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WELCOME TO THE WORLD OF PEPTIDES

Einblicke in die Peptidchemie der Bachem

Einblicke in die Peptidchemie

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EINE EINFÜHRUNG IN DIE WELT DER AMINOSÄUREN UND PEPTIDEpräsentiert von Monika Mergler, Ph.D., Bachem AG

Inhaltsverzeichnis

1. Die Geschäftsfelder der Bachem 03

2. Was sind Peptide? 06

3. Was sind Aminosäuren? 07

4. Herstellung von Peptiden 14

5. Analyse von Aminosäuren und Peptiden 24

6. Modifi zierung von Peptiden 26

Abkürzungsverzeichnis

ADS Analytical Datasheet, auch als Certifi cate of Analysis (CofA) bezeichnet

API Active Pharmaceutical Ingredient (Wirkstoff in Medikamenten)

CCD Counter Current Distribution (Gegenstromverteilung, Reinigungsmethode)

DC, TLC Dünnschichtchromatographie (thin layer chromatography, Analysenmethode)

DMF Dimethylformamid (bei der SPPS verwendetes Lösungsmittel)

GMP Good Manufacturing Practice („Gute Herstellungspraxis“, Richtlinien zur Qualitätssi-

cherung bei der Herstellung z.B. von pharmazeutischen Wirkstoffen)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Analysen- und Reinigungsmethode)

MS. Massenspektrometrie (Analysenmethode)

NCE New Chemical Entity (noch nicht zugelassener Wirkstoff)

NMP N-Methylpyrrolidon (bei der SPPS verwendetes Lösungsmittel)

QCRF Quality Control Release Form

RSLC Rapid Separation Liquid Chromatography (Analysenmethode)

SPPS Solid-phase Peptide Synthesis (Festphasen-Peptidsynthese)

Symbole für chemische Elemente

C Kohlenstoff

H Wasserstoff

N Stickstoff

O Sauerstoff

S Schwefel

* Um nicht ständig aktualisieren zu müssen, soll hier auf konkrete Zahlen verzichtet werden. Die aktuellen Angaben (Anzahl Produkte,

Umsatz etc.) kann man z.B. im Geschäftsbericht oder auf der Bachem Homepage www.bachem.com fi nden.

** GMP = Good Manufacturing Practice, Produktionsrichtlinien, die der Qualitätssicherung dienen. An diese Richtlinien muss man sich

bei der Herstellung von Substanzen, die am Menschen eingesetzt werden, halten. Ihre Einhaltung wird regelmässig von spezialisierten

Behörden (wie Swissmedic in der Schweiz, FDA in den USA) kontrolliert. Unter diese Produktionsrichtlinien fallen u.a. Wirkstoffe in

Medikamenten, Bestandteile von Kosmetika und Zusatzstoffe in Lebensmitteln.

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Die Geschäftsfelder der Bachem

Die Kerngeschäfte der Bachem sind die

Vertragsherstellung von pharmazeutischen

Wirkstoffen, insbesondere Generika, und

die Synthese und der Verkauf von Amino-

säurederivaten, Peptiden und Feinchemi-

kalien*. Bachem produziert sowohl Peptide

als auch “kleine Moleküle” (small molecule

APIs) als Wirkstoffe für die Pharmaindustrie

unter GMP-Bedingungen**.

Die Geschäftsfelder der Bachem sind:

Forschungchemikalien

Katalogprodukte, ab Lager

Diese Aminosäurederivate, Peptide und

weitere Chemikalien werden NICHT unter

GMP-Bedingungen hergestellt und dür-

fen nur für Labor- und Forschungszwecke

eingesetzt werden. Sie dürfen nicht am

Menschen verwendet werden.

Custom Synthesis

Auftragssynthesen, exklusiv für einen

Kunden

Meistens Peptide, die in Mengen von

wenigen Milligramm bis zu einigen Gramm

hergestellt werden. Auf Wunsch können die

Produkte unter GMP-Bedingungen synthe-

tisiert werden.

New Chemical Entities (NCEs)

Auftragssynthesen

NCEs sind patentierte Peptide oder or-

ganische Verbindungen, die die Bachem

exklusiv für den Patentinhaber oder einen

Lizenznehmer herstellt. Bei NCEs ist schon

während der ersten Synthese in kleinem

Massstab zu bedenken, dass sich das

Produkt als pharmazeutisch wirksam

erweisen kann und daher in grösseren

Mengen und evtl. unter GMP-Bedingungen

hergestellt werden muss.

Die Bachem strebt eine langfristige Part-

nerschaft mit solchen Kunden an. Diese

geht von anfänglichen Synthesen von NCEs

im Labormassstab über die Herstellung

von grösseren Mengen unter GMP-Bedin-

gungen für die klinischen Phasen bis zur

Herstellung des Wirkstoffs für das zugelas-

sene Medikament im Grossmassstab.

Generic Active Pharmaceutical Ingre-

dients (Generic APIs)

Pharmazeutisch aktive Verbindungen

Substanzen, die als Wirkstoffe in Medika-

menten eingesetzt werden, MÜSSEN unter

GMP-Bedingungen hergestellt werden. Sie

werden in Grossmengen verkauft.

Abb. 1: Das Bachem 360º Geschäftsmodell.

CATALOG PRODUCTS• more than 7500 products available online• peptides, amino acids, inhibitors, substrates• fast & easy ordering @ shop.bachem.com• bulk quantities according to your needs• excellent customer and technical support

CUSTOM SYNTHESIS• from discovery stages to early clinical candidates• strong focus on quality and timely execution• development of synthetic routes for scale up• best industry practice• highly motivated and experienced team

NCEs• process development, optimization and validation• comprehensive analytical services• supply of cGMP material for all clinical phases• sterile fi ll & fi nish for clinical trials (Clinalfa®) • cGMP-manufacturing of APIs for commercial supply

Research

Dev

elop

men

tContract

Manufacturing

Comm

erci

al

Sup

ply

GENERIC APIs• peptide and small molecule generics• supply of commercial quantities• reputation for sustained quality & supply• high-demand APIs available from stock• close and long term partnerships


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Generic Active Pharmaceutical Ingredients

(Generic APIs)

Generika sind Wirkstoffe bzw. Medikamen-

te, deren Patentschutz abgelaufen ist.

Medikament = „formulierter“ Wirkstoff:

Je nach Art der Verabreichung (als Tablette,

als Injektion etc.) werden diverse nicht-ak-

tive Hilfsstoffe zum eigentlichen Wirkstoff

gemischt. Dieser Prozess wird als Formulie-

rung bezeichnet, er kann unabhängig vom

Wirkstoffpatent geschützt werden. Durch

geeignete Formulierung kann z.B. erreicht

werden, dass der Wirkstoff nur langsam

freigesetzt wird (Depotformulierungen), als

Nasenspray angewendet oder über die Haut

aufgenommen wird. Die Entwicklung und

Patentierung neuer Formulierungen von

generischen Wirkstoffen bietet den Wirk-

stoffherstellern gute, langfristige Absatz-

möglichkeiten.

Die Entdeckung weiterer pharmakologi-

scher Aktivitäten kann zu zusätzlichen

Indikationen für ein Generikum führen und

damit den Bedarf an Wirkstoff erhöhen.

Auch in einem solchen Fall können Patente

(Anwendungspatente) erteilt werden.

Generika werden auch zur Diagnose von

Krankheiten (d.h. als Diagnostika) ein-

gesetzt. Ein weiterer Markt mit grossem

Potential ist die Verwendung von Generika

in der Veterinärmedizin.

Wegen der immensen Bedeutung der APIs

für den Umsatz der Bachem wird das Ange-

bot ständig angepasst.

Der Patentschutz eines Wirkstoffs läuft

meistens nach 18 Jahren aus. Ist ein pepti-

discher Wirkstoff für die Bachem von Inte-

resse, muss die Firma schon Jahre vorher

mit der Syntheseentwicklung beginnen. Ein

Verkauf des Peptids in kleinen Mengen für

Forschungs- und Entwicklungszwecke ist

schon vor Ablauf des Patents möglich (Bolar

Exemption). Einige peptidische APIs der

Bachem und ihre Indikation sind in

Tabelle 1 gelistet.

Die Strukturen von Calcitonin, Glucagon,

Gonadorelin (GnRH oder LHRH), und Sec-

retin entsprechen denen der natürlichen,

körpereigenen Peptidhormone, die anderen

in der Tabelle aufgeführten Produkte sind

modifi zierte natürliche Peptide. Durch

Veränderungen in der Struktur werden sie

im Organismus langsamer abgebaut als

körpereigene Peptide.

Triptorelin wird in zwei Salzformen angebo-

ten, Acetat und Pamoat. Das Pamoat wird

langsamer freigesetzt und daher in Depot-

formulierungen verwendet.

Die von der Bachem angebotenen small mo-

lecule APIs werden von unserer Zweignie-

derlassung in Vionnaz hergestellt (ausser

Antazolin). Beispiele dafür sind Propofol,

das zur Einleitung einer Allgemein-

anästhesie oder Sedierung von beatmeten

Erwachsenen während der Intensivbehand-

lung verwendet wird, oder Zonisamid als

Zusatztherapeutikum bei partiellen Epi-

lepsien. Interessenten können sich über die

angebotenen peptidischen und nicht-pepti-

dischen Generic APIs auf der Homepage der

Bachem (www.bachem.com) informieren,

unseren Generikakatalog herunterladen

und eine Offerte anfordern.

Unter der Marke Clinalfa® bietet die

Bachem Peptide für klinische Studien

und Fertigformulierungen von Peptiden

als zusätzlichen Service an. Es sind zwei

Produktlinien erhältlich. Clinalfa® basic

Produkte sind sterile gefriergetrocknete

oder fl üssige Fertigformulierungen für den

ausschliesslichen Einsatz in genehmigten

klinischen Studien. Sie werden gemäss den

Anforderungen und relevanten Richtlinien

der Aufsichtsbehörden hergestellt und frei-

Tabelle 1: Beispiele einiger peptidischer APIs

der Bachem und deren Indikationen

PeptidPeptid IndikationIndikation

Calcitonin Osteoporose

Deslorelin Fruchtbarkeitskontrolle

(Veterinärmedizin)

Desmopressin Diabetes insipidus

Glucagon Unterzuckerung bei Dia-

betes

Goserelin Krebs

Gonadorelin Reproduktionsmedizin

Leuprolid Krebs

Octreotid Akromegalie

Secretin Diagnostik

(Bauchspeicheldrüse)

Triptorelin Krebs

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gegeben und sind ab Lager erhältlich. Unter

Clinalfa® plus bieten wir die Formulierung

nach Kundenwünschen als zusätzlichen

Service zur Auftragsherstellung von pepti-

dischen Wirkstoffen an.

Abb. 2: Clinalfa®-Logo.

Forschungschemikalien

„Katalogprodukte“

Diese Produkte werden in verschiedenen

Packgrössen oder in grösserer Menge

(Minibulk und Bulk) ab Lager verkauft. Die

meisten werden bei der BUK in Grossbritan-

nien oder in Bubendorf hergestellt.

Die Katalogprodukte decken einen breiten

Kundenkreis ab. Die Produkte im Haupt-

katalog sind in drei durch unterschiedliche

Farben markierte Kategorien (gelb-blau-

rot) aufgeteilt:

Der gelbe Teil des Hauptkatalogs enthält

Aminosäurederivate und Produkte zur Syn-

these von Peptiden, wendet sich also primär

an Chemiker.

Der blaue Teil ist der bei weitem umfang-

reichste des Katalogs. In ihm sind die

angebotenen Peptide aufgelistet, er wendet

sich vor allem an die biologische und medi-

zinische Forschung.

Der rote Teil enthält Biochemikalien, die kei-

ne Aminosäurederivate oder Peptide sind.

Auch dieser Teil wendet sich an die biologi-

sche und medizinische Forschung.

Diese Aufteilung in 3 Produktkategorien

(Aminosäurederivate und Produkte für die

Peptidsynthese / Peptide / nicht-peptidi-

sche Biochemikalien) fi ndet sich auch im

Onlineshop (ohne Farbcodierung).

Das Kataloggeschäft ist auch wichtig für die

Akquirierung von Kunden für unsere wei-

teren Angebote, z.B. Auftragssynthesen. Es

erlaubt auf einfache Weise, den potentiellen

Kunden die hohe Produktqualität und den

guten Service der Bachem zu zeigen.

Abb. 3:

Einstiegsseite

des Bachem-

Onlineshops.


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Was sind Peptide ?

Peptide sind kleine Proteine.

Peptide und Proteine sind Makromoleküle,

d.h. lange Moleküle aus kleinen Unterein-

heiten. Man könnte sie sich als Perlen-

ketten aus verschieden geformten Perlen

vorstellen. Die “Perlen” sind die 20 prote-

inogenen Aminosäuren (Aminosäuren, die

in der Zelle zum Aufbau von Peptiden und

Proteinen verwendet werden). Sie werden in

beliebiger Kombination verknüpft, d.h. die

Anzahl der Kombinationsmöglichkeiten ist

praktisch unendlich. Dabei können die Ami-

nosäuren in beliebiger Häufi gkeit verwen-

det werden, so fi ndet sich beispielsweise im

Protein Kollagen Glycin (Gly) an jeder dritten

Position der Kette:

...-Xaa (meistens Pro (L-Prolin))-Yaa-Gly-...

Peptide und Proteine unterscheiden sich

nur durch ihre Länge:

Proteine > 100 Aminosäuren

Peptide 2-100 Aminosäuren

Unser Körper besteht, abgesehen vom

Wasser, zum grössten Teil aus Proteinen.

Trotz des gleichen Aufbauprinzips haben sie

die unterschiedlichsten Funktionen (siehe

Tabelle 2). Proteine sind auch ein lebens-

wichtiger Bestandteil unserer Ernährung!

Wie ist diese Vielfalt möglich?

Durch Variation der Aminosäurebausteine

können Makromoleküle mit den unter-

schiedlichsten Eigenschaften „gebaut“

werden!

Biologisch aktive Peptide sind z.B. Hormone

oder Toxine (s.S. 23).

Ein grosser Teil unserer Hormone sind Pep-

tide von recht unterschiedlicher Länge:

TRH (Thyreotropin-releasing hormone), ein

Tripeptid (es besteht aus 3 Aminosäuren).

LHRH (oder GnRH, Gonadotropin-releasing

hormone), ein Peptid aus 10 Aminosäuren

(Decapeptid).

Calcitonin besteht aus 32 Aminosäuren.

pTH (Parathormon), mit seinen 84 Amino-

säuren fast schon ein Protein.

Insulin besteht aus 2 Peptidketten, einer

aus 30 Aminosäuren und einer aus 21, die

miteinander durch Disulfi dbrücken (s. S. 23)

verknüpft sind.

Generell werden Peptidhormone von spezi-

alisierten Zellen produziert, ins Blut abge-

geben und zum Zielorgan transportiert.

Die Zellen, die stimuliert werden sollen, ha-

ben Rezeptoren, die die Hormone erkennen

und spezifi sch binden. Diese Rezeptoren

sind spezialisierte Proteine, die in der Zell-

membran eingelagert sind. Die Bindung des

Hormons wirkt als Signal für die Zelle und

der gewünschte Effekt wird ausgelöst.

Kurze Peptide

• 2 Aminosäuren = Dipeptid

• 3 Aminosäuren = Tripeptid

• 4 Aminosäuren = Tetrapeptid

• 5 Aminosäuren = Pentapeptid etc.

• wenige Aminosäuren = Oligopeptid

Tabelle 2: Körpereigene Proteine und deren Funktionen

Beispiele Vorkommen der Proteine Anforderungen/Funktion

Myosin, Actin Muskelgewebe fl exible Moleküle, kontrahierbar

Kollagen

(das häufi gste Protein im Körper)

Bindegewebe, Sehnen, Haut formstabile Moleküle, zugfest

Hämoglobin, Albumin Blut Transportermoleküle, löslich

Verdauungsenzym Trypsin im

Dünndarm

(Trypsin ist eine sog. Protease,

spaltet Peptide und Proteine)

Gesamter Organismus Enzyme = Katalysatoren

Hormon Thyreotropin (TSH)

(stimuliert die Schilddrüse)

Gesamter Organismus Hormone = Botenstoffe

Antikörper (Immunoglobuline) Blut Immunabwehr

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Mit den 20 Aminosäuren, die im Peptid

mehrfach vorkommen können, sind auch

schon bei kurzen Peptiden viele Kombinati-

onen möglich, z.B. ca. 3.2 Millionen ver-

schiedene Pentapeptide!

Selbst Dipeptide können schon biologisch

aktiv sein:

Leu-Trp und weitere Dipeptide wirken blut-

drucksenkend

Ac-Asp-Glu (NAAG) ist ein wichtiger Neuro-

transmitter, eine Substanz, die die Signal-

übertragung zwischen den Nervenzellen

vermittelt.

Die im Körper vorkommenden Peptide

werden gewöhnlich durch enzymatische

Spaltung von Proteinen erhalten.

Was sind Aminosäuren ?

Aufbau einer α-Aminosäure

An ein zentrales Kohlenstoffatom (dem α-C-

Atom) sind vier verschiedene Substituen-

ten* gebunden:

• die Säuregruppe

(Carbonsäuregruppe = Carboxylgruppe,

COOH, bei der Bachem kurz als -OH ge-

schrieben)

• eine basische Gruppe

(Aminogruppe, NH2, kurz H-)

• die Seitenkette

(R, kann stark variieren, bestimmt so die

Eigenschaften des Peptids!)

• ein Wasserstoffatom

(H)

Das α-C-Atom trägt demnach 4 Gruppen

mit unterschiedlichen chemischen Ei-

genschaften, was im Folgenden eine sehr

grosse Rolle spielt (Abb. 4).

Wie schon erwähnt, gibt es 20 verschiedene

“proteinogene” Aminosäuren, aus denen die

NH2

COOHR

H

C

Abb. 4: α-Aminosäure, das α-C-Atoms mit

den vier verschiedenen Substituenten.

Proteine der Zelle aufgebaut werden. Sie

unterscheiden sich nur in der Seitenkette

R. Daneben fi ndet man in der Natur - frei,

als Stoffwechselprodukte oder in Peptiden/

Proteinen eingebaut - noch viele ande-

re α-Aminosäuren, z.B. L-Hydroxyprolin

(Hyp) im Kollagen oder L-Ornithin (Orn)

frei imHarn. Weitere α-Aminosäuren, z.B.

L-Norleucin (Nle), sind bisher nur durch

chemische Synthese erhalten worden.

Bei der Bachem bezeichnet man nicht-

proteinogene Aminosäuren wie Hyp und

Nle als „unusual amino acids“, da man sie

nicht pauschal „unnatürliche Aminosäu-

ren“ nennen kann (wie es manche anderen

Firmen tun).

Aminosäuren (ob proteinogen oder nicht)

können biologisch aktiv sein, z.B. L-Trypto-

phan, L-Glutaminsäure.

Die Seitenkette R

• kann ein Wasserstoff-Atom sein:

Glycin, die einfachste α-Aminosäure

• kann eine zusätzliche Säuregruppe

(COOH) tragen:

Asparaginsäure, Glutaminsäure, oder eine

veränderte Säuregruppe sein (ein Amid,

CONH2): Asparagin, Glutamin

• kann eine zusätzliche basische Gruppe

tragen:

Arginin (stark basisch), Lysin, Histidin

(schwach basisch)

• kann eine polare Gruppe tragen:

Serin, Threonin

• kann ein Kohlenwasserstoff (unpolar) sein:

Alanin (R = Methyl), Phenylalanin (R = Ben-

zyl), Valin (R = Isopropyl)

• kann Schwefel enthalten:

Cystein, Methionin

Neben den α-Aminosäuren, aus denen

Peptide und Proteine aufgebaut sind, hat

die Bachem noch viele andere Aminosäuren

im Angebot, auch solche, bei denen die Ami-

nogruppe an ein anderes Kohlenstoffatom

gebunden ist.

L- und D-Aminosäuren

Die vier verschiedene Substituenten des

α-Kohlenstoffatom sind nicht in einer

Ebene angeordnet, sondern sitzen an den

*Substituenten sind Atome oder Atomgruppen, die an Stelle von einem Wasserstoffatom an ein zentrales Kohlenstoff-

atom (bei α-Aminosäuren das α-C) gebunden sind.


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vier Ecken eines Tetraeders, in dessen Mitte

das α-C-Atom sitzt (Abb. 5):

Daher sind 2 Formen der Aminosäuremole-

küle möglich, die sich wie Bild und Spiegel-

bild verhalten und als Stereoisomere oder

Enantiomere bezeichnet werden:

In ihren physikalischen Eigenschaften un-

terscheiden sich die beiden Enantiomeren

nicht, ausser dass sie in Lösung die Ebene

des polarisierten Lichts drehen. Verbindun-

Abb. 5: Anordnung der Substituenten um

das α-Kohlenstoffatom (grau).

Gly) sind L-Enantiomere (L steht für laevus,

lat. links), z.B. L-Alanin. Ihre „Spiegelbilder“,

die D-Aminosäuren, treten in der Natur viel

seltener auf. D steht für dexter (lat. rechts).

Um es noch einmal zu betonen, L oder D

bezeichnet die Anordnung der vier verschie-

denen Substituenten am α-C-Atom, d.h. das

jeweilige Enantiomer (vgl. Abb. 6). Man kann

nicht von der Bezeichnung L- oder D- auf

den Drehsinn schliessen. Bei L-Aminosäu-

ren kann er positiv oder negativ sein (s.u.),

bei den entsprechenden D-Aminosäuren ist

er immer entgegengesetzt gerichtet.

Die Drehwerte fi ndet man häufi g als [α] auf

den ADS/QCRF (s. S. 24) von Aminosäuren

und ihren Derivaten angegeben, da sie cha-

rakteristisch für die jeweilige Verbindung

sind. Auch bei Peptiden werden oft Dreh-

werte gemessen.

Tabelle 3: Die für Aminosäuren wichtigen funktionellen Gruppen

Bezeichnung Struktur Bezeichnung Struktur

Aminogruppe NH2

Carboxygruppe COOH

Hydroxylgruppe OH Amidgruppe

(Carboxamidgruppe)

CONH2

Thiol- oder Mercaptogruppe

(im Cystein)

SH Guanidinogruppe

(im Arginin)

NH-C(=NH)-NH2

Abb. 6: Absolute Konfi guration der L- und D-Isomere von Aminosäuren.

gen, die das tun, bezeichnet man als “op-

tisch aktiv”. Die optische Aktivität ist in der

Natur sehr weit verbreitet. Ausser Glycin (R

= H, Bild und Spiegelbild identisch) zeigen

alle proteinogenen Aminosäuren dieses

Phänomen. Auch Zucker drehen das Licht,

was man benutzt, um die Konzentration von

Zuckerlösungen zu bestimmen, ebenso die

DNA und ihre Bausteine.

Alle proteinogenen Aminosäuren (ausser

Einige Beispiele:

L-Alanin: + 14.3°

D-Alanin: -13.9°

L-Tryptophan: - 31.8°

D-Tryptophan: + 30.7°

(die Abweichungen liegen im Genauigkeits-

bereich der Methode)

Eine 1:1 Mischung der beiden Enantiomeren

bezeichnet man als Racemat. Die Drehun-

gen von L- und D-Form kompensieren sich.

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In der Bachem-Schreibweise wird die L-

Form wegen ihrer grossen Bedeutung nicht

explizit bezeichnet (z.B. L-Alanin = H-Ala-

OH). Bezeichnet werden nur das D-Enan-

tiomer (D-Alanin = H-D-Ala-OH) und das

Racemat, das mit DL gekennzeichnet wird.

Schreibweisen für Aminosäuren

Schreibt man bei einer Aminosäure den Na-

men aus, bezeichnet man auch die enantio-

mere Form: L-Alanin und D-Alanin.

Beim Racemat wird, wie in der organischen

Chemie üblich, das DL gewöhnlich wegge-

lassen.

Um Aminosäurederivate und Peptide darzu-

stellen, benutzt man den Dreibuchstaben-

Code (3-letter code, meistens die ersten 3

Buchstaben des Namens).

Daneben gibt es den Einbuchstaben-Code

(1-letter code), den man vor allem für länge-

re Peptide und Proteine bevorzugt.

Beispiele:

L-Alanin → Ala, L-Ala, H-Ala-OH (3-letter);

A (1-letter)

L-Arginin → Arg, L-Arg, H-Arg-OH (3-letter);

R (1-letter)

Bachem-Schreibweise:

H-Ala-OH, H-Arg-OH

Die Schreibweise bedeutet, dass es die

L-Form ist und dass die Amino- und die Car-

boxylgruppe frei sind!.

Die Kürzel der 20 proteinogenen Aminosäu-

ren sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

Englische Aminosäure-Bezeichnungen:

Ausser beim Tryptophan wird ein -e ange-

hängt, z.B. alanine, valine.

Asparaginsäure = aspartic acid

Glutaminsäure = glutamic acid

Der Einbuchstaben-Code wird nur für die

20 proteinogenen Aminosäuren verwendet,

für D-Aminosäuren schreibt man oft den

Kleinbuchstaben, z.B. f = D-Phe.

Dagegen gibt es für viele der nicht-prote-

inogenen Aminosäuren auch einen verbind-

lichen Dreibuchstaben-Code, z.B. Hyp

(L-trans-Hydroxyprolin), Nle (L-Norleucin),

Orn (L-Ornithin). Nicht alle literaturüb-

lichen Kürzel werden auch bei der Bachem

benutzt. Bei manchen Aminosäuren wird

bei der Bachem der ausgeschriebene Name

gebraucht, z.B. L-Thiazolidine-4-carboxylic

acid (sonst Thz).

Kurze Porträts der 20 proteinogenen Ami-

nosäuren

Ein Organismus, z.B. der menschliche, muss

alle 20 proteinogenen Aminosäuren zur

Verfügung haben, um Proteine synthetisie-

ren zu können. Sie müssen alle in L-Form

vorliegen (ausser Gly).

Man unterscheidet zwischen essentiellen

und nicht-essentiellen Aminosäuren.

Nicht-essentielle Aminosäuren kann der

Körper selbst herstellen, essentielle nicht,

sie müssen also mit der Nahrung zugeführt

werden.

Man kann die Aminosäuren auch nach der

Seitenkette (s.S.7), die ihre Eigenschaf-

ten bestimmt, unterteilen. Es gibt saure,

basische, polare und unpolare Aminosäu-

ren, in der “Periodic Chart of Amino Acids”

Tabelle 4: Kürzel der proteinogenen Aminosäuren (L-Form, ausser Gly)

Name im Peptid* 3-letter 1-letter Name im Peptid 3-letter 1-letter

Alanin alanyl Ala A Leucin leucyl Leu L

Arginin arginyl Arg R Lysin lysyl Lys K

Asparagin asparaginyl Asn N Methionin methionyl Met M

Asparaginsäure aspartyl Asp D Phenylalanin phenylalanyl Phe F

Cystein cysteyl Cys C Prolin prolyl Pro P

Glutamin glutaminyl Gln Q Serin seryl Ser S

Glutaminsäure glutamyl Glu E Threonin threonyl Thr T

Glycin glycyl Gly G Tryptophan tryptophyl Trp W

Histidin histidyl His H Tyrosin tyrosinyl Tyr Y

Isoleucin isoleucyl Ile I Valin valyl Val V

*s.Tab. 5 auf S. 15


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(s.S.13) werden sie durch verschiedene

Farben unterschieden. Die Eigenschaften

von Peptiden und Proteinen werden von den

Seitenketten der Aminosäuren, aus denen

sie aufgebaut sind, bestimmt.

Glycin (Gly, G)

ist die einfachste Aminosäure und eine

der in Peptiden/Proteinen am häufi gsten

vorkommenden. Gly ist nicht-essentiell.

Seinem süssen Geschmack verdankt Glycin

seinen Namen.

Alanin (Ala, A)

ist die einfachste optisch aktive Aminosäu-

re und die zweithäufi gste in Proteinen. Die

abgebildete L-Form dieser nicht-essentiel-

len Aminosäure wird vom Körper in Proteine

eingebaut, doch fi ndet sich in der Natur

auch D-Alanin recht häufi g in Peptiden.

Alanin wird zu den unpolaren Aminosäuren

gezählt.

Arginin (Arg, R)

ist eine stark basische Aminosäure. Die

stickstoffhaltige Guanidinogruppe in der

Seitenkette ist eine derartig starke Base,

dass sie praktisch mit jeder Säure ein Salz

bildet. Seinen Namen hat Arginin bekom-

men, weil es als Silbersalz isoliert worden

ist. Arg ist halb-essentiell (der Körper kann

es zwar produzieren, aber oft in zu geringer

Menge). Arg-haltige Peptide sind sehr polar

und leicht wasserlöslich

Asparagin (Asn, N)

ist eigentlich ein Derivat der Asparagin-

säure (das Amid) und wie diese wurde Asn

in Spargeln entdeckt. Asn ist eine polare

Aminosäure. In Peptiden und Proteinen ist

Asn relativ labil.

Asparaginsäure (Asp, D)

ist eine saure Aminosäure, weil sie in der

Seitenkette eine weitere Säuregruppe

enthält. Diese bleibt erhalten, wenn Asp in

ein Peptid eingebaut wird. Asparaginsäu-

re wurde in Spargeln entdeckt, was ihr zu

ihrem Namen verholfen hat. Für Säugetiere

ist Asp nicht-essentiell.

Cystein (Cys, C)

ist zwar eine seltene Aminosäure, aber äu-

sserst wichtig für die Struktur von Peptiden

und Proteinen. Das nicht-essentielle Cys

enthält Schwefel in der Seitenkette, als

leicht saure Thiolgruppe. Thiolgruppen las-

sen sich leicht unter Ausbildung einer Disul-

fi dbindung oxidieren. Aus zwei Cysteinmo-

lekülen erhält man ein Cystin (Cyt)-Molekül.

Bei Peptiden, die ein Cys erhalten, werden

zwei Ketten miteinander verknüpft. Sind 2

Cys im Peptid, kann ein Ring entstehen, wie

wir später noch sehen werden.

Glutamin (Gln, Q)

ist eigentlich ein Derivat (das Amid) der

Glutaminsäure. Glutamin ist eine polare

Aminosäure, die in freier Form in grossen

Mengen im menschlichen Körper vorkommt.

Glutamin am Beginn einer Peptidkette

bildet spontan oder mit Hilfe eines Enzyms

Pyroglutaminsäure.

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Glutaminsäure (Glu, E)

ist eine saure Aminosäure. Glu ist nicht-

essentiell. Die Salze der Glutaminsäure

heissen Glutamate, das Natriumsalz

(Monosodiumglutamate, MSG) ist bekannt

und berüchtigt als Geschmacksverstärker.

Glu hat grosse physiologische Bedeutung in

unserem Nervensystem als Neurotransmit-

ter. Glutaminsäure bildet viel weniger leicht

Pyroglutaminsäure als Glutamin.

Histidin (His, H)

ist eine schwach basische, polare, für Men-

schen essentielle Aminosäure. Der Name

leitet sich von „histos“ (griech. Gewebe) ab.

Der Imidazolring, den sie in der Seitenkette

trägt, enthält 2 Stickstoffatome. Imidazole

katalysieren viele Reaktionen, daher ist His

(in Kombination mit Cys, Ser oder Thr) oft im

aktiven Zentrum von Enzymen zu fi nden.

Leucin (Leu, L) und Isoleucin (Ile, I)

sind isomere α-Aminosäuren. Isomere

Verbindungen haben die gleiche Summen-

formel und das gleiche Molekulargewicht,

aber sie unterscheiden sich in der Struktur.

Beides sind unpolare Moleküle. Leu und

Ile sind für den Menschen essentiell. Der

Name Leucin rührt von den weissen (griech:

leukos) Blättchen, in denen es kristallisiert.

Beim Isoleucin sind weitere Stereoisomere

möglich (allo-Ile).

Lysin (Lys, K)

ist eine basische Aminosäure, die in ihrer

Seitenkette eine zweite Aminogruppe trägt,

eine α,ε-Diaminosäure. Lysin ist essentiell.

Methionin (Met, M)

ist, wie Cystein, eine schwefelhaltige

Aminosäure. Der Schwefel liegt als Methyl-

thioether vor, worauf der Name anspielt ,

„Me-thio“. Thioether sind oxidationsemp-

fi ndlich, was beim Umgang mit Met-haltigen

Peptiden zu beachten ist. Diese essentielle

Aminosäure zählt zu den unpolaren Amino-

säuren.

Phenylalanin (Phe, F)

ist eine essentielle, unpolare Aminosäure.

Sie zählt, neben His, Tyr (das als Phenyl-

alaninderivat betrachtet werden kann) und

Trp zu den aromatischen Aminosäuren.

Prolin (Pro, P)

ist die einzige cyclische proteinogen

Aminosäure, ein Ring aus 5 Atomen, der

α-Aminogruppe und α-C enthält. Pro ist

unpolar und nicht essentiell. Wegen seiner

speziellen Struktur hat Pro einen immensen


12

Einfl uss auf die räumliche Struktur von

Peptiden und Proteinen.

Serin (Ser, S)

ist dank der Hydroxylgruppe in der Seiten-

kette eine polare Aminosäure. Der Name

dieser nicht-essentiellen Aminosäure leitet

sich von der Seide (lat. sericum) ab

Threonin (Thr, T)

enthält wie Serin eine Hydroxylgruppe in

der Seitenkette, ist jedoch eine essentielle

Aminosäure. Threonin enthält wie Isoleucin

ein zweites asymmetrisches Kohlenstoff-

Atom mit vier verschiedenen Substituenten,

womit weitere Stereoisomere möglich sind

(allo-Thr).

Tryptophan (Trp, W)

ist eine unpolare, essentielle Aminosäure,

ein Indolderivat. Die freie Aminosäure wirkt

antidepressiv, sie ist eine Vorstufe vom

Serotonin. Tryptophan fl uoresziert im UV-

Bereich (308-350 nm).

Tyrosin (Tyr, T)

ist, da es im Organismus aus Phenylalanin

gebildet werden kann, eine nicht-essentiel-

le Aminosäure. Die relativ unpolare Amino-

säure wurde zuerst aus Käse (griech. tyros)

isoliert.

Valin (Val, V)

ist eine unpolare essentielle Aminosäure.

Aminosäurederivate

Generell versteht man in der organischen

Chemie unter Derivaten Abkömmlinge einer

Verbindung.

Ein Derivat einer Aminosäure wird erhalten

durch Modifi kation (chemische Verän-

derung) der Aminogruppe und/oder der

Carboxylgruppe und/oder der Seitenkette.

Wenn diese Modifi kation unter Bedingun-

gen wieder rückgängig gemacht werden

kann, die die Aminosäure nicht verändern,

kann sie als Schutzgruppe dienen. Solche

Derivate sind als Bausteine für die Peptid-

synthese geeignet.

Stamm-

verbindung

Derivat

H-Ala-OH → Ac-Ala-OH

(Aminogruppe blockiert)

→ H-Ala-NH2

(Carboxygruppe blockiert)

→ Fmoc-Ala-OH

(Aminogruppe blockiert)

→ Jedoch kann Fmoc sele-

ktiv unter milden Be-

dingungen abgespalten

werden, ist also eine für

die Peptidsynthese ge-

eignete Schutzgruppe.

13

His

His

tid

ine

H 155.

1613

7.14

C6H

9N3O

2H

9N3O

2

Arg

Arg

inin

e

R 174.

2015

6.19

C6H

14N

4O2

156.

19C

6H14

N4O

2

Lys

Lysin

e

K 146.

1912

8.17

C6H

14N

2O2

128.

17C

6H14

N2O

2

Ile

Iso

leu

cin

e

I 131.

1811

3.16

C6H

13N

O2

C6H

13N

O2

Ph

e

Ph

en

yla

lan

ine

F 165.

1914

7.18

C9H

11N

O2

147.1

8C

9H11

NO

2

Le

u

Le

ucin

e

L 131.

1811

3.16

C6H

13N

O2

C6H

13N

O2

Trp

Tryp

top

ha

n

W 204.

2318

6.21

C11

H12

N2O

2

Tryp

top

ha

n

1112

22

Ala

Ala

nin

e

A 89.0

971

.08

C3H

7NO

2

Me

t

Me

thio

nin

e

M 149.

2113

1.20

C5H

11N

O2S

Pro

Pro

lin

e

P 115.

1397

.12

C5H

9NO

2C

5H9N

O2

Cys

Cyste

ine

C 121.

1610

3.14

C3H

7NO

2S

Asn

Asp

ara

gin

e

N 132.

1211

4.10

C4H

8N2O

3

Va

l

Va

lin

e

V 117.1

599

.13

C5H

11N

O2

511

2

Gly

Gly

cin

e

G 75.0

757

.05

C2H

5NO

2

Se

r

Se

rin

e

S 105.

0987

.08

C3H

7NO

3

Gln

Glu

tam

ine

Q 146.

1512

8.13

C5H

10N

2O3

Glu

tam

ine

C5H

10N

2O3

Tyr

Tyro

sin

e

Y 181.

1916

3.17

C9H

11N

O3

Tyro

sin

e

C9H

11N

O3

Asp

Asp

arti

c A

cid

D

133.

1011

5.09

C4H

7NO

4

Glu

Glu

tam

ic A

cid

E 147.1

312

9.11

C5H

9NO

4

129.

11C

5H9N

O4

Th

r

Th

re

on

ine

T 119.

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1.10

C4H

9NO

3

Se

r

Se

rin

e

S 105.

0987

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C3H

7NO

3C

3H7N

O3

1-Le

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Rel

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Mol

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mic

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roup

. Rep

rodu

ctio

n fo

rbid

den

wit

hout

per

mis

sion

C3H

7NO

2


14

Herstellung von Peptiden

Wie synthetisiert man ein Peptid?

Warum eigentlich Peptide synthetisieren?

Kann es die Natur nicht besser?

Die chemische Synthese

hat Vorteile:

• Beliebiger Massstab möglich

• Bei kürzeren Peptiden einfacher als

biologische Methoden

• BSE/TSE-frei

und zusätzliche Möglichkeiten:

• Veränderung der Aminosäuresequenz

bekannter Peptide

• Modifi kation von Peptiden (s.S.26)

ZIEL: Die Natur verbessern, d.h. die biolo-

gische Aktivität des Peptids zu modifi zieren:

• Erhöhung der erwünschten Aktivität

(biologisch aktive Peptide zeigen gewöhn-

lich mehrere Aktivitäten)

• Optimierung der Stabilität

„nicht besser, aber länger“

(Peptide können nicht oral eingenommen

werden und werden im Körper schnell

abgebaut, was nicht günstig für ein Medika-

ment ist)

• Minimierung von Nebenwirkungen

• Aufklärung von Struktur-Wirkungs-

beziehungen

• Synthese von Peptiden, die es in der Natur

nicht gibt u.v.m.

Synthese eines Dipeptids aus zwei ver-

schiedenen Aminosäuren

Beispiel:

L-Alanyl-L-phenylalanin (H-Ala-Phe-OH)

Zwei Aminosäuren reagieren miteinander zum

Dipeptid unter Abspaltung von Wasser. Das tun

sie nicht spontan, man muss sie aktivieren, da-

mit die Reaktion stattfi ndet. Für diesen Zweck

hat man die sogenannten Kupplungsreagenzi-

en entwickelt. Sie erzeugen reaktivere Derivate

der Aminosäure, und entfernen das Wasser aus

dem System.

Doch wenn man einfach ein Kupplungsreagenz

zu einer Lösung von Alanin und Phenylalanin

gibt, resultiert eine Mischung der 4 möglichen

H-Ala-OH + H-Phe-OH H-Ala-Phe-OH + H2O

Dipeptide, daneben könnenTri- und längere

Peptide entstehen:

Um wirklich nur das gewünschte Dipeptid

H-Ala-Phe-OH und keine Mischung zu erhalten,

braucht es 2 Schutzgruppen. Sie dürfen unter

den Bedingungen der Kupplungsreaktion nicht

abgespalten werden, aber leicht in einem sepa-

raten Schritt nach der Kupplung.

Die Aminogruppe von Alanin muss blockiert

werden:

H-Ala-OH → X-Ala-OH

und die Säuregruppe vom Phenylalanin:

H-Phe-OH → H-Phe-OY

Jetzt kann nur noch die Säuregruppe des

Alanins mit der Aminogruppe des Phenylalanins

reagieren:

X-Ala-OH + H-Phe-OY → nur X-Ala-Phe-OY

Zum Schluss werden die Schutzgruppen

entfernt:

X-Ala-Phe-OY → H-Ala-Phe-OH

d.h. X und Y werden unter den gleichen Bedin-

gungen abgespalten.

Jetzt wählen wir X und Y so, dass X unter Be-

dingungen abgespalten wird, unter denen OY

erhalten bleibt:

H-Ala-Ala-OH

H-Ala-Phe-OH

H-Phe-Ala-OH

H-Phe-Phe-OH

H-Ala-OH+

H-Phe-OH

X-Ala-Phe-OY

H-Ala-Phe-OY

X-Gly-Leu-Ala-Phe-OY

X-Leu-Ala-Phe-OY

H-Gly-Leu-Ala-Phe-OH,

das gewünschte Peptid

Abspaltung X, Kupplung X-Gly-OH

Kupplung X-Leu-OH

Abspaltung X, Abspaltung Y

Abspaltung X

15

So kann man ein Peptid beliebig verlängern.

X nennt man temporäre Schutzgruppe, denn sie

wird nur für den Kupplungsschritt gebraucht.

Y ist eine permanente Schutzgruppe. Sie muss

so stabil sein, dass sie sämtliche Kupplungs-

und X-Abspaltungsschritte aushält. Trotzdem

muss man sie im letzten Schritt abspalten

können, ohne dass das Peptid beschädigt wird.

Ein Peptid hat immer zwei sich unterschei-

dende Endgruppen, und damit eine “Richtung”.

Die endständige Aminogruppe eines Peptids

bezeichnet man als N-Terminus, die endstän-

dige Carboxylgruppe als C-Terminus. Bei der

chemischen Synthese wird das Peptid vom

C-Terminus ausgehend in Richtung N-Terminus

aufgebaut, daher muss die endständige

Carboxylgruppe während der ganzen Synthese

geschützt sein. Unabhängig von der verwende-

ten Schreibweise beginnt man bei der Darstel-

lung einer Peptidsequenz am N-Terminus, s.

Tabelle 5.

Aminoschutzgruppen

In Tabelle 6 sind die bei der Bachem gebräuch-

lichsten Schutzgruppen für die α-Aminogruppe

zusammengestellt. Sie werden mit unter-

schiedlichen Methoden abgespalten. Beispiele

für Nα-geschützte Aminosäurederivate:

Z-Leu-OH

Boc-Ala-OH

Fmoc-Phe-OH

Tabelle 5: Schreibweisen für Peptide

Schreibweise Erklärung

H-Gly-Leu-Ala-

Phe-OH

Bachem-Schreibweise,

hier sind N- und C-

Terminus leicht zu erken-

nen, beide sind „frei“, nicht

modifi ziert

Gly-Leu-Ala-

Phe

Endgruppen werden

nur explizit angegeben,

wenn sie nicht frei sind

GLAF 1-letter code, Endgrup-

pen werden nur explizit

angegeben, wenn sie

nicht frei sind

Glycyl-L-

leucyl-L-ala-

nyl-L-phenyl-

alanine

“ausgeschrieben”, vor

allem bei kürzeren

Peptiden üblich

Viele Boc- oder Z-Aminosäurederivate werden

als DCHA- oder CHA-Salze ((Di)cyclohexylam-

monium-Salze) angeboten. Salzbildung verbes-

sert die Lagerstabilität bei säureempfi ndlichen

Derivaten, denn auch eine Aminosäure ist eine

Säure, stärker als Essigsäure!. Manche Boc-

oder Z-Derivate sind Öle, sie lassen sich nur als

Salz in fester, kristalliner Form erhalten. Feste

Produkte lassen sich viel leichter handhaben

als Öle, z.B. beim Abwägen.

Benzyloxycarbonyl (Z oder Cbz) ist übrigens

die älteste brauchbare Nα-Schutzgruppe für

Aminosäuren (Bergmann & Zervas 1932). Die

Entwicklung von Z brachte den Beginn der

modernen Peptidsynthese, daher auch die

Abkürzung Z zu Ehren von Leonidas Zervas. Die

Z-Gruppe wird heute noch häufi g zum Schutz

der Aminogruppe, auch in der organischen

Synthese, benutzt.

Schutzgruppen für Carboxylgruppen

Im Gegensatz zur α-Aminogruppe muss die

endständige Säuregruppe während der ganzen

Peptidsynthese geschützt sein. Die gebräuch-

lichsten Schutzgruppen sind in Tabelle 7

zusammengestellt.

Beispiele für Ester von Aminosäuren:

H-Ala-OtBu · HCl

H-Val-OMe · HCl

H-Glu(OBzl)-OBzl · p-tosylate

Ester von Aminosäuren sind nur in Form ihrer

Salze mit starken Säuren wie Salzsäure (Hydro-

chloride) oder p-Toluolsulfonsäure (p-Tosylate)

lagerstabil. Diese Salze sind auch leichter in

kristalliner Form zu erhalten als die freien

Aminosäureester.

Die Wahl der Amino- und Carboxylschutzgrup-

pe hängt auch von der Synthesemethode ab.

Die beiden wichtigsten Methoden werden im

nächsten Kapitel vorgestellt. Bei der Festpha-

sensynthese (SPPS) ist die C-terminale Schutz-

gruppe ein unlösliches Polymer.

Seitenkettenschutzgruppen

Die Vielfältigkeit der Seitenketten der Amino-

säuren und ihre grosse Bedeutung für die Ei-

genschaften der Peptide wurde schon erwähnt.

Während der Peptidsynthese müssen manche

Seitenkettengruppen permanent geschützt

werden.

Schauen wir uns die 20 proteinogenen Amino-

säuren genauer an:


16

Tabelle 8: Beispiele für Aminosäurederivate aus dem Katalog

Derivat Verwendung

Fmoc-Arg(Pbf)-OHStandardderivat von Arginin für die Fmoc SPPS, muss akti-

viert werden

Fmoc-Asn(Trt)-OPfp Standardderivat für die Fmoc-SPPS, schon aktiviert ("Ak-

tivester"), kann direkt eingesetzt werden

Z-Glu(OtBu)-OSu Derivat für die Lösungssynthese, schon aktiviert

Boc-Ser(tBu)-OHNUR für N-terminales Serin! Nα- und Seitenkettenschutz

werden unter den gleichen Bedingungen abgespalten

Tabelle 9: Gebräuchliche Seitenkettenschutzgruppen

Aminosäure Schutzgruppe Hauptsächliche Verwendung

Arg Pbf, Pmc Fmoc-SPPS

Arg (Salzbildung) Lösungssynthese

Asp, Glu OtBu Fmoc-SPPS, Lösungssynthese

Asp, Glu OBzl Lösungssynthese

Asn, Gln Trt, Mtt Fmoc-SPPS

Cys Trt Fmoc-SPPS, Lösungssynthese

Cys Acm SPPS, Lösungssynthese

His Trt Fmoc-SPPS

Lys Boc Fmoc-SPPS, Lösungssynthese

Lys Z Lösungssynthese

Ser tBu Fmoc-SPPS, Lösungssynthese

Ser Bzl Lösungssynthese

Thr, Tyr tBu Fmoc-SPPS

Trp Boc Fmoc-SPPS

Tabelle 6: Gebräuchliche temporäre Aminoschutzgruppen

Abk. Chemische Bezeichnung Spaltreagenz

Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Piperidin

Boc t-Butoxycarbonyl Trifl uoressigsäure

Z Benzyloxycarbonyl katalytische Hydrierung

Wasserstoff / Palladium

Tabelle 7: Gebräuchliche permanente Säureschutzgruppen für den C-Terminus

und die Seitenketten von Asp und Glu

Abk. Chemische Bezeichnung Spaltreagenz

OtBu t-Butylester Trifl uoressigsäure

OBzl Benzylester katalytische Hydrierung

Wasserstoff / Palladium

OMe Methylester Basen

17

Tabelle 11: Methodenvergleich Lösungssynthese versus SPPS

Lösungssynthese Festphasensynthese (SPPS)

Reaktionsmedium Reaktionen in Lösung Gel

(gequollenes unlösliches Polymer)

Batchgrösse beliebig (vor allem gross) beliebig (auch sehr klein)

Schnelligkeit der Synthese langsam schnell

Automatisierung schwierig zu realisieren halbautomatisch oder kommerziell

erhältliche Vollautomaten

Synthesestrategie meistens konvergent* meistens stufenweise

temporäre Schutzgrupppe meistens Boc oder Z Fmoc (Fmoc-SPPS), Boc (Boc-SPPS)

Seitenkettenschutz Minimum Maximum

Materialverbrauch

(Aminosäurederivate)

mässig hoch

Optimierung möglich möglich

Reinigung + Analyse von

Zwischenstufen

üblich nicht möglich

Endreinigung relativ einfach aufwendig

*konvergente Synthese von längeren Peptiden: Zuerst werden mehrere Teilstücke synthetisiert, die am Schluss zum

Endprodukt zusammengesetzt werden. Konvergent geht es etwas schneller als stufenweise, denn man kann gleich-

zeitg mehrere Fragmente aufbauen. Auch die Kombination „SPPS der geschützten Fragmente, danach Kupplung in

Lösung“ ist möglich (z.B. Synthese von Enfuvirtid).

Tabelle 10: Bedeutung der Abkürzungen für die Seitenkettenschutzgruppen

Abkürzung Bedeutung Hauptsächliche Verwendung

Acm Acetamidomethyl Cys, Fmoc-SPPS, Lösungssynthese

Boc t-Butyloxycarbonyl Lys & Trp, Fmoc-SPPS

tBu t-Butyl Ser, Thr & Tyr, Fmoc-SPPS

Bzl Benzyl Ser (Thr, Tyr) Lösungssynthese

OtBu t-Butyl ester Asp & Glu, Fmoc-SPPS

OBzl Benzyl ester Asp & Glu, Lösungssynthese

Pbf 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl Arg, Fmoc-SPPS

Pmc 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl Arg, Fmoc-SPPS

Trt Trityl (Triphenylmethyl) Cys, His, Asn & Gln, Fmoc-SPPS

Z Benzyloxycarbonyl Lys, Lösungssynthese

Ala, Leu und Phe haben Seitenketten, die unter

den Bedingungen der Peptidsynthese nicht

reagieren. Ebenso Ile, Pro und Val.

Andere Seitenkettenfunktionen können wäh-

rend der Peptidsynthese modifi ziert werden,

wenn man sie nicht blockiert.

Die Carboxylgruppen von Asp und Glu und die

Aminogruppe von Lys können an der Kupplung

teilnehmen. Es ensteht ein Peptid mit einer fal-

schen Verknüpfung oder ein verzweigtes Peptid.

Andere Nebenreaktionen gibt es mit den Sei-

tenkettenfunktionen von

Cys

Ser, Thr, Tyr

Arg

His

Asn, Gln

Trp

Met (Schutz nur in Sonderfällen)


18

Abb. 7: Synthesizer, Vollautomaten für die Festphasen-Peptidsynthese.

Das linke Bild zeigt Reaktoren, in denen gerade eine Synthese läuft.

• Lösungssynthese

(„Klassische Peptidsynthese“)

Gemeinsamkeiten und Unterschiede der beiden

Methoden sind in Tabelle 9 zusammengefasst.

Die meisten Peptide, die die Bachem anbietet

oder als Auftragssynthese herstellt, werden per

SPPS synthetisiert. Die Lösungssynthese wird

noch gewählt für die Synthese von einem Teil

unserer peptidischen Generika, von sehr kurzen

Peptiden (z.B. Dipeptide) und von am C-Termi-

nus modifi zierten Peptiden.

Die wesentliche Vorteile der Festphasensyn-

these gegenüber der Lösungssynthese sind ihre

Schnelligkeit und Automatisierbarkeit.

Allerdings gilt: Je grösser der Ansatz, umso

langsamer läuft die SPPS, da die „Handarbeit“

zunimmt.

Kleine und mittlere Peptidmengen können in

vollautomatischen “Synthesizern” hergestellt

werden (Abb. 7). Sehr grosse Mengen (mehrere

kg Rohpeptid) werden in Halbautomaten (nur

noch die Waschprogramme laufen automa-

tisch) oder manuell produziert.

Die Automatisierung ist möglich, weil das

Peptid stufenweise vom C-Terminus bis zum

N-Terminus aufgebaut wird. Man kuppelt eine

Aminosäure nach der anderen.

Vier Schritte wiederholen sich dabei immer

wieder:

Die Seitenkettenfunktionen von Lysin und Cys-

tein müssen während des Peptidaufbaus per-

manent blockiert sein, bei den anderen hängt

es von der Peptidsequenz und der Synthese-

methode ab, ob man dauerhaft schützt oder auf

eine Schutzgruppe verzichten kann.

Die gebräuchlichsten Seitenkettenschutz-

gruppen sind in Tabelle 9 zusammengestellt, in

Tabelle 10 sind die Abkürzungen erklärt.

Bei Lösungssynthesen müssen die Seiten-

ketten von Asn, Gln, His, Thr, Trp, und Tyr nicht

unbedingt geschützt werden. Beim Arg kann

die Salzbildung mit einer starken Säure wie HCl

genügen. Die Lösungssynthese stellt auch nicht

ganz so hohe Ansprüche an die Stabilität von

Schutzgruppen wie die SPPS.

Generell gilt:

Aminosäurederivate für die Peptidsynthese

sollten möglichst feinkristallin (keine amorphe

Masse oder Öl) und gut löslich sein. Die Fmoc-

Derivate sollten sich gut und schnell in DMF

(oder NMP) lösen, besonders wichtig ist dieser

Punkt bei der vollautomatisierten Fmoc-SPPS.

Methoden der Peptidsynthese

Wie schon erwähnt, gibt es 2 Standardmetho-

den der Peptidsynthese:

• Festphasensynthese

(Solid-Phase Peptide Synthesis, SPPS)

19

1. Abspalten der temporären Schutzgruppe

2. Auswaschen

3. Kuppeln der nächsten geschützten

Aminosäure

4. Auswaschen

Ein Nachteil der SPPS ist, dass erst am Ende

der Synthese, nachAbspaltung des Peptids

vom Harz, gereinigt werden kann. Das bedeutet

auch, dass während der Synthese am Harz kein

Fehler (z.B. Kuppeln der falschen Aminosäure)

passieren darf! Die Konsequenzen sind viel

schlimmer als bei Fehlern bei Lösungssyn-

thesen, bei denen man zuerst Teilsequenzen

aufbaut und diese am Ende zusammensetzt

(s.S. 17 und 21).

Als Trägermaterial (Harz) wird bei der SPPS

meistens vernetztes Polystyrol verwendet. Die-

ses erhält man in Form von feinen Kügelchen.

Bei der Bachem wird als Trägermaterial nur

mit 1% Divinylbenzol vernetztes Polystyrol

(polystyrene-co-1% divinylbenzene) verwendet

bzw. angeboten. Es stehen zwei Korngrössen

zur Auswahl:

200 - 400 mesh = 38 - 75 mm

100 - 200 mesh = 75 - 150 mm

(mesh: die bei der Polymerisation erzeugten Kü-

gelchen werden durch Aussieben in Fraktionen

einer gewissen Korngrösse aufgetrennt)

Die Polystyrol-Kügelchen sind dank der Vernet-

zung zwar in keinem Lösungsmittel löslich, aber

in manchen quellen sie auf zu einem Gel (s. Abb.

8). Erwünscht ist eine gute Quellung in Dime-

thylformamid (DMF) oder N-Methylpyrrolidon

(NMP), den Standardlösungsmitteln der SPPS.

Je besser die Quellung, desto gelartiger die

Kugeln, umso schneller laufen die Reaktionen

am Harz.

Man unterscheidet nach der Art der tem-

porären Nα-Schutzgruppe zwischen Fmoc-

und Boc-SPPS, ein Wechsel Fmoc <-> Boc

während der Synthese ist nicht möglich.

Boc- und Fmoc-SPPS unterscheiden sich

auch in der Auswahl der Seitenketten-

schutzgruppen.

Wegen ihrer immensen Bedeutung für die

Bachem soll hier nur die Fmoc-SPPS näher

besprochen werden. Sie hat sich gegenüber

der billigeren Boc-SPPS wegen der milde-

ren Reaktionsbedingungen und der daher

besseren Qualität des Rohpeptides nicht

nur bei der Bachem durchgesetzt.

Wang-Harz (4-Alkoxybenzyl alcohol resin)

und 2-Chlortrityl-Harz (2-chlorotrityl chlo-

ride resin) sind die gebräuchlichsten Harze

Tabelle 12: Schutzgruppen für die Fmoc-SPPS

Gruppe Schutzgruppe Spaltreagenz Stabil gegen

Nα Fmoc Piperidin Trifl uoressigsäure

Seitenketten Boc, tBu, OtBu,

Trt, Pbf

Trifl uoressigsäure

(spaltet auch vom Harz)

Piperidin

Abb. 9: Unvollständige Kupplung.

Die Farbe zeigt nicht umgesetzte Amino-

gruppen an.

Abb. 8: Gequollene Harzkügelchen unter

dem Mikroskop.


20

Abb. 10: Synthese von H-3528 Ac-Asp-Arg-Gly-Asp-Ser-OH (Ac-DRGDS).

TBTU (Q-1665) ist ein gebräuchliches Kupplungsreagenz. Um die Fmoc-Aminosäure mit TBTU

zu aktivieren, muss man noch eine äquivalente Menge Base (DIPEA, Diisopropylethylamin)

dazugeben.

1. Piperidin/DMF

2. Waschritte

Abspaltung Fmoc

Piperidin muss komplett entfernt werden

3. Fmoc-Asp(OtBu)-OH

TBTU/DIPEA/DMF

4. Waschschritte

1. und 2. wie oben

werden im Überschuss eingesetzt

koplettes Auswaschen der Kupplungsreagentien

3. Fmoc-Gly-OH

TBTU/DIPEA/DMF

4. Waschschritte

1. und 2. wie oben

3. Fmoc-Arg(Pbf)-OH

TBTU/DIPEA/DMF

4. Waschschritte

1. und 2. wie oben

3. Fmoc-Asp(OtBu)-OH

TBTU/DIPEA/DMF

4. Waschschritte

1. und 2. wie oben

3. Acetanhydrid/Pyridin/DMF

4. Waschschritte

Endspaltung

95% TFA

Fmoc-Ser(tBu)-Wang-Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Wang-Resin

H-Ser(tBu)-Wang-Resin

Ac-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Wang-Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Wang-Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Wang-Resin

Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Wang-Resin

H-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Wang-Resin

H-Asp-Arg-Gly-Asp-Ser-OH

Rohpeptid

21

für die Fmoc-SPPS von Peptiden mit freiem

C-Terminus. Das Beladen des Harzes mit

der carboxyterminalen Fmoc-Aminosäure

ist nicht so einfach, daher bietet die Ba-

chem eine grosse Auswahl von beladenen

Harzen an. Man spaltet die Fmoc-Gruppe

ab (nur bei Wang-Harz) und kuppelt die

nächste Fmoc-Aminosäure. Die Vollstän-

digkeit der Kupplung wird mit Farbtests be-

stimmt (positiv: freie Aminogruppen werden

“angefärbt”; negativ: farblos, da es keine

freien Aminogruppen mehr gibt). Abb. 9

zeigt, wie der Test bei einer unvollständigen

Kupplung unter dem Mikroskop aussieht.

Da das Peptid am Schluss der Synthese

mit Trifl uoressigsäure vom Harz gespalten

wird, müssen auch die Seitenkettenschutz-

gruppen gegen diese Säure labil sein. Die

verwendeten Schutzgruppen sind in Tabelle

12 zusammengefasst.

Abb. 10 gibt ein Beispiel für eine SPPS eines

sogenannten RGD-Peptides .

Möchte man ein C-terminales Peptidamid

synthetisieren, braucht man ein anderes

Harz als im Beispiel, z.B. Ramage-Harz

D-2200 oder Rink amide AM-resin D-1675.

Nach Abspaltung von Fmoc vom Harz kup-

pelt man die C-terminale Fmoc-Aminosäure

drauf und verfährt weiter wie oben be-

schrieben.

Harze wie 2-Chlorotrityl-Harz oder SASRIN

erlauben es, auch vollgeschützte Peptid-

fragmente zu synthetisieren.

Lösungssynthese

Eine Lösungssynthese muss sorgfältig

geplant werden. Für die Fmoc-SPPS gibt

es Standardprotokolle, nach denen die

Synthese der meisten Peptide gelingt (wenn

auch die Qualität des Rohpeptids schlecht

sein kann), für die Lösungssynthese nicht.

Nicht nur bei den möglichen Schutzgrup-

penkombinationen, sondern auch bei

den Kupplungsmethoden, verwendeten

Lösungsmitteln und Aufarbeitungsmetho-

den herrscht bei der Lösungssynthese die

grössere Vielfalt.

Nicht jede denkbare Schutzgruppenkom-

bination funktioniert. Hat man sich auf

eine α-Aminoschutzgruppe (Z, Boc, Fmoc...)

festgelegt, hat man damit auch die Aus-

wahl an Seitenkettenschutzgruppen stark

eingeschränkt, vor allem, wenn man sie

alle in einem Schritt am Ende der Synthese

abspalten möchte.

Die Schutzgruppenkombination Fmoc/tBu

Boc-Ala-OH + H-Ala-Pro-OBzl

Boc-Ala-Ala-Pro-OH

+ H-Arg-pNA . 2 HCl

(die Salzbildung wirkt auch

als Seitenkettenschutz)

H-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA · HCl

Reaktion mit

Bernsteinsäure-

anhydrid

Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA

(wird als Acetat verkauft)

1. Kupplung mit DCC

(ein Kupplungsreagenz)

2. Entfernung von Bzl (Hydrierung)

1. Kupplung mit DCC/Base

2. Abspaltung von Boc

(mit Salzsäure)

Abb. 11: Synthese von L-1720 Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA in Lösung.


22

Abb. 12: Lösungssynthese, Kupplung mit Aktivester.

Boc-Ala-OSu + H-Glu(OBzl)-OBzl

Boc-Ala-Glu(OBzl)-OBzl

nicht wasserlöslich, löslich in

organischen Lösungsmitteln

HOSu

gut wasserlöslich

+

EXTRAKTION Abspaltung von Boc...

ist besonders effi zient und beliebt in der

SPPS, weil man die Gruppen selektiv und in

beliebiger Reihenfolge abspalten kann. Eine

vergleichbare Kombination in der Lösungs-

synthese ist Boc/Bzl bzw. Z/tBu, wie in

Tabelle 13 zusammengefasst.

Ein Beispiel für eine Lösungssynthese von

einem am C-Terminus modifi zierten Peptid,

ein sogenanntes Peptidsubstrat, fi ndet sich

in Abb. 11.

Das Beispiel zeigt auch den Nutzen des

Baukastenprinzips:

Das Fragment Boc-Ala-Ala-Pro-OH wird

auch in der Synthese von anderen Substra-

ten wie L-1180 (Boc-Ala-Ala-Pro-Ala-pNA)

und Inhibitoren wie N-1280 (MeOSuc-Ala-

Ala-Pro-Ala-chloromethylketone) verwen-

det.

Alle Zwischenstufen werden isoliert, cha-

rakterisiert und falls nötig gereinigt. Dies

kostet natürlich viel Zeit.

Man kann aber häufi g benötigte Fragmente

in grösseren Mengen auf Vorrat synthetisie-

ren und somit wieder Zeit sparen.

Peptide, die in Lösung synthetisiert worden

sind, werden oft per Gegenstromverteilung

(Counter-Current Distribution, CCD) gerei-

nigt. Mit dieser Methode kann man sehr

grosse Mengen aufs Mal reinigen, sie dient

aber meistens nur der Vorreinigung.

Im Beispiel wurde Boc als temporäre Nα-

Schutzgruppe verwendet. Generell werden

in der Lösungssynthese für den temporären

Schutz Boc oder Z eingesetzt.

Anstelle von einem Kupplungsreagenz

werden oft auch reaktive “Aktivester” von

geschützten Aminosäuren verwendet. In der

Lösungssynthese werden gerne Hydroxy-

succinimid-ester eingesetzt (Bachem: OSu,

Abb. 12).

Reinigung des Rohprodukts

Die Reiningung des Rohpeptids durch prä-

parative HPLC kann bei schlechter Qualität

sehr aufwendig werden. Speziell bei gro-

ssen Peptidmengen kann sich die Reinigung

Tabelle 13: Schutzgruppen für die Lösungssynthese

GruppeGruppe SchutzgruppeSchutzgruppe SpaltreagenzSpaltreagenz Stabil gegenStabil gegen

Nα Boc Trifl uoressigsäure katalytische Hyd-

rierung

Seitenketten

evtl. C-terminal

Bzl, OBzl, Z katalytische Hyd-

rierung

Trifl uoressigsäure*

Nα Z katalytische Hyd-

rierung

Trifl uoressigsäure*

Seitenketten

evtl. C-terminal

tBu, OtBu, Boc Trifl uoressigsäure katalytische Hyd-

rierung

C-terminal OMe** Basen TFA, katal. Hydrie-

rung

*nicht absolut stabil gegen Trifl uoressigsäure, aber genügend stabil für die Lösungssynthese. **der C-terminale Methylester wird häufi g bei mittleren Fragmenten eingesetzt. Bei Behand-

lung mit der Base Hydrazinhydrat erhält man aus dem Methylester das Hydrazid ( …-Xaa-

OMe → …Xaa-NHNH2). Dieses Derivat kann man „aktivieren“ (als Azid) und auf ein anderes

Fragment mit freiem N-Terminus kuppeln (“Azidkupplung”).

23

als Engpass erweisen.

Sowohl bei der CCD als auch bei der präp.

HPLC erhält man das gereinigte Peptid

als Lösung. Das Lösungsmittel wird auf

schonende Weise durch Gefriertrocknung

(Lyophilisation) entfernt und man erhält ge-

wöhnlich ein feines, weisses Pulver. Wasser

lässt sich praktisch nie komplett entfernen,

ist aber weder nötig noch sinnvoll.

Enthält ein Peptid basische Gruppen (N-

Terminus, Arg, Lys, His), bindet es Trifl u-

oressigsäure (per Fmoc-SPPS erhaltene

Peptide) oder Essigsäure als Salz. Diese

lässt sich nicht entfernen. Mit wenigen

Ausnahmen liegen unsere Katalogpeptide

als Trifl uoroacetate oder Acetate vor.

Disulfi dbrücken

Viele Peptide im Katalog haben den Zusatz

„Disulfi de bond“ im Namen. Eine solche

Bindung wird durch die Oxidation der

Thiolgruppen von zwei Cysteinen in der Pep-

tidkette gebildet. Bei der SPPS wird diese

Oxidation nach der Spaltung vom Harz, bei

der auch das Trt vom Cys abgespalten wird,

durchgeführt. Acm-Gruppen werden bei

gleichzeitiger Oxidation zur Disulfi dbrücke

mit Iod abgespalten.

Ein Peptid kann mehrere Disulfi dbrücken

enthalten. Disulfi dbrücken und die kor-

rekte Verknüpfung der Cysteinpaare (falls

es mehrere Brücken sind) sind äusserst

wichtig für die biologische Aktivität eines

Peptids. Peptide liegen nicht als langge-

streckte Ketten vor, sie bilden dreidimen-

sionale Strukturen, die durch Disulfi dbin-

dungen stabilisiert werden. Abb. 13 und 14

zeigen Beispiele.

• Eine Disulfi dbrücke enthalten:

z.B. Calcitonin, Somatostatin, Vasopres-

sin, Oxytocin (natürliche Peptidhormone);

Octreotide, Desmopressin (Hormonanaloge,

APIs)

• Mehrere Disulfi dbrücken fi nden sich in

z.B. in Endothelin (2), Conotoxin (3) GaTx1,

Hepcidin-25 (4) (Peptidhormone und Toxine)

• Zwei Peptidketten, durch Disulfi dbrücken

verbunden:

Insulin, Relaxine (Peptidhormone)

Abb. 13: omega-Conotoxin MVIIA.

Quelle: PDB 1OMG

Kohno, T., Kim, J. I., Kobayashi, K., Kodera, Y.,

Maeda, T. and Sato, K.

Three-dimensional structure in solution of

the calcium channel blocker omega-conoto-

xin MVIIA.

Biochemistry 34, 10256-10265 (1995)

Abb. 14: Humanes Relaxin (ein Hormon, hat

eine ähnliche Struktur wie Insulin).

Quelle: PDB 6RLX

Eigenbrot, C., Randal, M., Quan, C., Burnier, J.,

O‘Connell, L., Rinderknecht, E. and Kossia-

koff, A. A.

X-ray structure of human relaxin at 1.5 A.

Comparison to insulin and implications for

receptor binding determinants.

J. Mol. Biol. 221, 15-21 (1991)


24

Analyse von Aminosäuren und Peptiden

Nach SPPS, Reinigung und Lyophilisation

hat man ein weisses Pulver erhalten. Dieses

muss jetzt in der Analytik (Quality Control,

QC) genauer untersucht werden, um Ant-

worten auf folgende Fragen zu fi nden:

• Ist es überhaupt das gewünschte Produkt?

• Wie sauber ist das Produkt?

• Welche Nebenprodukte enthält es?

• Wie hoch ist der Produktgehalt?

Unseren QC-Abteilungen steht ein grosses

Arsenal an Geräten und Methoden zur Ana-

Abb. 15:

QCRF und ADS von

Fmoc-Phe-OSu.

einem Aminosäure-

derivat.

lyse unserer Produkte zur Verfügung. Die

Wahl der analytischen Methoden hängt

auch davon ab, um was für ein Produkt es

sich handelt: Eine Aminosäure, ein sehr

kurzes Peptid oder ein Peptid. Manche

Analysen werden auch extern durchge-

führt.

Identität

Ist es das gewünschte Produkt?

Dann entspricht ein gemessener Wert

der Literaturangabe oder dem Wert der

mit einer Referenz erhalten wurde.

Abb. 16:

QCRF und ADS von

Octreotid, einem

Peptid, das von der

Bachem auch als

pharmazeutischer

Wirkstoff hergestellt

wird.

25

Zur Feststellung der Identität dienen:

• Schmelzpunkt

• Optischer Drehwert [a] (vgl. S.8)

• Der Rf-Wert wird mit Dünnschichtchroma-

tographie (DC oder TLC) bestimmt:

Rf-Wert = Quotient Laufstrecke des

Substanzfl ecks/Laufmittelfront. Er hängt

vom Laufmittel ab

(Rf immer <1)

• Koelution mit Referenz (DC):

Mischung Produkt mit Referenz gibt einen

Fleck (und nicht zwei)

• Das Molekulargewicht wird per Massen-

spektrometrie bestimmt.

• Die chemische Zusammensetzung der

Verbindung wird per Elementaranalyse

bestimmt:

Man bestimmt den Gehalt an Kohlenstoff,

Wasserstoff und Stickstoff und vergleicht

diesen mit den Werten, die sich aus der

Summenformel CxH

yN

zO

wS

v.. berechnen

lassen. Sauerstoff wird nur ausnahmsweise

bestimmt. Im Haus kann auch Schwefel

bestimmt werden.

• Spektroskopische Methoden:

IR-, NMR-, UV-Spektroskopie, bei Amino-

säurederivaten (keine Standardmethoden!)

• Koelution mit Referenz (analytische

HPLC):

Hauptsächlich bei Peptiden.

• Aminosäurezusammensetzung:

Aminosäureanalyse (AAA), das Peptid

wird mit starker Säure in die einzelnen

Aminosäuren gespalten, die resultierende

Mischung wird chromatographisch aufge-

trennt und die Aminosäuren quantifi ziert.

Die Korrektheit der Aminosäuresequenz

lässt sich mit dieser Methode nicht über-

prüfen.

Reinheit

Die Reinheit wird bestimmt per:

• Dünnschichtchromatographie (DC), bei

Aminosäurederivaten,

sehr kurzen Peptiden, Biochemikalien:

Die DC ist eine oft unterschätzte Methode!

Man kann auch Referenzmaterial von po-

tentiellen Verunreinigungen, z.B. die Edukte,

mitlaufen lassen und hat eine grosse Aus-

wahl an Detektionsmethoden.

• Analytische Hochdruckfl üssigkeitschro-

matographie (analytische HPLC oder die

schnellere Variante RSLC): Standardmetho-

de bei Peptiden

• “Optische Reinheit”: Gehalt am falschen

Enantiomer, (s.S. 7).

Ein wichtiger Wert bei Aminosäurederivaten

und beladenen Harzen.

Produktgehalt

Neben während der Synthese entstande-

nen Verunreinigungen enthalten unsere

Produkte oft auch geringe Mengen Rest-

lösungsmittel und/oder Wasser. Peptide

enthalten meistens auch Trifl uoressigsäure

oder Essigsäure, die fest als Salz gebunden

Abb. 17: Spezifi -

kationen für das

von der Bachem

angebotene Trip-

torelin Pamoat.

TRIPTORELIN ACETATE DMF

H-4075-GMP, 4008442

Triptorelin Acetate is a synthetic decapeptide LHRH agonist. Continuous administration results in a sustained decrease

of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) secretion followed by a marked reduction of testicular

and ovarian steroidogenesis. The suppressive effect on gonadal steroid concentrations is indicated for the treatment of

hormone-dependent prostate cancer, endometriosis, central precocious puberty, and assisted conception.

Amino acid sequence Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, acetate salt

International non-proprietary names Triptorelin Acetate (USAN)

Triptorelin (INN; BAN)

(D-Trp6)-LHRH, acetate salt

Molecular formula, relative molecular mass C64

H82

N18

O13

· C2H

4O

2

1311.5 (net) + 60.1 (acetate) = 1371.6 (1)

CAS-Number [140194-24-7]

Bachem regulatory documentation Drug Master File (CTD)

Tests Specifications

Appearance white to off-white powder

Appearance of solution clear, colorless to slightly colored solution in water

(10 mg/ml)

Identification by TLC complies

Identification by HPLC complies

Identification by amino acid analysis Arg 0.9 - 1.1 His 0.9 - 1.1 Ser 0.7 - 1.0

Glx 0.9 - 1.1 Leu 0.9 - 1.1 Trp detected

Gly 0.9 - 1.1 Pro 0.9 - 1.1 Tyr 0.9 - 1.1

Specific optical rotation [α]D

20 (1% in 1% acetic acid) = - 69.0 ± 3.0°

(corrected for net assay)

(1) Triptorelin Acetate exists essentially as the monoacetate equivalent to 4.4% acetic acid. The acetic acid is mainly bound to the arginine

residue and, to a lesser degree, bound to the histidine residue. Its level depends on the final freeze-drying process.

GENERIC APIsWater content by Karl Fischer titration ≤ 7.0%

Acetic acid content by HPLC 3.0 - 8.0%

Assay by HPLC 95.0 - 105.0%

(water- and acetic acid-free substance)

Related substances by HPLC ≤ 0.5% D-Ser4-Triptorelin

≤ 0.5% D-Tyr5-Triptorelin and

Triptorelin free acid (combined peak)

≤ 0.5% D-Leu7-Triptorelin

≤ 0.5% each individual unknown

report each individual unknown ≥ 0.10%

≤ 1.5% total

Heavy metals by ICP-MS ≤ 1 mg/kg palladium

Residual organic solvents by GC ≤ 880 mg/kg DMF

≤ 5000 mg/kg n-butanol

Bacterial endotoxins (Ph. Eur. 2.6.14, USP <85>) ≤ 10 IU/mg

Microbial limit test (Ph. Eur. 2.6.12, USP <61>)

Total aerobic microbial count (TAMC)

Total yeasts and moulds count (TYMC)

≤ 103 CFU/g (0.5 g tested)

≤ 102 CFU/g (0.5 g tested)

Further Information

Additional solubility information 1% in water: clear, colorless solution

5% in water: clear, colorless solution

1% in 1% acetic acid: clear, colorless solution

5% in 1% acetic acid: clear, colorless solution

1% in PBS-buffer pH 7.2: not soluble

5% in PBS-buffer pH 7.2: not soluble

Handling and storage The product remains stable for at least 36 months when stored at

≤ -15°C or 2-8°C. Prolonged exposure to elevated temperatures

(> 25°C) and light should be avoided.

Active substance Triptorelin Acetate is a synthetic decapeptide analog of lutein-

izing hormone-releasing hormone (LHRH or GnRH) with a higher

potency than the naturally occurring LHRH.

Continuous administration of Triptorelin Acetate results, after a

short initial stimulation, in a sustained decrease in luteinizing hor-

mone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) secretion with

a consequent reduction of ovarian and testicular steroidogenesis.

These effects are usually reversible after cessation of therapy.

Fields of application

Treatment of prostate carcinoma Administration of Triptorelin Acetate leads to suppression of go-

nadotropins and a subsequent fall in peripheral circulating levels

of testosterone and dihydrotestosterone in male. In hormone-

dependent prostate carcinoma, a tumor remission or retardation

of tumor progression is frequently observed after treatment with

Triptorelin Acetate. This is accompanied by an improvement of

function and objective symptoms.

Management of endometriosis Continued administration of Triptorelin Acetate suppresses

estrogen secretion which results in a shrinking of the uterine and

ectopic endometrial tissue and in the relief from the symptoms of

abdominal pain, dysmenorrhoea, and menorrhagia.

Treatment of central precocious puberty Triptorelin Acetate reduces the premature stimulation of gonado-

tropin secretion in children with central precocious puberty and

allows normal physiological growth and development. Normal pu-

bertal development is resumed after discontinuation of Triptorelin

Acetate therapy.


26

ist. Diese Verbindungen werden mit den

Methoden, mit denen man die Reinheit des

gewünschten Produkts bestimmt, nicht

erfasst. Um z.B. einen Reaktionsansatz

zu berechnen, müssen Parameter wie der

Wassergehalt bekannt sein.

• Wassergehalt: Bestimmung mit Karl-

Fischer-Titration (KF-Titration).

• Restlösungsmittel: Bestimmung per Gas-

chromatographie.

• Essigsäuregehalt: Mit HPLC oder Ionen-

chromatographie.

• Rest-TFA, bei unseren API-Peptiden, die

als Acetat verkauft werden: per Ionenchro-

matographie

• Titration mit Säure- oder Basenlösungen:

Bei Produkten, die Basen oder Säuren sind.

• Halogenidbestimmung: Der Chlorid- oder

Bromidgehalt kann bei Produkten, die als

die entsprechenden Salze verkauft werden,

per Titration mit Silbernitratlösung be-

stimmt werden.

• Stickstoffgehalt (aus Elementaranayse):

Dieser ist bei Peptiden ein Mass für den

Peptidgehalt.

Die Ergebnisse der Analysen werden auf

dem QCRF (Quality Control Release Form),

welches nur für den internen Gebrauch

bestimmt ist, hinterlegt. Eine Auswahl der

erhaltenen Ergebnisse fi ndet sich auf dem

ADS (Analytical Data Sheet) das den Kun-

den, die das Produkt kaufen, zur Verfügung

steht (s. Abb. 15 und 16).

Bei GMP-Produkten kommen auch noch

mikrobiologische Analysen dazu, die bei

der Bachem in einem spezialisierten Labor

durchgeführt werden (s.Abb. 17)

Bei vielen unserer Generika sind die durch-

zuführenden Analysen durch die Europä-

ische Pharmakopöe* vorgeschrieben. Das

Pharm. Eur. im Namen bedeutet, dass die

Wirkstoffe den Spezifi kationen der Phar-

makopöe entsprechen. z.B. Deslorelin High

Acetate Pharm. Eur.

Modifi zierung von Peptiden

Die Modifi kation eines Peptides bedeutet

eine bleibende chemische Veränderung des

Moleküls, im Gegensatz zu den Schutzgrup-

pen, die nach der Synthese wieder abge-

spalten werden.

Peptide können auf verschiedenste Weise

modifi ziert werden.

Auch in der Natur fi ndet man eine grosse

Anzahl von Peptid/Proteinmodifi kationen.

Einige sind wichtig für die Bioaktivität oder

die Funktion des Moleküls (z.B. Pro im

Kollagen wird enzymatisch zu Hydroxyprolin

oxidiert; Seitenketten-Phosphorylierung

von Ser, Thr oder Tyr), andere sind “uner-

wünscht”, sogar Indikatoren für pathologi-

sche Prozesse.

Modifi kationen wie N-terminale Acety-

lierung oder Pyroglutaminbildung und

C-terminale Amidierung dienen auch in

der Natur zur Stabilisierung von Peptiden.

“Blockierte” Peptide werden weniger schnell

enzymatisch abgebaut.

Natürliche Peptidhormone sind häufi g an

den Endgruppen modifi ziert, z.B. Gona-

dorelin, TRH. Die C-terminale Amidgruppe

wird durch enzymatischen Abbau von einem

Glycinrest erhalten, ein anderes Enzym

katalysiert die Zyklisierung von Gln zu Pyr:

H-Gln-Xaa-Yaa-…-Zaa-Gly-OH

→ Pyr-Xaa-Yaa-…-Zaa-NH2

Da die Oxidation von Methionin (s.S.11) in

Peptiden häufi g zur Deaktivierung führt,

werden biologisch aktive Peptide durch den

Ersatz von Met durch das analog gebau-

te, aber nicht oxidierbare Norleucin (Nle)

stabilisiert.

Chemische Modifi kationen erlauben auch,

die räumliche Struktur eines Peptids zu

fi xieren oder zu verändern.

Bei der chemischen Synthese von Peptiden

hat man viele Möglichkeiten zur Modifi zie-

rung. Der N-Terminus lässt sich am ein-

fachsten verändern. Es braucht nur einen

zusätzlichen Schritt bei der SPPS.

Wichtige N-terminale Modifi kationen:

• Acetylierung

*Eine Pharmakopöe (Arzneimittelbuch) ist eine Zusammenstellung anerkannter pharmazeutischer Regeln über

die Qualität, Prüfung, Lagerung und Bezeichnung von Arzneimitteln und die bei ihrer Herstellung und Prüfung

verwendeten Stoffe, Materialien und Methoden. In der Schweiz gilt die Europäische Pharmakopöe.

• Biotinylierung - Biotin (= Vitamin B7)

(Im Katalog lassen sich viele Beispiele für

acetylierte und biotinylierte Peptide fi nden.)

Biotinylierte Peptide binden spezifi sch an

das Protein Avidin.

• “Fluorophore” - Mca, Abz, FITC

(Die modifi zierten Peptide fl uoreszieren und

sind in geringsten Mengen detektierbar.)

Auch die Seitenketten von Cys und Lys las-

sen sich leicht modifi zieren, hierfür fi nden

sich einige Beispiele im Katalog.

H-Lys(biotinyl)-Lys-Glu-Asp-Val-Val-Abu-

Cys-Ser-Abu-Ser-Tyr-Lys-Lys-NH2 (M-2130)

Das “Rückgrat” des Peptids lässt sich durch

Einbau von speziellen Aminosäuren verän-

dern:

• D-Aminosäuren

• N-Methyl-Aminosäuren

• Nicht-proteinogene Aminosäuren

(“unusual amino acids”)

• Ersatz der Peptidbindung durch andere

Bindungen (z.B. “reduzierte Peptide“)

• Ringschluss, z.B. Disulfi dbrücke (s.S.23)

Peptidamide, die wichtigste Modifi kation

der endständigen Carboxylgruppe, sind

leicht zugänglich per SPPS. Man syntheti-

siert sie auf einem der speziell dafür entwi-

ckelten Harze wie “Ramage-Harz” (D-2200).

Für andere C-terminale Modifi kationen

braucht es viel Aufwand.

Ein Beispiel für Modifi kationen:

natürliches Peptid

Leu-Enkephalin (H-2740)

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH

leicht modifi ziert

(3,5-Dibromo-Tyr1)-Leu-Enkephalin

(H-2575)

H-3,5-Dibromo-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH

Leu-Enkephalin amide (H-2745)

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-NH2

stark modifi ziert

DAMGO (H-2535)

H-Tyr-D-Ala-Gly-N-Me-Phe-glycinol

(D-Pen2,p-chloro-Phe4,D-Pen5)-Enkephalin

(H-8875)

H-Tyr-D-Pen-Gly-p-chloro-Phe-D-Pen-OH

Bachem AG, Hauptsitz in Bubendorf (Schweiz).

2011

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