Einfluss eines gentechnisch veränderten, Auxin...

„Einfluss eines gentechnisch veränderten, Auxin produzierenden Rhizobienstammes auf die bakterielle

Bodengemeinschaft“

Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der

Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des

akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte

Dissertation

vorgelegt von

Diplom-Biologin

Corinna Lantin

aus Aachen

Berichter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Ursula B. Priefer

Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Andreas Schäffer

Tag der mündlichen Prüfung: 07.04.2008

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar

"Wenn du einen Hügel hinauf rennst, kannst du ruhig aufgeben, sooft du willst - solange

deine Füße in Bewegung bleiben."

Shoma Morita

.

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

A Einleitung ........................................................................................................... - 1 -

A.1 Die Rhizobien- Leguminosen Symbiose .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 1 - A.2 Rhizosphäre und Rhizoplane.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 3 - A.3 Wirkung von Indol-3-Essigsäure auf das Wachstum der Pf lanzen .. . - 5 - A.4 Die bakter ie l le Gemeinschaft im Boden .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 7 -

A.4 .1 Moleku larb io log ische Ana lysen der bakter ie l len D ivers i tä t im Boden . . . . . . . - 8 - A.4 .2 Mikroskop ische Detek t ion von hor izonta lem Gentransfer (HGT) . . . . . . . . . . . . - 10 -

A.5 Freisetzung von gentechnisch modi f iz ier ten Organismen (GMO) zur

Verbesserung der Landwir tschaft – Vortei le und Problemat iken .. . . . . . . . . . . . - 13 - A.6 Erntesteigerung bei Leguminosen durch bakter ie l le

Phytohormonprodukt ion - das Songl ines EU-Projekt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 16 -

B Zielsetzungen................................................................................................... - 18 -

B.1 Die Entwick lung eines kul t iv ierungsunabhängigen Detekt ionssystems

für den HGT bei Bodenbakter ien .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 18 - B.2 Die Analyse mögl icher Veränderungen innerhalb der

Zusammensetzung und Diversi tät der Bakter iengemeinschaft in Anwesenheit

des gentechnisch veränderten Rhizobienstamms .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 19 -

C Material und Methoden ................................................................................... - 20 -

C.1 Mater ia l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 20 - C.1 .1 Chemika l ien und Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 20 - C.1 .2 Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 22 - C.1 .3 Bakter iens tämme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 23 - C.1 .4 Pf lanzenmater ia l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 24 -

C.2 Mikrobiologische Methoden .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 25 - C.2 .1 Bakter ienku l t i v ie rung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 25 - C.2 .2 Hers te l lung von Glycer inku l tu ren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 26 - C.2 .3 Messung des Bakter ien t i te rs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 27 - C.2 .4 Hers te l lung kompeten ter Ze l len . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 27 - C.2 .5 Mobi l i s ie rung von P lasmiden aus E. co l i nach R. leguminosarum . . . . . . . . . . - 29 - C.2 .6 Analyse der P lasmids tab i l i tä t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 30 - C.2 .7 Hor izonta ler Gent ransfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 31 - C.2 .8 Versuche auf N i t roce l lu lose f i l te rn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 31 - C.2 .9 Konjugat ionsversuche in s ter i le r und unster i le r Erde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 32 - C.2 .10 Mikroskop ische Detek t ion von hor izonta lem Gentransfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 33 - C.2 .11 Konjugat ionsversuche auf Schrägagarp la t ten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 34 - C.2 .12 Untersuchung des hor izon ta len Gent rans fers in s te r i len Mik rokosmen . . - 35 -

C.3 Pflanzenkul t iv ierung .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 36 - C.3 .1 Samenster i l i s ie rung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 36 - C.3 .2 Pf lanzennodu la t ionsmedium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 37 -

Inhaltsverzeichnis

II

C.3 .3 Boden fü r d ie P f lanzenku l t i v ie rung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 38 - C.3 .4 Eigenschaf ten des Bodens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 38 - C.3 .5 Inoku la t ion der P f lanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 39 - C.3 .6 Ober f lächenster i l i sa t ion von Wurze lknö l l chen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 39 -

C.4 Plasmidkonstrukt ionen .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 40 - C.4 .1 pK19gabTgenta1 lac I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 40 - C.4 .2 pPJ2plac . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 40 - C.4 .3 pJPeGFPplac und pJPdsRedplac . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 41 - C.4 .4 pHR-P lasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 42 -

C.5 Molekularbiologische Methoden.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 43 - C.5 .1 I so l ie rung von P lasmid-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 43 - C.5 .2 I so l ie rung von Gesamt-DNA aus Bakter ien (CTAB-Methode) . . . . . . . . . . . . . . . . - 43 - C.5 .3 DNA-Konzent ra t ionsbest immung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 45 - C.5 .4 DNA-Spal tung durch Restr ik t ionsendonuk leasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 45 - C.5 .5 Agarose-Gele lek t rophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 45 - C.5 .6 Größenabschätzung von DNA-Fragmenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 46 - C.5 .7 I so l ie rung von DNA-Fragmenten aus Agarosege len . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 46 - C.5 .8 Auf fü l len von Rest r i k t ionsenden ( f i l l - in ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 46 - C.5 .9 Dephosphory l ie rung l inearer DNA-Molekü le . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 47 - C.5 .10 L igat ion von DNA-Fragmenten. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 47 - C.5 .11 Auf t rennung von P lasmidpro f i len (Eckhard t Lyse) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 48 - C.5 .12 Vakuumblo t t ing von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 49 - C.5 .13 Hers te l lung Digox igen in-dUTP mark ier ter Sonden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 51 - C.5 .14 Immunolog ische Nachweisreakt ion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 54 - C.5 .15 Ext rak t ion von DNA und RNA aus der Rh izosphäre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 55 - C.5 .16 Abbau der DNA und reverse Transkr ip t ion (RT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 57 - C.5 .17 Polymerase-Ket tenreak t ion (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 58 - C.5 .18 Denatur ie rende Grad ienten Gele lek t rophorese (DGGE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 61 - C.5 .19 Si lber färbung (nach Radojkov ica & Kus ic , 2000) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 63 - C.5 .20 TOPO-TA-Klon ie rung® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 65 - C.5 .21 Sequenz ierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 66 - C.5 .22 Termina ler Rest r ik t ions-Fragment Längen Po lymorph ismus ( tRFLP) . . . . . - 66 -

C.6 Analyt ische Methoden .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 68 - C.6 .1 Quant i ta t i ve IAA-Messung (nach Gl i ckmann & Dessaux, 1995) . . . . . . . . . . . . . - 68 - C.6 .2 Gaschromatograph ie und Massenspekt roskop ie (GC-MS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 69 -

C.7 Stat is t ik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 71 - C.7 .1 Mul t id imens iona le Ska l ierung (MDS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 71 - C.7 .2 Bivar ia te Kor re la t ionen – Mante l Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 72 - C.7 .3 Var ianzana lyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 73 -

C.8 Software .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 74 -

D Ergebnisse und Diskussion ........................................................................... - 75 -

D.1 Tei l 1 – Die Entwick lung eines kul t iv ierungsunabhängigen

Detekt ionssystems für den HGT bei Bodenbakter ien .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 75 - D.1 .1 Hor izonta ler Gent ransfer auf N i t roce l lu losef i l te rn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 75 -

Inhaltsverzeichnis

III

D.1 .2 Southern Hybr id is ie rung zum Nachweis des Transfers von pRleVF39b aus

VF39 [genta lac I ] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 83 - D.1 .3 Hor izonta ler Gent ransfer in s ter i lem und unster i lem Boden. . . . . . . . . . . . . . . . . . - 84 - D.1 .4 Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 86 - D.1 .5 Fluoreszenzmikroskop ische Detek t ion des hor izonta len Gent rans fers . . . - 88 - D.1 .6 Verg le ichende Auswer tung durch F luoreszenzmikroskop ie und KBE . . . . . . - 90 - D.1 .7 Untersuchung des hor izon ta len Gent rans fers in s te r i len Mik rokosmen . . - 92 - D.1 .8 Konjugat ionsversuche auf Schrägagarp la t ten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 95 - D.1 .9 Plasmidstab i l i tä t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 97 - D.1 .10 Zusammenfassung – Ergebn isse und Diskuss ion Te i l 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 99 -

D.2 Tei l 2 – Einf luss der gentechnisch veränderten Rhizobienstämme auf

die bakter ie l le Gemeinschaft im Boden .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 100 - D.2 .1 In v i t ro IAA Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 101 - D.2 .2 Versuchsansatz 1 : Analyse der bak ter ie l len Gemeinschaf t in der

Rh izosphäre und Rhizop lane der Erbse nach neunwöchiger Inkuba t ionsze i t . . . . - 103 - D.2 .3 Versuchsansatz V2: Analyse der bak ter ie l len Gemeinschaf t in der

Rh izosphäre und Rhizop lane der Erbse nach zehntäg iger Inkubat ionsze i t . . . . . . - 117 - D.2 .4 Versuchsansatz V3: Analyse der bak ter ie l len Gemeinschaf t in der

Rh izosphäre und Rhizop lane der Luzerne nach zehntäg iger Inkubat ionsze i t . . . - 122 - D.2 .5 Versuchsansatz V4: Analyse der bak ter ie l len Gemeinschaf t in der

Rh izosphäre und Rhizop lane der Erbse nach zwöl fwöch iger Inkubat ionsze i t . . . - 128 - D.2 .7 Analyse der IAA Konzentra t ion in der Rh izosphäre (V 1- 4) . . . . . . . . . . . . . . . - 132 - D.2 .8 Zusammenfassung IAA Synthese der versch iedenen VF39-Stämme . . . . - 137 - D.2 .9 Sequenz ier te DGGE Banden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 139 - D.2 .10 Phänotyp ische Veränderungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 142 - D.2 .11 Veränderungen im Ersche inungsb i ld der Wurze lknö l l chen . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 144 - D.2 .12 Veränderungen im Ersche inungsb i ld der Wurze ln . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 146 - D.2 .13 Stat is t i sche Auswer tung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 147 - D.2 .14 Ergebn isse der wei te ren b ivar ia ten Mante l tes ts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 154 - D.2 .15 Ergebn isse der Var ianzana lyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 155 - D.2 .16 Zusammenfassung Ergebn isse und D iskuss ion Te i l 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 156 -

E Zusammenfassung und Ausblick ................................................................ - 158 -

F Literatur .......................................................................................................... - 160 -

G Anhang ........................................................................................................... - 183 -

G.1 Shannon Divers i tätsanalyse .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 183 - G.2 Auswertungen der tRFLP-Analysen des Versuchsansatzes V1 .. . - 187 - G.3 Abbi ldungsverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 191 - G.4 Tabel lenverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 192 - G.5 Abkürzungsverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 194 -

H Danksagung................................................................................................... - 198 -

I Lebenslauf...................................................................................................... - 199 -

Einleitung

- 1 -

A Einleitung

A.1 Die Rhizobien- Leguminosen Symbiose

Rhizobien werden in die Gattungen Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium,

Mesorhizobium und Azorhizobium unterteilt und sind aerobe Gram-negative Stäbchen.

Sie gehören überwiegend zur Klasse der α-Proteobakterien (Young, 1992). Nach

neueren Studien gibt es auch einige Vertreter unter den β-Proteobakterien (Chen et al.,

2003). Rhizobien sind die bakteriellen Symbiose-Partner der Leguminosen und

deswegen für die gentechnische Veränderung, die im Rahmen des Songlines EU-

Projekts durchgeführt wird, optimal geeignet.

Die Bakterien induzieren in den Leguminosen die Bildung von Wurzelknöllchen, in denen

sie zu Bakteroiden differenzieren. Unter den im Inneren der Knöllchen herrschenden

sauerstoffreduzierten Verhältnissen sind sie in der Lage, molekularen Stickstoff zu

fixieren und als Ammonium (NH4+) an die Leguminosen abzugeben (Gisi et al., 1997).

Sie werden im Gegenzug dazu von der Pflanze mit Kohlenstoffverbindungen versorgt

(Gage, 2004). Die Symbiose zwischen Leguminosen und den symbiontischen Rhizobien

ist wechselseitig hoch spezifisch, d.h. eine bestimmte Leguminosengattung kann die

Symbiose nur mit bestimmten Rhizobien (z.B. Bohne - R. phaseoli; Erbse – R.

leguminosarum bv. viciae) eingehen. Die gegenseitige Erkennung erfolgt über die

Exsudation von flavonoiden Verbindungen durch die Pflanze, die eine Expression der

nod Gene in den Rhizobien hervorrufen. Die nod Faktoren induzieren in den

Wirtspflanzen z.B. die Bildung neuer Wurzelhaare, die Bildung der so genannten

„Shepherd’s Crooks“ (Spaink, Kondorosi, Hooykaas, 1998). Außerdem induzieren sie zu

Beginn der Knöllchenbildung die erneute meristematische Aktivität im inneren Kortex der

Wurzel (Schultze & Kondorosi, 1998).

Die Morphologie der Wurzelknöllchen wird in erster Linie durch die Leguminosen

bestimmt. Grundsätzlich unterscheidet man zwei verschiedene morphologische Formen.

Zum einen gibt es die nicht-determinierten Knöllchen, die eine zylindrische bis

keulenförmige Gestalt haben und sich durch fortlaufendes Wachstum des weiterhin

aktiven Apikalmeristems auszeichnen. Bei diesem Wurzelknöllchentyp sind im

ausgereiften Knöllchen alle bakteriellen Entwicklungsstufen vorhanden. Diese

Wurzelknöllchen findet man z.B. bei Pisum sativum und Vicia hirsuta. Zum anderen

findet man determinierte Knöllchen, welche eine globuläre Struktur und ein nur zeitweise

aktives Meristem aufweisen. Bei diesem Typ durchläuft das Knöllchen als Ganzes den

Entwicklungsprozess zum reifen Wurzelknöllchen, in dem dann Stickstoff fixiert wird.

Einleitung

- 2 -

Determinierte Wurzelknöllchen findet man besonders bei tropischen Leguminosen wie

z.B. Phaseolus vulgaris, Glycine max oder Sesbania rostrata (Hadri et al., 1998).

Zu den Leguminosen gehören ca. 600 Gattungen mit über 13.000 Arten. Sie gliedern

sich in drei Unterfamilien, die Mimosoideae, die Caesalpinioideae und die

Papilionoideae, von denen die Letzte die größte Gruppe darstellt. Die Leguminosen sind

weltweit zu finden und spielen eine bedeutende Rolle in der Landwirtschaft. Sie liefern

aufgrund ihres hohen Proteingehalts einen essentiellen Beitrag zur Ernährung

insbesondere in Entwicklungsländern. Wichtige Vertreter sind Bohnen (Phaseolus),

Erbsen (Pisum), Sojabohnen (Glycine) und Luzerne (Medicago). Die Leguminosen

erreichen durch ihre Fähigkeit, im Wurzelbereich Symbiosen mit Bakterien und Pilzen

einzugehen, eine optimale Versorgung mit Stickstoff, Phosphaten und Mineralien.

Dadurch können sie auch auf sehr nährstoffarmen Böden gut kultiviert werden. Sie

werden außerdem als Zwischenfrucht angepflanzt um den Boden zu lockern und als

Gründüngung den Nährstoffgehalt, besonders den Stickstoffgehalt des Bodens

nachhaltig zu verbessern. Ein Anbau von Leguminosen hinterlässt bis zu 300 kg/ha

Stickstoff, so dass bei der nachfolgenden Fruchtart entsprechend Stickstoffdünger

eingespart werden kann (Selbitschka et al., 1997). Wegen ihrer besonderen Bedeutung

für die weltweite Ernährung und ihrer Fähigkeit in enger Assoziation mit Rhizobien zu

leben, sind Leguminosen für die Versuche des Songlines EU-Projekts ideale

Versuchspflanzen.

Einleitung

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A.2 Rhizosphäre und Rhizoplane

Der Lebensraum im Boden lässt sich grob in drei Bereiche unterteilen: Rhizoplane,

Rhizosphäre und „wurzelfreier“ Boden. Die beiden erstgenannten Bereiche werden

durch die Interaktion zwischen Pflanzenwurzeln, Boden und Mikroorganismen

charakterisiert, während im letztgenannten Bereich Pflanzenwurzeln keine Rolle spielen.

Die Rhizoplane ist der räumlich sehr eng begrenzte Bereich direkt auf der

Wurzeloberfläche. Sie setzt sich aus der gelatinösen Mucigelschicht, die aus toten

Pflanzenzellen, Wurzelexsudaten, Diffusaten, Mucilaten und Lysaten besteht und

unmittelbar anhaftenden Bodenpartikeln zusammen. Die Rhizosphäre ist der etwa 3 mm

breite Bereich, der durch die Abgabe organischer Substanzen von der Wurzel direkt

beeinflusst wird (Gisi et al., 1997).

In unmittelbarer Umgebung der Pflanzenwurzel kommt es durch den Nährstoffbedarf der

Pflanze zu einer stark abgesenkten Nährstoffkonzentration, was zu einer Konkurrenz

zwischen Pflanzen und Mikroorganismen führen kann (Owen & Jones, 2001). Trotzdem

ist die Anzahl der Mikroorganismen in diesem Bereich sehr hoch, da die von der Pflanze

abgegebenen Wurzelexsudate eine leicht verfügbare Kohlen- und Stickstoffquelle für

Mikroorganismen darstellen. Dieser so genannte Rhizosphäreneffekt ist in der Region

der Wurzelspitze besonders ausgeprägt. Durch den Umbau und Abbau der

Wurzelexsudate, wie auch durch eigene Stoffwechselprodukte beeinflussen die

Rhizosphären-Bakterien nicht nur die Menge und Zusammensetzung der

Wurzelexsudate, sondern führen zusammen mit der Wurzelatmung zu einer starken

Senkung des pH-Werts (bis zu 2 pH-Einheiten) innerhalb der Rhizosphäre (Gisi et al.,

1997). Durch die Exsudation spezifischer Substanzen, wie z.B. der Flavonoide und

Tryptophan durch Leguminosen, werden Rhizobien chemotaktisch angelockt (Gage,

2004). Im Anschluss treten sie in Kontakt mit ihren Wirtspflanzen und sorgen durch die

Umwandlung des pflanzlichen Tryptophans in Indol-3-Essigsäure für die

Wurzelhaarkrümmung (Gisi et al., 1997). Diese Wurzelhaarkrümmung ist eine wichtige

Vorraussetzung für die Symbiose zwischen Leguminosen und Rhizobien (Schultze &

Kondorosi, 1998).

Rhizobien gehören zu den „plant growth promoting rhizobacteria“ (PGPRs). Diese

werden dadurch charakterisiert, dass sie durch rasche Mineralisierung organischen

Materials, zu einer verbesserten Versorgung der Pflanze z.B. mit Stickstoff, Phosphat

und Schwefel beitragen und somit einen positiven Effekt auf das Wachstum der Pflanzen

haben (Dolej, 1998; Bloemberg et al., 2001). PGPRS beeinflussen das

Pflanzenwachstum positiv zum einen durch die Fixierung von atmosphärischem

Stickstoff, der den Pflanzen in Form von Ammonium zur Verfügung gestellt wird, und

Einleitung

- 4 -

zum anderen die Exsudation wachstumsfördernder Substanzen. Beispiele hierfür sind

IAA produziert durch verschiedene Rhizobienstämme (Höflich, 1994; Antoun et al.,

1998) oder Indol-3-Buttersäure (IBA) insbesondere produziert durch Azospirillum

brasilense und Agrobacterium rhizogenes (Dobbelaere et al., 1998; Steenhaoudt et al.,

2000). Die verbesserte Nährstoffzufuhr der Pflanze schlägt sich wiederum in einer

veränderten Exsudation der Pflanzen nieder. Dieses komplexe Netzwerk von Interaktion

zwischen Pflanzen und Bakterien, das in der Rhizosphäre und Rhizoplane eine

essentielle Rolle spielt, ist im „unbepflanzten“ oder „wurzelfreien“ Boden von keiner

Bedeutung, da dieser Bereich landwirtschaftlich nicht genutzt wird und daher auch nicht

durch Pflanzen bzw. Wurzelexsudate beeinflusst wird. Im Gegensatz zur Rhizosphäre

besitzt er meist einen höheren pH-Wert und einen höheren Nährstoffgehalt.

Einleitung

- 5 -

A.3 Wirkung von Indol-3-Essigsäure auf das Wachstum der Pflanzen

Die bakterielle Synthese von Phytohormonen, wie dem Auxin Indol-3-Essigsäure, durch

gentechnisch veränderte Rhizobien, wird im Rahmen des Songlines EU-Projekts auf

eine positive Wirkung hinsichtlich des Pflanzenwachstums und damit einer Erhöhung der

Ernteerträge analysiert. Da Indol-3-Essigsäure (IAA) für die Entwicklung und das

Wachstum der Pflanzen eine wichtige Rolle spielt, ist die Untersuchung einer

zusätzlichen Zufuhr dieses Phytohormons für die Pflanzen ein optimaler Ansatzpunkt. Im

normalen Stoffwechsel der Pflanzen interagiert IAA mit anderen Pflanzenhormonen, wie

Cytokinin, Ethylen und Gibberillin. Das Zusammenspiel dieser Hormone ist für die

Pflanzen von essentieller Bedeutung.

Die Synthese der IAA findet vor allem in der Sprossspitze statt und unterdrückt die

Ausbildung von Seitenknospen (Apikaldominanz), sie führt zur Bildung von

Adventivwurzeln, und zur Stimulierung der Mitoseaktivität z.B. im Kambium und in

Gewebekulturen (Schopfer et al., 2005). IAA wird in vielen Pflanzen aus Tryptophan

hergestellt, es gibt aber auch einige zusätzliche bzw. alternative, d.h. Tryptophan-

unabhängige Synthesewege (Woodward & Bartel, 2005). IAA liegt in der Pflanze zum

größten Teil in einer inaktiven, konjugierten Form, gebunden an Zucker, Aminosäuren

oder Peptiden vor. Die Funktion dieser Konjugate ist noch nicht eindeutig geklärt. Es

wird allgemein angenommen, dass sie zur Speicherung, für den Transport, die

Entgiftung eines Übermaßes an IAA und als Schutz der IAA vor Abbau dienen

(Woodward & Bartel, 2005). Einige IAA-Konjugate werden in den Samen gespeichert

und hydrolysiert sobald die Keimung beginnt, sodass den Keimlingen freie, aktive IAA für

die Entwicklung zur Verfügung steht. Die Menge an IAA, die der Pflanze zur Verfügung

steht, wird neben der Speicherung in Form von Konjugaten ebenfalls durch permanente

Oxidation, die zu einer Inaktivierung des Phytohormons führt, kontrolliert. So ist

gewährleistet, dass der Hormonspiegel im Gewebe von einer ständigen Neusynthese

abhängt und hierdurch reguliert werden kann. IAA wird in den Pflanzen über das

Parenchym basipetal von Zelle zu Zelle transportiert. Die Biosynthese von IAA, der

Abbau und der Transport sichern zusammen, dass in der Pflanze die richtige Menge an

Auxin zur richtigen Zeit am richtigen Ort vorhanden ist (Woodward & Bartel, 2005).

IAA wird nicht nur in Pflanzen, sondern auch in Bakterien produziert. IAA produzierende

Bakterien gehören zu den „plant growth promoting rhizobacteria“ (PGPR) und fördern

durch das von ihnen freigesetzte IAA die Bildung von Seitenwurzeln und Wurzelhaaren.

Dadurch kann die Pflanze mehr Nährstoffe aus dem Boden aufnehmen und besser

wachsen. Außerdem kann bei jungen Pflanzen durch die verstärkte Bildung von

Lateralwurzeln die Verankerung im Boden verbessert werden (Patten et al., 2002). 80%

Einleitung

- 6 -

der Rhizosphären-Bakterien sind in der Lage, IAA zu synthetisieren (Zakharova et al.,

1999). Einige Vertreter sind Azotobacter vinelandii und Azotobacter chroococum,

Agrobacterium tumefaciens, Bradyrhizobium spp., Azospirillum spp. und Rhizobium spp.

(Martinez-Morales et al., 2003). Es wird vermutet, dass die bakterielle IAA Bildung die

Pflanze durch Förderung des Wachstums zur vermehrten Exsudation anregt, und das

wiederum die Nährstoffmenge für die Bakterien erhöhen würde (Patten et al., 2002). Es

ist bekannt, dass R. leguminosarum bv. viciae VF39 einen positiven Effekt auf das

Wachstum seiner Wirtspflanze hat. Dieser Effekt wird durch die Stickstofffixierung in den

Knöllchen während der Symbiose und die Produktion von IAA hervorgerufen. Es wurde

ebenfalls ein eindeutig positiver Effekt auf Pflanzen wie Raps und Salat gezeigt, der

unabhängig von der Stickstofffixierung vermutlich allein auf der Synthese von IAA beruht

(Noel et al., 1996). Aufgrund dieser Beobachtungen erhofft man sich eine Verbesserung

der landwirtschaftlichen Erträge durch die zusätzliche Zufuhr von bakteriell gebildeter

IAA für die Pflanzen.

Einleitung

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A.4 Die bakterielle Gemeinschaft im Boden

Der Boden ist ein hoch komplexes und zugleich sehr dynamisches Ökosystem. Die

Zusammensetzung und Aktivität der mikrobiellen Gemeinschaft ist von vielen Faktoren

abhängig. Diese beinhalten sowohl physikalische Faktoren, wie Porengröße, Temperatur

und Sauerstoff- und Wasser-Gehalt des Bodens, als auch chemische Faktoren, wie pH-

Wert oder Salzkonzentration im Boden. Des Weiteren spielen das Pflanzenwachstum,

die Verteilung der Mikroorganismen im Boden und der Nährstoffgehalt des Bodens eine

große Rolle (Hirsch, 1996). Der Boden ist ein strukturierter, heterogener, generell

nährstoffarmer und unstetiger Lebensraum (Stotzky, 1997). Die Vielzahl von Faktoren

bedingt, dass es im Boden eine große Zahl von „Mikrohabitaten“ gibt, die sich auf

kleinstem Raum stark unterscheiden und so Lebensräume für verschiedene Arten von

Mikroorganismen bilden.

Diese mikrobielle Diversität im Boden beschreibt die Komplexität und Variabilität

verschiedener Aspekte biologischer Strukturen innerhalb eines Ökosystems. Sie spiegelt

die Anzahl der Individuen „species richness“, die verschiedenen Arten zugeordnet

werden und ihre Verteilung innerhalb dieser Arten „Eveness“ (Lynch, 2004). Die

Stoffwechselleistungen von Bodenmikroorganismen (Ab-, Um- und Aufbau organischer

Substanzen, Mobilisierung und Immobilisierung anorganischer Nährstoffe) werden durch

die mikrobielle Diversität bestimmt. Jede Veränderung der Umweltbedingungen im

Boden, z.B. durch landwirtschaftliche Nutzung, führen zu einer Veränderung innerhalb

der Diversität. Um die Diversität zu beschreiben, gibt es verschiedene Ansätze. Ein Maß

für die Diversität ist der Shannon-Wiener Index H' (Odum, 1969).

Ein Gramm Boden kann bis zu 109 Mikroorganismen aus möglicherweise tausenden von

verschiedenen Arten enthalten (Torsvik, 2002). Von diesen Mikroorganismen konnten

bis jetzt nicht mehr als 10% kultiviert und in Reinkultur untersucht werden (Johnsen et

al., 2001). Traditionell angewandte Kultivierungsmethoden erfassen immer nur einen

kleinen Teil der Gesamtpopulation, da die natürlichen Bedingungen, die für das

Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind, im Labor nicht vollständig nachgeahmt

werden können.

Weiterhin gehen viele Bakterien unter Stress, z.B. bei Änderungen des osmotischen

Milieus, niedrigen Temperaturen oder Nährstoffmangel in einen Zustand über, in dem sie

zwar lebensfähig, aber nicht mehr kultivierbar sind (Bleul, 2004; McKay, 1992). Dieser

Zustand soll das Überleben der Bakterien sichern. Ein großer Teil der Bakterien ist aber

auch unter optimalen Lebensbedingungen im Boden bis jetzt nicht kultivierbar. Ein

weiterer Faktor, der die Verlässlichkeit der Kultivierungsmethoden begrenzt, ist die

Aggregation der Mikroorganismen an Bodenpartikel. So werden im Boden nur circa 5%

Einleitung

- 8 -

der vorhandenen Fläche besiedelt (Nannipieri et al., 2003), wobei eine „hot spot“ Zone

mit vermehrter biologischer Aktivität die Rhizosphäre ist.

Es gibt verschiedene Ansätze, mikrobielle Gemeinschaften in situ zu untersuchen. Dazu

gehören Untersuchungen der mikrobiellen Respiration, Bestimmung der Biomasse,

Bestimmung enzymatischer Aktivitäten, mikroskopische Analysen und Analysen

basierend auf Nukleinsäuren.

A.4.1 Molekularbiologische Analysen der bakteriellen Diversität im Boden

Um die mikrobielle Diversität im Boden zu erfassen, werden häufig molekularbiologische

Methoden angewandt, die auf der Extraktion von Nukleinsäuren (DNA und RNA)

beruhen.

Sie sind unabhängig von Kultivierungsmethoden detektieren auch unkultivierbare und

dormante Bakterien. Es gibt eine Vielzahl von molekularbiologischen Methoden zur

Untersuchung der mikrobiellen Rhizosphärengemeinschaft. Einige Beispiele sind: G+C

Gehaltanalyse, DNA fingerprinting von PCR amplifizierter rDNA und rRNA durch

„terminalen Restriktions-Fragment Längen Polymorphismus“ (tRFLP), „Denaturierende

Gradienten Gel Elektrophorese“ (DGGE) oder „Automated Ribosomal Intergenic Spacer

Analysis“ (ARISA) (Lynch et al., 2004). Hierbei werden bestimmte Bereiche der rDNA

analysiert, die sowohl konservierte als auch variable Regionen enthalten (Muyzer, 1995;

Torsvik, 1998). Die Sequenzunterschiede in diesen Regionen ist umso größer, umso

weiter entfernt die Verwandtschaft zwischen den verschiedenen Mikroorganismen ist.

Diese Korrelation zwischen Variabilität und Verwandtschaftsgrad stellt das Mittel für

phylogenetische Analysen bereit (Woese, 1992; Nakatsu, 2000).

Um die vorhandenen Bakterienarten in der Rhizosphäre mit den aktiven Arten

vergleichen zu können, muss eine parallele Extraktion von rRNA und rDNA erfolgen

(Costa, 2004; Bürgmann, 2003; Felske, 1998). Die rRNA wird nach Extraktion in

c-(r)DNA umgeschrieben und zusammen mit der rDNA in die PCR der 16S Fragmente

eingesetzt. In der DGGE Analyse werden die PCR-Fragmente dann über ihr

Schmelzverhalten aufgetrennt (Details siehe Material und Methoden). Da bei der

Extraktion der rDNA auch die Möglichkeit besteht, freie DNA, die an Bodenpartikel

angeheftet war, oder rDNA toter Bakterienzellen zu extrahieren, kann diese vorher mit

Ethidiummonoazid (EMA) entfernt werden (Nocker & Camper, 2006).

Die DGGE-Methode eignet sich zur Analyse verschiedener Populationen (Duineveld,

2001; Smalla, 2001; Nakatsu, 2000; Sapp, 2006). Auch für pilzliche Gemeinschaften

wurde diese Methode erfolgreich eingesetzt (Gomes, 2003; de Souza, 2004; Haselier,

Einleitung

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2007). Die Diversität spezieller Gruppen wie z.B. von Stickstofffixierern kann ebenso

mittels DGGE analysiert werden. Für solche Analysen können statt der universellen 16S

rDNA Primer spezielle Primer für bestimmte Gene wie das nifH Gen benutzt werden. Zur

Identifizierung einzelner Spezies in der mikrobiellen Gemeinschaft können nach der

DGGE die gewünschten Banden aus dem Gel isoliert und zur Identifizierung sequenziert

werden.

Dadurch ist man in der Lage innerhalb einer Gemeinschaft direkte Veränderungen z.B.

am Auftreten einer Bande feststellen festzustellen, was theoretisch der Veränderung

einer bestimmten Spezies entsprechen kann.

Einleitung

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A.4.2 Mikroskopische Detektion von horizontalem Gentransfer (HGT)

Eine weit verbreitete Methode zur Erfassung der Gesamtzellzahl von Mikroorganismen

in einem Lebensraum wie z.B. dem Boden ist die Fluoreszenzmikroskopie.

Fluoreszenzfarbstoffe wie 4', 6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI), werden verwendet, um

Bakterien unabhängig von ihrem physiologischen Status und ihrer Stoffwechselaktivität

zu färben (Klauth et al., 2004). DAPI lagert sich in die Doppelhelix der DNA ein und färbt

alle Zellen, die Nukleinsäuren enthalten. Weitere Farbstoffe, wie Sytox Green®, dagegen

färben keine lebenden Zellen an. Er kann als ungeladenes Molekül die intakte

Zellmembran nicht überwinden. Aus diesem Grund muss die Membran der

anzufärbenden Zellen vorher mit Tensiden wie z.B. Tween 80 oder SDS permeabel

gemacht werden.

Die direkte Bestimmung der Zellzahl unter dem Mikroskop ergibt oft 100-1000-fach

höhere Zellzahlen, als das durch Ausplattieren und Auswertung der Kolonie-bildenden

Einheiten (KBE) der Fall wäre (Johnsen et al., 2001). Ein wichtiger Nachteil ist

allerdings, dass diese Farbstoffe nicht geeignet sind, um zwischen verschiedenen Arten

von Bakterien und zwischen lebenden und toten Zellen zu differenzieren. Im Habitat

Boden kommt noch hinzu, dass die meisten Zellen an Bodenpartikel gebunden vorliegen

und es zu einer unspezifischen Fluoreszenz dieser Partikel kommen kann. Zur

Vermeidung dieses Phänomens müssen die Zellen von den Bodenpartikeln getrennt

werden (Klauth, 2001), wobei die Präparation der Bodenproben das natürliche Gefüge

von Bakterien und Bodenpartikeln zerstört. Ein Kompromiss zwischen der Entfernung

der störenden Bodenpartikel und einer Quantifizierung der Mikroorganismen ist

notwendig. Diese Problematik ist in der Untersuchung ein limitierender Faktor. Hingegen

werden Fluoreszenzfarbstoffe, wie das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus der

Qualle Aequorea victoria in der Molekularbiologie eingesetzt, um Proteinlokalisation und

Genexpression in vivo zu analysieren (Tsien, 1998; Zimmer, 2002). Ein weiterer

Farbstoff „DsRed“, das aus der tropischen Koralle Discosoma sp. isoliert wurde, wird

ebenfalls häufig benutzt (Jacobs et al., 2000). Diese Farbstoffe insbesondere GFP

konnten erfolgreich an eine Vielzahl bakterieller Proteine fusioniert werden. Mittels

solcher Fusionsproteine kann die Lokalisierung und räumliche Dynamik unter nicht

invasiven Bedingungen in lebenden Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet

werden. Des Weiteren werden diese Farbstoffe erfolgreich genutzt, um einen Einblick in

das Ökosystem des Bodens zu bekommen. Da der überwiegende Teil der

Bodenbakterien bis jetzt nicht kultivierbar ist, dienen Fusionsproteine zur gezielten

Analyse der Bakterien im Lebensraum Boden.

Einleitung

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In Versuchen mit Rhizobien ist es gelungen, die Interaktion zwischen Rhizobien und

Pflanze und die initialen Schritte der Nodulation in der Rhizosphäre in vivo zu

beobachten (Gage et al., 1996; Stuurman et al., 2000).

Die Möglichkeit Bakterien, die in der Lage sind Schadstoffe abzubauen in situ zu

beobachten, ist durch Anwendung dieser Fluoreszenzfarbstoffe ebenfalls möglich (Boldt

et al., 2004).

Eine andere Anwendungsmöglichkeit dieser Fluoreszenzfarbstoffe ist die in vivo

Untersuchung des horizontalen Gentransfers (HGT). Unter horizontalem Gentransfer

versteht man die Weitergabe genetischen Materials auch an nicht verwandte Arten über

Konjugation, Transformation und Transduktion. Der horizontale Gentransfer ist von

essentieller Bedeutung für die Entwicklung und Adaption von Bakterien. Eine Vielzahl

bakterieller Gene hat „fremde Vorfahren“, zum Beispiel das nifK Gen von Frankia ssp.

(Dahlberg et al., 1998a). Viele Antibiotikaresistenzen werden von Bakterien durch

horizontalen Gentransfer erworben. Ein Weg der Weitergabe genetischen Materials ist

die Konjugation, die bei Bakterien eine große Rolle spielt. Sie sorgt für die Weitergabe

der genetischen Information von einer Donor- in eine Rezipienten-Zelle. Vor allem

Plasmide werden auf diese Weise übertragen. In der Molekularbiologie hat man sich

diesen natürlichen Prozess zu Eigen gemacht und detektiert einen Plasmidtransfer

durch Wachstum der Rezipientenzellen auf Selektivmedien. Diese Methode benötigt

eine Antibiotikaresistenz auf dem Plasmid. Um horizontalen Gentransfer unter

Freilandbedingungen zu testen, ist dieser Selektionsmarker jedoch nicht erwünscht.

Leider ist die Verbreitung von Antibiotikaresistenzen in natürlichen

Bakterienpopulationen heutzutage eins der größten Probleme, mit dem die moderne

Medizin konfrontiert ist (Battermann, 2002). Ebenfalls stellt die Benutzung von

Antibiotika in der Landwirtschaft ein großes Risiko für die Verbreitung von

Antibiotikaresistenzen dar. Auch wenn die Weitergabe eines Plasmids über

Kultivierungsmethoden generell möglich ist, können Transferereignisse, bei denen das

Plasmid nicht stabil im Rezipienten verbleibt, oder über Rekombination teilweise ins

Genom eingebaut wird, mit der KBE-Methode nicht erfasst werden (Dahlberg et al.,

1998). Außerdem ist eine Detektion des HGT in Bakterien, die bis heute nicht kultivierbar

sind, durch KBE nicht möglich, so dass nach alternativen Detektionsmethoden gesucht

wurde.

Eine Methode zur Detektion von HGT, beruht nicht auf der Kultivierung der Bakterien,

sondern ausschließlich auf visueller Detektion. Diese Methode wurde von Christensen

(1996) entwickelt und in Marinen Ökosystemen erfolgreich eingesetzt (Christensen et al.,

1996; Dahlberg et al., 1998; Sørensen et al., 2003).

Einleitung

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lacI

eGFPplac eGFPplac

Abbildung 1: Donorzelle in der Donorzelle reprimiert der lac-Repressor den lac-Promotor, es wird kein eGFP gebildet lacI: Lac-Repressor, liegt chromosomal integriert vor plac: Lac-Promotor und eGFP liegen Plasmid-kodiert vor

Abbildung 2: Transkonjugand nachdem die Rezipientenzelle das Plasmid aufgenommen hat, wird das eGFP exprimiert, da kein LacI vorhanden ist, die Zellen fluoreszieren

Der Mechanismus basiert auf der Interaktion zwischen Lac-Repressor und Lac-

Promotor. Dazu wird ein konjugatives Plasmid eingesetzt, auf dem die Expression des

eGFP unter Kontrolle des lac-Promotors (plac) steht. Im Donorstamm wird der Lac-

Repressor (lacI) stabil integriert. Der Vorteil dieses Systems ist, dass kein „falsches“

eGFP-Signal aus den Donorzellen detektiert werden kann, da dort aufgrund der

Repression des plac durch lacI keine Expression des eGFP stattfinden kann. Nach der

Mobilisierung des Plasmids in einen Rezipientenstamm, der keinen Repressor trägt,

kann nun die Expression des eGFP erfolgen (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2). Durch

Hinzufügen von Isopropyl-thio-β-D-galactosid (IPTG) kann bei Bedarf ebenfalls die

Expression in Donorzellen induziert werden. Diese Methode eignet sich hervorragend für

die „flow cytometry“, bei der die fluoreszierenden Zellen aussortiert und gezählt werden

(Sørensen et al., 2003).

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A.5 Freisetzung von gentechnisch modifizierten Organismen (GMO) zur Verbesserung der Landwirtschaft – Vorteile und Problematiken

Eine Inokulation mit Rhizobien zur Steigerung von landwirtschaftlichen Erträgen wird seit

vielen Jahren erfolgreich praktiziert. Eine Verbesserung der Rhizobien durch

gentechnische Veränderungen soll die positiven Effekte der Bakterien auf das

Wachstum und die Nährstoffversorgung der Pflanzen weiter steigern. Doch diese

gentechnische Modifizierung (siehe Songlines EU-Projekt) birgt auch Gefahren für die

Umwelt. Folgende Fragen sind deshalb von Interesse.

Sind die GMO in der Lage, im Freiland zu überleben?

Können sie unter Freilandbedingungen mit den schon vorhandenen Rhizobien

konkurrieren?

Welche Effekte haben die GMO auf die einheimischen Lebensgemeinschaften in

der Umwelt?

Werden die veränderten Gene stabil exprimiert, oder gehen sie unter unselektiven

Bedingungen verloren?

Werden die veränderten Gene durch horizontalen Gentransfer weiter verbreitet?

Wie wirkt sich die erhöhte Expression von Indol-3-Essigsäure auf die Pflanzen und

die einheimische Bakterienpopulation der Rhizosphäre aus?

Es ist notwendig diese Fragen zu klären, bevor eine Freisetzung dieser GMO

durchgeführt werden kann. Einige Studien haben sich bereits mit der Problematik der

Freisetzung von GMO beschäftigt. Dabei waren viele Experimente zur Freisetzung von

Rhizobien erfolgreich. Die Kolonisierung der Rhizosphäre und Pflanzenwurzel fand in

zufrieden stellendem Maß statt (van Veen et al., 1997). Allerdings gab es auch einige

Fehlschläge, die vermutlich aus der schnellen Abnahme der aktiven GMO nach der

Einführung in den Boden resultieren (Akkermans, 1994; van Elsass & Heijnen, 1990).

Für jede Inokulation mit GMO ist es nötig, die abiotischen Faktoren, wie die

Zusammensetzung des Bodens, den pH-Wert, die Temperatur, Feuchtigkeit genau zu

analysieren, denn sie geben Ausschlag über das Überleben und die Aktivität des

eingebrachten Bakterienstamms (van Veen et al., 1997). Auch die Art der Bepflanzung

hat einen entscheidenden Effekt auf das Überleben der GMO. So war ein transgener

lacZY markierter P. aureofaciens Stamm in der Rhizosphäre von Weizenpflanzen nicht

in der Lage, bei einer Bodenfeuchte unter zwölf Prozent mit dem WT-Stamm zu

konkurrieren (Tappeser et al., 2000). Bei Maispflanzen hingegen war die

Konkurrenzfähigkeit beider Stämme gleichwertig - unabhängig von der Bodenfeuchte.

Einleitung

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Weitere Experimente mit R. leguminosarum bv. viciae fanden in Rothamsted in

Großbritannien, Dijon in Frankreich und Bayreuth in Deutschland statt und zeigten, mit

Ausnahme der Versuche in Rothamsted, kein Überleben der künstlich eingebrachten

GMO-Stämme nach 3 Monaten bzw. dem ersten Winter. Jedoch konnten in

Experimenten, die in Rothamsted durchgeführt wurden noch nach drei Jahren GMO

nachgewiesen werden. Ein weiteres Experiment mit gentechnisch veränderten

Pseudomonaden zeigte, dass es möglicherweise zu einer Verteilung der GMO in tiefere

Erdschichten kommen kann oder auch zu einer Auswaschung, bei heftigen Regenfällen

(Gillespie et al., 1995; Hekman et al., 1995).

Untersuchungen zum horizontalen Gentransfer der gentechnisch veränderten Stämme

unter Freilandbedingungen zeigten entweder keinen Plasmidtransfer in andere Bakterien

(Hirsch & Sokes, 1994) oder nur sehr geringe Frequenzen, die im Laufe des

Experiments abnahmen (Selbitschka, 2003). Es zeigte sich weiterhin, dass die

Transferfrequenzen innerhalb der Rhizosphäre im Gegensatz zu wurzelfreien Böden,

steigen (Hill & Top, 1998) wobei außerhalb der Rhizosphäre kein Transfer mehr

detektiert werden konnte (Smit & van Elsass, 1990; van Elsass, Nikkel & van Overbeek,

1989). Es können auch konjugative Plasmide aus der einheimischen

Bakterienpopulation in die gentechnisch veränderten Bakterien übertragen werden und

eine Konjugation der nicht transferierbaren gentechnisch veränderten Plasmide aus den

Bakterien bewirken (Tappeser et al., 2000). Doch nicht nur gentechnisch veränderte

Plasmide können mobilisiert werden, auch Transgene, die auf dem Chromosom

lokalisiert sind, werden mobilisiert (Troxler et al., 1997a).

Die möglichen Auswirkungen des gentechnisch veränderten R. leguminosarum Stamms

(Songlines) auf die einheimische Bakterienpopulation sind bisher unklar. Außerdem

kann die Freisetzung von Rhizobien mit verbesserter Stickstofffixierung die

Pflanzenpopulation über eine Erhöhung des Stickstoffgehalts im Boden verändern und

z.B. zur Ansiedlung neuer Unkräuter führen (Tappeser et al., 2000). Es gibt einige

Ergebnisse, die sowohl auf eine Störung der einheimischen Bakterienpopulationen

hinweisen, als auch eine lang anhaltende Reduktion der natürlichen Pilzpopulationen

(Doyle et al., 1991; Glandorf, 1998; Bakker et al., 2002) und Protozoenpopulationen

(Naseby & Lynch, 1998; Lynch et al., 2004).

Neuere Experimente zeigten wiederum keinerlei Einfluss auf die Bakteriengemeinschaft

(Lynch et al., 2004). Dennoch bleibt es zu Bedenken, dass sowohl die bakterielle als

auch die pilzliche Gemeinschaft im Boden ein kompliziertes Geflecht von Interaktionen

darstellt, so dass ein künstlich eingebrachter GMO die vorherrschende Balance

zwischen den einzelnen Arten anhaltend zerstören könnte.

Einleitung

- 15 -

Abschließend lässt sich zusammenfassen, dass das Überleben des gentechnisch

veränderten R. leguminosarum bv. viciae VF39 (pRD20) Stamms (Songlines) unter

Freilandbedingungen und seine Konkurrenzfähigkeit mit einheimischen Rhizobien

fraglich ist und die Möglichkeit eines horizontalen Gentransfers darüber hinaus nicht

ausgeschlossen werden kann. Ein möglicher Effekt auf die bakterielle

Rhizosphärengemeinschaft ist ebenfalls ungeklärt. Die verschiedenen Ergebnisse

anderer Studien lassen alle theoretischen Möglichkeiten für den VF39 (pRD20) Stamm,

auf den sich diese Arbeit konzentriert, offen. Um diese Lücke zu füllen ist es wichtig,

diese Punkte vor einer Freisetzung unter Zuhilfenahme moderner Methoden zu klären.

Einleitung

- 16 -

A.6 Erntesteigerung bei Leguminosen durch bakterielle Phytohormonproduktion - das Songlines EU-Projekt

Das Songlines EU-Projekt „Improving legume yield by bacterial delivery of

phytohormones“ hat die Verbesserung der landwirtschaftlichen Erträge mithilfe von

gentechnisch modifizierten Bakterienstämmen als Zielsetzung. Die verwendeten

Bakterien sollen durch die Synthese des pflanzlichen Hormons Indol-3-Essigsäure (IAA)

insbesondere die Ernteerträge von Leguminosen (Hülsenfrüchtlern) steigern. In vielen

Entwicklungsländern werden Leguminosen als essentielle Bestandteile für die

Ernährung der Bevölkerung benötigt. Allerdings sind die landwirtschaftlichen

Bedingungen für die Kultivierung der Pflanzen in vielen dieser Länder nicht optimal. Der

Boden ist oft sehr nährstoffarm, doch eine Verbesserung des Bodens durch

Kunstdünger ist aus finanziellen Gründen meist nicht möglich.

Deswegen wird als Alternative zur Düngung eine Verbesserung der

Kultivierungsbedingungen durch Zugabe von so genannten „plant growth promoting

bacteria“ erreicht (Nobbe & Hiltner 1896; Elshanshoury, 1995; Tang & Yang, 1997;

Bashan, 1998). Diese Bakterien wie z.B. Azospirillum brasilense und verschiedene

Rhizobienstämme (Vessey et al., 2003) werden entweder unter das Saatgut gemischt

oder direkt auf dem Feld verteilt (Bashan, 1998; Okon & Labandera-Gonzalez, 1994;

Zaman-Allah, 2007). Die Bakterien versorgen die Pflanzen mit zusätzlichem Stickstoff

und führen dadurch zu einer Verbesserung des Wachstums. Ein Beispiel: Der in

Pakistan produzierte „BioPower“ Dünger, bestehend aus einer speziellen

Bakterienmischung, erhöht die Ernteerträge von Leguminosen um 60 - 70% und erspart

gleichzeitig 62 - 288 US $ pro Hektar pro Jahr (Bilal et al., 1993; Malik et al., 2005). Eine

Inokulation von Vicia sativa mit Rhizobium leguminosarum führte in der Türkei unter

Freilandbedingungen zu einer signifikanten Verbesserung der Erträge (Albayrak et al.,

2006).

Die Idee des Songlines EU-Projekts ist es, durch gentechnische Modifizierung von

Rhizobien die Ernteerträge weiter zu verbessern. Diese sollen durch die Produktion des

wachstumsfördernden Pflanzenhormons Indol-3-Essigsäure (IAA) die Entwicklung der

assoziierten Pflanzen stimulieren. Rhizobien produzieren normalerweise geringe

Mengen an IAA, die eine wichtige Rolle während des Nodulationsprozesses spielt.

Durch ein speziell entwickeltes Plasmid, das in die Rhizobien integriert wird, soll eine

zusätzliche IAA-Synthese in den Bakterienzellen stattfinden (US Patent, 20030190754).

Das Plasmid besitzt beide für die IAA-Synthese notwendigen Gene, die für die

Tryptophan-Monooxigenase (iaaM) und die Indolacetamid-Hydrolase (tms2) kodieren.

Das aus Pseudomonas syringae pv. Savstanoi stammende iaaM-Gen wandelt

Einleitung

- 17 -

Tryptophan in Indolacetamid um. Im Anschluss daran wird das Indolacetamid durch die

Indolacetamid-Hydrolase (tms2-Gen), ursprünglich aus Agrobacterium tumefaciens, in

Indol-3-Essigsäure umgewandelt (siehe Abbildung 3).

Abbildung 3: Synthese von Indol-3-Essigsäure

A: Darstellung der Kassette, die für die Synthese von IAA aus Tryptophan verwendet wird.

Das iaaM- und tms2-Gen stehen unter Kontrolle des rolA Promotors; iaaM: Tryptophanmonooxygenase; tms2: Indolacetamid-Hydrolase

B: schematische Darstellung der IAA-Synthese

(Abbildung verändert nach Bartel et al., 2005)

Die beiden Gene stehen unter der Kontrolle des rolA Promotors, ursprünglich aus

Agrobacterium rhizogenes, der besonders in der stationären Wachstumsphase der

Bakterien sowie durch niedrigen pH induziert wird (Pandolfini et al., 2000). Dieser

Promotor ist in der Lage, die Expression der beiden Gene sowohl in den freilebenden

Rhizobien als auch in den Bakteroiden, zu kontrollieren.

Da die IAA-Synthese nicht nur in der Symbiose stattfindet, sondern auch in den

freilebenden Rhizobien, vermutet man, dass auch Nicht-Wirtspflanzen von der

Produktion des Hormons profitieren können. Die als Grundlage des Songlines-EU

Projekts durchgeführten Vorversuche mit Erbsenpflanzen, die mit dem gentechnisch

modifizierten Rhizobium leguminosarum bv. viciae pRD20 Stamm inokuliert wurden,

zeigten eine deutliche Steigerung des Pflanzenwachstums (75% höheres

Trockengewicht der Pflanzen), und eine Ertragssteigerung der Samenproduktion von

50% (Trockengewicht), im Gegensatz zu den mit R. leguminosarum bv. viciae WT

(Wildtyp) inokulierten Pflanzen. In vitro wurde eine zehnfache, in den Wurzelknöllchen

der inokulierten Erbsen eine 80-fache Steigerung der IAA-Synthese durch den

modifizierten R. leguminosarum Stamm im Vergleich zum WT Stamm detektiert.

Weiterhin wurde nachgewiesen, dass in Wurzelknöllchen von Vicia hirsuta die Kapazität

der Stickstofffixierung durch pRD20 tragende Rhizobien stark erhöht wurde (US Patent,

20030190754). Die Ergebnisse dieser Vorversuche für das Songlines EU-Projekt sind

insgesamt sehr viel versprechend, weitere Experimente müssen allerdings noch folgen.

A

prolA iaaM tms2

A

B

Einleitung

- 18 -

B Zielsetzungen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden im Wesentlichen zwei Zielsetzungen verfolgt:

B.1 Die Entwicklung eines kultivierungsunabhängigen Detektionssystems für den HGT bei Bodenbakterien

Die erste Zielsetzung gliedert sich in folgende Teile:

1. Etablierung des Detektionssystems Das in der Einleitung vorgestellte System zur Detektion des HGT basierend auf

Bestandteilen des Lac-Operons (plac, lacI) und der kontrollierten Expression von

eGFP in den Transkonjuganden, sollte in Rhizobium leguminosarum bv. viciae

VF39 etabliert werden. Diese Aufgabe beinhaltete:

Die Klonierung und Integration von lacI in den VF39 Stamm

Die Klonierung von eGFP in die zu untersuchenden Plasmide

Die Integration der Plasmide in VF39

Die Untersuchung der Funktionstüchtigkeit des Detektionssystems in VF39

2. Analyse des Gentransfers über KBE In diesem Teil der Arbeit sollte analysiert werden, ob die Möglichkeit eines HGT

des verwendeten Plasmids aus dem VF39 Stamm erfolgen kann. Folgende

Fragestellungen sollten beantwortet werden:

Findet ein HGT statt?

Wenn ja, mit welcher Frequenz findet er statt?

Wenn ja, unter welchen äußeren Bedingungen kann der HGT stattfinden?

3. Analyse des Gentransfers ohne Kultivierung Der HGT wurde in diesem Teil der Arbeit unabhängig von der Kultivierung der

Bakterien auf rein visuelle Detektion hin untersucht. Folgende Fragen wurden

dabei näher untersucht:

Kann der HGT sichtbar gemacht werden?

Welche Einschränkungen in der Detektion des HGT gibt es?

Einleitung

- 19 -

B.2 Die Analyse möglicher Veränderungen innerhalb der Zusammensetzung und Diversität der Bakteriengemeinschaft in Anwesenheit des gentechnisch veränderten Rhizobienstamms

Neben der Entwicklung des Detektionssystems zur kultivierungsunabhängigen Detektion

von HGT (Zielsetzung 1) wurden die Veränderungen innerhalb der Zusammensetzung

und Diversität der Bakteriengemeinschaft in Anwesenheit des gentechnisch veränderten

Rhizobienstamms analysiert (Zielsetzung 2). Dazu wurden die Rhizosphäre und

Rhizoplane von Erbsenpflanzen in Anwesenheit des VF39 (pRD20) Stamms über

verschiedene Zeiträume untersucht.

Die zweite Zielsetzung gliedert sich in folgende Teile:

1. Analyse eines Effekts der gentechnisch veränderten Rhizobienstämme auf die natürlichen Bakterienpopulationen im Boden

Der Einfluss einer Inokulation mit gentechnisch veränderten VF39-Stämmen, die

das Phytohormon IAA produzieren, auf die bakterielle Gemeinschaft im Boden soll

untersucht werden. Dazu wird durch DGGE und tRFLP die Bakteriengemeinschaft

in der Rhizosphäre und Rhizoplane nach Inokulation mit verschiedenen

transgenen VF39-Stämmen untersucht. Des Weiteren wurden die

Versuchsansätze durch Analyse des DICE Koeffizienten und Shannon-Wiener

Diversitäts Index H’ ausgewertet.

2. Analyse des IAA-Gehalts in der Rhizosphäre der Pflanzen durch GC-MS Die Rhizosphäre der behandelten Versuchspflanzen wird durch GC-MS Analyse

auf einen durch bakterielle Synthese veränderten Gehalt an IAA untersucht.

3. Untersuchung des Pflanzenphänotyps Die inokulierten Pflanzen wurden hinsichtlich phänotypischer Veränderungen, wie

Stängel- und Wurzelwachstum, sowie Knöllchenbildung, ausgelöst durch die

veränderten IAA Konzentrationen in ihrer Umgebung untersucht.

Material und Methoden

- 20 -

C Material und Methoden

C.1 Material

C.1.1 Chemikalien und Enzyme

Die verwendeten Chemikalien wurden in Analysequalität von den Firmen BIO-RAD,

FLUKA, MERCK, Promega, ROTH, SERVA und SIGMA ALDRICH, Hefeextrakt und

Trypton von OXOID, Agar von ICN und ULTRA-CLEAN Agarose von GIBCO-BRL

bezogen.

Alle Restriktionsenzyme und weitere DNA-modifizierende Enzyme inklusive Puffer

stammten von MBI-FERMENTAS und New England Biolabs, Reaktionskits von

BOEHRINGER, Eppendorf, MACHEREY-NAGEL, AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH

und QIAGEN (siehe Anhang).

Tabelle 1: weiteres Material

Material Hersteller und Einsatz

GeneRuler™ 1kb DNA Ladder FERMENTAS, Längenstandard und Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen in Agarosegelen

GeneRuler™100 bp DNA Ladder Plus FERMENTAS, Längenstandard

λ-EcoRI/HindIII Dig-Labelled Step Ladder ROCHE, Längenstandard für Southern-Blots

Nitrozellulose-Filter, Type 0,22 µm, 13 mm MILLIPORE, für Kreuzungsexperimente

Vermiculit APERG, Pflanzenanzucht

Folien für DGGE SERVA, GEL-FIX für PAG, 0.18 x 260 x, 204 mm

Qiabrane Nylonmembran für Southern-Blots

Übliche Materialien für molekularbiologische und mikrobiologische Arbeiten sind nicht

aufgeführt.


- 21 -

Tabelle 2: verwendete Kits

Kit Hersteller

NucleoSpin® Plasmid Macherey-Nagel

Nucleo Spin® ExtractII Macherey-Nagel

Invisorb Spin DNA Extraction Kit Invitek

TOPO-TA Cloning® Kit for Sequencing Invitrogen

Dig-Labeling-Kit Roche

Dig-Detection-Kit Roche

Tabelle 3: verwendete Geräte

Gerät Hersteller und Typ

Überkopfschüttler GFL 3040

PCR-Thermocycler: BIOMETRA, TRIO-Thermoblock™ EPPENDORF Mastercycler personal

Kühlzentrifuge: HETTICH, Universal 30RF SORVALL, RC-5B mit SLA-3000 und SS-34 Rotor

Geldokumentationssystem B & L SYSTEMS, Imago compact imaging system

Fluoreszenzmikroskop OLYMPUS BX50F

Waage METTLER Toledo, PB3002-S Delta Range®

Feinwaage SCALTEC, SBA 32

Tischzentrifugen HERMLE Z200 M/H

Vakuumblot-Kammer PHARMACIA, Vacu-Gene XL

CCD-Kamera FUJIFILM

Übliche Geräte für molekularbiologische und mikrobiologische Arbeiten sind nicht

aufgeführt.


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C.1.2 Plasmide

Tabelle 4: verwendete Plasmide

Plasmid Genotyp/Eigenschaften Referenz

pBBRIAA pBBR1MCS-5 Derivat, iaaM, tms2, prolA Bulawa, nicht publiziert, RWTH Aachen, 2006

pBBR1MCS-5 broad host range Kloniervektor, lacZα, GmR Kovach et al., 1995

pCR2.1 TOPO lacZα, ApR, KmR Klonier- und Sequenziervektor Invitrogen

pHRdsRedplac pHRGFPGUS-Derivat, dsRed statt GFP/ uidA unter plac diese Arbeit

pHReGFPplac pHRGFPGUS-Derivat, eGFP statt GFP/ uidA unter plac diese Arbeit

pHRGFPGUS Kloniervektor, mob und rep aus pBBR1 uidA und GFP unter Kontrolle des aacC1 Promotors, GmR, KmR

Ramos et al., 2003; Genbank: AY237647

pHRGFPGUSIAA pHRGFPGUS-Derivat, zusätzlich prolA, iaaM und tms2 diese Arbeit

pHReGFPGUSplac pHRGFPGUS-Derivat, plac vor eGFP und uidA anstelle von paacC1

diese Arbeit

pJP2 pTR102-Derivat, ApR, Tc, mob, parDEABC Prell et al., 2002

pJP2neo pJP2-Derivat mit dem nptII-Gen (Neomycinresistenzgen) vor dem uidA.

Saeglitz, nicht publiziert, RWTH Aachen, 2002

pJP2plac pJP2-Derivat mit plac vor dem uidA und universeller Ribosomenbindungsstelle diese Arbeit

pJP5 (PRU1156) Kloniervektor, GFP mut3.1, uidA Karunakaran & Poole, 2004; Genbank: AJ851292

pJP5plac pJP5-Derivat mit plac vor dem eGFP diese Arbeit

pJPdsRedplac pJP2-Derivat mit dsRed statt uidA, plac diese Arbeit

pJPeGFPplac pJP2-Derivat mit eGFP statt uidA, plac diese Arbeit

pJPGFPplac pJP2-Derivat mit GFP+ statt uidA, plac diese Arbeit

pK19gabTgenta1LacI pK19mobgabT-Derivat, mit GmR und lacI im gabT-Gen integriert diese Arbeit

pK19mobgabT lacZα, KmR, mob, gab-Gene Prell et al., 2002

pRD20 pMB393-Derivate, SpecR, CMR Gage et al., 1996

pRD20GFP+plac pRD20-Derivat mit GFP+plac statt iaaM und tms2 diese Arbeit

pRD20dsRedplac pRD20-Derivat mit dsRedplac statt iaaM und tms2 diese Arbeit

pRK2013 ColE1 RK2-Mob+, RK2-Tra+; KmR Helferplasmid für konjugativen Transfer Figurski & Helinski, 1979

pRP4.4 pRP4-Derivate, KmS, Tra+ IncP, ApR, TcR Hedges et al., 1974

pSLE85 pUC19-Derivat, ApR, CmR, GmR Muth et al.,1989


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C.1.3 Bakterienstämme

Tabelle 5: verwendete Bakterienstämme

Bakterienstamm Herkunft/Referenz Resistenz Temperatur

Agrobacterium tumefaciens Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C

Arthrobacter oxydans Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C

Arthrobacter spec. Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C

Azomonas macrocytogenes DSM Nr. 721 DSMZ, Braunschweig Sm 28°C

Azospirillum brasilense DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), Braunschweig

Nx 28°C

Azotobacter chroococcus Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Nx 28°C

Azotobacter vinelandii Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Nx 28°C

Bacillus subtilis Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C

E. coli DH5α Hanahan, 1983 − 37°C

E. coli S17-1 Simon et al., 1983 − 37°C

E. coli XL1 Blue Stratagene, Heidelberg − 37°C

Gluconobacter oxydans Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C

Herbaspirillum IIIb WT Stammsammlung Bodenökologie Sm 28°C

Klebsiella planticola Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C/37°C

Nocardia rubra Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm, Nx 28°C

Nocardioides simplex Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Nx 28°C

Paracoccus denitrificans Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Nx 28°C

Pseudomonas putida DSM 1693 DSMZ, Braunschweig Nx, Tc, Ap 28°C/37°C

Pseudomonas stutzeri DSM 4166 DSMZ, Braunschweig Nx, Tc, Ap 28°C-37°C

Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841 Johnston-Behringer, 1975 Sm 28°C

Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39 Priefer, 1989 Sm 28°C

Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39 [genta lacI] diese Arbeit Sm, Gm 28°C

Rhizobium tropici CIAT 899 Martinez-Romero et al., 1991 Nx 28°C

Sinorhizobium meliloti 2011 Denarié, Toulouse Sm 28°C

Sphingomonas paucimobilis Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C

Xanthobacter autotrophicus Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C


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C.1.4 Pflanzenmaterial

Folgende Pflanzen wurden zur Inokulation mit den Bakterienstämmen verwendet:

Erbsen (Pisum sativum cv. Rondo (Consorzio Agrario Parma))

Wicken (Vicia hirsuta)

Luzerne (Medicago sativa)


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C.2 Mikrobiologische Methoden

C.2.1 Bakterienkultivierung

Alle verwendeten Bakterienstämme wurden entsprechend in 10 ml LB- bzw. TY-Medium

bei geeigneter Temperatur (siehe Tabelle 5) durch Suspension einer Einzelkolonie im

Reagenzglas auf dem Roller angezogen. Ausgehend von einer Einzelkolonie wurden auf

Festmedium fraktionierte Ausstriche hergestellt und im Brutschrank inkubiert.

LB-Medium Luria-Bertani Broth, nach Sambrook et al., 1989

Substanz Menge [g/l]

Trypton 10

Yeast Extract 5

NaCl 5

Glucose 1

pH 7,2

TY-Medium Tryptone-yeast-extract, nach Beringer, 1974

Substanz Menge [ g/l]

Trypton 5

Yeast Extract 3

CaCl2 0,7

pH 7,5

Zur Herstellung von festen Nährmedien wurden dem jeweiligen Medium 15 g/l Agar

zugesetzt.


- 26 -

C.2.2 Herstellung von Glycerinkulturen

Zur dauerhaften Aufbewahrung von Bakterienstämmen wurden so genannte

Glycerinkulturen hergestellt. Dazu wurde eine Einzelkolonie auf einer LB- oder TY-Platte

ausgestrichen und im Brutschrank für 48 h bei entsprechender Temperatur inkubiert.

Dann wurde eine volle Impföse Bakterien in ein Eppendorfgefäß mit einer Mischung aus

0,5 ml entsprechendem Medium und 1 ml 87% (v/v) Glycerin gegeben. Die Lagerung

erfolgte bei –20°C.

Tabelle 6: Antibiotikazusätze für die Nährmedien

Antibiotikum Abkürzung Endkonzentration für E. coli [µg/ ml]

Endkonzentration für Rhizobien [µg/ ml]

Ampicillin Ap 100 -

Spectinomycin Spec 450 450

Nalidixinsäure Nx 20 20

Gentamycin Gm 10 20

Kanamycin Km 25 -

Neomycin Nm - 80

Streptomycin Sm 300 600

Tetracyclin Tc 10 10

Tabelle 7: weitere Zusätze

Substanz Stammlösung Lagerung

X-Gal 40 mg/ ml in N-N-Dimethylformamid –20°C

X-Gluc 40 mg/ ml in N-N-Dimethylformamid –20°C

IPTG 40 mg/ ml in Wasser + 4 – 6°C

Die Endkonzentration der Substanzen betrug im Medium jeweils 40 µg/ ml.


- 27 -

C.2.3 Messung des Bakterientiters

Die Messung der Bakteriendichte (optische Dichte: o.D.) erfolgte in Halbmikroküvetten in

einem Photometer bei einer Wellenlänge von λ = 580 nm. Als Referenz diente

unbeimpftes Medium. Dabei entspricht eine o.D. von 0,1 bei E. coli einem Titer von 2x

107 Zellen/ ml, bei R. leguminosarum 1x 108 Zellen/ ml.

C.2.4 Herstellung kompetenter Zellen

Unter dem Begriff Transformation versteht man die Aufnahme nackter DNA aus der

Umgebung in eine Bakterienzelle. Im Gegensatz zu Arten wie z.B. Bacillus und

Pseudomonas besitzt E. coli keine natürliche Kompetenz um freie DNA aus der

Umgebung aufzunehmen. Allerdings gibt es die Möglichkeit, E. coli durch Behandlung

mit Rubidiumchlorid (RbCl2), Kalziumchlorid (CaCl2) oder durch Elektroporation

kompetent zu machen. Die Herstellung der kompetenten Zellen erfolgte nach dem

Protokoll von Hanahan (1983).

Über Nacht wurden Vorkulturen von E. coli im Reagenzglas bei 37°C inkubiert und am

nächsten Morgen in 250 ml Erlenmyerkolben überimpft (Hauptkultur). Die Hauptkulturen

wurden bis zu einer o.D. 580 von 0,4 bis 0,7 auf einem Schüttler inkubiert. Danach

wurden die Zellen 10 min bei 4000 rpm und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde

verworfen und das Pellet (Bakterienzellen) vorsichtig in 30 ml eiskalten TfB I-Puffer

resuspendiert. Die Zellen wurden 30 min auf Eis inkubiert, dann wieder bei 4°C

abzentrifugiert Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet vorsichtig in 4 ml

eiskalten TfB II-Puffer resuspendiert. Aliquots von je, 200 µl wurden in Eppendorfgefäße

(auf Eis) pipettiert und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die kompetenten Zellen

wurden bei -80°C gelagert.


- 28 -

Tabelle 8 und 9: Zusammensetzung TfBI und TfBII Puffer

TfBI Puffer

Substanzen Menge

RbCl2 10 mM

Mops 10 mM

CaCl2 75 mM

Glycerin 15% (v/v)

pH 6,8

TfBII Puffer

Substanzen Menge

RbCl2 10 mM

Mops 10 mM

CaCl2 75 mM

Glycerin 15% (v/v)

pH 6,8

Alle Substanzen wurden gelöst und der pH–Wert eingestellt. Anschließend wurden die

Puffer steril filtriert und bei 4°C gelagert.

C.2.4.1 Transformation kompetenter E. coli Zellen

Für die Transformation der kompetenten E. coli- Zellen wurde ein Aliquot kompetenter

Zellen auf Eis aufgetaut. Die Zellen wurden vorsichtig mit dem entsprechenden Plasmid

oder Ligationsansatz gemischt und auf Eis inkubiert (30 min). Nach dem Hitzeschock bei

42°C im Wasserbad für circa 1 min wurden die Zellen zurück auf Eis gestellt und 600 µl

LB-Medium zugegeben. Zur Regeneration wurden die Zellen für 30-60 min bei 37°C (auf

dem Roller) inkubiert. Anschließend wurden die transformierten Zellen auf

entsprechende Selektionsplatten ausplattiert und über Nacht. bei 37°C inkubiert.


- 29 -

C.2.5 Mobilisierung von Plasmiden aus E. coli nach R. leguminosarum

Um Plasmide über Konjugation aus einem Donorstamm zu mobilisieren, muss dieser mit

dem gewünschten Rezipientenstamm gekreuzt werden. Der Stamm E. coli S17-1 trägt

die Transferfunktionen von RP4 (RK2) im Chromosom integriert (Simon et al., 1983) und

ist somit als Donor zur Konjugation geeignet. Im Folgenden werden das Prinzip sowie

die Durchführung der Filterkreuzung dargestellt.

Der Rhizobien Rezipientenstamm wurde in TY-Medium bis zur stationären Phase

kultiviert. Währenddessen wurde der E. coli S17-1 Stamm mit dem zu mobilisierenden

Plasmid selektiv in LB-Medium bis zur späten log-Phase kultiviert. 0,5 ml der Donorkultur

und 1 ml der Rezipientenkultur wurden gemischt und 1 min bei 12000 rpm

abzentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, das Pellet mit TY-Medium gewaschen

und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde im Rücklauf resuspendiert und auf einen

Nitrocellulose-Filter (Ø 1 cm), der auf einer unselektiven TY-Platte lag, pipettiert. Der

Konjugationsansatz wurde über Nacht bei 28°C inkubiert. Der Filter wurde anschließend

in 1 ml TY-Medium aufgenommen und die Bakterien durch Vortexen resuspendiert. Die

Suspension wurde verdünnt und auf geeignete selektive TY-Platten ausgestrichen.

Diese wurden solange bei 28°C inkubiert, bis Einzelkolonien zu erkennen waren.

Plasmidkonstrukte können auch durch „Übereinanderstreichen“ des Donor- und

Rezipientenstamms auf einer unselektiven TY-Platte und anschließender Inkubation

(über Nacht bei 28°C) mobilisiert werden. Anschließend wird eine Impföse Zellmaterial

auf Selektivmedium vereinzelt. Die Transferfrequenz bei dieser Methode ist deutlich

niedriger als bei einer Filterkreuzung, reicht aber zum einfachen Plasmidtransfer aus, um

genügend Transkonjuganden herzustellen.


- 30 -

C.2.6 Analyse der Plasmidstabilität

Da unter normalen Bedingungen sowohl in der Rhizosphäre und Rhizoplane einer

Pflanze, als auch in den Wurzelknöllchen kein Selektionsdruck durch Antibiotika

ausgeübt wird, sollte in diesem Test die Stabilität der einzelnen Plasmide im

Donorstamm R. leguminosarum VF39 ohne Selektionsdruck analysiert werden.

Optimalerweise sollten die Plasmide für die Versuche im Boden auch nach mehreren

Generationen noch im Donorstamm enthalten sein.

Je eine Kolonie R. leguminosarum VF39 (pHReGFPplac), R. leguminosarum VF39

(pBBRIAA) und R. leguminosarum VF39 (pRD20) wurden selektiv in Flüssigmedium

kultiviert. Sobald sie die stationäre Phase erreicht hatten, wurden sie unselektiv in

frisches Flüssigmedium überimpft. Gleichzeitig wurden 100 µl der Bakterienkultur

verdünnt und je sowohl selektiv (Titer der Bakterien mit Plasmid) als auch unselektiv

(Gesamttiter der Bakterien) ausplattiert und analysiert.


- 31 -

C.2.7 Horizontaler Gentransfer

Die Versuche zum horizontalen Gentransfer mit R. leguminosarum bv. viciae VF39

[genta lacI] als Donorstamm wurden mit unterschiedlichen Bodenbakterien als

Rezipienten durchgeführt. Dabei wurde analysiert, ob die verschiedenen Plasmide aus

dem Donorstamm (mit und ohne Helfer) in die jeweiligen Rezipientenstämme transferiert

werden können. Als Helfer wurde ein E. coli- Stamm, der das Plasmid RP4-4 oder

pRK2013 trägt, in einem so genannten „triparental mating“ eingesetzt. Der E. coli Stamm

besitzt dazu auf seinem Plasmid die Transferfunktion, die mit der mob-site des zu

mobilisierenden Plasmids interagieren kann. So bewirkt der Helfer dann den Transfer

des Plasmids. Durch selektives Ausplattieren können dann die Rezipientenzellen, die

das Plasmid erhalten haben, ermittelt werden.

C.2.8 Versuche auf Nitrocellulosefiltern

Um horizontalen Gentransfer auf Nitrocellulosefiltern durchzuführen, wurden die

Stämme im Reagenzglas selektiv kultiviert. Dann wurden sie im Verhältnis 2: 1

(Rezipient: Donor) oder 2: 1: 1 (Rezipient: Donor: Helfer) in einem Eppendorfgefäß

gemischt und zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, das Pellet mit TY-Medium

gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde im Rücklauf resuspendiert und auf

einen Nitrocellulose-Filter (Ø 1 cm), der auf einer unselektiven TY-Platte lag, pipettiert.

Der Konjugationsansatz wurde für 24 - 48 h bei 28°C inkubiert. Nach der Inkubation

wurde der Filter in 1 ml TY-Medium aufgenommen und die Bakterien durch Vortexen

resuspendiert. Die Suspension wurde verdünnt und auf geeignete selektive TY-Platten

ausgestrichen. Diese wurden so lange bei 28°C inkubiert, bis Einzelkolonien zu

erkennen waren. Die Transferfrequenz wurde anhand des Rezipienten- und Ereignis-

Titers berechnet.


- 32 -

C.2.9 Konjugationsversuche in steriler und unsteriler Erde

Um sich nativen Bedingungen innerhalb des Versuchsaufbaus anzunähern, wurde die

Analyse des horizontalen Gentransfers (HGT) in Ansätzen mit 1g steriler bzw. nativer

Erde durchgeführt. Im Gegensatz zu den Filterkreuzungen ist die Bakteriendichte in der

Erde nicht so konzentriert und die Umgebung, d.h. pH-Wert, Feuchtigkeit,

Nährstoffangebot usw., weniger optimal. Die schon in der nativen Erde vorliegende

einheimische Bakteriengemeinschaft ist ebenfalls ein wichtiger Faktor, der einen

möglichen Gentransfer beeinflussen kann. Deswegen wurden die Versuche sowohl in

sterilisierter, als auch unsteriler Erde durchgeführt.

Je 1 g tyndalisierte Erde oder native Erde wurden in Petrischalen eingewogen. Donor-

und Rezipientenkultur wurden bis zur log-Phase kultiviert. Die Kulturen wurden mit 10%

Glycerinlösung gewaschen um Mediumreste zu entfernen. Dann wurden je 108 – 1010

Zellen in 100 µl 10% Glycerin gelöst und unter die Erde gemischt. Mit dieser

Flüssigkeitsmenge ist die Wasserkapazität im Boden optimal auf 60% eingestellt. Als

Donorstamm diente VF39 [genta lacI], der das pHReGFPplac- oder pHRdsRedplac-

Plasmid trägt. Die Petrischale wurde verschlossen und der Versuchsansatz bei 28°C

inkubiert. Nach 24h und 48h erfolgte die Untersuchung auf Konjugationsereignisse unter

dem Mikroskop. Dazu wurde die Erde mit Natriumpyrophosphat geschüttelt um die

Bakterien von den Erdpartikeln zu lösen. Dann wurde kurz anzentrifugiert, um die

großen Erdklumpen zu sedimentieren. Der Überstand wurde mit Unterdruck auf einen

Nitrocellulosefilter (Ø 2,3 cm) abgesaugt und die Bakterien- Erdschicht konnte unter dem

Mikroskop auf fluoreszierende Transkonjuganden hin untersucht werden. Zusätzlich

wurden die Ansätze auf Selektionsmedien ausplattiert und anschließend die Titer- und

Transferfrequenz bestimmt.


- 33 -

C.2.10 Mikroskopische Detektion von horizontalem Gentransfer

Zur mikroskopischen Detektion des HGT wurden die Zellen nach der Kreuzung auf einen

Nitrocellulosefilter (Ø 2,3 cm) gebracht. Auf die Zellen wurde ein Tropfen Vectashield

Mounting Medium (mit DAPI) für Fluoreszenzmikroskopie gegeben und das Deckglas

aufgelegt. Die Detektion der Zellen erfolgte mit 1000-facher Vergrößerung in Öl

(Mikroskop: Olympus BX50). Zur Detektion der DAPI gefärbten Zellen wurde mit

Anregung im ultravioletten Bereich gearbeitet. Die Detektion der eGFP und dsRed

exprimierenden Zellen erfolgte mit Anregung durch Blaulicht bzw. Grünlicht. Dazu

wurden die folgenden Filter genutzt:

UV-Filter 330- 385 nm, Sperrfilter 425 nm

Blaufilter Anregung von eGFP bei 450- 480 nm, Sperrfilter 515 nm

Emission 509 nm

Grünfilter (Cy3) Anregung von dsRed bei 520 -550 nm

Emission 565 nm


- 34 -

C.2.11 Konjugationsversuche auf Schrägagarplatten

Um die Konjugationsfrequenz ausschließlich innerhalb der Rhizosphäre und Rhizoplane

zu testen wurden Medicago sativa Keimlinge in Petrischalen auf Schrägagar gesetzt.

Der Agar besitzt keine C-Quelle, sodass die inokulierten Bakterienstämme als C-Quelle

nur die Wurzelexsudate der Pflanzen nutzen können. So ist gewährleistet, dass die

Bakterien nur in der sehr eng begrenzten Zone, der Rhizoplane und Rhizosphäre der

Wurzeln, wachsen können. Die Pflanzenwurzeln können mikroskopisch auf

Konjugationsereignisse untersucht werden ohne das System zu stören.

Donor- und Rezipientenkultur wurden bis zur log-Phase kultiviert. Dann wurden je 1010 –

1012 Zellen in 100 µl TY-Medium gelöst nacheinander auf die Wurzeln pipettiert. Als

Donorstamm diente VF39 [genta lacI], der das pHReGFPplac oder pHRdsRedplac

Plasmid trägt. Die Petrischale wurde verschlossen und der Versuchsansatz in der

Pflanzenkammer inkubiert. Nach 24h, 48h und 72h erfolgt die Untersuchung auf

Konjugationsereignisse unter dem Mikroskop. Zusätzlich wurden von einigen Ansätzen

die Bakterien aus der Rhizoplane und Rhizosphäre mit einer Impföse aufgenommen, in

ein mit TY-Medium gefülltes Eppendorfgefäß gegeben und zur Bestimmung der Donor-,

Rezipienten- und Ereignis-Titer auf Selektionsmedien ausplattiert.

Verwendete Donorstämme R. leguminosarum bv. viciae VF39 [genta lacI] pHReGFPplac/ pHRdsRedplac

Verwendete Rezipientenstämme R. tropici CIAT 899

S. meliloti 2011

R. leguminosarum bv. viciae VF39

Klebsiella planticola

Pseudomonas stutzeri

Verwendetes Medium Es wurden die NOD A, B, B1, D Lösungen des Pflanzennodulationsmediums verwendet,

wobei anstelle von NOD C eine FeCl3-Lösung. benutzt wurde, da sie im Gegensatz zu

Fe-Citrat nicht als C-Quelle genutzt werden kann. Als N-Quelle wurde 0,05% KNO3-

Lösung. zugegeben.


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Baum wolldocht

Docht

Falcontube

Spritze

C.2.12 Untersuchung des horizontalen Gentransfers in sterilen Mikrokosmen

Ein weiterer Schritt in der Untersuchung des horizontalen Gentransfers des

pHReGFPplac-Plasmids ist die Analyse in sterilen Mikrokosmen. Diese bestehen aus

sterilisierter Erde, in der eine Erbsenpflanze wächst. Sie wurden mit Donor- und

Rezipientenstamm inokuliert und 4 Wochen in der Pflanzenkammer inkubiert.

Anschließend wurden die Bereiche Rhizoplane, Rhizosphäre und die verbleibende Erde

außerhalb der Rhizosphäre getrennt voneinander auf horizontalen Gentransfers mittels

mikroskopischer Detektion und Untersuchung der Kolonie-bildenden-Einheiten (KBE)

untersucht. Durch die Trennung in drei Bereiche sollte außerdem der Einfluss der

Pflanze auf die Transferfrequenz analysiert werden. Weiterhin wurde durch KBE die

Gesamtzahl der vitalen Donorzellen im Gegensatz zur Gesamtzahl der vitalen

Donorzellen mit Plasmid ermittelt. Dadurch sollte analysiert werden, wie stabil das

Plasmid bei vierwöchigem Wachstum unter den unselektiven Bedingungen im Boden in

den Donorzellen verbleibt.

Aufbau der Mikrokosmen

Abbildung 4: schematischer Aufbau der sterilen Mikrokosmen

Der sterilisierte Baumwolldocht wurde in die

Spitze der 60 ml Spritze geschoben, sodass

der obere Teil in die Erde hineinragte. Dann

wurde die Spritze mit Erde befüllt und

anschließend auf einem mit A. dest. gefüllten

Falcontube fixiert. Die Erde wurde mit

Alufolie abgedeckt und der Mikrokosmos 3 x

im Abstand von 48 h tyndalisiert.

Danach erfolgte das Bepflanzen mit einem

sterilisierten Erbsenkeimling. Eine Woche

nach Bepflanzen erfolgte die Inokulation mit

dem Donorstamm, 1 h später mit dem

Rezipientenstamm. Die Inkubationszeit

betrug vier Wochen.


- 36 -

C.3 Pflanzenkultivierung

C.3.1 Samensterilisierung

Zur Sterilisierung wurden die Pflanzensamen von Erbsen, Luzernen und Wicken in ein

steriles Falcongefäß gefüllt und zunächst zweimal kurz mit 96%igem Ethanol

gewaschen. Anschließend wurden die Samen mit konzentrierter Schwefelsäure für 15

min auf einem Schüttler inkubiert. Es folgten drei Waschschritte für jeweils zehn

Minuten. Nach dem Waschen wurden die Pflanzensamen zum Quellen über Nacht in

sterilem A. dest. bei 4°C gelagert. Dann wurden sie zur Sterilitätskontrolle mit einer

sterilen Pinzette aus dem Falcongefäß auf TY-Platten ausgebreitet. Die TY-Platten

wurden bei 28°C gelagert, bis die Samen deutlich gekeimt waren. Dann wurden die

Keimlinge von Erbsen und Luzernen in steriles Vermiculit gepflanzt. Die Wickensamen

wurden auf Schrägagarplatten gelegt.

Für die Rhizosphärenversuche in nativer Erde mussten die Samen nicht sterilisiert

werden. Sie wurden nur über Nacht zum Quellen bei 4°C gelagert und danach zum

Keimen in unsteriles Vermiculit gelegt. Anschließend wurden die Keimlinge in die mit

Erde gefüllten Töpfe eingepflanzt und mit den entsprechenden Bakterienstämmen

inokuliert. Das Pflanzenwachstum fand in einer Klimakammer bei konstanter Temperatur

von 24°C und 16h Belichtung (Langtag) statt.

Für den Versuch IV wurde die Erde im Verhältnis 2: 1 mit Vermiculit gemischt, damit der

Boden locker blieb.


- 37 -

C.3.2 Pflanzennodulationsmedium

Tabelle 10: Pflanzennodulationsmedium (nach Rolfe et al., 1980)

Lösungen Menge [g/l] Substanzen

Stammlösung A 294,0 CaCl2 x 2H2O

Stammlösung B 136,0 KH2PO4

Stammlösung B1 58,0 K2HPO4

Stammlösung C 6,7 Fe3-Citrat x 3H2O

Stammlösung D

123,0 87,0 0,333 0,25 0,288 0,10 0,056 0,048

MgSO4 x 7H2O K2SO4 MnSO4 x H2O H3BO3 ZnSO4 x 7H2O CuSO4 x 7H2O CoSO4 Na2MoO4

Die Stammlösungen A, B, B1, C, und D wurden mit A. dest. angesetzt und getrennt

autoklaviert. Zur Herstellung des Nodulationsmediums aus den Stammlösungen wurde

1l autoklaviertes A. dest. mit je 0,5 ml der Lösungen A, B, C, und D sowie 1 ml der

Lösung B1 versetzt.


- 38 -

C.3.3 Boden für die Pflanzenkultivierung

Zur Anzucht der Pflanzen wurde Erde von einem lokalen Rekultivierungsfeld bei Jülich

(Tagebau Inden West), NRW, Deutschland verwendet. Der Boden ist verdichtet und hat

nur einen geringen Humus- und Stickstoffgehalt. Um die Eigenschaften des Bodens

nachhaltig zu verbessern, wird dort Luzerne (Medicago sativa) angepflanzt. Nachdem

FAO-Klassifikationssystem handelt es sich um einen Regosol-Boden, d.h. eine

homogene Mischung aus Luvisol und glazialem Löss (Jahnke und Priefer, 2002). Die

oberen 10-15 cm des Bodens wurden abgetragen und im Labor bei 4 °C abgedeckt

gelagert. Vor Gebrauch wurde die nötige Menge bei Zimmertemperatur getrocknet und

anschließend gesiebt (zwei Millimeter). Für die Versuche in der nativen Erde wurden

Pflanztöpfe mit einer Schicht Kieselsteinen als Drainage und darüber ca. 230g Erde

befüllt. Das System wurde über 13mm dicke Baumwolldochte bewässert, deren Enden

sich einmal in der Erde und einmal in einer mit Wasser gefüllten Schale befanden. Durch

die Kapillarkräfte wurde das Wasser aufgesaugt bis die maximale Wasserhaltekapazität

des Bodens erreicht war. Dadurch konnte gewährleistet werden, dass die Ansätze in

allen Töpfen gleich feucht waren.

C.3.4 Eigenschaften des Bodens

Tabelle 11: Bodenparameter

(nach Dumbeck, Rheinisch Westfälische Energiewerke (RWE), 1992)

Parameter Anteil im Boden STABW

Sandfraktion 2-5 %

Schlufffraktion 70-80 %

Tonfraktion 14-17 %

CaCO3 10,4 % (0,7)

pH-Wert 7,5- 8 % (0,0)

Mg 94 µg/g Erde (5)

K2O 58 µg/g Erde (8)

P2O5 20 µg/g Erde (0)

Humusgehalt 0,4- 0,5 %

Gesamtstickstoffgehalt 0,025 % (0)

Gesamtkohlenstoffgehalt 0,24 % (0,04)

Porenvolumen 35 – 52 %

Feldkapazität 22 %


- 39 -

C.3.5 Inokulation der Pflanzen

Für die Inokulation wurden die entsprechenden Bakterienstämme in Medium mit

Antibiotika auf einem Roller bis zur späten log-Phase angezogen. Mit Hilfe der Thoma-

Kammer konnte die Zellzahl bestimmt werden. Anschließend wurden die Zellen

zentrifugiert, einmal mit A. dest. gewaschen und bis zu einem Titer von 106 Zellen/ ml

verdünnt. Auf jede zu beimpfende Pflanze wurde 1 ml der Zellkultur pipettiert. Dabei

wurde die Flüssigkeit direkt an der Wurzel in die Erde gespritzt, damit sich die Bakterien

direkt in der Rhizosphäre befinden.

C.3.6 Oberflächensterilisation von Wurzelknöllchen

Die Wurzelknöllchen wurden mit einem Stückchen verbleibender Wurzel in ein

Eppendorfgefäß mit 96% Ethanol gegeben und mehrmals kurz gevortext. Anschließend

wurden sie in einem neuen Gefäß mit 70% Ethanol gevortext. Zuletzt wurden sie

mehrmals mit sterilem Wasser gewaschen. Die sterilisierten Wurzelknöllchen wurden in

ein Eppendorfgefäß mit TY-Medium gegeben, gevortext und 100 µl davon ausplattiert.

Die Knöllchen wurden anschließend mit einem sterilen Stößel zerdrückt, und je 100 µl

der Suspension auf geeignete Selektivmedien ausplattiert.


- 40 -

pk19gabTgenta1lacI8160 bps

2000

4000

6000

8000

Xba I

Nco I

Ecl136II

136IIEcl65IAcc

ISmaHIBam

IXba

dIIIHin

1407IBsp

RVEco

1407IBsp

RVEcoINot

'gabT

gabD'

aph(3`)-IIa

oriTgabR''

gabT''

LacI

aacC1

C.4 Plasmidkonstruktionen

C.4.1 pK19gabTgenta1lacI

Die Konstruktion des Plasmids pK19gabTgenta1lacI dient zur Herstellung der VF39

[genta lacI]-Mutante. Das pk19mobgabT Plasmid (Prell, 2002) besitzt die Sequenz für

das gabT-Operon aus VF39 und dient als Ausgangsbasis für die Klonierung. Die

Gentamycinresistenz wird über HindIII aus pSLE85 ausgeschnitten und in pk19mobgabT

eingefügt. Dazu muss das Plasmid pk19mobgabT erst mit EcoRV geöffnet und

anschließend mit SmaI partiell verdaut werden. Nach Integration der GmR in das Plasmid

wird das aus DH5α amplifizierte lacI-Gen über Bsp1407I integriert. Beide Gene lagen in

der gleichen Orientierung vor wie gabT. Das fertige Plasmid (Abbildung 5 Plasmidkarte)

wird zur Konstruktion der VF39 [genta lacI]-Mutante über homologe Rekombination in

das gabT benutzt.

Abbildung 5: Plasmidkarte pk19gabTgenta1lacI oriT: RP4 „origin of transfer“,

zur konjugativen Mobilisierung;

aacC1: GmR;

aph(3’)-IIa: KmR/NmR;

gabD, gabR, gabT: Gene des gab-Operons;

lacI: Inhibitor des Lactose-Operons

C.4.2 pPJ2plac

Für die Konjugationsversuche wurde ausgehend von pJP2 (Prell, 2002) pPJ2plac

konstruiert (Abbildung 5 Plasmidkarte), das das uidA als Reportergen unter der Kontrolle

des lac-Promotors trägt. Der lac-Promotor wurde aus pUC19 über KpnI/ HindIII

ausgeschnitten und anschließend vor das uidA des pJP2 integriert.


- 41 -

pJP2pLac12378 bps

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Eco RI

Pst IBsp 1407I

Bsp 1407I

Eco RV

Eco RV

Xba IEcl 136IIXho IHin dIII

Acc 65IISma

RVEcoINar

INot

INar

trfA

uidA

plac

parCBA

parDEoriT

bla

tetA

tetR

oriV

pJPdsRedplac11286 bps

2000

4000

6000

8000

10000

Eco RI

Pst IBsp 1407I

Nco IXba IEcl 136IIXho IHin dIII

Acc 65I

ISma

RVEcoINar

INot

INar

trfA

dsRed

plac

parCBA

parDE

oriT

bla

tetA

tetR

oriV

pJPeGFPplac11286 bps

2000

4000

6000

8000

10000

Eco RI

Pst IBsp 1407I

Nco IXba IEcl 136IIXho IHin dIII

Acc 65I

ISma

RVEcoINar

INot

INar

trfA

eGFP

plac

parCBA

parDE

oriT

bla

tetA

tetR

oriV

Abbildung 6: Plasmidkarte pJP2plac

trfA: Replikationsstart von RK2;

oriT: Konjugationsstart von RK2;

uidA: ß-Glukuronidase (GUS);

parCBADE: Stabilitätsfunktionen aus RK2;

bla: AmpR; tetA, tetR: TetR

oriV: Replikationsstart aus RK2

Alternativ dazu wurde das Plasmid pJP5plac konstruiert, das zusätzlich zu uidA das

eGFP unter Kontrolle von plac trägt (Abbildung siehe Anhang). Zusätzlich zum uidA

Reportergen unter plac werden pJP-Derivate erstellt, die nur das eGFP oder ein rot

fluoreszierendes Chromophor (dsRed) unter der Kontrolle von plac haben. Dazu wurden

die Gene für eGFP (aus pHRGFPGUS) und dsRed (aus pTRAkt rfp) über PCR

amplifiziert, mit HindIII und PstI geschnitten und in das ebenfalls so geschnittene

pJP2plac ligiert.

C.4.3 pJPeGFPplac und pJPdsRedplac

Abbildung 7: pJPeGFPplac

Abbildung 8: pJPdsRedplac

trfA: Replikationsstart von RK2; oriT: Konjugationsstart von RK2; parCBADE: Stabilitätsfunktionen aus RK2; bla: AmpR; tetA, tetR: TetR; oriV: Replikationsstart aus RK2

Aufgrund der Größe der pJP-Plasmide, die als „low-copy“ Plasmide vorlagen, wurden für

die HGT-Versuche zusätzlich die Plasmide pHRGFPGUS, pHReGFPGUSplac,


- 42 -

pHRGFPGUSplac9159 bps

2000

4000

6000

8000

Not I

Not ISpe IBam HI

Nco I

Hin dIII

Nco I

dIIIHinHIBam

INco

ISpe

IKpnIXho

aph(NPTII)

uidA

eGFP

plac

blamob site

pHReGFPplac8114 bps

2000

4000

6000

8000

Pst I

Bsp 1407INco IXba IEcl 136IIXho IHin dIII

Acc 65IXho I

INot

INar

INotIXbaISpe

HIBamIXbaIPst

ISmaINco

IPstINar

INardIIIHin

RIEco

trfA

eGFP

plac

blamob site

aph(NPTII)

pHRdsRedplac8075 bps

2000

4000

6000

8000

Eco RI

Pst I

Xba IEcl 136IIXho IHin dIII

Acc 65IXho I

INot

INar

INotIXbaISpe

HIBamIXbaIPst

ISmaINco

IPstINar

INardIIIHin

trfA

dsRED

plac

blamob site

aph(NPTII)

pHReGFPplac und pHRdsRedplac benutzt. Sie sind ebenso wie pRD20 Derivate des

pBBR-1 Plasmids, wiesen eine höhere Kopienzahl auf und waren kleiner. Das Plasmid

pHReGFPGUSplac wurde durch Verdau von pHRGFPGUS mit KpnI und EcoRI (fill in)

und Integration des placeGFP aus pJP5plac über KpnI und Ecl136II hergestellt. Die

Plasmide pHReGFPplac und pHRdsRedplac wurden aus dem pHReGFPGUSplac

hergestellt in dem das uidA über HindIII entfernt und anschließend das Plasmid religiert

wurde. Nun konnte über ACC65I und EcoRI das placeGFPtrfA bzw. placdsRedtrfA in

das pHR-Plasmid gesetzt werden. Durch Austausch des iaaM- und tms2-Gens in pRD20

gegen placdsRed wurde das Plasmid pRD20dsRed zu Testzwecken konstruiert.

C.4.4 pHR-Plasmide

pRD20dsRedplac7335 bps

1000

2000

30004000

5000

6000

7000

NotI

BclI

BclI

SspI

Ecl136IINotIXbaI

BamHISmaI

PstI

DraI

XbaIEcl136II

XhoIHindIII

Acc65IKpnIEcoRI

DraI

spec

dsRED

pLac

mob site

Abbildung 9: pRD20dsRedplac Abbildung 10: pHReGFPGUSplac

Abbildung 11: pHReGFPplac Abbildung 12: pHRdsRedplac

mob site: Replikations-/Konjugationsstart; spec: SpecR; bla: AmpR; aph(NPTII): KmR/NmR; uidA: ß- Glukuronidase; eGFP; dsRed; trfA: Replikationsstart von RK2; bla: AmpR;


- 43 -

C.5 Molekularbiologische Methoden

C.5.1 Isolierung von Plasmid-DNA

Die Isolierung von Plasmid-DNA erfolgte über Adsorbtionschromatographie mit dem

Macherey-Nagel NucleoSpin® Plasmid-Kit. Dieses Kit ist sowohl zur Isolierung von

„high-copy“ als auch von „low-copy“ Plasmiden geeignet. Die Durchführung entsprach

den Herstellerangaben.

C.5.2 Isolierung von Gesamt-DNA aus Bakterien (CTAB-Methode)

Mit der CTAB-Methode nach K. Wilson (in Ausubel et al., 1987) lässt sich sowohl

plasmidäre als auch chromosomale DNA aus Bakterienzellen isolieren. Dazu wurden 1,5

ml einer Bakterienkultur (o.D. 580 = 0,6-0,8) für 2 min bei 13000 rpm abzentrifugiert. Das

Pellet wurde in 567 µl TE-Puffer resuspendiert. Zur Lyse der Zellen wurde eine

Mischung aus 30 µl 10%iger SDS-Lösung und 3 µl Proteinkinase K-Lösung (20 mg/ ml

TE) zugegeben, gründlich gemischt und 1 h bei 37°C inkubiert. Danach wurde 100 µl 5

M NaCl-Lösung zugeben und erneut gründlich gemischt. Dann erfolgte die Zugabe von

80 µl erwärmter CTAB/NaCl-Lösung (10% /0,7M). Nach Mischen der Lösungen wurde

10 min bei 65°C inkubiert. Anschließend wurden 600 µl Phenol/ Chloroform/

Isoamylalkohol (25: 24: 1) zugeben, gemischt und 10 min bei 13000 rpm zentrifugiert.

Die obere (wässrige) Phase konnte jetzt mit einer Pipette vorsichtig in ein frisches

Eppendorfgefäß überführt werden. Danach wurde 600 µl Chloroform/Isoamylalkohol (49:

1) zugesetzt, gründlich gemischt und 5 min bei 13000rpm zentrifugiert. Zur Fällung der

DNA aus der wässrigen Phase, wurde die obere Phase erneut in ein frisches

Eppendorfgefäß (1,5 ml) überführt, mit 500 µl Isopropanol versetzt und gründlich

gemischt. Dabei wurde die ausfallende DNA sichtbar, die dann 10 min bei 13000 rpm

abzentrifugiert wurde. Der Überstand wurde verworfen und das DNA-Pellet mit 700 µl

Ethanol (70%) gewaschen. Zuletzt wurde nach circa 5-15 min noch einmal zentrifugiert,

das Pellet getrocknet und dann in 100 µl A. dest. (steril) resuspendiert und bei 4°C

gelagert, oder direkt für weitere Analysen verwendet.


- 44 -

Lösungen für die CTAB Extraktion

TE-Puffer 10 mM Tris, 1mM EDTA, pH 8, 0

SDS-Lösung (10%) SDS in A. dest. lösen und autoklavieren

Proteinase K-Lösung 20 mg/ ml

CTAB/NaCl-Lösung 10% (w/v) Cethyltrimethylammoniumbromid (CTAB) in 0, 7 M NaCl-Lsg.


- 45 -

C.5.3 DNA-Konzentrationsbestimmung

Die Konzentrationsbestimmung der DNA erfolgte bei 260 nm mittels UV-

Absorptionsspektrometrie. Bei dieser Wellenlänge entspricht eine Absorption von 1,0

einem Gehalt von 50 µg/ ml doppelsträngiger DNA. Es muss allerdings berücksichtigt

werden, dass RNA bei dieser Wellenlänge ebenfalls absorbiert wird und die Menge der

DNA-Konzentration dadurch eventuell nicht ganz richtig abgeschätzt werden kann.

C.5.4 DNA-Spaltung durch Restriktionsendonukleasen

Restriktionsendonukleasen bauen DNA durch die Spaltung „innerer“ Phosphodiester-

Bindungen ab. In dieser Arbeit wurden die Typ II Restriktionsendonukleasen verwendet.

Sie schneiden direkt an ihrer 4-8 bp langen palindromischen Erkennungssequenz. Die

hier verwendeten Restriktionsenzyme wurden zur Spaltung der DNA gemäß den

Herstellerangaben eingesetzt.

C.5.5 Agarose-Gelelektrophorese

Diese Methode dient zur Auftrennung von DNA-Molekülen gemäß ihrer Größe. Je höher

die Konzentration des Agarosegels, umso kleinere Fragmente lassen sich auftrennen.

Die Gele wurden je nach gewünschtem Auftrennungsverhalten aus 0,8-1,5% (w/v)

Agarose (in 1x TA Puffer) gegossen, abgekühlt und mit 1x TA Puffer überschichtet. Die

DNA-Proben wurden mit 0,2 Volumen Ladepuffer versetzt und aufgetragen. Die DNA-

Moleküle wurden mittels Elektrophorese aufgetrennt und anschließend in

Ethidiumbromid-Lösung gefärbt. Nach der Entfärbung im Wasserbad erfolgte die

Dokumentation im UV-Durchlicht mit dem ImaGo Compact Imaging System der Firma

B&L System.


- 46 -

Tabelle 12: TA-Puffer (50x)

Substanz Menge in g/l

Tris HCl (2M) 242,28

Natriumacetat (500mM) 41,02

EDTA (50mM) 18,61

pH 7,8

C.5.6 Größenabschätzung von DNA-Fragmenten

In dieser Arbeit wurden zur Größenabschätzung die Größenmarker EcoRI/HindIII-

geschnittene λ-DNA, die 1 kb DNA-Leiter und die 100 bp DNAplus-Leiter der Firma

Fermentas verwendet. Zusätzlich wurde für die Southern-Hybridisierung ein DIG-

markierter EcoRI/HindIII-Marker der Firma Roche verwendet.

C.5.7 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte nach Herstellerangaben

mit dem NucleoSpin® ExtractII-Kit von MACHEREY-NAGEL. Die gewünschten DNA-

Fragmente wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und aufgereinigt. Die Isolierung

der DNA basiert auf Adsorptionschromatographie, bei der die DNA aufgrund von hohen

Salzkonzentrationen und pH-Werten <7,5 an die Silicat-Membran der Spin-Säule bindet.

C.5.8 Auffüllen von Restriktionsenden (fill-in)

Einige Restriktionsendonukleasen schneiden mit so genannten „sticky“ Enden, d.h. sie

produzieren beim Schneiden überhängende Enden. Entstehen 5’-überhängende Enden,

so lassen sich diese mit Hilfe des Klenow-Fragments (große Untereinheit der DNA-

Polymerase I) in Anwesenheit von Nukleotiden „auffüllen“. Diese Reaktion lässt sich

molekularbiologisch auf verschiedene Arten nutzen. Zum einen können durch den

Einsatz von radioaktiv markierten Nukleotiden DNA-Fragmente effektiv markiert werden.

Zum anderen können durch das Auffüllen von „sticky“ Enden Schnittstellen zerstört

werden bzw. „blunt“ Enden erzeugt werden. Die Durchführung erfolgte nach

Herstellerangaben.


- 47 -

C.5.9 Dephosphorylierung linearer DNA-Moleküle

Die Abspaltung endständiger 5’-Phosphatgruppen verhinderte die Religation von

linearisierten Vektor-Molekülen. Die Dephosphorylierung wurde direkt nach dem

Restriktionsverdau mit alkalischer Phosphatase aus Kälbermägen (CIAP) im selben

Ansatz durchgeführt. Die Durchführung erfolgte gemäß Herstellerangaben.

C.5.10 Ligation von DNA-Fragmenten

Die durchgeführten Ligationen wurden mit dem Enzym T4-DNA-Ligase durchgeführt.

Das Enzym wird aus E. coli- Bakterien gewonnen, die mit dem Bakteriophagen T4

infiziert sind. Die Eigenschaft dieses Enzyms, Brüche in DNA-Doppelsträngen zu

reparieren, wurde dazu genutzt, verschiedene DNA-Moleküle miteinander zu

verknüpfen. Die Durchführung der Ligationsreaktion erfolgte nach Herstellerangaben.


- 48 -

C.5.11 Auftrennung von Plasmidprofilen (Eckhardt Lyse)

Um den Plasmidgehalt in Bakterien festzustellen, wurde innerhalb dieser Arbeit die

Eckhardt-Lyse durchgeführt. Sie erfolgte in den Geltaschen eines Agarosegels durch

Lysozym und SDS. Die anschließende Elektrophorese trennt die Plasmide nach ihrer

Größe auf, während das Bakterienchromosom in der Geltasche zurückbleibt. Die hier

beschriebene Vorgehensweise wurde nach Eckhardt (1978) modifiziert. Dazu wurde ein

0,8 – 1%iges Agarosegel (TB-Puffer) mit 0,2% SDS-Lösung genutzt. Es wurden

abhängig von ihrer optischen Dichte verschiedene Volumina der Bakterienkulturen

zentrifugiert. Das Zellpellet wurde sofort danach auf Eis gestellt und die Zellen in, 20 µl

kalter SRL-Lösung resuspendiert. Die erhaltenen Zellsuspensionen wurden sofort in eine

Tasche des Gels pipettiert. Die Gelelektrophorese wurde gestartet nachdem die

Zellsuspensionen klar waren (circa, 20 min). Die Elektrophorese wurde zunächst in

einem Vorlauf bei, 20 V für, 20-30 Minuten gestartet. Der Hauptlauf erfolgte bei 100-120

V für weitere ein bis drei Stunden. Nach Färbung der Agarosegele mit Ethidiumbromid

erfolgte die Detektion der angefärbten DNA im UV-Licht auf dem Transluminator.

Danach wurde die DNA zum Blotten auf eine Nylonmembran überführt.

Tabelle 13: TB Puffer 5x

Substanz Menge [g/ l]

Tris [90mM] 10,9

EDTA [2,5mM] 0,93

Borsäure [90mM] 5,57

auf pH 8,5 einstellen

SRL-Lösung 25% (w/v) Saccharose und 10% Ficoll in TB-Puffer lösen, direkt vor Gebrauch 40 µl/ ml

RNase und 1 mg/ ml Lysozym zusetzen

Ethidiumbromid-Färbelösung 1 mg/l Ethidiumbromid


- 49 -

C.5.12 Vakuumblotting von DNA

Die Übertragung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen auf eine Nylon-Membran

erfolgte mit Hilfe einer Vakuum-Blott-Apparatur. Dazu wurde eine Nylon-Membran auf

geeignete Größe zugeschnitten, auf die poröse Trägerplatte der Apparatur aufgelegt und

mit einer Plastikmaske abgedeckt. Der äußere Rand der Membran (0,5 cm) war dabei

bedeckt. Nach luftblasenfreiem Auflegen des Agarosegels auf die Membran, erfolgte das

Abdichten der Apparatur und das Anlegen des Vakuums (50-80 mbar), welches nur über

das Gel ausgeglichen werden kann. So wurden die DNA-Fragmente aus dem

Agarosegel auf die Nylon-Membran übertragen. Unmittelbar nach Anlegen des Vakuums

wurden folgende Schritte durchgeführt:

C.5.12.1 Depurinierung der DNA

Zur Depurinierung wurde das Gel 15 min mit Depurinierungspuffer überschichtet, wobei

das Bromphenolblau des Markers auf dem Gel von blau nach gelb umgeschlagen ist.

C.5.12.2 Denaturierung der DNA

Nach Entfernen des Depurinierungspuffers erfolgte die Denaturierung der DNA für 15

min durch Überschichten mit Denaturierungslösung. Ein erneuter Farbumschlag des

Indikators nach blau fand statt.

C.5.12.3 Neutralisierung des Gels

Nach Entfernen der Denaturierungslösung folgte für 10 min die Überschichtung mit

Neutralisierungslösung.


- 50 -

C.5.12.4 Transfer und Fixierung der DNA

Nach Entfernen der Neutralisierungslösung wurde das Gel für 60 min mit Transferpuffer

überschichtet und die denaturierte DNA auf die Nylonmembran überführt. Nach

Beendigung des Vakuums wurde das Gel entfernt und die an die Nylonmembran

gebundene DNA durch eine fünfminütige UV-Bestrahlung fixiert. Die Membran wurde

entweder einige Tage bei 4°C gelagert oder sofort für die Hybridisierung benutzt.

Lösungen für den Vakuumblott

Depurinierungslösung 0,25 M HCl

Denaturierungslösung 1,5 M NaCl

0,5 M NaOH

Neutralisierungslösung 2,0 M NaCl

1,0 M Tris-HCl auf pH 7,5 eingestellt

Transferpuffer (20 x SSC) 3,0 M NaCl

0,3 M Na3-Citrat

0,3 M mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt


- 51 -

C.5.13 Herstellung Digoxigenin-dUTP markierter Sonden

Bei der nicht-radioaktiven Hybridisierung wurden die als Sonden verwendeten DNA-

Fragmente durch Einbau von Digoxigenin-dUTP markiert. Die Herstellung der Sonde

erfolgte in dieser Arbeit mittels PCR und „random priming“. Dazu wurde die Plasmid-

DNA, die den als Sonde gewünschten DNA Bereich enthält, als template in die PCR

Reaktion eingesetzt und mit entsprechenden Primern (lacI forward und lacI reverse)

amplifiziert. Hierbei enthielt der Nukleotidmix DIG-dUTPs (BOEHRINGER), die bei der

Amplifikation anstelle von dTTPs eingebaut werden, sodass das PCR-Produkt markiert

wurde.

C.5.13.1 Sondenherstellung über PCR

Tabelle 14: Sondenherstellung

PCR Ansatz Endkonzentration

10 x PCR Puffer 1x

25 mM MgCl2 1,5 mM

dNTP-Mix für DIG (A,C,G: 1 mM; T: 0,65 mM) A,C,G: 100 µM; T: 65 µM

DIG-dUTP (0,35 mM) 35 µM

Primer (lacI forward) 10 µM 1 µM

Primer (lacI reverse) 10 µM 1 µM

Taq Polymerase (5U/ µl) 2,5 U

DNA-template 1 µl

Gesamtvolumen 25 µl (Auffüllen mit A. dest.)

Tabelle 15: PCR Programm für die Sondenherstellung

PCR Programm Temperatur Dauer

Primärdenaturierung 94°C 5 min

Denaturierung 94°C 45 sec

Annealing 55°C 45 sec 30 Zyklen

Elongation 72°C 1 min

Terminale Elongation 72°C 10 min


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C.5.13.2 Sondenherstellung über „random priming“

Das zu markierende DNA-Stück (Gentamycin-Resistenzgen) wurde über HincII und NotI

aus dem Plasmid pSLE85 ausgeschnitten. Anschließend wurde das DNA-Stück mit

SauIIIA in kleine Stücke gespalten und denaturiert. Zu der denaturierten DNA wurde ein

Gemisch aus Hexanukleotiden mit zufälliger Sequenz (random priming) und ein

Gemisch aus Deoxynukleotiden (dNTPs) gegeben. Im Allgemeinen binden

Hexanukleotide statistisch verteilt an die einzelsträngige DNA, und das Klenow-

Fragment katalysiert an diesen Primer die Synthese des komplementären Stranges. Die

zugegebene dNTP-Mischung enthielt das DIG-dUTP, das in den neu synthetisierten

Strang alternativ zum dTTP eingebaut wurde. Die so markierte Sonden-DNA wurde

anschließend gereinigt. Die Reaktionen wurden mit dem „Labeling and Detection Kit“ der

Firma Roche durchgeführt.

C.5.13.3 Label-Kontrolle (Dot-Blot)

Die Label-Kontrolle zur Abschätzung der Effektivität der Sonde erfolgte über das

Anfärben von verschiedenen Verdünnungsstufen der Sonde und den Vergleich der

Farbintensität mit der Kontroll-DNA [10ng/ µl]. Es wurden sowohl Verdünnungsreihen

von der Sonden-DNA als auch von der DIG-markierten Kontroll-DNA (aus dem Labeling

und Detection Kit) von 100 – 10-5 angesetzt. Von jeder Verdünnungsstufe wurde je 1 µl

auf eine Nylonmembran pipettiert und durch UV-Bestrahlung an der Membran fixiert. Die

Membran wurde dann in eine Färbeschale überführt und gewaschen (siehe

Waschschritte bei Southern Hybridisierung) Die Farbintensität der Sonden- und der

Kontroll-DNA wurden miteinander verglichen und somit konnte jetzt die Nachweisgrenze

bzw. Effektivität der hergestellten Sonde bestimmt werden.


- 53 -

C.5.13.4 Southern Hybridisierung

Zunächst wurde die Nylon-Membran nach dem Vakuumblott durch die Vorhybridisierung

mit proteinhaltigem Blocking-Reagenz gegen unspezifische Bindungen abgesättigt.

Dabei besetzten die darin enthaltenen Proteine die freien Bindungsstellen auf der

Membran, sodass die Sonde nur noch an homologe DNA-Bereiche binden kann.

Anschließend erfolgte die Hybridisierung mit der eigentlichen DNA-Sonde.

C.5.13.5 Vorhybridisierung

Die Nylon-Membran mit der fixierten DNA wurde möglichst luftblasenfrei in einen

Hybridisierungszylinder gerollt, wobei die Seite mit der DNA nach innen zeigte. Es wurde

10 ml der Hybridisierungslösung (ohne Sonde) zugeben und für 1-3 h bei 68°C im

Hybridisierungsofen inkubiert.

C.5.13.6 Hybridisierung

Die markierte DNA-Sonde wurde zuerst zu 10 ml Hybridisierungslösung gegeben und 10

min bei 95 -100°C denaturiert. Die Lösung im Hybridisierungszylinder wurde durch die

Hybridisierungs-/DNA-Sonden-Lösung ersetzt. Anschließend wurde der Filter über Nacht

bei 68°C im Hybridisierungsofen inkubiert. Nach der Hybridisierung wurde die

Hybridisierungs-/DNA-Sonden-Lösung abgegossen und bei –20°C zur

Wiederverwendung gelagert. Die Nylon-Membran wurde 10 min gewaschen (50 ml 2 x

SSC; 0,1% SDS) und nochmals 30 min bei 68°C (in 50 ml 0,1 x SSC; 0,1% SDS) im

Ofen inkubiert, um die unspezifisch gebundene Sonde zu entfernen.

Zusammensetzung der Hybridisierungslösung 5 x SSC

1,00 % (w/v) Blocking-Reagenz (Casein)

0,10 % (w/v) N-Laurosylsarkosin

0,02 % (w/v) SDS


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C.5.14 Immunologische Nachweisreaktion

Der spezifische Nachweis der DIG-markierten Sonde erfolgte über die Bindung eines

Antikörpers. Das Prinzip dieser Nachweisreaktion basiert darauf, dass der Antikörper

eine kovalent gebundene alkalische Phosphatase trägt, die bei der Reaktion das

Substrat 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP) dephosphoryliert und in das

entsprechende Indoxyl überführt. Dieses tautomerisiert zu einem Keton, das unter den

gewählten Detektionsbedingungen zu einem blauen Indigofarbstoff dimerisiert. Zur

Verstärkung der Farbe wurde Nitroblau-Tetrazoliumsalz (NBT) zugesetzt, das durch die

freigesetzten Protonen zum purpurfarbenen Diformazan reduziert wurde.

Ablauf der Nachweisreaktion Nach Waschen des Filters wurde dieser für 30 min in 50 ml Puffer 2 inkubiert. Daraufhin

wurde 3 µl Anti-Digoxygenin-AP-Konjugat (BOEHRINGER) zu 10 ml Puffer 2

hinzugeben und der Filter 30 min damit inkubiert. Das ungebundene Antikörper-Konjugat

wurde durch zweimaliges Waschen (15 min) mit je 50 ml Puffer 1 entfernt. Die Nylon-

Membran wurde für zwei Minuten mit, 20 ml Puffer 3 gewaschen und anschließend in

einer Schale mit 5 ml Färblösung (DNA Seite nach unten) im Dunkeln inkubiert, bis die

Banden in der gewünschten Intensität sichtbar waren. Anschließend wurde die

Farbreaktion durch Zugabe von Puffer 4 gestoppt und der Filter zur Dokumentation der

Ergebnisse eingescannt.

Tabelle 16: Lösungen für den Antikörpernachweis

Puffer Zusammensetzung

Waschpuffer 0,3% (w/v) Tween, 20 in Puffer 1

Puffer 1 0,10 M Maleinsäure 0,15 M NaCl mit NaOH auf pH 7,5 eingestellt

Puffer 2 1% (w/v) Blocking Reagenz in Puffer 1

Puffer 3 0,1 M Tris-HCl 0,1 M NaCl 50,0 mM MgCl2 auf pH 9,5 eingestellt

Puffer 4 10,0 mM Tris-HCl 1,0 mM EDTA

Färbelösung (hochgiftig und lichtempfindlich)

45 µl Nitroblau-Tetrazolium-Lösung (NBT) 35 µl 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat p-Toluidin-Salz (BCIP) in 10 ml Puffer 3 gelöst


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C.5.15 Extraktion von DNA und RNA aus der Rhizosphäre

Der Einfluss des gentechnisch veränderten Rhizobienstamms auf die mikrobielle

Gemeinschaft im Boden wurde parallel auf DNA- und auf RNA-Ebene untersucht. Durch

die parallele Extraktionsmethode ist gewährleistet, dass die Ergebnisse beider

Untersuchungen miteinander verglichen werden können. So kann ein möglicher Effekt

auf die in der Rhizosphäre und Rhizoplane der inokulierten Pflanze vorhandenen

Bakterienpopulationen wie auch auf die Aktivität der einzelnen Bakterienarten innerhalb

der Population sichtbar gemacht werden.

Ablauf der Extraktion Die Extraktion basiert auf Protokollen von Bürgmann et al. (2001); Felske et al. (1996);

Griffiths et al. (2000); Sessitsch et al. (2002); Ranjard et al. (2003) und eigenen

Vorversuchen. Zur Durchführung der Extraktion wurden 500 mg Rhizosphäre oder 300

mg Rhizoplane jeweils in eine Bio-101-Säule eingewogen und 1 ml Extraktionspuffer

(60°C) zugegeben. Der Zellaufschluss der Bakterienzellen erfolgte in der Fast Prep für

45 sec bei einer Geschwindigkeit von 5.5 m/s. Anschließend wurden die Proben für fünf

Minuten bei 4°C und 11000 rpm zentrifugiert. Nach diesem Schritt erfolgte die Aufteilung

des Überstands auf zwei Eppendorfgefäße zur getrennten Extraktion der DNA und RNA

aus den Bodenproben. Zum Überstand wurden je 400 µl Phenol/ Chloroform/

Isoamylalkohol (25: 24: 1) zugegeben und je 400 µl Guanidinthiocyanat [4 M]

hinzugefügt, die verhindern, dass die im Boden vorhandenen Huminsäuren die

Isolierung der Nukleinsäuren stören. Zum Schutz der RNA vor Oxidation und zur

Stabilisierung wurde hier zusätzlich 0,1% 8- Hydroxychinolin hinzu gegeben. Die Proben

wurden gevortext und dann für zehn Minuten bei 11000 rpm zentrifugiert. Die wässrige

Phase, in der sich die Nukleinsäuren befinden, wurde vorsichtig in ein frisches

Eppendorfgefäß überführt und 1 Vol. Chloroform/ Isoamylalkohol (24: 1) hinzugefügt. Die

Mischung wurde gevortext und anschließend für fünf Minuten bei 13000 rpm

zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde erneut in ein frisches Eppendorfgefäß gegeben

und die Nukleinsäuren durch Zugabe von 2 Vol. PEG-Lösung ü.N. bei Raumtemperatur

ausgefällt. Die ausgefallene Nukleinsäure wurde für zehn Minuten bei 4°C und 13000

rpm abzentrifugiert, dann mit 3 Vol. eiskaltem Ethanol (70%) gewaschen, erneut für 15

min bei 4°C und 13000 rpm zentrifugiert und bei RT getrocknet. Zum Schluss wurde das

Nukleinsäurepellet in 50 µl RNase-freiem A. dest. gelöst und bei -20°C gelagert.


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Lösungen für die Extraktion von DNA und RNA

PEG-Lösung 30% Polyethylenglykol (PEG6000) in 1,6 M NaCl-Lsg.

Extraktionspuffer 0,7 M NaCl, 250 mM Dinatriumhydrogenphosphat,

50 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol

und 2% SDS (w/v), pH 8,0; RNase frei


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C.5.16 Abbau der DNA und reverse Transkription (RT)

Um den Einfluss des gentechnisch veränderten Rhizobienstamms auf die Aktivität der

einzelnen Bakterien innerhalb der Population zu untersuchen, musste die Gesamt-RNA

zuerst durch reverse Transkriptase (RT) in cDNA umgeschrieben werden. Damit DNA-

Reste die weiteren Analysen der RNA-Probe nicht stören können, wurde vor dem

Umschreiben eine Behandlung mit DNase-I durchgeführt.

Abbau der DNA 10 µl RNA-Lösung [1 µg] wurden mit 1 µl DNase-I Puffer und 1 µl DNase-I

(1U/ µl) gemischt

Inkubation bei 37 °C für 30 min

Hinzufügen von 1 µl EDTA (25 mM) zum Schutz der RNA

Inaktivierung der DNase-I bei 65 C für 10 min

Reverse Transkription Zu 4 µl RNA-Lösung wird ein Mastermix bestehend aus 0,5 µl Primer L-D-

Bact-132a-A-18 [100 pmol/ µl] und 10,25 µl A. dest. gegeben

Inkubation bei 70°C für 5 min

Abkühlen auf Eis

Hinzufügen des Reaktionsmixes bestehend aus 1,25 µl dNTPs [10mM], 1,5

µl MgSO4 [25mM], 1 µl M MLV-RT [200 U/ µl] und 5 µl (5 x) RT-Puffer

Reverse Transkription bei 48 °C für 45 min

Inaktivierung des Enzyms bei 99 °C für 5 min

Die cDNA kann bei -20 ° C gelagert werden

Sequenz des verwendeten L-D-Bact-132a-A-18 Primers [5' – CCG GGT TCC CCC ATT

CGG- 3']


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C.5.17 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine Methode zur Vervielfältigung eines bestimmten

DNA-Abschnitts. Zu diesem Zweck müssen jedoch die Sequenzen der flankierenden

Bereiche bekannt sein. Die PCR lässt sich in drei Schritte einteilen. Zuerst wird die DNA

denaturiert. Dann hybridisieren die Primer (kurze definierte Oligonukleotide) mit

komplementären Sequenzen der DNA-Matrize (Annealing). Die

Hybridisierungstemperatur wird durch die Sequenz und Länge der Primer bestimmt und

muss einerseits so niedrig gewählt sein, dass es zur Hybridisierung zwischen Primer und

Matrize kommt, und andererseits so hoch, dass sich keine falsch gepaarten Hybride

bilden können. In der anschließenden Elongationsphase heftet die zur Synthese der

DNA-Stränge verwendete DNA-Polymerase neue Nukleotide an das vorhandene freie

3’-OH Ende des Primers und synthetisiert so die Komplementärstränge. Als DNA-

Polymerase verwendet man gewöhnlich die hitzestabile Taq-Polymerase I aus dem

Bakterium Thermus aquaticus Nach diesem Reaktionsschritt folgt erneut die

Denaturierung der DNA, womit ein neuer Zyklus beginnt. In der Regel wählt man 30-35

Zyklen. Je größer die Anzahl der Zyklen, desto mehr PCR-Produkt erhält man, allerdings

ist dabei eine mögliche Erhöhung der Fehlerrate zu beachten. Nach dem letzten Zyklus

folgt die finale Extension. Die Auswertung der PCR erfolgt über Gelelektrophorese.


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Zusammensetzung PCR Reaktionsansätze Tabelle 17: RedTaq-Ready Mix

Einzelkomponenten Menge in µl End- konzentration

RedTaq-Ready Mix (enthält Taq-Polymerase) 12 1x

Primer forward [10 µM] 1 0,4 µM

Primer reverse [10 µM] 1 0,4 µM

A. dest. 8,5

DNA template 1

Gesamtvolumen 25

Tabelle 18: 16S PCR Mix

Einzelkomponenten Menge in µl End- konzentration

Puffer (10x) 2,5 1x

dNTPs [je 10mM] 0,5 0,4 mM

Primer forward [10 µM] 0,5 0,4 µM

Primer reverse [10 µM] 0,5 0,4 µM

Taq-Polymerase (5U/ µl) 0,5

A. dest. X

DNA template 2-3

Gesamtvolumen 25

Für die DGGE wurden die Primer L1401 [5' – CGG TGT GTA CAA GAC CC- 3'] und

U986-GC [5' – (GC-Klammer)-AAC GCG AAG AAC CTT AC- 3'] nach Felske (1996)

verwendet.


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Tabelle 19: 16S PCR

PCR Schritt Temperatur Dauer


Denaturierung 94°C 1 min

Annealing 48°C 1 min 30 Zyklen




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C.5.18 Denaturierende Gradienten Gelelektrophorese (DGGE)

Die Denaturierende-Gradienten-Gel-Elektrophorese (Muyzer et al., 1993) ermöglicht es,

mikrobielle Gemeinschaften aufgrund des unterschiedlichen GC-Gehalts der 16S rRNA-

Gene verschiedener Mikroorganismen aufzutrennen. Dabei werden PCR-Produkte

gleicher Länge, jedoch unterschiedlicher Sequenz, unter denaturierenden Bedingungen

aufgetrennt. Das Grundprinzip beruht darauf, dass eine GC-reiche Sequenz allgemein

stabiler ist als eine AT-reiche Sequenz und daher nicht so schnell denaturiert. Das PCR-

Produkt denaturiert im DGGE-Gel zuerst an den Schmelzdomänen (AT-reichen

Regionen). Die denaturierte DNA läuft aufgrund der veränderten Sekundärstruktur

langsamer in Richtung des positiven Pols als nicht-denaturierte DNA, was zu einer

Auftrennung im Spannungsfeld führt. Damit das PCR-Produkt nicht vollständig

aufschmilzt und vollständig aus dem Gel wandert, wird in der PCR ein Primer mit einer

so genannten GC-Klammer, d. h. einer GC reichen Sequenz von circa 40 bp an einem

Ende angehängt. Zusätzlich zum GC-Gehalt der Sequenz ist die Position der Basen

innerhalb des Fragmentes entscheidend, sodass sich auch bei gleichem GC-Gehalt

Stabilitätsunterschiede ergeben können. Ein großer Vorteil der DGGE-Methode ist, dass

die Banden nach der Elektrophorese aus dem Gel eluiert und sequenziert werden

können.

C.5.18.1 Präparation der Polyacrylamidgele mit Gradienten und Ablauf der DGGE

Zunächst wurde auf die hintere Glasscheibe eine passende Polyester-Folie mit

Acrylatschicht luftblasenfrei mit A. dest. fixiert. Das Polyacrylamidgel wurde mit einem

Gradienten von 30-70% hergestellt. Dazu wurden die Lösungen mit einem

Gradientenmischer und daran angeschlossener peristaltischer Pumpe zwischen die

beiden Glasscheiben gegossen, wo das Gel kovalent an die Acrylatschicht der Folie

binden kann. Nach dem Auspolymerisieren wurden die mit Ladepuffer beschwerten

PCR-Proben und der Marker auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei

60°C und 50 V über einen Zeitraum von 16- 17 h durchgeführt. Nach der Elektrophorese

wurde das DGGE-Gel aus der Kammer genommen und mit Silbernitrat gefärbt. Für die

DGGE wurde das DCode-System der Firma BIORAD verwendet.


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Reagenzien zur Herstellung des Polyacrylamidgels (6% PAA-Anteil) Tabelle 20: Stammlösungen PAA

Substanz 100% Lsg. 0% Lsg.

TAE-Puffer (50x) 2 ml 2 ml

Acrylamid (40%) 15 ml 15 ml

Harnstoff 42 g

Formamid 40 ml

A. dest. add 100 ml add 100 ml

Die Substanzen für beide PAA-Lösungen wurden in einen, 200 ml Kolben eingewogen

und zum Entgasen für ca. 15 min ins Ultraschallbad gestellt. Zur Herstellung des

Gradienten (70 %) wurden 10,5 ml (100% PAA-Lsg.) und 4,5 ml (0% PAA-Lsg.)

gemischt. Für die Herstellung von 30% wird die umgekehrte Menge genommen. Jeder

Gradient à 15 ml wird in einem Falconröhrchen gemischt und zur Polymerisation mit je

140 µl Ammoniumpersulfat (APS) und 15 µl TEMED versehen. Das Gel wird sofort

gegossen und für 45 – 60 min auspolymerisieren lassen.

Tabelle 21: TAE Puffer 50x

Substanz Menge [g/ l]

Tris [2 M] 242

EDTA [0,05 M] 18,61

Essigsäure [1 M] 60,05

auf pH 8,5 eingestellt


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C.5.19 Silberfärbung (nach Radojkovica & Kusic, 2000)

Nach der Elektrophorese wird das auf der Folie fixierte Polyacrylamidgel in eine Schale

gelegt und gefärbt. Die Silberfärbung ähnelt in den einzelnen Schritten dem Verfahren

der Entwicklung aus der Fotografie. Zunächst wird die DNA im Gel fixiert. Danach wird

das Gel in einer Silbernitratlösung inkubiert. Die Silberionen lagern sich dabei an die

DNA an, überschüssige Ionen werden beim Waschen des Gels entfernt. Anschließend

erfolgt die Entwicklung durch Zugabe von alkalischer Formaldehydlösung. Die Silber-

Ionen werden nun zu elementarem Silber reduziert und somit die DNA-Banden schwarz

gefärbt.

Die Silberfärbung fand im Dunkeln, bei Raumtemperatur auf einem Schüttler statt.

Zuerst wurde die DNA durch Waschen des Gels mit Lösung A dreimal für je drei Minuten

fixiert. Anschließend erfolgte die Färbung mit Silbernitratlösung (Lösung B) für 10-15

min, danach wurde das Gel mit A. dest. gewaschen um überschüssiges Silber zu

entfernen. Zur Entwicklung wurde das Gel bis zur gewünschten Intensität der Banden

mit Lösung C inkubiert. Zum Schluss wurde die Silberfärbung durch Inkubation mit

Lösung D für fünfzehn Minuten gestoppt. Anschließend wurde das Polyacrylamidgel

vorsichtig abgetrocknet. Es wurde dann in eine Plastikhülle verpackt und im Dunkeln bei

Raumtemperatur aufbewahrt. Tabelle 22: Lösungen für die Silberfärbung

Lösung Funktion Zusammensetzung

A Fixierung 10% Ethanol, 0,5% Essigsäure

B Färbung 0,1% Silbernitrat (AgNO3)

C Entwicklung 1,5% NaOH, 0,01% Natriumborhydrid (NaBH4), 0,15% Formaldehyd (Zugabe direkt vor Gebrauch)

D Stoppen 0,75% Natriumcarbonat (Na2CO3)


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C.5.19.1 Auswertung der Gele

Die Auswertung der DGGE-Gele erfolgte mit der GelCompar II-Software (Applied

Maths). Durch die Verwendung des DICE Koeffizienten (Dice, 1945; Nei & Li, 1979) und

der „unweighted pair-group method using arithmetic averages“ (UPGMA) wurde die

Ähnlichkeit der Bandenmuster in den einzelnen Versuchsansätzen bestimmt, was eine

vergleichende Aussage über die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft möglich

machte. Die Diversität in der bakteriellen Gemeinschaft der einzelnen Versuchsansätze

wurde durch den Shannon-Wiener Index H’ bestimmt. Dieser Index betrachtet die

Anzahl der Individuen (species richness), die verschiedenen Arten zugeordnet werden,

und ihre relative Abundanz innerhalb dieser Arten (Eveness).

H' = - Σ (n i /N) log (n i/ N)

= - Σ p i (log p i)

Eveness = H' / log s

Dabei ist n: Anzahl der Individuen dieser Art, N: Summe der Individuen und s: Anzahl

der Arten.

Da die Intensität der einzelnen Banden, die auf dem DGGE-Gel aufgetrennt wurden, mit

der Anzahl der Individuen korreliert, wurde innerhalb dieser Arbeit die Intensität jeder

DGGE-Bande einer Probe als n betrachtet. N wurde als die Summe der Intensität jeder

einzelnen Bande innerhalb dieser Probe angenommen. Der Faktor s steht für die Anzahl

der einzelnen Banden innerhalb der jeweiligen Probe.


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C.5.19.2 Elution der DNA-Fragmente aus dem PAA-Gel

Das PAA-Gel wurde auf einen Leuchttisch gelegt und die ausgewählten Banden mit

einem Skalpell ausgeschnitten, in ein Eppendorfgefäß gegeben und mit 50 µl DNA-

Elutionspuffer versetzt. Die Gelstücke wurden für 3h bei 37°C auf einem Schüttler

inkubiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand in einem neuen Eppendorfgefäß zur

Fällung der DNA mit 2 Vol. Ethanol gemischt und über Nacht bei -20°C inkubiert. Nach

erneuter Zentrifugation für 15 Minuten bei 4°C wurde das DNA-Pellet getrocknet und

danach in 15 µl A. dest. gelöst. Die DNA konnte sofort in die PCR eingesetzt werden.

Tabelle 23: DNA-Elutionspuffer

Substanz Menge

Ammoniumacetat 0,5 mM

Magnesiumacetat 10 mM

EDTA 1 mM

SDS 0,1%

pH 8,0

C.5.20 TOPO-TA-Klonierung®

Mit Hilfe des TOPO-TA® Cloning Kits (Invitrogen) werden PCR-Produkte kloniert. Das

Prinzip dieser Methode beruht auf der Tatsache, dass die Taq-Polymerase eine

terminale Adenosin-Transferase-Aktivität besitzt. Das Enzym produziert 3’-

Desoxyadenosin-Überhänge an den PCR-Produkten, die komplementär zu den 3’-

Desoxythymidin-Überhängen an einem liniearisierten Vektor sind. Die Ligation der

komplementären Enden erfolgte über eine an beiden Enden des Vektors kovalent

gebundene Topoisomerase. Zur Vermehrung des Plasmids wurde dieses in E. coli

transformiert. Die Kolonien mit integriertem PCR-Produkt wurden anschließend weiter

verwendet. Die Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben.


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C.5.21 Sequenzierung

Für die Sequenzierung wurden PCR-Produkte oder Plasmide nach Herstellerangaben

der jeweiligen Firma (z.B. MWG; 4base-lab) verdünnt, mit den gewünschten Primern

versehen und zur Sequenzierung verschickt. Die erhaltenen Sequenzen wurden

anschließend mit der Software Chromas und BLAST ausgewertet.

C.5.22 Terminaler Restriktions-Fragment Längen Polymorphismus (tRFLP)

Eine weitere Methode mikrobielle Gemeinschaften zu untersuchen ist die tRFLP-

Analyse, die in einigen Versuchsansätzen zusätzlich angewendet wurde. Dabei werden,

im Gegensatz zur DGGE-Analyse, PCR-Produkte unterschiedlicher Länge, jedoch

gleicher Sequenz analysiert. In der PCR wird dazu einer der beiden Primer mit einer

Fluoreszenzmarkierung (FAM) am 5´-Ende versehen. Die PCR-Produkte werden

anschließend durch Behandlung mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen

„fragmentiert“. Das Ausmaß dieser Fragmentierung ist von der Anzahl der vorhandenen

Erkennungsstellen für das entsprechende Enzym in der jeweiligen Sequenz abhängig.

Es entstehen also fluoreszenzmarkierte DNA-Fragmente verschiedener Länge. Diese

werden dann in einem Polyacrylamidgel nach ihrer jeweiligen Länge aufgetrennt und mit

einem Lasersystem detektiert. Aus der Häufigkeit von Fragmenten einer bestimmten

Länge wird dann ein Peak-Muster generiert werden. Dabei entspricht ein Peak im

Idealfall genau einer Bakterienart. Diese Methode ist einerseits durch die

lasersystemgestütze Auswertung sensitiver als die DGGE-Methode und besitzt eine

höhere Reproduzierbarkeit, andererseits kann keine Sequenzierung der vorhandenen

Banden im Polyacrylamidgel und somit keine direkte Identifizierung der Bakterienarten

stattfinden.

Für die tRFLP-Analyse wurde der FAM-gelabelte Primer Bac27for [5' –FAM- GAG TTT

GAT MTG GCT CAG- 3'] und der ungelabelte Bac1378rev [5' – CGG TGTG TAC AGC

CCG GGA ACG- 3'] verwendet.


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Tabelle 24: 16S PCR Programm für die tRFLP

PCR Programm Temperatur Dauer


Denaturierung 94°C 45 s

Annealing 48°C 1 min 30 Zyklen



Die PCR-Produkte wurden mit dem Invisorb PCRapid-Kit (Invitek) nach Angaben des

Herstellers aufgereinigt und zur tRFLP-Analyse in das Fraunhofer-Institut für

Angewandte Mikrobiologie in Schmallenberg geschickt. Die Auswertung der ermittelten

Rohdaten wurde ebenfalls mit Hilfe der Software GelCompar-II von Applied Maths

durchgeführt.


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C.6 Analytische Methoden

C.6.1 Quantitative IAA-Messung (nach Glickmann & Dessaux, 1995)

Der Salkowski- Test dient dem quantitativen kolorimetrischen Nachweis von Indol-3-

Essigsäure (IAA) und basiert auf der Oxidationsreaktion von IAA durch eine organische

Säure. In dieser Arbeit wurde der Test dazu benutzt, die von den Bakterien synthetisierte

IAA-Menge zu messen. Die IAA wurde von den Bakterien ins Kulturmedium abgegeben.

Wenn nach Zentrifugation der Bakterienkultur das Salkowski- Reagenz zum Überstand

zugegeben wird, bilden die Eisenionen aus dem Reagenz mit der IAA im Medium pink

gefärbte Komplexe. Je mehr IAA im Medium vorhanden ist, desto kräftiger wird die

Färbung. Der Test wurde nach dem Protokoll von Glickmann und Dessaux (1995)

durchgeführt.

Nach Zentrifugation einer Flüssigkultur wurde der Überstand in ein Eppendorfgefäß

überführt und zwei Volumen Salkowski- Reagenz hinzugegeben. Gleichzeitig wurde eine

Verdünnungsreihe mit verschiedenen IAA-Konzentrationen erstellt und ebenfalls mit

Salkowski- Reagenz versehen. Alle Ansätze wurden bei Raumtemperatur für 30 min im

Dunkeln inkubiert. Danach konnte die Färbung bei einer OD von 540 nm gemessen

werde. Die Konzentration wurde anhand einer Eichgerade, die aus der

Verdünnungsreihe erstellt wurde, ermittelt.

Zusammensetzung des Salkowski- Reagenz 10,8 M H2SO4, 4,5 g/ l FeCl3


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C.6.2 Gaschromatographie und Massenspektroskopie (GC-MS)

Die IAA-Konzentration in der Rhizosphäre wird durch GC-MS gemessen. Das Prinzip

der GC-MS beruht darauf, dass in der GC das Substanzgemisch aus der Rhizosphäre

mit Hilfe eines inerten Gases (z.B. Helium) als mobile Phase an einer stationären Phase

(Kapillarsäule mit Kieselgel) aufgetrennt wird. Dort verteilen sich die Substanzen

abhängig von ihren chemischen Eigenschaften in der stationären Phase und verlassen

die Säule nach für sie charakteristischen Retentionszeiten. Die Substanzen wurden im

Anschluss an die GC-Analyse massenspektroskopisch analysiert. Aus dem Ergebnis der

GC-MS-Analyse kann IAA sowohl quantitativ als auch qualitativ nachgewiesen werden.

Vorbereitung der Proben für die GC-MS-Analyse Zur Vorbereitung der GC-MS Analyse wurden die Proben durch Derivatisierung in leicht

verdampfbare und thermisch stabile Verbindungen überführt. Dazu wurde die Silylierung

benutzt. Sie diente der Umsetzung von Hydroxyl- und Carboxyl-Gruppen und erhöht die

Flüchtigkeit der Substanz. Pyridin wirkte dabei als Katalysator für die Umsetzung, bei der

sich die molekulare Masse von Indolessigsäure von 175 M auf 319 M erhöhte. In der

spektrometrischen Analyse fand eine Fragmentierung des Moleküls von 319 M zu, 202

M statt. Die Fragmente wurden anschließend ionisiert und die Detektion der

charakteristischen Fragmentionen (m/z 319, 202) der Indolessigsäure erfolgte im Single

Ion Monitoring (SIM) Modus.

Die Rhizosphärenproben wurden in Methanol aufgenommen und für eine Stunde auf

einem Schüttler inkubiert. Danach wurde die Erde abzentrifugiert und der Überstand je in

ein neues Gefäß überführt und getrocknet (ein bis drei Tage). Anschließend wurde das

Gefäß mit Ethylacetat ausgespült und die Flüssigkeit in ein GC-Fläschchen überführt.

Das Ethylacetat wurde ebenfalls getrocknet. Die Silylierung fand durch Zugabe von 30 µl

Pyridin (37°C, 1h) danach 35 µl MSTFA (70°C, 3h) statt. Nach der Silylierung konnte die

Probe zur Analyse in die GC-MS injiziert werden.


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Tabelle 25: Verwendete Parameter für die GC-MS Analyse

Geräte und Bedingungen Hersteller und weitere Angaben

Gaschromatograph Hewlett-Packard HP 5890 Series III

Mass-Selective Detector Hewlett-Packard HP 5971A

Programm Metprof C (SIM-Mode; Ionen:, 202.00 und 319.00)

Säule

Hewlett-Packard HP-5, 5% Diphenyl-/ 95% Dimethylpolysiloxan 0.25mm (Ø) x 30m (Länge), 0.25µm Schichtdicke entsprechende Vorsäule (retention gap), 5m

Trägergas Helium (0,7 ml/min)

Injektor 250°C (Injection: splitless)

Gradient (Laufzeit: 38,86 min)

Anfangstemperatur: 70°C (5 min) Temperaturanstieg erfolgt mit 7°C/min Endtemperatur: 300°C (1 min) Ende des Laufs und Abkühlen auf 50°C


- 71 -

C.7 Statistik

C.7.1 Multidimensionale Skalierung (MDS)

Die Multidimensionale Skalierung (MDS) ist ein exploratives Verfahren, durch das

Ähnlichkeiten oder Unterschiede von Datenpunkten als Distanz im zwei- oder

dreidimensionalen Raum dargestellt werden können. Dabei entspricht die Distanz

zwischen zwei Objekten im Plot der Unähnlichkeit. Die Berechnungen der MDS und

Clusteranalyse basieren direkt auf (Un-) Ähnlichkeitswerten. Im Gegensatz zur

Faktorenanalyse können bei der MDS auch Daten eingesetzt werden, die an wenigen

Versuchspersonen und unter wenigen Grundannahmen erhoben werden.

Ausgehend von einer Proximitätsmatrix kann eine zweidimensionale „Karte“ konstruiert

werden, in der die Proben entsprechend ihrer Ähnlichkeit zueinander angeordnet sind

(Fromin, 2002; Carson, 2007). Die räumliche Distanz zwischen den Proben (dargestellt

als Einträge auf der Karte) entspricht dabei den Ähnlichkeiten nach Bray-Curtis. Dabei

berücksichtigt sie die Relation jedes Gegenstands zu jedem anderen gleich stark. Ein

Vorteil des MDS-Verfahrens liegt darin, dass keine Voraussetzungen für die Daten

bezüglich ihrer Linearität oder Verteilung bestehen müssen (Schmiing, 2005).

Anschließend projiziert die MDS die räumliche Anordnung der Objekte in zwei

Dimensionen und liefert so eine graphische Darstellung der Gesamtähnlichkeiten der

untersuchten Objekte in Form eines Streudiagramms. Je nach der Struktur der Daten ist

die Dimensionsreduktion (von den vielen Dimensionen des multidimensionalen Raums

zu den nur zwei Dimensionen der flächigen Darstellung) mit einem Anpassungsverlust

verbunden, d.h. die Ähnlichkeitswerte-Relationen lassen sich im zweidimensionalen

Raum normalerweise nicht vollständig maßstabsgerecht abbilden. Über die Güte der

Anpassung informieren die beiden Kenngrößen der MDS, Stress und RSQ.

Der Stress stellt ein deskriptives Maß für die Anpassungsgüte der Skalierung dar. Er

kann zwischen 0 bei einer fehlerfreien Umsetzung und 1 bei einer unmöglichen

Umsetzung betragen. Stress-Werte < 0,2 lassen immer noch eine brauchbare

Interpretation zu, während Werte > 0,3 auf eine zufällige Anordnung der Proben in der

Ordination hindeuten (siehe Beispiele zur Datenanalyse, 2001). Weiterhin gibt der Stress

Wert im 3D Raum Aufschluss darüber, ob die Proben zufällig angeordnet sind. Liegt er

unter 0,3 sind die Proben nicht zufällig angeordnet. Der RSQ-Wert (quadrierte

Korrelation zwischen den optimal transformierten Daten und den Distanzen) ist ein Maß

zur Beurteilung der Beibehaltung der proportionalen Differenzen zwischen den Objekten.


- 72 -

Auch er liegt zwischen 0 und 1, wobei 1 eine vollständige Erhaltung der Proportionen bei

der graphischen Umsetzung bedeutet. Je kleiner der RSQ-Wert wird, desto stärker ist

die Darstellung verzerrt. Generell gilt: Je kleiner der Stress und je größer der RSQ-Wert,

desto vollständiger und verzerrungsfreier gibt die zweidimensionale Darstellung die

Datenstruktur wider.

Die Proximitätsmatrizen zur MDS wurden mit dem der Ähnlichkeitskoeffizient nach Bray

und Curtis (1957) berechnet. Gegenüber anderen Ähnlichkeitskoeffizienten hat der Bray-

Curtis-Koeffizient den Vorteil, dass die gemeinsame Abwesenheit einer Art auf zwei oder

mehr Platten nicht als Ähnlichkeit gewertet wird (Field & McFarlane, 1968). Allerdings

gewichtet der Koeffizient individuenreiche Arten mehr als seltene (Field et al., 1982). Um

diesen Effekt zu reduzieren wurde die Bray-Curtis Proximitätsmatrix aus den

quadratwurzeltransformierten Werten berechnet.

Zur Durchführung der MDS wurde die XLStat, 2007.7 Software benutzt.

C.7.2 Bivariate Korrelationen – Mantel Test

Der einfache Mantel-Test (Mantel, 1967) besteht darin, den Grad und die Signifikanz der

linearen Korrelation zwischen zwei Proximitätsmatrizen zu testen. Der Korrelationswert

Rm, oder Mantel-r, ist als Verhältnis aus dem Kreuzprodukt der Matrizen und der

Quadratwurzel aus dem Produkt der Summenquadrate der Matrizen definiert.

Korrelationen decken lineare Zusammenhänge zwischen Variablen auf und beschreiben

das Ausmaß des Bezugs quantitativ. Die Daten, mit denen Korrelationen gerechnet

wurden, waren metrisch (z.B. IAA-Konzentration, Shannon-Index) skaliert. Im Folgenden

werden nur diejenigen Zusammenhänge vorgestellt, die einen statistisch abgesicherten

Zusammenhang aufweisen. Als Signifikanzgrenze wurde das 5%-Niveau gewählt.

Korrelation Signifikanz

p < 1% hochsignifikant

p < 0,1% höchstsignifikant

p 5%- 10% Tendenz in Richtung Signifikanz

Um die Korrelation der verschiedenen Matrizen zu berechnen müssen sie erst

linearisiert und anschließend randomisiert werden. Die Anzahl der

Randomisierungsdurchgänge ist frei wählbar. Laut Wasilewski (2003) sind für eine


- 73 -

zuverlässige Signifikanzprüfung auf dem 5%-Niveau 1000 oder mehr

Randomisierungsdurchläufe erforderlich, für eine Prüfung auf dem 0,1%-Niveau 5000

Durchgänge. Alle Mantel-Tests der vorliegenden Arbeit wurden zweiseitig und mit 10000

Randomisierungen gerechnet und erlauben daher Signifikanzbewertungen auf dem

höchsten Niveau. Durchgeführt wurde, für alle Matrizen zur Berechnung des Mantel-

Test, die Pearson-Korrelation.

p = Irrtumswahrscheinlichkeit

r = Korrelationskoeffizient

r2 = prozentuale Varianzaufklärung = Bestimmtheitsmaß

Zur Durchführung der Manteltests wurde die XLStat, 2007.7 Software benutzt.

C.7.3 Varianzanalyse

Über die Varianzanalyse (ANOVA, Analysis of Variance) wird der Einfluss eines oder

mehrerer unabhängiger Merkmale (deren Ausprägung) auf ein bzw. mehrere abhängiger

Merkmale geprüft. Es wird von einem Zusammenhang zwischen den Merkmalen

ausgegangen.

Die zweifaktorielle Varianzanalyse untersucht den Einfluss von zwei unabhängigen

Merkmalen auf ein abhängiges Merkmal z.B. Inokulation und Inkubationsdauer auf die

Shannon-Diversität der bakteriellen Gemeinschaft in der Rhizosphäre.

Eine der Hauptanwendungen der ANOVA sind die multiplen Vergleichstests, deren Ziel

es ist herauszufinden, ob die verschiedenen Parameter signifikant verschieden sind oder

nicht. Zum Beispiel im Fall von vier Behandlungen Rhizosphäre, möchten man nicht nur

wissen ob die Behandlungen einen signifikanten Effekt haben, sondern auch, ob die

verschiedenen Behandlungen einen unterschiedlichen Effekt haben. Als multipler

Vergleichstest wurde der Holm Sidak Test benutzt. Er kann die Daten untereinander

sowohl paarweise, als auch gegen eine ausgewählte Kontrollgruppe vergleichen. Die

Analyse erfolgte mit der SigmaStat 3.0 Software, das Signifikanzniveau betrug 0,5%.


- 74 -

C.8 Software

Tabelle 26: Computersoftware zur Auswertung

Programm Verwendung Hersteller/ Internet link

BLAST Internetdatenbank zum Vergleich von Nukleotid- und Proteinsequenzen mit der NCBI-nr Datenbank (Altschul et al.,1997)

www.ncbi.nlm.nih.gov

Chromas Lite 1.51 Darstellung von Chromatogrammen www.technelysium.com.au/chrom

as.html

Clone Manager 5.03

Analyse von Nukeinsäuresequenzen, Planung der Klonierungsstrategie, Identifizierung von ORFs

Scientific & Educational Software, ©, 1995-98

ClustalX Internetdatenbank zum Vergleich von Nukleotidsequenzen www.ebi.ac.uk. clustalx/

Oligonucleotide-Properties Calculator

Bestimmung von Primer-Eigenschaften www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.htm

GelCompar II Version 2.5 Auswertung von DGGE Gelen Applied Maths

Sigmastat 3.0 Statistik-Software Sigmastat

Rhizobase Genomdatenbank für Rhizobien www.kazusa.or.jp.rhizobase/

Treeview 1.6.6 Betrachtung phylogenetischer Bäume http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html

XLStat, 2007.7 (Shareware) Statistik-Software Addinsoft; www.xlstat.com

Zeiss KS 400 V 3.0

Software zur Auswertung von mikroskopischen Bildern Carl Zeiss, Deutschland

Ergebnisse und Diskussion Teil 1

- 75 -

D Ergebnisse und Diskussion

D.1 Teil 1 – Die Entwicklung eines kultivierungsunabhängigen Detektionssystems für den HGT bei Bodenbakterien

Innerhalb dieser Arbeit wurde das im Rahmen des Songlines EU-Projekts benutzte

pRD20 Plasmid hinsichtlich seiner Stabilität und der Möglichkeit einer Verbreitung durch

horizontalen Gentransfer (HGT) zwischen verschiedenen Bakterienstämmen vor einer

Freisetzung untersucht. Für diese Analysen wurden Derivate des pHR-Plasmids anstelle

des pRD20 benutzt, da sie im Gegensatz zu pRD20 das eGFP unter Kontrolle des lac-

Promotors tragen, das eine Detektion des HGT möglich macht. Sie basieren außerdem

auf demselben Ursprungsplasmid (pBBR1) und besitzen somit dieselben Eigenschaften.

Die in anderen Detektionsmethoden notwendige Kultivierung der Bakterien schränkt die

Detektion eines HGT sehr stark ein, da ein Transfer in nicht-kultivierbare Bakterien nicht

detektiert werden kann. Die in dieser Arbeit angewandte Methode ist unabhängig von

der Kultivierung und deswegen nicht auf den geringen Anteil der Bakterien, die

kultivierbar sind, beschränkt. Der pHR-Plasmid tragende VF39 Wildtyp-Stamm wies eine

starke Fluoreszenz des eGFP auf. Wie erwartet zeigte der gentechnisch veränderte

VF39 [genta lacI] Stamm dagegen keine Fluoreszenz, da der integrierte lac-Repressor

den lac-Promotor und das unter seiner Kontrolle stehende Plasmid-kodierte eGFP

vollständig unterdrückte (siehe Einleitung). Durch die Zugabe von IPTG konnte ebenfalls

eine starke Fluoreszenz in der VF39 [genta lacI] Mutante hervorgerufen werden und

somit die stabile Expression des eGFP überprüft werden.

D.1.1 Horizontaler Gentransfer auf Nitrocellulosefiltern

Um einen möglichen horizontalen Gentransfer zu untersuchen, wurden zuerst

Kreuzungen verschiedener Donor/ Rezipienten Kombinationen auf Nitrocellulosefiltern

durchgeführt, da angenommen werden kann, dass dort die Zelldichte und der Zell-Zell-

Kontakt der Bakterien optimal ist. Alle Derivate des pHR-Plasmids, z.B.

pHReGFPGUSplac ließen sich aus den Donorstämmen R. leguminosarum VF39 und R.

leguminosarum VF39 [genta lacI] in die ausgewählten Rezipienten konjugieren. Nach

Transfer des pHR-Plasmids aus dem VF39 [genta lacI] Donorstamm in die

Rezipientenstämme konnte die Übertragung des Plasmids sowohl durch die Fluoreszenz

der Transkonjuganden wie auch durch Selektion auf die Plasmid-kodierte

Antibiotikaresistenz nachgewiesen werden. Eine Detektion des eGFP in den


- 76 -

Transkonjuganden war wegen der starken Pigmentierung in einigen Bakterienstämmen,

wie S. paucimobilis und N. rubra, schwierig bzw. nicht möglich. Die Transkonjuganden

konnten aber durch Selektionsplatten und PCR in allen Fällen eindeutig nachgewiesen

werden (Daten nicht gezeigt). Um den Plasmidtransfer nicht ausschließlich durch KBE

sondern mikroskopisch zu detektieren, wurde in einigen Versuchen ein anderes pHR-

Derivat, das dsRed anstelle des eGFP trug, benutzt. Generell akkumuliert dsRed stärker

in den Zellen und ermöglichte somit die Detektion des pHR-Plasmids in einigen Zellen,

in denen das eGFP nicht detektiert werden konnte. Weiterhin wurde die Rhizobien-

spezifische Ribosomenbindungsstelle (TG GAG GAA GAA AAA ATG) vor dem eGFP/

dsRed Gen durch eine allgemeinere Sequenz (TA GGA GGA GGT AAT ATG)

ausgetauscht, um die Expression der Gene in den Transkonjuganden zu verbessern.

Einige Vorversuche wurden mit pHRGFPGUS durchgeführt, das die Gene eGFP und

uidA unter Kontrolle des starken konstitutiven Gentamycin-Promotors besitzt. Da die

Expression des eGFP unter diesem Promotor stärker war, konnte ein Plasmidtransfer

des pHR-Plasmids in S. paucimobilis durch Detektion der Fluoreszenz in den Kolonien

sichtbar gemacht werden, was bei einem Transfer des pHReGFPGUSplac Plasmids

aufgrund der schwächeren Promotoreigenschaften des lac-Promotors nicht möglich war.

Der Transfer des zum Vergleich ausgewählten pJP-Plasmids konnte wiederum nur

durch Zugabe eines Helferstammes, wie E. coli rp4-4 oder E. coli pRK2013 in einem so

genannten „triparental mating“ erreicht werden. Das pJP-Plasmid stammte ursprünglich

von pTR102 ab. Es wurde wegen seiner Stabilität und seinem weiten Wirtsbereich in

Gram-negativen Bakterien verwendet. Es besitzt den oriV, oriT und die par

Stabilitätsfunktionen aus RK2 (Prell, 2003). Diese sorgen für eine hohe Stabilität des

Plasmids in den Bakterien. Zusätzlich scheinen sie dafür verantwortlich zu sein, dass die

Mobilisierung des Plasmids aus dem VF39 oder VF39 [genta lacI] Stamm nicht

durchgeführt werden kann (Troxler et al., 1997). Eine Übersicht der ausgewählten

Konjugationspartner des Rhizobien-Donorstamms R. leguminosarum VF39 ist in

(Abbildung 13) zu sehen.


- 77 -

Die für die Analyse des HGT ausgewählten Bakterien waren zum großen Teil α-

Proteobakterien und γ-Proteobakterien. Es wurden auch einige Gram-positive

Bakterienstämme ausgewählt, da sie wie die Proteobakterien im Boden und der

Rhizosphäre in großer Anzahl zu finden sind. Die Wahrscheinlichkeit, dass diese

Bakterien im Freiland als Partner für mögliche Interaktionen wie den horizontalen

Gentransfer zur Verfügung stehen, ist sehr hoch, deswegen wurden sie in den

Filterkreuzungen unter optimalen Bedingungen hinsichtlich des horizontalen

Gentransfers als mögliche Rezipienten untersucht.

Abbildung 13: Phylogramm der verwendeten Bakterienstämme

Das Phylogramm der verwendeten Bakterienstämme basiert auf der Homologie der jeweiligen 16S DNA-Sequenzen; die Längenangabe 0.1 entspricht einem Sequenzunterschied von 10%; vollständige Bakteriennamen siehe Abkürzungsverzeichnis

S. paucimobilis

Sphingomonas spec.

N. rubraN. simplex

Arthrobacter spec.

C. glutamicum

B. subtilis

A. oxydans

A. chroococcusA. macrocytogenes

A. caulinodans

X. autotrophicus

R. leguminosarum VF39

S. meliloti 1021

R. tropici CIAT 899P. denitrificans

A. tumefaciens

G. oxydans

A. brasilense

α-Proteobacteria

P. stutzeri

K. planticola

P. putida

γ−Proteobacterien

P. oleovorans

„gram-Positive“


- 78 -

D.1.1.1 Transferfrequenzen für den HGT auf Nitrocellulosefiltern

In fast allen Fällen war es möglich, das pHR-Plasmid aus VF39 [genta lacI] in die

verschiedenen Rezipienten zu mobilisieren. Für einige Stämme wurden exemplarisch

Transferfrequenzen bestimmt (Tabelle 27). Für die übrigen Rezipientenstämme wurden

keine Transferfrequenzen ermittelt, es wurde lediglich mehrfach getestet, ob ein Transfer

stattfand. Die Überprüfung des HGT fand dabei durch Ausplattieren auf entsprechenden

Selektionsmedien und mikroskopische Analyse der Transkonjuganden-Kolonien auf

Expression des eGFP hin statt. Die durch KBE festgestellten Transferfrequenzen des

pHR-Plasmids aus VF39 [genta lacI] in die verschiedenen Rezipienten lagen zwischen

10 – 5 und 10 – 12 (Tabelle 26), abhängig davon, welcher Rezipient benutzt wurde.

Ansätze, in denen zusätzlich der Helferstamm E. coli rp4-4 benutzt wurde, zeigten

keinen Einfluss des Helfers auf die Transferfrequenz des Plasmids. In vielen

Kreuzungsexperimenten wurden Plasmide mit höherer Frequenz zwischen Partnern, die

näher verwandt sind, statt mit entfernter verwandten Bakterienstämmen transferiert

(Ramos-Gonzalez et al., 1991; Nancharaiah et al., 2003). In den durchgeführten

Filterkreuzungen gab es jedoch keinen Hinweis darauf, dass die Verwandtschaft

zwischen dem VF39 [genta lacI] Donorstamm und den einzelnen Rezipienten einen

Einfluss auf die Transferfrequenz hatte. In einige wenige Stämme wie z.B. A.

chroococcus, B. subtilis, C. glutamicum, N. simplex konnte das Plasmid nicht transferiert

werden.

Tabelle 27: Transfer auf Nitrocellulosefiltern

Rezipient Transferfrequenz n

Azospirillum brasilense 10 – 5 – 10 – 6 4

Klebsiella planticola 10 – 7 – 10 – 9 3

Pseudomonas aureofaciens 10 – 7 – 10 – 8 2

Pseudomonas stutzeri 10 – 5 – 10 – 7 5

P. stutzeri ( Helfer) 10 – 6 – 10 – 7 3

S. meliloti 1021 10 – 8 – 10 – 9 4

Sphingomonas paucimobilis 10 – 5 – 10 – 9 5

S. paucimobilis (Helfer) 10 – 7 – 10 – 9 2

Xanthobacter autotrophicus 10 – 8 – 10 – 12 3

n: entspricht der Anzahl der ausgewerteten Versuche;

Transferfrequenz: Wird aus dem Quotient des Transkonjuganden-/

Rezipienten Titer ermittelt; Helfer: E. coli rp4-4


- 79 -

Es sollte beachtet werden, dass einige Bodenbakterien wie Pseudomonas und Klebsiella

eine natürliche Kompetenz besitzen und somit in der Lage sind, freie DNA z.B. aus

zerstörten VF39 [genta lacI] Zellen aufzunehmen. Um auszuschließen, dass das pHR-

Plasmid durch Transformation in diese Bakterien gelangt ist, wurden Inkubationstests

nur mit dem jeweiligen Rezipientenstamm und Plasmid-DNA durchgeführt. Es konnte

jedoch in keinem Versuchsansatz ein Transformant auf den Selektionsmedien wachsen,

daher wurde diese Art der Aufnahme des pHR-Plasmids in den Kreuzungen

ausgeschlossen (Daten nicht gezeigt).

D.1.1.2 Nachweis des Plasmidtransfers mittels „colony-PCR“

In den Filterkreuzungen, die mit Nocardia rubra und R. tropici CIAT 899 als Rezipient

durchgeführt wurden, wuchsen auf den Selektionsmedien für die Transkonjuganden

viele Kolonien, die keine Fluoreszenz zeigten. Die Kolonien dieser „möglichen“ Nocardia

rubra Transkonjuganden zeigten nicht nur keine Fluoreszenz, sondern auch keine

intensive rote Koloniefärbung, wie dies bei Kolonien des Wildtyps der Fall war. Die Farbe

der Kolonien war hell-orange, statt rot. Die Transkonjuganden von R. tropici CIAT 899

waren optisch identisch mit denen des Wildtyps, allerdings fluoreszierte nur ein kleiner

Teil der Kolonien. Zur Überprüfung der N. rubra und R. tropici CIAT 899

Transkonjuganden-Kolonien auf den Erhalt des pHR-Plasmids wurden sie durch PCR

analysiert und gaben ein eindeutig positives Signal auf eGFP. Somit hat ein Transfer des

eGFP tragenden pHR-Plasmids aus VF39 [genta lacI] in N. rubra und R. tropici CIAT

899 stattgefunden (siehe Abbildung 14), obwohl keine Fluoreszenz der Kolonien

erkennbar war. Die Detektion der Grünfluoreszenz des eGFP wurde in N. rubra

vermutlich durch die sehr starke rote Pigmentierung der Kolonien verhindert. Da die

Transkonjuganden-Kolonien von R. tropici CIAT 899 nach Konjugation mit VF39

(pHReGFPplac) grüne Fluoreszenz zeigten, kann vermutet werden, dass zusätzlich zum

pHReGFPplac Plasmid bei den Konjugationen mit VF39 [genta lacI] als Donor das

Megaplasmid pRleVF39b mit integriertem lac-Repressor transferiert wurde.

Die Transferfrequenz von pRleVF39b (10-7) lag in demselben Bereich, wie die für das

pHR-Plasmid ermittelte Frequenz (Hynes et al., 1988). Um dieses Ergebnis zu

bestätigen, wurden die nicht fluoreszierenden Transkonjuganden-Kolonien von

Selektionsplatten mit Neomycin auf Selektionsplatten mit Gentamycin (GmR liegt auf

pRleVF39b) überimpft. Durch Wachstum auf diesen Selektionsmedien, Amplifikation von

eGFP und lacI (Abbildung 14 und 15) und anschließender Eckhardt-Lyse (Abbildung 16)

der Kolonien, wurde bestätigt, dass sie während des Transfers sowohl das pHR-


- 80 -

Plasmid, als auch das Megaplasmid pRleVF39b aus dem Donorstamm VF39 [genta lacI]

erhalten hatten. Deswegen konnte nur bei einem Teil der Transkonjuganden

Fluoreszenz nach Erhalt des pHR-Plasmids detektiert werden. In Abbildung14 sind die

PCR-Produkte zum Nachweis des horizontalen Gentransfers des pHR-Plasmids aus

VF39 [genta lacI] in R. tropici CIAT 899 und N. rubra aufgetragen. Für die Wildtyp

Stämme konnte in keiner PCR ein Produkt nachgewiesen werden.

1a2a3a4a+- 1234+- 56M

Abbildung 14 aufgetragene PCR-Produkte mit eGFP-Primern (Produkt ∼ 750 bp)

1a2a3a4a +- 1234+- 56M

Abbildung 15 aufgetragene PCR-Produkte mit lacI-Primern (Produkt ∼ 1100 bp)

Agarosegel 1%; Größenmarker M: 1kb Leiter;

Spur 1-5: R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden; Spur 2a-4a: N. rubra Transkonjuganden;

Spur 6: R. tropici CIAT 899 WT; Spur 1a: N. rubra WT;

+ Positivkontrolle (pHReGFPplac); - Negativkontrolle (H20)

Die Kolonien 2, 4 und 5 der R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden wuchsen auf

Selektionsmedium mit Neomycin und zeigten unter dem Mikroskop eine starke Grün-

Fluoreszenz. Die Kolonien 1 und 3 wuchsen ebenfalls auf Selektionsmedium mit

Neomycin, zeigte allerdings keine Fluoreszenz. Ein erneutes Ausstreichen auf ein

Selektionsmedium mit Gentamycin und Amplifikation von lacI (Abbildung 15) bestätigte

die Theorie, dass das Megaplasmid pRleVF39b ebenfalls transferiert wurde.

Die Kolonien 2a-4a der N. rubra Transkonjuganden zeigten alle ein eindeutiges Signal

auf eGFP. Sie wuchsen ebenfalls auf den entsprechenden Selektionsmedien. Die


- 81 -

Kolonien 3a und 4a waren zusätzlich positiv für lacI. Dass der Wildtyp N. rubra eindeutig

kein Signal mit den jeweils gewählten Primern in allen PCR-Ansätzen zeigte, gibt Anlass

zu der Vermutung, dass auch in diesem Fall das Megaplasmid aus VF39 [genta lacI] co-

transferiert wurde.

D.1.1.3 Analyse der Plasmidprofile durch Eckhardt-Lyse

Zusätzlich zur Überprüfung des pRleVF39b Megaplasmid Transfers durch PCR wurde

von den einzelnen Konjugationspartnern R. tropici CIAT 899, S. meliloti 1021 und VF39/

VF39 [genta lacI] eine Eckhardt Lyse der Plasmidprofile mit anschließender Southern

Hybridisierung durchgeführt (Abbildung 16). Die Stämme S. meliloti 1021 und R. tropici

CIAT 899 besitzen jeweils 2 Megaplasmide, die sich in ihrer Größe eindeutig von

Plasmiden aus VF39 unterscheiden lassen. In Spur 12 sind die Megaplasmide von S.

meliloti 1021, psym a (1300kb) und psym b (1600kb) dargestellt. In den

Transkonjuganden wurde nach der Filterkreuzung kein zusätzliches Megaplasmid

gefunden, obwohl sie in der Lage waren, auf Gentamycin zu wachsen. Eine Überprüfung

des S. meliloti 1021 Stamms zeigte eine hohe Frequenz spontan auftretender

Gentamycinresistenz. Der R. tropici CIAT 899 WT Stamm trägt zwei Megaplasmide

(200kb und 400kb), die in allen aufgetragenen Kolonien dieses Stammes zu sehen sind

(Spur 1-11). Durch die Eckhardt Lyse konnte wie erwartet bestätigt werden, dass die

Transkonjuganden ein zusätzliches Megaplasmid besaßen (Spur: 1- 4, 8, 9). Es

entsprach in seiner Größe (Spur 3 und 9) eindeutig pRleVF39b. In den anderen Spuren

(1, 2, 4 und 8) war das zusätzliche Megaplasmid deutlich kleiner. In Spur 13 sieht man

das charakteristische Profil der Megaplasmide von R. leguminosarum bv. viciae VF39.

Die Plasmide pRleVF39 a- f (siehe Abbildung 16, von oben nach unten gesehen) haben

die folgenden Größen:

600 kb (pRleVF39f)

495 kb (pRleVF39e)

330 kb (pRleVF39d; Symbiose-Plasmid)

308 kb (pRleVF39c)

240 kb (pRleVF39b)

130 kb (pRleVF39a)

Der gentechnisch veränderte VF39 [genta lacI] Stamm (Spur 14) hatte das kleinste

Plasmid pRleVF39a entweder verloren, oder ein Rekombinationsereignis mit einem der


- 82 -

anderen Megaplasmide führte zu einer Vergrößerung (Zhang et al., 2001). Diese

Veränderung innerhalb des Plasmidprofils hatte keinen Effekt auf die Mobilisierung der

Plasmide (eigene Versuche) oder auf die Konkurrenzfähigkeit, Nodulation oder

Stickstofffixierung. (Hynes et al., 1988)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1110 12 13 14

a

b

dc

e & f

Abbildung 16: Eckhardt-Lyse der R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden

Spur 1-4: R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden; 5 und 11: R. tropici CIAT 899 WT; 6-10 und 14: S. meliloti

1021 WT; 13: VF39 WT, 12: VF39 [genta lacI], a-f: Megaplasmide in VF39

Um eindeutig zu bestätigen, dass die R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden das

pRleVF39b Megaplasmid mit dem integrierten lac-Repressor und der

Gentamycinresistenz trugen, obwohl es nicht in allen Transkonjuganden die gleiche

Größe auf dem Eckhardt Gel zeigte, wurde in einem weiteren Versuch nach einer

Eckhardt Lyse eine Southern Hybridisierung mit zwei spezifischen Sonden, zum einen

lacI und zum anderen Gentamycin durchgeführt (siehe Abbildung 17).


- 83 -

D.1.2 Southern Hybridisierung zum Nachweis des Transfers von pRleVF39b aus VF39 [genta lacI]

1 2 3 4 5 6 7 8 M1 2 3 4 5 6 7 8 M1 2 3 4 5 6 7 8

A B C

M

10 kb

8 kb

6 kb

Abbildung 17 A-C: Eckhardt Lyse mit anschließender Southern Hybridisierung

A: Eckhardt Gel; B: Southern Hybridisierung lacI Sonde; C: Southern Hybridisierung GmR Sonde

Nr.5-8: R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden; Nr.4: R. tropici CIAT 899 WT;

Nr.3: S. meliloti 1021 Transkonjugand;

Nr.2: VF39 [genta lacI]; Nr.1: VF39 WT; M: Größenmarker 1kb DNA-Leiter; zu sehen sind die drei größten Banden: 10kb, 8kb und 6 kb


- 84 -

In Abbildung 17 ist eine Eckhardt-Lyse (17a) mit anschließender Southern

Hybridisierung dargestellt. Erwartungsgemäß hybridisierte im VF39 WT keine Bande mit

einer der Sonden. Im VF39 [genta lacI] Stamm hybridisierte die pRleVF39b Bande

sowohl mit der lacI-, als auch der Gentamycin-Sonde. Der spontan resistente S. meliloti

1021 Transkonjugand hybridisierte mit keiner der Sonden. Der R. tropici CIAT 899 WT

Stamm (Spur 4) und der fluoreszierende Transkonjugand (Spur 6) besaßen kein

zusätzliches Megaplasmid und hybridisierten deswegen ebenfalls mit keiner Sonde. Die

nicht fluoreszierenden R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden (Spur: 5, 7 und 8) besaßen

ein zusätzliches Megaplasmid unterschiedlicher Größe. Da alle zusätzlichen

Megaplasmide in R. tropici CIAT 899 sowohl mit der lacI-Sonde, als auch der

Gentamycin-Sonde hybridisieren konnten, wurde die Vermutung, dass es sich um

pRleVF39b handelt, eindeutig bestätigt. Rekombinationsereignisse des Megaplasmids

könnten zum Verlust eines Teils des Plasmids geführt haben, was die unterschiedliche

Größe erklären würde. Ein Transfer oder Co-Transfer des Megaplasmids pRleVF39b

konnte ebenfalls in anderen Bakterienstämmen wie Xanthobacter autotrophicus,

Azomonas macrocytogenes, Azospirillum brasilense nachgewiesen werden. Die

Kolonien zeigten keine Fluoreszenz. Das Auftreten der Gentamycinresistenz nach der

Kreuzung mit VF39 [genta lacI] und ein positives PCR-Signal mit lacI Primern bestätigte

aber den Erhalt des Megaplasmids. Eine Eckhardt-Lyse dieser Stämme war aus

technischen Gründen nicht möglich. Ein Transfer des Megaplasmids nach S. meliloti

1021 konnte nicht nachgewiesen werden.

D.1.3 Horizontaler Gentransfer in sterilem und unsterilem Boden

Da die Filterkreuzungen unter optimalen Bedingungen hinsichtlich der

Nährstoffversorgung und des Zellkontakts durchgeführt wurden, bleibt zu untersuchen,

ob es im natürlichen Boden auch zu einem Plasmidtransfer kommen kann. Um die

Möglichkeit eines horizontalen Gentransfers unter Bedingungen zu analysieren, die dem

natürlichen Lebensraum der Bakterien im Boden näher kommen, wurden die

Kreuzungspartner in Mikrokosmen aus sterilisiertem und unsterilem Boden inkubiert und

auf mögliche Transferereignisse des pHR-Plasmid analysiert. Der Vorteil dieser

Mikrokosmen ist die Kontrolle über die abiotischen Faktoren wie z.B. die Temperatur und

die Feuchtigkeit des Bodens, die das System stark beeinflussen können. Im Allgemeinen

sind Experimente in solchen Mikrokosmen ein weiterer Schritt auf dem Weg zum

möglichen Freilandversuch (Hill & Top, 1998).


- 85 -

Für diese weiterführenden Versuche im Boden wurden 7 verschiedene Rezipienten

ausgewählt (siehe Tabelle 28), da sie aufgrund der gut detektierbaren Fluoreszenz nach

Erhalt des pHReGFPplac Plasmids und des eindeutig zu identifizierenden Phänotyps

der Kolonien eindeutig zu detektieren sind.

Tabelle 28: HGT in sterilem und unsterilem Boden

Stamm Transferfrequenz (steriler Boden) n Transferfrequenz

(unsteriler Boden) n

Azomonas macrocytogenes 10 – 9 – 10 – 14 5 10 – 11 – 10 – 13 3

Azospirillum brasilense 10 – 9 – 10 – 11 3 -

Klebsiella planticola 10 – 10 – 10 – 13 5 10 – 10– 10 – 11 2

Pseudomonas aureofaciens 10 – 10 – 10 – 12 2 -

Pseudomonas stutzeri n.d. 10 – 10– 10 – 13 2

R. tropici CIAT 899 10 – 11 – 10 – 13 3 -

Sinorhizobium meliloti 1021 10 – 11 – 10 – 14 5 -

Xanthobacter autotrophicus 10 – 8 – 10 – 11 4 10 – 10 2

n: Anzahl der ausgewerteten Versuche;

Transferfrequenz: Transkonjuganden/ Rezipienten Titer;

n.d.: nicht bestimmt

Die Transferfrequenzen für das pHR-Plasmid waren in sterilisiertem und unsterilem

Boden kleiner (siehe Tabelle 28) als bei den Filterkreuzungen. In der Erde war die

Dichte der Bakterien reduziert, teilweise hefteten sich die Zellen an Bodenpartikel, was

den Zellkontakt und damit auch den Transfer beeinträchtigte. Die Transferfrequenzen in

sterilisiertem Boden lagen in ihrem Bereich zum Teil höher, als die in unsterilem Boden.

Zwar war das Nährstoffangebot in sterilisiertem Boden geringer als auf den Platten für

die Filterkreuzungen, jedoch höher als in unsterilem Boden. Dies ist darauf

zurückzuführen, dass durch das Tyndallisieren des Bodens die einheimischen

Mikroorganismen abgetötet wurden und als Nährstoffquelle zur Verfügung standen.

Nachdem für die ausgewählten Bakterienstämme ein horizontaler Gentransfer durch

KBE in sterilisiertem Boden bestätigt werden konnte, wurde analysiert, in welchem

Zeitraum dieses Ereignis stattfand. Einige Versuchsansätze (mit VF39 [genta lacI] als

Donor und A. brasilense, A. macrocytogenes, S. meliloti 1021, K. planticola, und P.

aureofaciens jeweils als Rezipienten) wurden nach der Inokulation unterschiedlich lange


- 86 -

inkubiert. Schon nach 24h konnte bei einigen Ansätzen durch Ausplattierung auf

Selektionsmedien ein Transfer-Ereignis festgestellt werden. Nach 48h wurde das

Transfer-Ereignis bei allen Ansätzen eindeutig festgestellt. Die Frequenz des Transfers

veränderte sich bei längerer Inkubationsdauer kaum. Der horizontale Gentransfer

scheint also in den ersten 48h stattzufinden (Daten nicht gezeigt).

Die ermittelten Transferfrequenzen in unsterilem Boden sind ebenfalls geringer als bei

den Filterkreuzungen. Der unsterile Boden bietet nur eine sehr begrenzte Menge an

Nährstoffen, um die sowohl die einheimischen Mikroorganismen, als auch die

hinzugefügten Konjugationspartner konkurrieren müssen. Weitere Faktoren, wie der pH-

Wert, die Temperatur, der Wassergehalt des Bodens und die Konkurrenz um

Lebensraum und Nährstoffe führten zu Stressbedingungen für die Bakterien. Es darf

angenommen werden, dass dies den Eintritt in eine physiologische Ruhephase

verursachte. Das wiederum führte zu einer starken Beeinträchtigung der

Transferfrequenzen im Boden. Bei einigen Stämmen konnte durch Ausplattieren auf den

Selektivmedien keinerlei Transferereignis mehr detektiert werden.

Ein weiterer Faktor, der die Transferfrequenzen im Boden beeinträchtigte, ist die

Extraktion der Bakterien aus dem Boden, bei der es möglicherweise zu Verlusten

kommen kann. Diese beeinflussen aufgrund ihrer Größenordnung eher den Ereignis-

Titer, der relativ gering war, als den Rezipiententiter, der um ein Vielfaches größer war.

Des Weiteren ist ein horizontaler Gentransfer nach dem Ausplattieren auf den

Selektivmedien bei besseren Nährstoffbedingungen nicht ausgeschlossen (Walter et al.,

1991). In unsterilem Boden kam es in vielen Versuchen zu einer starken Abnahme des

Donor- und Rezipiententiters, der die Frequenz des HGT nachhaltig beeinträchtigt hat.

Innerhalb kurzer Zeit wurden die zusätzlich inokulierten Bakterien von den

einheimischen Bakterienpopulationen vollständig verdrängt, da diese wahrscheinlich

besser an die Lebensbedingungen im Boden angepasst waren (Wellington, 1990; van

Veen et al., 1997; Selenska-Pobell, 1994; Dröge et al., 1999; Hill & Top, 1998).

D.1.4 Zusammenfassung

Das pHR-Plasmid ist in der Lage, aus VF39 [genta lacI] in eine Auswahl von

verschiedenen Bodenbakterien über horizontalen Gentransfer weitergegeben zu

werden. Die Transferfrequenz ist dabei abhängig vom jeweiligen Rezipienten und den

Konjugationsbedingungen. So sind die Transferfrequenzen auf Nitrocellulosefiltern stets


- 87 -

höher als in sterilisiertem und unsterilem Boden. In unsterilem Boden lag die mögliche

Transferfrequenz teilweise unterhalb der Nachweisgrenze durch KBE. Da viele Bakterien

bei Inokulation in den Boden in einen dormanten oder physiologischen VBNC Status

übergehen, sind sie teilweise nicht mehr in der Lage, auf den Selektionsmedien zur

Detektion des HGT zu wachsen. Einige Bakterien verlieren aufgenommene Plasmide

während der ersten Zellteilung wieder und können durch KBE nicht detektiert werden

(Sørensen et al.;, 2005). Vor allem der Anteil der Transkonjuganden innerhalb der nicht

kultivierbaren Bodenbakterien kann mit dieser Methode nicht erfasst werden.

Die angestrebte mikroskopische Detektion von Transferereignissen setzt keine

Kultivierung voraus und ist deswegen nicht auf den kleinen Anteil an kultivierbaren

Bakterien beschränkt (Hill & Top, 1998; Sørensen, 2005; Wolska, 2003). Deswegen

vermittelt sie ein realistischeres Bild über die Möglichkeiten der Verbreitung des pHR-

Plasmids durch HGT.

Es ist allerdings nicht auszuschließen, dass Rezipienten, die ebenfalls das in pRleVF39b

integrierte Megaplasmid erhalten, keine Fluoreszenz zeigen werden und nicht zu

detektieren sind. Das stellt in dem bis jetzt entwickelten System eine nicht zu

unterschätzende Einschränkung dar. Die Gene für den lac-Repressor müssen an einer

stabileren Stelle im Genom von VF39 integriert werden können ohne essentielle Gene

des VF39 Donors zu zerstören. Ein Ansatz ist die Integration des lacI in das mcpd-Gen,

das auf dem Chromosom von VF39 liegt. Diese Verbesserung wurde in der Diplomarbeit

von Ute Neumann vorgenommen.


- 88 -

D.1.5 Fluoreszenzmikroskopische Detektion des horizontalen Gentransfers

Die mikroskopische in situ Analyse von horizontalem Gentransfer bietet viele Vorteile

gegenüber der Detektion über KBE, denn die Kultivierbarkeit der Bakterien ist keine

Vorraussetzung mehr für die Detektion des Plasmidtransfers. Dies bietet die Möglichkeit,

horizontalen Transfer auch in nicht kultivierbaren Bakterien zu untersuchen. Somit liegen

die Transferfrequenzen, die mikroskopisch ausgewertet wurden, vermutlich näher an

den natürlich vorkommenden Transferfrequenzen. Die Detektion der Ereignisse mittels

Fluoreszenzmikroskopie auf Einzelzellniveau wurde in Jülich mit Unterstützung von Dr.

Peter Klauth durchgeführt. Um auszuschließen, dass Transferereignisse durch den Co-

Transfer des Megaplasmids und die daraus resultierende Unterdrückung der

Fluoreszenz im Transkonjuganden eventuell mikroskopisch nicht sichtbar sind, wurden

die beiden Bakterienstämme Klebsiella planticola und Pseudomonas stutzeri als

Rezipienten gewählt, da bei ihnen bis jetzt kein Transfer des pRleVF39b nachgewiesen

werden konnte.

a) b)

c) d)

Abbildung 18 a-b: Mikroskopische Detektion grün-fluoreszierender Einzelzellen

nach Filterkreuzungen, c-d: Mikroskopische Detektion grün-fluoreszierender Einzelzellen nach

horizontalem Gentransfer in 1g sterilem Boden; rote Pfeile markieren die fluoreszierenden Einzelzellen


- 89 -

Wie anhand von Abbildung 18 a und b deutlich wird, ist die Detektion der eGFP

exprimierenden Transkonjuganden auf Einzelzellniveau nach dem horizontalen

Plasmidtransfer des pHReGFPplac auf Nitrozellulosefiltern sehr gut zu sehen (Abbildung

18 a, b). Die Detektion fluoreszierender Einzelzellen in der sterilisierten Erdprobe

(Abbildung 18 c, d) erwies sich als schwierig. Man konnte zwar fluoreszierende Zellen

finden, allerdings nur sehr wenige, da ein Teil der Zellen vermutlich von Erdpartikeln

verdeckt wurde. Darüber hinaus war die Hintergrundfluoreszenz des Bodens sehr

intensiv und beeinträchtigte die eindeutige Detektion der fluoreszierenden Einzelzellen

stark. Um sicher zu stellen, dass eine fluoreszierende Bakterienzelle und keine

fluoreszierenden Bodenpartikel detektiert wurden, wurde die Bodenprobe mit einem

DAPI enthaltenden Einbettmedium versehen, das die Mikroorganismen spezifisch

eingefärbt hat. Des Weiteren sollte das Einbettmedium das Ausbleichen des eGFP bei

länger andauernden Untersuchungen zur eindeutigen Identifizierung der

fluoreszierenden Einzelzellen verhindern (Bongaerts et al., 2002), da diese im Laufe der

Zeit ihre Fluoreszenz vollständig verlieren.

Trotz dieser Vorkehrungen konnten viele fluoreszierende Punkte nicht eindeutig als

Bakterienzellen identifiziert werden. Ein Nachteil der mikroskopischen Detektion ist die

Verschlechterung der eGFP Expression durch Bedingungen im Boden, wie hohen

Salzgehalt, niedrigen pH-Wert und Sauerstoffmangel (Tsien, 1998). Bakterien, deren

Stoffwechsel nur wenig aktiv oder inaktiv ist, exprimieren nur sehr geringe Mengen an

eGFP oder gar kein eGFP. Diese Zellen können mikroskopisch nicht erfasst werden.

Theoretisch können auch Transkonjuganden vorliegen, die zwar aktiv sind, das Plasmid

aber nicht replizieren oder das eGFP nicht effizient transkribieren können und deswegen

nicht fluoreszieren. (Sørensen, 2005; Wolska, 2003) Auch diese Bakterien werden nicht

detektiert. Um diese Möglichkeiten, in denen der Transfer mikroskopisch nicht detektiert

werden kann, in die Analyse der Transferfrequenz des pHR-Plasmids über HGT mit

einzubeziehen, wurden sieben Proben parallel zum Vergleich mikroskopisch und durch

Auswertung der KBE analysiert.


- 90 -

D.1.6 Vergleichende Auswertung durch Fluoreszenzmikroskopie und KBE

Um die Transferfrequenzen, die parallel durch Fluoreszenzmikroskopie und KBE ermittelt wurden, zu vergleichen, wurde die

Transferfrequenz des pHReGFPplac Plasmids aus dem Verhältnis von Transkonjuganden zur Gesamtzellzahl statt Transkonjuganden zu

Rezipienten berechnet. Da die Zellen bei der mikroskopischen Analyse mittels einer Sytox Green Färbung gezählt wurden, war es dabei

nicht möglich, Donor- und Rezipienten-Titer getrennt voneinander zu bestimmen.

Tabelle 29: Vergleich der Transferfrequenzen durch KBE versus Mikroskopischer Auswertung

Probe Zellzahl (Donor)

Zellzahl (Rezipient)

Gesamtzellzahl (KBE)/g

Trans- konjuganden (KBE)/g

Transfer- frequenz (KBE)

Gesamtzellzahl/g (Sytox Green)

Trans- konjuganden (visuelle Detektion)

Transfer-frequenz (visuelle Detektion)

1 3,66x1010 1,53x1013 1,53x1013 5,50x101 3,58x10-12 8,86x1010 2,68x105 3,03x10-6

2 5,16x1011 4,70x1011 9,86x1011 1,00x101 1,02x10-11 4,82x1010 6,93x103 1,44x10-7

3 1,73x1011 1,35x1012 1,52x1012 5,00x101 3,28x10-11 1,16x1011 9,24x103 7,97x10-8

1s 6,72x1012 5,20x1011 7,24x1012 1,70x102 2,35x10-11 1,77x109 1,74x105 2,17x10-5

2s 1,24x1010 2,20x1013 2,20x1013 4,00x104 1,82x10-9 8,01x109 1,35x103 7,63x10-8

3s 3,19Ex109 5,15x1012 5,15x1012 1,37x102 2,65x10-11 1,77x1010 1,35x103 7,62x10-8

1u 4,89Ex109 2,07x1012 2,07x1012 4,00x101 1,93x10-11 2,42x1010 0 0

Donor: VF39 [genta lacI] pHReGFPplac; Rezipient: Klebsiella planticola

Ansatz 1,2 und 3: Filterkreuzungen, parallel mit gleichem Donor-/Rezipiententiter inokuliert, 24h inkubiert;

Ansatz 1s, 2s und 3s: Kreuzungen in sterilisierter Erde, parallel mit gleichem Donor-/Rezipiententiter inokuliert, 24h inkubiert;

Ansatz 1u: Kreuzung in unsteriler Erde, 24h inkubiert


- 91 -

Wie man in Tabelle 29 erkennt, ist die mikroskopisch ermittelte Transferfrequenz des

pHReGFPplac Plasmids viel höher als bei Auswertung über KBE. Die ermittelte

Gesamtzahl der Bakterien, die durch Ausplattieren auf den verschiedenen

Selektionsmedien ermittelt wurde, ist um zwei bis drei Zehnerpotenzen höher als die

automatisch nach Sytox Green Färbung ausgezählte Zellzahl.

Es entspricht den Erwartungen, dass der mikroskopisch detektierte Ereignis-Titer höher

lag, als der durch KBE ermittelte, denn nur ein Teil der in den Boden eingebrachten

Bakterien war nach der Extraktion noch in der Lage, auf den Selektivmedien zu

wachsen. Da die nicht kultivierbaren Bakterien durch KBE nicht erfasst wurden, lagen

die Frequenzen der mikroskopischen Auswertung höher und sind als realistischer

einzuschätzen, als die Ergebnisse, die durch KBE erreicht werden konnten.

Die Feststellung, dass die Berechnung der Gesamtzellzahl durch KBE ein deutlich

höheres Ergebnis hat, als die Auswertung über die Sytox Green Färbung, ist unerwartet.

Das Ergebnis lässt sich zwar dadurch begründen, dass die Zellen im Boden Aggregate

bilden können, die unter dem Mikroskop nicht eindeutig ausgezählt werden können.

Allerdings können solche Aggregate beim Ausplattieren einen höheren Zelltiter

vortäuschen (Klauth, 2001). Da beide Auswertungen in dreifachen Parallel-Ansätzen

ausgewertet wurden, kann davon ausgegangen werden, dass eine ausreichend

statistische Absicherung der Ergebnisse vorliegt.

In unsterilen Bodenproben konnte mikroskopisch kein Transferereignis festgestellt

werden. Es kann davon ausgegangen werden, dass die Bakterien in unsterilem Boden

wegen des hohen Konkurrenzdrucks durch die einheimischen Bakterien und den

geringen Nährstoffen nur sehr schwach aktiv oder inaktiv waren. Eine Expression des

eGFP fand wahrscheinlich deswegen zu kaum, oder gar nicht statt (Sørensen, 2005).

Über KBE war die Detektion eines HGT möglich. Es ist allerdings nicht auszuschließen,

dass der Transfer nicht im Boden, sondern nach Ausplattieren auf der Selektionsplatte

stattgefunden hat.


- 92 -

D.1.7 Untersuchung des horizontalen Gentransfers in sterilen Mikrokosmen

Ein weiterer Schritt in der Untersuchung des horizontalen Gentransfers des

pHReGFPplac Plasmids ist die Analyse von HGT in der Rhizosphäre der Erbse (Pisum

sativum). Dazu wurden sterilisierte Samen in sterilen Mikrokosmen (Henschke &

Schmidt, 1989) kultiviert, die ein Volumen von circa 50g Boden besaßen. Diese

Mikrokosmen waren den realen Bedingungen im Freiland einen Schritt näher als die

Mikrokosmen mit 1g Boden ohne Bepflanzung (Hill & Top, 1998). Da die Rhizosphäre

als so genannter „hot spot“ für HGT gilt, sollte ihr Einfluss auf den Transfer des pHR-

Plasmids analysiert werden. Daher wurden die drei Bereiche Rhizoplane, Rhizosphäre

und die wurzelfreie Erde nach der Inkubation getrennt voneinander auf horizontalen

Gentransfer untersucht. Weiterhin wurde die Gesamtzahl der vitalen Donorzellen im

Vergleich zur Gesamtzahl der vitalen Donorzellen mit Plasmid durch KBE ermittelt. Die

Inokulation der Mikrokosmen fand über vier Wochen statt. In diesem Zeitraum sollten

sich die Bakterien an ihren Lebensraum angepasst haben. Des Weiteren sollte

analysiert werden, wie stabil das Plasmid bei vierwöchigem Wachstum unter den

unselektiven Bedingungen im Boden in den Donorzellen verbleibt. Die Rhizoplane der

Pflanzen wurde parallel zur Auswertung über KBE auch mikroskopisch auf

fluoreszierende Transkonjuganden untersucht.

Tabelle 30: Transfer in Mikrokosmen

Rezipient Transferfrequenz % Donor mit Plasmid

Klebsiella planticola (a) 10 – 8 – 10 – 9 7- 51%

Klebsiella planticola (b) 10 – 7 – 10 – 9 6- 56%

Klebsiella planticola (c) - 18- 92%

Pseudomonas stutzeri (a) 10 – 10 – 10 – 11 23- 30%

Pseudomonas stutzeri (b) 10 – 10 – 10 – 11 9- 18%

Pseudomonas stutzeri (c) 10 – 11 16- 47%

a: wurzelfreier Boden; b: Rhizosphäre; c: Rhizoplane

Donor: VF39 [genta lacI] pHReGFPplac

Die ausgewerteten Mikrokosmen (a-c) der jeweiligen Inokulation mit P. stutzeri und K.

planticola wurden mit dem gleichen Verhältnis von Donor zu Rezipiententiter inokuliert.

Die Auswertung der KBE erfolgte jeweils durch Ausplattieren von drei parallelen

Selektionsplatten. In den Bereichen des wurzelfreien Bodens und der Rhizosphäre


- 93 -

wurden die Bakterien während der Extraktion durch kurzes Anzentrifugieren von den

größeren Erdpartikeln abgetrennt, damit diese die mikroskopische Analyse des HGT

nicht stören konnten.

Trotzdem war es durch Fluoreszenzmikroskopie nicht möglich, Transkonjuganden zu

finden. Nur durch KBE auf den Selektivmedien konnte der Plasmidtransfer detektiert

werden. Ebenso wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop keine eGFP exprimierenden

Einzelzellen an der Rhizoplane der Erbsenpflanzen gefunden. Die ausgewerteten

Transferfrequenzen (Tabelle 30) beruhen deswegen ausschließlich auf Analyse der

KBE. Wie zu sehen ist, sind die Transferfrequenzen des pHReGFPplac Plasmids aus

VF39 [genta lacI] in Klebsiella planticola viel höher als die in Pseudomonas stutzeri. Die

in diesem Versuch ermittelten Transferfrequenzen des pHR-Plasmids nach Klebsiella

planticola sind mit den Frequenzen aus den vorherigen Versuchen vergleichbar. Sie

liegen um etwa zwei Zehnerpotenzen höher als die Transferfrequenzen in Pseudomonas

stutzeri. Insgesamt sind die Transferfrequenzen in den drei Bereichen der Mikrokosmen

mit P. stutzeri als Rezipient vergleichbar.

Die Nähe zur Wurzel zeigte keinen Einfluss auf die Transferfrequenz. Im Allgemeinen

hat die Besiedlung der Mikrokosmen ebenfalls einen Einfluss auf den Zellkontakt und

damit auf den horizontalen Gentransfer (van Veen, 1997). Deswegen wurde die

Verteilung der Bakterien auf die drei Bereiche hin untersucht. Dabei wurde festgestellt,

dass die höchsten Zelltiter für Klebsiella planticola vor allem im wurzelfreien Boden,

dagegen die des Donorstamms VF39 [genta lacI] pHReGFPplac in der Rhizosphäre zu

finden waren. Das Verhältnis von Donor zu Rezipient war in wurzelfreiem Boden und der

Rhizosphäre am größten. Dort lagen wesentlich mehr Donor- als Rezipientenzellen vor.

Da in diesen Bereichen die Transferfrequenz am größten war, ist anzunehmen, dass

sich die große Anzahl an Donorzellen positiv auf den Transfer ausgewirkt hat.

Weiterhin gab es eine klare Korrelation zwischen der Transferrate und dem Anteil an

VF39 [genta lacI] Donor, der das Plasmid besaß. Umso kleiner der Anteil an Plasmid-

tragenden Donorzellen war, umso größer war die Frequenz des HGT in diesem Bereich.

In der Kreuzung mit P. stutzeri war die größte Zellzahl des VF39 [genta lacI] Donors in

wurzelfreiem Boden und der Rhizosphäre zu finden, während der Zelltiter des

Rezipienten P. stutzeri in der Rhizoplane mit Abstand am höchsten war. Die Anzahl der

Donorzellen ist in keinem Bereich größer als die der Rezipientenzellen. Die Korrelation

zwischen dem Anteil an Plasmid-tragenden Donorzellen und der Transferfrequenz ist

nicht so eindeutig wie bei den Experimenten mit K. planticola, die Tendenz ist jedoch die

gleiche.

Der in einigen Experimenten eindeutig gezeigte positive Einfluss der Rhizosphäre auf

den horizontalen Gentransfer (van Elsass et al., 1989; Schwaner et al., 2001) konnte


- 94 -

mittels der in dieser Doktorarbeit gezeigten Ergebnisse nicht nachgewiesen werden. Da

dieser Effekt vermutlich nicht darauf beruht, dass Wurzelexsudate den Transfer

stimulieren, sondern auf die höhere Dichte der Bakterien in der Rhizosphäre

zurückzuführen ist (Kroer et al., 1998) und sich Donorstamm und der jeweilige Rezipient

in den analysierten Mikrokosmen in den drei verschiedenen Bereichen unterschiedlich

angesiedelt haben ist dieser Effekt nicht zu sehen.


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D.1.8 Konjugationsversuche auf Schrägagarplatten

Die Konjugationsversuche in Mikrokosmen haben gezeigt, dass es innerhalb von vier

Wochen Inkubation zu einer Reihe von HGT Ereignissen zwischen VF39 [genta lacI]

pHReGFPplac und P. stutzeri bzw. K. planticola gekommen ist. Die in situ Detektion der

Transkonjuganden war nicht erfolgreich, da einige Faktoren wie fluoreszierende

Erdpartikel oder mögliche Aggregatbildungen der Zellen die Besiedlung der Donor- und

Rezipienten-Stämme in unterschiedlichen Bereichen der Mikrokosmen zu Problemen

geführt haben. Deswegen sollte in einem Rhizosphärensystem ohne Boden versucht

werden, die Ereignisse in situ zu detektieren.

Dazu wurden zwei Luzernepflanzen auf einer Schrägagarplatte, bestehend aus

Pflanzennodulationsmedium ohne Kohlenstoffquelle jedoch mit zusätzlicher

Stickstoffquelle, kultiviert. Die Pflanzen wuchsen auf der Schrägagarplatte und bildeten

ihre Wurzeln auf der Oberfläche aus. Die inokulierten Bakterien konnten somit auf den

Schrägagarplatten ausschließlich in dem eng begrenzten Bereich der Rhizosphäre und

Rhizoplane, in dem durch die Exsudation der Wurzel essentielle Substanzen für die

Kohlenstoffversorgung des bakteriellen Stoffwechsels vorliegen, wachsen. Dadurch war

gewährleistet, dass die Bakteriendichte und der Zellkontakt zwischen den Bakterien in

diesem Raum am höchsten ist und somit die Wahrscheinlichkeit für Interaktionen wie

z.B. Konjugationen steigt.

Die mikroskopische Analyse der Wurzeloberfläche auf fluoreszierende Einzelzellen hin

war ohne Störung des Rhizosphärensystems durchführbar. Trotzdem war es in keinem

der Versuchsansätze möglich, ein Konjugationsereignis zu detektieren. Das könnte

einerseits daran liegen, dass die Ereignisfrequenz sehr niedrig war, andererseits hatten

Wurzel und Wurzelhaare der Luzerne ebenfalls eine recht hohe Autofluoreszenz, die die

Detektion gestört hat. Auf den zusätzlich ausplattierten Selektionsmedien zur

Untersuchung möglicher Konjugationsereignisse wurden einige wenige

Transkonjuganden ausschließlich in den Ansätzen mit R. tropici CIAT 899 als Rezipient

gefunden. Die Frequenz lag dabei sehr niedrig (<10-12). In Experimenten, in denen das

Überleben GFP-exprimierender Pseudomonas putida und Enterobacter cowanii Zellen in

der Rhizosphäre von Tomatenpflanzen untersucht wurde, verursachte die

Autofluoreszenz der Wurzeln ebenfalls erhebliche Probleme. (Unge & Janson, 2001;

Götz et al., 2006)

Es konnten mikroskopisch keine fluoreszierenden Zellen detektiert werden, obwohl die

vorliegenden fluoreszierenden Zellen bezogen auf das Gewicht der Wurzel mehr als 104

Zellen betrugen. Diese Zellzahl war weitaus größer, als die der Transkonjuganden in

dem hier durchgeführten Versuch. Trotzdem lag sie schon unterhalb der


- 96 -

Detektionsschwelle (Götz et al., 2006). Möglicherweise war die Bakteriendichte auch zu

hoch, sodass nicht genug Wurzelexsudate vorhanden waren um die Bakterien mit

ausreichenden Nährstoffen zu versorgen, was zur Folge hatte, dass sie in eine

physiologisch inaktive Phase übergetreten sind. Auch könnte R. tropici als einziger

Stamm in der Rhizosphäre bzw. Rhizoplane seiner Wirtspflanze hinsichtlich der

Nährstoffversorgung und ihrer Nutzung einen Vorteil gegenüber den anderen

Bakterienstämmen haben. Die verschiedenen Rhizobienstämme verfügen über

unterschiedliche Enzyme, die ihnen einen kompetitiven Vorteil in der Rhizosphäre ihrer

Wirtspflanze gegenüber anderen Rhizobienstämmen verschaffen. Die Wurzelexsudate

von Erbsen enthalten z.B. Homoserin, das von Rhizobium leguminosarum bv. viciae

metabolisiert werden kann, von S. meliloti jedoch nicht. Dies führt zu einer selektiven

Stimulation des Rhizobienwachstums in der Rhizosphäre ihrer kompatiblen Wirtspflanze

(Brockwell et al., 1995; Hirsch, 1996). Allgemein kann jede Pflanze so die für sie

passenden Bakterien in ihrer Rhizosphäre auswählen (Smalla et al., 2001).


- 97 -

D.1.9 Plasmidstabilität

Um einen Effekt der Bakterien, die das Indolessigsäure synthetisierende Plasmid pRD20

tragen, auf die Kultivierung und die Erträge zu untersuchen (siehe Songlines EU-

Projekt), muss gewährleistet sein, dass das Plasmid auch unter unselektiven

Bedingungen in den Bakterien erhalten bleibt. Die Versuche mit dem pHR-Plasmid, das

anstelle des pRD20 zu Testzwecken in den Mikrokosmenexperimenten im Zeitraum von

vier Wochen benutzt wurde, zeigten ein sehr heterogenes Ergebnis. Um die Stabilität

der Plasmide ausführlicher zu testen, wurden die Plasmid-tragenden VF39 [genta lacI]

Kulturen nach selektiver Anzucht über einen Zeitraum von 18 Tagen alle 48h unselektiv

in neues Medium überimpft und der Titer der VF39 [genta lacI] Zellen mit dem der VF39

[genta lacI] Zellen, die das Plasmid besitzen, verglichen. Aus den Ergebnissen ließ sich

ableiten, wie stabil das Plasmid unter unselektiven Bedingungen im VF39 [genta lacI]

Stamm verblieb, bzw. ob es bei der Zellteilung an die Tochterzellen weitergegeben

wurde.

1,00E+06

1,00E+09

2,00E+09

2 4 6 8 10 12 14 16 18

Gesamttiter VF39 VF39 (pRD20)

3x 10-9

2x 10-9

1x 10-6

1x 10-9

Zellen/ml

Tage

Plasmidstabilität von pRD20 in VF39

Abbildung 19: Plasmidstabilität pRD20 in VF39

Gesamttiter: VF39 Zellen mit und ohne pRD20 Plasmid (unselektiv ermittelt); VF39 (pRD20): Zellen, die das

pRD20 Plasmid tragen (selektiv ermittelt); Fehlerbalken: Standardabweichung von drei parallelen

Messungen

Wie aus Abbildung 19 ersichtlich ist, verliert der VF39 [genta lacI] Stamm das pRD20

Plasmid ohne Selektionsdruck sehr schnell. Nach 10 Tagen besitzen noch circa 10% der

Zellen das Plasmid. Die Plasmide pHReGFPplac und pBBRIAA hingegen sind auch


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ohne Selektionsdruck relativ stabil. Nach insgesamt 18 Tagen Wachstum in

Flüssigmedium besitzt ein Großteil (>80%) der Zellen nach wie vor das jeweilige

Plasmid. (Daten nicht gezeigt) Dieses Ergebnis ist überraschend, da alle drei

verwendeten Plasmide Derivate desselben Ursprungsplasmids (pBBR1) sind und sich

deswegen gleich verhalten sollten (siehe Plasmide in Material und Methoden). Das

pBBR1 Plasmid wurde schon vielfach benutzt und erwies sich in allen Fällen als sehr

stabil (Kovach et al., 1995; Stuurman, 2000; Ramos, 2006).

Es könnte jedoch möglich sein, dass die Belastung des Stoffwechsels der Rhizobien

durch die hohe Syntheserate von Indolessigsäure zu hoch war und das Plasmid aus

diesem Grund verloren ging. In einigen Versuchen wurde festgestellt, das die

plasmidtragende Zellen metabolisch durch die Plasmidgröße, Replikation der Plasmide

und vor allem plasmidkodierte Gene hinsichtlich ihrer Fitness und Konkurrenzfähigkeit

stark benachteiligt sind (Mølbak, 2003; Joquera et al., 2006).

Die für die IAA-Synthese essentielle Aminosäure Tryptophan musste unserem

Versuchsansatz von den Bakterien selber zu Verfügung gestellt werden und ist damit ein

limitierender Faktor für die Synthese. Es wäre interessant, diesen Test in mit Tryptophan

angereichertem Medium zu wiederholen, da in mehreren Studien die Synthese von

Indol-Derivaten durch Zugabe von Tryptophan um ein Vielfaches gesteigert werden

konnte (Müller et al., 1989; Martens & Frankenberger, 1993).

Es besteht weiterhin die Möglichkeit, dass die Stabilität des pRD20 Plasmids in der

Rhizosphäre höher ist, da die Bakterienzellen dort durch die Wurzelexsudate mit

zusätzlichem Tryptophan versorgt werden.


- 99 -

D.1.10 Zusammenfassung – Ergebnisse und Diskussion Teil 1

Die Idee HGT innerhalb eines Ökosystems durch mikroskopische Detektion in vivo

sichtbar zu machen, bietet die Chance Mikroorganismen, möglichst ungestört, in ihrer

natürlichen Umgebung zu untersuchen. Weiterhin können Transferereignisse in nicht

kultivierbare Bakterien und Bakterien in denen das Plasmid nicht stabil verbleibt nur so

erfasst werden (Dahlberg et al., 1998a). Die von Christensen (1996) entwickelte

Methode zur visuellen Detektion des HGT hat sich in Marinen Ökosystemen bewährt

(Christensen et al., 1996; Dahlberg et al., 1998; Sørensen et al., 2003).

Ein limitierender Faktor dieser Methode ist allerdings nach wie vor die Nutzung in

Bodenökosystemen. Im Gegensatz zu Marinen Ökosystemen fluoreszieren hier unter

Fluoreszenzanregung auch Bodenpartikel wie Mineralien. Die Anheftung der Bakterien

an Bodenpartikel und die Hintergrundfluoreszenz erschweren die Detektion erheblich.

Besonders da horizontaler Gentransfer mit einer relativ niedrigen Frequenz < 10- 7

Zellen/ Rezipient auftritt (Dröge et al., 1999; Schwaner et al., 2001; Walter et al., 1991).

Es kann also nur eine qualitative Aussage über den horizontalen Transfer eines

Plasmids gemacht werden, keine quantitative.

Die Detektion des Chromophor in den Transkonjugandenzellen wird durch verschiedene

Faktoren nachhaltig beeinflusst. Die Stärke der Fluoreszenz ist in verschiedenen

Bakterien unterschiedlich stark, wobei die Stärke unter anderem davon abhängt, wie

lange sich das Plasmid schon im jeweiligen Transkonjugand befindet. Metabolisch

inaktive Zellen exprimieren GFP nicht, schwach aktive Zellen nur sehr geringe Mengen.

Die Detektion dieser Zellen ist oft nicht möglich (Joquera, 2006; Musovic, 2006).

Untersuchungen in der Rhizosphäre der Gerste ergaben, dass nur circa 60% der

vorhandenen Rhizosphärenbakterien metabolisch aktiv waren. Folglich kann durch

visuelle Analyse ein großer Teil der Bakterien nicht erfasst werden.

Des Weiteren hat die Kopienzahl des Plasmids einen Einfluss auf die Stärke der

Fluoreszenz. Die Expression von GFP auf so genannten „low copy“ Plasmiden reicht

laut Joquera (2006) vermutlich für die Detektion in den Zellen nicht aus. Die Expression

einer im Chromosom integrierten Kopie des GFP kann visuell nicht detektiert werden

(Errampali, 1997; Joquera, 2006).

Abschließend kann man sagen, dass das Konzept der rein visuellen Detektion in

Ökosystemen viele Vorteile, leider aber auch einige Schwächen bietet. Eine

Verbesserung der Detektionsmethoden ist aufgrund dieser Vorteile erstrebenswert und

wird aktuell verfolgt. Zum jetzigen Zeitpunkt ist diese Methode, meiner Meinung nach,

als alleinige Auswertung des HGT in Bödenökosystemen ungeeignet.


- 100 -

D.2 Teil 2 – Einfluss der gentechnisch veränderten Rhizobienstämme auf die bakterielle Gemeinschaft im Boden

In diesem Teil der Arbeit wird der Einfluss der gentechnisch veränderten

Rhizobienstämme, die das Pflanzenhormon IAA produzieren, auf die Erbsenpflanze

(Pisum sativum) und die bakterielle Gemeinschaft in ihrer Rhizosphäre und Rhizoplane

diskutiert. Dabei standen die folgenden Fragestellungen im Vordergrund:

Gibt es einen Einfluss auf die Zusammensetzung und die Diversität der einheimischen

Bakterienpopulation in der Rhizosphäre und Rhizoplane der Pflanzen, bedingt durch die

Inokulation mit gentechnisch veränderten VF39-Stämmen?

Welche Bakterien werden beeinflusst?

Gibt es eine Veränderung des IAA-Gehalts in der Rhizosphäre von Pisum sativum

bedingt durch die Inokulation mit einem gentechnisch veränderten VF39 Stamm?

Gibt es Anzeichen für eine Veränderung des Phänotyps der Erbsenpflanzen, die sich

durch die Inokulation mit den gentechnisch veränderten VF39-Stämmen begründen

lässt?

Um die ersten beiden Fragestellungen zu beantworten, wurden die Mikrokosmen mittels

Gemeinschafts- und Diversitätsanalyse einschließlich der Identifizierung der

prominenten Bakterienpopulationen untersucht.

Die durchgeführten Analysen gliedern sich in vier verschiedene Versuchsansätze. Diese

Ansätze unterscheiden sich hinsichtlich der benutzten Pflanze und/ oder der jeweiligen

Versuchsdauer.

Versuchsansatz 1 (Versuchspflanze: Erbse, Dauer: neun Wochen)

Versuchsansatz 2 (Versuchspflanze: Erbse, Dauer: zehn Tage)

Versuchsansatz 3 (Versuchspflanze: Luzerne, Dauer: zehn Tage)

Versuchsansatz 4 (Versuchspflanze: Erbse, Dauer: zwölf Wochen)

Abschließend folgte eine statistische Auswertung der Ergebnisse aus den

unterschiedlichen Versuchsansätzen. Zur Beantwortung der dritten Frage wurden

Änderungen des IAA-Gehalts in der Rhizosphäre mittels GC-MS ermittelt.

Änderungen im Phänotyp wurden durch optische Auswertung und Messung des

Trockengewichts der zu untersuchenden Pflanzen analysiert.


- 101 -

D.2.1 In vitro IAA Synthese

Um den Einfluss der gentechnisch veränderten VF39-Stämme auf die Pflanzen zu

analysieren, wurde zunächst die Synthese des Hormons unter optimalen

Wachstumsbedingungen der Bakterien in Zellkulturüberständen gemessen. Dieser

Schritt sollte sicherstellen, dass die verschiedenen VF39-Stämme in der Lage sind,

größere Mengen an IAA zu synthetisieren und ermöglicht gleichzeitig die Menge des

produzierten Hormons abzuschätzen.

1,00E-08

1,00E-07

1,00E-06

1,00E-05

1,00E-04

1,00E-03

1,00E-02

1,00E-01

VF39 WT VF39 (pHReGFPplac) VF39 (pRD20)

VF39 (pJPpCAT) VF39 (pJProlA) VF39 (pBBRIAA)

10-1

10-2

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-3

[IAA] IAA-Konzentration (in vitro)

Abbildung 20: Wachstum der Erbse bei verschiedenen Auxinkonzentrationen

Aufgetragen ist das Wachstum (y-Achse) gegen die IAA Konzentration in M (x-Achse) grau gestreifte Zone: optimale IAA-Konzentration für das Stängelwachstum (Abbildung aus: Wareing P.F. & Phillips I.D.J)

Abbildung 21: IAA Synthese in vitro

Quantitative Messung des IAA Gehalts im Zellkulturüberstand der verschiedenen Rhizobienstämme; die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung von drei parallelen Messungen

In Abbildung, 20 und 21 ist der Effekt verschiedener IAA Konzentrationen auf das

Wachstum der einzelnen Teile der Erbsenpflanze, wie Wurzel, Stängel und

Seitenknospen, und die Menge an in vitro synthetisiertem IAA der gentechnisch

veränderten VF39-Stämme gegenübergestellt. Die optimale Konzentration für das

Wachstum der Stängel liegt bei 10-5 M, das Wachstum der Wurzeln wird durch

niedrigere Konzentrationen, die zwischen 10-11 M und 10-8 M liegen, gefördert. IAA-

Konzentrationen, die zwischen 10-8 M und 10-6 M liegen bewirken eine Hemmung des

Wurzelwachstums, fördern aber die Ausbildung von Seitenknospen. Zusammengefasst

bewirkt die nötige IAA-Konzentration zur Förderung eines Teils der Pflanze in den

meisten Fällen die Hemmung des Wachstums in einem anderen Teil der Pflanze. Um


- 102 -

einen positiven Effekt auf die Pflanze zu haben sollte die bakteriell synthetisierte IAA-

Menge entweder größer als 10-5 M oder kleiner als 10-8 M sein.

Wie man in Abbildung 21 sieht, ist der IAA Gehalt in den Kulturüberständen der

verschiedenen Rhizobienstämme, der mit Hilfe des Salkowski-Tests quantitativ bestimmt

wurde, in allen Kulturen größer als 10-5 M und somit theoretisch optimal um das

Wachstum der Erbsenpflanzen zu fördern. Die höchste IAA Konzentration wird von VF39

(pRD20) produziert, die niedrigste Konzentration vom VF39 WT Stamm. Die

zweithöchste Konzentration wird von VF39 (pJPpCAT) produziert, der die Gene zur

Produktion von IAA genau wie VF39 (pRD20) unter Kontrolle des konstitutiven CAT

Promotors hat, allerdings eine niedrigere Kopienzahl besitzt. Die beiden Stämme VF39

(pBBRIAA) und VF39 (pJProlA) besitzen die Gene zur Produktion von IAA unter

Kontrolle des schwachen induzierbaren rolA Promotors. Abschließend kann man

deutlich erkennen, dass alle Plasmid-tragenden VF39-Stämme zwischen 10-4 und 10-3 M

IAA produzieren. Diese IAA- Menge ist 10-mal höher, als die des VF39 WT Stamms.

Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit den Daten, die im Rahmen des Songlines EU-

Projekts erfasst wurden. Dort hatte der modifizierte Rhizobienstamm in vitro ebenfalls

eine 10-fach höhere Menge IAA produziert. Die Konzentration von 10-4 – 10-3 M liegt

zwar etwas höher als die optimale IAA Konzentration für das Wachstum der Stängel

(siehe Abbildung, 20), dennoch ist eine Förderung des gesamten Stängelwachstums der

Pflanze gewährleistet (Wareing & Phillips, 1978).


- 103 -

D.2.2 Versuchsansatz 1: Analyse der bakteriellen Gemeinschaft in der

Rhizosphäre und Rhizoplane der Erbse nach neunwöchiger Inkubationszeit

In diesem Versuchsansatz wurde der Einfluss des VF39 (pRD20) Stammes auf die

Bakterienpopulation in der Rhizosphäre und Rhizoplane über eine Inkubationszeit von

neun Wochen analysiert. Um auszuschließen, dass ein Effekt lediglich durch die

zusätzliche Inokulation hervorgerufen wurde, wurden Kontrollansätze ohne Inokulation,

Ansätze mit VF39 WT und Ansätze mit VF39 (pHReGFPplac) inokuliert. Das

pHReGFPplac „Leerplasmid“, das keine Gene für die zusätzliche IAA-Synthese trägt,

diente in diesem Versuchsansatz als Kontrolle dafür, dass der plasmidtragende VF39

Stamm sich nicht anders als VF39 WT verhält. Weiterhin wurden einige Ansätze nicht

zusätzlich inokuliert, aber mit IAA-Lösung (10-6 M) gegossen, um auszuschließen, dass

ein Effekt nicht durch VF39 (pRD20), sondern nur durch den unterschiedlichen IAA

Gehalt der Rhizosphäre ausgelöst wird. Alle Ansätze wurden zu vier verschiedenen

Zeitpunkten untersucht: vor der Inokulation, nach 7, 21 und 72 Tagen.

Die Untersuchung jedes Versuchsansatzes (V1-4) wurde in folgende Aspekte

untergliedert:

A.) Untersuchung der Rhizosphäre; 16S rDNA

B.) Untersuchung der Rhizosphäre;16S c-(r)DNA)

C.) Untersuchung der Rhizoplane; 16S rDNA

D.) Untersuchung der Rhizosphäre; 16S c-(r)DNA)


- 104 -

Analyse der 16S rDNA (Rhizosphäre)

vor A

nim

pfun

g

Kon

trol

le

VF39

(pH

ReG

FPpl

ac)

VF39

(pR

D20

)

VF39

WT

IAA

10-6

Kon

trol

le

VF39

(pH

ReG

FPpl

ac)

VF39

(pR

D20

)

VF39

WT

IAA

10-6

Kon

trol

le

VF39

(pH

ReG

FPpl

ac)

VF39

(pR

D20

)

VF39

WT

IAA

10-6

Mar

ker

Mar

ker

1.10.

Abbildung 22: DGGE-Gel für die16S rDNA V1

aus der Rhizosphäre nach 7 Tagen, 21 Tagen und 72 Tagen Inkubation und

daraus resultierende DICE-Analyse

Dice (Opt:1.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1

100

9590858075

1-3 DNA RZ

1-3 DNA RZ1-3 DNA RZ1-3 DNA RZ


1-3 DNA RZ1-3 DNA RZ




14

151618

1723

1012

4119

86

51vor Animpfung

VF39 WT

VF39 (pHReGFPplac)

Kontrolle

VF39 WT

VF39 WT

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

IAA

IAA

VF39 (pHReGFPplac)

VF39 (pHReGFPplac)

IAA

%

Rhizosphäre V1 16S rDNA


- 105 -

D.2.2.1 V1 A: Analyse der 16S rDNA (Rhizosphäre)

In Abbildung 22 sind die Profile der Gemeinschaftsanalyse des Versuchsansatzes 1 (V1

A) auf Basis der 16S rDNA der Rhizosphäre dargestellt. Da die Rhizosphäre reich an

Nährstoffen ist, ist sie von verschiedenen Bakterien dicht besiedelt, was deutlich an der

Vielzahl von Banden zu erkennen ist. Die Anzahl der Banden in den aufgetragenen

verschiedenen Versuchsansätzen lag zwischen 38 und 55. Weiterhin kann man sehen,

dass alle aufgetragenen Proben eine hohe Ähnlichkeit in ihrem Bandenprofil aufwiesen.

Insgesamt war die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft in den einzelnen

Versuchsansätzen zum überwiegenden Teil identisch. Dieses Ergebnis wird durch die

anschließende DICE-Analyse des Gels bestätigt. Weiterhin bedeutet es, dass die

unterschiedliche Behandlung der einzelnen Versuchsansätze z.B. durch die Inokulation

mit VF39 (pRD20) oder die Behandlung mit IAA, keinen großen Einfluss auf die

Zusammensetzung der Rhizosphärengemeinschaft hat. Die rot markierten Banden 1 und

10 fallen in den Proben dadurch auf, dass sie in den anderen Proben, desselben

Probenzeitpunkts, schwächer oder nicht vorhanden sind. Zur weiteren Untersuchung

wurden sie deshalb aus dem Gel ausgeschnitten und sequenziert.

Die DICE-Analyse des 16S rDNA DGGE-Gels zeigt erwartungsgemäß, dass die

Bakterienzusammensetzung in der Rhizosphäre bei allen Proben eine über 70%ige

Übereinstimmung zeigt. Die Probe „vor Animpfung“ fällt allerdings aus dem Cluster. Das

lässt sich dadurch erklären, dass die Rhizosphärengemeinschaft zu diesem Zeitpunkt

noch keine Zeit hatte sich zu „einzustellen“, da die Probe direkt zu Beginn des

Experiments genommen wurde. Die anderen Proben clustern in Korrelation zu ihrer

Inkubationszeit, nicht jedoch in Abhängigkeit der Behandlung. Da die 3 Parallelproben

aus einer Rhizosphäre (nur) zu 85- 95% übereinstimmen, ist die Ähnlichkeit der

verschiedenen Versuchsansätze untereinander sehr hoch. Ebenso verhält es sich mit

Versuchsansätzen, die mit IAA behandelt wurden. Da die mit VF39 (pRD20) inokulierten

Proben bis zur dritten Woche (Probennahme eins und zwei) nicht mit den

korrespondierenden Wildtyp oder den Kontrollansätzen clustern, kann auf einen leichten

Effekt dieses Stamms auf die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft in der

Rhizosphäre geschlossen werden. Dieser Effekt ist allerdings bis zur dritten

Probennahme verschwunden. Da die Ähnlichkeit der mit VF39 (pRD20) behandelten

Versuchsansätze mit den anderen Versuchsansätzen immer mehr als 80% beträgt, wird

allerdings nicht von einem deutlichen Einfluss ausgegangen.


- 106 -

Analyse der 16S c-(r)DNA (Rhizosphäre)

18.

20.

24.

25.

vor A

nim

pfun

g

Kon

trol

le

VF39

(pH

ReG

FPpl

ac)

VF39

(pR

D20

)

VF39

WT

IAA

10-6

Kon

trol

le

VF39

(pH

ReG

FPpl

ac)

VF39

(pR

D20

)

VF39

WT

IAA

10-6

Kon

trol

le

VF39

(pH

ReG

FPpl

ac)

VF39

(pR

D20

)

VF39

WT

IAA

10-6

Mar

ker

Mar

ker

Abbildung 23: DGGE-Gel für die16S c-(r)DNA V1

aus der Rhizosphäre nach 7 Tagen, 21 Tagen und 72 Tagen Inkubation und

daraus resultierender DICE-Analyse


100

95908580757065

1-3 cDNA RZ

1-3 cDNA RZ1-3 cDNA RZ1-3 cDNA RZ


1-3 cDNA RZ1-3 cDNA RZ




4

536

879

1615

171413

1011

212

Rhizosphäre V1 16S c-(r)DNA

vor Animpfung

VF39 WT

VF39 (pHReGFPplac)

Kontrolle

VF39 WT

VF39 WT

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

IAA

IAA

VF39 (pHReGFPplac)

VF39 (pHReGFPplac)

IAA

%


- 107 -

D.2.2.2 V1 B: Analyse der 16S c-(r)DNA (Rhizosphäre)

In Abbildung 23 sind die Profile der Gemeinschaftsanalyse des Versuchs I (V1 B) auf

Basis der 16S c-(r)DNA der Rhizosphäre dargestellt. Die Ähnlichkeit der Bandenprofile

ist nicht hoch verglichen mit den 16S rDNA Proben. Das lässt dich dadurch erklären,

dass in der Analyse auf Basis der extrahierten 16S rDNA kein Unterschied zwischen

aktiven und dormanten Bakterien gemacht wurde, da bei dieser Methode alle

vorhandenen Bakterien erfasst wurden. Um die Analyse eines Einflusses des

gentechnisch veränderten VF39 (pRD20) Stammes auf die Rhizosphärengemeinschaft

zu vervollständigen, wurde in der 16S c-(r)DNA Analyse untersucht, ob sich die

„Aktivität“ der bakteriellen Gemeinschaft verändert. Da die vorhandene Menge an rRNA

direkt mit der metabolischen Aktivität der Bakterien korreliert, kann so eine Aussage

über das Profil der Aktivität innerhalb der bakteriellen Gemeinschaft gemacht werden

(Sessitsch et al., 2002; Fromin et al., 2007).

Eine Reaktion der einheimischen Bakterien z.B. ein Anstieg oder das Einstellen des

Stoffwechsels, beim Übergang in eine Ruhephase, kann als Indiz für den Einfluss VF39

(pRD20) oder die Behandlung der Rhizosphärengemeinschaft mit IAA gewertet werden.

Diese Reaktionen treten schneller und oft in stärkerem Maß auf als Veränderungen auf

rDNA-Ebene. Wie zu erwarten, zeigt die Gemeinschaftsanalyse, dass die Diversität der

aktiven bakteriellen Gemeinschaft sehr hoch ist. Jede Probe besitzt zwischen 40 und 62

Banden. Es ist allerdings auch sichtbar, dass die Bandenprofile keine so hohe

Ähnlichkeit mehr besitzen, wie bei der 16S rDNA Analyse. Die PCR- Produkte der

letzten Probennahme sind, bei gleicher Menge an aufgetragener DNA-Konzentration,

viel intensiver. Dies könnte auf einen stärkeren Anteil aktiver Bakterien innerhalb der

bakteriellen Gemeinschaft hindeuten. Die Banden 18, 20, 24 und 25 sind auffällig

intensiv. Das deutet auf eine sehr hohe Aktivität dieser Bakterien in der Gemeinschaft

hin. Deshalb wurden sie zur weiteren Untersuchung sequenziert, um die Bakterien

identifizieren zu können.

Die DICE-Analyse der 16S c-(r)DNA DGGE-Profile zeigt, dass die Gemeinschaftsprofile

aktiver bakterieller Populationen in der Rhizosphäre bei allen Proben eine über 65%ige

Ähnlichkeit besitzen. Die Probe „vor Animpfung“ fällt aus dem Cluster, genau wie bei der

16S rDNA Analyse. Die anderen Proben clustern ebenfalls größtenteils in Korrelation zu

ihrer Inkubationszeit. Die Ähnlichkeit der mit VF39 (pRD20) behandelten

Versuchsansätze beträgt stets mehr als 65% im Verhältnis zu den mit VF39 WT

inokulierten Versuchsansätzen oder der Kontrolle. Sie wird im Verlauf des Experiments

sogar größer 70% - 75% - 85%. Gegen Ende des Experiments ist deutlich zu sehen,


- 108 -

dass sich die bakteriellen Aktivitätsprofile in den einzelnen Versuchsansätzen sehr

ähnlich sind. Ein Einfluss einer Inokulation mit VF39 (pRD20) ist nicht sichtbar. Ein Effekt

der Behandlung mit IAA auf die Aktivität der Bakterien deutet sich nach der ersten

Woche an und ist nach der dritten Woche deutlich sichtbar. Er schwächt sich allerdings

zum Ende des Experiments hin wieder ab und ist nach neun Wochen Inkubation nicht

mehr zu sehen. Das deutet auf eine Anpassung der Bakterien an die veränderten

Bedingungen durch den unterschiedlichen IAA-Gehalt innerhalb der Rhizosphäre hin.


- 109 -

D.2.2.3 Versuchsansatz V1 A und B: Shannon Index und Eveness

Abbildung 24: Shannon Diversitätsanalyse für Versuchsansatz V1

Die Analyse der Shannon-Diversität innerhalb der Rhizosphäre während des Versuchs

V1 basiert im Gegensatz zur DICE-Analyse nicht ausschließlich auf der Position der

Banden, sondern auch auf der Intensität der einzelnen Banden. Deswegen gibt sie nicht

nur Aufschluss über die Zusammensetzung der Bakterien innerhalb der Rhizosphäre in

Bezug auf ihre Anwesenheit oder Abwesenheit, sondern auch in Bezug auf die


- 110 -

Abundanz der anwesenden Bakterien. Die Diversität der Rhizosphäre in V1 befindet sich

bei allen Proben nach der ersten und letzten Woche ungefähr im selben Bereich. Die

Anzahl der Banden im DGGE-Gel, die die vorhandenen Bakterienarten repräsentieren,

nehmen bis zur neunten Woche zu (detaillierte Werte siehe Tabelle im Anhang).

Die Eveness Werte zeigen, dass alle vorhandenen Rhizosphärenbakterien in

vergleichbarer Anzahl vorhanden sein müssen. Der Kontrollansatz nimmt in seiner

Diversität erst ab, dann wieder zu und ist am Ende vergleichbar mit den anderen

Proben. Die Diversität im IAA behandelten Versuchsansatz nimmt während des

Versuchs stark ab. Die Anzahl der Banden und somit die der Bakterienarten liegt nach

neun Wochen unterhalb der Anzahl nach der ersten Probennahme. Die Eveness sinkt

von der dritten bis zur neunten Woche von 0,86 auf 0,49. Dieses Ergebnis zeigt, dass

die Behandlung mit IAA einen starken Einfluss auf die Diversität der

Bakteriengemeinschaft hatte. Sie weist einen Rückgang ihrer Artenzahl auf, zusätzlich

dazu ist die Verteilung der Bakterien am Schluss sehr ungleich, d.h. es gibt einige

Bakterien, die in ihrer Anzahl, als Reaktion auf das IAA, stark ab- bzw. zugenommen

haben und nun als prominente oder schwache Banden vorliegen. Dieser Einfluss ist

allerdings nicht signifikant.

Es gibt insgesamt keinen signifikanten Einfluss der Behandlung und Inkubationszeit auf

die Diversität der vorhandenen Rhizosphärenbakterien.

Die Auswertung der Diversität der aktiven Bakterienpopulation schwankt lediglich ein

wenig. Es zeigt sich kein Hinweis darauf, dass eine unterschiedliche Behandlung der

einzelnen Versuchsansätze das Aktivitätsprofil der Rhizosphärenbakterien beeinflusst.

Alle vorliegenden Bakterien sind in etwa gleichem Maß aktiv.

Abschließend kann man für die Gemeinschaft der Bakterien innerhalb der Rhizosphäre

sagen, dass es keinen signifikanten Einfluss der Inokulation mit VF39pRD20 gibt. Es ist

allerdings ein signifikanter Einfluss der IAA-Behandlung auf das Artenreichtum des

aktiven Bakterienprofils detektierbar, der sich auf die Diversität der vorhandenen

Bakterien auswirkt. Weiterhin spielt die Inkubationszeit für die Diversität (H’), die Anzahl

der Banden (s) und die Abundanz (Eveness) der aktiven Rhizosphärenbakterien eine

signifikante Rolle.

Die unterschiedliche Behandlung der einzelnen Versuchsansätze übt, mit Ausnahme der

IAA-Behandlung, keinen signifikanten Einfluss aus (siehe Statistik im Anhang).


- 111 -

Analyse der 16S rDNA (Rhizoplane)

42.

44.

45.49.

54.

vor A

nim

pfun

g

Kon

trol

le

VF39

(pH

ReG

FPpl

ac)

VF39

(pR

D20

)

VF39

WT

IAA

10-6

Kon

trol

le

VF39

(pH

ReG

FPpl

ac)

VF39

(pR

D20

)

VF39

WT

IAA

10-6

Kon

trol

le

VF39

(pH

ReG

FPpl

ac)

VF39

(pR

D20

)

VF39

WT

IAA

10-6

Mar

ker

Mar

ker

Abbildung 25: DGGE-Gel für die 16S rDNA V1

aus der Rhizoplane nach 7 Tagen, 21 Tagen und 72 Tagen Inkubation und



100

90807060504030

1-3 DNA RP

1-3 DNA RP1-3 DNA RP1-3 DNA RP


1-3 DNA RP1-3 DNA RP




2

541

181416

89

101211

63

1517

VF39 WT

VF39 (pHReGFPplac)

Kontrolle

VF39 WT

VF39 WT

VF39 (pRD20)

Kontrolle

vor Animpfung

%

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

IAA

VF39 (pHReGFPplac)

VF39 (pHReGFPplac)

IAA

IAA

Rhizoplane V1 16S rDNA


- 112 -

D.2.2.4 Versuchsansatz V1 C: Analyse der 16S rDNA (Rhizoplane)

In Abbildung 25 sind die Profile der Gemeinschaftsanalyse des Versuchs 1 (V1 C) auf

Basis der 16S rDNA der Rhizoplane dargestellt. Die Bandenprofile der Versuchsansätze

nach Inkubation von 7 und 21 Tagen sind sich sehr ähnlich. Nach Inkubation von 72

Tagen sehen die Bandenmuster der einzelnen Ansätze allerdings unterschiedlich aus.

Zur weiteren Analyse wurde die Bande 44 sequenziert, da sie in allen Ansätzen mit der

gleichen Intensität auftrat. Die Bande 49 trat nur bei den Versuchsansätzen der 3.

Probennahme nach 72 Tagen Inkubation auf. Diese Bakterienart brauchte entweder

länger um ihre Population zu vergrößern, weil sie sich in einer Ruhephase befunden hat,

oder sie war anfangs nur in einer sehr kleinen Anzahl vorhanden. Die Banden 42, 45

und 54 sind nur bei einzelnen Proben zu sehen. Das könnte ein Hinweis auf einen

Einfluss der unterschiedlichen Behandlungen der Versuchsansätze auf die Rhizoplane-

Gemeinschaft sein. So traten im Versuchsansatz VF39 (pRD20) nach 72 Tagen einige

Banden auf, die in keinem anderen Versuchsansatz zu finden waren.

Die DICE-Analyse für die rDNA Proben der Rhizoplane zeigt, dass sich die

Bakteriengemeinschaft nach der Behandlung mit IAA nach 72 Tagen Inkubation sehr

deutlich von den anderen Proben mit gleicher Inkubationszeit unterscheidet. Dies wird

auch anhand von Abbildung 25 ersichtlich. Die Probe „vor Animpfung“ fällt aus dem

Cluster, genau wie bei der Analyse der Rhizosphäre. Die Versuchsansätze VF39

(pHReGFPplac) und IAA nach 7 Tagen clustern mit den Versuchsansätzen nach 21

Tagen. Die Versuchsansätze VF39 WT und VF39 (pHReGFPplac) nach 72 Tagen

clustern ebenfalls nicht mit den korrespondierenden Versuchsansätzen nach 72 Tagen.

Schon das DGGE-Gel hat gezeigt, dass alle Versuchsansätze zu diesem Zeitpunkt sehr

unterschiedliche Bandenprofile aufwiesen. Die DICE-Analysen der einzelnen

Versuchsansätze zeigen zu allen drei Zeitpunkten nur eine Ähnlichkeit der

Bandenmuster von 70- 90%. Diese Streuung könnte sich durch die unterschiedliche

bakterielle Besiedlung der Wurzeln ergeben (Herschkovitz et al., 2005), da nicht ganz

ausgeschlossen werden kann, das teilweise unterschiedliche Abschnitte der Wurzeln für

die rDNA/ rRNA Extraktion benutzt wurden. Da sich bakterielle Gemeinschaften der

Rhizoplane als zeitlich sehr stabil erwiesen haben und auch in der Rhizoplane von Mais

nicht durch zusätzliche Inokulation mit dem IAA-synthetisierenden Stamm A. brasilense

SP245 beeinflusst wurden (Herschkovitz et al., 2005), wird ein Effekt der Behandlung mit

VF39 (pRD20) ausgeschlossen.


- 113 -

Analyse der 16S c-(r)DNA (Rhizoplane)

62.

vor A

nim

pfun

g

Kon

trol

le

VF39

(pH

ReG

FPpl

ac)

VF39

(pR

D20

)

VF39

WT

IAA

10-6

Kon

trol

le

VF39

(pH

ReG

FPpl

ac)

VF39

(pR

D20

)

VF39

WT

IAA

10-6

Kon

trol

le

VF39

(pH

ReG

FPpl

ac)

VF39

(pR

D20

)

VF39

WT

IAA

10-6

Mar

ker

Mar

ker

Abbildung 26: DGGE-Gel für die 16S c-(r)DNA V1

aus der Rhizoplane nach 7 Tagen, 21 Tagen und 72 Tagen Inkubation und


Dice (Tol 0.2%-0.2%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1

100

90807060504030

1-3 cDNA RP

1-3 cDNA RP1-3 cDNA RP1-3 cDNA RP


1-3 cDNA RP1-3 cDNA RP




14

161513

387

1011

1296

54

217

VF39 WT

VF39 (pHReGFPplac)

Kontrolle

VF39 WT

VF39 WT

VF39 (pRD20)

Kontrolle

vor Animpfung

%

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

IAA

IAA

VF39 (pHReGFPplac)

VF39 (pHReGFPplac)

IAA

Rhizoplane V1 16S c-(r)DNA


- 114 -

D.2.2.5 Versuchsansatz V1 D: Analyse der 16S c-(r)DNA (Rhizoplane)

In Abbildung 26 sind die Profile der Gemeinschaftsanalyse des Versuchs 1 (V1 D) auf

Basis der 16S c-(r)DNA der Rhizoplane dargestellt. Es fällt deutlich auf, dass nach 72

Tagen Inkubation wesentlich mehr Bakterienarten aktiv sind als vorher. Die

Bandenprofile der einzelnen Versuchsansätze nach Inkubation von 7 und 21 Tagen sind

bis auf einige Ausnahmen im Bandenmuster sehr ähnlich. Erst zwischen 21 und 72

Tagen divergieren die Bandenmuster der einzelnen Versuchsansätze. Besonders im

oberen Teil des Gels kommen viele Banden neu hinzu. Das deutet darauf hin, dass

diese Bakterien vorher entweder nicht aktiv waren, oder so wenig aktiv, dass sie nicht

detektiert werden konnten. Wenn man die Banden mit denen des 16S rDNA-Gels

vergleicht, fällt auf, dass auch nach 72 Tagen Inkubation im oberen Bereich noch neue

Banden sichtbar werden. Das gibt Anlass zur Vermutung, dass einige dieser Bakterien

inaktiv waren oder in der PCR aufgrund ihrer geringen template-Menge kaum amplifiziert

wurden (Zhang & Fang, 2000; Fromin et al., 2007). Zur weiteren Analyse wurde bisher

nur die Bande 62 erfolgreich sequenziert, weitere Banden werden vorbereitet.

Die DICE-Analyse der aktiven Bakteriengemeinschaft innerhalb der Rhizoplane zeigt,

dass der Versuchsansatz IAA nach 72 Tagen sehr wenig Ähnlichkeit mit den anderen

hat. Das kann jedoch daran liegen, dass die PCR für diese Probe nicht optimal

funktionierte und deswegen weniger rDNA auf das DGGE-Gel geladen wurde, was zu

einer schwierigen Auswertung dieser Probe führte. Die beiden Kontrollansätze sehen

sich in den ersten 21 Tagen ähnlich. Sie liegen allerdings außerhalb der anderen

Cluster. Nach 72 Tagen clustert die Kontrolle allerdings mit den anderen Proben zu

diesem Zeitpunkt. Insgesamt läst sich ablesen, dass der Einfluss durch die zusätzliche

Inokulation vorhanden ist, sich die Bakterien nach 72 Tagen aber offensichtlich daran

gewöhnt haben. Das Profil der aktiven Bakteriengemeinschaft der Rhizoplane ist in allen

Versuchsansätzen nach dieser Zeit in einem Cluster gelegen.

Es ist kein deutlicher Einfluss durch Inokulation oder die Behandlung mit IAA sichtbar.


- 115 -

D.2.2.6 Versuchsansatz V1 C und D: Shannon Index und Eveness

Abbildung 27 Shannon Diversitätsanalyse für Versuchsansatz V1

Die Diversitätsanalyse ergibt eine starke Abweichung der Probe VF39 (pHReGFPplac)

nach 72 Tagen. Das liegt allerdings an einem Fehler innerhalb des DGGE-Gels (siehe

Abbildung 25). Deswegen konnten die Werte für den Shannon Index nicht eindeutig

ermittelt werden. Ansonsten ist erkennbar, dass alle Versuchsansätze innerhalb der 72

Tage an Diversität zunehmen. Das ist allerdings eine normale zeitabhängige Reaktion,


- 116 -

die durch das Altern der Pflanzen und die dadurch veränderte Wurzelexsudation

begründet werden kann (Ikeda et al., 2005; Herschkovitz et al., 2005).

Die Eveness Werte für die 16S rDNA der Rhizoplane zeigen eine Ungleichverteilung der

Bakterien, was schon anhand des DGGE-Gels deutlich erkennbar war. Es gab

prominente und schwache Banden. Die Eveness Werte der 16S c-(r)DNA liegen alle

zwischen 0,81 und 0,90 (detaillierte Werte siehe Tabelle im Anhang).

Die statistische Auswertung zeigt allerdings keinen signifikanten Einfluss der

Behandlung und/ oder der Inkubationszeit auf die Zusammensetzung der Bakterien und

ihrer Aktivität innerhalb der Rhizoplane.

D.2.2.7 Zusammenfassung der Ergebnisse der Versuchsansätze V1 A- D

Abschließend kann man sagen, dass kein signifikanter Einfluss einer Inokulation mit

dem modifizierten Stamm VF39 (pRD20) zu sehen ist. Ein leichter Einfluss dieses

Stammes ist lediglich in der ersten Woche nach Inokulation in der DICE Analyse der 16S

rDNA zu sehen und beruht auf der zusätzlichen Einführung dieses Stamms in den

Boden (Lynch et al., 2004;). Da die Zellzahl inokulierter Bakterienstämme im nativen

Boden generell innerhalb kurzer Zeit sehr stark abnimmt (van Elsass, et al., 1997) ist

davon auszugehen, dass dieser Effekt nach der zweiten Probennahme bereits

verschwunden ist.

Die Inokulation mit VF39 WT und VF39 (pHReGFPplac) (als Leerplasmid) zeigte keine

starke Veränderung in den Versuchsansätzen. Es ist allerdings deutlich, dass die

Entwicklung der Bakterien und ihre Aktivität, sowohl in der Rhizosphäre, als auch in der

Rhizoplane, zeitabhängig waren. Das liegt vermutlich daran, dass sie auf das Wachstum

der Erbse und die zeitlich bedingten Veränderungen der Wurzelexsudate reagieren

(Herschkovitz et al., 2005; Ikeda et al., 2005; Scherwinski, 2007). Die Wurzelexsudate

sind zu allen drei Zeitpunkten der Probennahme in Korrelation zur Inkubationszeit sehr

verschieden (siehe Haselier, 2006).

Ein Effekt der Behandlung mit IAA auf die bakterielle Gemeinschaft der Rhizosphäre ist

nicht auszuschließen. Die Diversität des Versuchsansatzes nach 72 Tagen war extrem

gesunken. Die statistische Auswertung ergab sowohl einen signifikanten Effekt der

Behandlung mit IAA, als auch der Inkubationszeit auf die Diversität, Anzahl der

bakteriellen Gruppen und Abundanz innerhalb der aktiven bakteriellen Gemeinschaft der

Rhizosphäre.

Für die Rhizoplane wurde kein signifikanter Einfluss der Behandlung oder

Inkubationszeit gefunden. Da die Bakterien innerhalb der Rhizoplane in einem


- 117 -

komplexen Aggregat leben und interagieren, wird vermutet, dass sie auf externe

Faktoren weniger sensitiv reagieren als das in der Rhizosphäre der Fall ist.

Zusätzlich erfolgt die Besiedlung von Pflanzenwurzeln und einzelnen Wurzelabschnitten

durch inokulierte Bakterien keineswegs gleichmäßig (Zimmer, 2003). Da aufgrund

weiterer Analysen nicht die Rhizoplane der kompletten Wurzel zur

Nukleinsäureextraktion verwendet wurde, kann es dadurch zu vermehrten

Unterschieden zwischen den DGGE-Profilen der verschiedenen Versuchsansätze

gekommen sein.

In einer zusätzlich durchgeführten tRFLP-Analyse (siehe Anhang) zeigte sich ebenfalls

ein Effekt der IAA Behandlung auf die Zusammensetzung der Bakterien in Rhizosphäre

und Rhizoplane nach 72 Tagen. Dieses Ergebnis bestätigt die DICE-Analyse. Ein

weiterer Vergleich der Ergebnisse mit der ARISA Analyse (Haselier, 2006) zeigte, dass

auch dort nach 72 Tagen ein Effekt von IAA auf die bakterielle Gemeinschaft sichtbar

wurde.

Die molekularbiologisch ermittelten Ergebnisse stehen allerdings im Gegensatz zu den

Ergebnissen der GC-MS Messungen der IAA in der Rhizosphäre. Der IAA Gehalt war für

alle Rhizosphären-Ansätze etwa gleich. Da IAA nicht sehr stabil ist, könnte allerdings in

der Rhizosphäre oder bei der Probenaufbereitung ein Teil abgebaut worden sein.

D.2.3 Versuchsansatz V2: Analyse der bakteriellen Gemeinschaft in der

Rhizosphäre und Rhizoplane der Erbse nach zehntägiger Inkubationszeit

Da sowohl in der GC-MS Analyse, wie auch in Versuchsansatz V1 und Daten aus der

Diplomarbeit von André Haselier Hinweise darauf zu sehen waren, dass ein möglicher

Effekt der Inokulation mit dem IAA-synthetisierenden VF39 (pRD20) Stamm innerhalb

der ersten Woche der Inkubationszeit auftraten, wurde der Versuchsansatz V2 mit einem

kürzeren Zeitrahmen angelegt. Zusätzlich zu VF39 (pRD20) wurde der Stamm VF39

(pBBRIAA) für die Inokulation benutzt. Er besitzt die gleichen Gene für die IAA-Synthese

(iaaM und tms2), allerdings unter dem schwachen, induzierbaren rolA Promotor. Die

Probennahme erfolgte vor Animpfung, nach drei und zehn Tagen Inkubation.


- 118 -

Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (V2; Rhizosphäre)

VF39

(pB

BR

IAA

)

vor A

nim

pfun

g

Mar

ker

Mar

ker

vor A

nim

pfun

g

VF39

(pB

BR

IAA

)

VF39

WT

VF39

WT

VF39

(pR

D20

)

VF39

(pR

D20

)

Kon

trol

le

Kon

trol

le

VF39

(pB

BR

IAA

)

VF39

(pB

BR

IAA

)

VF39

WT

VF39

WT

VF39

(pR

D20

)

VF39

(pR

D20

)

Kon

trol

le

Kon

trol

le

Inkubation 10 Tage Inkubation 3 Tage

Abbildung 28: DGGE-Gel für die16SrDNA und c-(r)DNA V2

aus der Rhizoplane nach 3 Tagen und 10 Tagen Inkubation und daraus

resultierender DICE-Analyse;

DGGE Gel: aufgetragen sind in grau: c-(r)DNA; schwarz: rDNA Proben


100

95908580757065605550454035

2.Versuch c.

2.Versuch c.2.Versuch c.2.Versuch c.


2.Versuch c.2.Versuch c.

10

141216

8184

62

Dice (Tol 0.4%-0.4%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1

100

9590858075706560555045

2.Versuch cD.

2.Versuch cD.2.Versuch cD.2.Versuch cD.

2.Versuch cD.2.Versuch cD.2.Versuch cD.

2.Versuch cD.2.Versuch cD.

VF39 WT

VF39 (pBBRIAA)VF39 (pRD20)

KontrolleVF39 WT


Kontrolle

vor Animpfung


%

VF39 WT


Kontrolle

VF39 WT

VF39 (pBBRIAA)

VF39 (pRD20)

Kontrolle

vor Animpfung


%


- 119 -

Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (V2; Rhizoplane)

VF39

(pB

BR

IAA

)

vor A

nim

pfun

g

Mar

ker

Mar

ker

vor A

nim

pfun

g

VF39

(pB

BR

IAA

)

VF39

WT

VF39

WT

VF39

(pR

D20

)

VF39

(pR

D20

)

Kon

trol

le

Kon

trol

le

VF39

(pB

BR

IAA

)

VF39

(pB

BR

IAA

)

VF39

WT

VF39

WT

VF39

(pR

D20

)

VF39

(pR

D20

)

Kon

trol

le

Kon

trol

le

Inkubation 10 Tage Inkubation 3 Tage

Abbildung 29:DGGE-Gel für die 16SrDNA und c-(r)DNA V2

aus der Rhizoplane nach 3 Tagen und 10 Tagen Inkubation und daraus

resultierender DICE-Analyse

DGGE Gel: aufgetragen sind in grau: c-(r)DNA; schwarz: rDNA Proben

Dice (Opt:0.10%) (Tol 0.1% -0.1%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1

100

90

8070

605040

2.Versuch .

2.Versuch .2.Versuch .2.Versuch .

2.Versuch .2.Versuch .2.Versuch .

2.Versuch .2.Versuch .

9

71117

151319

53

VF39 WT

VF39 (pBBRIAA)

VF39 (pRD20)Kontrolle

VF39 WTVF39 (pBBRIAA)


vor Animpfung

%Rhizoplane V2 16S c-(r)DNA


100

90807060504030

2.Versuch c.



2.Versuch c.2.Versuch c.

6

161012

8142

418


VF39 (pRD20)

Kontrolle


VF39 (pRD20)

Kontrolle

vor Animpfung

%



- 120 -

D.2.3.1 V2 A- D: Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (Rhizosphäre und Rhizoplane)

In Abbildung 28 und Abbildung 29 sind die Profile der Gemeinschaftsanalyse des

Versuchs 2 auf Basis der 16S rDNA und c-(r)DNA der Rhizosphäre dargestellt. Die

DICE-Analyse der Rhizosphäre für den Versuchsansatz V2 zeigte für die rDNA

Auswertung einen leichten Effekt, durch die Inokulation mit VF39 (pRD20) und VF39

(pBBRIAA). Die Versuchansätze clustern, unabhängig ihrer Inkubationszeit. Dieses

Ergebnis bestätigt die Vermutung aus dem Versuchsansatz V1, in dem ausschließlich in

den ersten sieben Tagen des Versuchs V1 ein leichter Effekt der VF39 (pRD20)

Inokulation festgestellt werden konnte. Dieses Ergebnis wurde ebenfalls in der

Diplomarbeit von André Haselier durch DGGE-Analyse der pilzlichen Gemeinschaft

gezeigt.

Die Ansätze mit VF39 (pRD20) und VF39 (pBBRIAA) nach drei Tagen Inkubation bilden

ein gemeinsames Cluster, was auf einen möglichen Effekt hindeuten könnte. Dieser

Effekt war für VF39 (pRD20) nach zehn Tagen Inkubation allerdings nicht mehr sichtbar,

dann clusterte der mit VF39 (pRD20) behandelte Versuchsansatz mit der VF39 WT

Probe. Ein eindeutiger Effekt der VF39 (pBBRIAA) Inokulation auf das Profil der aktiven

Rhizosphärenbakterien ist nach zehn Tagen Inkubation feststellbar. Das Bandenmuster

der Probe hatte wenig Ähnlichkeit mit denen der anderen Versuchsansätze. Der Effekt

einer Inokulation mit VF39 (pRD20) schwächt sich also wahrscheinlich im Verlauf von

zehn Tagen ab, während der Einfluss der Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) in diesem

Zeitraum vermutlich noch zunimmt.

Die Untersuchung der Rhizoplane zeigte für die rDNA ebenfalls einen Effekt der

Inokulation mit VF39 (pRD20). Die mit VF39 (pRD20) inokulierte Probe (zehn Tage)

clustert mit der Kontrolle nach drei Tagen Inokulation und umgekehrt. Weiterhin befinden

sich beide VF39 (pRD20) inokulierten Ansätze im Cluster mit allen korrespondierenden

Ansätzen zum anderen Zeitpunkt der Probennahme. Das könnte ein Hinweis darauf

sein, dass die bakterielle Gemeinschaft dieses Ansatzes sich in den sieben Tagen

zwischen beiden Probennahme nicht weiterentwickelt und verändert hat. Da VF39

(pRD20) (zehn Tage Inkubation) mit den Proben nach drei Tagen Inkubation ein

gemeinsames Cluster bildet könnte eine Veränderung in der

Gemeinschaftszusammensetzung auch zum Stillstand gekommen sein. Diese Theorie

wird durch die Diversitätsanalyse (Abbildung 31) unterstützt.

Die Analyse der Bandenmuster für die c-(r)DNA der Rhizoplane zeigte keinen Effekt für

Inokulation mit VF39 (pRD20). Die Probe bildet stets Cluster zusammen mit dem WT

oder der Kontrolle. Ein leichter Effekt ist für VF39 (pBBRIAA) (nach drei Tagen

Inkubation) sichtbar. Diese Probe bildet ein Cluster mit der Kontrolle und VF39 (pRD20)


- 121 -

nach zehn Tagen Inkubation. Eine eindeutige Aussage über einen Effekt der Inokulation

mit den gentechnisch veränderten Stämmen kann allerdings nicht gemacht werden, da

die Auflösung der Banden im unteren Bereich des DGGE-Gels nicht sehr gut ist.

D.2.3.2 Versuchsansatz V2 A– D: Shannon Index und Eveness

Abbildung 30: Diversitätsanalyse der Rhizosphäre V2 rDNA und c-(r)DNA rot-schwarzes Dreieck: Diversität rDNA vor Animpfung rotes Dreieck: Diversität c-(r)DNA vor Animpfung rDNA: durchgezogene Linien; c-(r)DNA: gestrichelte Linien

Abbildung 31: Diversitätsanalyse der Rhizoplane V2 rDNA und c-(r)DNA rot-schwarzes Dreieck: Diversität rDNA vor Animpfung rotes Dreieck: Diversität c-(r)DNA vor Animpfung rDNA: durchgezogene Linien; c-(r)DNA: gestrichelte Linien

In Versuchsansatz V2 wird ein starker Effekt hinsichtlich der Diversität der bakteriellen

Gemeinschaft in den mit VF39 (pRD20) inokulierten Versuchsansätzen der Rhizosphäre

und Rhizoplane sichtbar. Die Diversität der rDNA Analyse dieser Ansätze nimmt

während des Versuchs kontinuierlich ab, während die der anderen Versuchsansätze


- 122 -

ansteigt. Die Diversität der c-(r)DNA nimmt hingegen zu. Das Vorhandensein eines

Einflusses von VF39 (pRD20) auf die Rhizosphärengemeinschaft wurde ebenfalls in der

vorangegangenen DICE-Analyse detektiert.

Die Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) beeinflusst die Diversität der bakteriellen

Gemeinschaft und ihre Aktivität innerhalb der Rhizosphäre, nicht jedoch innerhalb der

Rhizoplane. Die Diversität in der Zusammensetzung der aktiven Bakterien (c-(r)DNA)

nimmt während des Versuchs stark ab, während sie in den anderen Versuchsansätzen

zunimmt. Dieses Ergebnis bestätigt die DICE-Analyse, in der für diesen Versuchsansatz

ebenfalls ein Effekt sichtbar wird.

Die Diversitätsanalyse der Rhizoplane zeigt keinen signifikanten Effekt einer Behandlung

auf die Diversität. Bis auf die Kontrolle und VF39 (pRD20) zeigen alle Versuchsansätze

für die rDNA Auswertung eine Zunahme in der Diversität. Das lässt sich durch die

zeitlich bedingte Weiterentwicklung der bakteriellen Gemeinschaft innerhalb der

Rhizoplane begründen. Die Zusammensetzung der Bakterien wird scheinbar mit der Zeit

diverser und die Aktivität der einzelnen Bakterien ebenfalls. Das liegt vermutlich an der

PCR, die verschiedene rDNA-templates unterschiedlich bevorzugt amplifiziert (Zhang &

Fang, 2002).

Die Eveness der Versuchsansätze zeigt ebenfalls, dass die Verteilung der Bakterien und

die Aktivität innerhalb der Rhizoplane relativ gleichmäßig verteilt ist (Herschkovitz,

2005). Zwar tauchen im Gel prominente und schwache Banden auf, allerdings sind diese

in fast allen Proben vorhanden. Durch statistische Auswertung konnte allerdings kein

signifikanter Einfluss von Inokulation oder Inkubationsdauer auf die Diversität in

Rhizosphäre und Rhizoplane festgestellt werden.


Rhizosphäre und Rhizoplane der Luzerne nach zehntägiger Inkubationszeit

Parallel zu Versuchsansatz 2 wurde der Versuchsansatz 3 analysiert. In diesem

Versuchsansatz wurde der Einfluss des VF39 (pRD20) Stammes auf die Rhizosphäre

und Rhizoplane der Luzerne, die keine Wirtspflanze des R. leguminosarum bv. viciae

VF39 Stammes ist, getestet. Die Frage, ob VF39 in der Rhizosphäre der Erbse

möglicherweise anders reagiert als in der Rhizosphäre der Luzerne, sollte durch diesen

Versuchsansatz genauer untersucht werden. Zum Vergleich mit den Ergebnissen aus

Versuchsansatz V2 wurde dieselbe Inkubationszeit von drei und zehn Tagen auch für

diesen Versuchsansatz übernommen. Weiterhin sind alle Kultivierungsbedingungen für

V2 und V3 identisch.


- 123 -

Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (V3; Rhizosphäre)

cDNAvo

r Ani

mpf

ung

Mar

ker

VF39

(pR

D20

)

Kon

trol

le

VF39

(pR

D20

)

Kon

trol

le

vor A

nim

pfun

g

VF39

(pR

D20

)

Kon

trol

le

VF39

(pR

D20

)

Kon

trol

le

DNA

Abbildung 32: DGGE für 16SrDNA und c-(r)DNA V3

aus der Rhizosphäre nach 3 Tagen und 10 Tagen Inkubation und



100

98969492908886848280787674

Versuch3RZ cD

Versuch3RZ cDVersuch3RZ cDVersuch3RZ cD

Versuch3RZ cD


100

989694929088868482

Versuch3RZ DNA

Versuch3RZ DNAVersuch3RZ DNAVersuch3RZ DNA

Versuch3RZ DNA

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

Kontrolle

vor Animpfung

%


VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

Kontrolle

vor Animpfung

%



- 124 -

Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (V3; Rhizoplane)

cDNAvo

r Ani

mpf

ung

Mar

ker

VF39

(pR

D20

)

Kon

trol

le

VF39

(pR

D20

)

Kon

trol

le

vor A

nim

pfun

g

VF39

(pR

D20

)

Kon

trol

le

VF39

(pR

D20

)

Kon

trol

le

DNA

Abbildung 33:DGGE für 16SrDNA und c-(r)DNA V3

aus der Rhizoplane nach 3 Tagen und 10 Tagen Inkubation und



100

9080706050403020

Versuch3 RP cD

Versuch3 RP cDVersuch3 RP cDVersuch3 RP cD

Versuch3 RP cD

Dice (Tol 0.2%-0.2%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1

100

9080706050403020

Versuch3 RP D.

Versuch3 RP D.Versuch3 RP D.Versuch3 RP D.

Versuch3 RP D.

01.0

25.024.022.0

31.0

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

Kontrolle

vor Animpfung

%


VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

Kontrolle

vor Animpfung

%

Rhizoplane V3 16S c-(r)DNA


- 125 -

D.2.4.1 V3 A- D: Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (Rhizosphäre und Rhizoplane)

In Versuchsansatz V3 mit Luzerne (Medicago sativa) einer „Nicht-Wirtsplanze“ für R.

leguminosarum bv. viciae VF39 zeigt sich ein Einfluss der Inokulation mit VF39 (pRD20)

auf die Rhizosphäre. Nach drei Tagen Inkubation bildet der Versuchsansatz VF39

(pRD20) ein Cluster mit dem Versuchsansatz vor Beginn des Experiments. Es scheint in

diesem Zeitraum innerhalb der bakteriellen Gemeinschaft keine Veränderung

stattgefunden zu haben. Nach zehn Tagen ist dieser Effekt für VF39 (pRD20) nicht mehr

sichtbar. Allerdings deutet sich auch für die Struktur der aktiven Bakteriengemeinschaft

ein Effekt durch VF39 (pRD20) an. Zwar bildet der Versuchsansatz stets ein Cluster mit

VF39 WT, jedoch nicht mit der jeweils korrespondierenden Probe zum selben Zeitpunkt

der Probennahme.

Das könnte bedeuten, dass die Aktivität der Bakterien bei VF39 (pRD20) (drei Tage

Inkubation) zuerst Ähnlichkeit mit denen der Kontrolle (zehn Tage Inkubation) hatte, sich

anschließend die Struktur der aktiven bakteriellen Gemeinschaft verändert hat und die

Diversität der aktiven Bakterienpopulationen, im Gegensatz zu den anderen Proben,

nicht konstant geblieben ist, sondern abgenommen hat.

Für die Auswertung der Rhizoplane lässt sich keine Aussage über einen Effekt machen,

da die Ähnlichkeit der Proben maximal 40% betrug. Alle Versuchsansätze zeigten sehr

unterschiedliche Bandenmuster. Die Diversitätsanalyse zeigte eine Abnahme innerhalb

der Diversität des mit VF39 (pRD20) behandelten Versuchsansatzes. Die Bakterien

innerhalb der Rhizosphäre sind nach zehn Tagen Inkubation weniger divers als am

Anfang des Versuchs. Bei gleicher Anzahl der Phylotypen sinkt die Eveness. Das

bedeutet, dass die Zellzahl einiger Bakterienarten gesunken oder gestiegen ist. Das

könnte ein Effekt der Inokulation mit VF39 (pRD20) sein.

Die Auswertung für diesen Versuchsansatz wurde durch die Tatsache, dass die Luzerne

nur wenige Wurzeln hatte, erschwert. Es gab keine klare Begrenzung zwischen

Rhizosphäre und umgebender Erde. Auch war die Probennahme der Rhizoplane durch

die geringe Anzahl der Wurzeln sehr erschwert.


- 126 -

D.2.4.2 Versuchsansatz V3 A- D: Shannon Index und Eveness

Abbildung 34 Diversitätsanalyse der Rhizosphäre V3 rDNA und c-(r)DNA rot-schwarzes Dreieck: Diversität DNA vor Animpfung rotes Dreieck: Diversität c-(r)DNA vor Animpfung rDNA: durchgezogene Linien; c-(r)DNA: gestrichelte Linien

Abbildung 35 Diversitätsanalyse der Rhizoplane V3 rDNA und c-(r)DNA rot-schwarzes Dreieck: Diversität DNA vor Animpfung rotes Dreieck: Diversität c-(r)DNA vor Animpfung rDNA: durchgezogene Linien; c-(r)DNA: gestrichelte Linien

Wie man in der Diversitätsanalyse der unterschiedlich behandelten Versuchsansätze der

Rhizosphäre und Rhizoplane sieht, scheint die Inokulation mit VF39 (pRD20) einen

Einfluss auf die Bakterien der Rhizoplane zu haben. Die Diversität innerhalb dieses

Versuchsansatzes sinkt während des Versuchs, die der anderen Proben steigt an.

Dieses Ergebnis wurde ebenfalls in der Diversitätsanalyse der Rhizosphäre des

Versuchs V2 sichtbar. Da in der Rhizoplane sowohl die Diversität der Kontrolle als auch

die Diversität der mit VF39 (pRD20) inokulierten Versuchsansätze auf Basis der rDNA


- 127 -

ansteigt, während die Diversität auf Basis der c-(r)DNA sinkt, kann davon ausgegangen

werden, dass es keinen Effekt durch VF39 (pRD20) gibt.

Die statistische Auswertung bestätigt, dass weder einen signifikanten Einfluss der

Inokulation, noch der Inkubationszeit auf die Diversität vorhanden ist.

D.2.4.3 Zusammenfassung der Ergebnisse der Versuchsansätze V2 und V3

Nach Auswertung der Ergebnisse für den Versuchsansatz V2 (mit Pisum sativum) und

V3 (mit Medicago sativa) kann sicher davon ausgegangen werden, dass es keinen

länger anhaltenden Effekt einer Inokulation mit VF39 (pRD20) auf die bakterielle

Gemeinschaft und die Struktur der aktiven bakteriellen Gemeinschaft innerhalb der

Rhizosphäre und Rhizoplane gibt.

Weiterhin gilt dieses Resultat nicht nur für die Beimpfung der Wirtspflanze (V2), sondern

auch die der Nicht-Wirtspflanze (V3). Die möglichen Effekte der Inokulation mit VF39

(pRD20) sind zu Beginn der Experimente sichtbar und reduzieren sich dann. Auch sind

diese Effekte lediglich bei Untersuchung der 16S rDNA sichtbar. Die Aktivität der

bakteriellen Gemeinschaft, ausgewertet in der 16S c-(r)DNA, scheint unbeeinflusst.

Bemerkenswerterweise hat die Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) im Gegensatz zu VF39

(pRD20) einen offensichtlichen Einfluss auf die bakterielle Gemeinschaft und ihre

Aktivität. Ein Grund dafür könnte die größere Stabilität des pBBRIAA-Plasmids,

vermutlich bedingt durch die geringere metabolische Belastung der Rhizobien (Mølbak,

2003; Joquera et al., 2006; Sørensen, 2005), im Gegensatz zum pRD20-Plasmid sein

(siehe Analyse der Plasmidstabilität).

Die Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) und VF39 (pRD20) beeinflusste in diesem

Versuchsansatz ebenfalls die Zusammensetzung der Wurzelexsudate (Daten siehe

André Haselier). Das hat wiederum Auswirkungen auf die Zusammensetzung der

bakteriellen Gemeinschaft und ihrer Aktivität, innerhalb der Rhizosphäre. Diese

Auswirkungen betreffen auch diesmal nicht die Bakteriengemeinschaft der Rhizoplane,

da die dort vorliegenden Bakterien in einem komplexen Aggregat vorliegen und deshalb

unempfindlicher gegenüber transienten Veränderungen sind (Herschkovitz et al., 2005;

Zimmer, 2003).

Zusammenfassend ist der Einfluss der Inokulation mit VF39 (pRD20) nicht deutlich, der

von VF39 (pBBRIAA) zwar offensichtlicher, aber insgesamt scheint ein Effekt nicht

dauerhaft. Der Einfluss beider Stämme auf die Diversität innerhalb der Rhizosphäre und

Rhizoplane ist nicht signifikant.


- 128 -

Um die Langzeitwirkung der inokulierten Stämme auf die bakterielle Gemeinschaft in der

Rhizosphäre und Rhizoplane der Erbse zu untersuchen wurde anschließend an die

Experimente V2 und V3 noch ein vierter Versuchsansatz V4 angeschlossen.


Rhizosphäre und Rhizoplane der Erbse nach zwölfwöchiger Inkubationszeit

In diesem Versuchsansatz wurde die „Langzeitwirkung“ der gentechnisch veränderten

Bakterien näher betrachtet. Da nicht (eindeutig) sicher war, ob die Expression der

Plasmid-kodierten Gene, die der zusätzlichen IAA-Synthese dienen auch in den

Bakteroiden gewährleistet ist, wurden zwei neu konstruierte VF39-Stämme getestet, die

eine stabile Erhaltung des Plasmids innerhalb der Bakterien so wie eine Expression der

Gene für die IAA-Synthese in den Bakteroiden gewährleisten. Die Gene für die IAA-

Synthese wurden sowohl unter dem konstitutiven CAT-Promotor als auch unter dem

induzierbaren rolA Promotor in das pJP2-Plasmid (siehe Jürgen Prell) integriert, um die

entstandenen Plasmide pJPpCAT und pJProlA analog zu pRD20 und pBBRIAA

benutzen zu können. Als Vergleich diente wiederum der VF39 WT Stamm und der

unbehandelte Kontrollansatz. Die Inkubation betrug zwölf Wochen. Dieser Zeitraum

wurde gewählt, weil die verwendeten Erbsen innerhalb dieser Zeit ihren vollständigen

Generationszyklus bis zur Seneszenz (der Pflanzen) durchlaufen (siehe Abbildung 36). Abbildung 36: Wachstumskurve der Einzelteile einer Erbsenpflanze (nach Geisler, 1988) a: Schoten; b: Stamm; c: Blätter; d: Wurzeln;

aufgetragen ist die Dauer des Wachstums (x-Achse)

gegen die Trockenmasse (TM) in Gramm der einzelnen

Pflanzenteile (y-Achse)


- 129 -

Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (V4; Rhizosphäre und Rhizoplane)

Mar

ker

VF39

(pJP

rolA

) [R

P]

VF39

(pJP

rolA

) [R

P]

VF39

(pJP

pCA

T) [R

Z]

VF39

(pJP

pCA

T) [R

Z]

VF39

WT

[RZ]

VF39

WT

[RZ]

Kon

trol

le [R

P]

Kon

trol

le [R

P]

Mar

ker

VF39

(pJP

rolA

) [R

P]

VF39

(pJP

rolA

) [R

P]

VF39

(pJP

pCA

T) [R

Z]

VF39

(pJP

pCA

T) [R

Z]

VF39

WT

[RZ]

VF39

WT

[RZ]

Kon

trol

le [R

P]

Kon

trol

le [R

P]

Abbildung 37:DGGE-Gel für die 16SrDNA und c-(r)DNA V4

aus der Rhizosphäre und Rhizoplane nach 12 Wochen Inkubation und daraus

resultierender DICE-Analyse; RZ: Rhizosphäre, RP: Rhizoplane;

schwarz: PCR Produkte der 16S rDNA

grün: PCR Produkte der 16S c-(r)DNA


100

9590858075706560555045

Versuch4 rolA 1-4 R

Versuch4 ohne 1-3 Versuch4 pCAT1-4 Versuch4 WT1-3 R

Versuch4 pCAT1-4 Versuch4 WT1-3 RVersuch4 ohne 1-3

Versuch4 rolA 1-4 RKontrolle

Kontrolle

VF39 (pJProlA)

VF39 (pJProlA)

VF39 (pJPpCAT)

VF39 (pJPpCAT)

VF39 WT

VF39 WT

%

Rhizoplane V 4 16S rDNA und c-(r)DNA


100

9590858075706560

Versuch4 rolA1-4

Versuch4 ohne1-3Versuch4 pCAT1-4Versuch4 WT1-3 R

Versuch4 pCAT1-4Versuch4 WT1-3 RVersuch4 rolA 1-4

Versuch4 ohne 1-3

VF39 (pJProlA)

VF39 (pJProlA)

VF39 (pJPpCAT)

VF39 (pJPpCAT)

VF39 WT

VF39 WT

Kontrolle

Kontrolle

Rhizosphäre V 4 16S rDNA und c-(r)DNA

%


- 130 -

D.2.6 V4 A- D: Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (Rhizosphäre und Rhizoplane)

In Abbildung 37 sind die Profile der Gemeinschaftsanalyse auf Basis der 16S rDNA und

c-(r)DNA der Rhizosphäre und Rhizoplane nach zwölf Wochen Inkubationsdauer

aufgetragen. Es lassen sich jeweils zwei getrennte Cluster erkennen. Eins für die 16S

rDNA, das andere für die 16S c-(r)DNA. In der Analyse der Rhizosphäre bilden die mit

VF39 (pJProlA) und VF39 (pJPpCAT) inokulierten Ansätze immer Cluster mit den

Kontroll- oder VF39 WT inokulierten Ansätzen. Das gilt sowohl für die Analyse der 16S

rDNA, als auch der 16S c-(r)DNA. Die Ähnlichkeit der Bandenmuster liegt dabei für die

rDNA oberhalb von 85%, die der c-(r)DNA über 65%. Daraus lässt sich schließen, dass

es keinen Einfluss der Inokulation mit den gentechnisch veränderten Stämmen nach 12

Wochen Inkubation gab. In der Rhizoplane hingegen fällt auf, dass der Versuchsansatz,

der mit VF39 (pJProlA) inokuliert wurde, hinsichtlich der Zusammensetzung der

Bakterien wenig Ähnlichkeit mit den korrespondierenden Versuchsansätzen hatte. Das

kann daran liegen, dass die Menge der aufgetragenen PCR-Produkte zu gering war und

deswegen die Auswertung erschwert wurde. Die Profile der übrigen Versuchsansätze

clustern ähnlich wie die der Rhizosphären-Ansätze zusammen. Die Versuchsansätze,

die mit VF39 (pJProlA) und VF39 (pJPpCAT) inokuliert worden sind, haben hinsichtlich

ihrer Bandenmuster in allen Fällen mehr als 80% Übereinstimmung mit der Kontrolle

oder den VF39 WT inokulierten Versuchsansätzen.

Es ist kein Effekt einer Inokulation auf die Zusammensetzung der bakteriellen

Gemeinschaft oder der vorherrschenden Struktur innerhalb der Aktivität dieser Bakterien

zu erkennen. Ein offensichtlicher Effekt der Inokulation mit VF39 (pJProlA) wird

abhängig von früheren Ergebnissen aus den vorangegangenen Versuchen

ausgeschlossen.


- 131 -

D.2.6.1 Versuchsansatz V4 A- D: Shannon Index und Eveness

Abbildung 38 Diversitätsanalyse der Rhizosphäre V4 rDNA und c-(r)DNA Die c-(r)DNA Werte sind schraffiert dargestellt.

Abbildung 39 Diversitätsanalyse der Rhizoplane V4 rDNA und c-(r)DNA Die c-(r)DNA Werte sind schraffiert dargestellt.

Wie man in der Diversitätsanalyse der unterschiedlich behandelten Versuchsansätze der

Rhizosphäre und Rhizoplane sieht, hat die Inokulation mit den zwei verschiedenen

VF39-Stämmen keinen signifikanten Einfluss auf die Bakterien innerhalb der

Rhizosphäre und Rhizoplane. Die Diversität der 16S c-(r)DNA Proben liegt niedriger als

die der 16S rDNA Ansätze. Die Probe VF39 (pJProlA) fällt aus diesem Muster, was sich

allerdings durch die Menge an PCR-Produkt (siehe Auswertung der DICE-Analyse)

erklären lässt. Ein Effekt der gentechnisch veränderten Stämme auf die Diversität und

Abundanz der bakteriellen Gemeinschaft ist nach zwölf Wochen nicht zu sehen.


- 132 -

D.2.7 Analyse der IAA Konzentration in der Rhizosphäre (Versuchsansatz 1- 4)

D.2.7.1 IAA Konzentration der Rhizosphäre V 1

Die in vitro Messung der IAA Konzentration der einzelnen VF39 Mutanten gibt an,

welche Menge unter optimalen Kultivierungsbedingungen synthetisiert wird. Sie gibt

jedoch keinen Aufschluss darüber, wie viel IAA unter natürlichen Bedingungen in der

Rhizosphäre der Wirtspflanze gebildet bzw. freigesetzt wird. Durch die GC-MS Analyse

wurde deswegen die Konzentration von IAA in der Rhizosphäre der Erbsenpflanzen bei

den verschieden behandelten Versuchsansätzen gemessen. Es wurden je drei Pflanzen

pro Ansatz dreifach parallel gemessen.

1,0E-08

1,0E-07

1,0E-06

1,0E-05

1,0E-04

1,0E-03

1,0E-02

1,0E-01

Woche 0 Woche 1 Woche 3 Woche 9

vor Animpfung Kontrolle VF39 (pRD20) VF39 WT IAA VF39 (pHReGFPplac)

10-1

10-2

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-3

[IAA] V1: IAA-Konzentration in der Rhizosphäre

Abbildung 40: Versuchsansatz 1 IAA Konzentration in der Rhizosphäre

Y-Achse: IAA Konzentration in M/ g Erde; X-Achse: Probennahme vor Beginn des Versuchs,

nach 1, 4 und neun Wochen Inkubationsdauer; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von drei

parallelen Messungen

Wie man in Abbildung 40 sehen kann liegt die IAA-Konzentration in der Rhizosphäre in

der ersten Woche im Bereich zwischen 10-4 und 10-5 M. Die Menge an IAA ist höher als

vor Beginn des Versuchs (Woche 0). Zu diesem Zeitpunkt wurden die Erbsenpflanzen in

die Erde eingepflanzt, was den geringen Gehalt an IAA erklären könnte. Im Bereich der


- 133 -

Standardabweichung zeigt nur die mit VF39 (pRD20) beimpfte Rhizosphäre nach der

ersten Woche einen etwas höheren Gehalt an IAA. Nach drei Wochen Inkubation hat bei

allen Versuchsansätzen die Konzentration an IAA stark abgenommen.

Nach neun Wochen Inkubation liegt die IAA Konzentration wieder etwas höher,

zwischen 10-5- 10-6 M. Zu diesem Zeitpunkt ist das Wachstum der Erbse bis auf die

Hülsenproduktion bereits abgeschlossen. In Woche 0 konnten die vorliegenden

Bakterien vermutlich noch nicht durch die Exsudation der Erbsenwurzeln zu einer

vermehrten IAA Synthese angeregt werden. Außerdem hat zu diesem Zeitpunkt die

Inokulation mit zusätzlichen IAA synthetisierenden VF39-Stämmen noch nicht

stattgefunden. Allerdings hatten nach der ersten Woche sowohl die einheimischen

Bakterien, als auch die hinzugefügten Bakterien Zeit durch ihre IAA Synthese die in der

Rhizosphäre vorliegende Konzentration zu erhöhen. Nach vier Wochen hat die

Konzentration von IAA in der Rhizosphäre jedoch wieder abgenommen. Ein Grund dafür

könnte der größere Bedarf an IAA der Pflanze sein, die in dieser Zeit das Wachstum

aller Pflanzenteile stark erhöht (siehe Abbildung 20). Nach neun Wochen Inkubation ist

das Wachstum der Erbsenpflanze zum größten Teil abgeschlossen, die Pflanze benötigt

jetzt vermutlich weniger IAA.

Die IAA Produktion der Rhizosphärenbakterien ist ebenfalls abhängig von Signalen, die

die Pflanze mit bzw. durch ihre Wurzelexsudate vermittelt, z.B. die Abgabe von

Tryptophan. Da sich diese bekanntlich im Laufe der Zeit verändern, verändert sich

abhängig davon auch die bakterielle Gemeinschaft. Das könnte ebenfalls Auswirkungen

auf die Synthese der bakteriell produzierten Phytohormone haben.


- 134 -


In der Analyse der einheimischen Bodengemeinschaft durch DGGE wurde im Zeitraum

von drei bis zehn Tagen Inkubation ein möglicher Effekt der gentechnisch veränderten

VF39-Stämme auf die bakterielle Rhizosphärengemeinschaft detektiert, weshalb der IAA

Gehalt in der Rhizosphäre der Erbsenpflanze ebenfalls innerhalb dieses Zeitrahmens

untersucht wurde.

1,0E-08

1,0E-07

1,0E-06

1,0E-05

1,0E-04

1,0E-03

1,0E-02

1,0E-01

Tag 0 Tag 3 Tag 10

vor Animpfung Kontrolle VF39 (pRD20) VF39 WT VF39 (pBBRIAA)

10-1

10-2

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-3




nach 3 und 10 Tagen Inkubationsdauer; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von drei


Die GC-MS Analyse des IAA Gehalts in der Rhizosphäre der Erbsenpflanze lag bei allen

Versuchsansätzen nach drei und zehn Tagen Inkubation zwischen 10-4 und 10-5 M/g

Rhizosphäre. Ausnahme war der Kontrollansatz nach drei Tagen Inkubation. Die IAA-

Menge in der Rhizosphäre der inokulierten Versuchsansätze war im Bereich der

Standardabweichung vergleichbar. Nach zehn Tagen Inkubation waren die

Versuchsansätze bis auf VF39 (pBBRIAA) wieder im Rahmen ihrer Standardabweichung

vergleichbar. Die mit VF39 (pBBRIAA) inokulierte Rhizosphäre hatte einen etwas

höheren IAA-Gehalt. Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse die Ergebnisse der GC-MS


- 135 -

Analyse für Versuchsansatz V1 in diesem Zeitraum. Wie in Versuchsansatz V1 schon

gezeigt, ist die IAA Konzentration vor Beginn des Versuchs niedriger, was sich durch die

noch nicht stattgefundene Reaktion der Bakterien auf das Vorliegen der Erbsenpflanze

erklären lässt.


In Versuchsansatz V3 wurde der Einfluss der modifizierten VF39-Stämme auf den IAA

Gehalt in der Rhizosphäre der Luzerne über einen Zeitraum von 10 Tagen untersucht.

Die Luzerne wurde als Nicht-Wirtspflanze der VF39-Stämme vergleichend zur Erbse, der

Wirtspflanze untersucht.

1,0E-08

1,0E-07

1,0E-06

1,0E-05

1,0E-04

1,0E-03

1,0E-02

1,0E-01

Tag 0 Tag 3 Tag 10

vor Animpfung Kontrolle VF39 (pRD20)

10-1

10-2

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-3




nach 3 und 10 Tagen Inkubationsdauer; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von drei


Die GC-MS Analyse des IAA Gehalts in der Rhizosphäre der Luzerne lag vor Beginn des

Versuchs zwischen 10-3 M und 10-4 M und sank in den Kontrollansätzen dann bis auf

10- 5 M pro Gramm Boden ab. Nach dreitägiger Inkubation mit VF39 (pRD20) konnte im

Rahmen der Standardabweichung ein Anstieg des IAA Gehalts in der Rhizosphäre


- 136 -

beobachtete werden, der aber nach zehn Tagen wieder gesunken und somit

vergleichbar mit der Menge an IAA im Kontrollansatz war. Die Konzentration der IAA in

der Rhizosphäre der Luzerne war vergleichbar mit der Konzentration in der Rhizosphäre

der Erbse (Versuchsansatz V2). Aus technischen Gründen konnte die Inokulation mit

VF39 (pBBRIAA) nicht ausgewertet werden.

D.2.7.4 IAA Konzentration der Rhizosphäre V4

In Versuchsansatz 4 wurde der IAA-Gehalt in der Rhizosphäre nach 12 Wochen

Inkubationsdauer gemessen. Es sollte analysiert werden, ob nach dieser langen

Inkubationszeit ein Unterschied in der vorliegenden IAA Konzentration zu sehen ist.

Dadurch könnten Rückschlüsse auf die Persistenz bzw. anhaltende Stoffwechselaktivität

der inokulierten VF39-Stämme, die vermehrt IAA synthetisieren, geschlossen werden.

1,0E-08

1,0E-07

1,0E-06

1,0E-05

1,0E-04

1,0E-03

1,0E-02

1,0E-01

Kontrolle VF39 (pJPpCAT)VF39 (pJProlA) VF39 WT

12 Wochen

10-1

10-2

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-3


Abbildung 43: Versuchsansatz 4: IAA Konzentration in der Rhizosphäre

Y-Achse: IAA Konzentration in M/ g Erde; X-Achse: Probennahme nach 12 Wochen Inkubationsdauer;

Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung von drei parallelen Messungen

Die Messung des IAA-Gehalts nach 12 Wochen Inkubation in Versuchsansatz IV beträgt

für alle Versuchsansätze 10-6 M. Es ist kein Einfluss einer Inokulation auf die Menge an

IAA in der Rhizosphäre sichtbar. Alle gemessenen Konzentrationen sind im Rahmen


- 137 -

ihrer Standardabweichung gleich hoch und mit den Konzentrationen, die in V1 nach

neun Wochen gemessen wurden, vergleichbar. Daraus kann man schließen, dass die

inokulierten Bakterien entweder von den einheimischen Bakterienpopulationen verdrängt

wurden, oder aufgrund des Stresses nicht in der Lage waren, die Synthese von IAA, die

ihren Stoffwechsel zusätzlich belastet, weiterhin zu gewährleisten.

Die DGGE-Analyse zeigte eine hohe Ähnlichkeit zwischen den verschieden inokulierten

Ansätzen, weiterhin liegen die Eveness Werte für alle Ansätze zwischen 0,87 und 0,92.

Das lässt auf eine sehr gleichmäßige Verteilung innerhalb der vorliegenden

Bakteriengemeinschaft und bakteriellen Aktivitätsstruktur in der Rhizosphäre schließen.

Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass die einheimischen Bakterien die

zusätzlich inokulierten Bakterienstämme durch Reduzierung der Zellzahlen in ihre

Gemeinschaftsstruktur eingegliedert haben könnten, so dass sie keinen starken Einfluss

auf den IAA-Gehalt der Rhizosphäre ausüben können.

D.2.8 Zusammenfassung IAA Synthese der verschiedenen VF39-Stämme

In der in vitro Messung (Abbildung 21) wurden Unterschiede in der IAA Konzentration

des Kulturüberstands der verschiedenen VF39-Stämme gemessen, die sich anhand der

einzelnen Plasmide erklären lassen.

Tabelle 31: Plasmideigenschaften – IAA Synthese

Plasmid IAA Gehalt Eigenschaft Eigenschaften des Promotors

pRD20 2,5x 10-4 mittlere Kopienzahl stark, konstitutiv

pJPpCAT 1,5x 10-4 geringe Kopienzahl stark, konstitutiv

pJProlA 1,2x10-4 geringe Kopienzahl schwach, induzierbar

pBBRIAA 0,9x 10-4 mittlere Kopienzahl schwach, induzierbar

WT 2,3x 10-5 - -

pHReGFPplac (Leerplasmid) 2,0x10-5 - -

VF39 WT und VF39 (pHReGFPplac) besitzen beide kein Plasmid zur zusätzlichen IAA-

Synthese. Da R. leguminosarum bv. viciae VF39 unter natürlichen Bedingungen in der

Lage ist IAA zu synthetisieren, wurden diese beiden Stämme als Referenz benutzt.

Die Konzentration an IAA im Zellkulturüberstand des VF30 pRD20 ist am höchsten, das

Plasmid liegt in mittlerer Kopienzahl vor, die Gene für die IAA-Synthese stehen unter

Kontrolle des starken konstitutiven CAT Promotors. Dieser Promotor reguliert ebenfalls


- 138 -

die Expression in pJPpCAT, das Plasmid hat aber eine niedrigere Kopienzahl,

weswegen die IAA Konzentration etwas niedriger ist. Die Menge an synthetisiertem IAA

liegt für pJProlA und pBBRIAA unterhalb der Menge, die für pRD20 und pJPpCAT

gemessen wurde. Das entspricht den Erwartungen, da in diesen Plasmiden die Kontrolle

der IAA-Synthese vom schwachen, induzierbaren rolA Promotor gesteuert wird. Die

Menge an gebildetem IAA sollte allerdings für den VF39 (pBBRIAA) Stamm größer sein,

als für VF39 (pJProlA), da das Plasmid in höherer Kopienzahl vorliegt. Das ist allerdings

nicht der Fall. Da der Promotor durch niedrigen pH und die stationäre Wachstumsphase

induziert wird, ist es möglich, dass Unterschiede hinsichtlich dieser Bedingungen für das

Ergebnis verantwortlich sind. Möglich ist auch, dass der Salkowski-Test für diesen

Nachweis hinsichtlich der quantitativen Messung nicht sensitiv genug ist und lediglich

eine qualitative Aussage über die Synthese von IAA getroffen werden kann. Weiterhin

liegt die im Kulturüberstand von VF39 (pBBRIAA) weitaus höher, als die von Camerini

für diesen Stamm durch GC-MS ermittelte (76 nmol/ ml).

Die Bestimmung der IAA Konzentration in der Rhizosphäre wurde durch GC-MS Analyse

gemessen, da diese Methode sensitiver für die geringen Mengen ist. Die Ergebnisse der

Analyse zeigen, nach statistischer Auswertung (Mantel-Test) für die verschiedenen

Versuchsansätze innerhalb der Rhizosphäre der Erbse keinen signifikanten

Zusammenhang zwischen Inokulation und IAA-Gehalt. Die Menge an IAA ist in allen

Ansätzen in etwa vergleichbar und korreliert mit der Inkubationsdauer. Da laut Literatur

über 80% der Rhizosphärenbakterien in der Lage sind IAA zu produzieren (Perrine, et

al., 2004), bewirkt die Inokulation mit den verschiedenen VF39-Stämmen vermutlich

keine starken Veränderung innerhalb des IAA-Gehalts der Rhizosphäre. Der vorliegende

IAA-Gehalt, der in der Rhizosphäre der jeweiligen Versuchsansätze gemessen wurde,

liegt in allen Fällen in einem Bereich, der sich positiv auf das Stängelwachstum der

Pflanzen auswirkt. Trotzdem sah man in Versuchsansatz V1 eine sehr deutliche

Wachstumshemmung der Erbsenpflanzen, die mit IAA (10-6 M) behandelt wurden

(Dobbelaere et al., 1999). Da das Wachstum der Wurzeln bei einer Konzentration <10-6

M gehemmt wird (siehe Abbildung, 20) kann die Pflanze nicht optimal wachsen. Die

Stängel waren dicker und die Internodien kürzer als bei den anderen Pflanzen. Bei den

anderen Pflanzen war kein Einfluss der Inokulation auf das Wachstum sichtbar, während

der Zusatz von künstlichem Auxin das Wachstum nachteilig beeinflusst hat. Die mit

VF39 (pRD20) inokulierten Erbsen hatten etwas früher Schoten, als die anderen

Erbsenpflanzen.


- 139 -

1.1

20.1

25.1

42.1

10.1

42.2

42.3

54.1

54.2

62.1

24.1

42.4

57.1

62.2

24.2

25.2

44.1

45.1

1.2

54.3

49.1

D.2.9 Sequenzierte DGGE Banden

Spezielle Banden in den DGGE-Profilen, die durch ihre Position und/ oder Intensität

auffällig waren, wurden ausgeschnitten, aufgereinigt und kloniert. Je drei Klone pro

ausgeschnittener DGGE-Bande wurde amplifiziert und zum Sequenzieren geschickt.

Des Weiteren wurden die erhaltenen Sequenzen identifiziert und ein phylogenetischer

Baum erstellt. Dadurch konnte man einen Eindruck über die Bakterienarten gewinnen,

die in den vorangegangenen Versuchen beeinflusst wurden.

Abbildung 44: Phylogenetischer Baum der ausgeschnittenen und sequenzierten DGGE Banden

erstellt durch den Vergleich der homologen Bereiche nach der Sequenzierung; 0,1 ≙ 10% Unterschied in der

Sequenz; die erste Zahl ist die Nummer der DGGE Bande; die zweite Zahl ist die Nummer der Kolonie, die

zur Sequenzierung geschickt wurde

Wie man in Abbildungen 44 sehen kann, unterscheiden sich die verschiedenen

sequenzierten Klone einer speziellen DGGE-Bande oft schon sehr stark. Daraus lässt

sich schließen, dass zur 100%igen Identifizierung einer Bande, die möglicherweise nicht

nur von einer Bakterienart stammte, sondern verschiedenen Phylotypen, noch viel mehr

Klone sequenziert werden müssten. Aufgrund der sequenzierten Banden innerhalb

dieser Arbeit kann man nur bedingt auf den Bakterienstamm schließen. Es wurde

lediglich ein allgemeiner Eindruck der bakteriellen Gemeinschaft bzw. der Bakterien, die

möglicherweise durch die Inokulation oder IAA-Behandlung beeinflusst wurden,

gewonnen.


- 140 -

Tabelle 32: Sequenzierte DGGE Banden

DGGE-Bande Sequenzierung Bakterium Länge der

Sequenz Sequenz-Homologie Acession number

1 1 unkultivierbares Bakterium 427/430 99% EF397320

1 2 Microbacterium sp. 223/225 99% AM500663

10 1 unkultivierbares Bakterium 393/405 96% AF269015

20 1 unkultivierbarer Variovorax sp. 429/434 98% AM489659

24 1 Desulfotomaculum reducens 415/450 92% CP000612

24 2 Pseudomonas sp. 432/436 99% DQ990885

25 1 unkultivierbares Proteobakterium 441/447 98% EF019822

25 2 unkultivierbares Bakterium 432/434 99% DQ057366

42 1 Clostridium fimetarium 405/436 93% AF126687

42 2 unidentifiziertes Eubakterium 397/405 98% AJ229231

42 3 Clostridium sp. 426/429 99% DQ196630

42 4 Pisum sativum Chloroplast 427/429 99% X55033

44 1 R. leguminosarum bv. viciae 430/433 99% DQ835308

45 1 Pseudomonas sp. oder Xanthomonas sp.

432/436 99%

EF027004 oder EF027001

49 1 γ-Proteobacterium 431/435 99% AB174846

54 1 unkultivierbares β-Proteobakterium 424/430 98% AB286277

54 2 Streptomyces mirabilis 298/303 98% EF371422

54 3 R. leguminosarum bv. viciae 431/435 98% DQ835308

62 1 Oxalobacteraceae Bakterium 427/431 99% DQ113445

62 2 unkultivierbares Bakterium 343/346 99% DQ822391

Die sequenzierten DGGE Banden der Gele entsprechen der Nummerierung in der Tabelle; Sequenzierung

1-3 entspricht der Nummer des Klons der jeweiligen Bande, der sequenziert wurde; die Länge der Sequenz

entspricht der Größe des Fragments, das automatisch zur Identifizierung durch BLAST benutzt wurde

Die sequenzierten Phylotypen gehören zu Bakterienarten, die natürliche Bewohner des

Bodens darstellen. Dazu gehören Mikrobakterien (Bande 1), gram-positive,

unbewegliche, aerobe, nicht pathogene Bakterien, die im Boden und Oberflächenwasser

vorkommen. Weiterhin wurden Sequenzen gefunden, die Ähnlichkeit mit den Vertretern

der Gattung Burkholderiales haben. Dazu gehören Variovorax (Bande, 20), die teilweise


- 141 -

in der Lage sind, Phenole abzubauen und im Belebtschlamm vorkommen. Acidovorax

sp., ein Pflanzenpathogen und ein Bakterium der Familie Oxalobacteraceae (Bande 62),

die Oxalsäure als Kohlenstoffquelle benötigen. Die Bakterien dieser Gattung kommen

ubiquitär vor und sind bewegliche, aerobe Gramnegative Stäbchen, die ebenfalls

teilweise in der Lage sind, Pestizide und organische Umweltgifte z.B. PCB abzubauen.

Burkholderiales werden vielfach auch als „plant growth promoting rhizobacteria“ genutzt.

Es konnten ebenso Sequenzen gefunden werden, die zu den Clostridien (Bande 24 und

42) gehören, welche Grampositive, stäbchenförmige Bakterien sind, die mehr oder

weniger streng anaerob wachsen und hitzeresistente Endosporen bilden. Sie kommen

im Boden (in anaeroben Zonen), in Wasser, Staub und Lebensmitteln, aber auch im

Darm von Mensch und Tier vor. Im Boden zählen Clostridien zu den wichtigsten anaerob

Cellulose-Abbauenden Mikroorganismen.

Bande 54 repräsentiert Streptomyces mirabilis, ein Grampositives GC-reiches

Bodenbakterium, das Sporen bilden kann. Streptomyceten produzieren Antibiotika z.B.

Streptomycin, Spectinomycin und Tetracyclin. Des Weiteren sind sie am Abbau

organischer Stoffe im Boden beteiligt.

Die ebenfalls detektierten Pseudomonaden und Rhizobien gehören zu den

Proteobakterien. Sie sind ebenfalls sehr häufig vorkommende Bodenbakterien und

gehören zu den „plant growth promoting rhizobacteria“. Pseudomonaden werden unter

anderem genutzt, um Pilzwachstum auf den Pflanzenwurzeln zu inhibieren.


- 142 -

D.2.10 Phänotypische Veränderungen

D.2.10.1 Veränderungen im Wachstum der Erbsenpflanzen

Um einen Effekt der Inokulation auf das Wachstum und den Phänotyp der

Erbsenpflanzen zu analysieren, wurden Erbsenkeimlinge in sterilem Vermiculit mit

verschiedenen VF39-Stämmen inokuliert oder mit IAA-Lösung gegossen. Der sterile

Versuchsansatz sollte dafür sorgen, dass die Nodulation nur mit dem ausgewählten

Rhizobienstamm stattfand, und keine Konkurrenz durch andere Rhizobienstämme

vorlag.

Tabelle 33: Pflanzenwachstum mit unterschiedlicher Inokulation in Vermiculit

Ansatz Anzahl Pflanzen

Größe der Pflanzen [cm]

STD Fehler [cm]

Anzahl Schoten

Ø Schoten/ Pflanze

TG Wurzel [g]

TG Pflanze [g]

1.Messung

VF39 (pRD20) 2 48,5 16,5 9 4,5 0,7 7,8

VF39 WT 3 30 16,0 10 3,3 0,7 7,3

VF39 WT + IAA 10-6 2 45 2,0 8 4 0,5 5,6

IAA 10-6 3 29 6,7 8 2,7 0,6 5,2

IAA 10-4 2 15,5 2,5 1 0,5 0,1 0,6

2.Messung

VF39 WT (Trp) 3 45,7 3,7 6 2 1,1 5,3

VF39 (pRD20) (Trp)

3 38,7 6,2 5 1,7 0,5 4,5

VF39 (pBBRIAA) (Trp)

3 47,5 3,8 9 3 2,1 6,8

VF39 NifA– (Trp) 3 30,7 7,5 0 0 0,7 1,9

STD: Standardfehler der Messungen; TG: Trockengewicht; Trp: Pflanzen wurden zusätzlich zur Inokulation

mit 1g/l Tryptophan-Lösung. gegossen; TG: Trockengewicht in g

Wie man in Tabelle 33 erkennen kann, spielt die Inokulation in beiden Messungen im

Rahmen der jeweiligen Standardabweichungen für das Wachstum de Erbsen keine

Rolle. Die mit VF39 WT, VF39 (pRD20) und VF39 (pBBRIAA) inokulierten Pflanzen sind

allen ungefähr gleich groß. Pii (2007) stellte in Experimenten fest, dass die Luzerne

Pflanzen hinsichtlich ihrer Größe durch die Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) gefördert

wurden, während es keinen feststellbaren Effekt auf Bohnen gab.


- 143 -

Ein Effekt der Inokulation mit den IAA-synthetisierenden Stämmen scheint also vor allem

abhängig davon zu sein, welche Pflanze inokuliert wird. Die mit IAA-Lsg. gegossenen

Pflanzen zeigten einige wenige Knöllchen, da das Vermiculit wohl nicht ganz steril

erhalten blieb. Es waren allerdings so wenige, dass sie vermutlich bei Betrachtung der

Ergebnisse zu vernachlässigen sind. Es ist offensichtlich, dass je höher die Menge an

künstlich zugeführtem IAA ist, desto kleiner bleiben die Pflanzen.

Da IAA empfindlich gegenüber Licht ist (Perrine et al., 2004) und schnell degradiert wird

aus diesen Ergebnissen geschlossen, dass die Konzentration an zugeführtem IAA im

Vermiculit durch die Beleuchtung der Pflanzen und die Reflektion des Lichts an den

Vermicullitpartikeln dafür gesorgt hat, dass das IAA teilweise zerfallen und die in den

Pflanztöpfchen vorliegende Konzentration so niedrig war, dass sie das Wachstum der

Wurzeln gefördert, das der Stängel hingegen inhibiert hat. Das erklärt das sich

verschiebende Verhältnis Wurzelmasse zu Pflanze (siehe Tabelle 33).

Es wurde weiterhin vermutet, dass die Zugabe von Tryptophan die Wirkung einer

Inokulation mit VF39 (pRD20) oder VF39 (pBBRIAA) deutlich hervorhebt, da sie die

Vorstufe des IAA darstellt und dadurch die Synthese in diesen Stämmen gefördert wird

(Dobbelaere et al., 1999). Unterschiede in der Inokulation der Pflanzen wurden in der 1.

Messung nur hinsichtlich der Anzahl der Schoten pro Pflanze deutlich. Die mit VF39

(pRD20) inokulierten Erbsen hatten insgesamt mehr Schoten, als die anderen

Erbsenpflanzen. Die mit VF39 NifA- inokulierten Pflanzen dienten nur dazu, einen

Vergleich mit einem nicht stickstofffixierenden Stamm zu haben. Wie erwartet hatten

diese Pflanzen ausschließlich weiße Knöllchen und waren vermutlich wegen des

Stickstoffmangels etwas kleiner. Sie besaßen als einzige Pflanzen keine Schoten.

Da Pflanzen verschiedene Stoffwechselwege besitzen um die Menge an aktivem IAA

konstant zu halten bzw. zu kontrollieren, hat die Inokulation mit den modifizierten VF39

vermutlich keinen Einfluss auf die IAA-Konzentration in der Pflanze, weswegen keine

Veränderung im Wachstum festgestellt werden konnte (Östin et al., 1998; Kai et al.,

2007). Es wurde an Arabidopsis Pflanzen nachgewiesen, dass nur bis zu vier Stunden

nach Applikation von IAA ein erhöhter Gehalt in der Pflanze nachgewiesen werden

konnte. Dieser sank anschließend steil ab, was mit der raschen Zunahme an inaktiven

IAA-Konjugaten, wie z.B. IAA-Glu, oder IAA-Asp korrelierte (Kai et al., 2007).


- 144 -

D.2.11 Veränderungen im Erscheinungsbild der Wurzelknöllchen

Die Wurzelknöllchen der inokulierten Erbsenpflanzen wurden hinsichtlich möglicher

Unterschiede in ihren Phänotypen untersucht. Diese Auswertung wurde visuell

durchgeführt und fotografisch dokumentiert.

Das Aussehen der Wurzelknöllchen an Pflanzen, die mit den Stämmen VF39 WT und

VF39 (pHReGFPplac) inokuliert wurden, war normal. Sie entsprachen in Farbe und

Form der Literatur.

Abbildung 45

Typisches Aussehen von

Wurzelknöllchen nach Inokulation mit

R. leguminosarum bv. viciae VF39 WT

An Pflanzen, die mit VF39 (pRD20) inokuliert wurden, gab es etwas mehr kleinere weiße

Wurzelknöllchen, die rosa gefärbten Knöllchen sahen ähnlich wie die der mit VF39 WT

inokulierten Erbsen aus.

Abbildung 46


Wurzelknöllchen nach Inokulation mit

R. leguminosarum bv. viciae VF39 (pRD20)

Die mit VF39 (pJProlA) und VF39 (pJPpCAT) inokulierten Pflanzen zeigten verlängerte

Wurzelknöllchen, die bei Inokulation mit VF39 (pJPpCAT) in mehrere Lappen aufgeteilt

wurden, während sie bei VF39 (pJProlA) nur aus einem Lappen bestehen.

Abbildung 47


Wurzelknöllchen nach

Inokulation mit

R. leguminosarum bv.

viciae VF39 (pJPpCAT)

Abbildung 48



Inokulation mit

R. leguminosarum bv.

viciae VF39 (pJProlA)

Auffallend war das Erscheinungsbild der mit VF39 (pBBRIAA) inokulierten

Wurzelknöllchen. Sie waren bräunlich-rosa, glänzend und von „matschiger“ Konsistenz.


- 145 -

Diese Beobachtung wurde an allen Pflanzen gemacht, die mit diesem Stamm inokuliert

wurden. Da von jeder Pflanze die Wurzelknöllchen nur visuell analysiert und nicht

ausgezählt wurden, ist ein Einfluss der Inokulation auf das Aussehen der

Wurzelknöllchen nicht statistisch auswertbar.

Abbildung 49



Inokulation mit

R. leguminosarum bv. viciae

VF39 (pBBRIAA)

Der Einfluss der verschiedenen Rhizobien auf den Phänotyp der Wurzelknöllchen wurde

ebenfalls in der Songlines EU Projektschrift beschrieben. Knöllchen an Erbsen, die mit

einem IAA-synthetisierenden Rhizobienstamm inokuliert wurden, waren teilweise

länglicher, oder sie wiesen mehrere „Lappen“ auf, wie auch von Camerini (noch nicht

veröffentlicht) festgestellt wurde. Diese Beschreibung trifft in den vorliegenden

Versuchen für den Phänotyp der mit VF39 (pRD20) und VF39 (pJPpCAT) inokulierten

Pflanzen zu. Die phänotypischen Veränderungen der Wurzelknöllchen, die mit VF39

(pBBRIAA) inokuliert wurden, kann nicht direkt auf eine Wirkung des vermehrt

gebildeten IAA zurückgeführt werden. So fand Pii (2007) keine Veränderungen im

Aussehen der Wurzelknöllchen der mit dem modifizierten pRD20 tragenden S. meliloti-

Stamm inokulierten Medicago-Pflanzen.

Ein möglicher Grund für das Veränderte Erscheinungsbild (bräunlich-rosa, glänzend)

könnte auf eine Störung in der Knöllchenkortexbildung zurückzuführen sein. Weiterhin

deutet die „kollabierte“ Form der Knöllchen darauf hin, dass es sich um Fix- Knöllchen

handeln könnte (Vermutung von Dr. Dieter Kapp, Universität Bielefeld).

Eine eindeutige Ursache für diese Veränderungen wurde bis jetzt allerdings noch nicht

gefunden. Zusätzlich könnte es in den Knöllchen zu einer Tryptophan-Verknappung

gekommen sein. Die Pflanze ist eventuell nicht in de Lage den IAA-produzierenden

Bakteroiden genügend Tryptophan für die IAA-Synthese zu liefern (Vermutung von Dr.

Dieter Kapp, Universität Bielefeld). Da die Nodulation zum großen Teil von der Pflanze

kontrolliert wird (van Noorden et al., 2006), könnten die Veränderungen im Aussehen der

Knöllchen auch abhängig von der Wirtspflanze sein.

Ein eindeutiger Einfluss der Inokulation auf die Anzahl der Knöllchen und die

Vergrößerung des oberirdischen Teils der Erbsenpflanzen konnte im Gegensatz zu

Versuchen mit M. sativa nicht detektiert werden (Pii et al., 2007).


- 146 -

D.2.12 Veränderungen im Erscheinungsbild der Wurzeln

Das Aussehen der mit VF39 (pRD20) und VF39 (pBBRIAA) inokulierten sowie der mit

IAA gegossenen Wurzeln, war auffällig anders, als das der mit VF39 WT oder VF39

(pHReGFPplac) inokulierten Pflanzen (siehe Abbildung 50). Die Pflanzen hatten

teilweise sehr stark verdickte Seitenwurzeln, die sich kaum verzweigten und relativ kurz

waren.

Abbildung 50

Verändertes Erscheinungsbild der Wurzeln nach Inokulation mit VF39 (pRD20) und VF39 (pBBRIAA) bzw.

Gießen mit IAA-Lösung

Das veränderte Aussehen der Wurzeln könnte eine Reaktion auf eine IAA

Konzentrationen sein, die das Wurzelwachstum inhibiert. Es ist möglich, dass das

zugefügte IAA [10-6 M] durch das Licht in der Pflanzenkammer teilweise hydrolysiert

wurde und die Konzentration auf 10-7 – 10-8 M gesunken ist und somit die Entwicklung

der Wurzeln gehemmt hat. Das könnte dann indirekt zu einer Hemmung des gesamten

Wachstums (z.B. der mit IAA-Lsg. behandelten Erbsen) geführt haben. Eine hohe IAA-

Konzentration könnte möglicherweise auch zur Förderung der Ethylenbiosynthese und

damit zur Hemmung des Wurzel- und Sprosswachstums, was zu der Verkürzung und

Verdickung der Wurzelstücke geführt (Plazinski & Rolfe, 1985) haben kann. Eine

Störung des Infektionsschritts der Rhizobien kann zu einer stark aufgeblähten Zone in

den von Rhizobien infizierten Wurzelästen führen. Diese sind dann extrem voluminös

und enthalten dicht an dicht sehr viele veg. Exo-Rhizobien (Vermutung von Dr. Dieter

Kapp, Universität Bielefeld). Ein eindeutiger Rückschluss ist allerdings im Rahmen der

durchgeführten Versuche nicht möglich.


- 147 -

D.2.13 Statistische Auswertung

D.2.13.1 Ergebnisse für die Multidimensionale Skalierung (MDS) und den Manteltest der Gemeinschaftsprofile

Die Auswertung der DGGE Profile über MDS wurde durchgeführt um Veränderungen in

im Gemeinschaftsprofil der Bakterien zu visualisieren. Dabei werden komplexe DGGE-

Muster auf einen Punkt im 2D Raum reduziert (Fromin, 2002; Schauer et al., 2000;

Carson, 2007). Geringe Abstände zwischen den Punkten bedeuten dabei eine hohe

Ähnlichkeit zwischen den bakteriellen Gemeinschaften der einzelnen Versuchsansätze.

D.2.13.2 V 1 A- B: MDS Ergebnisse der Rhizosphäre 16S rDNA und c-(r)DNA

VF39 WT

VF39(pHReGFPplac)

Kontrolle

VF39 WTVF39 WT

VF39 (pRD20)

KontrolleVF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

IAA

IAA

VF39 (pHReGFPplac)

VF39(pHReGFPplac)

IAA

Dimension 1

Dim

ensi

on 2

Kruskals Stress: 0,278

MDS V1: Rhizosphäre 16S c-(r)DNADimension 1

Dim

ensi

on 2

MDS V1: Rhizosphäre 16S rDNA


VF39 WT

VF39(pHReGFPplac)

Kontrolle

VF39 WT

VF39 WT

Kontrolle

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

IAA

IAA

VF39 (pHReGFPplac)

VF39(pHReGFPplac) IAA

VF39 (pRD20)

Abbildung 51: Rhizosphäre 2-Dimensionaler MDS Plot für Versuchsansatz 1 (9 Wochen Inkubation) grün: Woche eins;

blau: Woche drei;

schwarz: Woche neun

Bray-Curtis Koeffizient,

Modell: Absolut, Kruskals Stress,

Anhaltebedingungen:

Konvergenz= 0,00001/ Iterationen= 500

Anfangskonfiguration: zufällig

Vierecke mit Kreuz:

Klassendurchschnitt der

Gemeinschaftsprofile aller Versuchsansätze

zur korrespondierenden

Inkubationszeit


- 148 -

Zusätzlich zur MDS-Analyse wurde ein Manteltest durchgeführt um analysieren, ob es

eine Korrelation in der Ähnlichkeit der Gemeinschaftsprofile zwischen allen Proben

verschiedener Zeitpunkte, z.B. Woche eins versus Woche neun gibt. Weiterhin sollte

damit herausgefunden werden, ob es eine Korrelation zwischen den Profilen der

vorliegenden Bakteriengemeinschaft und der aktiven Bakteriengemeinschaft gibt.

Wie man in der grafischen Darstellung der MDS für die 16S rDNA (Abbildung 51) sieht

bilden, mit Ausnahme der Rhizosphärengemeinschaft, die mit VF39 WT (neun Wochen

Inkubation) inokuliert wurde, alle Versuchsansätze eigene Cluster. Wie man deutlich

sehen kann verlagern sich die Gemeinschaften der unterschiedlichen Versuchsansätze

abhängig ihrer Inkubationszeit. Die Gemeinschaft „vor Animpfung“ liegt weit außerhalb

der anderen Cluster. Die des Ansatzes IAA nach neun Wochen Inkubation ebenfalls.

Daraus kann man einen Unterschied in der Gemeinschaftsstruktur dieser beiden

Ansätze zu den anderen schließen, was bei IAA (neun Wochen Inkubation) auf einen

Einfluss der Behandlung mit IAA zurückzuführen sein könnte. Allerdings liegen die

Stress-Werte für die 16S rDNA über 0,2, was die Aussage dieses Ergebnisses

einschränkt. Die Stress-Werte für die Analyse der Aktivitätsprofile der

Rhizosphärengemeinschaft liegen über 0,3. Sie sind deswegen nicht aussagekräftig

(siehe Beispiele zur Datenanalyse, 2001).

Da die Stress Werte für den 3D Raum unter 0,3 liegen (16S rDNA: 0,183; 16S c-(r)DNA:

0,203) ist auszuschließen, dass die Proben rein zufällig angeordnet sind.

Der durchgeführte Manteltest zeigte, dass die Gemeinschaftsprofile für die 16S rDNA

Proben der Woche eins und neun sind korreliert; die Proben der anderen Zeitpunkte sind

nicht korreliert. Daraus kann man schließen, dass die Zusammensetzung der

bakteriellen Gemeinschaft nur in einem kurzen Zeitraum durch die Inokulation oder

Behandlung beeinflusst wird. Sie „pendelt“ sich wieder auf ihr normales Level ein.

Die Gemeinschaftsprofile für die 16S c-(r) DNA Proben der Woche eins und drei sind

korreliert, die Proben der anderen Zeitpunkte sind nicht korreliert.

Das zeigt, dass die Aktivität der Bakterien in der weiter entwickelten Rhizosphäre nach

neun Wochen der Aktivität innerhalb der Rhizosphäre zu Beginn ihrer Entwicklung nicht

ähnlich ist.

Da die Gemeinschaftsprofile für die rDNA und c-(r)DNA Proben der Wochen eins und

neun korrelieren könnte man daraus schließen, dass die in größerer Zahl vorliegenden

Bakterienphyllotypen auch in größerem Maß aktiv sind – und umgekehrt.


- 149 -

D.2.13.3 V 1 C- D: MDS Ergebnisse der Rhizoplane 16S rDNA und c-(r)DNA

VF39 WT

VF39(pHReGFPplac)

Kontrolle

VF39 WT

VF39 WTVF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

Kontrolle VF39 (pRD20)

IAA

IAA

VF39 (pHReGFPplac)

VF39(pHReGFPplac)

IAA

Dimension 1

Dim

ensi

on 2


MDS V1: Rhizoplane 16S c-(r)DNA

Dimension 1

Dim

ensi

on 2

MDS V1: Rhizoplane 16S rDNA


VF39 WTVF39

(pHReGFPplac)Kontrolle

VF39 WT

VF39 WTKontrolle

VF39 (pRD20)

KontrolleVF39 (pRD20)

IAA

IAA

VF39 (pHReGFPplac)

VF39(pHReGFPplac)IAA

VF39 (pRD20)

Abbildung 52: Rhizoplane 2-Dimensionaler MDS Plot für Versuchsansatz eins (9 Wochen Inkubation)

grün: Woche eins;

blau: Woche drei;

schwarz: Woche neun



Anhaltebedingungen:



Vierecke mit Kreuz:

Klassendurchschnitt der Gemeinschaftsprofile aller

Versuchsansätze zur korrespondierenden

Inkubationszeit

Wie man in grafischen Darstellung der MDS für die Rhizoplane (Abbildung 52) sehen

kann, clustern die Gemeinschaftsprofile der vorliegenden Bakterien, innerhalb der

Rhizoplane, nicht in Korrelation mit Behandlung oder der Zeit. Die Profile der 16S -(r)

DNA Proben bilden hingegen Cluster in Korrelation mit der Inkubationszeit.


Proben der Woche eins und neun, und der Woche drei und neun korrelieren; die Proben

(Woche eins und drei) korrelieren nicht. Die Gemeinschaftsprofile für die 16S c-(r) DNA

Proben sind alle nicht korreliert. Die Gemeinschaftsprofile für die rDNA und c-(r)DNA

Proben der Wochen eins bis neun sind nicht korreliert.


- 150 -

D.2.13.4 V 2 MDS Ergebnisse der Rhizosphäre 16S rDNA und c-(r)DNA

VF39 WT

Kontrolle

VF39 WT

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

VF39 (pBBRIAA)

VF39(pBBRIAA)

Dimension 1

Dim

ensi

on 2


MDS V2: Rhizosphäre 16S rDNA

VF39 WTKontrolle

VF39 WT

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

VF39 (pBBRIAA)

VF39(pBBRIAA)

Dimension 1

Dim

ensi

on 2


MDS V2: Rhizosphäre 16S c-(r)DNA

Abbildung 53: Rhizosphäre 2-Dimensionaler MDS Plot für Versuchsansatz 2 (10 Tage Inkubation) obere Grafik: 16s rDNA

untere Grafik: 16S c-(r) DNA

grün: drei Tage Inkubation

blau: zehn Tage Inkubation



Anhaltebedingungen:



Vierecke mit Kreuz:

Klassendurchschnitt der Gemeinschaftsprofile

aller Versuchsansätze zur korrespondierenden

Inkubationszeit

Wie man in der grafischen Darstellung der MDS für die 16S rDNA erkennen kann,

bilden, mit Ausnahme der Rhizosphärengemeinschaft, die mit VF39 (pBBRIAA) (zehn

Tage Inkubation) inokuliert wurde, alle Versuchansätze eigene Cluster. Das könnte der

Einfluss der Inokulation mit diesem Stamm sein. Wie man deutlich sehen kann,

verlagern sich die Gemeinschaften der unterschiedlichen Versuchsansätze abhängig

ihrer Inkubationszeit. Die anderen Versuchsansätze liegen alle recht weit auseinander.

Daraus lässt sich schließen, dass die Ähnlichkeit der verschiedenen Gemeinschaften

nicht sehr hoch ist (3D Stress liegt bei 0,173 und 0,157).


Proben der Tage drei und zehn sind nicht korreliert. Die Gemeinschaftsprofile für die

16S c-(r) DNA Proben der Tage drei und zehn sind korreliert.


- 151 -

Die Gemeinschaftsprofile für die rDNA und c-(r)DNA Proben nach Tag drei und Tag10

sind nicht korreliert.

D.2.13.5 V 2 MDS Ergebnisse der Rhizoplane 16S rDNA und c-(r)DNA

VF39 WT Kontrolle

VF39 WT

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

VF39 (pBBRIAA)

VF39(pBBRIAA)

Dimension 1

Dim

ensi

on 2


MDS V2: Rhizoplane 16S rDNA

VF39 WT

Kontrolle

VF39 WT

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

VF39 (pBBRIAA)

VF39(pBBRIAA)

Dimension 1

Dim

ensi

on 2


MDS V2: Rhizoplane 16S c-(r)DNA

Abbildung 54: Rhizoplane 2-Dimensionaler MDS Plot für Versuchsansatz 2 (10 Tage Inkubation) obere Grafik: 16s rDNA,

untere Grafik: 16S c-(r) DNA,

grün: drei Tage; blau: zehn Tage



Anhaltebedingungen:



Vierecke mit Kreuz:

Klassendurchschnitt der Gemeinschaftsprofile

aller Versuchsansätze zur

korrespondierenden

Inkubationszeit

Wie man in der grafischen Darstellung der MDS für die Rhizoplane erkennen kann,

bilden sich generell Cluster in Korrelation zur Inkubationszeit. Auffällig ist das

Gemeinschaftsprofil der mit VF39 pBBRIAA inokulierten Probe (16S rDNA, zehn Tagen),

dass nur wenig Ähnlichkeit mit den anderen Gemeinschaften zu diesem Zeitpunkt hat.

Das ist ein starker Hinweis auf einen möglichen Einfluss der Inokulation mit VF39

pBBRIAA.


- 152 -


Proben der Tage drei und zehn sind korreliert.

Die Gemeinschaftsprofile für die 16S c-(r) DNA Proben der Tage drei und zehn sind

nicht korreliert. Die Gemeinschaftsprofile für die rDNA und c-(r)DNA Proben nach Tag

drei sind nicht korreliert, aber nach Tag zehn.

D.2.13.6 V 3 MDS Ergebnisse der Rhizosphäre 16S rDNA und c-(r)DNA

Vor Animpfung

Kontrolle

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

Dimension 1

Dim

ensi

on 2


MDS V3: Rhizosphäre 16S rDNA und c-(r)DNA

Vor Animpfung

Kontrolle

VF39 (pRD20)


Abbildung 55: Rhizosphäre 2-Dimensionaler MDS Plot für Versuchsansatz 3 (10 Tage Inkubation) 16S c-(r) DNA: schwarz umrandete

Vierecke

grün: drei Tage Inkubation

blau: zehn Tage Inkubation



Anhaltebedingungen: Konvergenz= 0,00001/

Iterationen= 500


Wie man in Abbildung 55 sieht liegen die Punkte im MDS Plot, die die DGGE Profile der

Rhizosphärengemeinschaft bzw. der aktiven Rhizosphärenbakterien repräsentieren, in

zwei eindeutig getrennten Gruppen vor.

Da die Stress-Werte relativ niedrig sind (2D: 0,191; 3D: 0,099) lässt sich hier mit großer

Sicherheit sagen, dass die „Zusammensetzung“ der aktiven Bakterien sich von der

Zusammensetzung der vorhandenen Bakterien, hinsichtlich ihrer Abundanz und

Phylotypen unterscheidet. Das lässt sich allerdings anhand der Einschränkungen

hinsichtlich der PCR und DGGE-Methode erklären. Sie bevorzugt nur Bakterien, die in

größerer Menge vorliegen (Fromin, 2002).

Es ist kein offensichtlicher Einfluss der Inokulation mit VF39 (pRD20) zu sehen.


- 153 -


Dimension 1

Dim

ensi

on 2

MDS V4: Rhizosphäre 16S rDNA und c-(r)DNA

VF39 (pJProlA)

VF39 (pJPpCAT)

VF39 WT

Kontrolle

VF39(pJProlA)

VF39(pJPpCAT)

VF39 WT

Kontrolle

Abbildung 56: Rhizosphäre 2-Dimensionaler MDS Plot für Versuchsansatz 4 (12 Wochen Inkubation)

schwarz: 16s rDNA,

grün: 16S c-(r) DNA,



Anhaltebedingungen: Konvergenz= 0,00001/

Iterationen= 500


Wie man in Abbildung 56 sieht liegen die Punkte im MDS Plot, die die DGGE Profile der

Rhizosphärengemeinschaft bzw. der aktiven Rhizosphärenbakterien repräsentieren in

zwei eindeutig getrennten Gruppen vor. Der Versuchsansatz mit VF39 (pJProlA) liegt

relativ weit entfernt von den anderen 16S c-(r) DNA Versuchsansätzen. Daraus kann

man schließen, dass es einen Effekt der Inokulation mit VF39 (pJProlA) auf die

Aktivitätsstruktur innerhalb der Rhizosphärengemeinschaft nach zwölfwöchiger

Inkubation gegeben hat (3D Stress: 0,113). Doch aufgrund der Auswertung des DGGE-

Gels, in dem sichtbar wurde, dass für diese Probe die aufgetragene 16S rDNA-Menge

nicht optimal war, kann dieser Effekt ausgeschlossen werden.


- 154 -

D.2.14 Ergebnisse der weiteren bivariaten Manteltests

Im zusätzlichen bivariaten Manteltests sollte überprüft werden, ob es eine Korrelation

zwischen der durch GC-MS in der Rhizosphäre gemessenen IAA-Konzentration und der

Diversität, Anzahl der Bakteriengruppen oder Eveness der verschiedenen

Versuchsansätze gibt.

Tabelle 34: bivariater Manteltest

Versuchsansatz 1 Rhizosphäre 16S rDNA und 16S c-(r) DNA

Matrix A Matrix B r p p % IAA Konzentration

Diversität -0,09 0,79 79,29

IAA Konzentration

Anzahl der Banden 0,10 0,76 76,37

IAA Konzentration Eveness -0,17 0,64 63,63

IAA Konzentration Diversität 0,16 0,64 64,17

IAA Konzentration

Anzahl der Banden -0,32 0,38 38,05

IAA Konzentration Eveness 0,29 0,41 40,69

Versuchsansatz 2 Rhizosphäre 16S rDNA und 16S c-(r) DNA

Matrix A Matrix B r p p % IAA Konzentration Diversität -0,36 0,50 50,42

IAA Konzentration

Anzahl der Banden 0,32 0,62 62,36


IAA Konzentration Diversität -0,21 0,54 54,31

IAA Konzentration

Anzahl der Banden -0,47 0,35 35,42


schwarze Schrift: 16S rDNA, rote Schrift: 16S c-(r) DNA

Testinterpretation:

H0: Die Matrizen sind nicht korreliert.

Ha: Die Matrizen sind korreliert.

Da der berechnete p-Wert größer als das Signifikanz-Niveau alpha=0,05 ist,

kann die Null-Hypothese H0 bestätigt werden.

Der p-value wurde mittels der Verteilung der r(AB) geschätzt auf Basis von 10000

Permutationen berechnet.

Das Risiko die Null-Hypothese H0 zurückzuweisen, obwohl sie wahr ist, beträgt für den

ersten Fall p= 79,29%.


- 155 -

Nach Auswertung des bivariaten Manteltests konnte keine Korrelation zwischen IAA-

Konzentration und Diversität, Anzahl der Bakterienarten oder Eveness gefunden

werden. Allerdings ist zu bemerken, dass das Risiko H0 zurückzuweisen, bei

Untersuchung der Korrelation zwischen IAA-Konzentration und Anzahl der Banden

innerhalb der Struktur des Aktivitätsprofils der Rhizosphärenbakterien, am geringsten ist.

Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass es doch einen, wenn auch nur geringen,

Zusammenhang zwischen den aktiven Bakterien und der vorliegenden IAA-

Konzentration innerhalb der Rhizosphäre gibt.

D.2.15 Ergebnisse der Varianzanalyse

In der Varianzanalyse sollte untersucht werden, ob es einen Einfluss der Inokulation mit

den verschiedenen VF39-Stämmen bzw. der Behandlung mit IAA und der

Inkubationsdauer auf die Diversität der bakteriellen Gemeinschaft in der Rhizosphäre

gibt.

Für die Diversität der Rhizosphärenbakterien ist die Inkubationszeit ein signifikanter

Faktor. Weiterhin wird die Anzahl der Bakterien, die das Aktivitätsprofil der

Rhizosphärenbakterien bestimmt, sowohl von der Behandlung/ Inokulation als auch von

der Inkubationszeit beeinflusst. Die Abundanz der aktiven Bakterien wird hingegen nur

von der Inkubationszeit beeinflusst.

Bis auf diese Ausnahmen gibt es keinen signifikanten Einfluss der Inokulation/

Behandlung oder der Inkubationszeit auf die Diversität, Anzahl der Banden oder die

Eveness.


- 156 -

D.2.16 Zusammenfassung Ergebnisse und Diskussion Teil 2

Der Einfluss des gentechnisch veränderten Rhizobienstamms auf die vorhandene

bakterielle Gemeinschaft wurde durch die kultivierungsunabhängige DGGE-Methode

untersucht. Diese basiert auf der parallelen Extraktion von 16S rDNA und rRNA aus dem

Boden.

Das Profil der vorhandenen Bakterienarten in der Rhizosphäre und Rhizoplane wurde

mit dem der aktiven Bakterienarten verglichen. Weiterhin wurden die durch den

gentechnisch veränderten Rhizobienstamm bedingten Unterschiede im IAA-Gehalt der

Rhizosphäre durch GC-MS Analyse gemessen.

Nach Auswertung der Ergebnisse für die Versuchsansätze V1-4 steht fest, dass es

keinen anhaltenden Effekt einer Inokulation mit VF39 pRD20 auf die bakterielle

Gemeinschaft und die Struktur der aktiven bakteriellen Gemeinschaft innerhalb der

Rhizosphäre und Rhizoplane gibt. Dieses Resultat gilt nicht nur für die Beimpfung der

Wirtspflanze (V1, 2 und 4), sondern auch die der Nicht-Wirtspflanze (V3).

Bemerkenswerterweise zeigte die Inokulation mit VF39 pBBRIAA in Versuchsansatz V2

einen offensichtlichen Einfluss auf die bakterielle Gemeinschaft und ihre Aktivität.

Ein Grund dafür könnte die größere Stabilität des pBBRIAA-Plasmids im Gegensatz zum

pRD20-Plasmid sein, vermutlich bedingt durch die geringere metabolische Belastung der

Rhizobien (siehe Analyse der Plasmidstabilität). Die Inokulation mit VF39 pBBRIAA und

VF39 pRD20 beeinflusste in diesem Versuch ebenfalls die Zusammensetzung der

Wurzelexsudate.

Im Langzeitversuchsansatz V4 ist kein Effekt einer Inokulation mit den verschiedenen

gentechnisch veränderten VF39 Stämmen auf die Zusammensetzung der bakteriellen

Gemeinschaft oder der vorherrschenden Struktur innerhalb der Aktivität dieser Bakterien

zu erkennen.

Die Analyse der Diversität in allen Versuchsansätzen zeigt keinen statistisch

signifikanten Zusammenhang zwischen der Inokulation oder Inkubationszeit und der

Diversität innerhalb der 16S rDNA und c-(r)DNA Profile der Rhizosphäre und

Rhizoplane.

Ein Effekt der Behandlung mit IAA auf die bakterielle Gemeinschaft der Rhizosphäre ist

nicht auszuschließen. Die statistische Auswertung verdeutlichte hier einen signifikanten

Effekt der Behandlung mit IAA auf die Diversität, Anzahl der bakteriellen Gruppen und

Abundanz innerhalb der aktiven bakteriellen Gemeinschaft der Rhizosphäre. Der


- 157 -

Einfluss der IAA-Behandlung konnte ebenfalls in der zusätzlich durchgeführten tRFLP-

Analyse und der ARISA Analyse von André Haselier gezeigt werden.

Die MDS Analysen der Gemeinschaftsprofile zeigen ebenfalls einen Effekt der IAA-

Behandlung auf die bakterielle Gemeinschaft.

Auch ist ein möglicher Einfluss der Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) auf die

Gemeinschaft der Rhizoplane sichtbar.

Nach Auswertung des bivariaten Manteltests konnte allerdings keine Korrelation

zwischen IAA-Konzentration und der Diversität, Anzahl der Bakterienarten und der

Eveness gefunden werden.

Die Varianzanalyse zeigte, dass die Inkubationszeit für die Diversität der

Rhizosphärenbakterien ein eindeutig signifikanter Faktor ist. Die Anzahl der Bakterien,

die das Aktivitätsprofil der Rhizosphärenbakterien bestimmt, wird sowohl von der

Behandlung/ Inokulation als auch von der Inkubationszeit beeinflusst. Die Abundanz der

aktiven Bakterien wird hingegen nur von der Inkubationszeit beeinflusst.

Die molekularbiologisch ermittelten Ergebnisse stehen allerdings im Gegensatz zu den

Ergebnissen der GC-MS Messungen der IAA in der Rhizosphäre. Der IAA Gehalt war für

alle Rhizosphären-Ansätze etwa gleich. Da IAA nicht sehr stabil ist, könnte allerdings in

der Rhizosphäre oder bei der Probenaufbereitung ein Teil abgebaut worden sein.

Die phänotypischen Veränderungen der Wurzelknöllchen und der Wurzeln lassen nicht

eindeutig auf die Inokulation mit den gentechnisch veränderten Rhizobienstämmen oder

die Behandlung mit IAA schließen.

Abschließend kann man sagen, dass sich in den durchgeführten Versuchen kein

einheitliches Bild ergibt. Es ist lediglich eine starke Tendenz zu sehen, dass die

Behandlung mit IAA einen Effekt auf die gesamte bakterielle Gemeinschaft hat.

Ein Einfluss der gentechnisch veränderten Stämme auf die bakterielle Gemeinschaft im

Boden – und damit die Umwelt – kann nicht vollständig ausgeschlossen werden.

Ein positiver Einfluss der Inokulation mit den IAA-synthetisierenden Stämmen auf die

Wirtspflanzen hinsichtlich ihrer Größe und ihres Ertrags, wurde in keinem der Versuche

sichtbar.

Zusammenfassung

- 158 -

E Zusammenfassung und Ausblick

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss eines gentechnisch veränderten Auxin

produzierenden Rhizobienstammes auf die bakterielle Gemeinschaft im Boden

untersucht.

Dazu sollte ein Detektionsverfahren, mit dem sich horizontaler Gentransfer ohne

Kultivierung der Bakterien nachweisen lässt, etabliert werden.

Dabei wurde festgestellt, dass die lacI-Gene, die die Expression des zur Detektion des

HGT verwendeten eGFP im Donorstamm reprimieren, ebenfalls transferiert wurden. Aus

diesem Grund wurde in einigen Rezipienten ebenfalls die Expression des eGFP

unterdrückt.

Damit der Transfer detektiert werden kann, ist es notwendig diese Gene stabil ins

Chromosom zu integrieren.

Der Transfer der verwendeten IAA-synthetisierenden Plasmide ließ sich in die Mehrheit

der getesteten Bakterien (Gram- und Gram+) nachweisen.

In einigen Stämmen war die Expression des eGFP jedoch nicht zu sehen. In den

analysierten Kolonien störte die starke Pigmentierung. Die Expression in „nicht

kultivierten“ Einzelzellen ist von der Stoffwechselaktivität abhängig, weswegen das

eGFP in metabolisch inaktiven Rezipientenzellen nicht detektiert werden konnte.

Zusätzlich dazu besitzt der Boden viele fluoreszierende Partikel und die Bakterien liegen

oft an Bodenpartikel assoziiert vor. Aus diesem Grund war es im Rahmen dieser Arbeit

nicht möglich, das Detektionssystem, das ursprünglich für aquatische Systeme

entwickelt wurde, auf das Ökosystem Boden zu übertragen.

Die Untersuchung des möglichen Einflusses, den der gentechnisch veränderte

Rhizobienstamm auf die bakterielle Gemeinschaft im Boden ausübt, wurde mittels

DGGE-Analyse der 16S rDNA und 16S c-(r)DNA durchgeführt.

Ein entscheidender Faktor für die Zusammensetzung der Bakterien und ihre Aktivität ist

die Zeit. Sie hat einen signifikanten Einfluss auf die Diversität und Abundanz der aktiven

Rhizosphärengemeinschaft. Die Anzahl der Phylotypen innerhalb der aktiven

Zusammenfassung

- 159 -

Rhizosphärengemeinschaft wird nicht nur von der Inkubationszeit, sondern auch von der

Behandlung beeinflusst. Abschließend wurden allerdings keine anhaltenden

Veränderungen in der Zusammensetzung und Diversität der Bakteriengemeinschaft und

ihrer Aktivitätsstruktur durch die modifizierten Rhizobienstämme festgestellt.

Da die Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaft stark von der Pflanze und von

der Art des Bodens abhängt, ist es empfehlenswert, sowohl weitere Pflanzen als auch

verschiedene Böden zu testen, um dann eine generelle Aussage über einen möglichen

Effekt der gentechnisch veränderten Rhizobienstämme treffen zu können.

Weiterhin ist es möglich, dass durch den raschen Verlust des pRD20 Plasmids in den

veränderten Stämmen nur am Anfang des Experiments Veränderungen in der

Bakteriengemeinschaft festgestellt werden konnten. Die stabile Expression der IAA-

Synthese Gene könnte durch die Integration ins Chromosom der Rhizobien

gewährleistet werden. Es ist allerdings fraglich, ob eine einzelne Kopie der Gene

ausreichend ist, um die IAA-Synthese zu verändern.

Die Analyse des IAA-Gehalts in der Rhizosphäre der Pflanzen ist durch die Inokulation

nicht beeinflusst worden. Auch gab es keine signifikante Veränderung hinsichtlich des

Pflanzen- und Wurzelwachstums.

Die eingehende Untersuchung der Wurzelknöllchen, die von den gentechnisch

veränderten Stämmen gebildet wurden, sowohl auf den IAA-Gehalt als auch auf die

morphologische Struktur der Knöllchen und ihre Nitrogenase-Aktivität hin, scheint mir

vielversprechend.

Die Sequenzierung der speziellen Banden ergab ein eher allgemeines Bild der

vorliegenden Bakteriengemeinschaft. Dies weist darauf hin, dass es in diesem Fall

besser ist, die bakterielle Gemeinschaft mit speziellen Primern, wie z.B. nifH in mehrere

Gruppen zu unterteilen und diese dann unabhängig voneinander auf Veränderungen zu

untersuchen.

Literatur

- 160 -

F Literatur

Akkermans, A. D. L. (1994) Application of bacteria in soils: problems and pitfalls. FEMS

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G Anhang

G.1 Shannon Diversitätsanalyse

Tabelle 35 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V1 Rhizosphäre

Rhizosphäre 16S RDNA 16S c-(r)DNA

Ansatz Shannon Index H s Eveness Shannon Index H s Eveness

vor Animpfung 3,16 42 0,85 2,40 41 0,65

IAA 10-6 2,72 38 0,75 3,56 55 0,89

IAA 10-6 3,16 40 0,86 3,30 53 0,83

IAA 10-6 1,77 37 0,49 3,19 62 0,77

Kontrolle 3,29 46 0,86 3,47 53 0,87

Kontrolle 2,34 32 0,67 3,40 53 0,86

Kontrolle 2,99 55 0,75 3,19 59 0,78

VF39 (pHReGFPplac) 3,47 47 0,9 3,51 54 0,88

VF39 (pHReGFPplac) 2,96 39 0,81 3,05 44 0,81

VF39 (pHReGFPplac) 3,16 53 0,8 3,31 54 0,83

VF39 (pRD20) 3,08 39 0,84 3,20 53 0,80

VF39 (pRD20) 3,26 48 0,84 3,10 45 0,81

VF39 (pRD20) 3,21 50 0,82 3,24 54 0,81

VF39 WT 2,94 37 0,81 3,57 52 0,90

VF39 WT 3,06 40 0,83 3,29 47 0,85

VF39 WT 3,25 44 0,86 3,02 54 0,81

s: Anzahl der Phylotypen, Eveness: Abundanz der Phylotypen Tabelle 36 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V1 Rhizoplane

Rhizoplane 16S RDNA 16S c-(r)DNA

Ansatz Shannon Index H s Eveness Shannon

Index H s Eveness

vor Animpfung 1,59 14 0,6 2,82 30 0,83

IAA 10-6 2,13 26 0,65 3,03 41 0,82

IAA 10-6 2,09 26 0,64 3,18 39 0,87

IAA 10-6 2,42 32 0,7 3,14 33 0,9

Anhang

- 184 -


Kontrolle 1,66 22 0,54 2,92 33 0,84

Kontrolle 2,42 27 0,74 3 41 0,81

Kontrolle 2,43 38 0,67 3,54 53 0,89

VF39 (pHReGFPplac) 2,48 28 0,74 3,6 39 0,98

VF39 (pHReGFPplac) 2,34 30 0,69 3,2 41 0,85

VF39 (pHReGFPplac) 1,64 23 0,52 3,33 47 0,86

VF39 (pRD20) 1,63 24 0,51 3,14 43 0,84

VF39 (pRD20) 2,37 29 0,7 3,17 41 0,85

VF39 (pRD20) 2,32 34 0,66 3,31 47 0,86

VF39 WT 2,16 26 0,66 3,2 39 0,87

VF39 WT 2,16 28 0,65 3,37 45 0,89


Index H s Eveness

VF39 WT 2,33 34 0,66 3,52 53 0,89

s: Anzahl der Phylotypen, Eveness: Abundanz der Phylotypen Tabelle 37 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V2 Rhizosphäre


Ansatz Shannon Index H

s Eveness Shannon Index H

s Eveness

vor Animpfung 1,33 42 0,36 1,02 37 0,28

Kontrolle 1,97 44 0,52 0,69 49 0,18

Kontrolle 2,51 51 0,64 2,25 48 0,58

WT 1,31 50 0,33 1,52 47 0,40

WT 1,65 47 0,43 2,29 50 0,58

pRD20 1,98 48 0,51 2,26 45 0,59

pRD20 1,53 48 0,40 2,55 49 0,65

pBBRIAA 2,96 47 0,77 2,75 46 0,72

pBBRIAA 2,37 51 0,60 2,38 43 0,63

s: Anzahl der Phylotypen, Eveness: Abundanz der Phylotypen

Anhang

- 185 -

Tabelle 38 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V2 Rhizoplane



Index H s Eveness

vor Animpfung 2,29 41 0,62 2,83 49 0,73

Kontrolle 3,03 48 0,78 3,14 46 0,82

Kontrolle 2,70 47 0,70 3,27 49 0,84

WT 3,02 47 0,78 2,97 50 0,76

WT 3,06 54 0,77 3,07 47 0,80

pRD20 3,20 52 0,81 3,00 46 0,78

pRD20 2,60 44 0,69 3,33 56 0,83

pBBRIAA 2,98 41 0,80 2,64 41 0,71

pBBRIAA 3,18 53 0,80 3,31 50 0,85

s: Anzahl der Phylotypen, Eveness: Abundanz der Phylotypen Tabelle 39 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V3 Rhizosphäre



Index H s Eveness

vor Animpfung 3,17 55 0,79 2,99 34 0,85

Kontrolle 3,32 54 0,83 2,67 32 0,77

Kontrolle 3,35 51 0,85 2,77 31 0,81

pRD20 3,31 52 0,84 2,7 31 0,79

pRD20 3,26 48 0,84 2,82 32 0,81

s: Anzahl der Phylotypen, Eveness: Abundanz der Phylotypen Tabelle 40 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V3 Rhizoplane



Index H s Eveness

vor Animpfung 2,50 33 0,71 2,52 30 0,74

Kontrolle 2,12 29 0,63 2,38 37 0,66

Kontrolle 2,09 38 0,58 1,92 44 0,51

pRD20 2,65 37 0,73 3,08 43 0,82

pRD20 2,44 34 0,69 2,29 36 0,64


Anhang

- 186 -

Tabelle 41 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V4 Rhizosphäre



Index H s Eveness

Kontrolle 3,35 38 0,92 3,14 37 0,87

WT 3,52 50 0,9 3,32 42 0,89

pJPpCAT 3,57 53 0,9 3,28 37 0,91

pJProlA 3,31 37 0,92 3,24 33 0,93

Tabelle 42 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V4 Rhizoplane



Index H s Eveness

Kontrolle 3,32 39 0,88 2,95 33 0,84

WT 3,38 52 0,86 2,82 34 0,8

pJPpCAT 3,33 50 0,85 2,97 34 0,84

pJProlA 2,39 22 0,77 2,78 29 0,82


Anhang

- 187 -

G.2 Auswertungen der tRFLP-Analysen des Versuchsansatzes V1

Pearson correla tion [6.4%-57 .9%]ILS600

100

50

ILS600

50.0

0

100

.00

150.

00

200.

00

250.

00

300

.00

350

.00

400.

00

450

.00

500.

00

550.

00

600.

00

650.0

0

700.

00

800.

00

900

.00

1000

1100

1200

1300

1400

bp

13.03.DNA (-)

17.03.DNA (Auxi

15.03.DNA (RD2

16.03.DNA (WT)

Pearson co rre lation [6 .4%-57.9%]ILS600

100

500

ILS600

50.0

0

80.0

0

150.

00

200

.00

250.0

0

300.

00

350.

00

400

.00

450.

00

500.

00

550.

00

600.

00

650.

00

700.

00

750.

00

900.0

0

1000

1100

1200

1300

1400

bp

15.05.DNA (

17.05.DNA (

18.05.DNA (

19.05.DNA (

VF39 WT

Kontrolle

VF39 WT

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

IAA

IAA

%

%

Rhizosphäre V1 16S (r)DNA nach Woche 1

Rhizosphäre V1 16S (r)DNA nach Woche 9

Abbildung 57: tRFLP-Analyse der 16S rDNA der Rhizosphäre Versuchsansatz 1


100

908070

ILS600

50.0

0

100.

00

150

.00

200.

00

250.

00

300.0

0

350.0

0

400.

00

450.

00

500.

00

550.0

0

700.0

0

800.

00

900.

00

1000

1100

1400

bp

15.03.DNA Rp

17.03.DNA Rp

16.03.DNA Rp

13.03.DNA (-)


100

806040

ILS600

100.

00

150.

00

200.

00

250.

00

300.

00

350.

00

400.

00

450.

00

500.

00

550.

00

600.

00

650.0

0

800.

00

900.

00

1000

110

0

1200

1300

bp

15.05.DNA Rp.

17.05.DNA Rp.

18.05.DNA Rp.

19.05.cDNA .

VF39 WT

Kontrolle

VF39 WT

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

IAA

IAA

Rhizoplane V1 16S (r)DNA nach Woche 1

Rhizoplane V1 16S (r)DNA nach Woche 9

Abbildung 58: tRFLP-Analyse der 16S rDNA der Rhizoplane Versuchsansatz 1

Anhang

- 188 -

Pearson correlation [6.4%-5 7.9%]ILS600

100

908070

ILS600

50.0

0

100.0

0

150

.00

200

.00

250.0

0

300.

00

350.

00

400.

00

450.

00

500

.00

550.0

0

600.0

0

700.

00

800

.00

900.

00

1000

1100

1200

1400

bp

17.05.cDNA (RD.

18.05.cDNA (WT)

15.05.cDNA (-)

19.05.cDNA (Auxi.

Pe arson correlation [6.4%-57.9%]ILS600

100

90807060

ILS600

50.0

0

80.0

0

150.

00

200

.00

250.0

0

300.

00

350

.00

400.

00

450.

00

500.

00

550

.00

600.

00

650

.00

700.

00

750

.00

900.

00

100

0

110

0

1200

130

0

140

0

bp

15.03.cDNA (RD

16.03.cDNA (W

17.03.cDNA (Au

13.03.cDNA (-)

VF39 WT

Kontrolle

VF39 WT

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

IAA

IAA

Rhizosphäre V1 16S c-(r)DNA nach Woche 1

Rhizosphäre V1 16S c-(r)DNA nach Woche 9

Abbildung 59: tRFLP-Analyse der 16S c-(r)DNA der Rhizosphäre Versuchsansatz 1


100

9080706050

ILS600

50.0

0

100.0

0

150.

00

200.0

0

250.

00

300.

00

350.

00

400.

00

450.

00

500.

00

550.

00

600.

00

700.

00

800.

00

900.

00

1000

1100

1200

1400

bp

15.05.cDNA Rp (-

18.05.cDNA Rp (W

17.05.cDNA Rp (R

19.05.cDNA Rp (A


100

806040

ILS600

100.0

0

150.

00

200.

00

250.0

0

300.

00

350.

00

400.

00

450.0

0

500.

00

550.

00

600.0

0

650.

00

700.

00

800.

00

900.

00

1000

1100

1200

1300

1400

bp

15.03.cDNA R

16.03.cDNA R

17.03.cDNA R

13.03.cDNA (-

VF39 WT

Kontrolle

VF39 WT

VF39 (pRD20)

Kontrolle

VF39 (pRD20)

IAA

IAA

Rhizoplane V1 16S c-(r)DNA nach Woche 1

Rhizoplane V1 16S c-(r)DNA nach Woche 9

Abbildung 60: tRFLP-Analyse der 16S c-(r)DNA der Rhizoplane Versuchsansatz 1

Anhang

- 189 -

GC-MS Analyse

Abbildung 61: beispielhafte Darstellung eines Ergebnisses der GC-MS Analyse

Dazu wurde der IAA-Standard in die GC-MS injiziert. Im oberen Teil ist der für die Indol-3-Essigsäure

charakteristische Peak zu sehen. Im unteren Teil sind die gebildeten Fragmentionen (m/z 319, 202) der IAA

und ihr „Mengen“- Verhältnis zu sehen.

Anhang

- 190 -

Plasmidkarten: pRD20 und pBBRIAA

pBBRIAA7776 bps

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

NarI

SspI

NotIXbaIBamHIEcoRIEcoRVHindIII

StuIEcoRI

EcoRVBglIINcoI

BamHIXbaISphI

HindIIIHindIII

EcoRV

BamHI

Acc65IEcoRIEcoRI

EcoRV

BglIIEcoRV

NotI

tms2

iaaM

rolA

gentamicinmob site

pRD209707 bps

2000

40006000

8000

NotINarI

SspI

Ecl136IISacINotI

XbaIBamHI

PstIEcoRI

EcoRVStuI

EcoRINheI

EcoRVBglII

NcoIBamHI

XbaIPstI

SphI

PstI

EcoRV

BamHI

Acc65IKpnIEcoRI

DraI

spec

tms2

iaaM

prolApCAT

mob site

Abbildung 62: Plasmidkarte pBBRIAA

Abbildung 63: Plasmidkarte pRD20

Anhang

- 191 -

G.3 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Donorzelle ............................................................................................................... - 12 - Abbildung 2: Transkonjugand ...................................................................................................... - 12 - Abbildung 3: Synthese von Indol-3-Essigsäure ........................................................................... - 17 - Abbildung 4: schematischer Aufbau der sterilen Mikrokosmen ................................................... - 35 - Abbildung 5: Plasmidkarte pk19gabTgenta1lacI.......................................................................... - 40 - Abbildung 6: Plasmidkarte pJP2plac............................................................................................ - 41 - Abbildung 7: pJPeGFPplac .......................................................................................................... - 41 - Abbildung 8: pJPdsRedplac ......................................................................................................... - 41 - Abbildung 9: pRD20dsRedplac .................................................................................................... - 42 - Abbildung 10: pHReGFPGUSplac ............................................................................................... - 42 - Abbildung 11: pHReGFPplac ....................................................................................................... - 42 - Abbildung 12: pHRdsRedplac ...................................................................................................... - 42 - Abbildung 13: Phylogramm der verwendeten Bakterienstämme................................................. - 77 - Abbildung 14: PCR eGFP ............................................................................................................ - 80 - Abbildung 15: PCR lacI ................................................................................................................ - 80 - Abbildung 16: Eckhardt-Lyse der R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden .................................. - 82 - Abbildung 17 A-C: Eckhardt Lyse mit anschließender Southern Hybridisierung......................... - 83 - Abbildung 18 a-b: Mikroskopische Detektion grün-fluoreszierender Einzelzellen ....................... - 88 - Abbildung 19: Plasmidstabilität pRD20 in VF39 .......................................................................... - 97 - Abbildung 20: Wachstum der Erbse bei verschiedenen Auxinkonzentrationen ........................ - 101 - Abbildung 21: IAA Synthese in vitro........................................................................................... - 101 - Abbildung 22: DGGE-Gel für die16S rDNA V1 .......................................................................... - 104 - Abbildung 23: DGGE-Gel für die16S c-(r)DNA V1..................................................................... - 106 - Abbildung 24: Shannon Diversitätsanalyse für Versuchsansatz V1 .......................................... - 109 - Abbildung 25: DGGE-Gel für die 16S rDNA V1 ......................................................................... - 111 - Abbildung 26: DGGE-Gel für die 16S c-(r)DNA V1.................................................................... - 113 - Abbildung 27 Shannon Diversitätsanalyse für Versuchsansatz V1 ........................................... - 115 - Abbildung 28: DGGE-Gel für die16SrDNA und c-(r)DNA V2..................................................... - 118 - Abbildung 29:DGGE-Gel für die 16SrDNA und c-(r)DNA V2..................................................... - 119 - Abbildung 30: Diversitätsanalyse ............................................................................................... - 121 - Abbildung 31: Diversitätsanalyse ............................................................................................... - 121 - Abbildung 32: DGGE für 16SrDNA und c-(r)DNA V3 ................................................................ - 123 - Abbildung 33:DGGE für 16SrDNA und c-(r)DNA V3 ................................................................. - 124 - Abbildung 34: Diversitätsanalyse Rhizosphäre V3 .................................................................... - 126 - Abbildung 35: Diversitätsanalyse Rhizoplane V3 ...................................................................... - 126 - Abbildung 36: Wachstumskurve der Einzelteile einer Erbsenpflanze (Geisler, 1988)............... - 128 - Abbildung 37:DGGE-Gel für die 16SrDNA und c-(r)DNA V4..................................................... - 129 - Abbildung 38: Diversitätsanalyse Rhizosphäre V4 .................................................................... - 131 - Abbildung 39: Diversitätsanalyse Rhizoplane V4 ...................................................................... - 131 -

Anhang

- 192 -

Abbildung 40: Versuchsansatz 1 IAA Konzentration in der Rhizosphäre .................................. - 132 - Abbildung 41: Versuchsansatz 2 IAA Konzentration in der Rhizosphäre .................................. - 134 - Abbildung 42: Versuchsansatz 3 IAA Konzentration in der Rhizosphäre .................................. - 135 - Abbildung 43: Versuchsansatz 4: IAA Konzentration in der Rhizosphäre................................. - 136 - Abbildung 44: Phylogenetischer Baum sequenzierter DGGE Banden ...................................... - 139 - Abbildung 45: Wurzelknöllchen nach Inokulation mit VF39 WT ................................................ - 144 - Abbildung 46: Wurzelknöllchen nach Inokulation mit VF39 (pRD20) ........................................ - 144 - Abbildung 47: Wurzelknöllchen nach Inokulation mit VF39 (pJPpCAT) .................................... - 144 - Abbildung 48: Wurzelknöllchen nach Inokulation mit VF39 (pJProlA)....................................... - 144 - Abbildung 49: Wurzelknöllchen nach Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) .................................... - 145 - Abbildung 50: Verändertes Erscheinungsbild der Wurzeln........................................................ - 146 - Abbildung 51: Rhizosphäre MDS V1.......................................................................................... - 147 - Abbildung 52: Rhizoplane MDS V1............................................................................................ - 149 - Abbildung 53: Rhizosphäre MDS V2.......................................................................................... - 150 - Abbildung 54: Rhizoplane MDS V2............................................................................................ - 151 - Abbildung 55: Rhizosphäre MDS V3.......................................................................................... - 152 - Abbildung 56: Rhizosphäre MDS V4.......................................................................................... - 153 - Abbildung 57: tRFLP-Analyse der 16S rDNA der Rhizosphäre Versuchsansatz 1 ................... - 187 - Abbildung 58: tRFLP-Analyse der 16S rDNA der Rhizoplane Versuchsansatz 1 ..................... - 187 - Abbildung 59: tRFLP-Analyse der 16S c-(r)DNA der Rhizosphäre Versuchsansatz 1.............. - 188 - Abbildung 60: tRFLP-Analyse der 16S c-(r)DNA der Rhizoplane Versuchsansatz 1................ - 188 - Abbildung 61: beispielhafte Darstellung eines Ergebnisses der GC-MS Analyse..................... - 189 - Abbildung 62: Plasmidkarte pBBRIAA ....................................................................................... - 190 - Abbildung 63: Plasmidkarte pRD20 ........................................................................................... - 190 -

G.4 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: weiteres Material ......................................................................................................... - 20 - Tabelle 2: verwendete Kits........................................................................................................... - 21 - Tabelle 3: verwendete Geräte...................................................................................................... - 21 - Tabelle 4: verwendete Plasmide .................................................................................................. - 22 - Tabelle 5: verwendete Bakterienstämme..................................................................................... - 23 - Tabelle 6: Antibiotikazusätze für die Nährmedien........................................................................ - 26 - Tabelle 7: weitere Zusätze ........................................................................................................... - 26 - Tabelle 8 und 9: Zusammensetzung TfBI und TfBII Puffer.......................................................... - 28 - Tabelle 10: Pflanzennodulationsmedium (nach Rolfe et al., 1980) ............................................. - 37 - Tabelle 11: Bodenparameter........................................................................................................ - 38 - Tabelle 12: TA-Puffer (50x).......................................................................................................... - 46 - Tabelle 13: TB Puffer 5x .............................................................................................................. - 48 - Tabelle 14: Sondenherstellung .................................................................................................... - 51 -

Anhang

- 193 -

Tabelle 15: PCR Programm für die Sondenherstellung............................................................... - 51 - Tabelle 16: Lösungen für den Antikörpernachweis...................................................................... - 54 - Tabelle 17: RedTaq-Ready Mix ................................................................................................... - 59 - Tabelle 18: 16S PCR Mix............................................................................................................. - 59 - Tabelle 19: 16S PCR.................................................................................................................... - 60 - Tabelle 20: Stammlösungen PAA ................................................................................................ - 62 - Tabelle 21: TAE Puffer 50x .......................................................................................................... - 62 - Tabelle 22: Lösungen für die Silberfärbung ................................................................................. - 63 - Tabelle 23: DNA-Elutionspuffer.................................................................................................... - 65 - Tabelle 24: 16S PCR Programm für die tRFLP ........................................................................... - 67 - Tabelle 25: Verwendete Parameter für die GC-MS Analyse ....................................................... - 70 - Tabelle 26: Computersoftware zur Auswertung........................................................................... - 74 - Tabelle 27: Transfer auf Nitrocellulosefiltern ............................................................................... - 78 - Tabelle 28: HGT in sterilem und unsterilem Boden ..................................................................... - 85 - Tabelle 29: Vergleich der Transferfrequenzen durch KBE versus Mikroskopischer Auswertung- 90 - Tabelle 30: Transfer in Mikrokosmen........................................................................................... - 92 - Tabelle 31: Plasmideigenschaften – IAA Synthese ................................................................... - 137 - Tabelle 32: Sequenzierte DGGE Banden .................................................................................. - 140 - Tabelle 33: Pflanzenwachstum mit unterschiedlicher Inokulation in Vermiculit......................... - 142 - Tabelle 34: bivariater Manteltest ................................................................................................ - 154 - Tabelle 35 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V1 Rhizosphäre............................................... - 183 - Tabelle 36 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V1 Rhizoplane................................................. - 183 - Tabelle 37 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V2 Rhizosphäre............................................... - 184 - Tabelle 38 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V2 Rhizoplane................................................. - 185 - Tabelle 39 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V3 Rhizosphäre............................................... - 185 - Tabelle 40 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V3 Rhizoplane................................................. - 185 - Tabelle 41 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V4 Rhizosphäre............................................... - 186 - Tabelle 42 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V4 Rhizoplane................................................. - 186 -

Anhang

- 194 -

G.5 Abkürzungsverzeichnis

verwendete Abkürzungen

% (v/v) Volumenprozent (volume per volume)

% (v/w) Gewichtsprozent (volume per weight)

(v/v) Volumenanteil

(w/v) Gewichtsanteil

° C Grad Celsius

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

A Adenin

A. dest destilliertes Wasser

aacC1 Gentamycinresistenzgen

Ap Ampicillin

aph(3’)-Iia Kanamycin-/Neomycinresistenzgen

APS Ammonium-persulfat

ARISA Automated ribosomal intergenic spacer amplification

ATG Startkodon

ATP Adenosintriphosphat

BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat (p-Toluidin-Salz)

bla Ampicillinresistenzgen

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bp Basenpaare

bv. Biovarietät

C Cytosin

ca. Circa

c-(r)DNA Komplementäre DNA

CIA Chloroform-Isoamylalkohol

cm Zentimeter

CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid

DDT Dithiothreitol

DEPC Diethylpyrocarbonat

DGGE denaturing gradient gel electrophoresis

DIG Digoxigenin

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonucleinsäure

DNase Deoxyribonuclease

dNTP Desoxynukleosid-Triphosphate

dsDNA Doppelsträngige DNA

dsRed „red fluorescent protein“

Anhang

- 195 -


DTT Dithiothreitol (Reduktionsmittel)

dTTP Desoxythmidintriphosphat

dUTP Desoxyuraciltriphosphat

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

et al. Und andere

EtBr Ethidiumbromid

EtOH Ethanol

g Gramm

G Guanin

gabC/gabR Regulatorgen des gab Operons

gabD Strukturgen der Succinatsemialdeyd

GFP green fluorescent protein”

GUS β-Glukuronidase

h Stunde

H2O Wasser

IPTG Isopropylthiogalactosid

kb Kilobase(n)

Km Kanamycin

l Liter

lacZ Strukturgen der β-Galactosidase

LB Luria Broth

log logarithmisch

Lsg. Lösung

M Molar

m Meter

MCS “multiple cloning site”

mg Milligramm

min Minute

ml Milliliter

mob Siehe oriT

mRNA messenger-RNA

MSTFA N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide

NBT Nitroblau-Tetrazolium-Salz

NCBI National Center for Biotechnology Information

ng Nanogramm

nm Nanometer

nM Nanomolar

Nm Neomycin

Anhang

- 196 -


Nx Nalidixinsäure

o.D. Optische Dichte

ORF “open reading frame”

oriT Transferstartpunkt der Konjugation

oriV Replikationsstartpunkt

PAA Polyacrylamid

parCBADE Stabilitätsfaktor von RK2

PCR Polymerasekettenreaktion

pH negativer dekadischer Logarithmus der [H+]

PNPG 4-Nitrophenyl-β-D-glucuronid R resistent

RBS Ribosomenbindungsstelle

rDNA ribosomale DNA

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuclease

rpm Umdrehungen „rounds per minute“

rRNA Ribosomale RNA

RT Reverse Transcriptase

SDS Natriumdodecylsulfat

sek. Sekunden

Sm Streptomycin

T Thymin

Tab. Tabelle

TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer

TBE Tris-Borsäure-EDTA- Puffer

Tc Tetracyclin

TE Tris-EDTA-Puffer

TEMED N,N,N´,N´-Tetramethyl-ethyldiamin

tetAR Tetracyclinresistenzgene

TGA,TAA,TAG Stopkodons

Tm Schmelztemperatur

trfA siehe oriV

tRFLP terminal restriction fragment length polymorphism

Tris Tris-(Hydroxymethyl)-Ammonium

TY-Medium Tryptone Yeast-Medium

U Enzymeinheit (Unit)

uidA Strukturgen der β-Glucuronidase

UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean

Anhang

- 197 -


UV ultraviolettes Licht

V Versuch

WT Wildtyp

X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid

X-Gluc 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronid

z.B. Zum Beispiel

Danksagung

- 198 -

H Danksagung

Bei Frau Prof. Dr. U. B. Priefer möchte ich mich für die Bereitstellung des Themas und

die Erstellung des Erstgutachtens bedanken. Prof. Dr. A. Schäffer danke ich für die

Erstellung des Zweitgutachtens.

Vielen Dank auch an Prof. Dr. A. Slusarenko für seine freundliche Hilfe und die

konstruktiven Gespräche über Pflanzenhormone und „Bonsai- Erbsen“.

Mein ganz besonderes Dankeschön geht an Ina Horst. Ohne dich hätte ich diese Zeit

wohl kaum gut überstanden!

Charlotte Lahaye danke ich ebenfalls ganz besonders für Ihre Unterstützung und die

Wochenend-Korrekturen.

Jürgen Prell danke ich ganz herzlich für die Einführung und die Unterstützung zu Beginn

dieser Arbeit.

Bei Beata Bulawa möchte ich mich für die Unterstützung während der zweiten Phase

dieser Arbeit und für die angenehme Begleitung nach Kapstadt sehr herzlich bedanken.

André Haselier danke ich für die gute Zusammenarbeit. Wie hätte ich mich ohne dich

bloß durch diese ganzen Proben durchkämpfen sollen?

Bei Melanie Sapp möchte ich mich für Ihre Unterstützung beim Schreiben dieser Arbeit

und besonders für die Einführung und Hilfe bei der „Multivariaten Statistik“ ganz herzlich

bedanken.

Bei Herrn Jahnke und Peter Klauth bedanke ich mich für die Unterstützung bei der

Fluoreszenzmikroskopie.

Für das Korrigieren dieser Arbeit und die hilfreiche konstruktive Kritik geht ein herzliches

Dankeschön an Ina Horst, Ute Neumann und Melanie Sapp. Vielen Dank auch an Maria

Krämer, Richard Ottermanns und Bob Kosier für die kleinen und großen Hilfen während

dieser Arbeit.

Ein herzlicher Dank gilt meinen Eltern, die mir das Studium ermöglicht haben.

Lebenslauf

- 199 -

I Lebenslauf

Persönliche Angaben

Name: Corinna Lantin

Geboren: 23.09.1977 in Aachen

Anschrift: Vaalser Str. 182

52074 Aachen

Schulische Laufbahn

1984 - 1988 Grundschule Gut Kullen Aachen

1988 - 1997 Privates St. Ursula Gymnasium Aachen

Studium

1997 - 2000 Grundstudium Biologie RWTH Aachen

2001 - 2002 Hauptstudium Biologie RWTH Aachen

2003 Diplomarbeit im Institut für Biologie II der RWTH Aachen

2003 - 2008 Promotion im Institut für Biologie I der RWTH Aachen

Einfluss eines gentechnisch veränderten, Auxin...

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