W. EngewaldUniversität LeipzigInstitut für Analytische Chemie

Wie funktioniert die Gaschromatographie und was kann man damit machen?

Hochschule Zittau (FH)

17.11.2014

Anfänge der modernen ChromatographieMichail (Mikhail) Semenovich Tswett (1872-1919)

Russischer Botaniker und BiochemikerEigenschaften und Zusammensetzung von Chlorophyll

M.S. Tswett, (1906) Ber. Deut. Botan. Ges. 24: 319.

„Wird eine petrolätherische Chlorophylllösung durch eine Säuleeines Adsorptionsmittels durchfiltriert (ich verwendehauptsächlich Calciumcarbonat, welches in engen Glasröhrendicht gestampft wird), so werden die Farbstoffe gemäß derAdsorptionsreihe von oben nach unten in verschieden gefärbtenZonen auseinandergelegt, indem die stärker adsorbiertenFarbstoffe die schwächer zurückgehaltenen weiter nach untenverdrängen. Diese Trennung wird praktisch vollständig, wennman nach dem Durchgange der Farbstofflösung durch dieadsorbierende Säule einen Strom des reinen Lösungsmittelsherstellt. Wie die Lichtstrahlen im Spektrum, so werden in derCalciumcarbonatsäule die verschiedenen Komponenten einesFarbstoffgemisches gesetzmäßig auseinandergelegt, und lassensich darin qualitativ und auch quantitativ bestimmen. Ein solchesPräparat nenne ich ein Chromatogramm und die entsprechendeMethode chromatographische Methode”

Chromatographie-Apparatur von Tswett (1906)

Mikhail Semenovich TSWETT I

1872 – 1919Botaniker, Biochemiker

Studium in Lausanne und Genf : Biologie, Chemie, Physik1896 Promotion an der Universität Genfmit einer Arbeit zur Zell-Physiologie

1896 Rückkehr der Familie nach Russland:→ die in der Schweiz erworbenen

akademischen Grade werden nicht anerkannt

1901 St. Petersburg : 2. Masterarbeit(über Chlorophyll)

1901-1915 Warschau (Universität, Poly-technisches Institut)

Arbeiten über Farbpigmente1910 2. Doktorarbeit (in Kazan eingereicht)

Buch

1915 Evakuierung vor deutschen Truppen

Grundbegriffe der Chromatographie

IUPAC - Definition:Chromatographie ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, bei dem die

zu trennenden Substanzen zwischen zwei Phasen verteilt werden, von denen eine, die stationäre Phase, festliegt, während die andere, die mobile Phase, sich in einer bestimmten Richtung bewegt.

Stationäre Phase• bewirkt Verzögerung (Retention) der Komponenten• Feststoff oder Flüssigkeit (mit großer Oberfläche)

Mobile Phase• bewirkt Stofftransport• Gas (GC), Flüssigkeit (LC) oder überkritisches Fluid (SFC)• Transport durch Druck, Schwerkraft oder Kapillarkräfte

Detektor-signal

t

Klassifizierung chromatographischer MethodenAggregatzustand der mobilen Phase (Hauptkriterium)

Trennmechanismus (Separationsfunktion)• Adsorption• Verteilung• Ionenaustausch • Selektive Bindungen (Affinitäts-Chromatographie)• Ausschlusseffekte

Geometrie der Trennanordnung• Säule: Säulenchromatographie (gepackte Säule, Kapillarsäule)• Schicht auf ebener Unterlage: Planarchromatographie

(Dünnschichtchromatographie, Papierchromatographie)

Technik der ChromatogrammentwicklungElutions-, Frontal- oder Verdrängungstechnik

Mobile Phase Stationäre Phase Methode

Gasförmig Flüssig (GLC) – Verteilung

Fest (GSC) -Adsorption

Gaschromatographie

Flüssig Flüssig (LLC) Fest (LSC) Flüssigchromatographie

Gas Versorgung: hochreines Trägergas (He, H2, N2)Injektor: Probenaufgabe (gas, flüssig): mittels Mikroliterspritzen, Autosampler, GasventileTrennsäule: gepackte Säule oder KapillarsäuleSäulenofen: Thermostat ( 30 – 350 °C )Detektor: Universal oder elementspezifischDatenaufnahmesystem

Aufbau eines Gaschromatographen

Trennsäulen

• Innendurchmesser von 2 bis 4 mm • Säule ist vollständig mit Partikel gefüllt

Adsorbens → GSCTrägermaterial mit stationäre Phase (Flüssigkeit) belegt → GLC

•Säulenlänge nur 1 bis 6 m (Strömungs-widerstand)•Säulenmaterial: Kupfer, Stahl, Glas oder Quarzglas

Gepackte Säulen

• Innendurchmesser <1 mm • Stationäre Phase befindet sich auf der Innenwand der Trennsäule•Säulenlänge: 5 bis 100 m•Säulenmaterial: Glas (zerbrechlich), Fused silica (Quarz) aus hochreinem SiO2 mit äußerer Schutzschicht aus Polyimid (flexibel), fused silica beschichteter Edelstahl (hochtemperaturstabil)

Kapillarsäulen

2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00

50000100000150000200000250000300000350000400000450000500000550000600000650000700000750000800000

Zeit (min) →

Abun

danc

e

C 1

1:0

C 1

2:0 C

13:

0 C 1

4:0

C 1

5:0

C 1

6:0

C 1

7:0

C 1

8:0;

Kp

337°

C

C 2

0:0;

Kp

363°

C

C 2

2:0;

Kp

387°

C

C 1

4:1

C 1

5:1

C 1

6:1

C 1

7:1 C

18:

1

C 1

8:2

C 1

8:3C

18:

3C 1

8:1

C 2

0:1

C 2

0:2

C 2

0:3 C

20:

4

C 2

2:1

C 2

2:2

C 2

4:1

Injektor: KAS 4; 280°CTrägergas: Helium; konst. Fluß; 1,3mL/minSplit: 1:358Säule: high polarity cyanophase (10m x 0,1mm x 0,1µm)Temp.: 40°C; 43°C/min → 185°C; 9,5°C/min → 215°CDetektion: MS (35 - 350amu); TIC

Fettsäuremethylester-Standardgemisch

Liquid – Liquid Verteilung

Verteilung von Substanzen zwischen 2 nicht mischbaren Flüssigkeiten (Wasser / organ.Lösungsmittel) nach ihrer LöslichkeitGrundlage: Nernstscher Verteilungssatz:

W. Nernst, 1891:“Löst sich eine Substanz in zwei verschiedenen, nicht mischbaren Flüssigkeiten,so verteilt sie sich derart, daß das Verhältnis der Konzentrationen konstant ist.”

II

I

Ii

IIi

IIi

IIIIi

Ii

IIiD V

Vmm

VmVm

cc

K ⋅===)(

)(

)(

)(

)(

)(

//

KD Verteilungskoeffizient (Verteilungskonst.) für den Stoff Ici(I), ci(II) Konzentration des Stoffes I in Phase I bzw. IImi(I), mi(II) Menge des Stoffes in Phase I bzw. IIVI, VII Volumen der Phase I oder IIVI / VII Volumenverhältnis der Phasen (Phasenverhältnis β)

Wird die Konzentration in einer Phase verändert, so stellt sich das Gleichgewicht gemäß KD neu ein.

Gültigkeit des Nernstschen Verteilungssatzes:- bei geringen Konzentrationen- wenn die Stoffe in beiden Phasen nur in der gleichen Molekülart vorliegen

Prinzip der multiplikativen VerteilungTrennung zweier Verbindungen mit Verteilungskoeffizient K1 = 2,0 und K2 = 1,0

Modell:Betrachtung des kontinuierlichen Trennvorgangs als Folge vonEinzelschritten

Zerlegung der Trennsäule in Segmente (Trennstufen, theoretische Böden),in denen jeweils eine Gleichgewichtseinstellung zwischen stationärer undmobiler Phase erfolgen soll:

mobile Phasestationäre Phase

Trennstufe (theoretischer Boden)Volumenverhältnis der Phasen β = VM / VS = 1

Verteilungskoeffizient K = cstat / cmob

K1 = 2,0 = 2:1 α = K1 / K2 = 2K2 = 1,0 = 1:1

Prinzip der multiplikativen Verteilung72 µg Verbindung 1 K1 = 2,072 µg Verbindung 2 K2 = 1,0

Start 72 72

1. Gleichgewichtseinstellung

Transport

2. Gleichgewichtseinstellung

Transport

3. Gleichgewichtseinstellung10,6 9 10,6 18 2,7 921,4 9 21,4 18 5,3 9

16 18 8 1832 18 16 18

16 18 8 1832 18 16 18

24 3648 36

24 3648 36

Multiplikative VerteilungFolge vieler nichtstationärer Verteilungsvorgänge zwischen stationärer und mobiler Phase (erfordert schnellen Stofftransport)Aufenthalt in der stationären Phase (Retention) erfolgt entsprechend der Verteilungskonstante Ki

Der chromatographische ProzessTheoretische Boden (Trennstufe): gedachter Längsabschnitt, der für eine Gleichgewichtseinstellung benötigt wird.

Molekulare Diffusion

Diffusion (diffundere (lat.): ausbreiten, sich zerstreuen)Durchmischung von verschiedenen miteinander in Berührung befindlichen gasförmigen,flüssigen oder festen Stoffen durch Bewegung der Ionen, Atome, Moleküle oder Kolloid-teilchen hervorgerufen durch Konzentrations-, Temperatur- oder Druckunterschiede bzw.durch äußere Felder.Bei der durch Konzentrationsunterschiede bewirkten Diffusion (Transportdiffusion) bewegensich mehr Moleküle vom Gebiet mit hoher Konzentration, zu einem Gebiet mit niedrigerer Konzentration bis überall die gleiche Konzentration erreicht ist:

Molekulare Diffusion: Zufällige Bewegung von Molekülen in fluiden Medien (Selbstdiffusion)

Diffusionskoeffizient D (m²/s)In binären Systemen ist der Teilchenfluß dem Konzentrationsgradienten direkt proportional

dn/dt = -D(dc/dx) (1. Ficksches Diffusionsgesetz)

Die Proportionalitätskonstante D ist ein Maß für die Wanderungsgeschwindigkeit (pro Einheits-fläche transportierter Stoffmenge) und wird als binärer Diffusionskoeffzient bezeichnet.

hohe Konzentration niedrige Konzentration

Trennsäulen in der Gaschromatographie

Gepackte Säule

a) dünner Film einer Flüssig-

keit auf der Oberfläche

eines Trägermaterials

b) Feststoffpartikel

a) Verteilungb) Ad ti

Filmkapillare (WCOT)

dünner Film einer hoch-siedeten Flüssigkeit an der Innenwand

Verteilung (Löslichkeit)

Schichtkapillare (PLOT)

Adsorbensschicht an der Innenwand

Adsorption

Bezeichnung

Stationäre Phase

Retentionsmechanismus

DimensionenL

Kapillaren aus Fused Silica (FS)

1979 R. Dandeneau und E.H. Zerenner (Hewlett-Packard):Kapillaren aus synthetischem Quarz

Vorteile:• weniger als 1 ppm Metalloxide (Glas > 5%)

wesentlich inerter als Glas• dünne Wandstärke (0,05 mm)

flexibel leichter Einbausehr empfindlich äußere Schutzschicht erforderlich

Stationäre Phase

Fused Silica

Äußere Schutzschicht: Polyimid (15-20 µm)

Probe: Kalmusöl

A: Kapillarsäule, OV-150m x 0.3mm ID

B: gepackte Säule4 m x 3mm ID, 3% OV-1 Gaschrom Q 60/8(Kieselgur, Diatomeenerde)

Aus P. J. Baugh (Ed.)Gas Chromatography, Oxford 1993

Vergleich gepackte versus Kapillarsäule

Silikonphasen (Polysiloxane)

Polymere Silikonphasen (Polysiloxane, exakt Poly(organosiloxane))• bestehen aus langen, flexiblen Ketten (Silikonöle, Silikongummi;Molmasse zwischen 5000 und 2 000 000) mit einer helikalen Struktur

• sind die wegen ihrer Vorteile am meisten verwendeten stationären Phasenin der GC

Vorteile• hohe chemische und thermische Stabilität ( hohe Arbeitstemperaturen,geringes Bluten)

• hohe Diffusionskoeffizienten der Analyten (geringer CS-Term)• niedrige Glasübergangstemperatur ( großer Temperaturbereich)• geringe Oberflächenspannung ( gute Filmbildung)• geringe Abnahme der Viskosität mit steigender Temperatur• definierte Struktur und chemische Vielfalt: durch Synthese aus Bausteinenmit verschiedenen funktionellen Gruppen lassen sich Phasen mit unter-schiedlichen Polaritäten / Selektivitäten herstellen(Stabilität bei symmetrisch substituierten Si-Atomen am größten: z.B. Diphenylstatt Methyl-Phenyl)

Si

CH3

CH3 n

O

Polydimethylsiloxan Poly-diphenyldimethylsiloxan

O Si

CH 3

CH 3 n

OSi

m

Poly(cyanopropylphenyl-dimethyl)siloxan

O Si

CH3

CH3 n

OSi

(CH2

m

CN

3)

Strukturen von Silikonphasen

Poly(methylphenyl)siloxan

Poly(trifluoropropylmethyl)siloxan

Si O

nCH3

Si O

nCH3

(CH2)2

CF3

Fettsäuren FS (Fatty acids FA)Natürlich vorkommende Fettsäurenvorwiegend unverzweigte Monocarbonsäuren mit einer geradenAnzahl von C-Atomen (meist zw. C12 und C22)

• Gesättigte Fettsäuren

• Einfach ungesättigte Fettsäuren: cis/trans

• Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (polyunsaturated fatty acids PUFA):nicht konjugierte Doppelbindungen; meist in cis-Anordnung und durch eine Methylengruppe voneinander getrennt (methylene-interrupted MI)

Position der Doppelbindungen

• Δ-Nomenklatur: Nummerierung vom Carbonylende ausgehend

• n- oder ω-Nomenklatur: Nummerierung vom Methylende ausgehendbei MI PUFA wird nur Position der ersten Doppelbindung angegeben

• Häufigste PUFA-Familien: n-3 (Linolensäure-Familie)n-6 (Linolsäure-Familie)

Hochtemperatur-GC der Butter - Triglyceride

Stationäre Phase

Polysiloxan: 100% Methyl

T Summe der C-Atome in den Seitenketten

50 % Phenyl

65 % Phenyl

p Palmitinsäures Stearinsäureo Ölsäure

Säule: 25 m x 0,25 mm ID x 0,1 µm df250 – 365°C mit 5 K/min

Trägergas: 1 ml / min H2Injektion: PTV-Injektor, 60 – 400°C, 8 µl,

split 1:40Detektor: FID bei 420°C

S.R. Lipsky, M.L. Duffy 1986

Nomenklatur von mehrfach ungesättigten Fettsäuren

n-6

n-3

n-6

Δ5

Δ9

Δ9

20:4 n-6 Arachidonsäure

18:3 n-3 Linolensäure

18:2 n-6 Linolsäure

All-cis-5,8,11,14-EicosatetraensäureC19H31COOH

All-cis-9,12,15-OctadecatriensäureC17H29COOH

All-cis-9,12-OctadecadiensäureC17H31COOH

COOH

COOH

COOH

FAMEs: Säulenpolarität und Retention I

Polysilphenylen-siloxanphasemit 5% Phenylsubstitution

(BPX 5)100 – 340°C mit 10°C/min

mit 60% Cyanopropylsubstitution

(BPX 60)100 – 280°C mit 10°C/min, 5 min bei 280°C

Säulen: 30m × 0,25mm ID × 0,25µm dfHelium (1,5 mL/min constant flow)

C18 C20

C18 C20 C22C21

aus: Chromatographia Suppl. Vol. 63, 2006, S61-S66

FAMEs: Säulenpolarität und Retention II

mit 80% Cyanopropylsubstitution

(BPX 80)

Polysilphenylen-siloxanphasemit 70% Cyanopropylsubstitution

(BPX 70)

Säulen: 30m × 0,25mm ID × 0,25µm dfHelium (1,5 mL/min constant flow)Säulentemperatur: 100 – 280°C (5 min) mit 10°C/min

aus: Chromatographia Suppl. Vol. 63, 2006, S61-S66

C18 C20 C21 C22

C18 C20 C21 C22 C23

Gas Versorgung: hochreines Trägergas (He, H2, N2)Injektor: Probenaufgabe (gas, flüssig): mittels Mikroliterspritzen, Autosampler, GasventileTrennsäule: gepackte Säule oder KapillarsäuleSäulenofen: Thermostat ( 30 – 350 °C )Detektor: Universal oder elementspezifischDatenaufnahmesystem

Aufbau eines Gaschromatographen

Dosiertechnik

Probenaufgabe in Kapillar-GC

Probenaufgabe (Injektion, Dosierung)Ziel: Schnelles Einbringen der Probe (oder eines repräsentativen Teils)auf den Säulenanfang

als schmale Substanzzone ohne Veränderung der stofflichen Zusammensetzung (keine Diskriminierung, Adsorption oder Zersetzung)

Probleme bei Kapillarsäulen• kleine Probemengen (0,1 – 100 ng/Komponente)

Manipulation geringer Probemengen• starke Volumenvergrößerung beim Übergang von der Flüssig- in die

Dampfphase (100 – 250 fach)• geringer Volumenfluß der mobilen Phase

lange Verweil- und Überführungszeit

Es gibt keine universelle Probenaufgabetechnik in der KGCIn Abhängigkeit von analytischer Aufgabenstellung sowie Eigenschaften der Probe (Analyt/Matrix) kommen unterschiedliche Dosiervorrichtungen und Dosiertechniken zur AnwendungProbe: gasförmig Gasdosierventil, Gasspritze

flüssig ) Spritzendosierung von Lösungenfest ) Lösungsmittelfreie Dosiertechniken

Lösungsmittel Kp °C MW g/mol QMol(Kp.)* µl Dampf von 1µl Liquid #

i-Octan (2,2,4-TMP)

99 114 30,8 110

n-Hexan 69 86 28,9 140

Toluol 111 92 33,2 170

Essigsäureethyl-ester

77 88 31,9 185

Aceton 56 58 29,1 245

Dichlormethan 40 85 28,1 285

Acetonitril 82 41 29,8 350

Methanol 65 33 35,2 450

Wasser 100 18 40,7 1010Agilent Flow Calculator: http://www.chem.agilent.com/caq/servsup/usersoft/main.html#Flowcalc205* Molare Verdampfungsenthalpie beim Siedepunkt in kJ/mol# bei 250 °C & 20 psi

Volumenvergrößerung beim Verdampfen

Aufbau eines Split/splitlos-Injektors

Spritze

Silikon-septum

Ofengehäuse

Splitausgang (Abfall)

Kapillarsäule

Beheizter Glas-Liner

Trägergas

Metallscheiben mit Führungslöchern

• Beheiztes Stahlrohr (Verdampfungskammer)

• Wechselbares Glas- oder Quarzrohr (Liner, Insert)

• Auswechselbares Septum aus Silikongummi

• Anfang der Kapillarsäule reicht in den Liner (Ort der Probenteilung)

• Splitventil: Aktivkohlefilter mit Nadelventil

• Septumspülung: Kleiner Spülstrom am Septum vorbei

• Pneumatik für Trägergas-Regelung

Verdampfungsinjektion mit Strömungsteilung: Split-Injektion

Spritze

Silikon-septum

Ofengehäuse

Splitausgang (Abfall)

Kapillarsäule

Beheizter Glas-Liner

Trägergas

Metallscheiben mit Führungslöchern

• Injektion von 0,1 - 1µL der flüssigen Probe in die Verdampfungskammer (Liner) des beheizten Injektors

• Verdampfung und Vermischung der Probedämpfe mit Trägergas

• Teilung des Gasstromes/ Probedämpfe in 2 ungleiche Anteile:

→Kleiner Anteil (1-10%) auf Säule

→Großer Anteil in Splitausgang

• Splitverhältnis (10:1 … 100:1) kann durch Nadelventil reguliert werden

1042

100

2

Splitverhältnis 50:1

KGC : Injektoren und Dosiertechniken für flüssige Proben

Injektor Dosiertechnik

Split/splitless –Injector Verdampfungsinjektion im heißen Injektor(Split/splitlos-Injektor) (beheizte Verdampfungskammer) und

Überführung des Probedampfes auf Säulenanfanga) mit Strömungsteilung : splitb) ohne Strömungsteilung : splitless

On-column-injector Cold-on-column-injection :Dosierung der flüssigen Probe direkt in die kalteKapillarsäule bzw. Vorsäule (retention gap)

PTVTemperaturprogrammierter PTV : programmiert heiz- und kühlbarer Verdampfungs-Injektor, split/splitlos - Injektorprogrammed Dosierung der Probe in den kalten Injektor mittemperature vaporizer, nachfolgendem schnellen Aufheizen; Überführung Kaltaufgabesystem des Probedampfes auf die Säule mit bzw. ohne

Gasstromteilung oder Entfernung des LM-Dampfes

Ethanolbestimmung in Blut (BAK)

1920 E.M.R. Widmark : „isotherme Destillation“Blutprobe wird in einem Spezialgefäß 1 Stunde auf 60 °C erwärmt,flüchtige Substanzen gelangen in eine Vorlage mit Bichromatlösung,Ethanol wird oxidiertRücktitration des nicht verbrauchten Bichromateswenig spezifisch (oxidierbare Substanzen)

1962 G. Machata (Universität Wien) : GC mit FIDBlutprobe wird auf gepackte Vorsäule dosiert, beim schnellen Aufheizengelangen flüchtige Verbindungen auf Trennsäule, während unverdampfbareRückstände auf Vorsäule verbleibenPackung der Vorsäule muss periodisch ausgewechselt werden

1962 A. C. Curry et al : Headspace – GC

1967 G. Machata und Bodenseewerk Perkin Elmer & Co, Überlingen : F- 40erstes automatisches System für Headspace-GC auf Messe ACHEMAin Frankfurt / M vorgestellt Problem : präzise und reproduzierbare Überführung der Analyten vom Dampfraum der Probengefäße in GC-Säule : balanced–pressure sampling

Prinzip der statischen HS-GC

1. Thermostatisierung der Probe in einem verschlossenen Gefäß bei höherer Temperatur(unterhalb der Siedetemperatur der Analyten)

⇒ Verteilungsgleichgewicht der flüchtigen Verbindungen zwischen Probe und Gasphase

2. Entnahme eines aliquoten Gasvolumens aus dem Dampfraum und Überführung in den GC mittels - gasdichter Spritze- pneumatischer Dosiervorrichtung(Gleichdruck- oder Konstantdruck-Dosierung)

3. Kalibrierung zur quantitativen Analyse interner oder externer Standard, Aufstockung

Headspace-GC HSGC

Headspace-GC-Vial

GC-Verfahren zur BAK-Bestimmung

• Headspace-Gaschromatographie nach MACHATA• Statische HSGC mit 22 ml Vials; GC-Detektor: FID• Serumprobe mit internem Standard (tert-Butanol)

versehen, erhitzt und Aliquot des Dampfraumes über Probe wird injiziert

• Ergebnis wird nach Umrechnung Serum ⇒ Blut als Blutalkoholkonzentration in ‰ (=g Ethanol/kg Blut) angegeben

Ethanolnachweis

• 2 unterschiedliche Methoden Vorschrift– ADH-Verfahren und GC-Verfahren– oder 2 x GC-Verfahren auf 2

verschiedenen Geräten mit unterschiedlich polaren Säulen

• jeweils Doppelbestimmungen (4 Einzelwerte)

• von unterschiedlichen Bearbeitern durchgeführt

g(THM) im gechlorten Trinkwasser

mittels HS-GCHeadspace-Probenahme:10 ml Probe im 22 ml-Gefäß30 min bei 70°C thermostatiert;nicht gerührt; noch kein Gleichgewichtpneumatische Dosierung: „Gleichdruckmethode“; 150 kPa H2; 0,1 min

GC-ECD:Säule: HP-624 (60 m x 0,32 mm ID; 1,8 df) (6 % Diphenylcyanopropylsiloxan)Temperaturprogramm: 6 min bei 45 °C, mit 10 °C/min bis 150 °C, 2 min bei 150 °C

ECD bei 300°C mit 60 ml/min N2 als

CHCl3(1,7

µg/L)

1,1,1-Trichloret

han

Trichlorethen

CHCl2Br(2,8

µg/L)

CHClBr2(4,4

µg/L)CHBr3

(3,2 µg/L)

Kp 61°C 87 °C 120 °C 148°C

Trihalomethane (THM) im Trinkwasser• Trinkwasser-Chlorung:

Desinfektion von Rohwasser mit Chlor bzw. chlorhaltigen Desinfektionsmitteln

aber: 1974 wurden in USA und Niederlande Chloroform u.a. Trihalogenmethanverbindungen im Trinkwassergefunden

• Bildung von „Desinfektions-Nebenprodukten“ (DNP)• viele Grund- und Oberflächenwasser enthalten

wasserlösliche organische Verbindungen (Huminstoffe, „gelöster organischer Kohlenstoff“ DOC)

• Chlor als Desinfektionsmittel reagiert auch mit natürlichen organischen Wasserinhaltsstoffen:

- Oxidation, elektrophile Substitution und Additionz. B. „Haloformreaktion“ (Einhorn-Reaktion) ⇒ CHCl3

- Oxidation anderer Halogenionen aus entsprechenden Salzen:

Abkürzung Name Anwendung/ SelektivitätWLD (TCD) Wärmeleitfähigkeitsdetektor

(thermal conductivity)universell

FID Flammenionisationsdetektor Organische Verbindungen (C, H)NPD Stickstoff/Phosphor Detektor Stickstoff-, phosphorhaltige

Verbindungen

ECD Elektroneneinfangdetektor (electron capture)

Halogenhaltige Verbindungen

FPD Flammenphotometrischer Detektor

Schwefelhaltige Verbindungen

PID Photoionisationsdetektor AromatenHID Heliumionisationsdetektor Gase

FTIR Fourier Transformation Infrarot Detektor

AED AtomemissionsdetektorMS Massenspektrometer

(MSD – mass selective detector)

Kopplungstechniken

GC-Detektoren

Meßprinzip: Wärmeleitfähigkeit des reinen Trägergases in einer Referenz-Zelle wird mit der Wärme-leitfähigkeit des Gasgemisches aus Trägergas und Analyt in einer Messzelle verglichen (Differenzprinzip).

Absenkung der Wärmeableitung führt zu Temperatur und damit Widerstandserhöhung am Heizdraht.

Universeller DetektorKonzentrationsempfindlicher DetektorHäufig Verwendung von Helium oder Wasserstoff als Trägergas (hohe Wärme-leitfähigkeit).

Wärmeleitfähigkeitsdetektor - WLD

• Wasserstoff-Luft-Flamme brennt am Ende einer Düse im elektrischen Feld

• Analyten werden mit Trägergas in die Flamme eingespeist

• Analyten werden in der Flamme thermisch gespalten, wodurch Radikale und in Folgereaktionen Ionen und Elektronen entstehen, die einen Strom erzeugen

• Heteroatome verringern den Response

Brenngase, H2 und Luft müssen sehr rein sein

FID: Universeller Detektor für organischeVerbindungen (C-C, C-H Bindungen)Weiter lineare Bereich (107)Niedrige Nachweisgrenzen (ca. 0.1ng) Exzellente Stabilität

Flammenionisationsdetektor - FID

Menschliche Nase als Detektor zur Erkennung geruchsaktiver Stoffe in komplexen Proben (Extrakte, Headspace) „Schnüffeldetektor“, sniffing portPrinzip:Geruchliche Beurteilung der getrennten Komponenten durch Abriechen des Gasstromes aus der Säule simultan zur instrumentellen Detektion

Olfaktometrischer Detektor (GC-O)

• Strömungsteiler• beheizte Transferle• Schnüffeltrichter• Spülgas• befeuchtete Luft

Aufbau• Gasstromteilung am Ende der Trennsäule

a) GC-Detektor : meist FID oder MSb) geheizte Transferleitung zu einem „Schnüffeltrichter“

•Einspeisung von Spülgas (make-up Gas)→ beschleunigter Transfer

•Zumischen von befeuchteter Luft→ verhindert Austrocknung der Nasenschleimhäute

(erhält Sensitivität)

Mitteilung der Geruchswahrnehmung : wann, was, wie stark ?

• Geruchsintensität : schwach … sehr stark→ Tastatur oder Potentiometer :

Signalaufzeichnung, solange Geruch wahrgenommen wird: → Olfaktogramm (Aromagramm)

• Geruchsbeschreibung : Ansage (2. Person oder Head Set)z. B. etherisch, blumig, minzig, faulig, fischig, seifig, stechend …

Olfaktometrischer Detektor II

Gas chromatography – olfactometry (GCO)

Detlef Ulrich, JKI ÖPV

GC-O : Olfaktogramm (Aromagramm)

Detlef Ulrich, JKI ÖPV

Extrakt von Früchten der Salakpalme : Schlangen(haut)frucht

J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 1637

GC mit biologischem Detektor

Pheromone : Botenstoffe der InsektenA.Butenandt (Nobelpreis 1939)untersuchte in 50er Jahren die Sexuallockstoffe des Seidenspinners (bombyx mori): Weibchen sendet Substanz aus, die die Männchen ingroßer Entfernung anlockt→ Extrakte aus den Drüsen der Weibchen→ Problem : welche Verbindung(en) wirkt(en) als Lockstoff(e) ?

E. Bayer, F. Anders 1959 : Biologische Objekte als Detektoren zur GCNaturwissenschaften 46, 380 (1959)in einer Kammer am Ende der GC-Säule wurde ein Seidenspinner-männchen plaziert→ keine Reaktion bei Elution der meisten Verbindungen→ Erregung, wirbelnder Tanz bei Elution einer Verbindung Butenandt : Strukturaufklärung(E,Z)-10,12-Hexadecadien-1-ol (Bombykol)

Massenspektrometrie (MS)Massenspektrometrie:

• Erzeugung gasförmiger Ionen aus der Probe• Trennung dieser Ionen entsprechend ihrem Verhältnis von Masse zu Ladung m/z

im Hochvakuum• Detektion dieser Ionen

Massenspektrum:• Darstellung der (relativen) Intensität der getrennten Ionen als Funktion des m/z-

Verhältnisses

Massenspektrometer• wichtigste Komponenten eines Massenspektrometers

Einlaßsystem Ionenquelle Detektor Computer

Proben-einführung

Erzeugung von gasförmigen Ionen

Trennung der Ionen entsprechend ihrem Verhältnis m/z

Detektion der Ionen

Gerätesteuerung Datenspeicherungund -verarbeitung

VakuumsystemTrennsystem

Ion SourceIon Source

AnalyzerAnalyzer(Mass Filter)(Mass Filter) Electron Electron MultiplierMultiplier

GC/MSEI/Quadrupole

column

vacuum

lenses

repeller

filament

• Electrons fragment compounds into positively charged species in the EI mode• Fragments are separated based upon mass/charge

Electron Impact (EI) Mass Spectrum of Hexane

Mass spectrum of hexane (70 eV) Fragmentation of hexane

“Electron Impact” – Mass Spectra

n-Octane C8H18 MW 114

2,2,4-Trimethyl pentane (iso octane) C8H18 MW 114

Größe der Peaks ist Menge der Komponenten in der Probe proportional

Auswertung1. Ermittlung der Peakgröße

Analog-Digital-WandlungMessung der Peakhöhe oder Integration der Peakfläche

2. Kalibrierung und Umrechnung der Peakflächen in Konzentrationen Methoden:• Flächen-Normalisierung (innere Normierung, 100 %-Methode)• Flächen-Normalisierung mit Response-Faktoren• Externe Kalibrierung/Standard• Interner Standard/Kalibrierung (mit Fremdsubstanz)• Standardaddition (Aufstockung, interner Standard mit

analyseneigener Substanz, Spiking)Analyse

Vermeidung bzw. Minimierung der Fehlerquellen in allen Schritten der Analyse

Quantitative Analyse

20 µL Probe

Zugabe interner Standard (Norvaline, 10µL)

Zugabe von Wasser zur Verdünnung der Probe

Zugabe von Propanol and NaOH Lösung, Vortex

Zugabe des Derivatisierungsmittels (Propylchloroformat), Vortex

Zugabe organisches Lösungsmittel zur Extraktion (Isooctan), Vortex

Nach Phasenbildung Injektion eines Aliquot aus der oberen organischen Phase

O

O

Cl+NH2 HR

O OH

NH HR

OO

OO

-CO2

-2 HCl2

cat.

Automatisierte Aminosäureanalyse mittels GC-MS

Automatisierte Aminosäureanalyse mittels GC-MS

Autosampler und Roboter• Autosampler

Ursprünglich zur automatisierten Dosierung flüssiger Probenin GC, HPLC usw.

• Kombination von Autosampler und xyz-RoboterZur Automatisierung komplexer Abläufe (in Steuersoftware des GC eingebunden); vielseitig einsetzbar:– Extraktionstechniken:

Head-space-Extraktion, SPE, SPME, SBSE, in-tube SPME– Probenvorbereitung

Heizen, Kühlen, Schütteln, Filtrieren, Verdünnen, Aufkonzentrieren, Spülen, Derivatisieren (Reagenzzugabe), Zugeben von Standards

– ProbenaufgabeLiquidinjektion LVI Thermodesorption Pyrolyse

4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

Time

Abundance

Tryp

toph

an

Tyro

sine

Hyd

roxy

lysi

ne

His

tidin

eLy

sine

Orn

ithin

e

Glu

tam

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ic a

cid

Amin

oadi

pidi

c ac

id

Phen

ylal

anin

eG

luta

mat

eH

ydro

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hion

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Asp

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teG

luta

min

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Aspa

ragi

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rolin

eSe

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Thre

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o-Le

ucin

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cine

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NVa

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Gly

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Cys

tine

Cys

tath

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ne

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hydr

oxyp

rolin

e

Gly

cine

-pro

line

Säule: ZB-AAA, 15 m x 0.25 mm ID, 0.1 µm df, 70°C (1 min) – 30°C/min - 300°C (5 min), He, 1.1 mL/min, Injektion: PTV split 1:15, 2.5 µL bei 50°C (0.5min) - 12°C/sec bis 320°C (5 min), Detektion: Simultan SCAN und SIM, Scanbereich: 50-420 m/z, SIM: bis zu 3 ions pro Analyt

Metaboliten-ProfilanalyseUntersuchung sehr komplex zusammengesetzter biologischer und medizinischer Proben→ Große stoffliche Vielfalt (viele Verbindungsklassen),

weiter Polaritätsbereich→ Großer Konzentrationsbereich

Erfassung möglichst vieler Stoffwechselprodukte in einem Analysenlaufbekannte und unbekannte/unerwartete Verbindungenniedermolekulare Verbindungen

Bestimmung der relativen Konzentrationsänderungenvon veränderten Proben (Umwelteinflüsse, gentechnische Manipulation) im Vergleich zu parallel genommenen Referenzproben(keine absolute Konzentrationsbestimmung!)

Anforderungen an Analysenmethode:schnell (hoher Probendurchsatz), empfindlich, automatisiert, reproduzierbar, robust

Metaboliten-Profilanalyse von PflanzenblätternProbe Pflanzenblätter (ca. 20-50 mg)

Extration Sequentielle Extraktion mit Methanol u. ChloroformZugabe von Wasser zu vereinigten ExtraktenFraktionierung in

Polare Fraktion Lipophile Fraktion

Derivatisierung Oximierung Transmethylierung(Autosampler/Roboter) (mit O-Methylhydroxylamin-

hydrochlorid)

Trimethylsilylierung Trimethylsilylierungmit MSTFA mit MSTFA

GC-TOF-MS

MultivariateDatenanalyse

Hydroxysäuren, Aminosäuren, Zucker, Zuckeralkohole, org. Monophosphate, (Poly-)Amine, Aromatische Säuren

Fettsäuren, Fettalkohole, Sterole, Phenole, aliphatische Verbindungen

nach O. Fiehn, J. Kopka, W. Weckwerth et al., MPI für Molekulare Pflanzenphysiologie

Unpolare StandardsäuleTemperaturprogramm

RetentionsindicesSpektren-Deconvolution

Weckwerth et al. 2001 Proc. ASMSWeckwerth et al. 2004 PNASWeckwerth et al. 2004 ProteomicsBoldt et al. 2005 Plant CellMorgenthal et al. 2005 MetabolomicsMorgenthal et al. 2005 Biosystems

aliphaticsalcoholsacids

HO -acids NH2 -acids

monosacch..fatty acids

sugar ~phosph..~alcohols

disacch..HO-fatty acids

trisacch..sterols

aliphaticsalcoholsacids

HO -acids NH2 -acids

monosacch..fatty acids

sugar ~phosph..~alcohols

disacch..HO-fatty acids

trisacch..sterols

Gas Chromatography coupled to Time of Flight Mass SpectrometryGC-TOF-MS

>600 detectable compounds ~100-200 chemically identified structures W. Weckwerth

Aminosäuren, organische Säuren, Alkohole

Monosaccaride Freie Fett-säuren

Di- und TrisaccarideSteroide

20 µL menschlicher Harn wurden mit Urease zur Entfernung von Harnstoff behandelt, anschließend wurden Proteine mit kaltem Ethanol ausgefällt, der Überstand getrocknet und dann mit MEOX und MSTFA derivatisiert.

10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00

5000000

1e+07

1.5e+07

2e+07

2.5e+07

3e+07

Time

Abundance

10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00

5000000

1e+07

1.5e+07

2e+07

2.5e+07

3e+07

Time

Abundance

Metabolitenmuster im Harn

OSi

OSi

NH

ONH

O

*

m

Chirasil-L-Val

(Frank, Nicholson, Bayer 1977)

V. Schurig / J. Chromatogr. A 906 (2001) 275 –299

Trennung aller proteinogenen Amonisäuren nach Derivatisierung auf Chirasil-Val

Landegerät „Philae“ (Rosetta Lander)

http://d1jqu7g1y74ds1.cloudfront.net/wp-content/uploads/2014/09/philae.jpg

Rosetta - Mission

Rosetta - Mission zum Komet 67P• 03/2004: Start der europäischen Raumsonde „Rosetta“ zum Komet

Tschurjumov-Gerassimenko (67P) in 480 km Entfernung• 08/2014: nach 6,4 Mrd. km wurde in eine elliptische Umlaufbahn des

Kometen eingeschwenkt• 12.11.2014: Landung des Landegerätes „Philae“ auf Kometenoberfläche

Benannt nach Stein von Rosetta (Rosetta-Stein):Fragment einer steinernen Stele von 196 v. Chr. mit einer Inschrift in3 versch. Sprachen, 1799 im Nildelta bei ägyptischer Stadt Rosettagefunden ermöglichte gemeinsam mit einem Tempelobelisk von der Nil-Insel Philae die Entzifferung der ägyptischen Hieroglyphen

Kometen – Schweifsterne im Sonnensystem:• bestehen aus Gestein, Staub und Eis: km – große „schmutzige Schneebälle“

leuchtender Schweif (Koma) durch Gas und Staub bei geringerer Entfernung zur Sonne durch Ausgasung und Staubwolken

• entstanden am Anfang unseres Sonnensystems vor ca. 4,5 Mrd. Jahrenwertvolle Erkenntnisse erwartet („Urmaterie“ u.a.)

Landegerät „Philae“ (Rosetta Lander)

12 verschiedene Messgeräte an Bord, darunter

• unterschiedliche Spektrometer

• 2 miniaturisierte GC/MS zur Untersuchung des Bodens und

der Atmosphäre: a) allgemeine Suche nach

organischen Verbindungen

b) Suche nach enantiomeren Aminosäuren:Automatische Extraktion, Derivatisierung und Trennung an 3 verschiedenechiralen Trennsäulen

http://www.cnes.fr/automne_modules_files/standard/public/p11223_35fa30dcb12db70a044488566f7f8096philae_david_ducros.png

http://www.esa.int/var/esa/storage/images/esa_multimedia/images/2013/12/philae_s_instruments_black_background/13466951-4-eng-

Gaschromatographie IMethode der Wahl für die Trennung flüchtiger VerbindungenDampfdruck der Analyten bei Säulentemperatur > 0,1 torr;Säulentemperaturen bis 350 °C

Begrenzte AnwendbarkeitThermisch stabile, verdampfbare Verbindungen (unpolar, schwach polar): MW < 600 (1000) Dalton Kp < 500°C C-Zahl < 50

Erweiterung des Anwendungsbereiches durch• Derivatisierung polarer Verbindungen zu weniger polaren, flüchtige

Derivaten• Definierte thermische Zersetzung der Probe und GC der flüchtigen

Pyrolyseprodukte: Pyrolyse-GC

☺ Übergang in die Gasphase ist elegante Möglichkeit zur Abtrennung der Analyten von unverdampfbarer bzw. schwerflüchtiger Probematrix

DosierungVerschiedene Injektoren und Techniken zur• Dosierung von verdünnten Lösungen: splitless, cold on-column, PTV• Dosierung großer Probenvolumina (LVI)• Lösungsmittelfreie („trockene“) Dosierung

Gaschromatographie II• Hohes Trennvermögen

Kapillarsäulen: L = 25-60mPeakkapazität: 100 – 500(...1000)

N = 100.000 – 300.000 α > 1,02

Temperaturprogrammierte Arbeitsweise → Proben mit weitem Siedebereich

• GC/MSKopplung von 2 „Gasphasentechniken“MS als universal- oder massenselektiver Detektor zur Identifizierung und Quantifizierung (schnell, robust, nachweisstark, großer linearer Bereich)⇒ leistungsfähige und konkurrenzlose Kombination zur A l flü hti

Wichtige Anwendungsgebiete der GC I

• Kohlenwasserstoffanalytik: Erdölraffinerie, PetrolchemieRaffineriegas (LPG; C1 – C5/C6) ⇒

Durchbruch der GCPetrolchemische Grundchemikalien

Prozeß-GCKomplexe KW-Gemische (z.B. Benzin)

• IndividuenanalyseKapillar-GC

• Stoffgruppenanalyse (z.B. PONA, C3 – C12)Mehrsäulentechnik

Wichtige Anwendungsgebiete der GC II

• Geruchs- und Aromastoffe (Flavours), Ätherische Öle„alles, was riecht“

⇒ unerwartet viele Inhaltsstoffe in Ätherischen Ölen

⇒ Erkennung von Verfälschungen

• Umweltanalytik: Wasser, Boden, Luft, Nahrungsmittel• Pestizid-Rückstände in Pflanzen, Tieren,

Nahrungsmitteln⇒Rückstandsanalytik ⇒ Electron Captur

D t t ECD

Derivatisierung in der GC

Chemische Derivatisierunggezielte chemische Veränderung der Probe

Veränderung der Funktionalität der Analyten

Ziele der Derivatisierung

Verbesserung / Ermöglichung der

a) Chromatographierbarkeit:Überführung nichtflüchtiger / polarer / ionischer / labiler / reaktiver Verbindungen in flüchtige / stabile Derivate (Beseitigung aktiver H-Atome)meist Silylierung, Alkylierung, Acylierung

b) Detektierbarkeit (Spurenanalyse):Einführung gut detektierbarer Gruppen oder Elemente zur Anwendung selektiver Detektorenz.B. Einführung von Fluoratomen ECD

MS / NC / GC-AED

Mückenplage, Botenstoffe und GC I

• Problem:

→ Verhalten von Insekten wird durch Botenstoffe gesteuert

• Botenstoffe (Signalstoffe, Semiochemicals):

Warum werden manche Menschen häufig von Mücken gestochen und andere gemieden?

Mückenplage, Botenstoffe und GC II

• Welche flüchtigen Verbindungen werden von Menschen über die Haut freigesetzt?→ Sammlung von „Körperessenz“ von

Versuchspersonen mit unterschiedlicher Affinität zu Mücken

1. Versuchspersonen werden in Al-beschichteten Beuteln eingepackt und gereinigte Luft darüber geleitet, die anschließend über Adsorbentien geführt wird

2. Extraktion der Adsorbentien mit hochreinen Lösungsmittel

Mückenplage, Botenstoffe und GC III

• Welche Verbindungen der „Körperessenz“wirken als Signalstoffe für Mücken?→ Kombination der GC mit

elektrophysikalischen Techniken:GC mit Teilung des Gasstromes am Ausgang der Trennsäule und Paralleldetektion:a) GC-Universaldetektor: FID oder MS →

Substanzerkennungb) „Antennographischer“ Detektor → biologische

Wirkung

Verknüpfung der Antennen von Mücken mit Mikroelektroden→ Wenn Geruchssensor der Mücke durch eine

Mückenplage, Botenstoffe und GC IV

• Resultat• Annahme: Für Mücken attraktive

Personen produzieren Stoffe, die Mücken anlocken

• Ergebnis: Für Mücken unattraktive Personen produzieren Stoffe, die eine abstoßende Wirkungausüben (Interferenzen bei der Suche nach attraktiven Oberflächen)besonders wirksam: 6-Methyl-5-hepten-2-on

Geranylaceton

N

O

N

O O O

N,N-Diethyl-m-toluamid(DEET)

(E)-N-Cyclohexyl-N-ethyl-2-hexenamid

6-Methyl-5-hepten-2-on Geranylaceton

aus: Chemistry World, Sept. 2010, 44-47

Testosteron – gedopt oder körpereigen?Testosteron-DopingDoping mit Testosteron und seinen Prohormonen

fördert Muskelwachstum (Kraft) und Aggressivitätbeschleunigt Erholung nach Training/Wettkämpfenschwer nachweisbar

GC/MS-Nachweis von Testosteron in Urinnach Extraktion und Derivatisierung (Trimethylsilylierung)→ Erlaubt keine Unterscheidung, ob Testosteron vom Körper selbst

synthetisiert oder durch Doping von außen eingeführt wurde, da Testosteron-Gehalt individuell sehr unterschiedlich

T/E-QuotientDonike: Verhältnis Testosteron/Epitestosteron (Stereoisomeren von T;

kein Stoffwechselprodukt von T) ist bei meisten Menschen relativ konst.)

T/E>6 wird als positiv bewertet, wenn dieser Wert deutlich oberhalb desindividuellen T/E-Referenzbereiches des Athleten liegt

Substanzspezifische Isotopenanalytik: KGC-Combustion-IRMS (13C/12C)

GC/MS-Nachweis von Testosteron im UrinDerivatisierung: Trimethylsilylierung

O

OH

H

H

H

MSTFA/TMIS

O

O

H

H

H

(CH3)3Si

Si(CH3)3

MSTFA N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoroacetamid

TMIS Trimethyliodsilan(als Katalysator, stärkster TMS-Donator)

• Ketogruppe wird in Enol-Tantomeres umgewandelt und der enolische Silylether gebildet (aber: Enol-TMSether sind thermisch und hydrolytisch nicht sehr stabil)

• Das aus dem TMIS gebildete Iod wird mit Ethanthiol zu HI reduziert (unter Bildung von Diethyldisulfid)

Bis-TMS-Ether(Enolether)

F3CC N

OSi(CH3)3

CH3

Multikomponenten-Analyse

Rückstandsanalytik in Lebens- und Futtermitteln Verschärfte Bestimmungen :→ Nachweis einer steigenden Anzahl von Analyten

in immer geringeren Konzentrationenin immer komplizierteren Matricesin kurzer Zeitbei möglichst geringen Kosten

MultimethodenSpurenanalyse einer möglichst großen Anzahl von Zielverbindungen (targets) in einem Analysenlauf

Anforderungen• empfindliche , einfache, schnelle Methoden

HPLC-MS oder GC-MS im SIM-ModusHPLC-MS/MS oder GC-MS/MS im MRM-Modus

möglichst viele MRM-Übergänge in einem Lauf

• einfache und möglichst universelle Probenvorbereitungz. B. QuEChERS: aber Extrakte enthalten noch Probenmatrix

GC von Zuckern und Zuckeralkoholen

2

1 Mannitol

2 Sorbitol

3 a, b Fructose I+II

4 Galactose I

5 Glucose I

6 Glucose II + Galactose II

7 Salicin (ISTD)

8 Saccharose

9 Lactitol

10 a, b Lactose I +II

11 Maltitol

12 a, b Maltose I +II

13 a, b Isomalt I +II

14 a, b Maltotriose I +II

Derivatisierung: 1) Oximbildung mit Hydroxylaminhydrochlorid/Pyridin2) Trimethylsilylierung mit BSTFA (N,O-Bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid)

Säule: ZB-5 (30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm Film)Injektion: split/splitless-Injektor, 250°C; 1µl (H2O/CH3OH) Split 1:30Trägergas: Helium,1,5 ml/min, constant flowOfentemperatur: 40°C-2 min/ 4°C/min/ 180°C/ 10°C/min/310°C-10 minDetektor: FID

1

2

3

4 5

6

78 9 10

11

12

13 14

Bratwürste im Test

Stiftung Warentest (2010) 19 gebrühte Bratwürste verschiedener

Anbieter getestet:• Sensorische Bewertung vor und nach dem Grillen

• Fleischqualität:- Anteil Muskelfleisch- Anteil Bindegewebe- Fettgehalt- Nachweis von ZNS-Gewebe…

• Mikrobiologische Qualität- Hefen- Schimmelpilze- Milchsäurebakterien…

Hintergrund: BSE, ZNS und SRM

• BSE-Krise: 2000/2001 RinderseucheBSE: Bovine Spongiforme Enzephalopathie, Rinderwahn

• schwammförmige Veränderung des Gehirns:Gleichgewichtsstörungen, Krämpfe

• zuerst in GB aufgetreten (Verfütterung von Tiermehl auserkrankten Schafen an Rinder)

• auf Menschen übertragbar (Creutzfeldt-Jacob-Krankheit)• SRM - Spezifiziertes Risikomaterial: Gewebe des zentralenNervensystems (ZNS: Gehirn, Rückenmark) von Rindern, Schafen undZiegen, die älter als 12 Monate sind (potentielle Träger des Erregers)

• EU - Verordnung (EG) Nr. 999/2001: Vorsorge für VerbraucherSRM darf nicht in Fleischerzeugnisse gelangen

Muss während der Schlachtung entfernt und beseitigt werdenKontrolle erforderlich: Bestimmung von Tierart und Tieralter zumZeitpunkt der Schlachtung

Nachweis von SRM in Fleischerzeugnissen

• Immunchemische (ELISA) und molekularbiologische (PCR)VerfahrenZum Nachweis von ZNS-Markersubstanzen (Cholesterin, bestimmteProteine und deren m-RNA)ABER: Ist evtl. nachgewiesenes ZNS-Material tatsächlich Risikomaterial?

Bestimmung von Tierart und Tieralter erforderlich

• GC/MS-Analyse von ZNS-typischen Fettsäuremustern• Nachweis von ZNS-typischen Fettsäuren (Fatty Acids - FA):Cerebronsre. isomere Tetracosensäuren Hydroxytetracosensäure2-OH-C24:0 C24:1ω9, C24:1ω7 C24:1ω9-OH, C24:1ω7-OHAus ihren Verhältnissen können Tierart und –alter bestimmt werden

• ZNS-typische FA liegen als komplex gebundene Lipide vorErfordert mehrstufige Probenvorbereitung und Derivatisierung

GC/MS-Analyse von ZNS-typischen Fettsäuren I

Mehrstufige ProbenvorbereitungZNS-typische FA liegen als komplex gebundene Lipide vor erfordert:

• Extraktion aus Fleischer-zeugnissen

• Abtrennen der Matrix sowie der freien FA, einfachenLipide, Triglyceride …

• Anreicherung• Derivatisierung

• kalte LM-Extraktion mit n-Hexan/MeOH• SPE (supelclean LC-Si) mit n-Hexan/MePropOH gewaschen, Elution mitMeOH

• Zugabe interner Standard• Abdampfen des LM• Methylierung FAME (methanol. HClbei 90°C,1,5h)

• Trimethylsilylierung Hydroxy-FA(TMSIM in DMF bei 100°C, 5min)

• In Hexan aufnehmen

Zeitaufwand: ca. 8 Stunden

GC/MS-Analyse von ZNS-typischen Fettsäuren II

GC/MSSäule: DB5 30m x 0,32mm x 0,25µmTemperaturprogramm:MS-Detektion im SIM-Modus

Auswertung1. Erkennung von ZNS

Cerebronsäure C24:0-OH dient als Markersubstanz für ZNSExterne Kalibrierung, MatrixkalibrierungSchwellwert (cut-off): 2,43 mg/kg = 0,2% ZNS-Gehalt

2. Tierartendifferenzierung (bei ZNS-positiven Proben) Charakteristische Peakflächenverhältnisse der ZNS-FA für Rind, Schafund Schwein:A: C24:1ω9/C24:1ω7 B: C24:1ω9-OH/C24:1ω7-OH C: A/B

3. TieralterdifferenzierungMit zunehmendem Alter steigen die Verhältnisse A und B an

18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.0050000

100000150000200000250000300000350000400000450000500000550000600000650000700000750000800000

Retentionszeit [min]

Sign

alhö

he

IS C22:0 d 2,2

C24:1(n-9)

C24:1(n-7)

C24:0

2OH-C24:1(n-9)

2OH-C24:1(n-7)

2OH-C24:0

2OH-C25:0

2OH-C26:1(n-9)

2OH-C26:1(n-7)

2OH-C26:0

SIM-Chromatogramm der Fettsäuremethylester aus einem Schafhirn

Derivatisierung: Veresterung mit MeOH /HCl; Silylierung der Hydroxyfettsäuren mit TMSIM GC: 30 m HP-5MS , 0,32 mm ID, 0,25 µm df

1 µl splitlos (Split 1:15 nach 1 min)Helium (constant flow 1,5 ml/min, v = 32 cm/s)Temperaturprogramm

MS: SIM-ModusFAME RT [min] Ionen [m/z]

Zeitfenster

ab: [min]

C22:0 2,2-D2 19,0 76, 145 18,6

C24:1n9c 22,0 348 21,0

C24:1n7c 22,1 348 21,0

C24:0 22,474, 143, 339,

38222,4

C24:0-OHsil 26,4 73, 411, 455 25,0

M. Grießbach et al „Species and age determination of central nervous system tissue by fatty acid patterns“, J Chromatogr A, 1179 (2008) 69-73

21.90 22.00 22.1021.80

C24

:1ω

9c

Schaf

Schwein

Rind

Retentionszeit [min]

rel.

Sign

alhö

he [%

]

25

0

50

75

100

C24

:1ω

7c

Retentionszeit (min)

rel.

Sign

alhö

he (%

)

Tierartdifferenzierung mit spezifischem FAME-Verhältnis

Aus den integrierten Flächen der SIM-Chromatogramme wurde das Flächenverhältnis der FAME C24:1ω9c zur FAME C24:1ω7c gebildet. Dieses Verhältnis hat für jede der drei untersuchten Tierarten einen spezifischen Wert.

F. Hartmann et al „Ernährung mit Köpfchen – Nachweis von Hirnzusätzen in Fleischerzeugnissen mittels GC-MS“, GIT Spezial Separation 2007

GC und GC/MS in Pharmaanalytik

„Klassische Qualitätskontrolle“Verunreinigungen über 0,05 % in pharmakologisch wirksamen Substanzen(active pharmaceutical ingredients - API`s)

Restlösemittel in pharmazeutischen Produkten : OVI organic volatileimpurities→ Einteilung der LM nach ihrem toxikologischen Risiko in 3 KlassenAllergene Verbindungen

Suspected Allergenes in Essential Oils, Flavours, Fragrances :Substanzliste („Q6-Verbindungen“)Deklarationspflicht , wenn über 0,001 % (10 ppm) für „leave-on“ Produkte

(verbleiben auf der Haut)0,01 % (100 ppm) für „rinse-off“ Produkte

( werden wieder abgespült)

Gentoxische und mutagene Verbindungen in pharmazeutischenProdukten2006 : Grenzwert für gentoxic impurities (GI´s): max. 1,5 µg pro Person und TagListe von Substanzgruppen (z.B. Alkylsulfonate)

PharmaverpackungenExtractables & Leachables (E&L) aus Primärverpackungen von pharma-zeutischen Formulierungen

1ppm = 1mg/kg^