Vorlesung ist unter:

http://bc.biochemtech.uni-halle.de/lehre/molbt/

Quellen:

Dingermann, T.: Gentechnik Biotechnik, Wissenschaftliche Verlagsgemeinschaft mbH Stuttgart

Stryer, L.: Biochemie, Spektrum Verlag

Rehm, H.-J. and Reed, G.: Biotechnology 5a 2nd edition, VCH

Renneberg, R.: Biotechnologie für Einsteiger, Spektrum Verlag

Lottspeich, F. And Engels, J.W.: Bioanalytik, 2. Aufl., Spektrum Verlag

Inhalt der Vorlesung

1. Übersicht: Rekombinante Poteine

in

Therapie

Diagnostik

Prozesskatalyse

Warum werden überwiegend rekombinante Proteine eingesetzt??

2. Historie der Herstellung eines rekombinanten, therapeutischen Proteins am Beispiel eines Antikörper-Proteins

Entstehungsgeschichte von der Grundlagenforschung, über die Entwicklung, die präklinischen und klinischen Studien bis hin zum Verkauf.

3. Das Hauptproblem bei der Herstellung therapeutischer Proteine: Die meisten sind disulfidverbrückt

Möglichkeiten der Expresssion im Periplasma von E. coli

Charakterisierung des Kompartiments „Periplasma“

Wann ist eine Expression im Periplasma sinnvoll?

Wie kommen die Proteine ins Periplasma?

Probleme bei der periplasmatischen Expresssion

Alternativen zum Periplasma: Neue Ansätze um Proteine mit Disulfidbrücken im Cytosol herstellen zu können

4. Probleme und Lösungsstrategien bei der Herstellung rekombinanterProteine

Toxizität des rekominanten Proteins in den Wirtszellen

Proteolyse

Unzureichende Translation und andersartige Codon-Auswahl (codon usage)

Modifikationen

Disulfidverbrückung

Aggregation und inclusion body-Bildung

5. Was sollte man für die rekombinante Expression in Escherichia coliwissen?

Klonierungsmöglichkeiten: Plasmide

Expressionssysteme: löslich, unlöslich, als Fusionsprotein

Promotoren

Expressionsverbesserung

Reinigungsmöglichkeiten des rekombinanten Proteins durch tags und Fusionen

Möglichkeiten zur Verbesserung des Genproduktes durch Mutagenese (Mutagenese-Techniken)

Aktuelle Klonierungstechniken

Übersicht über die derzeit käuflichen aktuellen E. coli-Stämme und Vektoren

(evt. Stammverbesserung)

6. Molekulare Evolution

Wie können Proteine oder Proteindomänen mit vollkommen neuen Eigenschaften hergestellt werden?

DNA shuffling

Phage display

Oberflächen display

Ribosomen display

7. Funktionelle Genklonierung

Wann ist eine funktionelle Genklonierung sinnvoll?Ich möchte den Rezeptor für einen bekannten Liganden identifizieren. Der Rezeptor ist unbekannt, also muss ich das Gen für ein mir unbekanntes Protein suchen.

Two hybrid system

Expressionsklonierung

Klonierung nach Identifizierung des Genproduktes

Homologieklonierungen durch PCR und Hybridisierung

8. Expression in Hefe

Expression in der Hefe Saccharomyces cerevisiae, Vektoren, Promotoren

Probleme bei der Expression in S. cereviseae

Alternative: Expression in methylotrophen Hefen wie Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis,

Hefe-Promotoren

9. Expression in Insektenzellen

Baculovirus-System: Prinzip, Klonierungsstrategien und Promotoren

10. Interferenz-Methoden

RNA-Interferenz als Analyse-Methode und als Möglichkeit eines therapeutischen Ansatzes

11. Transgene Tiere und Pflanzen

Prinzip der Herstellung transgener Tiere und Pflanzen

Nutzung transgener Tiere und Pflanzen für die Gewinnung therapeutischer Proteine

Nutzung transgener Tiere und Pflanzen für die Grundlagenforschung

12. Aktuelle Themen der molekularen Biotechnologie

Hello Dolly – Wie entstand Dolly? Welche Bedeutung hat Dolly für uns?

Ethische Aspekte der Nutzung transgener Tiere und die Relevanz der Transgen-Technik für die Menschen

13. Humane Stammzellen und Nutzung von Embryonen

Medizinische Bedeutung und ethische Aspekte

Blockvorlesung von Dr. Lorenz Mayr von Novartis am 4. / 5. Juni 2007

Montag, 04. 06. 2007:

- Baculovirus-Expression in Insektenzellen

- Transiente Expression in Insektenzellen

- MACS und FACS zur Selektion

- GFP und andere in-vivo Marker

- Regulierbare Expressionssysteme

- Herstellung stabiler Zellinien

- Retrovirale und adenovirale Systeme

Dienstag, 05. 06. 2007:

- Yeast-Two-Hybrid System

- Zelluläre und biochemische Assays

- High-Throughput Screening

- Genomics & Proteomics

- DNA-Chips & Microarrays

- Eigene Arbeiten

Rekominante Proteine

für die

- Prozesskatalyse

- Diagnostik

- Therapie

Industriell relevante Proteine werden in der Regel rekombinant hergestellt, da die Herstellung aus endogenen Quellen in den meisten Fällen viel zu teuer ist.

Aus Dingermann: Gentechnik Biotechnik, Wiss. Verlagsgesellsch. Stuttgart

Rekombinante Proteine in der Prozesskatalyse

Proteasen: Lebensmittelindustrie, Waschmittelindustrie

Amylasen: Lebensmittelindustrie, Waschmittelindustrie, Papierverarbeitung

Lipasen: Waschmittelindustrie

Cellulasen: Waschmittel

Proteasen

Vorkommen: Proteasen kommen in allen Organismen vor

Industrielle Anwendung: Waschmittelindustrie als Fleckenlöser

Lebensmittelindustrie: mit Proteasen angedautes Fleisch ist besonders zart, Rennin oder Chymosin für die Käseherstellung

Bekanntestes Beispiel für den Einsatz von Proteasen in der Lebensmittelindustrie: Chymosin z. B. bei der Käseherstellung

KäseherstellungDie Protease Rennin oder Chymosin stammt aus dem Kuhmagen (früher Labferment).Rennin wird zur Käseherstellung eingesetzt.

Wirtschaftliche Bedeutung

Pro Jahr gibt die Milchindustrie mehr als 100 Mio $ für Chymosin aus.

Prinzip der KäseherstellungKäse wird aus Casein gewonnen.Casein fasst eine Proteinfamilie der Milch zusammen. Pro Liter Milch sind ca. 25 gCasein vorhanden.Proteine der Caseinfamilie besitzen Phosphoserine und sind teilweise glykosyliert.

Caseine bilden Komplexe oder Submicellen. In der Milch sind die Submicellenüber Ca2+-Ionen verbunden. Die Ca2+-Phosphatclusterbilden sich über die Phosphoserinreste und tragen zur Micellenbildungbei. Reifes κ-Casein wird beipH 6.6, dem pH der Milch, spezifisch durch Chymosingespalten. Dadurch wird der hydrophile Teil entfernt. In Gegenwart von Ca2+-Ionenaggregieren die modifizierten Micellen und es entsteht Paracasein. Dies stellt den ersten Schritt bei der Käseherstellung dar.

Aus Dingermann: Gentechnik Biotechnik, Wiss.Verlagsgesellsch. Stuttgart

Herstellung von Chymosin

Chymosin ist eine sezernierte Protease mit Disulfidbrücken.

Seit 1990 existieren durch die FDA genehmigte rekombinante Enzyme für die Käseherstellung.

Derzeit gebräuchliche Verfahren zur rekombinanten Chymosinherstellung:

- Chymosin wird im Cytosol von E. coli produziert. Da Chymosin Disulfidbrücken enthält, fällt es in inclusion bodies aus. Das Protein muss zur nativen, aktiven Konformation renaturiert werden.

- Chymosin wird auch rekombinant durch Sekretion in niedrigen Eukaryonten, wie Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae oder Trichoderma reesei hergestellt. Durch die Sekretion in das oxidierende extrazelluläre Milieu in diesen Wirten kann Chymosin Disulfidbrücken ausbilden und dadurch die native Konformation annehmen.

α-Amylasen

Vorkommen: Säuger, Pflanzen, Mikroorganismen

α-Amylasen hydrolysieren α 1,4 glykosidische Bindungen, also Stärke

Industrielle α-Amylasen kommen meist aus Bacillus amyloliquefaciens, subtilis,stearothermophilus; Aspergillus niger, oryzae

Industrielle Anwendung: Waschmittelindustrie, Lebensmittelindustrie (Fructoseherstellung aus Getreidestärke), Papier- und Textilindustrie

aus: Rehm, H.-J. and Reed, G.: Biotechnology 5a 2nd edition, VCH

α-Amylasen

1. Stärkeverflüssigung

aus: Rehm, H.-J. and Reed, G.: Biotechnology 5a 2nd edition, VCH

2. Textilindustrie

Bei der Verarbeitung von Garn muss ein Reißen der Fäden verhindert werden. Während der Verarbeitung wird das Garn deshalb durch Schutzmaterialien vor Reißen geschützt. Der Prozess heißt sizing. Es werden Materialien aus Stärke, Gelatine oder modifizierten, wasserlöslichen Cellulosen verwendet. Das derzeit billigste Material ist Stärke. Stärke wird nach dem Weben durch α-Amylasen wieder entfernt (desizing). Thermostabile α-Amylasenermöglichen eine Zeitverkürzung des Prozesses.

3. Papierindustrie

Wie bei der Textilverarbeitung wird Stärke auch zum Verfestigen von Papier verwendet. Die Viskosität der Stärke wird durch den Einsatz von α–Amylasen reduziert.

4. Waschmittelindustrie

Alle kohlehydrathaltigen Lebensmittel enthalten Stärke. Deshalb werden Waschmitteln zum Entfernen von Stärkeflecken α-Amylasen zugesetzt. Für Waschen im oberen Temperaturbereich müssen die α-Amylasen auch bei höheren Temperaturen noch aktiv sein. Eine erhöhte Temperatur-Resistenz kann beispielsweise durch Mutagenese erreicht werden. Thermostabile α-Amylasen werden auch für Geschirrspülmittel verwendet.

Beispiele für gentechnisch veränderte α-Amylasen - 1

aus: Rehm, H.-J. and Reed, G.: Biotechnology 5a 2nd edition, VCH

Beispiele für gentechnisch veränderte α-Amylasen - 2

aus: Rehm, H.-J. and Reed, G.: Biotechnology 5a 2nd edition, VCH

Beispiele für Aufgaben der Molekularen Biotechnologie

Identifizierung und/oder Entwicklung neuer, geeigneter Enzyme für den jeweiligen Anwendungsbereich.

Im Fall von α-Amylasen werden beispielsweise oft angestrebt:

- Hohe Thermostabilität

- Unabhängigkeit von Ca2+-Ionen (für ein „Eintopfverfahren bei der Stärkeverflüssigung, da Ca2+-Ionen die anschließenden enzymatischen Reaktionen stören)

- Stabilität bei längerer Lagerung (in Pulverform als Waschmittel, z. B.)

- Etc.

Diese „neuen“ Enzyme können entweder durch screening-Verfahren aus endogenen Quellen oder durch molekularbiologische Ansätze erhalten werden. Bevorzugt werden seit mehreren Jahren die molekularbiologischen Methoden, da sie erfolgsversprechender und inzwischen auch schneller sind.

Lipasen

Natürliches Vorkommen: ubiquitär

Funktion: Hydrolyse von Triglyceriden, Phospholipiden

Lipasen werden hauptsächlich in der Waschmittelindustrie eingesetzt

Die ersten rekombinanten Lipasen wurden 1994 den Waschmitteln zugesetzt. Die Ergebnisse mit Lipasen entsprechen noch lange nicht den Erwartungen. So werden Enzyme mit niedrigen Substratspezifitäten benötig, mit hoher Toleranz gegenüber Detergentien und mit breiten Temperaturoptima. Modifizierte Lipasenwurden inzwischen auch molekularbiologisch hergestellt.

Cellulasen

Natürliches Vorkommen: Pilze (Trichoderma longibrachatum), Bakterien (Bacillus)

Funktion: Hydrolyse von β-1,4 glykosidischen Bindungen

Industrielle Anwendung:

Waschmittelindustrie – als Weichmacher in Weichspülmitteln oder als Fleckenentferner, da amorphe Bestandteile der Cellulose durch Cellulasen abgebaut werden und dadurch die Zugänglichkeit der Textilien für andere Komponenten des Waschmittels erhöht wird.

Textilindustrie - zur Herstellung von stone washed Jeans. Das Vorwaschen der Jeans auf Natursteinen würde die Jeans zu teuer machen. Cellulasen bleichen die Farben genauso gut und billiger aus.

Rekombinante Proteine

Relative Marktanteile rekombinanter Proteine

aus: Rehm, H.-J. and Reed, G.: Biotechnology 5a 2nd edition, VCH

Rekombinante Proteine für die Diagnostik

Blutzuckerbestimmung mittels Glucoseoxidase und Peroxidase

Hormonbestimmung durch Antikörper (Schwangerschaftstests)

Antikörper gegen bestimmte Tumormarker (Tumormarker sind atypisch auftretende Proteine, die für die Diagnostik von Tumorerkrankungen verwendet werden).

Aus Dingermann: Gentechnik Biotechnik, Wiss.Verlagsgesellsch. Stuttgart

Rekombinante Proteine für die Therapie

Wachstumsrate pro Jahr: ca. 20%

Weltweit nimmt der Umsatz an therapeutischen Proteine um ca. 20 % zu.

Übersichtsartikel: Biotechnology 5 b G.D. Wetzel S. 129.

Übernommen von Professor Rolf Werner, Boehringer Ingelheim

Beispiele für einige wichtige therapeutische Proteine

t-PA (tissue-type plasminogen activator)

t-PA katalysiert die Auflösung von Fibringerinnseln nach Herzinfarkten oder Schlaganfällen. Verschiedene Varianten von t-PA (Alteplase, Reteplase, TNK-t-PA) mit verbesserten Halbwertszeiten im Menschen sind auf dem Markt.

Insulin

Bei Insulin-Mangel-Diabetes

Welt-Jahres-Bedarf: 5 – 6 t (ca. 50 Schweine / Diabetiker im Jahr).

Der Bedarf lässt sich mittlerweile nicht mehr durch Schlachttiere decken.

Herstellungsverfahren für rekombinantes Insulin

1. Expression von Proinsulin (Hoechst, Lilly, Novo Nordisk)

2. Fusion mit Tryptophan-Synthetase, Abspaltung mit CNBr, oxidativeFaltung, Spaltung des C-Peptids durch Trypsin

3. Expression der beiden Ketten als Fusionsproteine in getrennten Bakterienstämmen, nach Reinigung: Aufbau des korrekten Insulins durch chemische und enzymatische Nachbehandlung

Schema von Proinsulin

Insulin-Like Growth Factor (IGF)

Bei inhibierter Wundheilung, unzureichender Schilddrüsenfunktion, Knochenerkrankungen und vielen anderen Krankheiten

Fibroblast – Like Growth Factor (FGF)

Behandlung von schlecht heilenden Wunden, angiogene Eigenschaften, wahrscheinlich auch wirksam bei Herz-Kreislauferkrankungen

Nerve Growth Factor und andere Neurotrophine (NGF, NT-3 z.B.)

Potentielle Anwendungsgebiete: bei Alzheimer, peripheren Neuropathien, Parkinson

Problem: Nebeneffekte wie Nekrosen

Bone Morphogenetic Proteins (BMP)

Stimulieren die Knochenbildung, zur Behandlung von langsam heilenden Knochenbrüchen, Implantate

Erythropoetin (EPO)

Stimuliert die Erythropoese, wird bei Anemien eingesetzt

Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF)

Stimuliert die Stammzell-Proliferation, wird nach Chemotherapien eingesetzt

Antiköper für Therapie und Diagnostik

Wird demnächst besprochen

Hämoglobin

Wird als Blutersatz (Plasma-Expander) verwendet

Rekombinantes Hämoglobin (Hb)

α2β2 Tetramer, jede Untereinheit enthält ein Fe2+ haltiges Protoporphyrin IX (Häm).

Lokal unterschiedliche Gaspartialdrücke, allosterische Effektoren und die Kooperativität des Tetramers modulieren die Sauerstoffaffinität des Proteins. Deshalb gab es schon früh Bestrebungen, Hb als Blutersatz zu produzieren.

Transfusion von rekombinantem Hb in Tieren ergab eine gute Sauerstoffversorgung

Stryer, L.: Biochemie, Spektrum Verlag

Nachteile von rekombinantem Hb:

- Freies Hb wirkt leicht immunogen

- Nur in Anwesenheit von 2,3 Diphosphogylcerat (DPG, BPG in englisch) ist Hb alsTetramer stabil. Physiologisch hohe 2.3 DPG-Konzentratione liegen nur in Erythrozyten vor. Deshalb zerfällt freies Hb in α1β1− und α2β2-Dimere, die mit ihren kleinen Molekulargewichten von ca 23 kDa in die Nierentubuli gefiltert werden und dort wegen ihrer hohen Konzentration toxisch wirken.

Die zu niedrige Konzentration von 2,3-DPG im Blut bewirkt auch eine zu hohe Sauerstoffaffinität, das bedeutet die Versorgung des Gewebes mit O2 ist unzureichend.

Stryer, L.: Biochemie, Spektrum Verlag

Ansätze auf molekular-biologischer Ebene um aktives, nicht toxisches Hb zu produzieren

- Herstellung von rekombinan-tem Hb als Fusion, in der die beiden α-Ketten verbunden sind.

- Herstellung von intra- und intermolekular quervernetztemHb

- Konjugiertes Hb an z. B. lösliche Polymere wie Dextranoder PEG

- Verpacktes Hb (Liposomen)

- Herstellung von modifiziertem Hb, dessen Hämbindetasche so modifiziert ist, dass NO reduziert gebunden wird. NO ist wichtig für die Blutdruckregulation

- Quervernetzung von Hb mit Katalase und Superoxiddismutase, damit sich keine reaktiven Sauerstoffspezies bilden können, die ansonsten im Erythrozyten eliminiert werden.

- PHP Hämoglobin: Pyridoxilliertes Hb, Polyoxethylen in Phase III

OVERVIEW A First-In-Class Oxygen Therapeutic Hemopure® [hemoglobin glutamer - 250 (bovine)], or HBOC-201, Biopure's first-in-class product forhuman use, is approved in South Africa for the treatment of adult surgical patients who are acutely anemic and for the purpose of eliminating, reducing or delaying the need for allogenic red blood cell transfusion in these patients. In October 2002, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) accepted for review Biopure's biologic license application (BLA) to market Hemopure in the United States for a similar indication in orthopedic surgical patients. This acceptance is the first time a hemoglobin-based oxygen therapeutic for humanuse has reached this stage in the U.S. regulatory process. On July 30, 2003, the FDA issued Biopurea complete response letter requesting additional information and setting forth all of the agency's questions as of that date. As a prerequisite to further company-sponsored clinical trials in the United States, Biopure is currently addressing the FDA's questions regarding the product’s safety and efficacy and questions arising out of the company’s BLA. As part of this process, the company is conducting FDA-requested animal studies. Biopure is also developing Hemopure for other potential medical applications in trauma andas a cardioprotective agent in ischemic conditions.Mechanism of Action

© 2005 Biopure Corporation · Legal Disclaimers · Webmaster