Vorlesung WS 2007/2008 VAK 02-03-5-AnC2-1 Johannes...

Einführung in die ChromatographieVorlesung WS 2007/2008

VAK 02-03-5-AnC2-1

Johannes Ranke

Einführung in die Chromatographie – p.1/36

Programm

23. 10. 2007 Trennmethoden im Überblick und Geschichte der Chromatographie30. 10. 2007 Thermodynamik der Stofftrennung06. 11. 2007 Stofftransport und intermolekulare Wechselwirkungen13. 11. 2007 Präparative Chromatographie und Dünnschichtchromatographie20. 11. 2007 Kenngrößen für die Säulenchromatographie27. 11. 2007 Gaschromatographie: Probenaufgabe und Trennsäulen04. 12. 2007 Gaschromatographie: Detektoren und Quantifizierung11. 12. 2007 Flüssigkeits-Chromatographie: Trennsäulen und Laufmittel18. 12. 2007 Flüssigkeits-Chromatographie: Gradienten und Detektion08. 01. 2008 Charakterisierung von Analyten in der Chromatographie15. 01. 2008 Ionenchromatographie22. 01. 2008 Gelpermeationschromatographie29. 01. 2008 Trenntechniken für die Probenvorbereitung05. 02. 2008 Beispiele aus Akademie und Praxis


Literatur

J. Silberring et al.Size-exclusion chromatography. In: Chromatography, 6th editionJournal of Chromatography Library, Vol 69AElsevier, Amsterdam (2004).

Polymer LaboratoriesKursunterlagenVarian (2007).

ViskothekKursunterlagenViskothek (2007).

C. F. PooleThe Essence of ChromatographyElsevier, Amsterdam (2003).


Überblick

Allgemeines und Theorie


Überblick

Allgemeines und Theorie

Detektion und Kalibration


Allgemeines zurGel-Permeations-Chromatographie


Definition

Die Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) oderauch Größenausschluss-Chromatographie (englischSize Exclusion Chromatography, SEC) trennt gelösteMoleküle nach ihrem hydrodynamischen Volumenauf.


Definition


Wird mit einem wässrigen Laufmittel gearbeitet, soverwendet man auch häufig den BegriffGelfiltrations-Chromatographie (GFC)


Definition


Wird mit einem wässrigen Laufmittel gearbeitet, soverwendet man auch häufig den BegriffGelfiltrations-Chromatographie (GFC)

Die stationäre Phase besteht im Allgemeinen auseinem hochvernetzten Polymer.


Ziel

Im Unterschied zu den meisten anderenchromatographischen Analysemethoden ist dasHauptziel der GPC zumeist die Charakterisierungder Größenverteilung in einer Mischung anhand derGrößen

Viskosität η


Ziel


Viskosität η

Radius RG, RH


Ziel


Viskosität η

Radius RG, RHMittlere Molmasse MN,MW


Ziel


Viskosität η

Radius RG, RHMittlere Molmasse MN,MW

Aus den Verhältnissen dieser Größen wird aufPolydispersität und Konformation geschlossen.


Anwendungsbereich

Polymer Laboratories


Typische Anwendungen

Charakterisierung von Polymeren:

Polysaccharide




Polysaccharide

Proteine




Polysaccharide

Proteine

Kunststoffe (z.B. PE, PET)




Polysaccharide

Proteine

Kunststoffe (z.B. PE, PET)

Weitere Anwendungen umfassen dieProbenvorbereitung, Entsalzung undphysikochemische Studien.


Aufbau



Trennsäulen

HochvernetztePolymerkügelchen,Partikelgrößen 5 bis15 µm

Satz von SinglePorosity Säulenoder Mixed BedSäulen

Alternativ: monolithi-sche Trennsäulen

Wikipedia


http://de.wikipedia.org/wiki/Bild:GPC-S�ule-ANTEC.jpg

Typische Mobile Phasen

Wässrige Systeme, ev. mit Salz- oderSäurezusatz




Toluol (Polystyrol, Polybutadien,Polydimethylsiloxan)





Tetrahydrofuran (Celluloseacetat,Polymethacrylat, PVC)





Tetrahydrofuran (Celluloseacetat,Polymethacrylat, PVC)

Um die Probe zu lösen, wird teilweise bei erhöhtenTemperaturen gearbeitet.


Geschichte der GPC

40er Trennungen per Größenausschluss mitKohle und Zeoliten

1955 Größenausschlusschromatographie mitStärke

Lindqvist undStorgård

1958 Einführung dextranbasierter Säulen mitdefinierter Porengröße (Sephadex)

Flodin und Porath

1961 Agar als Säulenmaterial Polson1962 Einführung von vernetztem Polyacrylamid

(Biogel P)Hjertén und Mos-bach


Mechanismus

Ausschluss



Mechanismus

Ausschluss

Selektive Permeation



Mechanismus

Ausschluss

Selektive Permeation

Volle Permeation



Weitere Mechanismen

Ionenausschluss

Dissertation Pascal Pfefferkorn 2004


Weitere Mechanismen

Ionenausschluss Adsorption



Weitere Mechanismen

Ionenausschluss Adsorption Größenausschluss



Weitere Mechanismen

Ionenausschluss Adsorption Größenausschluss Abbau



Trennung

Große Moleküle könnennicht in die Poren ein-dringen, und eluierenzuerst.

Kleinen Molekülen stehtein größerer Porenraumzur Verfügung, so dasssie später eluieren.



Detektion und Kalibration in derGel-Permeations-Chromatographie


Typische Detektoren

Brechungsindex (RI)


Typische Detektoren

Brechungsindex (RI)

UV


Typische Detektoren

Brechungsindex (RI)

UV

Viskosität


Typische Detektoren

Brechungsindex (RI)

UV

Viskosität

Lichtstreuung


Einfache Kalibration

KonzentrationsabhängigerDetektor:

RI

UV

Wikipedia


http://de.wikipedia.org/wiki/Bild:Gpccalibration.png

Kalibration mit mehreren Standards

Mirko Weinhold, UFT Bremen



Standards definierter Molekülgröße notwendig

Sigma Aldrich Website


http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Biochemicals/Enzyme_Explorer/Key_Resources/Carbohydrate_Analysis/Carbohydrate_AnalysisIII.html



Verfälschte Resultate für verzweigte Polymere






Kostengünstige Apparatur







Genaue Konzentration ist unkritisch







Genaue Konzentration ist unkritisch

Sehr gute Reproduzierbarkeit



Das Chromatogramm als Histogramm

Für jede Scheibe i kanndie Molekülgröße Mi

aus der Retentionszeit,und die Anzahl derMoleküle Ni aus derSignalhöhe bestimmtwerden.



Die mittlere Molmasse

Zahlenmittel der Molmasse:

MN =

∑

NiMi∑

Ni




MN =

∑

NiMi∑

Ni

Gewichtsmittel der Molmasse:

MW =

∑

NiM2i

∑

NiMi




MN =

∑

NiMi∑

Ni

Gewichtsmittel der Molmasse:

MW =

∑

NiM2i

∑

NiMi

Polydispersität d = MwMN


Beispiele

MW = 200000MN = 200000d = 1

MW = 200000MN = 60000d = 3, 33

Mirko Weinhold


Molekülformen

Dissertation Pascal Pfefferkorn


Kalibrationskurven

Kursunterlagen Viskothek


Intrinsische Viskosität

[η] =ηsp

c

bei unendlicher Verdünnung. Die spezifischeViskosität ηsp der Lösung von Makromolekülen oderPartikeln mit der Konzentration c ist

ηsp =η − η0

η

wobei η0 die Viskosität des Lösungsmittels ist.


Einsteins Viskositätsgesetz

Nach Einstein (1905) gilt folgende Näherung fürharte, sphärische Partikel

ηsp = 2.5 Φ

Φ ist der Volumenanteil der Makromoleküle in derLösung.


Einsteins Viskositätsgesetz

Nach Einstein (1905) gilt folgende Näherung fürharte, sphärische Partikel

ηsp = 2.5 Φ

Φ ist der Volumenanteil der Makromoleküle in derLösung. Daraus folgt

[η] =ηsp

c=2.5

ρ

wenn ρ die Dichte der Partikel in Lösung ist.


Flory-Fox Gleichung

Für zufällig geknäuelte Polymere gilt

M[η] = 63/2Φ0RG

Φ0 ist die Flory-Fox Konstante, und RG derGyrationsradius des Makromoleküls.


Flory-Fox Gleichung

Für zufällig geknäuelte Polymere gilt

M[η] = 63/2Φ0RG

Φ0 ist die Flory-Fox Konstante, und RG derGyrationsradius des Makromoleküls.

Hier kann die Dichte ρ eingesetzt werden:

[η] = 63/2Φ04π

3

3R3G

4πM=1.67

ρ


Universelle Kalibration




Bei bekannter Konzentration und Trennung strengnach Größenausschluss:

Kalibration für das Molekulargewicht unabhängigvom chemischen Typ des Polymers



Bei bekannter Konzentration und Trennung strengnach Größenausschluss:

Kalibration für das Molekulargewicht unabhängigvom chemischen Typ des Polymers

und unabhängig vom Verzweigungsgrad


Lichtstreudetektion

Verdampfungslichtstreuung


Lichtstreudetektion


Kleinwinkelstreuung


Lichtstreudetektion


Kleinwinkelstreuung

Streuung bei 90 °


Winkelabhängigkeit



Dreifachdetektion



Response-Verhalten

RI-Detektor

A = KRIdn

dcc

ViskometerA = KVisc [η] c

Lichtstreuung

A = KLS MW

(

dn

dc

)2

c


Dreifachdetektion

Unter optimalen Bedingungen bekommt man

Absolutes Molekulargewicht


Dreifachdetektion



Verzweigungsgrad


Dreifachdetektion



Verzweigungsgrad

Polydispersität


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