Phytohormone 2

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WWU-MünsterProf. Jörg Kudla

Aufbau-Modul:

Zellbiologie, Physiologie und Genetik

Vorlesung:

Phytohormone: Wirkung und Signaltransduktion

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption und primären Signalweiterleitung

• Auxin (ähnliche Mechanismen bei GA und JA)

• Cytokinin

• Brassinosteroid

• Abscisinsäure

• Ethylen

Phytohormone 2

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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Auxin, Jasmonat und Gibberellin

Auxin

GAJA

Degradation von negativen Regulatoren resultiert in derTranskription von Antwortgenen

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Auxin Signalweg – Das Prinzip

Inhibition von

Transkriptionsfaktoren

durch Interaktion mit

negativen Regulatoren

Degradation der

negativen Regulatoren

hebt die Transkriptions-

faktorinhibiton auf

Transkription der

Auxinantwort Gene

Keine Auxinantwort

Auxinkein Auxin

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• TIR1: Transport Inhibitor Response 1

(Rezeptor, F-box Protein)

• AUX/IAAs: Auxin/Indole-3-Acetic Acid Proteins

(TF-Inhbitoren)

• SCF: Ubiquitinligase Komplex (markiert Proteine

für folgende Degradation)

• Ub: Ubiquitin (Degradationssignal)

• 26S: 26S Proteasome

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Auxin Signalweg – Abkürzungen

K: Lysine

Ub: Ubiqitin

• Das stark konservierte Ubiquitin Protein (Ub) dient als wiederverwendbares Signal

für gezielten Proteinabbau

• Ubiquitinierung: kovalente Bindung von Ub an ein freies Lysin des Zielproteins

• Ub-Zielprotein Fusionen werden durch das 26S Proteasom erkannt

• 26S Proteasom degradiert die Ub-markierten Zielproteine

• Endprodukte: Aminosäuren und Ub

Ub-target conjugate

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Der Ubiquitin / 26S Proteasom Weg: Das Prinzip

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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Der Ubiquitin / 26S Proteasom Weg:

Ub-Bindung und Wiederverwendung

• E1: Ub-aktivierendes Enzym

(ATP abhängige Ub-“Aktivierung”)

• E2: Ub-Bindungs Enzym

(liefert Ub zu Zielprotein und nutzt

E3 als Katalysator)

• E3: Ub-Protein Ligase

(Substraterkennung und Initiation

der Bindung)

• DUBs: Deubiquitinierendes Enzym

• Fünf E3 Arten wurden identifiziert (hier: SCF)

• SCF E3 ist ein Komplex aus vier Proteinen die

zusammen Ub-Ligaseaktivität besitzen

• RBX1 vermittelt Bindung von E2-Ub an den SCP

Komplex

• E3 hat eine Gerüstfunktion und bringt E2-Ub in

räumliche Nähe zum Zielprotein

• E2 transferiert Ub an freie Lysine des Zielproteins

Zielprotein ist durch Ub für die Degradation markiert

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Der Ubiquitin / 26S Proteasom Weg:

Ub – Bindung durch den SCF Komplex

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TIR1

Aux/ IAA

TIR1Auxinrezeptor

AUX/IAATF-Inhibitoren der Auxin-antwort

= SCF complex

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Der Ubiquitin / 26S Proteasom Weg und Auxin

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Details des Auxin Signalwegs

TIR1: Transport Inhibitor Response 1

• Auxinrezeptor (Tasche an der Oberfläche für

Auxin)

• F-Box Protein welches SCFTIR1/AFBs bildet

AFB1-5: Auxin-Signaling F-Box Proteins

• Auxinrezeptoren

• F-Box Proteine

• TIR1 Homologe

AFB1-5

Auxin

Rezeptoren

an SCF

gebunden

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AUX/IAAs: Auxin/Indol-3-Essigsäure-Proteine

• Negative Regulatoren von Transkriptionsfaktoren

• Bindet alleine kein Auxin, bindet nur Auxin, das

sich bereits in TIR1 Auxinbindetaschen befindet

Auxin

Ubiquitinierung von AUX/IAA Proteinen (im

Komplex mit SCFTIR1) markiert diese negativen

Transkriptionsregulatoren für die Degradation

durch den 26S Proteasom Weg

Für Degradation markiert

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Details des Auxin Signalwegs

Ohne Auxin:

• Transkriptionsfaktoren sind durch

physikalische Interaktion mit Repressoren

(AUX/IAA) inaktiviert

Auxin-Antwortgene werden nicht transkribiert

Nach Auxinbindung an Rezeptor (TIR1):

• Repressoren (AUX/IAA) werden degradiert

• Transkriptionsfaktoren werden nicht mehr

inaktiviert

Auxin-Antwortgene werden transkribiert

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Auxin - Effekte auf das Transkriptom

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Auxin-binding protein 1 (ABP1):

• ER-lokalisiertes Protein

• geringe Mengen ABP1 wirken an der PM als Auxin Rezeptor

• Auxin blockt ABP1 vermittelt Endocytose von PIN-Proteinen

• Der ABP1 Signalweg aktiviert K+ Kanäle und H-ATPasen

• Der ABP1 Signalweg aktiviert des weiteren Rho GTPasen, welche Auxin Signale weiterleiten

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:ABP1: ein weiterer Auxin-Rezeptor

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Jasmonat Signalweg - Abkürzungen

• COI1: Coronatine Insensitive 1

(Rezeptor, F-box Protein)

• JAZs: Jasmonat ZIM-Domänen

Proteine (Transkriptionsfaktor-

Inhibitoren)

• SCF: Ubiquitinligase Komplex

JA

Jasmonatrezeptor

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Ohne Jasmonat:

• Transkriptionsfaktoren sind durch physikalische

Interaktion mit Repressoren (JAZ) inaktiviert

Jasmonat-Antwortgene werden nicht transkribiert

Nach Jasmonatbindung an Rezeptor (COI1):

• Repressoren (JAZ) werden degradiert

• Transkriptionsfaktoren werden nicht mehr inaktiviert

Jasmonat-Antwortgene werden transkribiert

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Jasmonat – Effekte auf das Transkriptom

• GID1: “GA Insensitive Dwarf 1”

(GA Rezeptor aus Reis, kein F-Box

Protein)

• DELLA: Aminosäuresequenz einer

charakteristischen N-terminalen

Domäne (Inhibitor von

Transkriptionsfaktoren)

• SCF: Ubiquitinligase Komplex

(markiert Proteine für folgende

Degradation)

• SCF complex F-box proteins :

• GID2: “GA Insensitive Dwarf 2”

SLY1: SLEEPY1 (Arabidopsis)

GA

Gibberellinrezeptor

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Gibberellin Signalweg - Abkürzungen

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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Gibberellin – Effekte auf das Transkriptom

Ohne Gibberellin:

• Transkriptionsfaktoren sind durch physikalische

Interaktion mit Repressoren (DELLA) inaktiviert

Gibberellin-Antwortgene werden nicht

transkribiert

Nach Gibberellinbindung an Rezeptor (GID1):

• Repressoren (DELLA) werden degradiert

• Transkriptionsfaktoren werden nicht mehr

inaktiviert

Gibberellin-Antwortgene werden transkribiert

Molekulare Mechanismen der HormonperzeptionUnterschiede in der SCF-Komplex Bildung

Direkte Interaktion zwischen Rezeptor undSCF-Komplex möglich, da der Rezeptorselbst ein F-Box Protein ist

Rezeptor

Gerüstprotein (F-Box Protein)vermittelt SCF Interaktion

Rezeptor

Jasmonat GibberellinAuxin

GID2: Reis

SLY1: Arabidopsis

TF-Inhibitor

TF-Inhibitor

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Jasmonat GibberellinAuxin

* **

* = F-box Protein

Rezeptor = F-box Protein Rezeptor ǂ F-box Protein

Durch austauschen der F-Box Untereinheit kann ein SCF-E3 Komplex spezifisch verschiedene Zielproteine erkennen und ubiquitinieren.

Molekulare Mechanismen der HormonperzeptionUnterschiede in der SCF-Komplex Bildung

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Cytokinin, Brassinosteroid und Abscisinsäure Signalwege

Signalweiterleitung geschieht durch reversible Phosphorylierungskaskaden, die die Regulation von Transkriptionsfaktoren

steuern

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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Cytokinin Signalweg – das Prinzip

Signal Perzeption

• Phosphorylierung einer Histidin Kinase

Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren (TFs)

Phosphorylierte TFs steuern die Expression von Cytokinin Antwortgenen

receptor

• AHK: Arabidopsis Histidin Kinase

• AHPs: Arabidopsis Histidin

Phosphotransfer Proteine

• ARRs: Arabidopsis Response Regulators

(Transkriptionsfaktoren)

• CRF: Cytokinin Response Factors

(Transkriptionsfaktoren)

receptor

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Cytokinin Signalweg – Abkürzungen

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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Cytokinin Signalweg Teil 1: Phosphotransfer

• AHK bindet über die CHASE Domäne

Cytokinin

• Cytokinin Bindung führt zur Phosphorylierung

von AHK

• AHPs (5 in Arabidopsis)

• Positive Regulatoren des Signalwegs

• Können zwischen Cytoplasma und Zellkern

pendeln

• Bringen das Phosphat zu ARRs im Zellkern

• ARRs (durch Phosphotransfer aktiviert)

• Typ B: aktivieren Cytokinin Antwortgene

• Typ A: inhibieren Typ-B ARRs

P = Phosphorylierung

receptor

cytosol

nucleus

+ -

• Durch B-ARRs positiv regulierte Gene:

1) A-ARRs

2) CRFs

3) andere Cytokinin Antwortgene

• CRFs regulieren Cytokinin-vermittelte Antworten

der Pflanze positiv

• A-ARRs

• Regulieren Cytokinin Antwortgene negativ

• Inhibition von B-ARRs (negative

Rückkopplung)P = Phosphorylierung

cytosol

nucleus

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3

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Cytokinin Signalweg Teil 1: Regulation der Transkription

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inaktiv

kein Cytokinin Cytokinin Bindungkein Cytokinin:

• Rezeptorkinase inaktiv, kein Phosphotransfer

• TF nicht phosphoryliert (inaktiv)

Antwortgene werden nicht transkribiert

Cytokinin Bindung durch Rezeptor (AHK):

• Rezeptorkinase ist aktiv, Phosphotransfer

zum Zellkern

• TFs werden phosphoryliert

Antwortgene werden transkribiert

cytosol

nucleus

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Cytokinin Signalweg: Effekt auf das Transkriptom

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Brassinosteroid Signalweg – Das Prinzip

BR bindet an eine Rezeptor ähnliche Kinase

Heteromerisierung, Phosphorylierungen

Nicht phosphorylierte TFs aktivieren BR Antwortgene

Freisetzung der BR-Signalkinase

Phosphorylierungen / Dephosphorylierungen

BAK1

PM

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• BRI1: Brassinosteroid Insensitive 1

(Rezeptor-ähnliche-Kinase)

• BKI1: BRI1 Kinase Inhibitor

• BAK1: BRI1-Assoziierter Rezeptor

Kinase 1 (Positiv regulierende Komponente

des Rezeptors)

• BSK: BR-Signal Kinase

(vermittelt die Signaltransduktion in den

Zellkern)

BAK1

BRI1 = BR-Rezeptor

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Brassinosteroid Signalweg Teil 1 – Abkürzungen

• BR Bindung an den Rezeptor initiiert

die Dissoziation des Kinase

Inhibitors BKI1

• Anschließend interagiert der positive

Regulator BAK1 mit dem Rezeptor

• Zahlreiche Phosphorylierungs-

ereignisse führen letztendlich zur

Phosphorylierung und Freisetzung

der Kinase BSK1

BAK1

BRI1 = BR-Rezeptor

inhibiert BRI1

aktiviert BRI1BAK1

P = Phosphorylierung

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Brassinosteroid Signalweg Teil 1: Freisetzen der Kinase

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• BSK: BR-Signalkinase

• BSU1: BRI1 Supressor (Phosphatase)

• BIN2: Brassinosteroid Insensitive 2

(Kinase)

• BES1: BRI1-EMS Suppressor

• BZR1: Brassinazole Resistant 1

(TFs, positive Regulatoren der BR Antwort)

• PP2A: Protein Phosphatase 2A

TF aktiv TF inaktiv

TF = Transkriptionsfaktor

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Brassinosteroid Signalweg Teil 2 – Abkürzungen

• BSK bindet an die Phosphatase BSU1

• Anschließend dephosphoryliert und

inaktiviert BSU die Kinase BIN2

• Die Inaktivierung von BIN2 führt zur

Akkumulation der nicht

phosphorylierten und damit aktiven

TFs BES1/BZR1 (PP2A dephos-

phoryliert diese TFs zusätzlich)

• Aktive BES1/BZR1 rekrutieren weitere

TF-Proteins und induzieren die

Expression von Antwortgenen

TF aktiv TF inaktiv

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Brassinosteroid Signalweg Teil 2 – Regulation der Transkription

TF = Transkriptionsfaktor

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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Brassinosteroid - Effekt auf das Transkriptom

Kein Brassinosteroid:

• Rezeptor-ähnliche-Kinase ist inaktiv, “Signalkinase” (BSK) wird

nicht freigesetzt

• Transkriptionsfaktoren sind phosphoryliert (inaktiv)

Brassinosteroid-Antwortgene werden nicht transkribiert

Brassinosteroid Bindung an den Rezeptor(BRI1):

• Rezeptor-ähnliche-Kinase ist aktiv, “Signalkinase” (BSK)

wird freigesetzt

• Transkriptionsfaktoren sind nicht phosphoryliert (aktiv)

Brassinosteroid-Antwortgene werden transkribiert

P

inaktiv

aktiv

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Ethylen Signalweg – Das Prinzip

Rezeptor bindet Ethylen

Inhibition der Ethylenantwort durch den Rezeptor wird aufgehoben

Unbekannte Mechanismen steuern die Transkriptionskaskade

Transkription von Ethylen Antwortgenen

Die Degradation positiver Regulatoren durch das 26S Proteasom wird inhibiert

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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Ethylen Signalweg - Abkürzungen

• ETR1: Ethylene Response 1 (Rezeptor)

• CTR1: Constitutive Triple Response

(MAPKK Kinase)

• EIN2: Ethylene Insensitive 2 (überaus

mysteriöses Transmembranprotein)

• EIN3: Ethylene Insensitive 3 (TF)

• EIL1: EIN3-Like Protein (TF)

• SCF Komplex Komponenten:

• ETP1+2: EIN2 Targeting Protein 1/2

• EBF1+2: EIN3 Binding F-Box 1/2

integral membraneprotein

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Der Ethylen Signalweg – ETR1 wirkt als negativer Regulator

• Der Ethylen Rezeptor ETR1 bindet CTR1

(MAPKKK) und inhibiert EIN2

• ETR1 wirkt als konstitutiv aktiver negativer

Regulator, wenn kein Ethylen gebunden ist

• Proteinmengen von EIN2 und von

Signalweg TFs EIN3/EIL1werden durch

26S Proteasom Degradation reduziert

• Keine Transkription von Antwortgenen

Kein Ethylen

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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Ethylen Signalweg – ETR1 ist ein negativer Regulator

• Ethylenbindung durch ETR1 führt zur

Dissoziation und Inaktivierung von CTR1

• Inhibition der 26S Proteasom vermittelten

Degradation von EIN2 und TFs sowie

Aufhebung der Inhibition von EIN2

• Aktiviertes EIN2 wirkt als positiver

Regulator von EIN2/EIL1 (TFs)

• EIN3/EIL1 aktivieren “downstream”

Signalkomponenten sowie spezifische TFs

für die Transkription weiterer Antwortgene

TF

Ethylen an ETR1 gebunden

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption: Ethylen Signalweg – EIN2 C-Terminus wird nach Proteolyse in den Zellkern

transportiert

- Ethylen + Ethylen

• ETR1 bindet CTR1 (MAPKKK)

und inhibiert EIN2

• Phosphorylierung des EIN2 C-

Terminus erfolgt durch CTR1

• Phosphoryliertes EIN2 ist inaktiv

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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption: Ethylen Signalweg – EIN2 C-Terminus wird nach Proteolyse in den Zellkern

transportiert

- Ethylen + Ethylen

• Ethylenbindung an ETR1 führt

letztendlich zur

Dephosphorylierung vom EIN2

C-Terminus

• Proteolytische Spaltung des C-

Terminus erfolgt an einer

dephosphorylierten Position

• EIN2 C-Terminus wird vom ER in

den Nukleus transportiert uns ist

an der Transkriptionsaktivierung

beteiligt

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Ethylen Signalweg – Effekt auf das Transkriptom

Kein Ethylen:

• ETR1 (Rezeptor) reprimiert die Ethylenantwort

• 26S Proteasome degradiert positive Regulatoren

Antwortgene werden nicht transkribiert

Ethylen bindet an den Rezeptor (ETR1):

• ETR1-Ethylenbindung hebt die Repression von

Signalwegkomponenten auf

• Degradation von positiven Regulatoren durch das 26S

Proteasome wird reduziert

Transkription von Antwortgenen

Kein Ethylen Ethylene gebunden

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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Abscisinsäure wird durch verschiedene Rezeptoren gebunden

• GTG1+2: GPCR-Typ G-Protein

• PYR: Pyrabactin Resistant

• PYL: Pyrabactin Resistant Like

• RCAR: Regulatory Component of

ABA Receptors

• ABAR: “ABA Receptor“

• CHlH: Chelatase H Subunit

Plasma-membran

Nucleo/Zyto-plasmatisch

Chloroplast

???

???

bestätigt

• ABA bindet an PYR/PYL/RCAR

• Nach der ABA Bindung interagiert der Rezeptor mit PP2Cs

(Protein Phosphatase 2C)

• Die Bildung des Rezeptor/ABA/PP2C Komplex hebt die

Phosphataseaktivität der PP2Cs auf, diese können SnRK2

Kinasen nicht mehr inhibieren

• Autophosphorylierung der SnRK2s ermöglicht die

Phosphorylierung von TFs

• Phosphorylierte TFs aktivieren die langfristige ABA Antwort

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Abscisinsäure wird durch verschiedene Rezeptoren gebunden

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Ohne ABA:

• Ohne ABA können die PYR/PYL/RCAR

Rezeptoren PP2Cs nicht inhibieren, diese

inhibieren SnRK2 Kinasen

• TFs werden nicht phosphoryliert (inaktiv)

ABA Antwortgene werden nicht transkribiert

ABA wird vom Rezeptor gebunden

(PYR/PYL/RCAR):

• ABA bindet an Rezeptor und inhibiert PP2Cs, was zu

aktiven SnRK2s führt

• TFs werden phosphoryliert

Transkription der Antwortgene

inaktiv

inhibition inhibitionreleased

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Abscisinsäure wird durch verschiedene Rezeptoren gebunden

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Stomata – molekulare Details einer kurzfristigen ABA Antwort

Phytohormone 2

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ABA – schnelle und langfristige Antwort

Sowohl kurzfristige ABA-Antworten, wie der Stomataschlussbei Wassermangel (reguliert über Aktivität von Ionenkanälen),als auch langfristige Antworten, wie Keimungshemmung undWachstumsinhibition durch das Hormon (reguliert durchAktivität von Transkriptionsfaktoren), werden durch diegleichen Signalwegkomponenten vermittelt!

Beispiel:Die abi1-1 Phosphatase Mutante zeigt sowohl in kurzfristigenals auch in langfristigen Prozessen Phänotypen!

WT abi1-1

Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Subzelluläre Lokalisation von Phytohormonrezeptoren

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Integration von Hormonwegen

Hormonsignalwege beeinflussen sich gegenseitig!Ein Hormon kann den Signalweg eines anderen auf drei Arten regulieren:

1. Synthese des zweiten Hormons wird regulierta) Ethylen und Auxin kontrollieren für die Synthese des anderen Hormons kritische Gene

2. Transport des zweiten Hormons wird verändert b)Cytokinin inhibiert Expression von PIN Auxintransportern

3. Zwei Signalwege wirken parallel auf das gleiche Zielprotein c) die BR-regulierte BIN2 Kinase reguliert den eigentlich Auxin-regulierten TF ARF2)d) Die Stabilität der DELLA Proteine wird durch andere Hormonwege beeinflusst

d)

d)

d)

a)

a)

b)

c)

Integration von HormonwegenBeispiel: ABA inhibiert GA-induzierte DELLA Degradation

nach GA-Gabe werden DELLA:GFP Fusionsproteine abgebaut (links)durch Behandlung mit 20 µM ABA wird dieser Effekt aufgehoben

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Cytokinin:Durch Phosphotransfer vom Rezeptor am ER zu TFs im Zellkern wird das Signal weitergeleitet.

Auxin, Jasmonat, Gibberellin:Degradation negativer Regulatoren führt zur Transkription von Antwortgenen.

Brassinosteroid:Nach Hormonbindung an den Rezeptor and der PM wird eine Kinase freigesetzt, die eine Phosphorylierungs- / Dephosphorylierungskaskade startet, die schließlich TFs reguliert.

Abscisinsäure:ABA Bindung an den Rezeptor inhibiert eine Familie von Phosphatasen, die sowohl kurzfristige Antworten wie das Schließen von Stomata als auch langfristige Transkriptionsantworten steuern.

Ethylen:Ethylenbindung an den Rezeptor am ER hebt die Degradation positiver Regulatoren des Signalwegs auf und startet so die Transkription von Antwortgenen.

Molekulare Mechanismen der HormonperzeptionZusammenfassung