Vergleich von zwei ELISA-Kits zum Nachweis von Antikörpern gegen LAV/HTLV-III
Transcript of Vergleich von zwei ELISA-Kits zum Nachweis von Antikörpern gegen LAV/HTLV-III
Zbl. Bakt. Hyg. A 264, 196-200 (1987)
Vergleich von zwei ELISA-Kits zum Nachweis von Antikorperngegen LAVIHTLV-III
Useof two ELISA Kits for the Detectionof Antibodies against LAV/HTLV-III
FRANZ X. HEINZ 1, CHRISTIAN KUNZ 1 und NOEL BARRETT2
I Institut fiir Virologie, Universitiit Wien, 1095 Wien, Osterreich2 IMMUNO AG, Wien, Osterreich
Received June 23, 1986 . Accepted August 14, 1986
Summary
Eight hundred sera from a non-risk group and thousand sera from people at risk foracquiring AIDS were tested for the presence of LAV/HTLV-IIIspecific antibodies by ELISAtest kits manufactured by Du Pont and Organon. Western Blot analysis was used as aconfirmatory test. All Western Blot positive sera were also positive in the Du Pont ELISAwhich in addition revealed a very low rate of false positive results (0.44%). In the OrganonELISA negative results were obtained with one positive and one questionable positiveserum, as determined by Western Blot. The possible problem of test sensitivity being too lowhas been taken into account by the manufacturer by changing the calculation of cut-offvalues.
Zusammenfassung
Achthundert Seren aus einer Nichtrisikogruppe sowie tausend Seren aus einer AIDSRisikogruppe wurden mit Hilfe von ELISA-Testkits der Firmen Du Pont und Organon aufdas Vorhandensein von LAV/HTLV-III-spezifischen Antikorpern untersucht. Als Bestatigungstest wurde der Western Blot eingesetzt. Mit dem Du Pont-ELISA wurden aile imWestern Blot positiven Seren als positiv erkannt und gleichzeitig eine sehr niedrige Ratefalsch positiver Ergebnisse (0.44%) erhalten. 1m Organon ELISA wurden ein im WesternBlot positives sowie ein fraglich positives Serum als negativ gewertet. Dem moglichen Problem einer zu geringen Testsensitivitat wurde durch eine geandcrtc Cutoff-Berechnung vonder Herstellerfirma Rechnung getragen.
EinIeitung
Der Erreger des »Acquired Immunodeficiency Syndrome" (AIDS) ist ein Retrovirus,dessen Isolierung erstmals von Barre-Sinoussi et al. (1) beschrieben wurde und je nachForschergruppe als LAV (1), HTLV-III (2) oder ARV (3) bezeichnet wird. Urn diese
ELISA-Kits zur LAVIHTLV-III-Diagnostik 197
unterschiedlichen Namen fur offensichtlich das gleiche Virus zu vereinheitlichen,wurde kiirzlich von Mitgliedern eines Subkommittees der Internationalen Taxonomiekommission fur Viren die Bezeichnung "Human Immunodeficiency Virus"(HIV) vorgeschlagen (4). Obwohl die Isolierung des Virus nicht nur von etwa 50% derseropositiven, sondern auch von seronegativen Personen beschrieben wird (5, 6),kommt dem Nachweis spezifischer Antikorper derzeit iiberragende Bedeutung fur dieDiagnose der Erkrankung und die Identifizierung Infizierter zu (7). Letzteres ist vorallem fur Blutbanken entscheidend, urn weitgehende Sicherheit fur die Verwendungvon Blutkonserven gewiihrleisten zu konnen. Es stehen heute einfache, auch fur dasMassenscreening geeignete Testkits auf der Basis von Enzymimmunoassays zur Verfugung, die von mehreren Herstellern angeboten werden. Obwohl bei diesen Testsgereinigtes Virus als Antigen verwendet wird, kann dennoch eine hundertprozentigeSpezifitat nicht gewiihrleistet werden. Vielmehr muB man auch mit falsch positivenErgebnissen rechnen, hochswahrscheinlich aufgrund von Reaktionen des Patientenserums mit Proteinen aus den fur die Virusvermehrung verwendeten Zellen, zum Beispiel HLA-Antigenen (8). Es ist daher aufgrund der Tragweite des Ergebnisses fur denBetroffenen ein Bestatitungstest erforderlich, wobei derzeit der wesentlich aufwendigere Western Blot den Test der Wahl darstellt. Die Zahl der falsch positiven ELISAErgebnisse hangt von der Qualitiit der Antigenpriiparation sowie von der Berechnungdes Cutoff-Wertes abo Wird dieser zu hoch angesetzt, urn moglichst wenig falsch positive Ergebnisse zu erhalten, kann es jedoch zu falsch negativen Ergebnissen kommen,die vor allem fur Blutbanken unakzeptabel sind. Von einem guten Test ist daherhochste Sensitivitat verbunden mit einer moglichst niedrigen Rate falsch positiverErgebnisse zu fordern. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, daB die Rate falschPositiver und auch falsch Negativer zwischen den Testkits verschiedener Herstellerstark schwanken kann (9, 10, 11). Wir haben in der vorliegenden Studie zwei verschiedene ELISA-Systeme in Kombination mit Western Blot, Immunfluoreszenz sowieeinem ELISA auf der Basis gentechnologisch hergestellter Antigene fur die Analyse vonSeren aus AIDS-Risiko- sowie Nichtrisikogruppen verglichen.
Material und Methoden
Serumproben. Alle Seren wurden vor der Durchfiihrung der Tests bei 56°C 1 Std.inaktiviert, urn das potentielle Infektionsrisiko auszuschlifsen.
ELISA. Die Bestimmung von LAVIHTLV-III-Antikorpern mit Hilfe der ELISA-Testkitsder Firmen Du Pont und Organon bzw. des gentechnologischen Tests der Firma Abbottwurden entsprechend den Angaben der Hersteller durchgefiihrt.
lmmunofluoreszenztest (1FT). Serumproben wurden in einer Verdiinnung von 1:10 inPBS pH 7.4 mit Aceton-fixierten H9-HTLV-IIIB-Zellen auf Objekttragern 1 Std. bei 37°Cin einer feuchten Kammer inkubiert. Danach wurden die Objekttrager in PBS gewasehenund mit einem FITC-konjugierten Anti-Human-IgG 1 Std. bei 3rc inkubiert. Nach demneuerliehen Wasehen erfolgte das Eindeeken mit PBS-Glyzerin (1 Teil PBS + 9 Teile Glyzerin) und die Auswertung mit HiIfe eines Immunfluoreszenzmikroskops. Als Kontrolle wurden die Serumproben aueh mit niehtinfizierten H9-Zellen analysiert.
Western Blot. LAV/HTLV-III wurde in H9/HTLV-IIIB-Zellen vermehrt (2) und durehUltrazentrifugation aus dem Oberstand pelletiert. Die Virusproteine wurden mit Hilfe derSDS-Polyaerylamidgelelektrophorese aufgetrennt und durch Elektroblotting (12) auf Nitrozellulosepapier transferiert. Die so erhaltenen Blots wurden in 0,5 em breite Streifengesehnitten und mit Testserum inkubiert, das 1:200 in Phosphatpuffer, enthaltend 1%Rinderalbumin und 0,3% Triton X-100, verdiinnt wurde. Nach dem Wasehen der Streifen
198 F.X. Heinz, Ch. Kunz und N. Barrett
wurde ein Peroxidase-konjugiertes Anti-Human-IgG im selben Puffer zugegeben, inkubiertund wieder gewaschen. Der Nachweis von gebundener Peroxidase und damit von an einzelne Virusproteine gebundenen spezifischen Anrikorpern erfolgte durch Zugabe vonDiaminobenzidin und HzOz. Als positiv wurde ein Serum bewertet, wenn es zumindest mitzwei virusspezifischen Proteinbanden reagierte, wobei eine davon gp 41 oder gp 120 seinmufSte.
Erge bnisse
Zunachst wurden 800 Seren von Probanden aus einer Niehtrisikogruppe (medizinisehes Hepatitis B-Risikopersonal) im Organon- und im Du Pont ELISA getestet. Wieaus der Tabelle 1 hervorgeht, waren 797 Seren in heiden ELISAs und im Western Blot
Tabelle 1. LAV/HllV-III-Antikorperbestimmung mittels Du Pont-ELISA, Organon-ELISAund Western Blot in 800 Seren aus einer Niehtrisikogruppe
Anzahl der Seren ELISADu Pont Organon
797 neg. neg.2 pas. neg.1 pas. neg.
a Reaktivitar mit den Banden p 24 und p 55
Western Blot
neg.neg.fragl. pas !
negati v. Zwei im Western Blot nega tive Seren reagierten im Du Pon t-ELISA falsehpositiv, wa hrend sie im Organon-ELISA negativ waren. Ein Serum jedoeh, das imWestern Blot mit zwei virusspezifischen Proteinen reagierte (p 24 und p 55 ), wurde nurvorn Du Pont-ELISA, nieht jedoeh vom Organon-ELISA als positiv erkannt. Auch dieImmunfluoreszenz war in diesem Fall negativ. Die zweite Probandengruppe, insgesamt1000 Seren, stamrnre aus AIDS-Risikogruppen (HomosexueJle, Orogensiiehtige, Hamophile, Prostituierte). In dieser Gruppe war aueh ein Kollektiv von 40 im OrganonELISA falseh positiven Seren enthalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammenge-
Tabelle 2. LAVlHTLV-III-Antikorperbestimmung rnittels Du Pont-ELISA, Organon-ELISAund Western Blot in 1000 Seren aus einer Risikogruppe
Anzah l der Seren ELISADu Pont Organon
Western Blot
718 neg. neg. neg.240 pas. pas . pas .
1 pas . neg. neg.1 pas . neg. pas!
35b neg. pas. neg.5b pos. pos, neg.
a Reaktivitat mit den Banden p 24, p 50, p 55 und gp 120b Kollektiv von vierzig im Organon-ELISA falsch positiven Seren
ELISA-Kits zur LAV/HTLV-lII-Diagnostik 199
faBt. 718 Seren waren in allen Tests negati v, wahrend 240 Seren in allen Tests alspositiv erkannt wurden. Der Du Pont-ELISA lieferte zusatzlich ein falsch positivesErgebnis. Ein Serum, das im Western Blot mit vier viru sspezifi schen Proteinen (p 24,50, 55, gp 120 ) reagierte und auch in einem von der Firm a Abbott zur Verfiigunggestellten Test unter Verw endung gentechnologisch herge stellter Antigene eine positiveReaktion zeigte, wurde vom Du Pont-ELISA ebenfalls als po sitiv erkannt, wahrend esvorn Organon-ELISA als negativ bewertet wurde. Von den 40 ausgewahlten, im Organon-ELISA falsch positiven Seren ergaben im Du Pom-ELISA nur 5 ein positives Ergebni s.
Diskussion
Beim Vergleich von Seren aus einer Nichtrisikogruppe zeigte sich, daf sowohl derDu Pont-ELISA als auch der Organon-ELISA eine sehr niedrige Rate falsch positiverErgebnisse liefern. Dies ist umso bcmerkenswerter, als fiir aile Tests Seren eingesetztwurden, die 1 Std. bei 56 °C inaktiviert worden waren. Offensichtlich ergeben jedochunterschiedliche Seren in den beiden Tests eine falsch positive Reaktion, die bei Serenaus der Risikogruppe in hoherem MalSe beobachtet wurde als bei jenen aus der Nichtrisikogruppe. Von 40 ausgewahlten Seren aus der Risikogruppe, die im Organon-Testfalsch positiv reagierten, zeigten im Du Pont-Test nur 5 positive Reaktivitat, wiihrendim Kollektiv der Nichtrisikopersonen zwei im Du Pont-Test falsch positive Seren imOrganon-Test negariv waren. Die Tarsache, daIS auch unterschiedliche Seren als falschpositiv erkannt wurden, weist auf mogliche Unterschiede in der Zusammensetzung derfiir die beiden Testkirs verwendeten Antigenprapararionen hin. Auch muf darauf hingewiesen werden, daB die lnaktivierung der Seren nichr von den Testherstellern ernpfohlen ist und die Rate falsch positiver Ergebnisse bei verschiedenen Testkits unterschiedlich stark beeinflussen kann. Der Organon Test lieferte ein falsch negatives Ergebni s bei einem Serum, das sowohl im Western Blot (Reaktivitat mit den Banden p 24,50, 55 und gp 120) als auch in einem von der Firma Abbott entwickelten ELISA, derauf der Verwendung gentechnologisch hergestellter Antigenpraparationen beruht, alspositiv erkannt wurde. Die Bedeutung des negativen Ergebnisses des Organon ELISAbei einem Serum, das im Western Blot nur mit den Banden p 24 und p 55 reagierte, alsoals fraglich positiv zu bewerten ist , mulS vorliiufig offenbleiben. Einer rnoglichen zugeringen Testsensitivitat wurde von der Firma Organon in der Zwischenzeit Rechnunggetragen, indem zur Erhohung der Empfindlichkeit die Cutoff-Berechnung geandertwurde. Wie stark die Rate der falsch positiven Ergebnisse davon beeinflufst wird,miiBte Gegenstand einer eigenen Untersuchung sein. Obwohl derzeit der Western Blotnach wie vor den Bestatigungstest der Wahl darstellt, scheint die Entwicklung einerneuen Generation von Bestati gun gstests auf der Basis genrechnologisch hergestellterAntigene vielversprechend.
Literatur
1. Barre-Sinoussi, F., J. C. Chermann, F. Rey, M. T. Nugeyre, S. Chamaret, j. Gruest, C.Dauguet, C. Axler-Blin, F. Yezinet-Brun, C. Rouzioux, W. Rozenbaum, and L. Montagnier: [solation of a T-Iymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Science 220 (1983) 868-871
200 F.X. Heinz, Ch. Kunz und N. Barrett
2. Popovic, M., M. G. Sarngadbaran, E. Read, and R. C. Gallo: Detection, isolation andcontinuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDSand pre-AIDS. Science 224 (1984) 497-500
3. Levy, J. A., A. D. Hoffman, S. M. Kramer, J. A. Landis, J. M. Shimabukuro, and 1. S.Oshiro: Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients withAIDS. Science 225 (1984) 840-842
4. Coffin, J., A. Haase, J. A. Levy, 1. Montagnier, S. Oroszlan, N. Teich, H. Temin, K.Toyoshima, H. Varmus, P. Vogt, and R. Weiss: Human immunodeficiency viruses.Science 232 (1986) 697
5. Feorino, P. M., H. W.Jaffe, E. Palmer, T. A. Peterman, D. P. Francis, V. S. Kalyanaraman, R. A. Weinstein, R. 1. Stoneburner, W. J. Alexander, C. Raevsky,J. P. Getchell,D. Warfield, H. W. Haverkos, B. W. Kilbourne,]. K. A. Nicholson, and]. W. Curran:Transfusion-associated aquired immunodeficiency syndrome. Evidence for persistentinfection in blood donors. New Eng!.]. Med. 312 (1985) 1293-1296
6. Gallo, R. c, S. Z. Salahuddin, M. Popovic, G. M. Shearer, M. Kaplan, B. F. Haynes, T.J. Palker, R. Redfield, J. Oleske, B. Safai, G. White, P. Foster, and P. D. Markham:Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patientswith AIDS and at risk for AIDS. Science 224 (1984) 500-503
7. Weiss, S. H., J.]' Goedert, M. G. Sarngadharan, A. Bodner, The AIDS Seroepidemiology Collaborative Working Group, R. C. Gallo and W. A. Blattner: Screening test forHTLV-III (AIDS agent) antibodies: specificity, sensitivity, and applications. ]. Amer.med. Ass. 2533 (1985) 221-225
8. Kidml, R., S. Seidel, and G. Holzberger: HLA DR4 antibodies cause positive HTLV-IIIantibody ELISA results. Lancet I (1985) 1222
9. Mortimer, P. P.,J. V. Parry, and J. Y. Mortimer: Which anti-HTLV-III/LAV assays forscreening and confirmatory testing? Lancett i (1985) 873-877
10. Carlson, J. R., S. H. Hinrichs, N. B. Levy, M. B. Gardner, P. Holland, and N. C.Pedersen: Evaluation of commercial AIDS screening test kits. Lancet i (1985) 1388
11. Kunz, C. und F. X. Heinz: Zum Nachweis von HTLV-III-Antikorpern mittels ELISAund Western Blot. Wien. klin. Wschr. 97 (1985) 829-832
12. Towbin, H., T. Staehelin, and J. Gordon: Electrophoretic transfer of proteins frompolyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. nat.Acad. Sci. (Wash.) 76 (1979) 4350-4354
Dr. Franz X. Heinz, Institut fur Virologie, Kinderspitalgasse 15, A-I095 Wien