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Dezember 2013

Wasser-, Lebensmittel- und Betriebshygiene

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• Rauch-, Eß- und Trinkverbot

• Äußerste Sauberkeit und Ordnung im Raum und am Arbeitsplatz

• vor Beginn der Arbeit und nach Beendigung der Arbeit Hände desinfizieren

• Schutzkleidung (weißer Arbeitsmantel)

• Arbeitsfläche vor Beginn und nach Beendigung der Arbeit desinfizieren (Wischtechnik!)

• Sachgemäße Entsorgung der kontaminierten Gegenstände

ALLGEMEINE VERHALTENSWEISEN IM MIKROBIOLOGISCHEN LABOR

SACHGEMÄSSE ENTSORGUNG!

OBJEKTTRÄGER(Nur Agarplatten, Plastikpipette, Handschuhe) KEIN GLAS

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Vortexer

Drigalskispatel

Stomacher

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Bunsenbrenner nicht unbeaufsichtigt lassen (nur bei Bedarf anzünden)

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BAKTERIOLOGISCHE WASSERUNTERSUCHUNG

BAKTERIOLOGISCHE WASSERUNTERSUCHUNG1. Anahl koloniebildender Einheiten/ml (KBE/ml)

2. Qualitative Untersuchung auf das Vorhandensein von coliformen Bakterien und E. coli in einer Probenmenge von 100 ml Wasser 2.1.: Ansatz eines Presence-Absence-Tests mit Eijkman-Bouillon 2.2.: Ansatz eines Presence-Absence-Tests mit LMX-Bouillon 2.3.: Ansatz eines Presence-Absence-Tests mit Readycult Coliforms3. Qualitative Untersuchung auf das Vorhandensein von Enterokokken in einer Probenmenge von 100 ml Wasser (Presence/Absence) mit Chromocult-Enterokokken- Bouillon.

4. Quantitative Untersuchung auf das Vorhandensein von E.coli and Coliformen Bakterien in einer Probenmenge von 100 ml Wasser (Membranfiltration) mit CC Agar5. Quantitative Untersuchung auf das Vorhandensein von Enterokokken in einer Probenmenge von 100 ml Wasser (Membranfiltration) mit Kanamycin-Äsculin-Azid-Agar6. Quantitative Untersuchung auf das Vorhandensein von P.aeruginosa in einer Probenmenge von 100 ml Wasser (Membranfiltration) mit Pseudomonas Agar

7. Semiquantitative Untersuchung auf das Vorhandensein von coliformen Bakterien in einer Probenmenge von 100 ml (Most Probable Number, MPN) mit Eijkman-Bouillon

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1. Anzahl koloniebildender Einheiten/ml:

P C A Dextrose0 -1 0 -1

Probenvolumen: 0,1 ml 1 ml 0,1 ml 1 ml

Plate-Count-Agar (PCA), Inkubation: 22°C, 48 h. Caseinpepton-Glucose-Hefeextrakt-Agar (PCA): Hemmstoff- und indikatorfreier Nährboden, zur Bestimmung der Gesamtkeimzahl in Milch, Milchprodukten, Wasser und anderen Materialien.

Dextrose-Agar (D), Inkubation: 37°C, 48 h. Bromthymolblau dient zur Hemmung der Gram-positiven Bakterien, Säurebildung durch Verwertung von Zucker sichtbar durch Farbumschlag des Indikators (orange/gelb).

Angabe der Ergebnisse:KBE/ml bei 22°C ...........KBE/ml bei 37°C (Gesamt/Säurebildner) ..................

INDIKATORWERTE

2. Qualitative Untersuchung auf das Vorhandensein von coliformen Bakterien und E. coli in einer Probenmenge von 100 ml Wasser

2.1.: Ansatz eines Presence-Absence-Tests mit Eijkman-Bouillon100 ml Wasserprobe in 2-fach konzentrierte Lactose-Bouillon mit Gärfänger,

37°C/2d

wenn positiv (Säure- und Gasbildung)Chromocult-Coliform-Agar, frakt. Ausstrich, 37°C/1dblaue - violette Kolonien: E. coli, Indol-positiv, Cytochromoxidase-negativ API 10Erosa - rote Kolonien:coliforme Bakterien, Cytochromoxidase-negativ API 10E

Lactose-Bouillon: Lactoseverwertung wird durch Umschlag von Chlorphenolrot angezeigt, Gasbildung ist im Gärfänger sichtbar.

Angabe der Ergebnisse:Coliforme Bakterien/100 ml (nachweisbar/nicht nachweisbar).....E. coli/100 ml (nachweisbar/nicht nachweisbar)...........................

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100 ml Wasserprobe in 2-fach konzentrierte Lactose-Bouillon mit Gärfänger, 37°C/1-2d

Beurteilung von Säure- und Gasbildung

Lactose-Bouillon: Lactoseverwertung wird durch Umschlag von Chlorphenolrot angezeigt, Gasbildung ist im Gärfänger sichtbar.

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2.2.: Ansatz eines Presence-Absence-Tests mit LMX-Bouillon

100 ml Wasserprobe in 2-fach konzentrierte LMX-Bouillon, 37°C/1d

Beurteilung von Blaufärbung und Fluoreszenz: wenn positiv, weitere Bestätigung

CCA, frakt. Ausstrich, 37°C/1dblaue - violette Kolonien:E. coli, Indol-positiv, Cytochromoxidase-negativ API 10Erosa - rote Kolonien:coliforme Bakterien, Cytochromoxidase-negativ API 10E

Angabe der Ergebnisse: Coliforme Bakterien/100 ml (nachweisbar/nicht nachweisbar) ......................E. coli/100 ml (nachweisbar/nicht nachweisbar) ............................................

100 ml Wasserprobe in 2-fach konzentrierte LMX-Bouillon, 37°C/1d

Fluoreszenz (unter UV LICHT):E.coli

Beurteilung von Grün-Blaufärbung(coliforme Bakterien)

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2.3.: Ansatz eines Presence-Absence-Tests mitReadycult Coliforms

• Ein Blister von Readycult in 100 ml Wasserprobe geben, 37°C/1d

• Beurteilung von Blaufärbung und Fluoreszenz: wenn positiv, weitere Bestätigung • • CCA, frakt. Ausstrich, 37°C/1d• blaue - violette Kolonien:E. coli, Indol-positiv, Cytochromoxidase-negativ API

10E• rosa - rote Kolonien:coliforme Bakterien, Cytochromoxidase-negativ API 10E

• Angabe der Ergebnisse: • Coliforme Bakterien/100 ml (nachweisbar/nicht nachweisbar) ......................• E. coli/100 ml (nachweisbar/nicht nachweisbar) ............................................

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Readycult Coliforms

MEMBRANFILTERVERFAHREN

• Das Membranfilterverfahren ist eine Methode zur mechanischen Anreicherung von Mikroorganismen aus einer beliebigen Menge eines filtrierbaren Untersuchungsmaterials. Dies erlaubt selbst bei minimalem Keimgehalt eine exakte Keimzahlbestimmung.

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Trichter mit Alkohol befeuchten

Abflammen

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mit sterilem Wasser befeuchten

sterilen Filter entnehmen und auflegen

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Wasserprobe filtrieren

Filter ablösen und auf Agar legen

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3. Quantitative Untersuchung auf das Vorhandensein von E.coli and Coliformen Bakterien in einer Probenmenge von 100 ml Wasser (Membranfiltration auf CC Agar)

• je 100 ml Wasser werden durch Membranfilter (0,45 µm) filtriert

• • CCA, 37°C/1d• • rote Kolonien weisen auf die Coliformen hin, violette Kolonien

auf E.coli • • Oxidase Test• blau-violette Kolonien weisen auf die E. coli und rote Kolonien

auf Coliforme hin. Angabe der Ergebnisse:• Coliforme / E.coli ....................

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4. Semiquantitative Untersuchung auf das Vorhandensein von coliformen Bakterien in einer Probenmenge von 100 ml (MPN Test) mit Eijkman-

Bouillon

• 3 x je 10 ml Wasserprobe 3 x je 1 ml Wasserprobe 3 x je 0,1 ml Wasserprobe•

• in Galle-Lactose Bouillon Röhrchen mit Gärfänger pipettieren, 37C°/2d

• • Beurteilung von Säure- und Gasbildung (Gas und

Säurebildung POSITIV) = coliforme Bakterien• Galle-Lactose Bouillon: Galle hemmt grampositive Bakterien

Lactoseverwertung durch Umschlag von Bromthymolblau angezeigt, Gasbildung im Gärfänger sichtbar

Auswertung: 1. 2. 3. KBE/100ml10 ml - - - <3........................

10 ml + - - 3 .......................10 ml + + - 6........................10 ml + + + 20.......................

1 ml + - - 40.......................1 ml + + - 100.......................1 ml + + + 200.......................

0,1 ml + - - 400.......................0,1 ml + + - 1000 ......................0,1 ml + + + >2000.......................

Angabe der Ergebnisse..............................................................................

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5. Qualitative Untersuchung auf das Vorhandensein von Enterokokken in einer Probenmenge von 100 ml Wasser

(Presence/Absence)

• 100 ml Wasser in 2-fach konzentrierte Chromocult-Enterokokken-Bouillon• • 44°C/2d• • Beurteilung von Blaufärbung: wenn positiv, Frakt. Ausstrich auf KANA• • Schwarze Kolonien weisen auf die Enterokokken hin, weitere Bestätigung

mit Katalase-Test• Kanamycin-Äsculin-Azid-Agar: Kanamycin und Azid hemmen die Begleitflora, Äsculin wird von Enterokokken (ß-Glucosidase)

zu Äsculetin hydrolysiert, welches mit Fe3+ einen schwarzen Komplex bildet. Chromocult-Enterokokken Bouillon: 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-ß-D-Glucopyranosid wird durch das Enzym ß-D-Glucosidase abgespalten. Der Farbumschlag der Bouillonnach blau weisen auf die Enterokokken hin.

6. Quantitative Untersuchung auf das Vorhandensein von Enterokokken in einer Probenmenge von 100 ml Wasser

(Membranfiltration)

• je 100 ml Wasser werden durchMembranfilter (0,45 µm) filtriert

• • Agar:Kanamycin-Äsculin-Azid (KANA) ,

44°C/1d. Schwarze Kolonien die Katalase-negativ sind Enterokokken

• Angabe der Ergebnisse:Enterokokken pro 100 ml Wasser:……………………………………

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7. Quantitative Untersuchung auf das Vorhandensein von C. perfringens in einer Probenmenge von 100 ml Wasser

(Membranfiltration)

• je 100 ml Wasser werden durch Membranfilter (0,45 µm) filtriert

• • TSC-Agar, 44°C/1d (anaerob)•

• Schwarze Kolonien weisen auf sulift-reduzierende Clostridien hin. C. perfringens zeigt Fluoreszenz unter der UV-Lampe.

• • Angabe der Ergebnisse: KBE/100ml ...................

8. Quantitative Untersuchung auf das Vorhandensein von P. aeruginosa in einer Probenmenge von 100 ml Wasser

(Membranfiltration)

• je 100 ml Wasser werden durch Membranfilter (0,45 µm) filtriert

• • PSM Agar, 44°C/1d • • grünliche Kolonien weisen auf die P.

aeruginosa hin.• Angabe der Ergebnisse: KBE/100ml ...................

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TSC-Agar

CC-Agar

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LMX-Bouillon

EK-Bouillon

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MIKROBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNG EINER LEBENSMITTELPROBE

Verdünnungsreihe

• Verdünnungsreihen müssen angelegt werden, um bei der späteren Kultivierung auswertbare Koloniezahlen auf dem Agar zu erhalten. In der Praxis ist die dezimale Verdünnung am gebräuchlichsten.

• Aus der zuvor hergestellten Verdünnungsreihe werden genau abgemessene Mengen zur Anzüchtung von Mikroorganismen verwendet. Üblicherweise werden Plattenguß- und Oberflächenverfahren verwendet.

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Verdünnungsreihe

• Zum Anlegen einer Verdünnungsreihe wird die Originalprobe (Verdünnungsstufe 0) 1:10 verdünnt (z.B. 10 g auf 100 ml mit Verdünnungsflüssigkeit auffüllen, Verdünnungsstufe 1).

• Aus dieser Stufe wird 1 ml entnommen und zu 9 ml Verdünnungsflüssigkeit pipettiert (Verdünnungsstufe 2). Nach dem Durchmischen auf dem Vortexer werden weitere Dezimalverdünnungen angelegt.

• Für jede Verdünnungsstufe wird eine frische Pipette verwendet.

• Die Pipetten dürfen nicht in die Flüssigkeit der Verdünnungsstufen getaucht werden.

• Benutzte Pipetten werden in einer Desinfektionslösung abgestellt.

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QUANTITATIVE UNTERSUCHUNG

Homogenisat: 10 g Probe mit 90 ml gepufferter Peptonlösung homogenisieren= H

H= Verdünnung 1:10 = Stufe –1,Verdünnungsreihe: -1, -2, -3, -4, -5

Anzahl KBE: Plattengußverfahren, Plate Count Agar Stufen: -1, -2, -3, -4, -5E. coli, Coliforme: Oberflächenspatelverfahren, CCA, Stufen: -1, -2, -3, -4, -5Enterokokken: Oberflächenspatelverfahren, KANA Stufen: -1, -2, -3, -4, -5Hefen und Schimmelpilze: Oberflächenspatelverfahren,YGC Stufen: -1, -2, -3, -4, -5Staphylococcus aureus: Oberflächenspatelverfahren, BP Stufen: -1, -2, -3, -4, -5B. cereus: Oberflächenspatelverfahren, BC Stufen: -1, -2, -3, -4, -5

YGC-Agar: Chloramphenicol unterdrückt die bakterielle Begleitflora.Baird-Parker-Agar: Tellurit und Lithiumchlorid hemmen die Begleitflora. Eigelb wird durch Lipolyse und Proteolyse abgebaut (Bildung einesDoppelhofes), Tellurit wird zu Tellur reduziert, es kommt zur Schwarzfärbung.Verdächtige Kolonien werden durch positiven Katalase-Test und durchpositiven Koagulase-Test (Latex-Agglutinationstest) bestätigt.

Ergebnis:Anzahl KBE/g..................................................Coliforme/g .....................................................E. coli/g............................................................Hefen/Schimmelpilze/g....................................Enterokokken/g................................................Staphylococcus aureus/g.................................B.cereus/g………..

QUALITATIVE BESTIMMUNG VON SALMONELLEN/10 G

10 g Probe mit 90 ml Rappaport-Vassiliadis-Bouillon (RV) homogenisieren,44°C/5dAusstrich auf SMID-Agar, 37°C/1drote Kolonien, Cytochromoxidase-negativ, salmonellenverdächtigeKolonien, serologische Bestätigung

RV-Bouillon: Malachitgrün und pH 5,5 hemmen andere Darmbakterienund fördern das Wachstum von Salmonellen.

Ergebnis: Salmonellen/10 g (nachweisbar / nicht nachweisbar) ..........

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PERSONAL-, und BETRIEBSHYGIENE

HÄNDEDESINFEKTIONSVERSUCH

• Die Testperson drückt beide Handflächen auf die vorbereitetenAbklatschschwämme, danach reinigt und desinfiziert sie die Hände undwiederholt den Versuch nachdem die Hände luftgetrocknet sind.

• • Abklatschschwämme inkubieren, Auszählen der KBE•• Ergebnis:• Handabklatsch vor Desinfektion: nach Desinfektion:•• PCA, 37°C/1-3 d .......................... ..............................

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BESTIMMUNG DER KEIMZAHL VON OBERFLÄCHEN

• Verschiedene Oberflächen (Arbeitsplatz,Sterilbank, etc.) werden mittels Rodac-Plattenabgeklatscht.

• Inkubation: 37°C, 1d; Auszählen der KBE

• Ergebnis:.....................................................

BESTIMMUNG DER LUFTKEIMZAHL

• 1. Sedimentationstest: Grobe Abschätzung des Keimgehaltes der Luft• Verwendeter Nährboden:• Agarplatte mit geöffnetem Petrischalendeckel 30 min exponieren, Bebrütung 30°C, 3d.

Auszählen der KBE ….Ergebnis:•• 2. Impaktion-Verfahren• Die zu untersuchende Luft wird mittels eines Zentrifugalsammlers angesaugt und durch einen

Spalt auf einen im Inneren des Gerätes befindlichen Nährbodenstreifen aufgeschleudert.• Verwendetes Gerät: Biotest-Luftkeimsammler (Abscheidevolumen 40 l/min)• Nährbodenstreifen in den Zentrifugalsammler einlegen• • Zentrifugalsammler 1 min betreiben , Nährbodenstreifen entnehmen und inkubieren: 30°C,

2d• • KBE KBE/m3 = KBE x 1000 : 40 = ...........................

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BESTIMMUNG DER KEIMZAHL IN FLÜSSIGKEITEN

• Eintauchverfahren

• Schnellverfahren zur orientierenden Abschätzung vonKeimgehalten in Flüssigkeiten, geeignet für dieBetriebskontrolle, AIPC-Slides (Agar Immersion Plating andContact-Slides), erfaßte Probenmenge ist 1 ml

• Einheit öffnen, Objekträger in die Probe tauchen, Überschußabtropfen lassen, Objekträger im Behälter inkubieren: 2d/37°C, Auszählen der KBE

• Ergebnis: Anzahl E. coli/ml ......................

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Hygiene Test Strip

• Die HYRiSE repräsentiert eine Methode zur Oberprüfung der allgemeinenSauberkeit von Oberflächen.

• Der Test zeigt die Sauberkeit von Oberflächen an, indem er organischeVerunreinigungen in Form von Produktrückständen nachweist, die nachunzureichender Reinigung der Oberflächen zurückbleiben.

• Verunreinigungen können zu ungewolltem Wachstum vonMikroorganismen führen.

• Messergebnisse mit dem HYRiSE können schon früh vor möglichenVerunreinigungen auf spezifischen Oberflächen warnen und erlaubensofortige Korrekturmaßnahmen, z. B. das Beseitigen der Lebensmittel- undGetränkerückstände.

• Auf sichtbar sauberen Oberflächen kann der Test die Anwesenheit solcherProduktrückstände entdecken, die für das Auge unsichtbar sind. Er kanndeshalb die versteckte Gefahr für mikrobielles Wachstum anzeigen.

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HY-RiSE

Colour Result

‘The 3-drop strip test’

Wet and Wipe Chemistry

CLEAN DIRTY

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BACTERIA

FOOD

Before cleaning

DIRTY

After cleaning

CLEAN

Einen Tropfen Reagenz AEinen Tropfen Reagenz B(Substratlösung, gelbe Schraubkappe) Einen Tropfen Reagenz C(Enzymlösung, blaue Schraubkappe) Gelbe Farbe der Testzone zeigt einen sauberen Zustand an (Test bestanden). Rosa/purpur bis blauviolette Verfärbung der Testzone zeigt einen schmutzigen Zustand an (Test nicht bestanden).