VOM LICHTBRECHUNGSVERHALTEN VON TRADESCANTIA-ZELLEN VOR UND W.~HREND DER KARYOKINESE

yon HANS PFEIFFER (Bremen)

Mit 1 Textfigur

Eingegangen am 2. Mai 1934

1. M e t h o d e n de r l ~ e f r a k t i o n s b e s t i m m u n g . - - Zahlreich sind die rhythmischen Veri~nderungen physikalisch-chemischer Merkmale der Zellen im Verlaufe ihrer Teilung (FAuRI~-FREMIET, S. 139f., HEILBRV~, S. 255f.), aber sicher ist der Wechsel der Lichtbrechung eine der dem Mikroskopiker am li~ n g s t e n b e k a n n t e n Verschiebungen unter den biophysikalischen Konstanten.

Aus den historischen Notizen yon ttEILBRV~ (S. 274) entnehmen wir, dab solche Ver~nderungen u. a. schon yon W. FL~,~NG deutlich erkannt und beschrieben und auf die auch in Fi~rbbarkeitsun~erschieden sich auBernden Differenzen in der Konsistenz des Proto- plasmas zurfickgeffihrt worden sind. Aber auch A. N. LUNDSTRSM und E. S~ASBV~GE~ ebenso wie nach ihnen alle jene Autoren, welche sich um die ErmSglichung der Vitalbeob~ch- tung des Teilungsvorganges bemiiht haben, muBten eigentlich letzten Endes nur immer wieder ungeeignete Lichtbrechungsverh~Itnisse zu tiberwinden suchen, auch wenn sie sich dieses Zieles der Beherrschung der Brechungsindices der protoplasmatischen Struktur nicht immer bewu~t geworden sind (vgl. hierzu auch die grSl]eren karyologischen Zusammenfassungen yon G. TzSCt~L]~, L. W. SEAI~P, A. GVILLIm~MO~D-G. MA~(~NoT-L. PLA~TEFOL U. a.). Manche dieser Forscher, wie G. LEvi (1917) und FI~. VL~S (1921) haben dann auch Erfahrungen der Mteren Cytologen an fixierten Pr~paraten wieder aufgenommen und speziell nach dem Rhythmus im Wechsel des Lichtbrechungsverhaltens gefragt.

Bei so entscheidender Bedeutung des Brechungsindex ffir cytologische und Protoplasmauntersuchungen mul3 eigentlich fiberraschen, wie wenig bislang zu r q u a n t i t a t i v e n E r m i t t l u n g des Faktors getan worden ist.

Freilich hat VL~S zumal ffir den Spezialfall kugelig geformter Zellen eine mehrfach auch yon E. FAVm~-Flz]~IET und H. PFEIFF~R mit wechselnden Zielen erprobte Bestimmungsmethode entwickelt (PFEIFF~ 1931, S. 49, 55f.). Ferner hat PFEIFFER (1931, S. 51f.) neben jenem Verfahren einige a n d e r e M e t h o d e n mitgeteilt, denen ebenso wie jenem die Aufsuchung yon Bildorten und die vergleichende Messung des Abstandes der brechenden Substanz mit~els Bewegung der Mikrometerbewegung gemeinsam ist. In jiingster Zeit hat A. M. FRED:ERIKSE (S. 476f.) eines der dort vorgeschlagenen Verfahren noch erheblich vervollkommnet und mit bestem Erfolge an Plasmodien der Amoeba verrucosa

erprobt. Aber alle die Modifikationen der Bestimmungen gem~tl~ dem Brechungs- verhalten p l a n p a r a l l e l e r Platten (P~EI~Y]~R 1931, S. 51f.), k u g e l i g e r Tropfen (PFEI~ER 1931, S. 53f.) und k a l o t t e n f 5 r m i g e r Fliissigkeitsffillungen

Vom Lichtbreehungsverhalten yon Tradescantia-Zellen vor und wKhrend der Karyokinese 23

(PFEIFFER 1931, S. 86f.) leiden an den engen G r e n z e n i h r e r A n w e n d b a r k e i t und kSnnen beispielsweise fiir die Brechbarkeits/~nderungen w/thrend der Karyo- kinese leider nieht herangezogen werden. Hierffir wiirde sieh allein das in den letzten Jahrzehnten in der Mineralogie und Petrographic gebr/~uchlieh gewordene I m m e r s i o n s v e r f a h r e n eignen, dessen Anwendung ffir cytologisehe Zweeke PFEI]~FER (1928, S. 419f.) sehon auf dem Budapester Kongrel~ ffir experimentelle Zellforsehung und auch sp~ter mehrfach, vorwiegend zum Nachweis yon Ver- kieselungen im Protoplasma lebender Pflanzenzellen, empfohlen hat.

Fiir die meisten cytologischen Aufgaben sind n~mlich die um ein Vielfaehes genaueren Methoden des Physikers (PULFR~e~, S. 103f., 105f., 124f.) durehg~ngig v611ig ungeeignet. Soweit die beispielsweise yon NEED~AM (S. 833f.) besproehenen Arbeiten sieh nicht auf das Verfahren yon VL~S (s. S. 22) griinden, sondern haupts/~ehlieh auf der Benutzung eines der gebriiuchlichen Refraktometer , auf interferometrisehen oderspektroskopisehen Messungen beruhen, handelt es sieh nur um die substantielle Charakterisierung des Eiweil3, des Dotters oder ganzer Eier versehiedener Organismen (NE~D~M, S. 292f., 820), um Be- ziehungen des Breehungsindex zu Diehte, osmotischem Druck (F. E. RIc~, D. L. u usw., um die Unabh~ngigkeit des Breehungswertes des Auges von jenem des Blutes (K.GoI~Do) u. ~. Fragen mehr (I~EEDttAM, S. 814, 820, 1593f.). Dasselbe gilt ftir die yon F. P. FlSC~:R ausgeffihrten Refraktionsbestimmungen an tierisehen und mensehlichen Augen und ffir viele andere Untersuchungen, die daher gar nicht erst aufgez~hlt zu werden brauehen. Fiir die Ermittlung yon Lichtbrechungs/mderungen sich teilender Zellen in vitro oder in situ stehen aber der Anwendung der angefiihrten Messungen der heutigen Physik vorl/~ufig unfiberwind- liehe, in der Organisation der Objekte begrtindete Schwierigkeiten entgegen.

Wenn wir die L5sung unserer Aufgabe durch quantitative Bestimmungen unterbauen wollen, verbleibt also schlie$lich nur die wegen ihrer f a s t unbe - g r e n z t e n A n w e n d b a r k e i t und wegen r e l a t i v e i n f a c h e r D u r e h f f i h r - b a r k e i t trotz der b e s e h r / ~ n k t e n G e n a u i g k e i t der Ergebnisse sieh empfeh- lende Immersionsmethode.

Indem diese in der zusammenfassenden Bearbeitung einiger fiir die Proto- plasmaforsehung bedeutsamen mikrorefraktometrisehen Methoden (PrEIr~E~ 1931, S. 49f., 51f.) seinerzeit noch zurfiekgestellt worden ist, mul~ an dieser Stelle zuerst fiber die A u s g e s t a l t u n g u n d A n p a s s u n g de r M e t h o d e an die Untersuehungsobjekte berichtet werden. Erst dann mSgen - - zugleich als Beleg ffir die Brauehbarkeit des vorgeschlagenen Bestimmungsverfahrens - - die bisherigen E r g e b n i s s e fiber Veranderungen des Liehtbrechungsverm6gens w/ihrend der Karyokinese a u s z u g s w e i s e mitgeteilt und kurz mit rhythmischen Variationen a n d e r e r b i o p h y s i k a l i s c h e r M e r k m a l e der Protoplasten ver- glichen werden, um so vielleieht dureh Aufdeeken symbather Versehiebungen die kolloidphysikalisehe Bedingtheit der Brechungs~nderungen erkennen zu lassen.

2. P r i n z i p der b e i d e n H a u p t m o d i de r I m m e r s i o n s m e t h o d e . - - Die Immersionsmethode zur Ermittlung des Brechungskoeffizienten einer Sub- stanz stellt ein i n d i r e k t e s V e r f a h r e n dar, das au f dem P r i n z i p beruht, durch Einhfillen des zu untersuehenden optischen Mediums (also des 0bjekts) in ein anderes yon gleieher optiseher Diehte die sonst sichtbare Grenze zwischen

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beiden zum Verschwinden zu bringen; sofern dann die Lichtbrechung der e i n e n Komponen te des Systems bekannt ist, so ist dami t - - ganz analog der Schwebe- methode bei der Bes t immung der Massen-Dichte - - der die optisehe Diehte bezeiehnende Brechungsindex des Objekts festgestellt (SPA~GES]3]~G, S. 1; PULFgICH, S. 147f.; PF~IFFER 1928, S. 419f.).

Mit diesem Untersuchungsprinzip ist der Mikroskopiker praktisch eigentlich seit langem vertraut. Sobald ein Medium, das das Licht s t a rker oder schw/~cher als das Objekt brich$, zwischen 1VIiceUen des letzteren eindringt, muB es dessen Strukturen deutlicher heraus- heben, bei gleichem Brechungskoeffizienten aber zum Verschwinden bringen. Auf die ausgedehnte Anwendung dieser Erscheinungen zu optischen i~essungen in der Mineralogie und Petrographie in den letzten Jahrzehn~en (0. MASe~KE, W. L. SOLLER, V. v. E~EN~R, S. EXNEI~, H. A~IBI~ONN, A. BRUN, C. VIOLA, J .L.C. Se~RO]~D~R VAN D~g KOL~, F .E . WRIGHT, A. K6ttLEI~, K. SCttLOSSIVIAOHER, K. SPANGENBERO, A. BENEDELLI-~OttLER u. v. a.)l) ' sei nur nochmals hingewiesen, um daraus einen neuen Berecht.igungsgrund ffir die Ausgestaltung der Methode nunmehr auch zu cytologischen Arbeiten abzuleiten.

Die Kontu ren der Objekte kSnnen aber vollst/~ndig nur verschwinden, wenn Gleiehheit der optisehen Diehte yon Untersuehungsobjekt und Einbet tungs- medium g l e i c h z e i t i g f f i r a l l e W e l l e n l a n g e n erreieht wird: ein fiberaus selten, am Protoplasm~ vielleicht niemals verwirklichter Fall (PuLFRIC~, S. 148). I n allen andern Fallen miissen sieh in der Nahe des kri t isehen Wertes an den R/~ndern der Objekte F a r b e r s c h e i n u n g e n als Zeiehen daffir einstellen, dab fiir bes t immte Teile des Spektrums die Gleiehheit der Brechungsindices noch nicht erreicht ist. Es kSnnen nun sehon solche farbigen Rander mi t Vorteil zur Beur- teilung der Brechungsunterschiede herangezogen werden (]~ 1928, S. 420 u . f . ) . Es deekt sieh nur mi t Er fahrungen der Mineralogen, wenn wir die farbigen Rander am deutlichsten b e i s e h i e f e r B e l e u c h t u n g finden oder z. B. mittels vorgehaltener Finger oder dureh eine Blende zwischen Spiegel und Kondensor des Mikroskops einen Teil des eintretenden Lichtes abfangen (PFEIFFER, a. a. O.).

Schon A. T6PLEI~ hat 1866 ein derartiges Verfahren angegeben, um auch geringste Inhomogenitaten in festen und fliissigen KSrpern nachzuweisen. Indem er an einem Fernrohr oder i~ikroskop an geeigneter St~lle - - z. B. unter dem Kondensor oder in der Austritts- pupille des Mikroskops - - eine geradlinig abgeschnittene Blende einfiihrt, erzeugt er unter Vermeidung yon Dunkelfeldbeleuchtung eine e insei t ig-schiefe Beleuohtung. Ober die praktische Verwer~ung dieser , ,Schl ierenmethode" zur Untersuchung optischer Glaser (E. ABBE), zur Sichtbarmachung der durch Gesohosse erzeugten Schallwellen (E. und L. MAc]t) und fiir weitere ballistische Ziele (C. CI~ANZ, K. BlOCKIeR) kann in der physikalischen Literatur (PuLFI~ICH, S. 147) nachgelesen werden.

Auf dem B e o b a c h t u n g s p r i n z i p d e r e i n s e i t i g - s c h i e f e n B e l e u c h - t u n g beruht aber vor allem S~GM. EXN]~Rs , ,Mikro-Refraetometer" (bei K. Reichert-Wien), ein passend mont ier ter Sehirm fiber dem Okular an jener Stelle der Strahlenaehse, an weleher das mikroskopische Bild zu einem hellen P u n k t zusammensehrumpft , sobald man das Auge vom Mikroskop um die deut- liche Sehweite entfernt. Wenn ffir eine Stelle des mikroskopisehen 0b jek t s

1) Vgl. dazu etwa: E. A. W~3LmNG, Mikroskopische Physiographie der petrographisch wichtigen Mineralien, 5. Aufh, Bd. 1, Stuttgart 1921.

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bekannt ist, nach welchen Seiten hin sie an Dicke (bezogen auf die Rich tung der Mikroskopachse) zunimmt, 1/s sich entscheiden, ob der Brechungskoeffizient des Objekts oder der der Einbet tungssubstanz grSBer istX).

An Schemata nach Fig. l a - - c ha t PFEI~FEg (1928, S. 421) erl/~utert, wie je nach der relativen Breehbarkei t der Untersuehungssubstanz und des Mediums infolge der schiefen Beleuchtung entweder der der abgeblendeten Seite abge- w~ndte oder der ihr zugewandte l ~ n d verdunkel t wird, w/~hrend im krit isehen Bereiche kein Lichtverlust eintritt . Es gilt hierbei die Rege]: B e f i n d e n s i c h d a s B i l d d e r a b g e b l e n d e t e n H/~ l f t e de s G e s i c h t s f e l d e s u n d d i e R a n d v e r d u n k e l u n g a u f d e r e i n a n d e r e n t g e g e n g e s e t z t e n S e i t e

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Der untere Teil der Figuren zeigt Schema ta des S t r ah lenganges fiir ein Objekt yon gr6Berer (a), gleicher (b) und geringerer (c) optischer Dichte als jener des umgebenden Ein- schluBmediums. Auger im mittleren Grenzf~lle (b) gelangt durch die Blende bl unterhalb des Kondensors k nur ein Tell des Lichtes in das Objektiv o, und zwar liegen (vg]. die sche- ma, t i schen Dars t e t lungen des Gesichtsfe ldes fiir die F/~le a - - b - - c im oberen Teile der Figuren) Randverdunkelung des Objekts und abgebildete Blende entweder auf derselben (c) oder auf der entgegengeset~zten Seite (a) und ermOglichen dadurch einen SchluB auf die

gegenseitige Lage der Brechungsindices yon Objekt und Einschlul]medium.

(Fig. l a ) , so b e s i t z t d a s e i n g e s c h l o s s e n e O b j e k t d e n h S h e r e n B r e c h u n g s i n d e x ; beobachte t m a n die Randverdunke lung auf der abgeblen- deten Gesiehtsh/~lfte (Fig. 1 c), so ist das EinschluBmedium st/s l ichtbreehend; nur bei Ubereins t immung beider in der Refrak t ion (Fig. 1 b) wird wegen Fehlens

1) Umgekehrt kann bei Kenntnis der beiden Brechungskoeffizienten in analoger Weise ein sieherer Schlul] auf die Re l i e fbeschaf fenhe i t des Objek ts gezogen werden. - - ~ehrfach modifiziert worden ist die Apparatur durch O. MASO~X~, J .L .C. S c ~ o ~ D ~ VA~ D ~ K o ~ und neuerdings durch F. E. W~IG~T; ~ltere ~hnliche Verfahren mit Messer- schneiden n~ch L. FoucA~nTscher Ar~, fiber die die gr6Beren I-Iandbficher der Physik be- richten, gehen auf C. C~RISTIA~S~N und M. L~ BLANC zurfick.

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jegl icher R a n d v e r d u n k e l u n g die K o n t u r ganz verschwinden (P]rE~FFE~ 1928, S. 419; s. auch PULFnICH, S. 149)1).

Eine grSi~ere Gen~uigkei t als die Aufsuehung yon R a n d v e r d u n k e l u n g e n gew~hrt aber ers t die nuch dem Vorgange yon O. MASCItKE entwicke l te Methode von F. BECK, nach welcher bei z e n t r a l e r B e l e u e h t u n g und mi t t e l s ganz engen St rahlenkegels die b e i d e r V e r i ~ n d e r u n g d e r S e h a r f e i n s t e l l u n g a u f t r e t e n d e n U n t e r s c h i e d e i n d e r L i c h t v e r t e i l u n g zu be iden Sei ten der Grcnze zwischen Objek t und Einschlul~medium beobach te t werden (PuLFRIC~I, S. 149f. ; PFEIFFER 1928, S. 422fi). Wenn m a n n~tmlich naeh erfolgter Seharf- e ins te l lung den Tubus ein wenig heb t (resp. das 0 k u l a r u m 1 oder 2 cm heraus- zieht) , so b le ib t die bei monoehroma t i s chem Lich t beobach te t e Hel l igkei ts- ver te i lung beidersei ts jener Grenze nur bei Ube re ins t immung der Brechungs- indices ffir jene Wellenli~nge dieselbe, ws im Fa l le untersehiedl icher Brechungszahlen auf der e i n e n Scite ein dunkler , auf der ~ n d e r n ein hel ler Streifen (die nach F. BECKE benann te Linie) erscheint . Dabe i gi l t als K r i t e r i u m : b e i m t I e b e n d e s T u b u s w a n d e r t d i e h e l l e L i n i e i m m e r i n d a s h S h e r l i c h t b r e e h e n d e o p t i s c h e M e d i u m (SPA~GENBER(~, S. 2; PULFRIC~, S. 149; vgl. auch PFEI~FER 1928, S. 422f.). Dem Anseheine naeh is t die Hel l igkei t der BEcKEschen Linie den Differenzen der Brechungskoeff iz ienten propor t iona l .

Die Erscheinung ist yon BECKE 1893 und sp~,ter noch vielfach (so von ~FEIFFER 1928, S. 422) dureh geometrisch-optische Betraehtung des Strahlenganges als Brechung an einer Grenzfl~che gedeutet worden. Besonders ffir 0bjekte unter 50 ~ Dieke reicht diese Erkl~rung indessen nieh~ aus; vielmehr sind dann Interferenzerseheinungen an der Grenze der Medien verschiedener optischer Dichte heranzuziehen, wie ausfiihrlich yon SPA~G~B~RG (S. 3f.) an den Maxima und Minima der Interferenzsysteme unter Berficksichtigung auch der St5rungen dureh HA~D~(~sche l~inge gezeigt worden ist. Entgegen C. VIOL~ soll es sieh nicht um FR~sN~Lsche Intefferenzen, sondern um Beugungserseheinungen handeln (Se~E~B]~RO, S. 16f., 18f.). In gleicher Weise wie dutch zunehmende Dieke (SP~aE~- B~(~, S. 12f., 22) werden die Deformationen der Lichtwellen und ihre Intensit~tsuntersehiede auch dureh zunehmende Differenz der Breehungskoeffizienten (S~A~n~BEnr S. 8, 23) versti~rkt. Ubrigens kSnnen unter bestimmten Voraussetzungen am Entstehen der Lichtlinien auSer Interferenz- und Refraktionserseheinungen noeh weitere Ph~nomene beteiligt sein ( S P x ~ B E ~ , S. 24), die aber ~fir die yon uns untersueh~en Verh~ltnisse ohne Bedeutung bleiben.

3. A u s g e s t a l t u n g d e r h n m e r s i o n s m e t h o d e n f f i r P r o t o p l a s m a - u n t e r s u c h u n g e n . - - W e n n es gelingt , ein E insch lu lhned ium von gleicher

I) Wegen der Abh~ingigkei~ der Brechungsindices auch yon der Wellenl~nge der Beobachtungsstrahlen (s. oben) wird man bei den Versuchen eine - - oder vielleicht besser: vergleichsweise mehrere - - der im Handel befindlichen m o no ch r o m a t i s c h e n Lichtquellen benutzen mfissen. Ferner zeigen sich die hier und welter unten aufgesuchten Helligkeits- un~ersehiede ebenso wie die farbigen R~nder (S. 24) deutlich nur bei Benutzung yon Achro- m a t e n , nicht aber bei den sph~irisch auf zwei, chromatisch auf drei Farben korrigierten Apochromaten in Kombination mi~ den dabei iiblichen Kompensa~ionsokularen (PFEIFF~.a 1928, S. 421f.).

Vom Lichtbrechungsverhalten von Tradescantia-Zellen vor und wghrend der Karyokinese 27

optischer Diehte wie das Uutersuchungsobjekt empirisch zu finden 1) und den Brechungsindex des ersteren zu bestimmen, dann ist die gestellte Aufgabe gel6st. Sofern eine grSl3ere Zahl yon Einsehlul~medien bekannter optischer Dichte in sukzessiven Versuchen angewendet werden kann, muB man also durch f o r t - s c h r e i t e n d e s E i n e n g e n au f i m m e r nigher b e n a e h b a r t e W e r t e zum Ziele gelangen (vgl. PVLF~ICH, S. 148). Obgleieh der so erreichbare Genauigkeits- grad - - gleiehgiiltig, ob wir die Randverdunkelung oder die BECKE sehe Liehtlinie als Kri ter ium unserer Untersuchungen w~hlen - - nur gering ist, sind wir ffir die sehr h~ufigen F~lle, dab der Breehungsindex des Protoplasmas den des Glases der Objekttr~ger nicht erreieht, auf diesen unbequemen Weg verwiesen (s. die Begriindung daffir unten).

Wenngleich das Verfahren der sukzessiven Ann~herung an den gesuchten Breehungswert fiir den Cytologen also nicht fiberholt ist, k6nnen wit doch in Fi~llen h S h e r e r B r e e h b a r k e i t - - im allgemeinen also wohl nur in solchen pathologiseher Reffaktionserh5hung - - die Genauigkeit der Werte dureh experi- mentelle V e r ~ n d e r u n g des B r e c h u n g s i n d e x des M e d i u m s u n d d e s s e n n a e h t r ~ g l i c h e B e s t i m m u n g erheblich steigern. Aueh in diesen F~llen sind beide Beobachtungsprinzipien brauchbar. Es gilt festzustellen, wie bei steigenden Breehungswerten der einsehlieI3enden Fliissigkeitsmischung an einer gewissen Stelle Absehattung (resp. Randaufhellung) verschwindet, um bei weiterer Re- fraktionszunahme des Mediums auf die Gegenseite der begrenzenden Kontur des Objekts umzuschlagen2). Die Richtung, in weleher der Breehungsindex des Einschlu~mediums zu ver~ndern ist, um die dem Umschlag vorausgehende ~bereinst immung der optisehen Dichte yon Objekt und Medium zu erhalten, l~I3t sich aus den beiden mitgeteilten R e g e l n (S. 25, 26) entnehmen. Je naehdem die Randverdunkelung und das Bild der abgeblendeten Gesichtshi~lfte auf dieselbe oder die entgegengesetzte Seite fallen resp. die Liehtlinie beim Heben des Tubus vom Objekt in der Richtung des Einsehlul3mediums oder umgekehrt wandert, muB die Lichtbreehung des Mediums also herabgesetzt oder erh6ht werden.

Die n a c h f o l g e n d e B e s t i m m u n g der Liehtbreehung des darin mit dem Objekt iibereinstimmenden Mediums kann wegen der sehr geringen Menge des- selben wohl kaum irgendwann in der sonst iiblichen Weise mittels eines der gebr~uchlichen Refraktometer oder naeh einem yon Physikern angewandten Verfahren erfolgen. Wenn die Lichtbrechung geniigend stark, n~mlich hSher als jene des Glases der erforderlichen hohl geschliffenen Objekttri~ger ist, kann ein vereinfachtes Verfahren benutzt werden, das SPv~NcE (S. 226) im AnschluB an

1) Start die den Bedingungen entsprechende Fltissigkeit aufzusuchen, kann man auch nach dem Vorgange yon F. E. WRm~T nacheinander eine Beleuchtung mit wechselnden WellenlAngen (546, 560, 578, 588 m#) anwenden, doch sind dazu reichere apparative Vorbedingungen erforderlich, als gewShnlich zur Verffigung stehen.

2) S. E x ~ halt die Ermi t t lung des Umschlagpunktes schon bei einer BrechungsAnderung urn eine Einheit der vierten Dezimale des Koeffizienten ffir m6glich. Es daft indessen nicht vergessen werden, dab zu solch hervorragenden Leistungen eine lange, grtindliche (~bung die unerlAl31iche Vorbedingung ist.

28 P f e i f f e r

Mte re Ve r suche v o n PIGOTT, H. L. SMITH u n d EDWARD M. NELSON e ingef f ih r t h a t (vgl. f iber al le diese M e t h o d e n : PFEIFFER 1931, S. 57).

Nachdem die K6hlung des Objekttragers gerade ausgefiillt und mit einem planpar~lle]en Objekttrager bedeckt worden ist, wird das System umgewendet; alsdann wird naeh beliebiger Markierung auf die obere Seite des planparaIlelen 0bjekttragers eingestellt und die Stellung der Mikrometerschraube angemerkt, und nun wird der Tubus soweit gehoben, dab ein ent- ferntes Objekt in die Brennweite des Systems kommt und abgebildet wird, und noehmals die Stellung der Mikrometerschraube abgelesen. Aus der Mikrometerbewegung und zwei andern direkt meBbaren GrSl~en (vgl. PFEIFF~ 1931, S. 58f.) lal3t sich dann bei Kenntnis des Brechungskoeffizienten des Glases der gesuchte Wert ftir das eingeffillte Medium errechnen.

W e n n g l e i c h wi r in j e d e m der b e i d e n u n t e r s c h i e d e n e n F a l l e - - sukzess ive

E i n e n g u n g bis zu d e m g e r a d e p a s s e n d e n M e d i u m resp. e x p e r i m e n t e l l e V e r a n d e r u n g

eines M e d i u m s bis zu r E r k e n n u n g des U m s c h l a g p u n k t e s - - m i t e iner b e s c h e i d e n e n

Z a h l y o n E i n s c h l u B m e d i e n a u s k o m m e n , beda r f de r en A u s w a h l f f i r d i e

c y t o l o g i s c h e A n w e n d u n g doch noch gewisser ]~ber legungen . A u c h w e n n die

n a c h s t l i e g e n d e n V o r a u s s e t z u n g e n , wie gen i igende D u r c h s i c h t i g k e i t , F a r b l o s i g k e i t

a u c h bei l ange re r A u f b e w ~ h r u n g u n d e r schwing l i che r Pre is , y o n v o r n h e r e i n

erff i l l t sind, so sol len doch die M e d i e n dar f ibe r h inaus in s t e t s g le ieher Beschaf fen-

he i r ( zumal in H i n b l i e k auf ihre R e f r ~ k t i o n ) vo r l i egen u n d mSg l i chs t v i e l f a l t i g

m i t e i n a n d e r m i s c h b a r sein. D a es d a r a u f a n k o m m t , die P r o t o p l a s t e n m i t den

F l f i s s igke i t en zu d u r c h t r a n k e n , sche iden d ie v ie l f aeh aueh du rch zu s t a r k e L ich t -

b r e c h u n g a u s g e z e i c h n e t e n R e a g e n z i e n m i n e r a l o g i s c h e r u n d p e t r o g r a p h i s c h e r I m m e r s i o n s b e s t i m m u n g e n z u m e i s t aus. U m die A u f n a h m e f a h i g k e i t de r Ze l len

fi ir die S u b s t ~ n z e n zu ve rbesse rn , e m p f e h l e n sieh in v i e l en F a l l e n V e r d f i n -

T a b e l l e 1

A u s w ~ h l y o n I m m e r s i o n s f l f i s s i g k e i t e n zur E r m i t t l u n g des B r e c h u n g s -

koe f f i z i en t en y o n P r o t o p l a s t e n t ~ 20 o

Methylalkohol CH 3 �9 CK . . . . . . . 1,331 C2H ~

Diathyl~ther C2I_I >O . . . . . . . 1,35~

J~thylalkohol CH a �9 CH 2 �9 OH . . . . . 1,36~ _~thylazetat C2H s �9 CHACO ~ . . . . . 1,373

CH3 i-Propylalkohol CH >CrL �9 OH . . . . 1,381

i-Butylalkohol CHa CH20H 1,396 CH3>Ctt �9 . .

i-Amyl~lkohol CI-I3~(~. c!H . CH~OH 1,40~ CH 3 . . . . . . . 2

6 0 : 4 0 . . . 1,415

Chloroform-~thylalkohol- 65 : 3 5 . . . 1,42~ 7 5 : 2 5 . . . 1,430

Gemisehe: / 8 0 : 2 0 . . . 1,435

L 8 5 : 1 5 . . . 1,440

Chloroform CHC1 a . . . . . . . 1,44~ Tetrachlorkohlenstoff CC14 . . . 1,460 ,,Euparal"-Gemisch (K. Hollborn-

Leipzig) . . . . . . . . . . 1,48 a Toluol C6tt 5 �9 CH 3 . . . . . . . 1,49 e Benzol C6tt 6 . . . . . . . . . 1,501 Perchlor~thylen CHC1 = CC12 . 1,506 Methylbenzoat CH a �9 C6H~CO 2 1,51~ m-Chlorbenzol C6H 5 �9 C1 . . . . 1,527 Benzylalkohol C6H 5 �9 CH20H . . 1.541 Aeidum carbolieum liquefactum 1,550 Anilin (Phenylamin) C6Hs-NH 2 1,586 Sehwefelkohlenstoff CS 2 . . . . 1,628

Veto Liehtbrechungsverh~lten von Tradeseantia-Zellen vor und w~hrend der Karyokinese 29

n u n g e n mit Wasser (n~) ~ 1,33a), Xthylalkohol (n~ 1,361) o.a.1); woil dadurch der Breehungskoeffizient yon jenem der unvermischton Fliissigkeiten abweich~, ist die vorherige I~efraktionsmessung (mittels Refraktometer o. a.) der benutzten Medien nStig und dfirfen die tabellarisch verzeiehneten Brochungswerte nicht ohne Korrektur eingesetzt werden. Wegen der vielen, teilweise schwer miteinander zu vereinenden Wfinsche kann auch die vorgeschlagene A u s w a h l de r I m m e r - s i o n s f l i i s s i g k e i t e n (Tab. 1) noch nieht als vollkommen betrachtet werden. Trotzdem seien aber die Reagenzien, mit deren ttilfe bereits einige brauchbare Ergebnisse erzielt worden sind, mit don Breehungswerten vor der Vermischung angegeben.

4. U n t e r s c h i e d e d e r l ~ e f r a k t i o n w ~ h r e n d des T e i l u n g s a b l a u f e s . - - So betrs wie aus der ausgew~hlten Reihe der Einschlul~medien (Tab. 1) geschlossen werden kSnnte, sind die b i s h e r e r h a l t e n e n L i c h t b r e c h u n g s - u n t e r s c h i e d e der Karyo- und Cytoplasten w~hrend der Teilungsstadien nun jedoch nicht. HSchstens in jenen Fi~llen, in welchen optisch sehr verschieden dichte Objekte zur Untersuchung kommen oder Einflfisse experimenteller Schi~- digungen auf die Lichtbrechung best immt werden sollen, mSchten die weiter a u l ~ e n s t e h e n d e n G l i e d o r der mitgeteilten l~eiho einmal erforderlich werden2).

Als vorl~ufig einziges Beispiel der Differenzen des Brechungsindex seien nur kurz Ergebnisse an S tamina lhaaren yon Tradescantia virginica besprochen, w~hrend fiber Befunde an andern Objekten (einschl. experimentell entbl6Bter Pflanzenzellen und ein- f~cher Gewebekulturen in vitro) bei sp~terer Gelegenheit andernorts berichtet werden mSge. Eine Beschr~nkung der Mittei lungen ~uf l~esultate an jenem klassischen Objekt der Vit~lmikroskopie der sich teilenden Pfl~nzenzelle (vgl. aul~er ~lteren Untersuchungen yon A. N. LvN])sT~5~, E. ST~AS]~U~G~R, 1 ). SXMASSA und z~hlreichen sp~teren Arbeiten vor allem MA~T~.NS, S. 170f., 195fL) ist um so mehr angebracht, als die wesentlichen Ver~n- derungen der Brechungskoeffizienten sieh nach bisherigen Vorversuehen hier ebenso wie bei den ~ndern untersuchten Beispielen bewegen.

Bei den Staminalhaaren yon Tradescantia ist der in den plasmareichen Zellen gelegene, psoudogranul~r strukturierte (oder noch fibrillare ?) R u h e k e r n nut schwach lichtbrechend; die ermittel ten Sch~tzungswerte liegen alle zwischen n~ ~ 1,42 und 1,40. Allerdings vertr~gen die Kerne keine m e c h a n i s c h e n Schi~- d i g u n g e n bei der Pr~parierung, ohne - - auffallenderweise moist unter Aufgeben fast jeglicher Struktur - - an Lichtbrechung zuzunehmen (n~ ~ 1,42--1,44 odor bisweilen noch hSher). Auch das C y t o I ) l ~ s m a , ffir welches in der unbesch~- digten Zelle ein noch etwas niedrigerer Wort (1,38--1,40) als fiir den Kern ge- funden wird, erf~hrt dutch die mechanische Alteration eine Lichtbrechungs- steigerung, so dab es jetzt etwa mit dem Karyoplasma der normalen Ruhezelle fibereinstimmt. Volumon yon Kern und Cytoplasma pflegen dabei gleichzeitig

1) Die Da~en fiber die Misehbarkeit der in der Tabelle verzeichneten Reagentien brauchen hier nicht erst aus tIandbfichern der Chemie wiederholt zu werden.

2) Zu Meclien noeh hSheren Brechungsgrades als jenem des CS 2 k~nn man leieht dureh Aufl6sen yon Sehwefel darin gelangen (bis n~ ~ 1,75), doeh dringen solehe Flfissigkeiten nut schleeht ein.

30 Pfe i f fer

zugunsten des vakuol/~ren Anteils (vielleicht teilweise Neubildung von Vakuolen ?) abzunehmen, und schon bei den leiehteren Seh/~digungen wird die PlasmastrS- mung sistiert.

Bedauerlicherweise sind die fiir die l~efraktionsbestimmung benutzten Zellen und Kerne in den meisten F/~llen ffir die W e i t e r b e o b a c h t u n g verloren. Nur sofern es gelingt, die Einschlul3fliissigkeit dutch Auswasehen griindlieh genug ZU entfernen, k6nnen die Untersuchungen noGh kurze Zeit fortgesetzt werden. Die sp/iteren karyokinetischen Stadien sind also fiberhaupt nur dadureh der Beobaehtung und Refraktionsbestimmung zug/~ngig zu maehen, dal~ sogleich von fortgeschritteneren Phasen ausgegangen wird.

Zu diesem gewiB sehr schwerwiegenden Nachtei l der Bes t immungsmethode (Umst~ndlichkeit, grol3er Materialverbrauch, Langwierigkeit der Bestimmungen) gesellt sich als weiterer der Umstand hinzu, dal3 nicht einmal mit Sicherheit entschieden werden kann, ob nicht schon der angewandte Versuchseingriff der Durchtri~nkung genfigt, die ,,normal" vorhandene Lichtbrechung lange vor ihrer Bestimmung zu erhShen.

~ber die Geschwindigkeit des Ablaufes der Karyokinese daft aus den Ver- suchen ebenfalls nichts gefolgert werden, ist doch seit Untersuchungen yon J. D~MOOR, F. M. ANDREWS, M. MALTAUX, J. MASSART U. a. lgngst bekann~, dal3 die yon uns benutzten und verwandte Medien die mit der Teilung verkniipften Vorg/~nge beschleunigen oder ge- legentlich auch hemmen.

Anseheinend kfindet sigh der K e r n t e i l u n g s b e g i n n dureh eine allerdings sehnell voriibergehende und nur geringe Breehungsabnahme des Karyoplasmas (n~ 1,38 oder gar nur 1,37), an welcher aber das Cytoplasma nicht teilzunehmen braueht, an. Vielmehr sind beide in dieser Zeit einander soweit in der Licht- brechung gen/~hert, daft der leicht aufgequollene Kern night immer mehr deutlieh vom Cytoplasma getrennt erseheint. Durch den yon 1~. C~A~BERS angewandten Eingriff einer V e r l e t z u n g d e r Ze l l e lassen sigh aber auch in diesem Stadium selbst Chromosomen mit ihrer glatten Kontur sichtbar machen, indem letztere dabei - - offenbar unter Abnahme ihres Wassergehaltes in irreversibler Ent- quellung - - an Liehtbreehung stark zunehmen (n~ ~ 1,48--1,50 oder mehr) und gedrungener werden.

I m iibrigen n immt die Lichtbrechung des Karyoplasmas w/~hrend der ganzen P r o p h a s e b is z u r M e t a p h a s e sukzessiv bis zu ~hnlieh hohen Index- werten zu, w/~hrend das Kernvolumen abnimmt und die Fixierungsstabilit/~t in bekannter Weise w/s Erscheint der KGrn anfangs noeh als Gin diehtes Aggreg~t vielfaeh gewundener (und teilweise sigh iibersehneidender und dadureh Granulis vortiiusehender?) F/iden, die in der Lichtbrechung (n~) ~ 1,42--1,43) mit ihrer Zwisehensubstanz nahezu fibereinstimmen (n~ 1,42--1,41 ?), so n immt die Strukturdeutlichkeit des Kernes unter unregelm/~l~iger VergrSberung und oft gut erkennbarer Volumverminderung der Kernmasse zugleiGh mit der LiGht- breehung (n~) ~ 1 ,44--1 ,48--1 ,50. . . ) zu, und nur das Cytoplasma ver/~ndert den Brechungskoeffizienten (1,40--1,41) kauml). In m i t t t e r e n P r o p h a s e s t a d i e n

1) Dal3 sich der Kolloidaufbau des Cytoplasmas aber ebenfalls - - in schwer definier- barer Weise - - i~ndert, folgt wohl aus der Str6mungssis t ierung.

Vom LichtbrechungsvermSgen yon Tradescantia-Zellen vor und w~hrend der KalTokinese 31

des Kernes werden die Chromosomen zu einem dichten Kni~uel geballt, und ihre steigende Lichtbrechungszunahme (n~ ~ 1,48--1,50 und mehr) geht dann mit einer unregelm~l~igen Erweiterung der Zwischenri~ume einher, so dal~ die l~ukleolen, welche schon vorher allms einen breiteren ,,Hof" erhalten haben, nut noch an vereinzelten Stellen mit einer Chromosomensehlinge ver- bunden bleiben. Ob die C h r o m o s o m e n bei der Refraktionszunahme weiterhin ihr Volumen reduzieren, ist in sp~teren Stadien schwer oder vielleieht fiberhaupt nicht mehr zu entscheiden.

In irgendeinem noch nieht genfigend sieher bestimmbaren Stadium - - wahr- scheinlich jedoch schon vor B e g i n n de r T e l o p h a s e - - verlaufen die Vorg~nge, die bis dahin auf eine erhShte Lichtbrechung nebst den bezeiehneten Begleit- erseheinungen gerichtet gewesen sind, umgekehrt. Bringt man Zellen dieses Stadiums erstmalig in die Einschlul~fliissigkeit, so stimmen die riiekschreitenden l%efraktionswerte auch numerisch mit entspreehenden der Prophase gut iiberein. Im einzelnen finden sieh trotzdem im Zusammenhange mit der b e g i n n e n d e n A u s b i l d u n g de r s p i i t e r e n Z e l l w a n d gewisse Abweichungen. Die als ,,Phrag- moplast" gedeutete homogene Struktur ziemlich niedriger Lichtbrechung kann i~hnlich wie ein zur Teilung sich ansehickender Karyoplast dureh preparative Seh~digung einen hSheren Brechungsindex annehmen. Aber auch im normalen Geschehen bildet sieh im Innern jenes Bestandteils eine sti~rker lichtbrechende Masse heraus, welche vielleicht allm/~hlich in kleinere, sp/iter an Zahl abnehmende ,,Tr6pfchen" aufgel6st wird oder etwas unregelmi~Big an immer mehr Stellen eine Herabsetzung der Lichtbrechung erf/~hrt; wahrscheinlich liegen solehe I~este st/~rker lichtbrechender Substanz beiderseits der sparer ausgebildeten Zellwand. Auch die weiteren Ver~nderungen, wie die bi z e n t r i s c h e A n s a m m- l u n g de r C h r o m o s o m e n , das Auftreten der ersten Anastomosen zwischen ihnen usw., verlaufen hinsichtlich der Liehtbrechungs/~nderungen den einlei- tenden Teilungserscheinungen entgegengesetzt. Absichtlich sind hier aber wie ffir alle die sp/~teren Stadien keine der erhaltenen Brechungswerte angegeben worden, weft nur die frtiheren in inverser Folge erhalten werden. Es bleiben augerdem noch einige wenige, aus dem gewohnten l~ahmenherausfallende Werte einzuordnen; vornehmlich beruhen diese wohl auf der mit Fortschreiten des Teilungsprozesses wachsenden Zunahme experimenteller Sehwierigkeiten.

In groBen Ziigen haben jedenfalls die aus Immersionsbeobaehtungen ab- geleiteten Brechungswerte auBer einem anf/inglichen leichten Rtickgang der Refraktion des Kernes (als Zeichen des l~berganges zur Teilung) im g a n z e n e r s t e n A b s c h n i t t d e r a u f e i n a n d e r f o l g e n d e n Vorg/~nge e ine L i c h t . b r e ch u ngs z u n ah m e ergeben, welche mit oder vieUeicht schon vor einsetzender Telophase w i e d e r u m d u r c h e ine V e r m i n d e r u n g d e r R e f r a k t i o n ab- g e 16 s t wird. Wenn wir die mit diesen Ver/inderungen verbundenen Volumwand- lungen zu Fliissigkeitsverschiebungen (Entquellung oder Fltissigkeitsaufnahme) in Beziehung setzen wollen, so scheinen die S t e i g e r u n g e n des B r e c h u n g s - k o e f f i z i e n t e n u n s t e t i g aufzutreten, wie sich bei sorgf/~ltiger Durchsicht der Schilderungen wohl ergibt. Weft sich darin vielleicht ein Zeichen ffir sprunghafte -i~nderungen yon Gr61]e und Art der W a s s e r b i n d u n g der protoplasmatischen

3~ P f e i f f e r

Kol lo ide erkennen l~Bt, sollen diese deswegen b e d e u t s a m e n Eigen t f iml iehke i ten an neuen Ob jek ten noeh wei ter verfolgt werden. A n g e m e r k t sei hier aber schon, dab F~. VL~s an E ie rn nueh einer L i ch tb r e e hungsa bna hme noch fiber das Dias te r - s t ad ium hinaus einen Reff~kt ions~nst ieg im A m p h i a s t e r s t a d i u m gefunden und die Unterseh iede m i t einer Verminderung des Molekulargewichts (viel leieht A b b a u gewisser Kol lo id te i l chen?) zu deuten versuch t hat . Bemerkenswer t b le ib t fi ir die e rha l tenen Ref rak t ionsuntersch iede , dal] noch maneher le i a n d e r e b i o p h y s i k a l i s e h e M e r k m ~ l e der P ro top l a s t e n in ~hnliehem, keineswegs aber in einem ws al ler En twiek lungss t ad ien s te ts para l le len Sinne var i ieren. Hierbe i aber b e k o m m t die b iophys ika l i sehe Ana lyse der Gesehehen w~hrend der Kern- und Zel l te i lung sicher noeh vie l zu tun.

Beispielsweise folgt aus Zentrifugenversuchen L. V. tt~InB~U~NS ahnlich wie aus den mikrurgischen yon R. C~A~BEUS, dal3 die vor Eintrit t in den Teilungsvorgang niedrige V i s k o s i t ~ t in der Prophase st~rk ~nsteigt, sod~nn l~ngere Zeit - - vor allem auch in der ~[etaphase - - absinkt und erst sparer ~llm~hlich erneut whchst. Ferner findet M. H~ULA~T nach schnell voriibergehender Zunahme der W a s s e r p e r m e a b i l i t ~ t in den ersten Pro- phaseabschnitten ein Absinken derselben und in rnitt]eren und sp~teren Stadien einen er- neuten Anstieg vor endgtiltigem Fermeabilit~tsriickgang fiir Wasser, w~hrend nach K. Goz~Do (s. S. 23) an K[ihnereiern die Empfindlichkeit gegen die Einwirkung toxischer Substanzen kurz vor und zu Beginn des Teilungs~bl~ufes erhSht ist (vgl. N~EDxx~.~, S. 1420ff., 1593f.). Dal~ die ges~mte Energetik w~hrend des Teilungsgeschehens umstiirzenden Wandlungen unterliegt, folgt besonders klar aus B. E~aavss~s Bestimmungen des T e m p e r a t u r k o e f f i - z i en t en (Q10 in der Prophase 2,5--1,66, in der An~phase hingegen 1,0--1,22). Bei griind- licherer Behandlung des Gegenstandes miil~ten such im Verlaufe des Teilungsvorganges und zumal in seinen ersten Stadien auftretende Anderungen des o s m o t i s c h e n D ruc ke s (J. Rv~sTuS~) , der C H und der n e g a t i v e n L a d u n g (E. F.~V~-F~]~XET), der Ober- f l ~ c h e n s p a n n u n g (J. S~K, F~. VL~S) usw. Berficksichtigung finden.

Mehr noeh als b isher gew5hnlich i s t indessen bei der sp~teren Verknf ipfung aller soleher Kennze iehen sieh te i lender Zellen auf den jeweil igen Z e i t p u n k t i n n e r h u l b d e s G e s a m t ~ b l a u f e s zu aehten, in welchem die Max ima und Mi- n ima sieh einstel len. Vielleicht lassen sieh dann e inmal die aus dem uns te t igen E i n t r i t t maneher der b iophys ika l i schen ~ n d e r u n g e n gezogenen Schlfisse auf die wechselnde A r t der W a s s e r b i n d u n g noeh mehr fest igen, u m so in den K o m p l e x des Tei lungsgesehehens ana ly t i seh noeh wei ter als b isher vorzudr ingen.

B r e m e n , 29. Apr i l 1934.

Z u s a m m e n f a s s u n g

Die zur t~efraktionsbestimmung an sich tei]enden Zellen ~llein anwendbare Immer - s i o n s m e t h o d e wird n~ch den beiden wichtigsten Beobachtmlgskriterien - - dem Aufsuchen yon R a n d v e r d u n k e l u n g e n oder der BECKEschen L i c h t l i n i e an den Strukturgrenzen - - und in ihrer spez i e l l en A u s g e s t ~ l t u n g ffir die cytologischen Aufgaben besproehen. Die Brauchb~rkeit der Methode unter Benutzung einiger der in einer Ausw~hl zusammengestellten Einschlul~medien folgt unter anderm aus den Befunden ~n Tradescantia, fiir deren Staminal- ha~rzellen vor Einsetzen der Kernteilung eine leichte Abnahme, w~hrend der P r o p h a s e eine s t u f e n w e i s e Zunahme und mit oder wahrscheinlich vor E i n t r i t t der T e l o p h a s e

Vom Lichtbreehungsverhalten yon Tradescantia-Zellen vor und wi~hrend der Karyokinese 33

ein Ri ickgang der ]~efrakt ion zu den Breehungswerten der normalen Ruhezelle erhalten wird. Aus dem Vergleieh mit andern die Teilung begleitenden Veranderungen an den Kern- kolloiden kaun auf Versehiebungen ihres WasserbindungsvermSgens gesehlossen werden, doeh ben0tigen wir dazu noch vieler spezieller Versuchsdaten.

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N a e h s c h r i f t bei der K o r r e k t u r . Leider konnten die inzwisehen bekannt ge- wordenen Untersuchungen yon J. E l l e n h o r n (Experimental-photographisehe Studien der lebenden Zelle, Z. f. Zellf. u. mikr. Anat. 20, 288--309, 1933) nieht mehr bertieksiehtigt werden. Wenigstens einen kurzen Hinweis aber verdient sein Befund, dab an der Trades- cantia-Zelle mechan i sche E ing r i f f e je nach deren St~rke versehiedenartige, gr6Bten- tells auf Koagulation und Syn~rese gerichtete Ver~nderungen hervorrufen, welche fiir die D e m o n s t r a t i o n sons t u n s i c h t b a r e r S t r u k t u r e l e m e n t e wertvolle Dienste leisten.

9. Juli 193L Pf.

Protoplasma. XXII 3