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Ronald SrokaLaser-Forschungslabor, LIFE-Zentrum, Klinikum Großhadern

Diagnostik und optische Biopsie

∗ Fluoreszenzdiagnostik

(Prinzip, Nachweis aus Gewebe, 5-ALA)

∗ Optische BiopsieSensiti

zerSauerstoffTumorSensiti

zer

Thema

Photosensibilisator

5-Aminolävulinsäure und Protoporphyrin IX

x 8

C

HC C

CC C

C

C

C

C

CCC

C

C

C

CH

CH

CH

N

N

N

N

CHHC

COO-

CH2

CH3

CH2 CH2

CH2

CH3

CH3

CH2

H C2

H C3

COO-

H

H

CC

C

C

C

O

NH2

O OH

5-ALA PPIX

Häm-Biosynthese und 5-ALA-Applikation

Zelle

Mitochondrium 5-ALA

glycinsuccinyl CoA

5-ALA

PorphobilinogenUroporphyrinogen III

Coproporphyrinogen III

protoporphyrinogen IX

protoporphyrin IX

heme ferrochelatase+Fe++

feed back

5-ALA Applikation

protoporphyrin IX

PPIX

protoporphyrin IX5-ALA

GlycinSuccinyl CoA

HÄM Ferrochelatase+Fe++

Protoporphyrinogen IX

Rückkopplung

Protoporphyrin IX

Fluoreszenzdiagnostik

Was ist fluoreszenz ?

FITC und PPIX in Küvette

Demonstration

2

Fluoreszenz-Prinzip Anregung - Emission

Rot-VerschiebungStokes-Shift Na-Fluorescein PPIX

Fluoreszenz

Wellenlänge [nm]300 400 500 600 700

Abs

orpt

ion

[rel

.Ein

h.]

0,0

0,5

1,0

Wellenlänge [nm]300 400 500 600 700

Fluo

resz

. Int

. [re

l.Ein

h.]

0,0

0,5

1,0

Absorption Fluoreszenz

PPIX in Ethanol

UV IR UV IR

Fluoreszenz

Standard Weißlicht-Zystoskopie Fluoreszenz-Zystoskopienach Instillation von 5-Aminolävulinsäure

Rote Protoporphyrin IX Fluoreszenz

Wellenlänge [nm]400 450 500 550 600 650 700 750

Inte

nsitä

t [%

]

0

20

40

60

80

100

Anregungslichtquelle Beobachtungsfilter

Durch das Okular transmittierter Anteil der Remission

Fluoreszenzspektrumca. x10

Fluoreszenzzystoskopie: Technische Umsetzung Technik

3

Diangnostik Set vorstellen

Puppe mit Tumor Zystoskopie

Demonstration

• Harnblasentumor

5-ALA-Instillation3%, 50 ml, 3 h

Weißlichtinspektion

Fluoreszenzbeobachtung

Fluoreszenzendoskopie

Normal

Fluoreszenzdiagnostik im OP-Einsatz

Papillärer Harnblasentumor Hochrisikobefund: Carcinoma in situ Resektion zweier Carcinoma in situ Herde

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Multifokaler Harnblasentumor Condylomata acuminata der Harnröhre

Gefrierschnitt - WL

Hyperplasie

Vorteile von 5-ALA

Gewebeselektivität der PPIX-Akkumulation

Fluoreszenz

Tumorselektivität der PPIX-Anreicherung

Vorteile von 5-ALA

Mundhöhle - Larynx

Fluoreszenzdiagnostik mit 5-ALA

Ovarialkarzinom – Peritonealmtastase/Colon

Fluoreszenzdiagnostik mit 5-ALA

5

Bronchialkarzinom

Fluoreszenzdiagnostik mit 5-ALA Fluoreszenzdiagnostik mit 5-ALAGlioblastom

Fluoreszenzdiagnostik -Gehirntumor

Fluoreszenzdiagnostik -Gehirntumor

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

0 10 30 50 70 90 110 130 150

Überlebensdauer (Wochen)

ALA

konventionell

p < 0.001 log-rank Test

NeurochirurgieMalignes Gliom

Klinische Ergebnisse:

Fluoreszenzdiagnostik

Überlebenskurven:Vergleich konventioneller (historisches Kollektiv) mit fluoreszenzgestützter Resektion

Optische Biopsiedie

Diagnostische Zukunft

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Optische Diagnostik

Für die Intraoperative Diagnostik ist wichtig:

§ Lokalisierung

§ Staging

§ Grading

FluoreszenzdiagnostikOptische Tomographie

OCTOptoakustik

Konfokale EndoskopieOCTSpektroskopie

Konventionelle MikroskopieAufbau Ergebnisse

Niere ohne Indigokarmin

Niere mit Indigokarmin

Nachteile der konventionellen Mikroskopie

• Gewebe ist „durchsichtig“, da nur geringe Absorption und kaum Brechungsindexsprünge

• Projektion? keine Information in z-Richtung

Beispielaufnahmen

Tumorselektivität der PPIX-Anreicherung

FluoreszenzmikroskopieH&E-Färbung

Vor- und Nachteile der Fluoreszenzmikroskopie

Vorteil:• Präparation mit Fluoreszenzfarbstoffen

? Anfärbung spezifischer KomponentenNachteile:• Ausbleichen der Farbstoffe• keine 3-dim. Darstellung• Manchmal Zerstörung der Probe durch

Farbstoffe oder UV-Licht

Konfokale Mikroskopie• Fokussierung des Lasers in

der Probe• Filtern von Emission

außerhalb des Fokus durch Lochblende in der Bildebene ? Punkt-zu-Punkt-Abbildung

• Durch Scannen im Rasterverfahren erhält man eine dreidimensionale Abbildung

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Konfokale Endoskopie

Intrakorporale Scanner: Extrakorporale Scanner:(KOMED-Projekt)

http://www.fraunhofer.de/english/press/md-e/md2000/md01-2000e_t2.html

http://www.optiscan.com/

Konfokale Endoskopie

Urothel im gefärbten GewebeschnittJe ca. 10 µm tiefer

In vivo, Kolon, 150 µm²

König, Knittel, Stepp Science 292, 2001

Thema

FemtoSCOPE & Maunakeaneue Bilder

MotivationOptische Kohärenz Tomographie

OCTMotivation

Intensität des rückgestreuten Lichts ó Brechungsindexó Proteingehalt

• Unterschiedliche Weglängen à Rückgestreutes Licht trifft zu unterschiedlichen Zeitpunkten auf den Detektor

• Lichtgeschwindigkeit ist zu groß um Zeitverzögerungen elektronisch auflösen zu können à Interferometrie

Physikalische Grundlagen

8

Signal

Physikalische Grundlagen

Michelson -Interferometer

Physikalische GrundlagenAnwendungen

• Ophthalmologie• Kardiologie • Dermatologie

IMALUX – System

LightLab – Sonde

Demonstration Thema

BetaMod

Anwendungen Ophthalmologie

9

Anwendungen Ophthalmologie

Struktur der Netzhaut à Diagnose von Netzhauterkrankungen

Anwendungen Kardiologie

• Herzinfarktvorsorge

à Diagnose von Arteriosklerose

OCT-Sonde

Durchmesser 0.4 mm

Anwendungen Kardiologie

Kleiner anfänglicher Riss

Vergrößert

Anwendungen Venenchirurgie

50mm Rückzug der OCT Sonde

Ausblick: Intraoperative optische Pathologie

Fluoreszenzdetektion→ Lokalisierung

Optische Kohärenztomografie

(OCT)→ Staging

KonfokaleEndoskopie→ Grading

Thema

High End Endoscopy MunichHEEM

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Physikalische Methoden in der Medizin

Danke für ihreAufmerksamkeit!

Walter AssmannInes Lanzl

Ronald Sroka

undviele Mitarbeiter

DiplomandenDoktoranden