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Validierung von AnalysenmethodenValidierung von Analysenmethoden

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GrundlagenGrundlagen

Analytische Ergebnisse haben oft weitreichende Konsequenzen.

Die Untersuchungen müssen demnach mit nachweislich geeigneten Methoden durchgeführt werden.

Die Validierung ist der Nachweis der Gebrauchstauglichkeit.

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Was bedeutet ValidierungWas bedeutet Validierung

Validierung einer Analysenmethode beinhaltet:Festlegung der analytisch/chemischen AnforderungenBestimmung der MethodenparameterÜberprüfung, dass die Methode die Anforderungen erfülltAngabe der Gültigkeit

EN/IEC 17025: „Eine durch Überprüfung erlangte Bestätigung, dass alle Voraussetzungen für eine beabsichtigte Anwendung erfüllt sind“

„Ein Prozess der feststellt, dass eine Methode geeignet ist“

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Ziel der ValidierungZiel der Validierung

Charakterisierung der Methodenperformance (Kenndaten)Umfang/Anwendungsbereich und LimitierungenIdentifizierung von Faktoren die die Charakteristik der Methode ändern können (auch Ausmaß der Änderung)

Welchen Analyten kann eine Methode in welcher Matrixin Gegenwart welcher Störungen bestimmen?Mit welcher Messunsicherheit geschieht das?

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Ziel der ValidierungZiel der Validierung

Charakterisierung der Methodenperformance (Kenndaten)Umfang/Anwendungsbereich und LimitierungenIdentifizierung von Faktoren die die Charakteristik der Methode ändern können (auch Ausmaß der Änderung)

Welchen Analyten kann eine Methode in welcher Matrixin Gegenwart welcher Störungen bestimmen?Mit welcher Messunsicherheit geschieht das?

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3 3 Milestones Milestones der ISO/IEC 17025der ISO/IEC 17025

Validierung (validation)– Basisvalidierung (für in-house Methoden und nicht normierte

bzw. von der Norm abweichende Verfahren)– Bestätigung (im Falle von über ÖNORM, ISO, EN, DIN etc.

normierten Verfahren)

Rückführbarkeit der Analysenergebnisse (tracebility)Unsicherheit der Analysenergebnisse (uncertainty)

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Wozu?Wozu?

Sicherung der Qualität der Analysenergebnisse (im eigenen Interesse)Voraussetzung für AkkreditierungJuristisch abgesichertForderung der Auftraggeber

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Wann?Wann?

Entwicklung einer MethodeÄnderung einer MethodeWenn Kontrollunterschungen zeigen, daß sich die Methode verändert hatWenn eine anerkannte Methode in einer neuen Umgebung eingearbeitet werden soll.

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ChecklistChecklistKenndaten der Analysenmethode (im Wesentlichen durch die Grundkalibrierung abgedeckt)– Arbeitsbereich - linearer Bereich) / working range - linearity– Empfindlichkeit / sensitivity– Selektivität, Spezifität / selectivity, specificity– Nachweis, Bestimmungsgrenze /

limits of detection, determination

Eigenschaften des Analysenresultates– Rückführbarkeit / traceability

(z.B. auf das Internationale Einheitssystem SI)– Unsicherheit / uncertainty, unter Berücksichtigung von:

• Wiederfindung / recovery• Robustheit / robustness• Wiederholbarkeit / repeatability• Reproduzierbarkeit / reproducibility

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ChecklistChecklistKenndaten der Analysenmethode (im Wesentlichen durch die Grundkalibrierung abgedeckt)– Arbeitsbereich - linearer Bereich) / working range - linearity– Empfindlichkeit / sensitivity– Selektivität, Spezifität / selectivity, specificity– Nachweis, Bestimmungsgrenze /

limits of detection, determination

Eigenschaften des Analysenresultates– Rückführbarkeit / traceability

(z.B. auf das Internationale Einheitssystem SI)– Unsicherheit / uncertainty, unter Berücksichtigung von:

• Wiederfindung / recovery• Robustheit / robustness• Wiederholbarkeit / repeatability• Reproduzierbarkeit / reproducibility

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020406080

100120140160

0 20 40 60 80 100 120

NWGBG

Arbeitsbereich

Arbeitsbereich / working rangeArbeitsbereich / working rangeWird durch technische und praktische Erwägungen festgelegt und durch die Validierung bestätigt. (Meist bestimt durch den niedrigsten und höchsten Kalibrations Standard)

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Empfindlichkeit / sensitivityEmpfindlichkeit / sensitivity

Steigung der KalibrationsgeradenDifferenz in der Analytkonzentration, die der kleinsten detektierbaren Signaldifferenz entspricht

Ein Maß für die Signalauflösung eines Verfahrens.

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SelektivitSelektivitäät t –– SpezifitSpezifitäät / selectivity t / selectivity -- specificityspecificity

Spezifität bedeutet 100% Selektivität

Die IUPAC empfiehlt diesen Begriff nicht zu verwenden, weil praktisch keine Methode spezifisch ist.

Selektivität bedeutet bis zu welchem Ausmaß eine Methode geeignet ist, einen Analyten in einer Matrix ohne Störungen der anderen Komponenten zu bestimmen.

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S E L E K T I V I T Ä T

WägenLC

LC-DAD

LC/GC/CE-ICP-MSNAA

LC-MS-MS-MS

GC-MS-MSGC GC-MS

Photometrie

ICP-AES, ICP-MS, AAS

SelektivitSelektivitäät / selectivityt / selectivity

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A measure of the trueness of a (measurement) procedure(IUPAC 1999)

Referenzwert von:- CRM- Spiken einer Reinsubstanz

Je näher R = 1, umso kleiner ist die Abweichung in der Prozedur

rtReferenzweMesswertR =

CRM

observed

CCR =

spike

matrixobserved

cccR −

=

Wiederfindung / recoveryWiederfindung / recovery

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Wiederholbarkeit / repeatabilityWiederholbarkeit / repeatability

Präzision ausgedrückt als Standardabweichung von n unabhängigen Wiederholmessungen unter Wiederholbarkeitsbedingungen:

– Gleiches Labor, gleicher Analytiker, gleiches Gerät, kurzes Zeitintervall

Für die Variaton zwischen einzelnen Batches oder wiederholten Messungen

Auch als Wiederholpräzision bezeichnet

Fälschlicherweise mit Messunsicherheit gleichgesetzt

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Reproduzierbarkeit / reproducibilityReproduzierbarkeit / reproducibilityPräzision unter ‘intermediate precision conditions’ von n Wiederholungen:

– gleiches Labor– gleiche Meßprozedur– Messung über einen längeren Zeitraum

Auch genannt: within-laboratory reproducibility, Rw

Präzision unter ‘reproducibility conditions’:– Unterschiedliche Laboratorien– Unterschiedlicher Analytiker, Gerät, Zeit– Gleiche Methode

Auch genannt: between-laboratory reproducibility,R

Typically used for studying variation on measurements made between laboratories. (Reproducibility according to ISO 3534-1)

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Don’t forget

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Robustheit / robustness or ruggednessRobustheit / robustness or ruggednessWiederholbarkeit (repeatability) und Reproduzierbarkeit (reproducibility) der Analysenergebnisse eines Analysenverfahrens unter Variation verschiedener Bedingungen wie z.B. Methodenparameter (pH, T), Personen, Laboratorien, Geräte oder Geräteteile

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RRüückfckfüührbarkeit / traceability des hrbarkeit / traceability des MessergebnissesMessergebnisses

Lückenlose Rückführung aller, das Meßergebnis beeinflussenden Größen (Waagen, Volumsmeßgeräte, Kalibrationsstandards) auf nationale oder internationale Meßnormale (z.B. SI Einheiten).

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Nachweisgrenze / BestimmungsgrenzeNachweisgrenze / Bestimmungsgrenze

Es ist wichtig eine statistisch sichere Unterscheidung zwischen dem Messsignal einer Probe und dem Mess-signal des Blindwerts vorzunehmen.

α-Fehler (falsch positive Entscheidung): Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Probe substanzfrei ist, obwohl ein positiver Messwert vorliegt.β-Fehler (falsch negative Entscheidung): Die Wahrscheinlichkeit, dass die untersuchte Probe die Substanz doch enthält, obwohl der Messwert als Blindwert angesehen wird.

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Nachweisgrenze (limit of detection)Nachweisgrenze (limit of detection)(Entscheidungsgrenze f(Entscheidungsgrenze füür das Vorhandensein eines Analyten)r das Vorhandensein eines Analyten)Die Nachweisgrenze stellt den kleinsten Meßwert dar, der mit einer vorgegebenen Sicherheit vom Blindwert zu unterscheiden ist. Besitzt eine Probe genau diesen Gehalt des Analyten, so wird in 50% der Fälle der konkrete Meßwert kleiner als die Nachweisgrenze sein (β-Fehler = 50%).

Erhält man bei einer Analyse Meßwerte im Bereich der Nachweisgrenze, kann mit der vorgegebenen Sicherheit (Signifikanz) von z.B. 99% entsprechend einer Unsicherheit von 1% (α-Fehler) davon ausgegangen werden, daß der Analyt vorhanden ist.

Blindwert

X0 MeßwertXNG

Nachweisgrenze

50 %negativ

50 %positiv

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Die Nachweisgrenze stellt den kleinsten Meßwert dar, der mit einer vorgegebenen Sicherheit vom Blindwert zu unterscheiden ist. Besitzt eine Probe genau diesen Gehalt des Analyten, so wird in 50% der Fälle der konkrete Meßwert kleiner als die Nachweisgrenze sein (β-Fehler = 50%).

Erhält man bei einer Analyse Meßwerte im Bereich der Nachweisgrenze, kann mit der vorgegebenen Sicherheit (Signifikanz) von z.B. 99% entsprechend einer Unsicherheit von 1% (α-Fehler) davon ausgegangen werden, daß der Analyt vorhanden ist.

Blindwert

X0 MeßwertXNG

Nachweisgrenze

50 %negativ

50 %positiv

Vorgegebene Sicherheit3σ = 99.7%

=> NG = 3 x σ BW

Nachweisgrenze (limit of detection)Nachweisgrenze (limit of detection)(Entscheidungsgrenze f(Entscheidungsgrenze füür das Vorhandensein eines Analyten)r das Vorhandensein eines Analyten)

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Erfassungsgrenze Erfassungsgrenze –– nur DIN !nur DIN !(kleinste Konzentration eines Analyten, die mit hoher Wahrschein(kleinste Konzentration eines Analyten, die mit hoher Wahrscheinlichkeit lichkeit nachgewiesen werden kann nachgewiesen werden kann –– Untere Grenze fUntere Grenze füür die Quantifiziernug eines Analyten)r die Quantifiziernug eines Analyten)

Vorgegebene Sicherheit= 99.7%

=> EG = 2 x NG = 6 x σ BW

Um den β-Fehler der Nachweisgrenze zu verringern, wurde die Erfassungsgrenze eingeführt. Sie stellt den Meßwert dar, bei dem der β-Fehler gleich dem α-Fehler ist. Damit entspricht die Erfassungsgrenze dem 2 fachen der Nachweisgrenze. Unter Zugrundelegung eines α-Fehlers von 1% ist der Analyt auch hier, wie bei der Nachweisgrenze, mit einer Sicherheit von 99% nachgewiesen.

Blindwert

X0 MeßwertXNG

Nachweisgrenze Erfassungsgrenze

XEG

α = ß = 1%ß-Fehler α-Fehler

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Bestimmungsgrenze (limit of determination)Bestimmungsgrenze (limit of determination)(kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit eine(kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem vorgegebenen m vorgegebenen relativen Fehler bestimmt werden kann relativen Fehler bestimmt werden kann –– Untere Grenze fUntere Grenze füür die Quantifizierung r die Quantifizierung innerhalb eines bestimmten Fehlers)innerhalb eines bestimmten Fehlers)Die Analysenpräzision sollte über den gesamten Messbereich gleich groß sein. Die relative analytische Unpräzision (VB) nimmt mit sinkender Konzentration zu. Die BG entspricht jener Konzentration, ab der die geforderte Analysenpräzision (zumeist 33.3%) erfüllt ist.

0

20

40

60

80

100

120

140

Konzentration

Rel

. ana

lyt.

Unp

räzi

sion

VB

reli

n %

33%

XB

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Bestimmungsgrenze (limit of determination)Bestimmungsgrenze (limit of determination)(kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit eine(kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem vorgegebenen m vorgegebenen relativen Fehler bestimmt werden kann relativen Fehler bestimmt werden kann –– Untere Grenze fUntere Grenze füür die Quantifizierung r die Quantifizierung innerhalb eines bestimmten Fehlers)innerhalb eines bestimmten Fehlers)

Annähernd: BG ≈ 3.33 NG => BG = 10 x σ BW

Im Konzentrationsbereich der Bestimmungsgrenze wird die Anwesenheit des Analyten vorausgesetzt. Über das die Kalibrationsgerade umschliessenden Vertrauensband errechnet sich der Bestimmungsfehler ± VB. VB ist in der Arbeitsbereichsmitte am kleinsten und steigt mit zunehmender Entfernung von der Mitte. Es gilt BG = k* VB, näherungsweise auch BG = k * NG. Die Bestimmungsgrenze bezeichnet den Konzentrationswert, bei dem der relative Fehler erstmals die vorgegebene Schranke der Ergebnisunsicherheit unterschreitet. z.B. k=3 entsprechend 33,3%

f(x)

k * VB

VB

x

VB

BG

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Bestimmung von NG/EG/BG Bestimmung von NG/EG/BG -- BlindwertmethodeBlindwertmethodeBestimmung erfolgt über das Blindwertrauschen (Blindwertstatistik)=> Gültig für alle nicht kalibrierbare Methoden=> Gute Annäherung für kalibrierbare Methoden

Instrumenteller Blindwert (=> instrumentelle NG)Methodenblindwert (=> NG der Methde)

Lineare Kalibrierfunktion (ohne Blankkorrektur) :y=kx + d sbl ... Standardabweichung des Blanksignals

yNWG = Ybl + 3 sbl NWG = (yNWG – d)/k

yBG = Ybl + 10 sbl BG = (yBG – d)/k

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Bestimmung von NG/EG/BG Bestimmung von NG/EG/BG --BlindwertmethodeBlindwertmethode

lineare Kalibration

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0 2 4 6 8 10 12

Konzentration[ ng g-1]

Inte

nsitä

t [cp

s]

lineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 0 0.5

Konzentration[ ng g-1]

Inte

nsitä

t [cp

s]

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Bestimmung von NG/EG/BG Bestimmung von NG/EG/BG -- BlindwertmethodeBlindwertmethodelineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 0 0.5

Konzentration[ ng g-1]

Inte

nsitä

t [cp

s]

BW σ

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Bestimmung von NG/EG/BG Bestimmung von NG/EG/BG -- BlindwertmethodeBlindwertmethodelineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 0 0.5

Konzentration[ ng g-1]

Inte

nsitä

t [cp

s]

BW

3 x σ = NG

σ

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Bestimmung von NG/EG/BG Bestimmung von NG/EG/BG -- BlindwertmethodeBlindwertmethodelineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 0 0.5

Konzentration[ ng g-1]

Inte

nsitä

t [cp

s]

BW

3 x σ = NG

σ

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Bestimmung von NG/EG/BG Bestimmung von NG/EG/BG -- BlindwertmethodeBlindwertmethodelineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 0 0.5

Konzentration[ ng g-1]

Inte

nsitä

t [cp

s]

BW

3 x σ = NG

σ

NG

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Bestimmung von NG/EG/BG Bestimmung von NG/EG/BG -- BlindwertmethodeBlindwertmethodelineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 0 0.5

Konzentration[ ng g-1]

Inte

nsitä

t [cp

s]

BW

3 x σ = NG

σ

NG

6 x σ = EG

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Bestimmung von NG/EG/BG Bestimmung von NG/EG/BG -- BlindwertmethodeBlindwertmethodelineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Konzentration[ ng g-1]

Inte

nsitä

t [cp

s]

BW

3 x σ = NG

σ

NG

6 x σ = EG

EG

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Bestimmung von NG/EG/BG Bestimmung von NG/EG/BG -- BlindwertmethodeBlindwertmethodelineare Kalibration

0

1000

2000

3000

4000

-0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Konzentration[ ng g-1]

Inte

nsitä

t [cp

s]

BW

3 x σ = NG

σ

NG

6 x σ = EG

EG

10 x σ = BG

BG

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Bestimmung Bestimmung üüber die Kalibrationsgeradeber die KalibrationsgeradeBestimmung erfolgt über die Kalibrationsgerade bei kalibrierbaren Methoden(z.B. Mittels Software DIN Test©):

Ausreisserkontrolle + Statistik (t-Test...)

Bestimmung der NG/EG/BG über die Vertrauensbänder (Berechnung nach DIN 32645)

Nachteil der Berechnung: – Standards, aus denen die Kalibrationskurve erstellt wurde, müssen eigentlich

dieselbe Probenvorbereitungsprozedur wie die Proben durchlaufen, um einen dem Methodenblank entsprechende NG/BG und EG zu ergeben.

– Standards sollten äquidistant in der Nähe der NG liegen.– Bei nicht-linearer Kalibration: Gewichtung der Punkte

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Bestimmung Bestimmung üüber die Kalibrationsgeradeber die KalibrationsgeradeNG/BG eines Verfahrens kann nicht aus einer einmaligen Kalibrierung ermittelt werden

Bei einmaliger Kalibrierung dient die Berechnung der EG zur Überprüfung des unteren Arbeitsbereichsendes.Das untere Arbeitsbereichsende ist nur dann statistisch abgesichet, wenn EG kleiner als die Konzentration des niedrigsten Standards ist.

Zur Ermittlung der EG aus der Kalibration wird mehrfach mit immer kleineren Standarkonzentrationen kalibriert.

Liegt die berechnete EG im Bereich der niedrigsten Standardkonzentration, wird das Ergebnis als EG genommen.

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Angabe von Analysenergebnissen lt. DIN 32645Angabe von Analysenergebnissen lt. DIN 32645x < NG: nicht nachgewiesen (mit NG), Höchstgehalt EGNG < x < EG: nachgewiesen, nicht quantifizierbarEG < x < BG: quanitifzierbarx > BG: Gehalt mit Konfidenzintervall bzw. Messunsicherheit

Allgemein: x < NG : < NGNG < x < BG: [Wert]x > BG: Wert +/- Fehler

NG und BG müssen für jede Probenart (Matrix) separat ermittelt bzw. angegeben werden und dürfen sich nicht nur auf Standardlösungen beziehen.

Beim Vergleich der NG und BG verschiedener Laboratorien ist es wichtig, wie diese Parameter ermittelt worden sind und auf welche Matrix sich diese beziehen.

Für „worst case“-Betrachtungen von Werten unter der NG (n.n. Werte) kann gemäß DIN 32645 die Erfassungsgrenze als möglicher Höchstgehalt herangezogen werden.

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Angabe von Analysenergebnissen lt. DIN 32645Angabe von Analysenergebnissen lt. DIN 32645x < NG: nicht nachgewiesen (mit NG), Höchstgehalt EGNG < x < EG: nachgewiesen, nicht quantifizierbarEG < x < BG: quanitifzierbarx > BG: Gehalt mit Konfidenzintervall bzw. Messunsicherheit

Allgemein: x < NG: < NGNG < x < BG: [Wert]x > BG: Wert +/- Fehler

NG und BG müssen für jede Probenart (Matrix) separat ermittelt bzw. angegeben werden und dürfen sich nicht nur auf Standardlösungen beziehen.

Beim Vergleich der NG und BG verschiedener Laboratorien ist es wichtig, wie diese Parameter ermittelt worden sind und auf welche Matrix sich diese beziehen.

Für „worst case“-Betrachtungen von Werten unter der NG (n.n. Werte) kann gemäß DIN 32645 die Erfassungsgrenze als möglicher Höchstgehalt herangezogen werden.

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BeispielBeispiel

Bei der Bestimmung von Pb in Trinkwasser mittels ICP-MS wurde eine Kalibrationsgerade von

I[cps] = 75000 x c[ng g-1] (nach Blank Korrektur).

Für den Blank wurden nun folgende Intensitäten gemessen:1520; 1340; 1850; 1250; 1670 cps

Berechnen Sie die NG/EG/BG dieser Messung.