Wundauflagen aus natürlichen rohstoffen mit regulierbarer ... · 11a. No. of Pages Report 46 11b....

August 2006

Wundauflagen aus natürlichen rohstoffen mit regulierbarer therapeutika-freisetzung

für chronische Wunden

Abschlussbericht zum Verbundvorhaben

Förderkennzeichen des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF): 0330463

Zeitraum: 01.03.2003 bis 28.02.2006, bewilligte Verlängerung bis 31.08.2006

Berichtszeitraum: 01.07.2003 - 31.08.2006

Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF)

KliniKen lUDWiGSBURG-BietiGheiM gGMBh

Posilipostraße 4 · 71640 Ludwigsburg

Ausführende Stelle: Krankenhaus Bietigheim · Abteilung für Unfall- und Wiederherstellungschirurgie

teilvorhaben 2: humanbiologische und klinische prüfung der neuen Wundauflage

Abschlussbericht der Kliniken Ludwigsburg-Bietigheim gGmbH zum Verbundvorhaben

Wundauflagen aus natürlichen Rohstoffen mit regulierbarer therapeutika-Freisetzung für chronische Wunden

Beginn: 01.03.2003 · Ende: 28.02.2006 Bewilligte Verlängerung bis 31.08.2006

Abschlussbericht zum Verbundprojekt

BMBF-nr. 0330463

von

Christoph Marquardt

Janina von Seydlitz-Kurzbach

BEKLEidUnGSPHySioLoGiSCHES inStitUt HoHEnStEin E.V.

Wundauflagen aus natürlichen rohstoffen

mit regulierbarer therapeutika-freisetzung

für chronische Wundenteilvorhaben 2:

humanbiologische und klinische prüfung der neuen Wundauflage

6

WUndAUfLAGEn AUS nAtürLiCHEn roHStoffEn Mit rEGULiErBArEr tHErAPEUtiKA-frEiSEtzUnG für CHroniSCHE WUndEn

6

die grundlegenden in vitro Untersuchungen zur klinischen Wirksamkeit der neuen Wundauflage erfolgten durch folgende Mitarbeiter der Kliniken Ludwigsburg-Bietigheim gGmbH:

Mitarbeiter funktionBeschäftigt

seitBeschäftigungsgrad Verg.-Gruppe

dr. med. C. Marquardt Arzt, Physiker 01.07.2003 20% BAt ib

J. v. Seydlitz-Kurzbach Biotechnologin 01.09.2003 75% BAt iii

n. Berner technische Assistentin 01.08.2003 100% BAt Vii

A. nödinger technische Assistentin 01.11.2003 100% BAt Vb

Aufgrund der zeitdiskrepanz zwischen Kick-off-Meeting vom 01.03.2003 und der Einstellung der Mitarbeiter beginnend am 01.07.2003 sollten die Arbeitsziele auf die daten der Arbeitsaufnahme der Mitarbeiter korrigiert werden.

die Arbeitsziele konnten dennoch zeitgerecht erreicht werden.

Ludwigsburg, 31. August 2006

dr. med. Christoph Marquardt dipl.-ing. (fH) Janina v. Seydlitz-Kurzbach(Projektleiter 1. 7. 2003 - 30. 6. 2005) (Projektleiterin 1. 9. 2005 - 31. 8. 2006)

7


*) Auf das Förderkennzeichen des BMBF soll auch in der Veröffentlichung hingewiesen werden. BMBF-Vordr. 3831/03.99

Berichtsblatt

1. ISBN oder ISSN geplant

2. Berichtsart Schlussbericht

3a. Titel des Berichts Wundauflagen aus natürlichen Rohstoffen mit regulierbarer Therapeutika-Freisetzung für chronische Wunden

3b. Titel der Publikation geplant

4a. Autoren des Berichts (Name, Vorname(n)) Marquardt, Christoph; v. Seydlitz-Kurzbach, Janina

4b. Autoren der Publikation (Name, Vorname(n)) geplant

5. Abschlussdatum des Vorhabens 31.08.2006

6. Veröffentlichungsdatum geplant

7. Form der Publikation Broschüre

8. Durchführende Institution(en) (Name, Adresse)

Kliniken Ludwigsburg – Bietigheim gGmbH Posilipostraße 4 71640 Ludwigsburg

13. Fördernde Institution (Name, Adresse)


53170 Bonn

9. Ber. Nr. Durchführende Institution

10. Förderkennzeichen*)

033046311a. Seitenzahl Bericht 46

11b. Seitenzahl Publikation geplant

12. Literaturangaben 35

14. Tabellen 1

15. Abbildungen 29

16. Zusätzliche Angaben

17. Vorgelegt bei (Titel, Ort, Datum)

18. Kurzfassung

Ziel des Forschungsvorhabens war die Entwicklung einer regulierbar Therapeutika freisetzenden Wundauflage zur Behandlung chronischer Wunden. Als Therapeutikum wurden Sekretions- und Exkretionsprodukte der Fliegenmade der Goldfliege Lucilia sericata gewonnen und untersucht. Testsysteme für die antimikrobielle, proteolytische und proliferative Aktivitätsbestimmung dieser Produkte wurden entwickelt. Das Madenprodukt wurde funktionell analysiert und anschliessend in Kombination mit den einzelnen Bestandteilen der Wundauflage – Zellulosehohlfilament, Zellulase – und der Wundflüssigkeit (Wundsekret oder Wundexsudat) auf Wechselwirkungen getestet. Ein mit Madenprodukt befüllter Hohlfilament-Prototyp wurde mit Zellulase und Wundsekret auf proteolytische und proliferative Aktivität getestet. Es konnte nach Etablierung und Anwendung von 5 Testsystemen keine antimikrobielle Aktivität der Madenprodukte nachgewiesen werden. Dies steht im Widerspruch zu bisherigen, zum Teil zweifelhaften Publikationen. Eine weitere Untersuchung der antimikrobiellen Wirkung wurde im Rahmen des internen Statusseminars vom 29.10.04 im Konsensus aller beteiligten Projektpartner ausgeschlossen. Enzymatisch und proliferativ aktive Madenprodukte konnten vom Organismus gelöst und konserviert werden. Madenprodukte blieben in Mischungsversuchen mit Wundexsudat und dem Biokatalysator Zellulase in ihren enzymatischen und proliferativen Eigenschaften aktiv. Die enzymatische und proliferative Wirkung der Madenprodukte konnte in Vorversuchen auf verschiedene herkömmliche Wundauflagen übertragen und ungeregelt wieder freigesetzt werden. In den Hohlfilament–Prototypen konnte aktives Madensekret in die Filamente eingebaut und die nekrolytische Eigenschaft des Sekretes durch Auflösung mittels des Biokatalysators Zellulase wieder reaktiviert werden.

19. Schlagwörter Lucilia sericata, Madenprodukt, antimikrobielle, proteolytische und proliferative Aktivität, Hohlfilament-Prototyp

20. Verlag 21. Preis

8


8

BMBF-Vordr. 3832/03.99

Document Control Sheet 1. ISBN or ISSN planned

2. Type of Report Final report

3a. Report Title wound dressings with adjustable release of therapeutics for the treatment of chronic wounds made of renewable resources

3b. Title of Publication planned

4a. Author(s) of the Report (Family Name, First Name(s)) Marquardt, Christoph; v. Seydlitz-Kurzbach, Janina

4b. Author(s) of the Publication (Family Name, First Name(s)) planned

5.End of Project August 31st, 2006

6. Publication Date planned

7. Form of Publication Brochure

8. Performing Organization(s) (Name, Address)

Kliniken Ludwigsburg – Bietigheim gGmbH Posilipostraße 4 71640 Ludwigsburg

13. Sponsoring Agency (Name, Address)


53170 Bonn

9. Originator’s Report No.

10. Reference No. 0330463

11a. No. of Pages Report 46

11b. No. of Pages Publication planned

12. No. of References 35

14. No. of Tables 1

15. No. of Figures 29

16. Supplementary Notes

17. Presented at (Title, Place, Date)

18. Abstract

The aim of the project was the development of an adjustable therapeutic releasing wound dressing for the treatment of chronic wounds. As therapeutic substance the secretion- and excretion products of the blowfly maggot Lucilia sericata were extracted and analysed. Test systems to detect the antimicrobial, proteolytic and proliferative activities of these products were developed. The maggot product was analysed functionally and interactions with the separate parts of the wound dressing – cellulose hollow fibres, cellulase – and the wound fluid, respectively were tested. The proteolytic and proliferative activity of a hollow fibre prototype filled with maggot product was tested in combination with cellulose and wound fluid.

After the development and application of 5 test systems no antimicrobial activity of the maggot product could be demonstrated. This is a disagreement or antithesis to previous publications. The members of the status meeting (29.10.2004) decided to exclude further antimicrobial analysis.

Maggot products with enzymatic and proliferative activity could be separated from the organism and preserved. Maggot products in combination with wound fluid and cellulase kept their enzymatic and proliferative activities.

The enzymatic and proliferative effects of the maggot products could be transfered on different conventional wound dressings and be released unregulated. Maggot product could also be filled into the hollow fibres of the prototype and dried. The proteolytic activity could be re-activated after dissolving the fibres with cellulase.

19. Keywords

Lucilia sericata, maggot product, antimicrobial, proteolytic and proliferative activity, hollow fibre prototype

20. Publisher 21. Price

�


Inhaltsverzeichnis

Danksagung................................................................................................................................... 11

Zusammenfassung.........................................................................................................................12

Kurzdarstellung..............................................................................................................................13

1.. Versuche.und.Ergebnisse....................................................................................... 14

i. Beschaffung der Ausgangsmaterialien und Etablierung der experimentellen Versuchsaufbauten ......................................................................................14

I.1 Gewinnung von humanem Wundexsudat .............................................................................14

I.2 Gewinnung von Madenprodukten in Zusammenarbeit mit den Firmen POLYMEDICS und NEOCURA als Produzenten von sterilen therapeutischen Maden der Gattung Lucilia sericata ........................................................................................................15

I.3 Anlegen von L929 Maus-Fibroblastenkulturen und Etablierung des Proliferationstests mittels ATP-Nachweis ...............................................................................17

I.4 Etablierung des Suspensionstests nach Norm JIS L 1902 mit Bakteriensuspensionen und des Live/Dead Tests zum Nachweis der antimikrobiellen Wirkung ...................................19

I.5 Etablierung des quantitativen enzymatischen Nachweises von Trypsin (TRP) und der Leucin – Aminopeptidase (LAP) als klinisch relevantes Proteolysemodell ................................24

ii. Wirkung der Einzelkomponenten (zellulase, Wundexsudat, Madenprodukt) auf nekrolytische Potenz und proliferative Wirkung .....................................................................28

II.1 Bestimmung der Wirkung auf Fibroblasten als Ausdruck der Stimulation der Wundheilung (Proliferation) ............................................................................................28

II.2 Bestimmung der proteolytischen Enzymaktivität als Ausdruck der Wundreinigung durch Nekrolyse ...........................................................................................28

iii. Bestimmung der Wechselwirkungen der Einzelkomponenten ................................................30

III.1 Wechselwirkung zwischen Wundexsudat und dem Biokatalysator Zellulase ...........................30

10


10

Inhaltsverzeichnis

III.2 Wechselwirkung zwischen Biokatalysator und Produkten von Lucilia sericata ........................34

III.3 Wechselwirkung zwischen Produkten von Lucilia sericata und den Abbauprodukten der Zellulose ..............................................................................................36

III.4 Wechselwirkung zwischen Madenprodukt in Wundauflagen und Wundexsudat ...................37

2.. Diskussion..............................................................................................................40

3.. Voraussichtlicher.Nutzen,.insbesondere.der.Verwertbarkeit.des..Ergebnisses.im.Sinne.des.fortgeschriebenen.Verwertungsplans.........................42

4.. Bekannt.gewordener.Fortschritt.auf.dem.Gebiet.des.Vorhabens.. bei.anderen.Stellen................................................................................................43

5.. Bereits.erfolgte.und.geplante.Veröffentlichungen.des.Ergebnisses....................43

6.. Literatur..................................................................................................................44

11


Danksagung

Wir danken dem Bundesministerium für Bildung und forschung für die finanzielle förderung des Vorhabens (BMBf-Vorhaben nr. 0330463) im förderprogramm „integrierter Um-weltschutz in der textilindustrie“.

für die Begleitung in fachlichen und administra-tiven fragen sei dem Projektträger Jülich (PtJ), ins-besondere frau Birgit George, herzlich gedankt.

Ebenfalls danken wir unseren Projektpartnern für die enge Kooperation und ihre engagierte zusam-menarbeit.Alle Mitarbeiter, die mit unermüdlichem Einsatz und großem ideenreichtum zum Gelingen des Projektes sowie dieses Berichtes beigetragen ha-ben und aufgrund ihrer Anzahl nicht im Einzelnen genannt werden können, seien ebenso unseres dankes versichert.

12


12

Zusammenfassung

ziel des forschungsvorhabens war die Entwick-lung einer regulierbar therapeutika freiset-zenden Wundauflage zur Behandlung chronischer Wunden. Als therapeutikum wurden Sekretions- und Exkretionsprodukte der fliegenmade der Gold-fliege Lucilia sericata gewonnen und untersucht. testsysteme für die antimikrobielle, proteolytische und proliferative Aktivitätsbestimmung dieser Produkte wurden entwickelt. das Madenprodukt wurde funktionell analysiert und anschliessend in Kombination mit den einzelnen Bestandteilen der Wundauflage-zellulosehohlfilament, zellulase-und der Wundflüssigkeit (Wundsekret oder Wundexsu-dat) auf Wechselwirkungen getestet. Ein mit Ma-denprodukt befüllter Hohlfilament-Prototyp wurde mit zellulase und Wundsekret auf proteolytische und proliferative Aktivität getestet.Es konnte nach Etablierung und Anwendung von 5 testsystemen keine antimikrobielle Aktivität der Madenprodukte nachgewiesen werden. dies steht im Widerspruch zu bisherigen, zum teil zweifel-

haften Publikationen. Eine weitere Untersuchung der antimikrobiellen Wirkung wurde im rahmen des internen Statusseminars vom 29.10.04 im Konsensus aller beteiligten Projektpartner ausge-schlossen.Enzymatisch und proliferativ aktive Madenprodukte konnten vom organismus gelöst und konserviert werden. Madenprodukte blieben in Mischungsver-suchen mit Wundexsudat und dem Biokatalysator zellulase in ihren enzymatischen und proliferativen Eigenschaften aktiv.

die enzymatische und proliferative Wirkung der Madenprodukte konnte in Vorversuchen auf ver-schiedene herkömmliche Wundauflagen übertra-gen und ungeregelt wieder freigesetzt werden.in den Hohlfilament–Prototypen konnte aktives Madensekret in die filamente eingebaut und die nekrolytische Eigenschaft des Sekretes durch Auf-lösung mittels des Biokatalysators zellulase wieder reaktiviert werden.

13


Kurzdarstellung

in deutschland leiden momentan ca. 4 Millionen Menschen an chronischen Wunden, obwohl auf dem Markt eine Vielzahl von modernen Wundauf-lagen zur Wundbehandlung und Wundtherapie erhältlich ist. ziel des Vorhabens war die Entwick-lung einer regulierbar therapeutika freisetzenden Wundauflage (rtf-Wundauflage) als völlig neuer Ansatz. Von dieser Wundauflage werden die the-rapeutika zu 100 % kontrolliert freigesetzt. Aufgrund der hervorragenden Erfolge der Maden-therapie mit sterilen fliegenlarven der Gattung Lucilia sericata, die zu einem Standard der therapie bei der Behandlung chronischer Wunden gewor-den ist, wurden die sterilen Produkte der Larven bzw. Maden (Sekrete und Exkrete) als Wirkstoff gewonnen, um ihn unabhängig vom organismus zu charakterisieren und zu konservieren und als Wirkstoff in der neuen rtf-Wundauflage einzu-setzen.das Studiendesign sah zwei getrennte Wege vor. die Entwicklung der rtf-Wundauflage (Welche zellulosefaser bzw. welche zellulase zur Auflösung dieser faser soll verwendet werden?) und die Ge-winnung und Charakterisierung der Madenpro-dukte von Lucilia sericata.im Labor der Kliniken Ludwigsburg-Bietigheim gG-mbH am institut für Hygiene und Biotechnologie des forschungsinstituts Hohenstein erfolgte die humanbiologische Prüfung der Madenprodukte und der neuen Wundauflage. der entscheidende

biochemische Vermittler zwischen den freige-setzten Substanzen aus der Wundauflage und den zellstrukturen der Wundoberfläche ist das Wundsekret. die wirksamen Substanzgruppen, nämlich die zellulase, die Spaltprodukte bei der reaktion zwischen zellulase und zellulose und die Madenprodukte wurden deshalb im Beisein von Wundsekret in ihrer Wirkung getestet. Stellvertre-tend für die potentielle Vielzahl therapeutischer do-tierungen der neuen Wundauflage wurden sterile Madenprodukte von Lucilia sericata untersucht, da der klinische Behandlungserfolg bei der Behand-lung chronischer Wunden über Jahre dokumentiert ist [6, 7, 9 - 11, 19, 20, 23, 28, 31, 32] und diese therapieform unter dem namen Biochirurgie zu einem Standard geworden ist. die optimierung der Wundbehandlung erfolgt durch drei postulierte Wirkungen der Madenprodukte:

1. Antimikrobielle Wirkung2. Wundreinigung durch Proteolyse3. Stimulation der Wundheilung

das Madenprodukt ist darüber hinaus eine natür-liche Substanz, die ohne schädliche Einflüsse auf die Umwelt vollständig biodegradierbar ist.die Ergebnisse werden im folgenden aufgeführt, wobei der komplexe Untersuchungsablauf in Ein-zelschritte aufgeteilt wurde.

14


14

1.. Versuche.und.Ergebnisse

UnteRSUchUnGSABlAUF:

I.. Beschaffung.der.Ausgangsmaterialien.und.Etablierung.der.experimentellen.Versuchsaufbauten

einzelkomponenten

• Wundsekret• Madenprodukte (Polymedics,

Biomonde, neocura)• zellulase (Henkel)• trypsin, Leucinaminopeptidase (LAP)• insulin

Versuchsaufbauten

• Enzymatische Aktivität zellulase: Auflösen von zellulose mit zellulase

• Etablieren einer fibroblastenkultur zur Be-stimmung der Proliferationsraten

• Bestimmung der antimikrobiellen Wirkung mit verschiedenen Bakterienspezies

• Proteolysemodell: Enzymtests zur Bestim-mung der proteolytischen Aktivität

I.1.. Gewinnung.von.humanem.Wundex-sudat

in der Abteilung für Unfall- und Wiederherstel-lungschirurgie des Krankenhauses Bietigheim werden routinemäßig Patienten mit Hüftgelenksar-throse mittels implantation einer Endoprothese am Hüftgelenk behandelt. diese elektiven Patienten spenden für den Eingriff präoperativ Eigenblut und sind deshalb streng auf infektionskrankheiten (Hepatitis B und C, HiV) hin untersucht worden.

das Wundexsudat dieser Patienten kann deshalb unter Beachtung der hygienischen richtlinien für den Umgang mit potentiell kontagiösen Körper-flüssigkeiten ohne Bedenken im Labor verwendet werden. Sämtliche im Labor tätige Mitarbeiter wurden gegen Hepatitis A und B geimpft. nach implantation der Endoprothese wird das im Wund-gebiet anfallende Wundexsudat in sogenannte redonflaschen mittels drainagen abgeleitet. Am ersten postoperativen tage kann das Wundexsudat durch Wechsel der drainageflasche mit Hilfe eines redonsystems steril am Patienten entnommen werden (Abbildung 1).

Abbildung 1: Redonsystem zum Ableiten des Wundexsu-dates

da die Patienten zur infektionsprophylaxe stan-dardisiert perioperativ antibiotisch abgedeckt werden, enthält ihr Wundexsudat Antibiotika mit einem antimikrobiell wirksamen Wirkspiegel. Un-tersuchungen von Bischoff et al. konnten zeigen, dass Wundexsudat akuter Wunden eine eigene antibakterielle Aktivität auf Staph. aureus, Staph. epidermidis und E. coli besitzt [35].das so gewonnene Wundexsudat wurde sofort am BPi Hohenstein für 15 Minuten bei 1600 g abzentrifugiert um die korpuskulären Bestand-teile zu entfernen und bei -80º C bis zur Messung eingefroren.

15


I.2.. Gewinnung.von.Madenprodukten.in.Zusammenarbeit.mit.den.Firmen.POLYMEDICS.und.NEOCURA.als.Produzenten.von.sterilen.therapeu-tischen.Maden.der.Gattung.Lucilia.sericata

Beim zyklus der Metamorphose durchlebt Lu-cilia sericata für 5 – 8 tage das Larvenstadium. Grassberger [12] gibt genaue daten zur mittleren minimalen dauer der einzelnen Stadien bei 22ºC an (Abbildung 2). dabei durchleben die Larven 3 Stadien und wachsen von ihrer Anfangsgröße (ca. 0,5 – 1 mm) bis auf die 10-fache Größe (ca. 10 - 15 mm) an. nur in diesen 3 Stadien nehmen die Larven nah-rung auf, danach jedoch nicht mehr. Sie verlassen dann in der Migrationsphase das feuchte Habitat der Wunde, denn erst an einem trockenen ort ist es den Larven möglich, sich erfolgreich zu verpuppen (Abbildung 3).Bei 34° C verkürzt sich die dauer der angegebenen Larvenstadien auf etwa die Hälfte. im feuchten Verband am Unterschenkel bei der Madentherapie

liegt die temperatur bei etwa 30°C (eigene unver-öffentlichte Messungen). der gekühlte transport in die Klinik verzögert dagegen die Entwicklung der Larven. Unter Berücksichtigung dieser Um-stände ergibt sich naturgemäß bei der Biotherapie die klinische Anwendungsdauer von 1 - 3 tagen in der Wunde, entsprechend den Larvenstadien 1 – 3. da die Larven nur in diesen Stadien nahrung aufnehmen und eine erhöhte Enzymaktivität besit-zen, erfolgte die Sammlung der Madenprodukte nur in diesem zeitfenster. Unter den verschiedenen Methoden der Gewin-nung von Madenprodukten gingen folgende in den Versuchsablauf ein:Lebende Larven wurden zu Brei zerquetscht und getrocknet [19]. da eine Abtötung von Bakterien im darm der Maden beobachtet wurde [13, 21, 27], wurde Larvendarm mittels Stereolupe präpa-riert. Auch die Hämolymphe der Maden zeigt ver-schiedenste Effekte [25] und wurde an präparierten Larven abpipettiert.die Madenprodukte selbst können nur in kleinsten Mengen pur gewonnen werden. Es existieren aber verschiedenste Verfahren zur Gewinnung von

Abbildung 2: Minimale mittlere Dauer der einzelnen Larvenstadien bei 22º C nach Grassberger [12]

Stad

ium

Stad

ium

Stad

ium

eier

Migration Puppe

lebenstag

16


16

verdünnten Produkten durch Waschen der Larven [14, 16, 25, 29, 30, 33]. füllt man Maden in ei-nen Abtropftrichter, so können durch Besprühen wirksame Produkte gewonnen werden [16, 29]. Wir verwendeten das in den meisten Arbeiten angewendete Verfahren nach Vistnes [33], wobei die Larven in einer Petrischale bzw. flasche direkt gewaschen werden. 100 – 200 sterile und unsterile fliegenlarven von Lucilia sericata wurden von verschiedenen Herstel-lern bezogen und ihre Produkte durch Waschungen mit je 20 ml Kochsalzlösung für 2h in der flasche gesammelt (Abbildung 4). durch Abpipettieren erhielt man die verdünnten Madenprodukte, die sofort bei – 20°C eingefroren wurden.ferner wurden bei der firma Polymedics, Belgien

Abbildung 3: Larve, Puppe und Fliege der Art Lucilia sericata sowie Spuren der Larven (Maden) auf Bakterienrasen

unsterile Madenprodukte in der Petrischale gesam-melt, wobei jeweils etwa 1000 Maden gewaschen wurden. die Sekrete wurden 24 stündlich dekan-tiert und sofort bei – 20°C eingefroren. Ein teil der Produkte wurde gekühlt zur Herstellung eines Lyophilisats an den Projektpartner am Pharmako-logischen institut der Universität Kiel verschickt, der rest ebenfalls gekühlt sofort an unser Labor versendet. dadurch konnte ein direkter Vergleich der Wirkungen von frischen und lyophilisierten Madenprodukten geführt werden, um das Lyophi-lisationsverfahren zu optimieren.die pH-Messungen der Madenprodukte wurden sowohl mit Lackmusstreifen, als auch mit einem pH-Meter (firma wtw, Weilheim am oB) gemessen und diente als erster nachweis von wirksamen

17


Abbildung 4: unsterile Larven in der Petrischale bzw. Flasche

Madenprodukten in der Waschlö-sung. Man erhielt Mittelwert ± Stan-dardabweichung = 7,41 ± 0,48 (Ab-bildung 5). in der Literatur [4] werden die pH-Werte des Wundexsudates bei chronischen Wunden von 5,45 - 8,65 (Mittelwert 7,45) unabhängig vom Wundtyp und Wundstadium an-gegeben.frische Proben der Madenprodukte wurden wie oben beschrieben durch Waschungen ge-wonnen und mittels Gel-Elektrophorese untersucht (Abbil-dung 6). dabei fand man für die untersuchten

Madenprodukte keine charakteristischen Banden, wie z. B. für Enzyme und defensine etc. die Men-ge an ausgeschiedenen Produkten liegt unter der nachweisgrenze im SdS – Gel.

I.3. Anlegen.von.L929.Maus-Fibro-.blastenkulturen.und.Etablierung..des.Proliferationstests.mittels..ATP-Nachweis

Erst 1997 wurde von Pamela Prete ein direkt das zellwachstum stimulierenden Effekt durch Larven-produkte in vitro an fibroblastenkulturen [25] nach-

Abbildung 5: pH-Wertbestimmung mittels Lackmusstreifen

gewiesen. Sie quantifizierte diesen Effekt anhand von Waschungen der Madenprodukte und von abpipettierter Hämolymphe von Phaenicia sericata Larven im direkten Vergleich mit EGf (epidermal growth factor). L929 Maus-fibroblasten wurden von der dSMz (deutsche Sammlung für Mikrooganismen und zellkulturen, Braunschweig) bezogen und in Kul-turflaschen (t75, Greiner bio-one, frickenhausen) in dMEM (Cambrex, Verviers, Belgien) + 10 % fCS (Sigma-Aldrich, München) bei 37ºC, 93 % relativer Luftfeuchtigkeit, 5 % Co2 und 20 % o2 im Brut-schrank steril gehalten (Abbildung 7).

brdu-test:L929 - zellen werden mit und ohne zu prüfende Substanz für 18 – 48 h kultiviert. 4 h vor Ende der Kultivierung wird BrdU (Bromodeoxyuridin) laut Protokoll zugegeben (BrdU-ELiSA von roche dia-gnostics 1647229). Es erfolgt der Einbau des BrdU in die zell-dnA, welches durch Antikörper im ELiSA nachgewiesen wird. Je mehr BrdU nachgewiesen wird, desto größer war die proliferative Leistung der zellen.

18


18

Abbildung 7: L929 Maus-Fibroblasten in der Kultur (siehe Text)

Abbildung 6: Gelelektrophorese eines durch Waschung gewonnenen Madenproduktes

Protein-marker

BSA- Standard

Maden- produkt a

Maden- produkt b

Maden- produkt a

Protein-marker

die Messreihen zeigten, dass aufgrund der Standardab-weichungen im Versuch, eine Aussage zu einer pro-liferierenden Wirkung mit Madensekreten nicht mög-lich war (Abbildung 8). für unsere fragestellung war der BrdU-test ungeeignet, wes-halb ein sensiblerer test, der AtP-test, etabliert wurde.

atp-test zur Messung der zellulären Proliferation wurde mit dem AtPlite 1step Kit (Perkin Elmer, zaventem, Belgien) gearbeitet. dieser liefert den Gesamtgehalt des AtP je Kulturansatz und ist damit ein proportionales Maß für die zellzahl.L929-zellen wurden mittels trypsin aus ihrer Kulturfla-sche abgelöst und in der thomakammer (Paul Marien-feld GmbH&Co.KG, Lauda-Königshofen) bzw. mittels durchflusszytometer Cyflow (Partec GmbH, Münster) gezählt. dabei wurden in einer 96-well Platte (Greiner bio-one, frickenhausen) je 50 µl/well zellsuspension mit 1 x 105 zellen/ml eingesäht und mit 50 µl/well an zusät-zen (z. B. growth factor bzw. cytotoxische Substanzen) auf das Endvolumen von 100 µl/well aufgefüllt. Es

1�


Abbildung 8: BrdU Test mit verschiedenen Madenproduktsammlungen (MP)

musste mit AtP - freiem Material (Biopur Spitzen und Cups der fa. Eppendorf) und Handschuhen ge-arbeitet werden. Als Standard wurde je Platte eine fCS-Verdünnungsreihe (0 %, 2 % und 5 % fCS) angesetzt. diese Ansätze wurden für 42 Stunden im Brutschrank inkubiert.danach wurden die Platten auf raumtemperatur abgekühlt, mit den reagenzien des Kits gemischt und bei raumtemperatur gegen eine AtP-Stan-dard-Verdünnungsreihe mittels eines tecan Genios Mikroplattenreaders (tecan GmbH deutschland, Crailsheim) im Lumineszenzbetrieb gemessen. der Messfehler des Gerätes in diesem Modus beträgt 1 %. die Sensitivität des testsystems beträgt dabei 5 zellen/100 µl Medium.

I.4. Etablierung.des.Suspensionstests.nach.Norm.JIS.L.1902.mit.Bakterien-suspensionen.(Staphylococcus.aure-us,.Staphylococcus.epidermidis.und.betahämolysierenden.Streptokok-ken.u.a.).und.des.Live/Dead.Tests.zum.Nachweis.der.antimikrobiellen.Wirkung

Seit der erfolgreichen Behandlung von Kindern mit osteomyelitis durch William S. Baer [1] im Jahre 1931 wurde eine antimikrobielle Wirkung der Larven postuliert und durch zahlreiche Stu-dien belegt. die intrinsische (darmassoziierte) antimikrobielle Aktivität in den Larven ist fundiert

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Insuli

n 1m

g/l

FCS 5

% PBS

MP 1

5/6

MP 1

5/7

MP 1

5/1

MP

15/5

MP 1

7A

OD

[450

nm]

1

1:100

1:1000

1:10.000

20


20

belegt und beruht auf der Verdauung der Bakte-rien im darm der Larven [5, 13, 21, 27] (Proteus mirabilis lebt im Larvendarm in Symbiose und produziert antibakteriell aktive Phenylessigsäure und Phenylacetaldehyd [5]) sowie auf dem im-munsystem der Larven (defensinsekretion) [3, 17, 18]. Eine extrinsische antimikrobielle Aktivität der (Mundspeichel-) Sekrete und (darm-) Exkrete wurde direkt an verschiedenen Bakterien in Sus-pension nachgewiesen [15, 22, 29, 30]. daneben könnten sekundäre Effekte, wie z. B. die Spülung der Wunde durch Anregung der Exsudatbildung [26] oder eine immunologische Stimulation für die antimikrobielle Wirkung verantwortlich sein [2]. Grassberger [11] gibt einen überblick über die verschiedenen direkten und indirekten Experimente an verschiedenen Bakterien.Simmons zeigte 1935 [29] mit dem Sekret von Lucilia sericata, das er getrocknet und autokla-

viert anwendete, bei einem Mischungsverhältnis 9 : 1 ein Absterben von Staphylococcus aureus und Streptococcus pyogenes. diese Untersuchungen ermutigten uns trocknungsversuche mit Maden-produkt durchzuführen. Gwatkin mischte 1938 [14] Sekrete von Calliphora vomitoria/ latifrans/ ery-throcephala im Verhältnis 50 : 1 mit Suspensionen von Staphylococcus aureus und Streptococcus mastiditis und erhielt ein Absterben der Bakte-rien. S. thomas beschrieb 1999 [30], dass Sekrete von Lucilia sericata bei Mischungen von 2 : 1 bis 5 : 1 mit Staphyloccocus aureus zum Absterben der Bakterien führten.diese in der Literatur beschriebene antimikro-bielle Wirkung der Madenprodukte sollte an verschiedenen Bakterienstämmen bestimmt und quantifiziert werden. tabelle 1 gibt eine übersicht der Experimente zur antibakteriellen Wirkung der Madenprodukte.

BakterienstammSuspensions-

testtest auf Agarplatten mit Madenprodukten

test auf Agarplatten mit lebenden Maden

Staphylococcus aureus + + +

Klebsiella pneumoniae + + -

Strept. agalacticae + + -

Escherichia coli + + -

Staph. Epidermidis - + -

Citrobacter freundii - + -

Pseudomonas aeruginosa - + -

Proteus mirabilis - + -

Enterococcus faecium - + -

Tabelle 1: Übersicht der Experimente zur antibakteriellen Wirkung der Madenprodukte

21


Es wurden zunächst verschiedene Bakterien (2 h Kulturen von Staphylococcus aureus, Streptococcus epidermidis, betahämolysierenden Streptokokken, Streptococcus agalacticae und Klebsiella pneumo-niae) in Caso-Bouillon auf eine zellzahl von etwa 1 x 105 zellen/ml eingestellt. die Madenprodukte wurden gesammelt, wenn nötig abzentrifugiert (4° C, 3000 g, 5 min), und autoklaviert oder ste-rilfiltriert. Als negativkontrolle diente 0,9 %-ige naCl-Lösung in Caso-Bouillon. Als Positivkontrolle wurde 1% Penicillin/Streptomycin verwendet. Es wurde in Anlehnung der norm JiS L 1902 verfahren.die Proben bzw. negativ- und Positivkontrolle wur-den in verschiedenen Verhältnissen (1 : 1 bis hin zu 9 : 1, entsprechend Madenprodukte : Bakterien-suspension) mit der verdünnten Bakteriensuspen-sion gemischt. dann wurden zur Bestimmung des nullstunden-Wertes 10 µl der Mischung 1 : 100 mit naCl verdünnt und mit dem Autoplate 4000 Spiral Biotech (Biosys, Karben) 50 µl auf Caso-Agarplatten ausspiralisiert. die Proben wurden bei 36° C im Brutschrank inkubiert und nach bestimmten zeiten (1h, 2h, 4h, etc.) in entsprechender Verdünnung ausspiralisiert. die Agarplatten wurden dann bei 36° C über nacht bzw. 24 h bebrütet und danach mit dem Koloniezählgerät Countermat flash (iUL instruments, Königswinter) ausgezählt.für die negativ- und Positivkontrollen erhielt man die erwarteten Ergebnisse, was die Validität der testsysteme zeigte. für die Madenprodukte konnten für die verschiedenen Bakterien über-raschenderweise in keinem der verschiedenen untersuchten Ansatz-Varianten (direkt, steril gewonnenes Sekret der verschiedensten Larven-stadien, Sekret aus Belgien, autoklavierte und sterilfiltrierte Sekrete) eine antibakterielle Wirkung nachgewiesen werden. Auch selbst gesammelte sterile Produkte von Larven anderer Hersteller (Bi-omonde, Hamburg und neocura, tübingen) sowie

bis 10fach aufkonzentrierte Lyophilisate zeigten keine antimikrobielle Aktivität.die folgenden Abbildungen 9 a. und 9 b. verdeut-lichen die Versuchsergebnisse der quantitativen Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität diverser Madenprodukte.Entgegen bisherigen Literaturangaben konnte eine antimikrobielle Aktivität der Madenprodukte nicht nachgewiesen werden, dies wurde durch weitere unterschiedliche (nicht näher beschriebene) testsysteme untermauert. ferner wurden lebende Maden direkt von der klinischen Anwendung aus der Wunde am Patienten untersucht, wobei sich ein breites Keimspektrum nachweisen ließ.Aufgrund dieses Widerspruches mit den publi-zierten wissenschaftlichen Arbeiten wurde ein weiterer semiquantitativer test zur Bestimmung einer antibakteriellen Aktivität etabliert, bei dem im fluoreszenzmikroskop Bakterien durch färbung als abgestorben oder lebendig charakterisiert werden können. Beim LiVE/dEAd BacLight tM Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, Eugene USA) färbt der Syto 9 farbstoff sowohl lebende als auch tote zellen. Propidiumiodid markiert ausschließlich zellen mit geschädigter zellwand rot und reduziert dabei die Grünfluoreszenz des Syto 9.Eine 2h-Log-Kultur aus einer Bakterien-über-nacht-Kultur wurde hergestellt und mit Caso-Bouillon verdünnt. Je 1 ml der Bakteriensuspension wurde in Eppendorf reaktionsgefäßen (cups) pipettiert und bei 2600 g für 5 min abzentrifugiert. das so erhaltene Sediment aus Bakterien wird in 8 µl Ma-denprodukt, naCl (negativkontrolle) oder in 70%-igem isopropanol (Positivkontrolle) resuspendiert und bei rt für 1h inkubiert. diese Ansätze wurden anschließend mit 4 µl Live/dead - Stammlösung re-suspendiert und 5 min im dunkeln inkubiert. diese Suspension wurde auf objektträger aufgetropft und im fluoreszenzlicht mikroskopiert. dabei erhält man rote fluoreszenz für tote und grüne fluores-

22


22

Abbildungen 9 a. und b.: Antimikrobielle Wirkung auf Staphylococcus aureus-Kulturen verschiedener Madenprodukte (MP8)(a) und auf Klebsiella pneumoniae-Kulturen von Madenprodukt (MP16) in Kombination mit Wundexsudat (WE9) und Cellulase (b). Negativkontrolle: NaCl 0,9 %, Positivkontrolle: 1 % Penicillin/Streptomycin

1,00E +00

1,00E +01

1,00E +02

1,00E +03

1,00E +04

1,00E +05

1,00E +06

1,00E +07

1,00E +08

1,00E +09

0 1 2 18 20,75Ze it in h

CFU

/ml

NaC l

1% P en/S trep.

MP 8a)a

MP 8a)b)

MP 8a)c)

MP 8b)

1,00E +00

1,00E +01

1,00E +02

1,00E +03

1,00E +04

1,00E +05

1,00E +06

1,00E +07

1,00E +08

1,00E +09

0 1 3 5,5Ze it in h

CFU

/ml

NaCl

1% Pen/S trep.

WE9

WE9 +NaCl

WE9+ MP16C-1

WE9+Cellulas e

WE9+MP16C-1+Cellulas e

23


zenz für lebende Bakterien. Ein antimikrobieller Effekt kann so schnell sichtbar gemacht werden (Abbildung 10).in diesem Versuch wurden sowohl zerriebene Larven, präparierter Larvendarm, abpunktierte Hä-molymphe sowie verschiedenste Sekrete getestet, wobei keine antibakterielle Wirkung nachgewiesen werden konnte. Auch wurden lebende Maden auf Bakterienrasen

Abbildung 10: Bakterien Klebsiella pneumoniae im Live / Dead - Test, rot = tot, grün = lebend

(Keim: Staph. aureus auf Blutagar) gesetzt, wobei das freßverhalten beobachtet wurde. die Platten wurden nach Abnahme der Maden inkubiert und es zeigten sich auch hier keine Hemmhöfe um die Madenspuren, was als Ausdruck einer antibak-teriellen Wirkung gewertet werden könnte. Als Vergleich diente eine Kontrollplatte, auf der mit einem Spatel Kratzspuren aufgebracht wurden (Abbildung 11).

Abbildung 11: Platten nach 12 Stunden Inkubation, links Fraßspuren, rechts Kontrolle mit aufgebrachten Kratzspuren.

24


24

Kompetente (d.h. an Wunden eingesetzte) Maden wurden direkt aus der Anwendung am Patienten aus der Wunde entfernt und auf Agarplatten (Abbildung 12) untersucht. dabei zeigte sich eine Kontamination mit mehreren offenbar verschiedenen fremdkeimen. Bei einer ausreichenden antimikrobiellen Wirkung der Maden in der Wunde sollten diese eigentlich steril sein. Auch durch diesen Versuch konnte keine messbare antimikrobielle Wirkung der Maden im Wundeinsatz gezeigt werden.zu Herrn Prof. Mumcuoglu, (department of Pa-rasitology, Hebron University, Jerusalem, israel) wurde Kontakt hergestellt und er bestätigte unsere Ergebnisse bezüglich einer direkten antibakteriellen Wirkung der Madenprodukte. Auch seine Arbeits-gruppe konnte die bisher publizierten Ergebnisse trotz intensiver wissenschaftlicher Arbeit nicht nachvollziehen. ferner wurden die Versuche in der Pharmakologischen Abteilung der Universität Kiel (Prof. Müller, dr. furkert) nochmals verifiziert.

Auch dort konnte keine antibakterielle Wirkung der Madenprodukte nachgewiesen werden.nach dem derzeitigen Kenntnisstand, kann nicht von einem antibakteriellen Wirkprinzip der Maden-produkte von Lucilia sericata ausgegangen werden. Vielmehr scheint ein intrinsisches Wirkprinzip (Ab-tötung von Bakterien im darm) vorzuliegen.zur Verdeutlichung der Begriffe intrinsische und extrinsische antimikrobielle Wirkung kann die Made als Modell vereinfacht dargestellt werden (Abbildung 13).Eine wissenschaftliche Erklärungsmöglichkeit wäre der Verlust einer natürlichen extrinsischen antimi-krobiellen Aktivität der Larven in der zucht. nach diskussion dieser Ergebnisse im internen Statusse-minar vom 29.10.2004 wurde die Versuchsreihe zur Untersuchung der antimikrobiellen Aktivität der Madenprodukte im Einvernehmen aller Pro-jektpartner eingestellt.

I.5. Etablierung.des.quantitativen.enzy-matischen.Nachweises.von.Trypsin.(TRP).und.der.Leucin.–.Aminopep-tidase.(LAP).als.klinisch.relevantes.Proteolysemodell

Heutzutage wird die reinigung der Wunden von debris und nekrosen unter Madentherapie auf die extrakorporale Verdauung der Maden zurückge-führt. die Larven scheiden offenbar proteolytische Enzyme aus, die abgestorbenes Gewebe und debris zu einem nahrungsbrei auflösen, den sie dann einsaugen und verdauen (und gegebenenfalls desinfizieren). Experimentell wurden Larvenenzyme bislang lediglich durch Analyse des Umsatzes be-kannter Enzymsubstrate nachgewiesen. Beschrie-ben wurden eine generelle Proteaseaktivität, eine tryptische Aktivität und Enzymaktivitäten von Leucinaminopeptidase, Carboxypeptidase A und B, Elastase [33] und Kollagenase [16, 34]. Studien

Abbildung 12: Maden auf Kulturen von Staphylococcus aureus

25


zur genauen molekularen Charakterisierung der Enzyme, z.B. durch Sequenz- und Strukturanalyse, stehen bisher aus.die klinisch beobachtete nekrolytische Wirkung der Larvenprodukte kann sowohl durch sezernierte Enzyme (Sekretion), als auch durch Ausscheidung noch aktiver im darm vorhandener Enzyme (Ex-kretion) hervorgerufen werden. Bezüglich der bekannten intrinsischen enzymatischen Wirkung [24] konnte ein bakterieller Ursprung der im darm vorhandenen Enzyme 1981 durch Vistnes [33] ausgeschlossen werden. durch Waschungen der Maden erhält man stets ein Gemisch aus Exkreten und Sekreten, wobei eine getrennte Analyse bisher aussteht.

Abbildung 13: Modellvorstellung des Larvenprinzips

Bei den von Vistnes [33] in Larvenprodukten von Calliphora erythrocephala nachgewiesenen ver-schiedenen enzymatischen Aktivitäten waren die tryptische Aktivität und eine Aktivität der Leucin - Aminopeptidase stets schwach. daher wurde zunächst die tryptische Aktivität als Leitaktivität zur stellvertretenden Bestimmung der Gesamtaktivität herangezogen. die Bestimmung der Leucin - Ami-nopeptidase war aufgrund des im Wundexsudat vorhandenen trypsin - inhibitors für die durchfüh-rung der Mischungsversuche nötig.zum nachweis von trypsin wurde das trypsinspezi-fische Substrat n-Benzoyl-dL-Arginyl-p-nitroanilid (BAPnA) (fluka, Buchs, Schweiz) verwendet. trypsin spaltet von BAPnA p-nitroanilid (pnA) ab, dieses

26


26

Substrat wurde in Konzentrationen von 0,1 mM bis 1 mM eingesetzt. für trypsin existieren Stan-dardlösungen zur Eichung der Geräte.zum nachweis der LAP – Aktivität im Madenpro-dukt wurde das spezifische Substrat der Leucin – Aminopeptidase, Leucin-p-nitroanilid, in Kon-zentrationen von 0,2 - 1,2 mM eingesetzt. Als Er-gebnis der Messung erhielt man nach dem Lambert - Beer´schen Gesetz die Extinktion der gelben p-nitroanilid - Lösung durch Messung der optischen dichte bei 405 nm im Mikroplattenlesers Genios (tecan deutschland GmbH, Crailsheim). zunächst erfolgte die Eichung des Gerätes mittels p – ni-troanilid, welches in definierten Konzentrationen gemessen wurde. die erhaltenen Kurven zeigten

das erwartete lineare Verhalten (Abbildung 14).die verschiedenen Larvenprodukte wurden 1 : 25 in Aqua dest. verdünnt gemessen. Eine Stamm-lösung von 0,5 % trypsin aus Schweinepankreas (Sigma Aldrich Biotechnology, München) diente in einer Verdünnung von 1 : 200 in Aqua dest. als Positivkontrolle für den trypsinnachweis.Gemessen wurde über einen zeitraum von 105 Minuten in intervallen von je 5 Minuten. nach den regeln der Enzymkinetik wurde die Anfangsstei-gung dieser Messkurven bei verschiedenen Sub-stratkonzentrationen berechnet. die Messwerte wurden als Änderung der optischen dichte (od) pro zeiteinheit (Minute) angegeben, diese ent-spricht der Aktivität des Enzyms. Eine Umrechnung

Abbildung 14: Eichgerade mit dem pNA-Standard

27


Abbildung 15: Michaelis-Menten-Diagramm für den Trypsin-Standard

der Aktivität in internationale Einheiten verbietet sich, da ein direkter experimenteller nachweis der Enzyme trypsin bzw. LAP in den Larvenprodukten noch aussteht. deshalb konnten wir uns im fol-genden auf die Angabe der mittleren Steigung der optischen dichte und auf die Auswertung der relativen Aktivitätsänderung beschränken.Enzyme folgen einer Kinetik, die mittels der Mi-chaelis – Menten – Gleichung abgebildet werden kann. die darin enthaltenen Konstanten KM (Sub-stratkonzentration bei Halbsättigung des Enzyms) und Vmax (Maximale reaktionsgeschwindigkeit)

charakterisieren das jeweilige Enzym. die grafische darstellung erfolgt im Michaelis – Menten – oder im Lineweaver – Burke – diagramm.die Kinetik wurde in den Versuchsanordnungen anhand von trypsinlösung in verschiedenen Konzentrationen gemessen. Abbildung 15 zeigt ein Michaelis - Menten diagramm für trypsin in verschiedenen Konzentrationen. Es spiegelt die erwartete Enzymaktivität wider.nach dieser Eichung wurden die verschiedenen Madenprodukte in das testsystem eingebracht und ausgewertet.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

B AP NA [mM]

max

imal

e St

eigu

ng [O

D(4

05nm

)/m

in]

Tryps in 0,5%

Tryps in 1%

Tryps in 1%

Tryps in 0,5%

28


28

II.. Wirkung.der.Einzelkomponenten.(Zellu-lase,.Wundexsudat,.Madenprodukt).auf.nekrolytische.Potenz.und.proliferative.Wirkung

zunächst wurden folgende Einzelkomponenten in die testsysteme eingebracht:

• zellulase (Henkel)• Wundexsudat • Madenprodukte (Polymedics, Biomonde,

neocura)

II.1. Bestimmung.der.Wirkung.auf.Fibro-blasten.als.Ausdruck.der.Stimulati-on.der.Wundheilung.(Proliferation)

AtP-test Ergebnisse: Es wurde zum Vergleich der Ergebnisse die Standard fCS-Serie mit 0%, 2% und 5% mitgeführt. der Ansatz in allen folgenden AtP-tests ist dMEM + 2% fCS + Verdünnung der testsubstanz. So gilt fCS 2% als Kontrolle.die Ergebnisse (Abbildung 16 a., b., c.) zeigen, dass zellulase die fibroblastenproliferation (zell-wachstum) hemmt. Erst ab Verdünnungen von 1 : 500 ist diese Hemmung nur unwesentlich und kann ab 1 : 1000 gänzlich vernachlässigt werden. das Wundexsudat hingegen ist eindeu-tig bei allen getesteten Verdünnungen prolife-rativ, während die Madenproduktverdünnung 1 : 5 am stärksten zum Wachstum anregt.zusätzlich zum AtP-Proliferationstest wurde die Wirkung des Madenproduktes auf die zellzyklus-verteilung der fibroblasten (L929) bestimmt. der zyklus beinhaltet die G1-Phase = zellwachstum bzw. –vergrößerung, die S-Phase = dnS Verdopp-lung, die G2- und M-Phase = zellteilung. das heisst die zyklusverteilung zeigt an, wie viel zellen zum zeitpunkt der Analyse gerade wachsen (% G1), wie viele ihre dnS verdoppeln (% S) und wie viele

sich in der tatsächlichen zellteilung befinden (% G2/M), (Abbildung 17). der Ansatz entspricht dem des AtP-tests: dMEM + 2% fCS + Verdünnung der testsubstanz. So gilt auch hier fCS 2% als Kontrol-le. die zyklusanalyse erfolgte im durchflusscytome-ter Cyflow (Abbildung 18 a. und 18 b.).zellen denen Madenprodukt zugesetzt wurden, verhielten sich im Wachstum ähnlich den zellen, die fCS 2%erhielten: 70-80% der zellen befan-den sich in G1-, 10-15% in S- und um 10% in G2/M-Phase. diese zellen sind in der sogenannten interphase nur mit zellwachstum beschäftigt. Es gibt aber auch Ausnahmen (z. B. MP16a) mit einer ganz anderen Verteilung: über 50% der zellen verdoppeln ihre dnS, nur sehr wenige teilen sich. diese zellen bereiten gerade ihre zellteilung vor, sie proliferieren. zusammengefasst bedeutet das, dass das gesammelte Madenprodukt proliferative Eigenschaften aufwies.

II.2. Bestimmung.der.proteolytischen.Enzymaktivität.als.Ausdruck.der.Wundreinigung.durch.Nekrolyse

lap-test ergebnisse:für die Auswertung der Ergebnisse der LAP-test Messung wurde die mittlere Steigung gewählt. normalerweise wird in der Enzymkinetik die an-fängliche maximale Steigung verwendet, weil am Beginn der Enzymreaktion noch kein reaktionspro-dukt vorhanden ist, das die Kinetik stören könnte. im falle des Madenproduktes handelt es sich nicht um ein reines Enzym , sondern um eine Mischung, die je nach Charge (Waschung) unterschiedlich aus-fällt und in der u.a. auch Schwebstoffe vorkommen können. nach vielen Vergleichen der mittleren und maximalen Steigung hat sich für Madenprodukte die mittlere Steigung als die bessere darstellung der Ergebnisse erwiesen.

2�


Abbildung 16 a., b., c.: Die Einzelkomponenten Zellulase (a), Wundexsudat (WE) (b) und Madenprodukt (MP) (c) in Verdün-nungsreihe im ATP-Proliferationstest. Als Kontrolle für alle Darstellungen gilt FCS 2%.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

FC S 0 % FC S 2 % FC S 5 % 1:100 1:200 1:500 1:1000 1:2000 1:5000

Zellulas e V erdünnung

ATP

[nM

]

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

FCS 0 % FCS 2 % FCS 5 % 1:2 1:10 1:20 1:50 1:100 1:200 1:500

Wunde xs udat V e r dünnung

ATP

[nM

]

0

200

400

600

800

1000

1200

F C S 0 % F C S 2 % F C S 5 % 1:2 1:5 1:10 1:25 1:50 1:100 1:200

Ma de nprodukt V e rdünnung

ATP

[nM

]

30


30

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

G 1 S G 2/M

% Z

elle

n in

Zel

lzyk

lusp

hase

FC S 2%

FC S 5%

MP 16a 1:5

MP 16D4,5 1:20

MP 23D4 1:10

MP 26B 4C 1 1:5

MP 23F1 1:5

Abbildung 17: Zellzyklusverteilung von L929 mit FCS 2% und Madenproduktsammlungen

in Abbildung 19 sind die Unterschiede in der LAP-Aktivität in den verschiedenen Chargen und Sam-meltagen deutlich zu erkennen (a). Wundexsudat und zellulase haben dagegen kaum bzw. keine Aktivität (b).

III.. Bestimmung.der.Wechselwirkungen.der.Einzelkomponenten.(ohne.Bestim-mung.der.antimikrobiellen.Aktivität)

iii.1 Wechselwirkung zwischen Wundexsu-dat und dem biokatalysator zellulase

iii.1.1 Wundexsudat und zellulase wurden auf fibroblastenkulturen aufgebracht und der AtP-Pro-liferationstest durchgeführt. die Bestimmung des AtP-Gehalts ist Ausdruck des zellulären Wachstums

(Proliferation). in der Mischung der optimalen Ver-dünnungen von Wundexsudat (1:20) und zellulase (1:1000) ergab sich keine Veränderung der Prolife-ration im Vergleich zur Kontrolle mit dMEM + fCS 2 % (Abbildung 20).

iii.1. 2 Wundexsudat und zellulase wurden dem angepassten Proteolysemodell zugeführt und die proteolytische Aktivität der LAP (Leucinaminopep-tidase) bestimmt. dabei wurde für Wundexsudat eine minimale LAP-Aktivität bestimmt, die sich durch eine normale LAP-Konzentration im Serum von 30 U/l erklärt. zellulase allein zeigte keine enzymatische Aktivität. in der Mischung von Wun-dexsudat und zellulase erhält man eine Verstärkung der Aktivität, insgesamt bleibt sie aber minimal (Abbildung 21 - vergleiche mit Abbildung 19 b.).

31


FL2-Diagramm der Kontrolle mit Zyklusanalyse.

Alle Zellen aus Q2 wurden analysiert. G1-Spitze bei 60 (blau gefärbt), G2/M bei 110 (grün gefärbt), und S (orangerot gefärbt) dazwischen.

Abbildung 18 b.: FSC/SSC-Plot der Zellen + Madenprodukt.

95,52% der gezählten Partikel befinden sich im Q2-Qua-dranten. Diese Partikel sind die zu analysierenden Zellen.

FL2-Diagramm der Zellen + Madenprodukt mit Zyklusanalyse.

Im Vergleich zur Kontrolle ist die G1-Spitze kleiner und G2/M wesentlich breiter und höher.

Abbildung 18 a.: FSC/SSC-Plot der Kontrolle.

97,63% der gezählten Partikel befinden sich im Q2-Qua-dranten. Diese Partikel sind die zu analysierenden Zellen.

32


32

Abbildung 19 a. und b.: LAP-Aktivität der Einzelkomponenten Madenprodukt (MP) (a), Wundexsudat (WE) und Zellulase (b)

33


Abbildung 20: ATP-Proliferationstest mit Wundexsudat und Zellulase in Kombination

Abbildung 21: LAP-Aktivität von Wundexsudat (WE) und Zellulase in Kombination

0

500

1000

1500

2000

FCS 0

%

FCS 2

%

FCS 5

%

Cellu

lase 1

:1000

WE 1

9 1:20

WE 1

:20 +

Zellu

la se 1

:1000

ATP

[nM

]

34


34

Abbildung 22: Proliferationstest mit Madenprodukt (MP), Wundexsudat (WE) und Zellulase in Kombination

iii.2 Wechselwirkung zwischen biokatalysa-tor und produkten von lucilia sericata

iii.2. 1 Wundexsudat und zellulase wurden mit Madenprodukt versetzt und fibroblastenkulturen zugesetzt. in der Mischung blieb die proliferative Aktivität des Madenproduktes zu 76 % gegenüber der Einzelkomponente Madenprodukt erhalten (Abbildung 22).

iii.2. 2 Wundexsudat und zellulase wurden mit Madenprodukt versetzt und zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität dem trypsin-Proteolyse-modell zugefügt.die Methodik zur Analyse der enzymatisch-ne-krolytischen Wirkung (Proteolysemodell) musste verbessert und auf die Mischung mit Wundexsudat abgestimmt werden, da sich eine Hemmung der

tryptischen Aktivität der Madenprodukte durch den im humanen Serum und Wundexsudat enthaltenen trypsininhibitor zeigte (Abbildung 23). Aus diesem Grunde war die Etablierung eines weiteren testsy-stems zum nachweis einer zweiten enzymatischen Aktivität der Madenprodukte (Leucinaminopepti-dase, LAP) nötig, die nicht durch das Wundexsudat gehemmt wird. diese LAP-Aktivität wurde durch Mischung mit Wundexsudat zwar beeinflußt, blieb aber zu einem hohen Prozentsatz erhalten.in Abbildung 24 wurde ein stark tryptisch aktives Madenprodukt aus der datenbank ausgewählt und in einer Verdünnung von 1 : 25 in die Mes-sungen eingebracht. die LAP-Aktivität war hoch und wurde durch das Wundexsudat WE um etwa 10 % gehemmt. Wundexsudat (WE) und zellulase hemmen zusammen die LAP-Aktivität des MP um ca. 50 %.

0

500

1000

1500

2000

2500

FCS 0

%

FCS 2

%

FCS 5

%

MP 1

:5

WE 1

:20

Zellu

lase 1

:1000

MP1

:5 +

WE 1

:20 +

Zellu

lase1

:1000

ATP

[nM

]

35


Abbildung 23: Tryptische Aktivität von Madenprodukt (MP) und Wundexsudat (WE) in Kombination

Abbildung 24: LAP-Aktivität von Madenprodukt (MP), Wundexsudat (WE) und Zellulase in Kombination

36


36

iii.3 Wechselwirkung zwischen produkten von lucilia sericata und den abbau-produkten der zellulose

in einem Handversuch wurde zellulase der firma Henkel einzelnen zellulose - Hohlfilamenten als Ausgangsmaterial für die Wundauflage zugesetzt. nach einer inkubation von bis zu 4 tagen ist das Ausgangsmaterial komplett zersetzt und die Ab-bauprodukte der zellulose können mit verschie-denen Lösungen (Madenprodukt, Wundexsudat) gemischt und in die testsysteme eingebracht werden (siehe Endbericht Hohenstein).

iii.3.1 Wundexsudat wurde mit enzymatischen Spaltprodukten der zellulose (Hohlfilament) und Madenprodukt zur Bestimmung der Proliferations-rate fibroblastenkulturen zugefügt. die ursprüng-

lich hohe proliferative Wirkung des Wundexsudates wurde nur durch zellulase gehemmt, lag aber noch ca. 15 % über der Proliferationsförderung der Kontrolle von dMEM + 2% fCS. die ebenfalls sehr hohe proliferative Wirkung des Madenproduktes wird durch die in zellulase aufgelösten Hohlfila-mente nur ganz schwach gehemmt (Abbildung 25).

iii.3.2 Wundexsudat wurde mit den enzymatischen Spaltprodukten der zellulose und Madenprodukt zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität dem LAP - Proteolysemodell zugefügt. in der Mischung misst man eine um 30 % erhöhte LAP - Gesamt-aktivität der Mischung im Vergleich zur Aktivität des Madenproduktes alleine. dies entspricht einem additiven Effekt in der Mischung (Abbildung 26).

Abbildung 25: Wundexsudat, Hohlfilament in Zellulase aufgelöst und Madenprodukt in Kombination im ATP - Proliferati-onstest

37


Abbildung 26: Wundexsudat, Hohlfilament in Zellulase aufgelöst und Madenprodukt in Kombination im LAP-Test

iii.4 Wechselwirkung zwischen madenpro-dukt in Wundauflagen (baumwolle, mull, Viskose, hohlfilamente) und Wundexsudat

Erste Vorversuche bei dem Madenprodukt bzw. trypsinstandard in Baumwolle, Mullkompressen sowie Viskose eingebracht wurde, zeigten eine Konservierung und ungeregelte freisetzung der proteolytischen Aktivität bei Abwesenheit von Wundexsudat (Siehe Endbericht Hohenstein). Vergleichbare Untersuchungen wurden nun mit dem Hohlfilament–Prototyp durchgeführt. dabei wurde zunächst am Endpunkt, das heisst bei voll-

ständiger Auflösung des Prototyps gemessen. in diesem Prototyp konnten frische und lyophilisierte Madenprodukte in die Hohlfilamente eingebaut werden.

iii.4.1 Hohlfilamente wurden mit Madenprodukt befüllt und anschliessend getrocknet. diese wurden mit zellulase vollständig aufgelöst und zusammen mit Wundsekret als Gesamtmischung dem Proli-ferationsmodell (fibroblastenkulturen) zugefügt. in diesem Ansatz wurde ein proteolytisch aktives, das heisst zuvor auf Proteolyse getestetes Maden-produkt eingesetzt (Abbildung 26), das jedoch nur

38


38

Abbildung 27: Madenprodukt im Hohlfilament, getrocknet, in Zellulase aufgelöst (MPinHF+Zell.) und Wundexsudat (WE) im ATP-Proliferationstest

geringe proliferativen Eigenschaften besitzt. Man kann erkennen, dass die Mischung (MPinHf + zell. 1:1000) nur wenig unter dem Proliferationsstan-dard mit 2% fCS (rote Linie) liegt und die Gesamt-mischung (MPinHf + zell. + WE) nahezu dieselbe proliferative Wirkung zeigt wie Wundexsudat allein (blaue Linie). folglich geht in der Gesamtmischung die proliferative Wirkung der Einzelkomponenten nicht verloren (Abbildung 27).

iii.4.2 die Hohlfilamente wurden mit Madenpro-dukt befüllt und getrocknet. diese wurden mit zellulase vollständig aufgelöst und zusammen mit Wundsekret in das Proteolysemodell eingebracht.

durch den trocknungs- und Auflösungsprozess verliert das Madenprodukt an proteolytischer Wirkung (Abbildung 28). So ist die LAP-Aktivität im Vergleich zur Einzelsubstanz stark herabgesetzt, trotzdem ist noch restaktivität vorhanden.

der nächste Schritt sah vor die eine Sorte von Hohl-filamenten mit Madenprodukt und die andere mit zellulase zu befüllen und zu trocknen. Beide Sorten wurden in zellkulturmedium + 2% fCS gegeben, wodurch die getrocknete zellulase reaktiviert wur-de und die Hohlfilamente auflöste. dieser Vorgang setzte nun Madenprodukt frei. in diesem Versuchs-ansatz betrug die Endkonzentration des Maden-

0

500

1000

1500

2000

2500

MP 1:5 W E 1:20 MP inHF +Zell.1:1000

MP inHF +Zell.+ W E

HF +Zell.1:1000

HF +Zell. +W E

Zellulas e1:1000

F C S 2% F C S 5%

ATP

[nM

]

3�


produktes rechnerisch 1 : 25. diese Mischung wurde anschliessend dem Proliferationsmodell (fibroblasten-Kulturen) zugefügt. dabei war eine Wachstumshemmung gegenüber der Kontrolle mit 2% fCS zu beobachten. der trocknungsprozess

Abbildung 28: MP im Hohlfilament, getrocknet, in Zellulase aufgelöst und Wundexsudat im LAP-Proteolysetest

Abbildung 29: Madenprodukt in Hohlfilament und Zellulase in Hohlfilament, getrocknet, wieder befeuchtet in Kulturmedium und aufgelöst im ATP-Proliferationstest

des Madenproduktes im Hohlfilament verminderte offenbar die proliferative Wirkung. zudem lösten sich die Hohlfilamente in diesem Ansatz aufgrund der geringen zellulasekonzentration erst nach 1 Woche auf (Abbildung 29).

40


40

die Wiedereinführung der Madentherapie zum debridement chronischer Wunden unter dem Synonym “Biochirurgie” [8, 32] führte zu einer “renaissance” dieser bis auf die Mayas zurück gehenden technik. inzwischen ist die Biochirur-gie zu einem Standard bei der Behandlung von Problemwunden geworden, was insbesondere auf eine nekrolytische Wirkung der Larvensekrete und -exkrete zurückzuführen ist. fliegenlarven der Gattung Lucilia sericata (familie der Schmeißflie-gen, Calliphoridae) sind als steriles Arzneimittel in deutschland zugelassen und in 2 darreichungs-formen erhältlich: als „freiläufer“ zur Anwendung mit direktem Wundkontakt und im textilen „Beu-tel“ verpackt, einer insbesondere für den ambu-lanten Bereich praktischen Applikationsform.nachdem William S. Baer die Madentherapie nach dem 1. Weltkrieg zur Behandlung der osteomye-litis etabliert hatte [1], waren sterile fliegenlarven (Phaenicia sericata) kommerziell von der firma Lederle (um 1935) erhältlich. nach Entdeckung der Antibiotika 1941 geriet die Biotherapie allerdings für etwa 40 Jahre in Vergessenheit. Sherman und Pechter [23, 28] nahmen die Madentherapie nach 40 Jahren in den USA wieder auf, unglücklicher-weise stieß diese Art der therapie dort nicht auf Akzeptanz. Es dauerte weitere 10 Jahre, bis die Biotherapie in deutschland und England eine re-naissance erlebte [30, 32].durch die große zeitliche Lücke zwischen dem 1. Weltkrieg und dem letzten Jahrzehnt, die sich auch durch in dieser zeit fehlende Publikationen widerspiegelt, kam es zu Veröffentlichungen mit teilweise gegensätzlichen Aussagen. insbesondere wegen der weiterentwickelten Meßmethodik sind die Studien über diesen großen zeitraum kaum

vergleichbar. So existieren diverse Studien an verschiedenen Spezies der fliegenlarven (Lucilia sericata [16, 21, 29, 30], Phaenicia sericata [25, 34], dem nordamerikanischen Äquivalent von Lucilia sericata, Calliphora vomitoria / latifrans / erythrocephala), bezüglich ihrer Wirkungen, der verschiedenen Arten der Sekretsammlung (Larven-darm [13, 21, 27], Hämolymphe [25], zerstoßene Larven [19], Waschen der Larven [16, 25, 29, 30, 33]), der direkten Analyse ihrer Produkte [30] und bezüglich des experimentellen Aufbaus.die klinisch beobachteten Wirkungen der Larven-produkte können sowohl durch sezernierte Sub-stanzen (Sekretion), als auch durch Ausscheidung noch aktiver im darm vorhandener Substanzen (Exkretion) hervorgerufen werden. durch Wa-schungen der Maden erhält man ein Gemisch aus Exkreten und Sekreten, wobei eine getrennte Ana-lyse bisher aussteht. im folgenden wird die Summe der Larvenexkrete und -sekrete zur Vereinfachung als „Larvenprodukt“ oder „Madenprodukt“ (in der englischen Literatur excretion - secretion product, ES) bezeichnet.Analog zur klinisch beobachteten Wirkung der Larven oder Maden – Säuberung der Wunde vom Bakterienrasen und von nekrotischem fleisch, förderung des Wundschlusses - wurden in un-seren Versuchen die antimikrobielle, nekrolytische bzw. proteolytische und proliferative Aktivität des Madenproduktes getestet. die Madenprodukte stammten von Maden, die speziell für die Anwen-dung in der Wundtherapie gezüchtet wurden. Es wurden keine wildlebenden Maden verwendet, was die Vermutung zulässt, dass die in der Literatur so oft beschriebene antimikrobielle Aktivität bei der zucht möglicherweise verloren ging und deshalb

2.. Diskussion

41


nicht nachgewiesen werden konnte. natürlicher-weise saugt die Made die Bakterien zusammen mit dem vorverdauten (Proteolyse) fleischbrei ein und tötet diese in ihrem Mitteldarm ab. in dieser Arbeit konnte eindeutig festgestellt werden, dass Ma-denprodukt auch nach Lagerung bzw. trocknung seine proliferative Wirkung weitgehend behält. Genauso verhält es sich mit den proteolytischen Eigenschaften des Madenproduktes.die Hohlfilament-Prototypen entwickelten sich aus

der guten und einfachen Möglichkeit der Hand-habung zusammen mit dem Madenprodukt. die Hohlfilamente können durch einfaches Aufsaugen mit Madenprodukt bzw. anderen therapeutika oder zellulase befüllt sowie bei raumtemperatur getrocknet und im Kühlschrank gelagert werden. die Wundauflage kann mit den unterschiedlichen Wirkstoff-gefüllten Hohlfilamenten individuell zu-sammengesetzt werden. Hier gilt es, die optimale zusammensetzung zu finden.

42


42

das forschungsvorhaben konnte erstmals die grundlegenden Prinzipien einer steuerbaren freisetzung von therapeutika aus einer Wundauf-lage demonstrieren. dabei gelang die nutzung einer textilen depotstruktur (Hohlfilamente), die mit hoher reservoir-Aufnahmekapazität für flüs-sigkeiten ausgestattet ist. diese depotstruktur ist neben den untersuchten Aufnahmefähigkeit und re-Aktivierbarkeit von Madensekret, grundsätzlich auch für andere Substanzen und Wundtherapeu-tika geeignet. Gleichzeitig konnte der Prototyp der Wundauflage so gestaltet werden, dass sie sich durch zellulase-gefüllte Hohlfilamente unter der Anwendung im flüssigen Milieu vollständig auflöst. im forschungsvorhaben konnte ein er-ster Wirkstoff-abgebender und sich auflösender Prototyp entwickelt werden. für eine serienreife Produktion müssen weitere optimierungen stattfin-den, weshalb derzeit an einem Anschlussvorhaben gearbeitet wird. die erzielten Ergebnisse kamen der im Antrag gestellten Verwertung bereits nahe, konnten jedoch mit dem Prototyp nicht realisiert werden. dort stand:

Wirtschaftliche erfolgsaussichten:

im rahmen der nächsten Jahre sollte es mög-lich sein eine marktreife, selbstauflösende Wundauflage mit regulierbarer therapeuti-kafreisetzung zu entwickeln.

Wissenschaftliche und technische erfolgsaus-sichten:

nach Abschluss des Vorhabens ist es weiter-hin möglich eine enzymatisch (Wundreini-gung) und proliferativ (Heilungsförderung) wirksame selbstauflösende Wundauflage zu entwickeln, die den handelsüblichen Produkten mindestens gleichwertig ist. die technischen Erfolgsaussichten können daher als sehr gut bewertet werden. die Herstel-lung von sterilen Hohlfilament-Prototypen der rtf-Wundauflage wird in einem folge-projekt bearbeitet.

3.. Voraussichtlicher.Nutzen,.insbesondere.der.Verwertbarkeit.des.Ergebnisses... im.Sinne.des.fortgeschriebenen.Verwertungsplans

43


die Aussagen von Wissenschaftlern zum aktuellen Stand der Madenproduktforschung sind im Bericht integriert.

4.. Bekannt.gewordener.Fortschritt.auf.dem.Gebiet.des.Vorhabens.bei.anderen.Stellen

5.. Bereits.erfolgte.und.geplante.Veröffentlichungen.des.Ergebnisses

die Ergebnisse des forschungsvorhabens werden gemeinsam mit dem Projektleiter Bekleidungs-physiologisches institut Hohenstein e.V. (BPi) veröffentlicht. das BPi veranstaltet Seminare, Kolloquien und Workshops hauptsächlich, aber nicht nur, für die textilindustrie. diese Veranstal-tungen informieren und fördern den dialog mit der industrie. des weiteren werden in zahlreichen Workshops und Seminaren der „technischen Akademie Hohenstein die forschungsergebnisse industrievertretern vorgestellt und diskutiert. dem gleichen zweck dienen Vortragsveranstaltungen, wie z.B. die jährlich stattfindende „Hohensteiner

innovationsbörse“ in deren rahmen die abge-schlossenen forschungsvorhaben in kurzen und allgemein verständlichen Vorträgen präsentiert werden, sowie zukunftsforen, die das BPi für die textilindustrie durchführt.die forschungsergebnisse werden weiterhin auf verschiedenen Konferenzen und tagungen präsen-tiert. Am 27.01.2006 wurden die Ergebnisse des Vorhabens auf der 2. Hohensteiner innovations-börse, einem großen fachpublikum der deutschen textilindustrie unterbreitet. im februar 2006 wurde zu gleichem thema im deutschlandradio Kultur ein interview gegeben.

44


44

1. Baer, W. S., (1931) the treatment of chronic osteomyelitis with the maggot (larva of the blowfly) J Bone and Joint Surg 13: 438 - 475

2. Bowles, d., Grey, S. t., and Brandon, M. r., (1992) Cellular immune response in the skin of sheep infected with larvae of Lucilia cuprina, the sheep blowfly Vet.Parasitol. 44: 151 - 162

3. Cocianchich, S., Ghazi, A., Hetru, C., Hoffmann, J. A., and Letellier, L., (15-9-1993) insect defensins, an iducible Antibacterial Peptide, forms Volatage-dependent Channels in Micrococcus lu-teus the Journal of Biological Chemistry 268: 19239 - 19245

4. dissemond, J., (2004) der Einfluss des pH-Wertes auf die Wundheilung zfW 5: 242 - 243

5. Erdmann, G. r. and Khalil, S. K. W., (2004) isolation and identification of two Antibacterial Agents Produced ba a Strain of Proteus Mirabilis isolated from Larvae of the Screwworm (Cochliomyia Hominivorax) (diptera: Calliphoridae) J.Med.Entomol. 23: 208 - 211

6. fleischmann, W., (1998) Lasst Maden an die füsse! Medical tribune 21:

7. fleischmann, W. and Grassberger, M., (2002) Erfolgreiche Wundbehandlung durch Maden-therapie.

8. fleischmann, W., russ, M., Moch, d., and Marquardt, C., (1999) Biochirurgie - Sind fliegenmaden wirklich die bes-seren Chirurgen = Chirurg 70: 1340 - 1346

6.. Literatur

9. fleischmann, W., russ, M., Moch, d., and Marquardt, C., (1999) Biochirurgie - Sind fliegenmaden wirklich die bes-seren Chirurgen ? Chirurg 70: 1340 - 1346

10. Grassberger, M., (2002) Was die Maden alles können Medreport A2: 4 - 4

11. Grassberger, M. and frank, C., (9-10-2003) Wundheilung durch sterile flie-genlarven: mechanische, biochemische und mikrobiologische Grundlagen Wie-ner Medizinische Wochenschrift 198 - 201

12. Grassberger, M. and reiter, C., (2001) Effect of temperature on Lucilia sericata (diptera: Calliphoridae) development with special reference to the isomega-len - and isomorphen - diagram foren-sic Science international 120: 32 - 36

13. Greenberg, B., (1968) Model for the destruction of bacteria in the midgut of blow fly maggots J.Med.Entomol. 5: 31 - 38

14. Gwatkin, r. and fallis, M., (1938) Bactericidal and Antigenic Qualities of the Washings of Blowfly Maggots Canadian Journal of research 16: 343 - 352

15. Gwatkin, r. and fallis, M., (1938) Bac-treicidal and Antigenic Qualities of the Washings of Blowfly Maggots Canadian Journal of research 16: 343 - 352

16. Hobson, r. P., (1931) on an enzyme from blow-fly larvae (Lucilia sericata) which digests collagen in alkaline soluti-on Biochemistry 25: 1458 - 1463

45


17. Hoffmann, J. A., (1995) innate immuni-ty of insects Current opinion in immu-nology 7: 4 - 10

18. Hoffmann, J. A. and Hetru, C., (1992) insect defensins: inducible antibacterial peptides immunology today 13: 411 - 415

19. Livingston, S. K. and Prince, L. H., (2-4-1932) the treatment of chronic osteo-myelitis Jour.A.M.A. 98: 1143 - 1149

20. Mumcuoglu, K. y., (2001) Clinical appli-cations for maggots in wound care Am J Clin dermatol 2: 219 - 227

21. Mumcuoglu, K. y., Miller, J., Mum-cuoglu, M., friger, M., and tarshis, M., (2001) destruction of Bacteria in the digestive tract of the Maggot of Lucilia sericata (diptera: Calliphoridae) J.Med.Entomol. 38: 161 - 166

22. Pavillard, E. r. and Wright, E. A., (2-11-1957) An Antibiotic from Maggots nature 180: 916 - 917

23. Pechter, E. A. and Sherman, r. A., (1983) Maggot therapy: the surgical metamorphosis Plast.reconstr.Surg. 72: 567 - 570

24. Pendola, S. and Greenberg, B., (1975) Substrate-specific Analysis of Proteolytic Enzymes in the Larval Midgut of Calli-phora vicina Ann.Entomol.Soc.Am. 68: 341 - 345

25. Prete, P. E., (1997) Growth effects of Phaenicia sericata larval extracts on fibroblasts: mechanism for wound hea-ling by maggot therapy Life Sci. 60: 505 - 510

26. robinson, W., (1933) the use of blowfly larvae in the treatment of infected wounds Ann.Entomol.Soc.Am. 26: 270 - 276

27. robinson, W. and norwood, V. H., (1934) destruction of Pyogenic Bacte-ria in the Alimantary tract of Surgical Maggots implanted in infected Wounds Journal of Laboratory and Clinical Medi-cine 19: 581 - 586

28. Sherman, r. A. and Pechter, E. A., (1988) Maggot therapy: a review of the therapeutic applications of fly larvae in human medicine, especially for treating osteomyelitis Med.Vet.Entomol. 2: 225 - 230

29. Simmons, S. W., (1935) A Bactericidal Principle in Excretions of Surgical Mag-gots which destroys important Etio-logical Agents of Pyogenic infections J.Bacteriology 30: 267 -

30. thomas, S., Andrews, A., Hay, n. P., and Bourgoise, S., (21-7-1999) the anti - microbial activity of maggot secretions: results of a preliminary study Journal of tissue Viability 9: 127 - 131

31. thomas, S., Jones, M., Shutler, S., and Andrews, A., (1996) Wound care. All you need to know about ... maggots nurs.times. 92: 63 - 6,68,70

32. thomas, S., Jones, M., Shutler, S., and Jones, S., (1996) Using larvae in modern wound management [see comments] J.Wound.Care 5: 60 - 69

33. Vistnes, L. M., Lee, r. M., and Ksander, G. A., (30-4-1981) Proteolytic activity of blowfly larvae secretions in experimen-tal burns Surgery 90: 835 - 841

46


46

34. ziffren, S. E., Heist, H. E., May, S. C., and Womack, n. A., (1953) the secre-tion of collagenase by maggots and its implication Ann.Surg. 138: 932 - 934

35. M. Bischoff, L. Kinzl, P. frei, M. trut-mann, (2000) Bakterizidie des Wund-sekrets bei der Vakuumversiegelung bei traumatischen Wunden. zentralbl Chir 125: Abstract 82 – 83

Wundauflagen aus natürlichen rohstoffen mit regulierbarer ... · 11a. No. of Pages Report 46 11b....

Documents

Transcript of Wundauflagen aus natürlichen rohstoffen mit regulierbarer ... · 11a. No. of Pages Report 46 11b....