatidylinositol; PE: Phosphatidylethanolamin; PG: Phosphatidylglycerol; PA: Phosphatidyl Acid; CL: Cardiolipin; Mem 1 und 2: jeweils 2 und 4 μl Extrakt der Membranfraktion aus E. coli C43, die NirC exprimieren; HisTrap: NirC/LDAO vor Gelfiltration; Gelfiltration: NirC/LDAO nach Gelfiltration; Puffer: Puffer der Proteinlösung. 1: PE; 2: PG; 3: CL; 4: LDAOH+; 5: LDAO. Das Laufmittel: Chloroform/ Methanol/ Essigsäure (65/ 25/ 8).


64

Die Fettsäurezusammensetzung der Phospholipide in NirC/LDAO ohne vorhertige

Gelfiltration wurde mittels GC/MS quantitativ bestimmt (Tabelle 3.1). Es waren sechs

unterschiedliche Fettsäuren vorhanden, von denen Ölsäure (18:1, 9Z) und Palmitinsäure

(16:0) die häufigsten waren. Insgesamt kamen auf ein mg NirC/LDAO ca. 1,39 μg

Fettsäure, die 1 Mol Fettsäure pro 6,8 Mol NirC/LDAO entspricht. Da ein Mol

Phospholipide zwei Mol Fettsäuren enthalten, beträgt das Verhältnis von Phospholipid zu

NirC/LDAO im PDK ca. 1: 13,6.

Tabelle 3.1 Die Fettsäurezusammensetzung von Phospholipiden in NirC/LDAO ohne Gelfiltration.

Fettsäure μg/mg

NirC/LDAO Anteil MW

μMol/mg NirC/LDAO

Myristinsäure, 14:0 0,0416 3,00 % 228 0,000182456

Palmitinsäure, 16:0 0,278264857 20,04 % 256 0,001086972

Palmitoleinsäure, 16:1 (9Z) 0,160355556 11,55 % 254 0,000631321

Heptadecenoinsäure,17:1 (10Z) 0,135111111 9,73 % 268 0,000504146

Stearinsäure, 18:0 0,04186546 3,01 % 284 0,000147414

Oleinsäure, 18:1 (9Z) 0,731377778 52,67 % 282 0,002593538

Σ(Fettsäure) 1,388574761 0,005145847

Phospholipid/NirC (Mol/Mol) 1 / 13,6

3.7 Aggregationstest

Um die Relevanz von Detergenz auf die Kristallisation von Membranproteinen zu

berücksichtigen, müssen einige Detergenzien ausgewählt und getestet werden. Das

Ergebnis ist in Abb. 3.13 dargestellt. Das mit DDM (0,01 %) gereinigte NirC wurde für

dieses Experiment ausgewählt, da es nicht so stabil war: die Proteine fielen einige Tage

nach Aufreinigung teilweise aus. Dieses Experiment ergab, dass die Absorptionen bei 320

nm von OGP, Fos-Cholin-iso9 und der Verdünnung mit der Zeit stiegen und die

Absorptionen der anderen fünf Detergenzien sanken. Dies bedeutet, dass OGP und Fos-


65

Cholin-iso9 auf keinen Fall mit NirC kompatibel sind. Im Gegensatz dazu sind LDAO,

DDPO, D10M und D11M mögliche geeignete Detergenzien für NirC.

OGPVerdünnung

Fos Cholin iso 9

Fos Cholin 12LDAODDPO

D11MD10M

3.8 Austausch von Detergenz

Es wurden insgesamt fünf Detergenzaustausche durchgeführt: LDAO→DDPO

LDAO→D10M, D10M→D9M, D10M→D11M, D10M→DDM.

In der Abb. 3.14.A ist das Chromatogarmm des Austausches (LDAO→DDPO) dargestellt.

Der Elutionspuffer besteht aus: 50 mM HEPES pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 % Glycerol und

Abb. 3.13 Aggregationstest. Die mit DDM (0,01%) gereinigten Proteinproben, wurden mit verschiedenen Detergenzien (bis zu 300 μl) gemischt, in der die Konzentration an Protein 1 mg/ml betrug und die Konzentration des neuen Detergenz das 10 fach seines CMC ausmachte. Die Absorption bei 320 nm wurde mit einem Zeitabstand von 20 Sekunden für 30 Minuten gemessen. Verdünnung: Die Proteinprobe wurde mit Puffer ohne Detergenz 10 fach verdünnt.


66

0,2 % DDPO. Die Fraktionen in dem Durchflusspeak und Elutionspeak wurden mit Hilfe

eines SDS-Gel analysiert (Abb. 3.14.B). In der Durchflussfraktion war noch NirC zu

erkennen, was auf die limitierte Säulenkapazität zurückgeführt werden kann. Das eluierte

Protein war relativ sauber und wurde mittels einer Ultrazentrifugationsmembran mit einer

Ausschlussgröße von 50 kDa und Zentrifugation (3000 x g, 4 °C) für weitere

Kristallisationsversuche ankonzentriert.


0

200

400

600

800

1000

mAu

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 min1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Durchfluss

NirC_DDPO

Abb. 3.14.A Chromatogramm des Detergenzaustausches (LDAO→DDPO) mittels Affinitätschromatographie. Das mit LDAO gereinigte NirC wurde auf eine 1 ml HisTrap FF Säule geladen. Die Säule wurde mit etwa 35 ml DDPO-haltigen Puffer gewaschen und anschließend über einen linearen Gradienten von 0-100% Elutionspuffer eluiert (100% Elutionspuffer entsprach 500 mM Imidazol). Dabei war ein scharfer Peak zu erkennen.


67

M 1 2 3 4 5

25 kDa

45 kDa

In der Abb. 3.15.A ist das Chromatogramm des Austausches (D10M→D9M) gezeigt.


0

50

100

150

mAu

0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 min

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Durchfluss

NirC_D9M

100 mMImidazol

120 mMImidazol

Abb. 3.15.A Chromatogramm des Detergenzaustausches (D10M→D9M) mittels Affinitätschromatographie. Das mit D10M gereinigte NirC wurde auf einer 1 ml HisTrap FF Säule geladen. Die Säule wurde mit etwa 20 ml D9M-haltigem Puffer gewaschen, und NirC anschließend mit einem linearen Gradienten von 24-100% Elutionspuffer eluiert (100% Elutionspuffer entsprach 500 mM Imidazol). Dabei war ein scharfer Peak zu erkennen.

Abb. 3.14.B SDS-PAGE des Detergenzaustausches (LDAO→DDPO). M: Protein Molecular Weight Marker von Fermentas. 1: Durchflussfraktion, 2-5: Elutionsfraktionen.


68

Der Elutionspuffer besteht aus: 50 mM HEPES pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 % Glycerol, 0,6

% D9M. Die Analyse der Fraktionen mittels eines SDS-Gels zeigte, dass das eluierte

Protein ebenfalls sauber war (Abb. 3.15.B). Daher wurde es mit Hilfe einer

Ultrazentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 30 kDa auf ca. 10 mg/ml

ankonzentriert.

M 1 2 3 4 5 6

45 kDa

25 kDa

Die Austausche von D10M→D11M und D10M→DDM wurden ebenfalls durchgeführt

(Daten hier nicht gezeigt), wobei der Austausch noch über DC zu verifizieren ist.



69

3.9 Kristallisation von NirC

Die Kristallisationsversuche fanden unter den in 2.7 angegebenen Bedingungen statt.

Kristalle von NirC/LDAO wurden zuerst einige Tage nach Pipettierung in einigen initialen

Bedingungen gefunden.

a). b). c).

Sie waren jedoch entweder zu klein (Abb. 3.16.b und c) oder nicht regelmäßig (Abb.

3.16.a). Durch zur Optimierung des pH-Werts, der Konzentration an Präzipitant und der

Ionenstärke konnten größere (Abb. 3.17.b) bzw. plattenförmige Kristalle (Abb. 3.17.a)

gefunden werden.

a). b).

Die plattenförmigen Kristalle konnten durch Mikroseeding hinsichtlich ihres

dreidimensionalen Wachstums verbessert werden, jedoch waren sie für

Röntgenbeugungsexperimente immer noch zu klein bzw. nicht regelmäßig angeordnet.

Abb. 3.16 Kristalle von NirC/LDAO in drei initialen Bedingungen. a): 0,2 M Imidazolmalat pH 5,5, 33% PEG 600, 4°C; b): 0,1 M MES pH 6,5, 2,4 M Diammoniumsulfat, 20 °C; c) 0,1 M Natriumcitrat pH 3,5, 0,1 M Lithiumsulfat, 30% PEG 400. 4 °C. Proteinkonzentration: 10 mg/ml.

Abb. 3.17 Kristalle von NirC_LDAO in Finescreens. a): 0,1 M Natriumcitrat pH 4,5, 0,12 M Lithiumsulfat, 28% PEG 400; b): 0,2 M Imidazolmalat pH 5,5, 35% PEG 600. Proteinkonzentration: 10 mg/ml, 4 °C.


70

Daher wurden weitere Additive und Detergenzien ausprobiert. Um die kinetischen

Eigenschaften der Kristallisation zu ändern, wurde das Reservoir mit Paraffinöl

überschichtet. Die besten Kristalle konnten nach Zugabe von vier Additiven (Additive 1:

10 % Pluronic F68, Additive 2: 4 mM Zwittergent 3-14, Additive 3: 1,1 mM C12E8,

Additive 4: 60 mM NaNO2) und 100 μl Paraffinöl im Reservoir beobachtet werden (Abb.

3.18).

Für das mit anderen Detergenzien gereinigte NirC wurden die oben genannten

Kristallisationsbedingungen wiederholt. Mit Ausnahme von NirC/DDPO konnten überall

Kristalle gefunden werden. Es wurde ebenfalls Finescreens, Mikroseeding, Additive

Screens und Detergent Screens durchgeführt, die bisher besten Kristalle sind in Abb. 3.19

dargestellt. Die Kristalle von NirC_D10M waren zwar dreidimensional und groß, jedoch

war ihre Oberfläche unregelmäßig, was darauf hindeutet, dass die Proteinmoleküle

innerhalb des Kristalls nicht perfekt angeordnet waren.

Die bisher besten Bedingungen sind in Tabelle 3.2 zusammengefasst:

Tabelle 3.2 Kristallisationsbedingungen.

Protein Detergenz Puffer Präzipitant Salz Additive 1 Additive 2 Bemerkung

NirC LDAO 0,1 M NaCitrat, pH 4,5

28 % PEG 400 0,12 M Li2SO4

10 % Pluronic F68

1.1 mM C12E8

100 μl Paraffinöl

in Reservoir

NirC DDM 0,1 M NaCitrat, pH 4,9

36 % PEG 400 0,12 M Li2SO4

NirC D11M 0,1 M NaCitrat, pH 4,4

33 % PEG 400 0,12 M Li2SO4


35 % PEG 400 0,12 M Li2SO4

15 % 1,2,3-Heptantriol


40 % PEG 400 0,12 M Li2SO4

Abb. 3.18 Kristall von NirC_LDAO. Die Bedingungen im Reservoir: 0,1 M Natriumcitrat pH 4,5, 0,12 M Lithiumsulfat, 28% PEG 400, Additive 1: 10% Pluronic F68, Additive 2: 4 mM Zwittergent 3-14, Additive 3: 1,1 mM C12E8, Additive 4: 60 mM NaNO2. 100 μl Paraffin wurde als Zusatz in Reservoir verwendet, um die Kristallisationsgeschwindigkeit zu verringern. Proteinkonzentration: 10 mg/ml, 4 °C.


71

a). b). c).

d). e). f).

3.10 Röntgenbeugungsexperimente

Ungefähr fünfzig Kristalle von NirC_LDAO bzw. NirC_D10M wurden getestet. Sie

streuten jedoch entweder nicht oder nur sehr schlecht, daher wurden drei

Kristallmanipulationen probiert: „crystal annealing“, Kristalldehydration und „cross-link“.

Sie erbrachten aber keine Verbesserung, so dass bis jetzt die Auflösungsgrenze bei ca. 8 Å

(NirC_D10M) liegt.

Abb. 3.19 Kristalle von NirC_D10M (a, b, c), NirC_D11M (d), NirC_DDM (e), NirC_D9M (f). Kristallisationsbedingungen: a): 0,1 M Natriumcitrat pH 4,3, 0,12 M Lithiumsulfat, 35% PEG 400, Additive: FOS-Choline-12; b): 0,1 M Natriumcitrat pH 4,3, 0,12 M Lithiumsulfat, 34% PEG 400, nach Mikroseeding; c): 0,05 M HEPES, pH 8,0, 25% PEG 4000, 10% MPD; d): 0,1 M Natriumcitrat, pH 4,4, 0,12 M Lithiumsulfat, 33% PEG 400; e): 0,1 M Natriumcitrat, pH 4,9, 0,12 M Lithiumsulfat, 36% PEG 400;f): 0,1 M Natriumcitrat pH 3,9, 0,12 M Lithiumsulfat 40% PEG 400. Proteinkonzentration: 10 mg/ml, 4 °C.


72


Das ITC-Experiment wurde bei 20 °C bei unterschiedlichen pH Werten (pH 3, 5, 6, 8)

sowie Protein- und Ligandenkonzentration durchgeführt. Als Protein wurden NirC/LDAO

und NirC/D10M getestet und als Liganden Natriumnitrit, Natriumnitrat und

Natriumformiat getestet (Tabelle 3.3). Eine Bindung zwischen Protein und Ligand war

jedoch bei allen Versuchen nicht zu beobachten. In der Abb. 3.20 ist ein Beispiel gezeigt.

Die Puffer bestand aus 20 mM MES pH 6, 300 mM NaCl, 10 % Glycerol und 0,1 %

LDAO. Die Konzentration an Protein (NirC_LDAO) und Ligand (NaNO2) betrug jeweils

0,116 mM bzw. 30 mM. Nach Berücksichtigung des Einflusses einer Puffer-Puffer-

Titration konnte keine sigmoidale Kurve detektiert werden. Die lineare Messkurve war

wahrscheinlich eine Folge der Proteinverdünnungsenthalpie.

Tabelle 3.3 Die getesteten Bedingungen für ITC.

Versuch Detergenz pH CProtein (mM) Ligand CLigand (mM)

1 LDAO 8 0,005 Nitrit 0,15

2 LDAO 8 0,05 Nitrit 1,25



5 LDAO 6 0,116 Nitrit 30



8 LDAO 8 0,125 Nitrat 10

9 LDAO 8 0,125 Formiate 3,75

10 D10M 8 0,063 Nitrit 5


73

Abb. 3.20 ITC-Experiment. Protein: NirC_LDAO (0,116 mM), Ligand: NaNO2 (30 mM), Puffer: 20 mM MES pH 6, 300 mM NaCl, 10% Glycerol und 0,1% LDAO. Der Versuch wurde bei 20 °C durchgeführt. Es konnte keine Bindung beobachtet werden. Die lineare Messkurve spiegelt wahrscheinlich die exothermische Proteinverdünnungsenthalpie wider.

DDIISSKKUUSSSSIIOONN

74

4 DISKUSSION

4.1 Solubilisierung und Aufreinigungen von NirC

NirC war zu Anfang mit DDM solubilisiert und aufgereinigt worden. Aber die

Solubilisierungseffizienz von DDM war nicht hoch und das Protein NirC/DDM war

ebenfalls nicht sehr stabil, da es einige Tage nach der Reinigung teilweise präzipitierte.

Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass DDM ein nichtionisches Detergenz und

daher relativ milder ist.

Anhand der Ergebnisse der Aggregationstests wurde LDAO für die weiter führenden

Experimente gewählt. LDAO ist zwitterionisch und stärker als DDM. Das Detergenz

funktionierte sowohl bei der Solubilisierung als auch bei der Aufreinigung des NirC sehr

effizient. Die Ausbeute war sehr hoch (2,7 mg NirC/ 1 g Zellen) und die Proteine waren

nach HisTrap Reinigung schon sehr sauber. Außerdem waren NirC/LDAO für lange Zeit

stabil.

Daraus ergibt sich jedoch ein Problem: LDAO ist ein zwitterionisches Detergenz und hat

daher eine hohe Affinität zum Membranprotein, was zur starken Delipidierung führen kann

(le Maire et al., 2000). Anhand des Ergebnisses der Phospholipidanalyse (3.6.2) beträgt das

Phospholipid-Protein-Verhältnis in dem Protein-Detergenz-Komplex ca. 1:13,6 (Mol:Mol).

Dieser Wert ist im Vergleich zu dem des Glycerol-3-Phosphat-Tranporters (41,1:1 nach

Affinitätschromatographie), welcher mit DDM aufgereinigt wurde, sehr niedrig.

Die Effekte der Membranprotein-Lipid-Interaktion sind unterschiedlich. Sie sind

möglicherweise notwendig für die Stabilität des Membranproteins. Sie können als

Chaperonin bei der Insertion und Faltung funktionieren. Sie können sich ebenfalls direkt

am molekularen Funktionsmechanismus beteiligen, wie etwa der enzymatischen Aktivität

oder dem Transportprozess (Palsdottir et al., 2004).

Die Wechselwirkungen zwischen Membranprotein und Lipid beruhen auf zwei Ursachen.

Die erste, auch die stärkste und häufigste ist die Wechselwirkung der negativ geladenen

Kopfgruppe des Lipids mit der positiv geladenen Seitenkette von Aminosäuren an der

Proteinoberfläche. Als zweites kann die hydrophobe Lipidseitenkette fest in einer Furche


75

der Proteinoberfläche binden und dort durch die van-der-Waals-Kräfte stabilisiert werden

(Palsdottir et al., 2004).

Es ist bekannt, dass eine zu starke Delipidierung zur Inaktivierung des Proteins führen

kann, wie z.B. beim Cytochrom-bc1-Komplex (Schagger et al., 1990) und der Na+,K+-

ATPase (Esmann et al., 1984). Außerdem benötigen einige Membranproteinkristalle die

Phospholipide für bessere Beugungsqualität wie z.B. im Fall der Ca2+-ATPase (Toyoshima

et al., 2000) und des Lichtsammelkomplexes in Pflanzen (Nussberger et al., 1993). Daher

kann die starke Delipidierung des NirC/LDAO in dieser Arbeit möglichweise für die

schlechte Beugungsqualität des Kristalls und die nicht erfolgreichen ITC-Experimente

verantwortlich sein.

Einige Maßnahmen können getroffen werden, um eine starke Delipidierung zu vermeiden.

Zuerst können mildere Detergenzien anstelle von LDAO zur Solubilisierung verwendet

werden. Nichtionische Detergenzien sind generell von allen drei Typen am mildesten. Es

wurde jedoch gezeigt, dass DDM für NirC nicht geeignet ist und kein anderes

nichtionisches Detergenz in unserem Labor in großer Menge vorliegt. Deshalb könnte eine

Detergenzmischung aus z.B. LDAO und DDM eingesetzt werden. Damit wird

möglicherweise ein Optimum von Solubilisierung und minimaler Delipidierung erreicht

(Esmann, 1983).

Zweitens kann man versuchen, möglichst wenig Detergenzien bei der Solubilisierung zu

benutzen. In der Abb. 4.1 wird der Solubilisierungsprozess biologischer Membran mit

Protein dargestellt. Die Detergenzien werden schrittweise zu einer Membransuspension

hinzugefügt. Nach jedem Schritt wird die Suspension bei 100,000 x g zentrifugiert. Die

Masse des Sediments und die Konzentration an Protein und Lipid im Überstand wird

gemessen und somit der Solubilisierungsgrad von Protein und Lipid bestimmt. Dieser

Prozess kann in drei Phasen eingeteilt werden. In der Phase I findet noch keine

Solubilisierung des Proteins statt, so dass bei einer Zentrifugation bei 100,000 x g für 1 h

die Membranen nahezu vollständig sedimentiert würden. Diese Phase entspricht ebenfalls

der Phase a in der Abb. 1.7: Die Detergenzmoleküle dringen zunehmend in die

Lipiddoppelschicht ein, aber die Lipide überwiegen noch. In der Phase II werden die

Membranproteine und Lipide kontinuierlich mit dem Detergenz solubilisiert. Der in dieser

Phase entstehende Protein-Detergent-Komplex enthält noch relativ viele Lipide. In der

Phase III werden sowohl die Lipide als auch die Membranproteine vollständig solubilisiert

und die vorher noch im PDK vorhandenen Lipide werden schrittweise durch Detergenz

ersetzt. Am Ende werden die Proteine fast ausschließlich von Detergenzien umhüllt.


76

Anhand des Diagramms sollen die Proteine kurz vor dem Übergangsbereich von Phase II

zur Phase III solubilisiert werden. Damit können die Membranproteine effizient gelöst

werden, ohne dass sie gleichzeitig zu stark delipidiert werden (Kragh-Hansen et al., 1998).

Als dritte Möglichkeit können die Phopholipide auch bei der Aufreinigung des Proteins

eingesetzt werden (Causes et al., 1997). Dafür muss zuerst analysiert werden, welche

Phospholipide in den Membranen vorhanden sind. So können bestimmte Phospholipide

gezielt zugesetzt werden. Anhand der Ergebnisse aus Abschnitt 3.6.2, liegen drei

verschiedene Phospholipide in der Membran von E. coli C43 vor, bei denen NirC

überexprimiert wird: Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylglycerin (PG) und

Cardiolipin (CL).

Abb. 4.1 Ein schematischer Solubilisierungsprozess. Die Phase I ist charakteristisch durch eine nahezu vollständige Sedimentierung von Membranen nach einer Zentrifugation bei 100,000 x g für 1 h. In der Phase II werden Membranproteine und Lipide kontinuierlich solubilisiert. Der in dieser Phase entstehende Protein-Detergent-Komplex enthält noch relativ viele Lipide. In der Phase III werden sowohl Lipide als auch Membranproteine vollständig solubilisiert und die vorher noch im PDK vorhandenen Lipide werden schrittweise durch Detergenz ersetzt. Am Ende werden die Proteine fast ausschließlich von Detergenzien umhüllt (Kragh-Hansen et al., 1998).


77

Ein anderes Problem während der Aufreinigung des Proteins war die Größe von NirC. Die

theoretische molekulare Größe von NirC ist 28.562 kDa. Deshalb wurde am Anfang eine

Superdex 75 Säule, die für die Trennung von Proteinen mit einer molekularen Größe von

3-70 kDa effizient ist, für die Größenausschlusschromatographie verwendet. Hier fand sich

NirC aber immer im Ausschlussvolumen. Dies kann darauf zurückführen sein, dass die am

Protein gebundenen Detergenzmoleküle sowie die möglichen Multimerformen des Proteins

vernachlässigt wurden. Aufgrund der Tatsache, dass NirC im SDS-Gel in vier Banden

(Monomer, Dimer, Trimer, Tetramer) auftrat und alle Proteine nach der Zertrifugation

mittels einer Zentrifugationsmembran mit einer Ausschlussgröße von 50 kDa

aufkonzentriert werden konnten, wird vermutet, dass NirC als Tetramer vorliegt. Diese

Vermutung wurde durch eine Gelfiltration mit einer Superdex 200 Säule bestätigt, welche

Proteine mit einer Größe von 10-600 kDa effektiv trennen kann.

4.2 Bestimmung der Detergenz-/Phospholipidzusammensetzung im PDK

Die qualitative und quantitative Analyse der Zusammensetzung von Detergenz und

Phospholipid im Protein-Detergenz-Komplex liefert wichtige Informationen über

Delipidierung. Wegen des Zeitlimits wurde jedoch die Analyse nur auf das mit LDAO

aufgereinigte NirC eingegangen. Weitere Experimente sollen mit Protein ausgeführt

werden, das mit anderem Detergenz aufgereinigt worden ist. Ein Vergleich des

Lipidgehalts von Protein vor und nach der Gelfiltration sollte ebenfalls durchgeführt

werden. Damit könnte die Delipidierungsfähigkeit der Gelfiltration bzw. verschiedener

Detergenzien verglichen werden (Lemieux et al., 2003).


78

4.3 Kristallisation

Die Kristallisation ist eine der entscheidenden und auch schwierigsten Schritte in der

Ermittlung einer dreidimensionalen Proteinstruktur. Bei Membranproteinen tritt ein

Kristall normalerweise in der Nähe der LLPS (engl. liquid-liquid phase separation) auf, bei

der sich die wässrige Phase und die Detergenzphase voneinander trennen. Die LLPS wird

wiederum durch mehrere Faktoren beeinflusst, wobei der Typ des Detergenz, die

Präzipitanzkonzentration, die Temperatur und eventuell ein zusätzliches Amphiphil zu den

wichtigsten gezählt werden (Tanaka et al., 2003; Rosenow et al., 2000; Yu et al., 2000).

Detergenz vermittelt die Interaktion im Protein-Detergenz-Komplex (Abb. 4.2). In dieser

Arbeit wurden insgesamt 6 verschiedene Detergenzien getestet, D9M, D10M, D11M,

DDPO und LDAO. D9M, D10M, D11M sind nichtionische Detergenzien und haben alle

einen Maltopyranosid-Kopf, aber unterschiedlich lange Alkylketten. DDPO ist ein

nichtionisches Phosphinoxid und LDAO ist ein zwitterionisches Aminoxid (Tabelle 1.3).

Es wurde Kristalle bei allen Dergentien außer DDPO gefunden. Die besten

Kristallisationsbedingungen sowie die Gestalt des Kristalls waren jedoch leicht

unterschiedlich, was den Einfluss des Detergenz bei der Kristallisation widerspiegelt. Bis

jetzt sind die Kristalle aus NirC/LDAO am besten gewachsen. Sie sind vergleichsweise

groß und dreidimensional und haben typisch eine oktaedrische Gestalt (Abb. 3.18). Leider

streuten sie sehr schlecht (≥ 18 Å). Bei NirC/D10M wurden auch viele große

dreidimensionale Kristalle produziert. Sie waren hexagonal und relativ dünn. Ihre

Oberflächen waren unregelmäßig (Abb. 3.19), was vermutlich darauf hindeutet, dass die

Proteinmoleküle im Kristall nicht perfekt angeordnet waren. Solche Kristalle streuten

maximal bis ca. 8 Å. Einige Kristallmanipulationen, wie z.B. „crystal annealing“,

Kristalldehydration und „cross-link“ wurden durchgeführt. Sie erbrachten jedoch keine

Verbesserung. Vor kurzem wurden Kristalle bei NirC/D9M, NirC/D11M und NirC/DDM

(Abb. 3.19) beobachtet. Sie hatten die gleiche Gestalt wie Kristalle aus dem NirC/D10M,

aber waren dicker und ihre Oberflächen waren ebenfalls glatter im Vergleich zu

NirC/D10M. Sie sind aber noch zu klein für Beugungsexperimente.


79

Es wurde beobachtet, dass das Präzipitanz PEG 400 bei der Löslichkeit des Proteins

NirC/LDAO eine interessante Rolle spielt. Das Auftreten von Präzipitat nimmt deutlich zu,

wenn die Konzentration an PEG 400 höher als 32 % ist, da PEG 400 die Löslichkeit des

Proteins verringern kann. Ist Jedoch die Konzentration niedriger als 28 %, fällt das Protein

wieder aus, was schwieriger zu erklären ist. Vielleicht kann die OH-Gruppe der PEG-

Moleküle den Protein-Detergenz-Komplex mittels polarer Wechselwirkungen stabilisieren,

so dass eine bestimmte Konzentration an PEG benötigt wird. Dieses Phänomen wurde

jedoch bei der Kristallisation von NirC mit D9M, D10M, D11M oder DDM nicht

beobachtet. Diese Proteinsolubilisate sind generell stabiler als NirC/LDAO bei höherer

Präzipitanzkonzentration (34 % - 40 % PEG 400).

Für die Verbesserung des Kristalls sollen vor allem andere Detergenzien oder

Detergenzmischungen getestet werden. Eine Mischung von Detergenzien mit

unterschiedlicher Kettenlänge hat den Vorteil, dass sie die reale Lipidumgebung innerhalb

der Membrandoppelschicht besser simulieren kann (Esmann 1983). Als nächstes soll das

Protein ohne eine starke Delipidierung ausprobiert werden. Der für die

Affinitätschromatographie eingesetzte HisTag sollte ebenfalls nicht vernachlässigt werden.

Acht Aminosäuren (sechs Histidin und zwei Aminosäuren aus der Schnittstelle von XhoI)

werden am C-Terminus des NirC eingefügt, was möglicherweise die Proteine instabil

macht. Deshalb kann eine Schnittstelle für eine Protease vor dem HisTag eingebaut werden,

so dass der HisTag nach der Aufreinigung des Proteins entfernt werden kann. Die TEV-

Abb. 4.2 Die durch Detergenz vermittle Interaktion zwischen Membranproteinmoleküle innerhalb Kristalle. a): Typ I 3D Kristall; b): Typ II 3D Kristall (Ostermeier et al., 1997).


80

Protease passt perfekt zu NirC, da ihre Erkennungssequenz Gly↓Gln-Phe-Tyr-Leu-Asn-

Glu ist und ein Glycin genau die letzte Aminosäure von NirC ist.

Die Beugungsqualität des Kristalls hängt darüberhinaus von der Kryobedingung ab. In

dieser Arbeit wurde dieselbe Lösung aus dem Reservoir, jedoch mit 35 % PEG 400 als

Kryobedingung, benutzt. Hirebei wurde häufig beobachtet, dass sich entweder die Kristalle

lösten oder die Oberflächen der Kristalle rauher wurden. Deshalb müssen bessere

Kryobedingungen gefunden werden.

4.4 ITC

Bei dem ITC-Experiment wurden insgesamt zehn verschiedene Bedingungen (Tabelle 3.3)

getestet. Aber keine richtige Bindung wurde beobachtet. Bei fast allen Fällen fand sich ein

linearer Verlauf (Abb. 3.20). Dies sollte vielmehr ein Ergebnis der Verdünnung des

Proteins bzw. Ligands sein. Da die Experimente in einem großen Bereich von

Bedingungen durchgeführt wurden, wird vermutet, dass die Bindung noch von anderen

Faktoren abhängt, als bisher getestet wurde.

Eine Möglichkeit ist, dass die Proteine in einer durch Detergenz inaktivierten Form

aufgereinigt wurden. Genau wie in Abschnitt 4.2 erläutet, führt eine zu starke

Delipidierung häufig zur Inaktivierung eines Membranproteins. Mit Blick auf die

Ergebnisse in Abschnitt 3.6.2 wurde NirC/LDAO wahrscheinlich durch Delipidierung

inaktiviert. D10M ist ein nichtionisches Detergenz und ist eigentlich milder als LDAO.

Aber das NirC/D10M wurde durch den Detergenzaustausch aus NirC/LDAO erhalten,

deshalb sollte es wahrscheinlich ähnlich stark delipidiert worden sein. Um diese

Deaktivierung zu vermeiden, könnte vor allem das weniger delipidierte Protein verwendet

werden. Als eine alternative Möglichkeit können andere Detergenzien als Zusätze benutzt

werden. C12E10 scheint hier eine gute Wahl zu sein, da es eine Mischung aus

Polyoxyethylen mit unterschiedlichen Oxyethylenkettenlängen ist. Deshalb sollte es die

essentiellen Phospholipide teilweise ersetzen. In einigen Fällen konnte die enzymatische

Aktivität dadurch fast vollständig wiederhergesetzt werden. Zum Beispiel wird bei der

durch C12E8 solubilisierten Na+,K+-ATPase irreversible inaktivierung beobachtet, wenn

das C12E8/Protein-Verhältnis (mg/mg) höher als vier ist. Wenn aber 1 mg/ml C12E10


81

eingesetzt wird, bleibt die Aktivität bei ca. 90-95 %, selbst wenn die Konzentration an

Protein in der Lösung 0,35 mg/ml, C12E8 2 mg/ml beträgt (Esmann, 1983).

Da die vermutliche Funktion von NirC im Nitrittransport liegt, ist es möglich, dass es in

zwei Konformationen auftritt. Die erste Form sollte eine höhere Affinität zu Nitrit bzw.

HNO2, so dass Nitrit bzw. HNO2 an der periplasmatischen Seite der Cytoplasmamembran

binden kann. Die zweite Form sollte im Gegensatz dazu eine niedrigere Affinität zu Nitrit

bzw. HNO2 haben, so dass das Substrat auf der cytoplasmatischen Seite wieder ins

Medium freigesetzt werden kann. Daher kann NirC, wenn es in der zweiten Form

aufgereinigt wird, seine Substrate nicht binden. In diesem Fall ist die Inaktivierung vom

Detergenz unabhängig und kann deshalb nicht vermieden werden.

ZZUUSSAAMMMMEENNFFAASSSSUUNNGG

82

5 ZUSAMMENFASSUNG

Denitrifikation ist ein anaerober Prozess, bei dem Nitrat anstelle von Sauerstoff als

terminaler Elektronenakzeptor fungiert. Der Nitrit/ Protonen-Symporter NirC ist an diesem

Prozess beteiligt. Er ist ein Membranprotein mit sechs Transmembranhelices und gehört

zur FNT-Familie (Formiat/Nitrat-Transporter). Das durch NirC importierte Nitrit wird mit

Hilfe der cytoplasmatischen Nitritreduktase NirB zu Ammoniak reduziert, welches die

wichtigste Sticktsoffquelle für die Biosynthese von Aminosäuren und Nukleinsäuren

darstellt.

Um den Transportmechanismus aufzuklären, wurde in dieser Diplomarbeit das Gen nirC

aus E. coli mit PCR amplifiziert und dann in den Expressionsvektor pET-21a(+) kloniert.

NirC wurde in E. coli C43 überexpremiert und anschließend mit LDAO solubilisiert. Die

Aufreinigung erfolgte mittels Affinitätschromatographie und Gelfiltration. Mit dem reinen

NirC/LDAO wurden Detergenzaustausche (LDAO→DDPO, LDAO→D10M,

D10M→D9M, D10M→D11M, D10M→DDM) durchgeführt. Kristalle wurden überall bei

all diesen Protein-Detergenz-Komplexen mit Ausnahme von NirC/DDPO gefunden. Sie

beugten jedoch nicht ausreichend für die Strukturaufklärung.

Zur Charakterisierung der Bindungsaffinität (Ka), der Bindungsenthalpie (ΔH) und der

Bindungsstöchiometrie (n) von NirC mit seinem Liganden Nitrit wurden ITC-Experimente

durchgeführt. Eine Bindung von Ligand und Protein konnte nicht nachgewiesen werden,

da das Protein möglicherweise in einer inaktivierten Form aufgereinigt wurde.

Zusätzlich wurde die Zusammensetzung des Detergenz bzw. Phospholipids im Protein-

Detergenz-Komplex qualitativ und quantitativ bestimmt, was die Informationen für die

Verbesserung der Kristallisation bzw. der ITC-Experimente in der Zukunft liefert.

LLIITTEERRAATTUURRVVEERRZZEEIICCHHNNIISS

83

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AANNHHAANNGG

92

7 ANHANG

7.1 Abkürzungsverzeichnis

Å Angstrøm = 10-10 m (keine SI-Einheit)

ε molarer Extinktionskoeffizient

Amp Ampicillin

APS Ammoniumpersulfat

BCA 2,2'-Bichinolin-4,4'-dicarbonsäure Dikaliumsalz

bp Basenpaare (base pairs)

BCA Bicinchroninsäure

BSA Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin)

C12E8 Polyoxyethylene(8)dodecyl ether


CIAP calf intestine alkaline phosphatase

CL Cardiolipin

D9M n-Nonyl-ß-D-Maltopyranosid

D10M n-Decyl-ß-D-Maltopyranosid

D11M n-Undecyl-ß-D-Maltopyranosid

Da Dalton [g/mol]

DDM n-Dodecyl-ß-D-Maltopyranosid

DDPO Dimethyl-Decylphosphin

DC Dünnschichtchromatographie

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonucleinsäure

GC Gaschromatographie

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

His-Tag Histidin Marker

AANNHHAANNGG

93

IPTG Iso-propylthiogalactosid

ITC Isothermal Titration Calorimetry

Kan Kanamycin

kDa KiloDalton, 1 kDa = 1000 g·mol-1

LB Luria Bertani

LDAO n-Dodecyl-N,N-Dimethylamin-N-Oxid

M mol/L

MS Massenspektrometrie

MW Molekulargewicht [g/mol]

OD Optische Dichte

PA Phosphatidyl Acid

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PC Phosphatidylcholin

PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

PDK Protein-Detergenz-Komplex

PE Phosphatidylethanolamin

PEG Polyethylenglykol

PG Phosphatidylglycerol

PI Phosphatidylinositol

SDS Natriumdodecylsulfat

TEMED N, N, N´, N´ Tetramethylethylendiamin

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

UV Ultraviolett

v/v Volumenprozent (volume per volume)

w/v Gewichtsprozent (weight per volume)

AANNHHAANNGG

94

7.2 Basensequenz von NirC

1 atgtttacag acactattaa taagtgtgcg gctaacgctg cgcgcattgc acgcctgtcg

61 gcaaataacc cgctcggctt ttgggtcagc tccgccatgg cgggcgcgta tgtgggtctt

121 gggatcatcc tgattttcac gctcggtaat ttgctcgatc catccgtacg ccctttggtg

181 atgggcgcga cctttggtat cgccttaacg ctggtgatta tcgccggttc tgaactgttc

241 accggacaca ccatgttcct cacctttggg gtaaaagcgg gcagcatcag ccacgggcaa

301 atgtgggcaa tcctgccgca aacctggctg ggtaacctgg tcggttccgt cttcgttgcc

361 atgctctata gctggggcgg cggtagcctg ctgccggtag ataccagcat cgttcactcc

421 gtcgcgctgg ctaaaaccac tgcaccggca atggtactct tcttcaaagg tgcattgtgt

481 aactggctgg tttgcctggc aatctggatg gcgctgcgca ctgaaggggc ggcgaaattt

541 atcgctatct ggtggtgtct gctggcattt atcgcgtccg gctacgagca ctctatcgct

601 aacatgacgc tgttcgcgct ctcctggttc ggcaaccaca gcgaagccta cacgctggcg

661 ggtattggtc ataacctgct gtgggtgacg ctgggtaata ctttatcagg tgccgtattc

721 atgggattgg gttattggta tgctacgccg aaagcgaatc gtccggttgc ggacaaattt

781 aatcaaactg aaacggctgc cggttaa

7.3 Aminosäuresequenz von NirC

1 mftdtinkca anaariarls annplgfwvs samagayvgl giiliftlgn lldpsvrplv

61 mgatfgialt lviiagself tghtmfltfg vkagsishgq mwailpqtwl gnlvgsvfva

121 mlyswgggsl lpvdtsivhs valakttapa mvlffkgalc nwlvclaiwm alrtegaakf

181 iaiwwcllaf iasgyehsia nmtlfalswf gnhseaytla gighnllwvt lgntlsgavf

241 mglgywyatp kanrpvadkf nqtetaag

DDAANNKKSSAAGGUUNNGG

95

Ich danke herzlich:

Herrn Prof. Dr. Oliver Einsle für eine hochspannende Aufgabenstellung und

seine engagierte und lehrreiche Betreuung.

Herrn Prof. Dr. Ralf Ficner für die Übernahme des Korreferates.

Herrn Daniel Heitmann für die hervorragende Betreung und Diskussion im

Verlauf der Diplomarbeit.

Frau Dr. Susana Andrade für die hilfreiche Unterstützung.

den Mitgliedern der M’n’M-Gruppe: Andreas, Anja, Haitham, Maren, Peer

und Sarah für die äußerst angenehme Arbeitsumgebung und viele

beantwortete Fragen sowie allen weiteren Mitgliedern der Abteilung

molekulare Strukturbiologie für Hilfestellungen.

meinen Eltern für ihre Liebe und finanzielle Unterstützung.

Juan für alles

UUnntteerrssuucchhuunnggeenn zzuurr FFuunnkkttiioonn ddeess NNiittrriitt--TTrraannssppoorrtteerrss NNiirrCC aauuss EEsscchheerriicchhiiaa ccoollii

Diplomarbeit vorgelegt von

Wei Lü

aus

Jiangsu, China

angefertigt im Institut für Mikrobiologie und Genetik

Abteilung Molekulare Strukturbiologie an der Biologischen Fakultät der Georg-August-Universität zu Göttingen

2007

Referent: Prof. Dr. Oliver Einsle Korreferent: Prof. Dr. Ralf Ficner Abgabedatum der Diplomarbeit: 13.04.2007 Letzter mündlicher Prüfungstermin: 14.07.2006


1

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG .................................................................................................... 4

1.1 Biologische Membran .................................................................................. 4 1.1.1 Aufbau biologischer Membranen............................................................. 4 1.1.2 Funktionen biologischer Membranen ...................................................... 7

1.2 Membranproteine ......................................................................................... 7 1.2.1 Klassifizierung ......................................................................................... 8 1.2.2 Funktionen von Membranproteinen......................................................... 9

1.3 Detergenzien .............................................................................................. 10 1.3.1 Klassifizierung ....................................................................................... 11 1.3.2 Wichtige Parameter von Detergenzien................................................... 12 1.3.3 Solubilisierung von Membranproteinen mit Detergenzien.................... 13 1.3.4 Delipidierung ......................................................................................... 15 1.3.5 Detergenz-Membranprotein-Interaktion und Kristallisation.................. 15

1.4 Stickstoffkreislauf ...................................................................................... 17

1.5 Bedeutung von Nitrat und Nitrit ................................................................ 19

1.6 Das Nitratreduktasesystem in E. coli ......................................................... 20

1.7 Das Nitritreduktasesystem in E. coli .......................................................... 21

1.8 Transport von Nitrat und Nitrit in E. coli................................................... 22

1.9 Daten von NirC aus E. coli ........................................................................ 24

1.10 Aufgabenstellung und Zielsetzung............................................................. 25

2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................... 26

2.1 Primer-Design ............................................................................................ 26



2.4 Überexpression in E. coli ........................................................................... 31

2.5 Reinigung von NirC ................................................................................... 31 2.5.1 Zellernte ................................................................................................. 32 2.5.2 Zellaufschluss......................................................................................... 32 2.5.3 Isolierung der Membranen ..................................................................... 33 2.5.4 Solubilisierung mit Detergenz ............................................................... 33 2.5.5 His-Tag Affinitätschromatographie ....................................................... 34 2.5.6 Größenausschlußchromatographie......................................................... 34 2.5.7 Austausch von Detergenz....................................................................... 35


2

2.6 Analytische Methoden ............................................................................... 36 2.6.1 Agarosegelelektrophoresen .................................................................... 36 2.6.2 Gelextraktion.......................................................................................... 37 2.6.3 SDS-PAGE............................................................................................. 37 2.6.4 Western Blot .......................................................................................... 39 2.6.5 Dünnschichtchromatographie (DC) ....................................................... 39 2.6.6 Lipidextraktion....................................................................................... 40 2.6.7 Saure Methylierung................................................................................ 41 2.6.8 Gaschromatographie .............................................................................. 42 2.6.9 GC/ MS .................................................................................................. 42 2.6.10 Aggregationstest................................................................................. 43

2.7 Kristallisation von gereinigtem NirC......................................................... 44 2.7.1 Vorgefertigte und kommerziell erhältliche Screens............................... 45 2.7.2 Feinscreen, Additive Screen und Detergent Screen............................... 46 2.7.3 Microseeding.......................................................................................... 46 2.7.4 Kryobedingungen................................................................................... 47 2.7.5 Kristall Annealing .................................................................................. 47 2.7.6 Kristall Dehydrierung ............................................................................ 48 2.7.7 Röntgenbeugungsexperimente ............................................................... 48


3 ERGEBNISSE .................................................................................................. 50



3.3 Überexpression in E. coli C43 ................................................................... 53

3.4 Wachstumskurven...................................................................................... 54

3.5 Reinigung von NirC ................................................................................... 55 3.5.1 Zellernte, Aufschluss und Isolierung de Membranen ............................ 55 3.5.2 Solubilisierung mit Detergenz ............................................................... 56 3.5.3 Affinitätschromatographie ..................................................................... 56 3.5.4 Größenausschlußchromatographie......................................................... 59 3.5.5 Bestimmung der Proteinkonzentration................................................... 60

3.6 Quantitative Bestimmung der Zusammensetzung von Detergenzien und Lipiden im Protein-Detergenz-Komplex (PDK).................................................... 61

3.6.1 Bestimmung des Detergenz-Protein-Verhältnisses im PDK.................. 61 3.6.2 Bestimmung der Lipidzusammensetzung im PDK................................ 63

3.7 Aggregationstest......................................................................................... 64

3.8 Austausch von Detergenz........................................................................... 65

3.9 Kristallisation von NirC ............................................................................. 69

3.10 Röntgenbeugungsexperimente ................................................................... 71



3

4 DISKUSSION ................................................................................................... 74

4.1 Solubilisierung und Aufreinigungen von NirC.......................................... 74

4.2 Bestimmung der Detergenz-/Phospholipidzusammensetzung im PDK..... 77

4.3 Kristallisation ............................................................................................. 78

4.4 ITC ............................................................................................................. 80

5 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................. 82

6 LITERATURVERZEICHNIS........................................................................ 83

7 ANHANG.......................................................................................................... 92

7.1 Abkürzungsverzeichnis .............................................................................. 92

7.2 Basensequenz von NirC ............................................................................. 94

7.3 Aminosäuresequenz von NirC ................................................................... 94


4

1 EINLEITUNG

1.1 Biologische Membran

Alle Lebewesen, sowohl Pro- als auch Eukaryonten, besitzen eine Plasmamembran (Abb.

1.1). Sie trennt das Zytoplasma von der Umgebung ab und hält somit die Zellen von

Gleichgewicht fern, was die Voraussetzung für das Leben ist. Mit einem Wort, die

biologische Membran ist die Grundlage der Entwicklung komplexen biologischen Systems.

1.1.1 Aufbau biologischer Membranen

Biologische Membranen unterscheiden sich je nach ihren Funktionen in ihrer chemischen

Zusammensetzung, ihrer Morphologie und ihren enzymatischen Funktionen sehr stark

voneinander. Jedoch sind sie nach einem gemeinsamen Prinzip aufgebaut:

Lipiddoppelschichten bilden die Permeabilitätsschranke und enthalten Membranproteine,

Abb. 1.1 Biologische Membran. Links: Plasmamembran im Elektronenmikroskop. Rechts: schematische Darstellung einer Plasmamembran (aus dem Internet).


5

die entweder als Transportsystem, bestehend aus Pumpen und Kanälen, wirken, oder

enzymatische Funktionen übernehmen. Zusätzlich sind noch andere Moleküle wie z.B.

Cholesterin vorhanden, die bestimmte biologische Funktionen haben. Biologische

Membranen sind asymmetrisch, d.h. die verschiedenen Phospho- und Glycolipide sind

stark ungleich verteilt. In der äußeren Schicht überwiegen Phosphatidylcholin,

Sphingomyelin, Cholesterin und Glycolipide. In der inneren Schicht überwiegen

Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol und Phosphatidylethanolamin (Biochemie Stryer,

5. Auflage).

Membranen weisen eine hoch dynamische Struktur auf. Das Flüssigmosaikmodell (Singer

und Nicolson, 1972) beschreibt die biologische Membran folgendermaßen: Membranen

sind zweidimensionale Lösungen gerichteter Lipide und globulärer Proteine. In anderen

Worten, die Lipidkomponente bewegt sich ständig, sowohl durch laterale Diffusion

(spontan, schnell) als auch durch transversale Diffusion (mit Hilfe von Flippase, langsam).

Membranproteine können ebenfalls lateral in der Lipidmatrix diffundieren.

Die Lipidzusammensetzungen einiger Tiere- bzw. Bakterienzellmembranen werden in

Tabelle 1.1 dargestellt.

Tabelle 1.1 Lipidzusammensetzung einiger Tier- bzw. Bakterienzellmembranen. PC: Phosphatidylcholin; PE: Phosphatidylethanolamin; PG: Phosphatidylglycerin; PS: Phosphatidylserin; CL: Cardiolipin; SM: Sphingomyelin.

Lipidzusammensetzung

Membran PC PE PG PI PS CL SM Cholesterin Gangliosid

Myelin (Mensch) 10% 20% - - 8,5% - 8,5% 27% 26%

Erythrozyt (Mensch) 25% 22% - - 10% - 18% 25% -

Mitochondrium 40% 39% - 2% - 17% - in Spuren -

E. coli - 74% 19% - - 3% - - -

Zur den biologisch wichtigsten Eigenschaften der Lipide gehört ihr amphiphiles Verhalten.

Diese Eigenschaft ist im Wesentlichen auf ihren besonderen Aufbau zurückzuführen: alle

Lipide haben einen hydrophilen Kopf, der am häufigsten aus Glycerin oder Sphingosin

besteht, und einen hydrophoben Schwanz aus Fettsäuren. Ein schematischer Aufbau

verschiedener Lipide wird in Abb. 1.2 dargestellt.


6

Tabelle 1.2 Einige natürlich vorkommende Fettsäuren (Biochemie Stryer, 5. Auflage).

Anzahl der C-Atome

Anzahl der Doppelbindungen

Trivialname systematischer Name

12 0 Laurat n-Dodecanat

14 0 Myristat n-Tetradecanat

16 0 Palmitat n-Hexandecanat

18 0 Stearat n-Octadecanat

20 0 Arachinat n-Eicosanat

22 0 Behenat n-Docosanat

24 0 Lignocerat n-Tetracosanat

16 1 Palmitoleat cis-Δ9-Hexadecenat

18 1 Oleat cis-Δ9-Octadecenat

18 2 Linoleat cis,cis-Δ9-Δ12-Octadecadienat

18 3 Linolenat all-cis-Δ9,Δ12,Δ15-Octadecatrienat

20 4 Arachidonat all-cis-Δ5,Δ8,Δ11,Δ14-Eicosatetraenat

Abb. 1.2 Schematischer Aufbau verschiedener Lipide (http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-2/ch11_lipid-struct.jpg).


7

Fettsäuren in biologischen Systemen besitzen gewöhnlich eine gerade Anzahl von

Kohlenstoffatomen, typischerweise zwischen 14 und 24 (Tabelle 1.2). Dabei kommen

Fettsäuren mit 16 und 18 C-Atome am häufigsten vor. Die Alkylkette kann gesättigt sein

oder eine bzw. mehrere Doppelbindungen enthalten, die meistens eine cis-Konfiguration

haben.

1.1.2 Funktionen biologischer Membranen

Die Lipidkomponenten bilden eine Permeabilitätsbarriere, so dass Membranen für Ionen

und die meisten polaren Moleküle sehr gering durchlässig sind. Ausnahme sind einige

unpolare kleine Moleküle wie z.B. Sauerstoff bzw. Wasser (zwar polar, aber klein, hohe

Konzentration und keine komplette Ladung). Damit wird die Zelle von der Umgebung

getrennt. Dies ist die wichtigste Funktion biologischer Membranen. Die zweite wichtige

Funktion ist die Energiespeicherung, da Fettsäuren hochkonzentrierte Energiespeicher sind.

Weitere Funktionen der Membran werden hauptsächlich mittels Membranproteinen erfüllt,

wie z.B. Transport, Signalübertragung, enzymatische Funktionen. Sie werden im nächsten

Abschnitt (1.2) genauer erläutert.

1.2 Membranproteine

Ein Membranprotein ist ein in die Lipidschicht einer Biomembran eingelagertes oder

dieser aufgelagertes Protein. Gemäß der Analyse von genomischen Sequenzen sind 30 %

der gesamten Proteine bei E. coli Membranproteine.


8


Membranprotein werden in zwei große Klassen unterteilt: Intergrale Membranproteine und

membranständige Proteine.

Als intergrale Membranproteine werden die Proteine bezeichnet, die die

Lipiddoppelschicht einer Membran durchspannen. Sie werden wiederum in zwei Gruppen

unterschieden. Die erste sind aus α-Helices bestehende Transmembranproteine, zu denen

sowohl die sogenannten „singlepass“ Transmembranproteine (engl. bitopic membrane

proteins) gehören, die die Membran nur einmal durchqueren, wie z.B. T-Zell-Rezeptoren,

als auch die „multipass“ Transmembranproteine (entl. polytopic membrane proteins) wie

z.B. Membrantransporter und Ionenkanäle. Die zweite sind Transmembranproteine, die aus

β-Faltblättern aufgebaut sind. Solche Proteine sind nur in der äußeren Membran Gram-

negativer Bakterien, der Zellwand Gram-positiver Bakterien und äußeren Membran von

Mitochondrien vorhanden und haben eine zylinderförmige Transmembran-β-

Faltblattstruktur, wie z.B. LamB, eine Maltoseporin (Van Gelder et al., 2002).

Als membranständige Proteine (engl. monotopic membrane proteins) werden Proteine

bezeichnet, die zwar in der Membran verankert sind, diese jedoch nicht durchqueren. In

der Abb. 1.3 werden einige verschiedene membranständige Proteine schematisch

dargestellt.

Abb. 1.3 Intergrale Membranproteine. 1: singlepass Transmembranprotein mit einer Transmembranhelix. 2: multipass Transmembranprotein mit mehreren Transmembranhelices. 3: Transmembranprotein aus β-Faltblättern (http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_proteins).