VU 771.119 und 771.314 Validierung von Analysenmethoden.
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VU 771.119 und 771.314
Validierung von AnalysenmethodenValidierung von Analysenmethoden
VU 771.119 und 771.314
GrundlagenGrundlagen
Analytische Ergebnisse haben oft weitreichende Konsequenzen.
Die Untersuchungen müssen demnach mit nachweislich geeigneten Methoden durchgeführt werden.
Die Validierung ist der Nachweis der Gebrauchstauglichkeit.
VU 771.119 und 771.314
Was bedeutet ValidierungWas bedeutet Validierung
Validierung einer Analysenmethode beinhaltet: Festlegung der analytisch/chemischen Anforderungen Bestimmung der Methodenparameter Überprüfung, dass die Methode die Anforderungen erfüllt Angabe der Gültigkeit
EN/IEC 17025: „Eine durch Überprüfung erlangte Bestätigung, dass alle Voraussetzungen für eine beabsichtigte Anwendung erfüllt sind“
„Ein Prozess der feststellt, dass eine Methode geeignet ist“
VU 771.119 und 771.314
Ziel der ValidierungZiel der Validierung
Charakterisierung der Methodenperformance (Kenndaten)
Umfang/Anwendungsbereich und Limitierungen Identifizierung von Faktoren die die Charakteristik der
Methode ändern können (auch Ausmaß der Änderung)
Welchen Analyten kann eine Methode in welcher Matrix in Gegenwart welcher Störungen bestimmen?
Mit welcher Messunsicherheit geschieht das?
VU 771.119 und 771.314
Ziel der ValidierungZiel der Validierung
Charakterisierung der Methodenperformance (Kenndaten)
Umfang/Anwendungsbereich und Limitierungen Identifizierung von Faktoren die die Charakteristik der
Methode ändern können (auch Ausmaß der Änderung)
Welchen Analyten kann eine Methode in welcher Matrix in Gegenwart welcher Störungen bestimmen?
Mit welcher Messunsicherheit geschieht das?
VU 771.119 und 771.314
3 Milestones der ISO/IEC 170253 Milestones der ISO/IEC 17025
Validierung (validation)– Basisvalidierung (für in-house Methoden und nicht normierte
bzw. von der Norm abweichende Verfahren)– Bestätigung (im Falle von über ÖNORM, ISO, EN, DIN etc.
normierten Verfahren)
Rückführbarkeit der Analysenergebnisse (tracebility) Unsicherheit der Analysenergebnisse (uncertainty)
VU 771.119 und 771.314
Wozu?Wozu?
Sicherung der Qualität der Analysenergebnisse (im eigenen Interesse)
Voraussetzung für Akkreditierung Juristisch abgesichert Forderung der Auftraggeber
VU 771.119 und 771.314
Wann?Wann?
Entwicklung einer Methode Änderung einer Methode Wenn Kontrollunterschungen zeigen, daß sich die
Methode verändert hat Wenn eine anerkannte Methode in einer neuen
Umgebung eingearbeitet werden soll.
VU 771.119 und 771.314
ChecklistChecklist
Kenndaten der Analysenmethode (im Wesentlichen durch die Grundkalibrierung abgedeckt)
– Arbeitsbereich / linearer Bereich)– Empfindlichkeit– Selektivität, Spezifität– Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze
Eigenschaften des Analysenresultates– Rückführbarkeit (z.B. auf das Internationale Einheitssystem SI)– Unsicherheit, unter Berücksichtigung von:
• Wiederfindung
• Robustheit
• Wiederholbarkeit
• Reproduzierbarkeit
VU 771.119 und 771.314
ChecklistChecklist
Kenndaten der Analysenmethode (im Wesentlichen durch die Grundkalibrierung abgedeckt)
– Arbeitsbereich / linearer Bereich)– Empfindlichkeit– Selektivität, Spezifität– Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze
Eigenschaften des Analysenresultates– Rückführbarkeit (z.B. auf das Internationale Einheitssystem SI)– Unsicherheit, unter Berücksichtigung von:
• Wiederfindung
• Robustheit
• Wiederholbarkeit
• Reproduzierbarkeit
VU 771.119 und 771.314
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 20 40 60 80 100 120
NWG
BG
Arbeitsbereich
ArbeitsbereichArbeitsbereichWird durch technische und praktische Erwägungen festgelegt und durch die Validierung bestätigt. (Meist bestimt durch den niedrigsten und höchsten Kalibrations Standard)
VU 771.119 und 771.314
Empfindlichkeit (sensitivity)Empfindlichkeit (sensitivity)
Steigung der Kalibrationsgeraden Differenz in der Analytkonzentration, die der kleinsten
detektierbaren Signaldifferenz entspricht
Ein Maß für die Signalauflösung eines Verfahrens.
VU 771.119 und 771.314
Selektivität/SpezifitätSelektivität/Spezifität
Spezifität bedeutet 100% Selektivität
Die IUPAC empfiehlt diesen Begriff nicht zu verwenden, weil praktisch keine Methode spezifisch ist.
Selektivität bedeutet bis zu welchem Ausmaß eine Methode geeignet ist, einen Analyten in einer Matrix ohne Störungen der anderen Komponenten zu bestimmen.
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S E L E K T I V I T Ä T
WägenLC
LC-DAD
LC/GC/CE-ICP-MSNAA
LC-MS-MS-MS
GC-MS-MSGC GC-MS
Photometrie
ICP-AES, ICP-MS, AAS
SelektivitätSelektivität
VU 771.119 und 771.314
RobustheitRobustheit
Beeinflussung der Leistungsfähigkeit bei (unvermeidlich) kleinen Änderungen bei der Durchführung des Analysenverfahrens.
VU 771.119 und 771.314
Nachweisgrenze (limit of detection)Nachweisgrenze (limit of detection)(Entscheidungsgrenze für das Vorhandensein eines Analyten)(Entscheidungsgrenze für das Vorhandensein eines Analyten)
Die Nachweisgrenze stellt den kleinsten Meßwert dar, der mit einer vorgegebenen Sicherheit vom Blindwert zu unterscheiden ist. Besitzt eine Probe genau diesen Gehalt des Analyten, so wird in 50% der Fälle der konkrete Meßwert kleiner als die Nachweisgrenze sein (-Fehler = 50%).
Erhält man bei einer Analyse Meßwerte im Bereich der Nachweisgrenze, kann mit der vorgegebenen Sicherheit (Signifikanz) von z.B. 99% entsprechend einer Unsicherheit von 1% (-Fehler) davon ausgegangen werden, daß der Analyt vorhanden ist.
Blindwert
X0MeßwertXNG
Nachweisgrenze
50 %negativ
50 %positiv
VU 771.119 und 771.314
Die Nachweisgrenze stellt den kleinsten Meßwert dar, der mit einer vorgegebenen Sicherheit vom Blindwert zu unterscheiden ist. Besitzt eine Probe genau diesen Gehalt des Analyten, so wird in 50% der Fälle der konkrete Meßwert kleiner als die Nachweisgrenze sein (-Fehler = 50%).
Erhält man bei einer Analyse Meßwerte im Bereich der Nachweisgrenze, kann mit der vorgegebenen Sicherheit (Signifikanz) von z.B. 99% entsprechend einer Unsicherheit von 1% (-Fehler) davon ausgegangen werden, daß der Analyt vorhanden ist.
Blindwert
X0MeßwertXNG
Nachweisgrenze
50 %negativ
50 %positiv
Vorgegebene Sicherheit3σ = 99.7%
=> NG = 3 x σ BW
Nachweisgrenze (limit of detection)Nachweisgrenze (limit of detection)(Entscheidungsgrenze für das Vorhandensein eines Analyten)(Entscheidungsgrenze für das Vorhandensein eines Analyten)
VU 771.119 und 771.314
ErfassungsgrenzeErfassungsgrenze(kleinste Konzentration eines Analyten, die mit hoher Wahrscheinlichkeit (kleinste Konzentration eines Analyten, die mit hoher Wahrscheinlichkeit nachgewiesen werden kann – Untere Grenze für die Quantifiziernug eines Analyten)nachgewiesen werden kann – Untere Grenze für die Quantifiziernug eines Analyten)
Vorgegebene Sicherheit= 99.7%
=> EG = 2 x NG = 6 x σ BW
Um den -Fehler der Nachweisgrenze zu verringern, wurde die Erfassungsgrenze eingeführt. Sie stellt den Meßwert dar, bei dem der -Fehler gleich dem -Fehler ist. Damit entspricht die Erfassungsgrenze dem 2 fachen der Nachweisgrenze. Unter Zugrundelegung eines -Fehlers von 1% ist der Analyt auch hier, wie bei der Nachweisgrenze, mit einer Sicherheit von 99% nachgewiesen.
Blindwert
X0MeßwertXNG
Nachweisgrenze Erfassungsgrenze
XEG
= ß = 1%
ß-Fehler -Fehler
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Bestimmungsgrenze (limit of determination)Bestimmungsgrenze (limit of determination)(kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem vorgegebenen (kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem vorgegebenen relativen Fehler bestimmt werden kann – Untere Grenze für die Quantifizierung relativen Fehler bestimmt werden kann – Untere Grenze für die Quantifizierung innerhalb eines bestimmten Fehlers)innerhalb eines bestimmten Fehlers)
Die Analysenpräzision sollte über den gesamten Messbereich gleich groß sein. Die relative analytische Unpräzision (VB) nimmt mit sinkender Konzentration zu. Die BG entspricht jener Konzentration, ab der die geforderte Analysenpräzision (zumeist 33.3%) erfüllt ist.
0
20
40
60
80
100
120
140
Konzentration
Rel
. an
alyt
. Un
prä
zisi
on
VB
rel i
n %
33%
XB
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Bestimmungsgrenze (limit of determination)Bestimmungsgrenze (limit of determination)(kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem vorgegebenen (kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem vorgegebenen relativen Fehler bestimmt werden kann – Untere Grenze für die Quantifizierung relativen Fehler bestimmt werden kann – Untere Grenze für die Quantifizierung innerhalb eines bestimmten Fehlers)innerhalb eines bestimmten Fehlers)
Annähernd: BG ≈ 3.33 NG => BG = 10 x σ BW
Im Konzentrationsbereich der Bestimmungsgrenze wird die Anwesenheit des Analyten vorausgesetzt. Über das die Kalibrationsgerade umschliessenden Vertrauensband errechnet sich der Bestimmungsfehler ± VB. VB ist in der Arbeitsbereichsmitte am kleinsten und steigt mit zunehmender Entfernung von der Mitte. Es gilt BG = k* VB, näherungsweise auch BG = k * NG. Die Bestimmungsgrenze bezeichnet den Konzentrationswert, bei dem der relative Fehler erstmals die vorgegebene Schranke der Ergebnisunsicherheit unterschreitet. z.B. k=3 entsprechend 33,3%
f(x)
k * VB
VB
x
VB
BG
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Bestimmung von NG/EG/BG - BlindwertmethodeBestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode
Bestimmung erfolgt über das Blindwertrauschen (Blindwertstatistik)
=> Gültig für alle nicht kalibrierbare Methoden
=> Gute Annäherung für kalibrierbare Methoden
Instrumenteller Blindwert (=> instrumentelle NG) Methodenblindwert (=> NG der Methde)
Lineare Kalibrierfunktion (ohne Blankkorrektur) :
y=kx + d sbl ... Standardabweichung des Blanksignals
yNWG = Ybl + 3 sbl NWG = (yNWG – d)/k
yBG = Ybl + 10 sbl BG = (yBG – d)/k
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Bestimmung von NG/EG/BG - Bestimmung von NG/EG/BG - BlindwertmethodeBlindwertmethode
lineare Kalibration
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
0 2 4 6 8 10 12
Konzentration[ ng g-1]
Inte
nsi
tät
[cp
s]
lineare Kalibration
0
1000
2000
3000
4000
-0.5 0 0.5
Konzentration[ ng g-1]
Inte
nsi
tät
[cp
s]
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Bestimmung von NG/EG/BG - BlindwertmethodeBestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode
lineare Kalibration
0
1000
2000
3000
4000
-0.5 0 0.5
Konzentration[ ng g-1]
Inte
nsi
tät
[cp
s]
BW σ
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Bestimmung von NG/EG/BG - BlindwertmethodeBestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode
lineare Kalibration
0
1000
2000
3000
4000
-0.5 0 0.5
Konzentration[ ng g-1]
Inte
nsi
tät
[cp
s]
BW
3 x σ = NG
σ
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Bestimmung von NG/EG/BG - BlindwertmethodeBestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode
lineare Kalibration
0
1000
2000
3000
4000
-0.5 0 0.5
Konzentration[ ng g-1]
Inte
nsi
tät
[cp
s]
BW
3 x σ = NG
σ
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Bestimmung von NG/EG/BG - BlindwertmethodeBestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode
lineare Kalibration
0
1000
2000
3000
4000
-0.5 0 0.5
Konzentration[ ng g-1]
Inte
nsi
tät
[cp
s]
BW
3 x σ = NG
σ
NG
VU 771.119 und 771.314
Bestimmung von NG/EG/BG - BlindwertmethodeBestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode
lineare Kalibration
0
1000
2000
3000
4000
-0.5 0 0.5
Konzentration[ ng g-1]
Inte
nsi
tät
[cp
s]
BW
3 x σ = NG
σ
NG
6 x σ = EG
VU 771.119 und 771.314
Bestimmung von NG/EG/BG - BlindwertmethodeBestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode
lineare Kalibration
0
1000
2000
3000
4000
-0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Konzentration[ ng g-1]
Inte
nsi
tät
[cp
s]
BW
3 x σ = NG
σ
NG
6 x σ = EG
EG
VU 771.119 und 771.314
Bestimmung von NG/EG/BG - BlindwertmethodeBestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode
lineare Kalibration
0
1000
2000
3000
4000
-0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Konzentration[ ng g-1]
Inte
nsi
tät
[cp
s]
BW
3 x σ = NG
σ
NG
6 x σ = EG
EG
10 x σ = BG
BG
VU 771.119 und 771.314
Bestimmung über die KalibrationsgeradeBestimmung über die KalibrationsgeradeBestimmung erfolgt über die Kalibrationsgerade bei kalibrierbaren Methoden
(z.B. Mittels Software DIN Test©):
Ausreisserkontrolle + Statistik (t-Test...)
Bestimmung der NG/EG/BG über die Vertrauensbänder (Berechnung nach DIN 32645)
Nachteil der Berechnung: – Standards, aus denen die Kalibrationskurve erstellt wurde, müssen eigentlich
dieselbe Probenvorbereitungsprozedur wie die Proben durchlaufen, um einen dem Methodenblank entsprechende NG/BG und EG zu ergeben.
– Standards sollten äquidistant in der Nähe der NG liegen.– Bei nicht-linearer Kalibration: Gewichtung der Punkte
VU 771.119 und 771.314
Bestimmung über die KalibrationsgeradeBestimmung über die Kalibrationsgerade NG/EG/BG eines Verfahrens kann nicht aus einer einmaligen
Kalibrierung ermittelt werden
Bei einmaliger Kalibrierung dient die Berechnung der EG zur Überprüfung des unteren Arbeitsbereichsendes.
Das untere Arbeitsbereichsende ist nur dann statistisch abgesichet, wenn EG kleiner als die Konzentration des niedrigsten Standards ist.
Zur Ermittlung der EG aus der Kalibration wird mehrfach mit immer kleineren Standarkonzentrationen kalibriert.
Liegt die berechnete EG im Bereich der niedrigsten Standardkonzentration, wird das Ergebnis als EG genommen.
VU 771.119 und 771.314
Angabe von Analysenergebnissen lt. DIN Angabe von Analysenergebnissen lt. DIN 3264532645x < NG: nicht nachgewiesen (mit NG), Höchstgehalt EG
NG < x < EG: nachgewiesen, nicht quantifizierbar
EG < x < BG: quanitifzierbar
EG < x < BG: Gehalt mit Konfidenzintervall bzw. Messunsicherheit
NG und BG müssen für jede Probenart (Matrix) separat ermittelt bzw. angegeben werden und dürfen sich nicht nur auf Standardlösungen beziehen.
Beim Vergleich der NG und BG verschiedener Laboratorien ist es wichtig, wie diese Parameter ermittelt worden sind und auf welche Matrix sich diese beziehen.
Für „worst case“-Betrachtungen von Werten unter der NG (n.n. Werte) kann gemäßDIN 32645 die Erfassungsgrenze als möglicher Höchstgehalt herangezogen werden.
VU 771.119 und 771.314
BeispielBeispiel
Bei der Bestimmung von Pb in Trinkwasser mittels ICP-MS wurde eine Kalibrationsgerade von
I[cps] = 75000 x c[ng g-1] (nach Blank Korrektur).
Für den Blank wurden nun folgende Intensitäten gemessen:
1520; 1340; 1850; 1250; 1670 cps
Berechnen Sie die NG/EG/BG dieser Messung.