ZPG07 Phytohormone I - uni-muenster.de · • Wurzelapikalmeristem wichtige Funktion für...
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Phytohormone 1
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WWU-Münster
Prof. Jörg Kudla
Aufbau-Modul:
Zellbiologie, Physiologie und Genetik
Vorlesung:
Phytohormone: Wirkung und Signaltransduktion
Wochenziel:
Welche Aufgaben übernehmen Phytohormone in Pflanzen?
Was sind die molekularen Mechanismen der Phytohormonperzeption?
Phytohormone 1
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Definition Phytohormone
• Phytohormone sind Signalmoleküle
• Sie wirken in Pflanzen in verschwindend kleinen Mengen
• Synthese und Funktion von Phytohormonen kann in verschiedenen Zellen stattfinden (aber z.B. ABA kann in der Zelle wirken, in der es produziert wurde)
• Im Gegensatz zu Tieren haben Pflanzen keine hormonproduzierenden Drüsen, prinzipiell kann jede Zelle Hormone produzieren
• Phytohormone werden von spezifischen Rezeptoren oder Rezeptorfamilien erkannt
Phytohormone
fünf “klassische“Pflanzenhormone:
• Auxin
• Gibberellin (GA)
• Cytokinin
• Abscisinsäure (ABA)
• Ethylen
“neue“Pflanzenhormone:
• Brassinosteroid (BR)
• Jasmonat (JA)
• Salicylat (SA) ***
• Strigolacton (SL) ***
*** = unbekannte Rezeptoren
• Stickstoffmonoxid (NO) ***
• Polyamine ***
• Peptide
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Die „klassischen“ Phytohormone
„fördern Wachstum“ „hemmen Wachstum“
Auxine Abscissinsäure (ABA)
Cytokinine Ethylen
Gibberelline
Auxin- Struktur und Synthese-
• Verschiedene Moleküle wirken als
Auxin (vor allem IES)
• Verschiedene Synthesewege (z.B.:
Tryptophan als Ausgangsmolekül)
• Syntheseorte: Apikalmeristem, junge
Blätter und die Wurzelspitze
• Die Regulation des Transports von
Auxin ist entscheidend für die
Funktion des Hormons (PIN-
Proteine)
Indol-3-Essigsäure (IES)
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Auxin- Physiologie und Mutanten -
• Pflanzenwachstum
Elongation der Zellen
(Phototropismus ,
Gravitropismus)
Zellteilung
Apikaldominanz
(Inhibition von
Seitenknospen)
• Fruchtentwicklung
• Keimung Col Ws tir1 afb2
Rezeptormutanten
tir1 afb1afb2 afb3
tir1 afb2afb3
Phototropismen werden durch Auxin vermittelt
• In der Spitze produziertes Signal (Auxin) wandert zur Elongationszone
• Schattige Seite wächst schneller (rot) durch verstärkte Zellstreckung und
führt somit zur Krümmung
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Auxin wird zur Fruchtreife benötigt
• Achänen produzieren Auxin und ermöglichen die Entwicklung des
Blütenbodens (botanisch nicht die Frucht)
• Bei Entfernung der Achänen entwickelt sich der Blütenboden nicht normal
• Sprühen mit Auxin kann normales Wachstum wiederherstellen
geschwollener Blütenboden
Achäne(Frucht mit einem einzelnen Samen)
Auxin Biosynthese aus Tryptophan und IndolVerbindungen
• Indol-3-Essigsäure (IES) ist das am weitesten
verbreitete Auxin in Pflanzen
• Hauptstoffwechselweg aus Tryptophan
• Tryptophan-unabhängige IES Synthese kann zu
bestimmten Entwicklungszeitpunkten bedeutend
sein
Indol-3-Essigsäure
Tryptophan
Tryptophan
Indol Verbindungen
IES
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Auxin Akkumulation in Sproß und Wurzel
• IES Biosynthese überwiegend in sich schnell teilenden, wachsenden Geweben
• Primäre Syntheseorte: Sprossapikalmeristem und junge Blätter
• Wurzelapikalmeristem wichtige Funktion für Entwicklung und Organogenese
(„Feinregulation“), allerdings bleibt die Wurzel abhängig vom primären Syntheseort
PromotorDR5::GFP bzw. PromotorDR5::GUS Fusion zeigt Syntheseorte
Sprossapikalmeristem und Blattprimordien
junge Blattbereiche
Wurzelapikalmeristem Seitenwurzel Initiation Seitenwurzel
Sproß Wurzel
Auxin reguliert das Streckenwachstum
• Transport von Sproßspitze abwärts
• stimuliert Streckungswachstum der
Sproßachse (durch Zellstreckung an
bestimmten Zonen)
• bei höheren Konzentrationen wirkt Auxin
hemmend (wie bei Überproduktion)
WT AuxinÜberproduzierer
IES
Transport
Warum hemmend bei Überproduktion?
Wie wird polarer Transport ermöglich?
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Hormonwirkungen zeigen ein gewebespezifisches Optimum
Beispiel: Auxin-stimuliertes Streckungswachstum der Stängelsegmente
Bezogen auf die Kontrolle
(Wachstum in H2O, ohne exogene IES)
Wachstums-förderung
10–7 10–6
(µM)10–5 10–4 10–3
(mM)
Auxin (IES) -Konzentration
10–8 10–2 M
Rel
ativ
es W
ach
stu
m (
in m
m)
Maximum
Optimum(im
Spross)
Wachstums-Hemmung
Nachweis des polaren Auxintransportsdurch radioaktiv markierte IES
B
A
A
A
B
B
IES
IES
IES
Polarität des Transports ist unabhängig von der Schwerkraft und wird durch die Beschaffenheit des Pflanzengewebes bestimmt
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Polare Anordnung von PIN Auxin Influx und Efflux Transportern
• AUX1 (Auxin resistant 1) 2H+/Auxin Symporter, vermittelt Influx
• PIN1 (PIN Formed 1) Auxin Transporter, vermittelt Efflux
• IES- Auxin Anion
• IESH protoniertes Auxin (unpolar)
Polare Anordnung von PIN Auxin Influx und Efflux Transportern
• Anionische IES- wird durch AUX1Symporter aufgenommen
• Nicht dissoziiertes IESH gelangt per Diffusion über die Plasmamembran in die Zelle
• In der Zelle liegt überwiegend die Anionische IES- Form vor („Ionenfalle“)
• Efflux der anionischen IES- wird durch PIN1vermittelt
• Polare Anordnung von Auxin Influx und Efflux Transportern ermöglicht den gerichteten Transport
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Apikale Lokalisation von AUX1 und basale Lokalisation von PIN1
PIN1 (grün) AUX1 (rot)
Die Arabidopsis pin1 Mutante zeigt gravierende Entwicklungsphänotypen
- (in der Regel) Keine Blütenbildung
- Sprossachse Stäbchen (pin) ähnlich verlängert
- Oft reduziert Keimblattzahl
- Reduzierte Anzahl an Blättern
- Form der Blätter oft gestört
- Keine Trichome auf den Blättern
- Keine Anthocyane im Spross
- Gelbe Samen
- Veränderte Struktur der Samenhülle
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Apoplast
Zytosol
ATP
Auxin induzierte Zellstreckung: Säurewachstumshypothese
Cellulosemikrofibrille
Expansin
Glykan spaltendes Enzym
Quervernetzte Glykane
H+-ATPase
Auxin
Apoplast
Zytosol
ATP
A. Auxin erhöht die Aktivität von
Protonenpumpen
B. Ansäuerung des Apoplasten
C. Ansäuerung aktiviert Expansine, die
quervernetzende Glykane von den
Mikrofibrillen ablösen
D. Enzymatische Spaltung der
Quervernetzenden Glykane
Auflockerung der Zellwand
Erhöhte Dehnbarkeit der Zellwand führt durch den Turgor zur Zellstreckung
Die Orientierung der Cellulosemikro-fibrillen legt die Dehnungsrichtung fest
Auxin induzierte Zellstreckung: Säurewachstumshypothese
Auxin
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Auxintransport und ApikaldominanzAuxin wirkt antagonistisch zu Cytokinin
• Apikaldominanz: Unterdrückung von Seitensprossen
• Durch Dekapitieren (Enthaupten) wird Apikaldominanz aufgehoben
Auxin
Cytokinin Cytokinin
Cytokinin wird aus der Wurzelspitze
nach oben transportiert und stimuliert
die Seitensprossbildung
Auxin wird aus der Sproßspitze nach
unten transportiert und unterdrückt die
Bildung von Seitensprossen
Cytokinin
Auxin
Dekapitiert Dekapitiert + auxinhaltige Gelatinekapsel Apikalmeristem intakt
Cytokinin-Struktur und Synthese-
• Zeatin (trans- und cis-) bilden die
häufigsten Formen
• Syntheseweg: Adenin als
Ausgangsmolekül
• Syntheseorte: Wurzeln sich
entwickelnde Embryonen, junge
Blätter, Fürchte, WurzelhalsgallenZeatin
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Cytokinin-Physiologie und Mutanten-
• Zellteilung
• Löst Sprosswachstum aus
• Inhibiert Wurzelwachstum, leitet
aber Zelldifferenzierung ein
• Verzögert Seneszenz
Col Ws versch. Rezeptormutanten
Cytokinin Biosynthese aus ATP / ADP
• Transfer Isopentenylgruppe an ATP/ADP durch : Isopentenyl Transferase (IPT)
• Weitere enzymatische Reaktionen führen zum aktiven Cytokinin (= freie Base)
• Cytokinine sind Adenin Derivate mit Isopentenyl basierter Seitenkette
• DMAPP wird sowohl in Zytosol als auch in Plastiden gebildet
• Das plastidäre DMAPP wird hauptsächlich zur Cytkininsynthese genutzt
Adenin
Adenin
Seitenkette
(Dimethylallyldiphosphat)
Zwischenprodukt Cytokinin
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Cytokinin Akkumulation in Wurzel, Spross und Embryo
AtIPT::GUS
AtIPT::GUSARR5::GUS
Wurzel Embryo
AtIPT::GUS
SprossLeitgewebe
junge Blätter
Wurzel und Wurzelapikalmeristem
Seitenwurzel
Cytokinin hat verschiedene Wirkungen in unterschiedlichen Geweben
Cytokinin Überproduktion ähnelt dem Phänotyp nach exogenen Cytokinin-Gaben
• Überexpression der IPT (Isopentenyl
Transferase) führt zu erhöhtem Cytokininlevel
• Katalysiert ersten Schritt der
Cytokininbiosynthese
35S::IPT (transgener Tabak)
• Apikaldominanz reduziert(„buschiges“ Wachstum durch Ausbildung von Seitensprossen)
• Seneszenz verzögert(alte Blätter werden kaum gelb)
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Cytokinine fördern das Sprosswachstum durch erhöhte Zellteilung im Sprossapikalmeristem
• Cytokinin Oxidase (CKX) degradiert
Cytokinine irreversibel
• Bei Überexpression von CKX ist
weniger Cytokinin vorhanden
• Verminderte Cytokininkonzentration
führt zu geringerem Wachstum des
Sprosses
CKX-OE = CKX Überexpressionslinie
WT
CKX-OE
WT CKX-OE
Cytokinine hemmen das Wurzelwachstum durch verminderte Zellteilung im Wurzelapikalmeristem
• Deutlich mehr Wurzeln in der
CKX-OE Linie
• Zellkernfärbung (DAPI):
• deutlich erhöhte Zellanzahl
• verlängertes Wurzelmeristem
• Zellen vergrößert
WT CKX-OE
RM = root apical meristem
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Cytokinin und kontrollierte Seneszenz-Verzögerung durch induzierbare Promotoren
Cu-Prom::GUS
Cu-Prom::IPT
• Cu-Prom: Cu2+ induzierbarer Promotor
• GUS Expression hat keinen Einfluß auf
Cytokininkonzentration (Kontrolle)
• Isopentenyl Transferase (IPT) Expression führt zu
erhöhter Cytokinakkumulation
• Induktion von IPT bei älteren Pflanzen führt zu
einer deutlichen Verzögerung der Seneszenz
Cu-Prom Cu-PromGen X Gen X
Cu
Gibberellin (GA)-Struktur und Synthese-
Gibberellin GA1
• Tetracyclische Diterpene(C20)
• Biosynthese über den Isoprenoid-Weg
• Syntheseorte: Keimende Embryos,
junge Keimlinge, Spross, Apizes und
sich entwickelnde Samen
• Komplexe Synthese in mehreren
Kompartimenten
GA1-promoter:GUS; zeigt Syntheseorte
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Gibberellin (GA)-Physiologie und Mutanten-
• Löst Samenkeimung aus
• Blühinduktion
• Pollenentwicklung und -
schlauchwachstum
• Elongation der Internodien
(Zelllängenwachstum und -
teilung)
• Löst Fruchtwachstum aus
Wt gdi1(Rezeptormutante)
Schritt 1 (Plastid)
• GGPP (Geranylgeranyldiphosphat)
aus Terpenoidsynthese wird
zyklisiert
Schritt 2 (ER)
• Synthese von GA12 über mehrere
Zwischenstufen im ER
Schritt 1 und 2 der GA Biosynthese
sind in allen Pflanzen im wesentlichen
identisch
Gibberellin Biosynthese verläuft in drei Schritten
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Gibberellin Biosynthese verläuft in drei Schritten
Schritt 3 (Zytosol)
• Synthese bioaktiver Gibbereline
ausgehend von GA12
• Präferenz des Syntheseweges ist
artspezifisch
• Stoffwechselweg für GA4 am
weitesten verbreitet
Gibberellin nehmen Einfluß auf Wachstum und Entwicklung
• Der Einfluss von GA auf ausgewachsene Mais-Pflanzen ist gering.
• Aber bei einer Zwergmutante korrigieren exogene GA-Gaben das Längenwachstum.
Mut- GA
Mut+ GA
WT- GA
WT+ GA
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Gibberelinsäure erhöht Ausbeute bei Fürchten
- GA + GA• „Weintrauben“ sind botanisch
Weinbeeren
• Ohne GA-Behandlung wird die Fruchtentwicklung früher abgebrochen (gerade in kernlosen Weinbeeren, da GA in den Kernen gebildet wird)
• GA behandelte Beeren nehmen deutlich an Größe zu
• Zudem lockert sich die Dichte mit denen die Beeren an der Rispe auftreten durch Verlängerung des Beerenstiel
• Lockere Anordnung senkt das Risiko von Pilzbefall
• Verminderte Sensitivität gegenüber GA verhindert exzessives GA induziertes Wachstum bei Überflutung (Ressourcenschonend)
vor Überflutung Überflutung (16 Tage) Regeneration (7 Tage)
WT Sub1A-OE
A B C
WT Sub1A-OE WT Sub1A-OE
Submergence tolerant 1A (Sub1)
• WT versucht der Überflutung durch starkes GA vermitteltes Wachstum zu zu entkommen
• Starker Energie und Ressourcenverbrauch führt zum Absterben
WT
Reduzierte GA Sensitivität ist bei Überflutungvon Vorteil
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Reduzierte GA Sensitivität ist bei Überflutungvon Vorteil
A. Reispflanzen gleichen Alters werden für 16 Tage unter Wasser inkubiert
B. Nach 16 Tagen Überflutung ist der WT deutlich weniger vital im Vergleich zur Sub1A-OE Überexpressions-Linie
C. Während der Regenerationszeit stirbt der WT vollständig ab, im Gegensatz dazu erholt sich die Sub1A-OE Linie
vor Überflutung Überflutung (16 Tage) Regeneration (7 Tage)
WT Sub1A-OE
A B C
WT Sub1A-OE WT Sub1A-OE
Submergence tolerant 1A (Sub1)
Gibberelline nehmen Einfluß auf Wachstum und Entwicklung
• Im Kurztag bildet Kohl nur Rosetten.
• GA-Applikation induziert „Schießen“ und Blütenbildung.
• Spinat bildet nur im Langtag Sprosse.
• GA-Applikation kann auch im KurztagSprossbildung induzieren.
KT- GA
LT- GAKT
+ GAKT
- GA
KT+ GA
KT = Kurztag
LT = Langtag
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Abscisinsäure (ABA)-Struktur und Synthese-
Abscisinsäure(ABA)
• Sesquiterpen (15 C Atome,
Terpenoid)
• Syntheseweg: Carotinoide als
Ausgangsmoleküle; findet in
Plastiden und Zytoplasma statt
• Hat kurz- und langfristigen
Einfluss auf
Pflanzenentwicklung und
Stressadaption
Abscisinsäure (ABA)-Physiologie und Mutanten-
• Stressantwort
Trocken-, Salz- und
osmotischer Stress
Schließzellregulation
Pathogenabwehr
Entwicklungsprozesse
• Samen- und Knospenruhe
(Antagonist von GA)
• vegetatives Wachstum
• Seneszenz (vermehrte
Ethylenbildung)
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CHLOROPLAST
ZYTOSOL
Abscisinsäure (ABA) wird aus Carotinoiden synthetisiert
Chloroplast:aus Carotinoiden wird Zeaxanthin gebildetdurch Epoxidationsreaktionenund Isomerisierung werden9-cis Neoxanthin oder 9-cis Violaxanthin gebildetDurch oxidative Spaltung wird Xanthoxin abgetrennt
ZytosolÜber verschiedene Reaktionen wird Xanthoxinin ABA umgewandelt
ABA insensitiv 1 (abi1-1)
ABA hemmt die Entwicklung von Keimlingen
WT abi1-1
• ABA im Medium hemmt die Entwicklung von WT-Keimlingen
• Keimlinge der abi1-1 Mutante entwickeln sich auch bei Anwesenheit von ABA ungehemmt weiter
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Arabidopsis abi1-1 Mutanten zeigen gestörte Stomataregulation:Infrarot-Thermographie von Arabidopsis Keimlingen zeigen die erhöhteVerdunstungsrate der Blätter der abi1-1 Mutanten, die zu einer lokalenTemperatursenkung führt (rechts)
Abscisinsäure (ABA) Mutanten haben häufig deregulierte Stomata
Abscisinsäure wird durch Wassermangel induziert
Dynamik der ABA AntwortArabidopsis Keimlinge, deren Wurzeln einem osmotischen (Wasser-) Stress ausgesetzt werden, zeigen innerhalb von wenigen Stunden ABA-Reaktionen in den Keimblättern. pAtHB6::Luc = ABA-abhängiger Promotor treibt Luciferase Gen
Der Reiz „Wassermangel“, der in der Wurzel wahrgenommen wird, löst Signalwege aus, die zu spezifischen Reaktionen in anderen Organen führen!
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Ethylen- Struktur und Synthese-
• Kohlenwasserstoff, brennbares Gas
• Syntheseweg: Methionin als
Ausgangsmoleküle
• ACC (Aminocyclopropancarboxylsäure), der
direkte Vorläuferstoff von Ethylen bildet die in
Pflanzen transportierbare Form
• Ethylenproduktion wird durch verschiedene
Faktoren ausgelöst:
Andere Phytohormone
Umweltbedingungen
Entwicklungsstadien
Ethylen
Ethylen-Physiologie und Mutanten-
• “Triple response” in dikotylen
Keimlingen
• Beteiligt am Wachstum von
Keimlingen
• Zellausdehnung und Struktur der
Zellwand
• Bildung von Wurzelhaaren
• Induziert Fruchtreife
Screen: Etiolierte Keimlinge 3 Tage in Dunkelheit mit Ethylen angezogen
Rezeptormutante
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Ethylen löst Dreifachantwort in etiolierten Keimlingen aus
• Stark verlängertes Hypokotyl• Apikaler Haken
• Inhibition von Wurzel und Hypokotyl Elongation• Schwellung des Hypokotyl• Verstärkung des apikalen Haken („Kringel“)
Detail
- Ethylen (etioliertes Wachstum) + Ethylen (Dreifachantwort)
Ethylensynthese aus Methionin
Methionin wird unter Verbrauch von ATP zu S-Adenosyl-Methionin umgewandelt
Die ACC-Synthase spaltet dies in 5‘-Methylthioadenosin und ACC
5‘-Methylthioadenosin fließt in den Yang-Kreislauf zurück
ACC wird von der ACC Oxidase zu Ethylen verstoffwechselt
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Ethylen ist notwendig für Fruchtreife
Früchte von Wildtyp-Tomaten und ACC-Synthase RNAi Linien Tomaten wurden70 Tage lang (einzeln!) bei Raumtemperatur gelagert
WT-Kontrollfrüchte begannen nach 8-10 Tagen zu verrottenFrüchte der RNAi Linien zeigen starke Verzögerungen im Reifeprozess!
Regulation des BlattabwurfsDurch Auxin und Ethylen
Drei Phasen des Blattabwurfs:
1. Erhaltungsphase: Bevor die ersten Abwurfsignale wahrgenommen werden,
unterdrückt ein vom Blatt ausgehender Auxingradient die Ethylensensitivtät der
Trennungszone
2. Induktionsphase des Blattabwurfs: Reduktion oder Umkehr des Auxingradienten
löst Ethylensensitivität der Trennungszone aus
3. Abwurfphase: In der Trennungszone reagieren die sensitiven Zellen auf endogene
geringe Ethylenkonzentrationen und sekretieren Zellwand-auflösende Enzyme
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Brassinosteroid (BR)
bri1 WT
• Erstmals wurde das BR Brassinolid
1979 in B. napus Pollen nachgewiesen
• BR löst Zellproliferation und –
Längenwachstum aus
Brassinolid
Rezeptormutante
Brassinosteroid (BR) „Bioassay“ zeigt Wirkungen biologisch aktiver BRs
• Zweites Internodium aus Bohnen in BR Lösung inkubieren
• Effekt auf Internodium abhängig von Konzentration:
niedrige BR Konzentration: Elongation und Wachstum
hohe BR Konzentration: Verdickung, Biegung, Spaltung
ansteigende BR Konzentration
Kontrolle(keine BR)
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Brassinosteroide wirken in verschiedenen Entwicklungsprozessen
Rote Pfeile: ausgelöst durch BRBlaue Pfeile: inhibiert durch BRhigh: Effekt hoher BR Konzentrationenlow: Effekt geringer BR Konzentrationen
Salicylsäure
• Wird hauptsächlich aus Phenylallanin
synthetisiert
• Beteiligt bei Pflanzenwachstum und -
entwicklung
• Chloroplastenstruktur und
Photosynthese
• Vermittelt Abwehrreaktionen
Wichtig für systemic acquired
resistance (SAR)
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Salicylsäure vermittelt systemische Resistenz
Salicylic acid (SA), Methyl Salicylate (MeSA)
Jasmonat (JA) and Methyljasmonat (MeJA)
Jasmonsäure (JA) Methyljasmonat (MeJA)
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Strigolactone
• Erstmals in Wurzeln identifiziert
Löst Samenkeimung parasitärer Pflanzen
aus (Striga spp. Strigolactone)
• Werden aus Carotinoiden gebildet
• Inhibieren Sprossverzweigung
• Lösen die Verzweigungen der Hyphen von
Mycorrhiza Pilzen aus
ccd8: Carotenoid cleavege dioxygenase 8(katalysiert einen essenziellen Syntheseschritt)
Zusammenfassung Wirkung von Phytohormonen
Die Perzeption eines Phytohormons erfolgt durch gewebespezifische
und entwicklungsabhängige Expression von Hormon-Rezeptoren
• Zeigen multiple Signalwirkungen (selten einzelne)
• Optimale Wirkung bei bestimmter Konzentration
• Wirkung eines Hormons ist häufig gewebespezifisch
• Zentrale Koordination von Wachstum und Entwicklung
• Beeinflussen sich untereinander, Übergänge sind oft fließend