Eawag: Das Wasserforschungs-Institut des ETH-Bereichs

Nachweis und Verhalten von Antibiotikaresistenzen im Abwasser und in Behandlungsanlagen

Dr. Helmut Bürgmann

«Keime, Antibiotikaresistenz und Desinfektion in Wassersystemen» - Basel.Area Swiss 7. «Wassertechnologie» Veranstaltung, 24.10.2016 Basel

Konsum, Kontakt

Tierhaltung Aquakultur Bevölkerung Spitäler Pharma-Industrie

Boden

GülleapplikationTrinkwasser

Sickerungund Erosion

Klärwerke

Gewässer

Aquifer

Bewässerung

Konventionelle Kläranlagen als Resistenz Hot Spots Verbreitungswege von Resistenzgenen

Figure modifiied from Kim and Aga , 2007 J. Toxicol. Environ. Health, Pt. B Crit. Rev. vol. 10, and Baran et al., 2011 . Hazard. Mater. Vol. 196 2

Selektionsdruck: Mutationen die Resistenz vermitteln

Lagasse, E., Cancer stem cells with genetic instability: the best vehicle with the best engine for cancer. Gene Ther 2007, 15, (2), 136-142

Konsum, Kontakt

Tierhaltung Aquakultur Bevölkerung Spitäler Pharma-Industrie

Boden

GülleapplikationTrinkwasser

Sickerungund Erosion

Klärwerke

Gewässer

Aquifer

Bewässerung

Kreuzselektion durch andere Verunreinigungen, z.B. Schwermetalle, Biozide

Konventionelle Kläranlagen als Resistenz Hot Spots Verbreitungswege von Resistenzgenen

26.10.2016 3

Selektionsdruck → Mutationen die Resistenz vermitteln

Kläranlagen: hohe Zelldichten, Schadstoffe gute Bedingungen für Selektion, HGT, Resistenzen

Fuller & Braverman, National Science Foundation

= Horizontaler Gentransfer

Untersuchungen an Schweizer ARAs

3

Pharma-Industrie

Birs ProRheno AG Basel

Brusio

Ozonung / UF

Wädenswil

Neugut

Uerikon

Krankenhäuser

Erlach Davos

Bühler

Sévery

Colombier

Romont

Messen

Kernenried

Dürnten

Herisau

Rothenthurm

Niederdorf

Hornussen

Buttisholz

Beprobung Vorfluter

Hochdorf

< 100’000

50’001 - 100’000

10’001 - 50’000

2’001 - 10’000

C C P C P NH4+ C P NH4+ F C P NH4+ N2 C P NH4+ N2 F C P NH4+ N2 F ++

Capacity

Treatment

Catchment

ARA eliminieren Bakterien und resistente Keime…

Untersuchungen an Schweizer ARAs

o Reduktion von (multi)resistenten Bakterien um 90-99% C

zeka

lski

et a

l. 20

12; C

zeka

lski

, unp

ublis

hed

data

26.10.2016 5

N/C resistent

1 2

CFU

[mL-1

]

1e-1

1e+0

1e+1

1e+2

1e+3

1e+4

1e+5

1e+6

1e+7

1e+8

S/T/T resistent

1 2

CFU

[mL-1

]

1e-1

1e+0

1e+1

1e+2

1e+3

1e+4

1e+5

1e+6

1e+7

1e+8

Gesamt LKZ

1 2

CFU

[mL-1

]

1e-1

1e+0

1e+1

1e+2

1e+3

1e+4

1e+5

1e+6

1e+7

1e+8

Zulauf Ablauf Zulauf Ablauf Zulauf Ablauf

Basel Ind.

Brusio

Uerikon

Bühler

Bühler

Brusio

Basel Ind. Buttisholz

Brusio Brusio

Untersuchungen an Schweizer ARAs

Identifikation von resistenten Bakterien im Ablauf:

• ARA-Abläufe entlassen multiresistente Bakterien mit transferierbaren Resistenzgenen in die Umwelt

• Einige dieser Arten sind in der Umwelt überlebensfähig

Norfolxycin/Ceftazidim (N/C): Microbacterium Acetobacter

Sulfonamid/Trimethoprim/Tetrazyklin (S/T/T): Chryseobacterium Stenotrophomonas Afipia (Link Klinik-Trinkwasser?) Escherichia/Shigella Enterococcus Fäkalkeime

opportunistisch pathogen

Harmlose Kommensalen

26.10.2016 6

Auswirkungen auf die Gewässer

Einleitung von Abwasser erhöht die Resistenzhäufigkeit in Fliessgewässern

o Mischung erklärt Abundanz der Resistenzgene flussabwärts nicht ausreichend.

26.10.2016 7

sul1

tet(W)

Auswirkungen auf die Gewässer

Einleitung von Abwasser erhöht die Resistenzhäufigkeit in Fliessgewässern

1 2 3 4

sul1

,tet(W

) / 1

6S G

enko

pien

1e-9

1e-8

1e-7

1e-6

1e-5

1e-4

1e-3

1e-2

1e-1

1e+0

WTP in WTP out upstream downstream

o Mischung erklärt Abundanz der Resistenzgene flussabwärts nicht ausreichend: Relative Abundanz steigt ebenfalls: Selektion auch im Vorfluter?

26.10.2016 8

sul1

tet(W)

Auswirkungen auf die Gewässer

Sufonamidresistenz (abs) Sufonamidresistenz (rel)

Quecksilber (Hg)

Cze

kals

ki e

t al.

2014

, IS

ME

J

Belastung des Sediments im Genfersee

o Abwassereinleitung erhöht die Häufigkeit von Resistenzen im Vorfluter

26.10.2016 9

Zusammenfassung: Antibiotika - Resistenzen in Schweizer ARAs und Oberflächengewässern

o Elimination von Bakterien / Resistenzen in konventionellen ARA > 90%

o Resistenzlast in geklärtem Abwasser dennoch deutlich über natürlichem Hintergrund

o Multiresistente Bakterien: harmlose Kommensalen aber auch potentielle Krankheiterreger sind Resistenzträger

o Abwasser erhöht die Häufigkeit von Resistenzen im Vorfluter in Wasser und Sediment

Was bringen die neuen Technologien zur Mikroschadstoffelimination?

26.10.2016 10

Zusätzliche Reinigungsstufen

II Pulveraktivkohlel (PAK)

I Ozonung

Verfahrenstechnik zur Entfernung von Mikroverunreinigungen

«Strategie MicroPoll»

11

Austritt von freier DNA aus der Zelle

Desinfektion und Resistenzelimination mit Ozon

Zerstörung der Zellwand Zerstörung der DNA

12

O3

Schädigung der Basen (Mutationen)

Doppelstrangbruch

Einzelstrangbrüche

O3

www.thescienceinscifi.files.wordpress.com

o Ozonung eliminiert verbleibende (multiresistente) Bakterien aus gereinigtem Abwasser und zerstört die DNA (mit den Resistenzgenen)

o Während der biologischen Nachbehandlung kommt es zu einer erneuten Besiedelung mit Bakterien, aber mit reduzierter Resistenz

Arbeitshypothesen:

Zusätzliche Reinigungsstufen: Ozonung

O3-Reaktor (QT)

NKB Sandfilter (SF)

CFU

/mL

13

VKB Ablauf ARA

Cze

kals

ki e

t al.

2016

, ES

&T

Prozess und Kinetik? (Modellsystem)

Ozonungsexperimente: Dosisabhängig: Batchversuche, Kontaktzeit = ∞

Abfluss NK (Bakterien, Flocken) 0 - 0.8 gO3 g DOC-1

E. coli + steriler Abfluss Nachklärbecken (SE) 0 – 1.72 gO3 g DOC-1

E. coli + Puffer (kein DOC)

0 - 0.2 mgO3 L-1

O3

Ozonexposition: 𝐶𝐶𝐶𝐶 = ∫ 𝑂𝑂3 𝛿𝛿𝛿𝛿

Kinetik: Quench-flow

14

http://www.bio-logic.info/ WWTP

0.2 mgO3 L-1 0 - 5 s

0.45 gO3 g DOC-1 0 - 2 s

0.57 gO3 g DOC-1

0-2 s

O3 O3

Quantification of ozone-induced damage in bacteria

15

1. Viability (Culturability)

4. Intracellular Gene disruption (quantitative PCR)

0 0.06 0.11 0.17 0.23 0.29 0.34 0.40 0.46 0.57 0.69 0.92 1.72 [gO3 g-1 DOC]

intact

O3 O3

3. DNA damage (Total cell counts TCC)

sul1

16S rRNA

2. Viability (Membrane integrity (ICC))

Green Fluorescence

Red

Flu

ores

cenc

e

E. coli in sterilisiertem geklärtem Abwasser

DOC = 4.27 mg L-1

16

Dosisabhängig

[mg O3 L-1]

[g O3 g DOC-1] 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 1 2 3 4 5

Log(

N/N

0)

contact time = ∞ WWTP

Kultivierbarkeit

Membranintegrität

DNA-Stabilität (TCC)

16S rRNA (qPCR)

sul1 (qPCR)

sul1

16S rRNA

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 1 2 3 4 5

Log(

N/N

0)

contact time = ∞ WWTP

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 1 2 3 4 5

Log(

N/N

0)

WWTP

O3

N0 = 2 × 106 Zellen mL-1

-5

-4

-3

-2

-1

0

0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2

Log(

N/N

0)

CT [mg s L-1]

16S rRNA?

E. coli in sterilisiertem Abwasser (Nachklärung)

2.2 mgO3 L-1 / 0.45 gO3 g DOC-1

17

Viability (Culturability) Viability (Membrane Integrity ICC) sul1 (qPCR) 16S rRNA (qPCR) DNA stability (TCC)

CTlag k

Ozone exposure [mg s L-1] for

inactivation of [mg s L-1] [L mg-1 s-1] 2-log 4-log

Culturability n.d. 32 (±2.1) 0.13 0.28 Membrane integrity 0.22 (± 0.08) 12 (±1.6) 0.61 1.01 sul1 0.76 (±0.49) 2 (±0.4) 2.98 5.15 16S 1.43 (±1.05) 1 (±0.6) 5.50 9.35

Kinetik ICC

sul1

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-4

-3

-2

-1

0

0 1 2 3 4 5

Log

(N/N

0)

contact time = ∞

14.03.2016 Nadine Czekalski 18

Kultivierbarkeit Sulfamethoxazol/Trimetoprim/Tetracyclin Norfloxacin/Ceftatzidim Membranintegrität DNA Stabilität (TCC) 16S rRNA (qPCR), N0 = 6.8 106

sul1 (qPCR), N0 = 3.7 106

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5

Log(

N)

10 µm filtered, contact time = ∞

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5

Log(

N)

Presence of flocs, contact time = ∞

Natürliche Abwasserbakterien (Nachklärung) DOC = 5.0 mg L-1

[mg O3 L-1] [g O3 g DOC-1]

[mg O3 L-1] [g O3 g DOC-1]

O3

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-4

-3

-2

-1

0

0 1 2 3 4 5

Log

(N/N

0)

contact time = ∞

1.E+4

1.E+5

1.E+6

1.E+7

1.E+8

SE OR1 OR2 SF

even

ts [m

l-1]

TCC ICC

Ozonung WWTP Neugut 0.55 gO3 g DOC-1, 20-30 mins, n=3

19

1.E+0

1.E+2

1.E+4

1.E+6

1.E+8

SE OR1 OR2 SF

gene

cop

ies

[mL-

1 ]

16S_457 bp sul1_827 bp

SE

OR1

OR2

SF

1.E+0

1.E+2

1.E+4

1.E+6

1.E+8

SE OR1 OR2 SF

CFU

[mL-

1 ]

Total S/T/T N/C

1.E+4

1.E+5

1.E+6

1.E+7

1.E+8

SE OR1 OR2 SF

even

ts [m

l-1]

TCC ICC

Zusammenfassung: Wirkung der Ozonung auf Antibiotikaresistenz im Abwasser

o Elimination der Antibiotika (Spurenschadstoffe) leistet einen positiven Beitrag o Ozonung wie in der untersuchten Anlage zur Spurenstoffelimination angewandt:

o Tötet resistente Keime weitgehend ab o Eliminiert die DNA / Resistenzgene nicht o Erlaubt überleben einiger Keime in Partikeln / Flocken

o Ermittelte kinetische Parameter bieten Möglichkeit zur gezielten Verbesserung der Entkeimung und DNA-Inaktivierung

o Wiederaufwuchs von resistenten Bakterien in der biologischen Nachbehandlung o Verbesserungen sollten erforscht und entwickelt werden

20

Danke!!

Nadine Czekalski Urs v. Gunten Karin Beck Karolin Schweichler Marjan Veljkovic José Santos S. Imminger F. Hammes E. Salhi H.R. Sigrist J. Fleiner C. McArdell H. Singer C. Stamm ARAs (Neugut)

21

Literatur:

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.est.6b02640