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Zum Mechanismus der Urocanase-Reaktion : Bestatigung der Struktur des NAD + -1nhibitor- Adduktes durch direkte 3C-1 3C-Kopplung ** Carsten Schubert, Ymin Zhao, Jung-Hyn Shin und Janos RCtey* Professor Joachim Knappe zum 65. Geburtstag gewidmet

In Oxidoreduktasen fungiert das Nicotinamidadenindinucleo- tid (NAD') als Redoxreagens. Eine andere, bis jetzt einzigartige Rolle als Elektrophil ubernimmt es in der Urocanase-Reaktion (Schema 1). Urocanase (E.C. 4.2.1.49) kommt in den meisten

NvNH 3

Schema 1. Sterischer Verlaur der Urocanase-Reaktion. Die Protonen aus dem Lo- sungsmittel werden an die Re-Positionen der Seitenkette addiert.

Zellen vor und katalysiert den zweiten Schritt im Abbau des Histidins. Dabei wird ein Wassermolekul auf eine ungewohnli- che Art an Urocaninsiiure 1 addiert. Insbesondere die Anknup- fung eines OH--Ions an den elektronenreichen Imidazolring scheint chemisch unplausibel zu sein. Bei diesem Schritt spielt das fest an das Enzym gebundene NAD' eine entscheidende Rolle. Unter Einsatz des kompetitiven Inhibitors Tmidazolpro- pionsaure 6 konnte nach Rearomatisierung ein NAD +-Inhibi- tor-Addukt isoliert werden, dem zunachst Struktur 411' zuge- schrieben wurde. Die Bindung des NAD' an den Inhibitor sollte hierbei uber das N1'-Atom der Imidazoleinheit erfolgen (Schema 2).

["I Prof. Dr. J. Ritey, Dipl.-Chem. C. Schubert, Dr. Y. Zhao"', Prof. Dr. J.-H. Shin[++' Lehrstuhl fur Biochemie im Institut fur Organische Chemie der Universitst Rich;rrd-Willatdtter-Allee, 0-761 28 Karlsruhe Telehn: Iut. +721:608-4823

(Volksrepublik China) ["I Gegenwirtige Adresse- Department of ChemiFtry,

Seoul National University Seoul 151-742 (Korea) [**I Diese Arbeit wurde von der Dcutschen Forschungsgemeinschaft und dem

Fonds der Chemischen Industrie gefordert. Fur das 600 MHz-'H-NMR- Spektrum danken wir Dr. M. Spraul, Bruker Analytische MeBtechnik GmbH, Rheinstetten/Karlsruhe. Dr. H. Rottele danken wir fur das 13C-NMR-Spek- trum des Addukts, Frau J. Hernian fur die Hilfe bei der Enzymisolierung und Dr. M. Lenz fur den uberexprimierenden Urocanase-Klon aus E. col;.

['I Gegenwirtige Adresse: Xiao-qu-deng-tong 6, Dong-cheng-qu, 100010 Beijing

"OOC\

Schema 2. Strukturvorschlige fur das NAD+-Imidazolpropions~ure-Addukt (13C-Markierung durch Punkte angedeutet). R = ADP-Ribosyl.

In der durch UV-Spektroskopie gestiitzten Annahme". *I, &I3 Urocaninsaure in den Anfangsschritten der Reaktion das analoge kovalente Addukt bildet, wurde fur die Reaktion ein Mechanis- mus vorge~chlagen[~l, der aber das envahnte chemische Pro- blem nicht loste. Weiterhin fehlte in dem 'H-NMR-Spektrum des Adduktes ein Signal fur die Tmidazolprotonen, was die Au- toren mit einem spontanen Austausch des 2'-H-Atoms mit Deu- terium aus dem Losungsmittel erkliirten"]. Klepp et al.141 postu- lierten daraufhin Struktur 5 und belegten diese mit den experi- mentellen Befunden des in den Positionen 2' (Imidazol) und 4 (Nicotinamid) spezifisch 3C-markierten Addukts. Somit konnte ein plausibler Mechanismus fur die Urocanase-Reaktion formu- liert werden (Schema 3).

H+

CONH,

I R R

! n

OH

CONH, CONH, CONH,

I R

I R R

Schema 3. Vorgeschlagener Mechanismus fur die Urocanase-Reaktion. R = ADP- Ribosyl.

Einen endgiiltigen Beweis fur Struktur 5 wurde ein Nachweis der direkten '3C-13C-Kopplung im doppelt ' 3C-markierten Ad- dukt 5 a liefern. Hier beschreiben wir die Synthese der [5'-13C]- Imidazolpropionsiiure 6 a sowie die Isolierung und die NMR- spektroskopische Charakterisierung des daraus enzymatisch ge- bildeten Adduktes 5 a. Die bereits bekannte 5-Amino-[5-' 3C]- Iavulinsiiure . HC17 wurde als ein geeigneter Vorlaufer von 6 a

COOH COOH 0

&AJ"I- KSCN, + N+NH HOOC

6 n "yN;

7 SH

Angew. Chem. 1994. 106. Nr. 12 0 VCH Verlagsgesellschaft mbH, 0-69451 Weinhein?. 1994 0044-8249/94/1212-13.~1 $10.00+ ,2510 1331

ZUSCHRIFTEN

nach der Vorschrift von Pfaltz et al.L5] aus Cu' [13C]N (99% 3C) 16] und 3-Chlorformylpropionsauremethylester synthetisiert.

Der RingschluB zum Imidazolthiol 8 erfolgte durch Konden- sation von 7 mit KSCN"]. AnschlieDende Oxidation mit Fe,(S0,),[81 und Ioncnaustauschchromatographie (Dowex SOW X 4, H'-Form) fiihrten zum gewunschten Produkt 6a (Ta- belle 1). [4-'3C]Nicotinsaure (99% I3C) wurde nach der Vor- schrift von Oberfrank et al.['I synthetisiert und biosynthetisch in die Urocanase eingebautt4]. Die Fermentation von Pseudo- moms putidu nic I1 (eine Nicotinsaure-auxotrophe Mutante), die Isolierung des markierten Enzyms und die enzymatische Bildung des NAD + -1midazolpropionsaure-Adduktes erfolgten wie von Klepp et al. be~chrieben~~]. 250 mg (2.03 pmol) I3C- markierte Urocanase und 48 mg (300 pmol) [5'-' 3C]Imidazol- propionsaure) . HCI wurden dabei eingesetzt.

Tabelle 1. Spektroskopische Daten rur die Verbindungen 5 a und 6a. NMR-Spek- tren in D,O. Natrium-3-trimethylsilyl-[*H~]propionat (TSP) als Standard fur 'H-, externe Dioxan-Referenz (6 = 68.0) als Standard fur '3C-NMR-Spektren. A be- zeichnet Positionen im Adeninrest, a und ,fl beziehen sich auf die Positionen der Propionsiureseitenkette, die ungestrichenen und die gestrichenen Angaben auf den Pyridinium- bzw. lmidazolnng. Wassersignal der ' H-NMR-Spektren durch Vorslt- tigung unterdriickt.

5a: 'H-NMR (600 MHz: D,O, pD = 9.0): d = 8.88 (d, 3J(H2,'3C4) = 5.4 Hz. l H , HZ), 8.78 (t. 'J(H6,I3C4) = 6.2 Hz, 'J(H6,H5) = 6.8 Hz. 1 H, H6). 8.33 (s, l H , A8). 8.01 (s, IH, A2), 7.93 (dd, 3J(H5,'3C5') = 6.7 Hz, 3J(H5,H6) = 6.8 Hz, I H , H5), 7.61 (d, 3J(H2'.'3C5') = 9.5 Hz, l H , H2'): 'H-NMR (400 MHz; D,O, pD = 9.0): 6 = 3.05 (dt. 3J(p-H, a-H) ~ 7 . 0 HL, 3J('H,13C) z 2 Hz, 2H. p-H), 2.47 (t. 'J(a-H, fi-H) =7.0 Hz, 2H, x-H); I3C-NMR (100 MHz; D,O. pD = 8.0. ca. 320 vg): 6 =130.12 (d, ' J ('3C5','3C4) z 70 Hz, 1 C, C5'). 151.12 (d, 'J("C4, 13C5') =70 Hz, 1C. C4). 6a: 'H-NMR (400 MHz; D,O, pD = 4.6): 6 = 2.60 (t, 'J(z-11, p-H) =7.3 Ha, 2H, a-H), 2.96 (dtr, 'J(P-H, a-H) =7.3 Hz, 'J('H,I3C) = 4.4 Hz, ?H, P-H). 7.20 (dd, 'J('H,'3C)~200.3H~,4J=1.3H~,1H,HS).8.55(dd,3J=5.4Hz,4J=i.4H~, 1 H, H2'): I3C-NMR (100 MHz; D,O, pD = 3.9): d = 20.99 (Lj-C), 34.80 (a-C), 116.44 (C5'). 133.85 (CZ'), 133.69 (C4'), 179.25 (COOH): MS (70eV): mji: 141.14 [M+I.

Im 13C-NMR-Spektrum (Tabelle 1) des partiell gereinigten doppeltmarkierten Adduktes 5a (Abb. 1) erkennt man zwei Du- bletts bei 6 = 130.12 bzw. 151.12 mit einer Kopplungskonstante von 70 Hz, die einer direkten '3C-'3C-Kopplung entspricht. Das Singulett bei 6 = 144.04 stammt von nichtumgesetztem [4-' 3C]NADf. Im Tieffeldausschnitt des ' H-NMR-Spektrums von 5a (Abb. 2, Tabelle 1) entsprechen die meisten Signale den- jenigen des Adduktes 5 aus [4-I3C]NAD+ und [2-13C]Imida- zolpropionsaure. Eine zusatzliche Kopplung von 3J = 6.7 Hz erkennt man beim H5-Signal (6 = 7.93) infolge der vicinalen Kopplung mit dem S'-13C-Atom. Das H2'-Signal(6 = 7.61) weist

154 152 150 148 146 144 142 140 138 136 1% 132 130 128

- 6

Abb 1 Tieffeldausschnitt des '3C-NMR-Spektrums des [4-I3C]NAD '-[5'-''C]- Imid~olpropionsaure-Adduktes 5 a.

Abb. 2. Tieffeldausschnitt des 'H-NMR-Spektrums des [4-'3C]NAD+-[5'-'3C]- Imidazolpropionsaure-Adduktes 5 a.

nur eine vicinale Kopplung rnit 3J = 9.5 Hz auf, die direkte mit ' J = 212 Hz wie im Spektrum von SL4] fehlt hier. Eine zusatzliche vicinale 1H-13C-Kopplung findet man auch im Signal der /$Me- thylengruppe der Seitenkette vom Imidazolpropionsaureteil des Adduktes 5 a. All diese Befunde erharten den Vorschlag von Klepp et al.14], daD es sich beim isolierten NADf-Imidazolpro- pionsaure-Addukt um Struktur S handelt. Der im Schema 3 wiedergegebene Mechanismus der Urocanase-Reaktion er- scheint also um so wahrscheinlicher.

Eingegangen am 3. Februar 2994 [Z 66651

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Erste Cycloadditionsreaktionen mit dimeren Arsenium-Ionen" * Neil Burford", Trenton M. Parks, Pradip K. Bakshi und T. Stanley Cameron*

Kleine Molekiile rnit koordinativ ungesattigten Zentren sind eine hervorragende Ausgangsbasis fur die Entwicklung neuer Synthesestrategien. Carbene 1 sind das vielleicht bekannteste Bei- spiel"] fur solche Molekiile, und erst kurzlich wurde iiber neuar-

[*] Dr. N. Burford, T. M. Parks, P. K. Bakshi, Dr. T. S. Cameron Department of Chemistry, Dalhousie University Halifax, Nova Scotia B3H 453 (Kanada) Telefax: Int. + 9021494-1310

[**I In diesem Beitrag werden durchgehend die eingefiihrten Bezeichnungen Phos- phcnium- und Arsenium-Ion anstelle der IUPAC-konformen Namen Phospa- nylium- bzw. Arsanylium-Ion verwendet.

1332 8 VCH Verlunsnesellschufi mhH, D-69451 Weinheirn, 1994 0044-8249/94/!2i2-~332 $10.00+ .25jO Ange~; . Chem. 1994. 106, Nr. 12