Zytogenetische Untersuchungen an Pankreaskarzinom ... · Aus dem Institut für Humangenetik der...

Aus dem Institut für Humangenetik

der Universität Würzburg

Vorstand: Professor Dr. H. Höhn

Zytogenetische Untersuchungen an Pankreaskarzinom-Zelllinien transgener TGFα/p53+/-- Mäuse

Inaugural – Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät

der

Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg

vorgelegt von

Christian Böhm

aus Nürnberg

Würzburg, September 2005

Referent: Prof. Dr. M. Schmid

Koreferent: Prof. Dr. H. Höhn

Dekan: Prof. Dr. G. Ertl

Tag der mündlichen Prüfung: 21. Juli 2006

Der Promovend ist Arzt.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ...................................................................................... 1

1.1 Das humane Pankreaskarzinom .................................................... 1

1.1.1 Epidemiologie ................................................................................... 1

1.1.2 Symptomatik, Diagnostik und Therapie ............................................ 2

1.1.3 Pathologie und prämaligne Läsionen des Pankreaskarzinoms ........ 3

1.1.4 Genetische Veränderungen in duktalen Pankreaskarzinomen

und prämalignen Läsionen ............................................................... 4

1.1.4.1 Aktivierende Mutation des K-RAS-Onkogens .................................. 5

1.1.4.2 Inaktivierung von P16INK4a ................................................................ 5

1.1.4.3 Inaktivierung von P53 ....................................................................... 6

1.1.4.4 Inaktivierung von DPC4/SMAD4 ...................................................... 6

1.1.4.5 Sonstige genetische Veränderungen ............................................... 7

1.1.5 Das familiäre Pankreaskarzinom....................................................... 7

1.2 Die Maus als onkologisches Modell für den Menschen ............. 9

1.2.1 Knock-out-Mäuse ............................................................................. 9

1.2.2 Transgene Mausmodelle ................................................................. 11

1.2.3 Die TGFα/p53+/--Maus als Modell für das duktale

Pankreaskarzinom ........................................................................... 12

1.3 Chromosomenaberrationen ........................................................... 13

1.3.1 Numerische Chromosomenaberrationen ......................................... 14

1.3.2 Strukturelle Chromosomenaberrationen .......................................... 14

1.3.2.1 Deletion ............................................................................................ 14

1.3.2.2 Translokation ................................................................................... 15

1.3.2.3 Duplikation ....................................................................................... 15

1.3.2.4 Inversion .......................................................................................... 16

1.3.2.5 Sonstige strukturelle Chromosomenaberrationen ........................... 16

1.4 Spectral Karyotyping (SKY) .......................................................... 17

1.5 Fragestellung der Arbeit ................................................................. 19

2 Material und Methoden ............................................................. 20

2.1 Chemikalien und Bioreagenzien .................................................... 20

2.2 Puffer und Lösungen ...................................................................... 21

2.3 Antikörper und Reagenziensysteme ............................................. 22

2.4 Geräte und Materialien .................................................................... 22

2.5 Etablierung der Zelllinien ............................................................... 22

2.5.1 Herkunft der Tumoren ...................................................................... 22

2.5.2 Isolation von Tumorzellen durch mechanische Zerkleinerung ......... 23

2.5.3 Isolation von Tumorzellen durch Feinnadelaspiration ...................... 24

2.5.4 Weitere Etablierung und Klonierung der Tumorzelllinien ................. 24

2.5.5 Herstellung der Chromosomenpräparate ......................................... 25

2.5.6 Übersicht der Zelllinien ..................................................................... 26

2.6 Comparative Genomic Hybridization (CGH) ................................. 27

2.6.1 Aufbereitung der Proben-DNA ......................................................... 27

2.6.2 Vorbereitung der Chromosomenpräparate und Hybridisierung ........ 27

2.6.3 Waschen und Detektion .................................................................... 28

2.6.4 Visualisierung .................................................................................... 28

2.7 Spectral Karyotyping (SKY) ........................................................... 28

2.7.1 Vorbehandlung der Chromosomenpräparate ................................... 29

2.7.2 Denaturierung der Chromosomen .................................................... 29

2.7.3 Vorbereitung der Sondenprobe und Hybridisierung ......................... 30

2.7.4 Waschen und Detektion .................................................................... 30

2.7.5 Visualisierung und Auswertung der Ergebnisse ............................... 31

2.8 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) .................................... 31

2.8.1 Vorbehandlung und Denaturierung der Chromosomenpräparate .... 32

2.8.2 Vorbereitung der Sondenprobe und Hybridisierung ......................... 32

2.8.3 Waschen und Detektion ................................................................... 33

2.8.4 Visualisierung und Auswertung der Ergebnisse ............................... 34

3 Ergebnisse ................................................................................... 35

3.1 Etablierung der Zelllinien ............................................................... 35

3.2 Molekular-zytogenetische Charakterisierung der Zelllinie MMUPaTu 7 = TD2 ............................................................. 35

3.2.1 CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 7 = TD2 ................................ 36

3.2.2 SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 7 = TD2 ................................. 37

3.2.3 Charakterisierung des Markerchromosoms 11 mittels

FISH-Analyse ................................................................................... 39

3.3 Molekular-zytogenetische Charakterisierung der Zelllinie MMUPaTu 8 = 7B ............................................................................. 40

3.3.1 CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 8 = 7B .................................. 40

3.3.2 SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 8 = 7B ................................... 40

3.3.3 Charakterisierung des Markerchromosoms 11 mittels

FISH-Analyse .................................................................................... 44

3.3.4 Weiterführende Untersuchungen der Zelllinie TD2 ........................... 44

3.4 Molekular-zytogenetische Charakterisierung der Zelllinie MMUPaTu 9 ........................................................................ 46

3.4.1 CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 9 ............................................ 46

3.4.2 SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 9 ............................................. 46


3.5.1 CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 3 ............................................ 49

3.5.2 SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 3 ............................................. 50

3.5.3 Differenzierung des Translokationschromosoms t(X;13)

durch FISH-Analyse .......................................................................... 51


3.6.1 CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 4 ........................................... 53

3.6.2 SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 4 ............................................ 53


3.7.1 CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 5 ........................................... 56

3.7.2 SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 5 ............................................ 57

3.7.3 FISH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 5 mit WCP X ........................ 59

3.8 Übersicht über häufig detektierte Aberrationen ........................... 59

4 Diskussion .................................................................................... 62

4.1 Beteiligung von Signaltransduktionswegen, Zellproliferation und Apoptose am Prozess der Tumorgenese .............................. 62

4.2 Charakterisierung verschiedener Pankreaskarzinomzelllinien aus transgenen TGFα/p53+/--Mäusen durch Spectral Karyotyping (SKY) ........................................................... 63

4.2.1 Polyploidisierung ............................................................................... 64

4.2.2 Detektierte Aberrationen der Zelllinien MMUPaTu 7 = TD2 und

MMUPaTu 8 = 7B ............................................................................. 65

4.2.2.1 Charakterisierung des Markerchromosoms t(11;5) ........................... 67

4.2.2.2 Charakterisierung der Aberrationen von Chromosom 15 ................. 70

4.2.3 Detektierte Aberrationen der Zelllinien MMUPaTu 9, 3, 4 und 5 ...... 72

4.2.3.1 MMUPaTu 9 ...................................................................................... 72

4.2.3.2 MMUPaTu 3 ...................................................................................... 74

4.2.3.3 MMUPaTu 4 ...................................................................................... 75

4.2.3.4 MMUPaTu 5 ...................................................................................... 76

4.2.4 Zusammenfassung häufig detektierter Abberationen ....................... 77

4.2.5 Erfordernis weitergehender Untersuchungen der Zelllinien .............. 78

4.3 Vorteile und Limitierungen des Spectral Karyotyping ................ 79

5 Zusammenfassung ................................................................... 82 6 Literaturverzeichnis .................................................................. 84 7 Publikationen .............................................................................. 99 8 Abkürzungsverzeichnis .......................................................... 100

1 Einleitung 1

1 Einleitung 1.1 Das humane Pankreaskarzinom

1.1.1 Epidemiologie Das Pankreaskarzinom zählt aufgrund seiner uncharakteristischen Früh-

symptome und der damit verbundenen späten Diagnosestellung trotz neuer

therapeutischer Ansätze immer noch zu den Krebserkrankungen mit infauster

Prognose (Zalatnai, 2003). Laut Statistik des Robert-Koch-Instituts erkranken in

Deutschland jährlich 4900 Männer und 5500 Frauen an bösartigen

Veränderungen des Pankreas (Krebsbroschüre des Robert-Koch-Instituts,

2002). Tumoren der Bauchspeicheldrüse stellen demnach 3% aller

Krebserkrankungen sowie 5% aller Krebstodesfälle dar und sind bei beiden

Geschlechtern die sechsthäufigste Krebstodesursache in Deutschland. Im

europäischen Vergleich rangiert die Bundesrepublik bei Männern nach

Frankreich, Österreich und Italien an vierter Stelle, bei Frauen etwas dahinter

an siebter Stelle. Das Schlusslicht bildet bei beiden Geschlechtern jeweils

Spanien mit einer relativ niedrigen Inzidenz für das Pankreaskarzinom.

Mit einem mittleren Alter bei Diagnosestellung von 67 Jahren bei Männern und

74 Jahren bei Frauen liegt das Erkrankungsalter im Vergleich zu anderen

Krebserkrankungen eher hoch, eine deutliche Altersabhängigkeit des

Erkrankungsrisikos ist zu erkennen (Ries et al., 2002). Als weiterer anerkannter

Risikofaktor für Pankreaskarzinome gilt Nikotinabusus, der zu einem zwei bis

dreifach erhöhten relativen Risiko führt, an Bauchspeicheldrüsenkrebs zu

erkranken (Boyle et al., 1996). Zusätzlich werden neben der chronischen

Pankreatitis (Schlosser et al., 1996) vor allem ernährungs- und lifestylebedingte

Faktoren wie der vermehrte Konsum von Alkohol, Kaffee, gesättigten

Fettsäuren und Cholesterin sowie gegrillten Speisen (Anderson et al., 2002) als

prädisponierend für eine maligne Erkrankung des Pankreas diskutiert. Auf die

genetischen und familiären Aspekte des Pankreaskarzinoms wird in den

folgenden Kapiteln noch näher eingangen werden.

1 Einleitung 2

1.1.2 Symptomatik, Diagnostik und Therapie Fatalerweise zeigt das Pankreaskarzinom weitgehend keine Frühsymptome, so

dass die Diagnosestellung meist erst in fortgeschrittenen und somit

prognostisch ungünstigeren Stadien erfolgt. Meist klagen die Patienten über

unspezifische Oberbauchbeschwerden, Inappetenz und Gewichtsverlust. Vor

allem bei Prozessen im Bereich des Pankreaskopfes kann ein Verschluss-

ikterus, eventuell mit tastbarer schmerzloser Gallenblase (= Courvoisier-

Zeichen), beobachtet werden.

Verbesserungen in der bildgebenden Technik unter Einsatz von Endosono-

graphie, High-Resolution Computertomographie (hrCT), MRCP (Magnet-

resonanz-Cholangio-Pankreatikographie), ERCP (Endoskopische retrograde

Cholangio-Pankreatikographie) und Fluorodeoxyglukose-PET (Positronen-

Emissions-Tomographie) haben mit einer kombinierten Trefferquote von etwa

90% wesentlich dazu beigetragen, maligne Prozesse im Bereich des Pankreas

früher zu erkennen (Riker et al., 1998).

Zusätzlich zur radikalen Operation (partielle Duodenopankreatektomie nach

Kausch-Whipple), für die lediglich 10-20% aller Patienten geeignet sind (Kelly et

al., 1995), werden adjuvant Chemotherapeutika sowie weitere palliative

Therapieansätze zur Schmerzbekämpfung und Wiederherstellung der

Verdauungspassage angeboten, um die Lebensqualität und Überlebensraten

der Patienten zu verbessern (Glimelius et al., 1996). Nachdem bis Ende der

90er Jahre hauptsächlich 5-Fluoruracil eingesetzt wurde (Schmoll et al., 1999),

stehen heute Schemata mit dem Pyrimidin-Antimetaboliten Gemcitabine

(Gemzar®) im Vordergrund der Chemotherapie (Burris et al., 1997). Trotz dieser

Bemühungen und verschiedener neuer experimenteller Ansätze, unter anderem

mit Oligonukleotiden gegen p53-RNA (Tepel et al., 2004), bleibt die Prognose

für Pankreaskarzinompatienten mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 6% für

Männer sowie 3% für Frauen infaust (Krebsbroschüre des Robert-Koch-

Instituts, 2002).

1 Einleitung 3

1.1.3 Pathologie und prämaligne Läsionen des Pankreaskarzinoms Im Vergleich zu den endokrinen Tumoren überwiegen die Neoplasien des

exokrinen Pankreas mit 95% deutlich (Warshaw et al., 1992). Meist handelt es

sich dabei um Adenokarzinome, die mit etwa 70% am häufigsten den

Kopfbereich betreffen. Ausgangspunkt ist zu 90% das einschichtige Epithel der

kleinen Ausführungsgänge (duktales Karzinom) und zu 10% die sekretorischen

Zellen des Azinusepithels (azinäres Karzinom) (Klöppel u. Lüttges, 2001). Die

Metastasierung erfolgt frühzeitig sowohl lymphogen als auch hämatogen in

Leber, Lunge, Knochen und Gehirn.

Man geht heute ähnlich wie bei der Adenom-Karzinom-Sequenz kolorektaler

Tumoren (Kinzler u. Vogelstein, 1996; Vogelstein et al., 1988) von einem

Tumorprogressionsmodell von Normalgewebe über Hyperplasie und Dysplasie

zum Karzinom aus unter Akkumulation verschiedener architektonischer,

zytologischer und genetischer Veränderungen (Brockie et al., 1998). Zur

Charakterisierung der prämalignen Läsionen des duktalen Pankreaskarzinoms

wurde der Begriff der intraepithelialen Neoplasien des Pankreas, PanIN

(pancreatic intraepithelial neoplasia) etabliert (Klöppel u. Lüttges, 2001; Hruban

et al., 2001). Dabei unterscheidet man morphologisch drei verschiedene

Differenzierungsgrade von der „low grade pancreatic duct lesion“ (PanIN-1A,

1B) über die „high grade pancreatic duct lesion“ (PanIN-2) bis hin zum

invasiven Karzinom (PanIN-3), die mit zunehmender architektonischer Störung,

Dysplasie und Zellatypien einhergehen (http://pathology.jhu.edu/pancreas

_panin). Das duktale Adenokarzinom zeichnet sich ebenso wie die

Vorläuferstadien durch die Ausbildung Ausführungsgang-ähnlicher Strukturen

sowie die Expression duktaler Marker wie der Zytokeratine 8, 18 und 19 aus

(Real et al., 1993).

Obwohl der Zusammenhang zwischen benigner intraduktaler Proliferation und

dem duktalen Adenokarzinom schon seit langem propagiert wurde (Cubilla u.

Fitzgerald, 1976; Kozuka et al., 1979; Klöppel et al., 1980) und durch klinische

Verlaufsstudien bestätigt werden konnte (Brat et al., 1998), bleibt die eigentliche

Ursprungszelle der Tumoren unbekannt. Unter anderem werden epitheliale

1 Einleitung 4

Stammzellen mit Entwicklungspotential zu den verschiedenen Zelltypen des

Pankreas in Betracht gezogen (Meszoely et al., 2001).

Auch molekulargenetisch können unterstützende Hinweise für das

Progressionsmodell des duktalen Pankreaskarzinoms gefunden werden. So

gehen die zunehmenden histopathologischen Veränderungen der prämalignen

Läsionen mit Aberrationen von Signalmolekülen des Zellzyklus und

Wachstumsfaktoren einher, die auch in hoher Frequenz in Pankreaskarzinomen

anzutreffen sind (Biankin et al., 2003). Weiterführende Untersuchungen konnten

zudem eine Einteilung der beobachteten genetischen Alterationen in frühe,

fortgeschrittene und späte Ereignisse während der Tumorgenese aufzeigen

(Maitra et al., 2003; Wilentz et al., 2000), die auszugsweise in Tabelle 1.1

dargestellt sind.

Frühe Ereignisse Punktmutation K-RAS;

Überexpression ERBB2 (HER-2/NEU); Expression des epithelialen Apomuzins MUC5, Expression des

Prostate Stem Antigens Fortgeschrittene

Ereignisse Inaktivierung von P16;

Expression von Cyclin D1

Späte Ereignisse

Inaktivierung von P53, SMAD4/DPC4, BRCA2; Expression von MUC1, Mesothelin und 14-3-3-varsigma

Tabelle 1.1: Zeitliche Abfolge der molekulargenetischen Ereignisse während der Entwicklung von intraepithelialen Neoplasien des Pankreas zum invasiven Karzinom (modifiziert nach Maitra et al., 2003).

1.1.4 Genetische Veränderungen in duktalen Pankreaskarzinomen und prämalignen Läsionen Durch Fortschritte in der Molekularbiologie konnten im Verlauf der letzten Jahre

zunehmend Erkenntnisse über die genetischen Veränderungen während der

Tumorgenese von duktalen Pankreaskarzinomen gewonnen werden. Vor allem

Mutationen des K-RAS-Onkogens sowie inaktivierende Alterationen der

Tumorsuppressorgene P53, P16INK4a und DPC4 werden als entscheidende

Prozesse im Verlauf der Karzinogenese betrachtet (Cowgill u. Muscarella,

2003).

1 Einleitung 5

1.1.4.1 Aktivierende Mutation des K-RAS-Onkogens Aktivierende Mutationen des K-RAS-Onkogens können in 90% aller

Pankreaskarzinome gefunden werden (Almoguera et al., 1988). Bei den

Mitgliedern der RAS-Proteinfamilie handelt es sich um GTP-bindende Proteine

im Verlauf des zellulären Signaltransduktionswegs, die nach Aktivierung

verschiedene Mediatoren des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung

beeinflussen (Malumbres u. Pellicer, 1998).

Interessanterweise sind die Veränderungen von K-RAS keineswegs spezifisch

für Malignome des Pankreas, sondern können auch in benignen Prozessen

sowie auf allen Stufen der intraepithelialen Neoplasien beobachtet werden

(Caldas et al., 1994; DiGiuseppe et al., 1994). Somit werden K-RAS-

Punktmutationen, die meist das Codon 12 betreffen, als ein sehr frühes Ereignis

innerhalb der pankreatischen Tumorgenese angesehen (Kalthoff et al., 1993),

was auch Untersuchungen an in Hamstern induzierten Malignomen bestätigen

konnten (Cerny et al., 1993). Neuere Studien konnten einen Einfluss

unterschiedlicher Mutationen des K-RAS-Onkogens auf die Prognose von

Pankreaskarzinompatienten feststellen (Kawesha et al., 2000).

1.1.4.2 Inaktivierung von P16INK4a Das Genprodukt des Tumorsuppressorgens P16INK4a auf Chromosom 9p21

greift in die Regulation des Zellzyklus ein, indem es die Bildung des Cyclin

D1/CDK4/6-Komplexes inhibiert, der den Übergang von der Ruhephase G1 in

die S-Phase steuert. Tritt ein Verlust der P16-Funktion ein, kommt es auf diese

Weise zur ungebremsten Progression des Zellzyklus (Serrano et al., 1993).

Homozygote Deletionen, Mutationen oder Hypermethylierungen im

Promotorbereich des P16INK4a-Lokus konnten sowohl in humanen

Pankreaskarzinom-Zelllinien (Liu et al., 1995) als auch in Tumorgewebe

(Caldas et al., 1994; Huang et al., 1996; Schutte et al., 1997) in hohen

Frequenzen bis zu 80% nachgewiesen werden. Auch PanIn-Läsionen zeigen

bereits häufig Alterationen des P16-Tumorsuppressorgens (Yamano et al.,

1 Einleitung 6

2000). Im Gegenzug führt die Transfektion des Wildtyp-Allels P16 in

menschliche Pankreaskarzinomzellen zu einer verminderter Tumorzell-

proliferation in vitro und in vivo (Ghaneh et al., 2001). Neuere Studien konnten

die Rolle einer P16INK4a-Inaktivierung als ungünstigen prognostischen Marker

aufzeigen (Gerdes et al., 2002).

1.1.4.3 Inaktivierung von P53 Wie viele andere Malignome zeigen auch bis zu 75% aller Pankreaskarzinome

eine Inaktivierung des Tumorsuppressorgens P53 (Rozenblum et al., 1997).

Dieses ubiquitär exprimierte Protein reagiert auf zelluläre DNA-Schäden mit

einer Arretierung des Zellzyklus oder der Induktion von Apoptose (Levine,

1997). Als primärer Mechanismus der P53-Inaktivierung bei Pankreas-

karzinomen gilt die Frame-Shift-Mutation, die eine Inhibition des Wildtyp-Allels

des zweiten homologen Chromosoms nach sich zieht. Laut Bardeesy et al.

(2001) ist diese Alteration als ein eher spätes Ereignis in der Tumorgenese der

duktalen Pankreaskarzinome anzusiedeln.

1.1.4.4 Inaktivierung von DPC4/SMAD4 Auch der Verlust des Tumorsuppressorgens DPC4 (deleted in pancreatic

cancer locus 4) auf Chromosom 18q21.1 geschieht eher spät innerhalb der

Progression der duktalen Pankreasläsionen (Wilentz et al., 2000). Das durch

DPC4 kodierte zytoplasmatische Protein SMAD4 ist Bestandteil der TGF-ß-

Signaltransduktionskaskade und wirkt als Transkriptionsfaktor (Lagna et al.,

1996). Eine homozygote Deletion konnte in etwa 50% aller Pankreaskarzinome

beobachtet werden, Loss of heterozygosity wird für bis zu 90% aller Tumoren

vermutet (Hahn et al., 1996). Interessanterweise war in Untersuchungen von

Rozenblum et al. (1997) eine Inaktivierung von DPC4 stets von einer

Inaktivierung von P16INK4a begleitet.

1 Einleitung 7

1.1.4.5 Sonstige genetische Veränderungen Weitere, häufig in duktalen Pankreasläsionen detektierte Alterationen sind in

Tabelle 1.2 zusammengefasst (nach Bardeesy et al., 2002; Jaffee et al., 2002).

Genetische Alteration Zelluläre Funktion

Überexpression der Rezeptortyrosinkinasen EGF-R und

ERBB2 (HER-2/NEU) sowie ihrer Liganden EGF und TGFα

Bestandteil der zellulären Signaltransduktionskaskade zur

Stimulation des Zellzyklus

Inaktivierung des Tumorsuppressorgens P14ARF

(identischer Genlokus wie P16INK4a)

Stabilisierung von P53

Überexpression des Proteins P21WAF1/CIP1

Regulation des Zellzyklus

Tabelle 1.2: Weitere häufige genetische Veränderungen in duktalen Pankreaskarzinomen. Gegenwärtig werden in zahlreichen Studien „neue“ genetische Veränderungen,

wie zum Beispiel die Up-Regulation der CDC25-Phosphatase in Pankreas-

karzinomen (Guo et al., 2004) erforscht.

1.1.5 Das familiäre Pankreaskarzinom Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass bei etwa 10% aller Pankreas-

karzinome familiäre Aspekte eine wesentliche Rolle spielen (Simon u. Printz,

2001; Lynch et al., 1990). So existieren zahlreiche meist autosomal-dominant

vererbte genetische Syndrome, die mit einem erhöhten Risiko einhergehen, an

Bauchspeicheldrüsenkrebs zu erkranken (Hall et al., 2002).

Im Falle der chronischen hereditären Pankreatitis liegt eine Keimbahnmutation

des PRSS1-Gens auf Chromosom 7q34 vor, das für ein kationisches

Trypsinogen-Gen kodiert (Whitcomb et al., 1996). Anlageträger weisen ein

gegenüber der Normalbevölkerung 20-fach erhöhtes Risiko auf, einen malignen

Prozess des Pankreas zu entwickeln (Lynch et al., 2002).

Neben hamartomatösen gastrointestinalen Polypen und einer perioralen

Pigmentierung treten beim Peutz-Jeghers-Syndrom mit einer Mutation im

1 Einleitung 8

STK11/LBK1-Gen auf Chromosom 19p13.3 (Jenne et al., 1998) vermehrt

gastrointestinale Malignome inklusive des Pankreaskarzinoms auf (Su et al.,

1999). Giardiello et al. (2000) sprechen sogar von einem 132-fachen relativen

Risiko gegenüber nicht betroffenen Personen.

Das hereditäre nicht-polypöse Kolonkarzinom (HNPCC) (Lynch et al., 1993)

basiert auf einer Keimbahnmutation der DNA-Mismatch-Reparaturgene hMLH1

oder hMSH2. Zusätzlich zu Dickdarm- und Endometriumtumoren können auch

hier vermehrt Pankreaskarzinome bei den Anlageträgern beobachtet werden.

Ebenso zeigt die familiäre adenomatöse Polyposis (FAP), bedingt durch eine

Mutation des APC-Tumorsuppressorgens auf Chromosom 5q21, ein vierfach

erhöhtes Risiko, an einem Pankreaskarzinom zu erkranken (Maire et al., 2002;

Seket et al., 2003), wobei hier vor allem azinäre Tumoren auftreten.

Durch eine Keimbahnmutation des P53-Genlokus entsteht das sogenannte Li-

Fraumeni-Syndrom, das in Kapitel 1.2.1 näher besprochen wird.

Dem familiären atypischen multiplen Muttermal- und Melanom-Syndrom

(FAMMM) (Lynch et al., 1975; Bergman u. Gruis, 1996) liegt eine Keimbahn-

mutation des Tumorsuppressorgens P16INK4a (CDKN2A) auf Chromosom 9p21

zugrunde. Es prädisponiert mit einem 22-fach erhöhten Risiko zur Entwicklung

eines Pankreastumors (Goldstein et al., 1995; Bartsch et al., 2002).

Schliesslich führt auch eine Keimbahnmutation im BRCA2-Gen auf Chromsom

13q13, die durch einen Eingriff in die Regulation des Zellzyklus und der DNA-

Reparatur vor allem Malignome der Mamma und des Ovars verursacht, zu einer

moderaten Erhöhung des Pankreaskarzinom-Risikos (Hahn et al., 2003).

Insgesamt liegt laut epidemiologischen Studien einem Drittel der deutschen

Pankreaskarzinom-Familien entweder eine Keimbahnmutation von CDKN2A

oder BRCA2 zugrunde (Rieder et al., 2003).

Neben den aufgeführten genetischen Syndromen konnten zahlreiche weitere

Fälle familiärer Häufung von Pankreastumoren beobachtet werden, die zwar

keiner dieser Entitäten zuzuordnen waren, aber dennoch ein bis zu 57-fach

erhöhtes Risiko bei drei betroffenen Verwandten ersten Grades mit sich

brachten, an einem Pankreaskarzinom zu erkranken (Hruban et al., 2001).

1 Einleitung 9

1.2 Die Maus als onkologisches Modell für den Menschen Die Möglichkeit, das Genom der Maus gezielt zu manipulieren, hat die Maus zu

einem der wichtigsten genetischen Modellorganismen für den Menschen

gemacht (Resor et al., 2001). Neben der Anwendung bei metabolischen und

neurodegenerativen Krankheiten wurden insbesondere im Bereich der

Onkologie zahlreiche Mausmodelle entwickelt, die wesentlich dazu beigetragen

haben, molekulare und biochemische Grundlagen der menschlichen

Krankheiten zu verstehen und moderne Therapieformen zu erforschen (Wu u.

Pandolfi, 2001). Einen Überblick über etablierte Tumormodelle und neue

methodische Ansätze bietet beispielsweise Ostrand-Rosenberg (2004).

Hintergrund dieser Modelle ist die bemerkenswerte Homologie zwischen Maus

und Mensch sowohl auf physiologischer als auch auf pathologischer Ebene. So

gleicht das murine Genom demjenigen des Menschen nicht nur hinsichtlich

Grösse und Anzahl der Gene, mittlerweile ist auch die Anordnung homologer

Chromosomenabschnitte von Maus und Mensch weitgehend bekannt. Auch in

der Tumorgenese zeigen sich erstaunliche Übereinstimmungen zwischen

beiden Organismen bezüglich der beteiligten Tumorsuppressorgene und

Onkogene sowie der Pathologie der jeweiligen Tumoren (Balmain u. Harris,

2000).

1.2.1 Knock-out-Mäuse Bei sogenannten Knock-out-Mäusen wird mit der Methode des „gene targeting“

(Capecchi, 1989; Frohman u. Martin, 1989) ein definierter DNA-Abschnitt eines

Chromosoms durch eine künstlich veränderte ähnliche Sequenz ausgetauscht,

wodurch die Expression des betroffenen Gens verändert oder inaktiviert wird.

Über diesen Prozess der homologen Rekombination kann ein künstlich

mutiertes Gen in embryonale Stammzellen eingebracht werden, die nach

anschliessender Injektion in die Blastozyste einer Maus eine permanente

genetische Modifikation in der Keimbahn erzeugen. Wird bei diesem

klassischen Knock-out-Verfahren beispielsweise ein Tumorsuppressorgen

1 Einleitung 10

ausgeschaltet, kann der Effekt dieser Inaktivierung aus dem Phänotyp der

genetisch alterierten Tiere im Vergleich zum Wildtyp abgeleitet werden.

Limitierend hierbei ist allerdings ein eventuelles Absterben der Maus noch im

Embryonalstadium durch den kompletten Verlust der Genfunktion in allen Zellen

des Organismus.

Um diesem Problem zu entgehen, wurde die Methode des konditionalen Knock-

outs entwickelt, die es erlaubt, sowohl den Zeitpunkt der Genveränderung als

auch den von der Mutation betroffenen Zelltyp festzulegen (Sauer, 1998; Nagy,

2000). Dabei macht man sich die Eigenschaft der bakteriellen Rekombinase

Cre (cyclization recombination) zunutze, spezifisch Gene zu alterieren, die von

zwei loxP (locus of crossing over of P1) - Sequenzen flankiert (= „gefloxt“) sind

(Hamilton u. Abremski, 1984). Kreuzt man also einen Mausstamm, der die Cre-

Rekombinase unter Kontrolle eines induzierbaren Promoters exprimiert, mit

einem zweiten Stamm, der ein „gefloxtes“ Tumorsuppressorgen enthält, kann in

der Tochtergeneration die Geninaktivierung durch Anschalten des Promoters zu

jedem beliebigen Zeitpunkt ausgelöst werden. Je nach gewebsspezifischer

Expression des Promoters kann zusätzlich auch das Zielgewebe des Knock-

outs beeinflusst werden. Flesken-Nikitin et al. (2003) konnten etwa durch

Inokulation eines Cre-haltigen Adenovirus in eine p53/Rb1-„gefloxte“ Maus

Ovarkarzinome induzieren.

Als klassischer Modellorganismus in der Onkologie gilt die p53-Knock-out-Maus

(Jacks et al., 1994), bei der durch homologe Rekombination mit einem das

Neomycinresistenzgen tragenden Integrationsvektor ca. 40% der kodierenden

Sequenz von p53 deletiert wurde. Wie bereits unter 1.1.4.3 dargestellt, ist das

Tumorsuppressorgen P53 bei etwa der Hälfte aller menschlichen Tumoren

mutiert (Greenblatt et al., 1994). Entfällt die physiologische Aufgabe des

Proteins, im Falle eines DNA-Schadens den Zellzyklus zu arretieren bzw. den

programmierten Zelltod durch Apoptose auszulösen (Lane, 1992), führt dies zu

erhöhter genomischer Instabilität und mutagenen Veränderungen.

Keimbahnmutationen des P53-Gens auf Chromosom 17p12 führen zum

sogenannten Li-Fraumeni-Syndrom (Evans u. Lozano, 1997), bei dem bereits in

frühem Lebensalter multiple Malignome in variabler Kombination auftreten.

1 Einleitung 11

Dabei ist etwa bei der Hälfte der heterozygoten Anlageträger ein Verlust des

normalen homologen Allels zu beobachten. Interessanterweise zeigen

heterozygote p53+/--Knock-out-Mäuse ein dem Li-Fraumeni-Syndrom sehr

ähnliches Tumorspektrum mit einem relativ zur Lebenszeit vergleichbaren

Zeitpunkt des Auftretens der Malignome und ebenfalls einem Verlust des

Wildtyp-p53-Allels in über 50% der Fälle (Donehower, 1996). So entwickelten

etwa 50% der p53+/--Knock-out-Mäuse nach einem Zeitraum von 18 Monaten

Osteosarkome, Weichteilsarkome und Lymphome. Sie gelten somit als ein

adäquates Tumormodell für das genetische Li-Fraumeni-Syndrom.

Im Gegensatz dazu konnte bei homozygoten p53-/--Knock-out-Mäusen eine

deutliche Akzeleration der Tumorgenese festgestellt werden. Bereits nach

durchschnittlich 4½ Monaten traten hauptsächlich T-Zell-Lymphome und zu

einem geringeren Prozentsatz Sarkome auf (Purdie et al., 1994). Embryonale

und postnatale Entwicklungsstörungen waren weder bei heterozygoten noch

homozygoten Tieren zu beobachten (Donehower et al., 1992).

1.2.2 Transgene Mausmodelle Mit Hilfe von transgenen Techniken ist es möglich, fremde DNA in einen

Organismus einzubringen. So kann beispielsweise über die Infektion einer

embryonalen Stammzelle mit einem Retrovirus, das ein bestimmtes humanes

Onkogen trägt, eine Maus generiert werden, die das entsprechende

Genprodukt überexprimiert, um die Auswirkungen dieses Onkogens auf den

Organismus zu studieren.

Für eine bessere örtliche und zeitliche Kontrolle der Genexpression wird auch

hier in konditionalen Modellen das Transgen an einen gewebespezifischen

Promoter gekoppelt. Das am weitesten verbreitete System benützt hierbei

Tetrazyklin-induzierbare Promotoren (Kistner et al., 1996).

Ein klassisches transgenes Mausmodell ist die transgene TGFα-Maus

(Sandgren et al., 1990). TGFα (transforming growth factor alpha) zählt zur

Familie der epidermalen Wachstumsfaktoren und ist ein Ligand des EGF-

Rezeptors, einer transmembranen Tyrosinkinase, die über die intrazelluläre

1 Einleitung 12

Signaltransduktion proliferative Stimuli vermittelt, unter anderem auch in

Pankreaszellen (Ohlsson et al., 1997). Desweiteren konnte eine Beteiligung

dieses Systems bei der Induktion verschiedener humaner Tumoren wie auch

dem Pankreaskarzinom nachgewiesen werden (Barton et al., 1991).

Sandgren und Kollegen (1990) inserierten die cDNA-Sequenz des TGFα-Gens

der Ratte zwischen ein Elastase-Promoter-Fragment der Ratte und der

Sequenz des humanen Wachstumshormons (hGH). Dieses EL-TGFα-hGH-

Konstrukt (Ornitz et al., 1985) führte nach Injektion in befruchtete Eizellen einer

Maus zur gewebespezifischen Expression von Tgfα in azinären Zellen des

Pankreas unter der Kontrolle des Elastase-Promoters. Resultat der Über-

expression von Tgfα war eine massive Fibrosierung des Pankreas (Sandgren et

al., 1990). Im weiteren Verlauf konnte eine zunehmende Transdifferenzierung

von azinären zu duktalen Zellen beobachtet werden mit charakteristischen

Veränderungen der Zellen im Hinblick auf Morphologie, Genetik und

Genexpression (Bockmann et al., 1992). Zusätzlich entwickelten sich in den

transgenen Tieren nach Ablauf von mehr als einem Jahr ausgehend von

tubulären Komplexen duktale Pankreaskarzinome (Wagner et al., 1998), so

dass eine azinär-duktale-Pankreaskarzinom-Sequenz in transgenen TGFα-

Mäusen postuliert werden konnte (Schmid et al., 1999).

1.2.3 Die TGFα/p53+/--Maus als Modell für das duktale Pankreaskarzinom Um den Prozess der Tumorgenese in diesen transgenen TGF-α-Mäusen zu

beschleunigen, wurden sie mit p53-defizienten Stämmen gekreuzt. Auf diese

Weise entstanden TGFα/p53+/+-, TGFα/p53+/-- sowie TGFα/p53-/--Mäuse im

erwarteten Verhältnis (Wagner et al., 2001).

Tatsächlich entwickelten die TGFα/p53+/--Mäuse bereits durchschnittlich nach

weniger als 300 Tagen maligne Veränderungen des Pankreas. Bei

homozygoter Inaktivierung des p53-Allels (TGFα/p53-/-) war die Latenzzeit bis

zum Auftreten der Tumoren sogar auf etwa 100 Tage verkürzt. Fast sämtliche

TGFα/p53+/--Mäuse zeigten einen Verlust des Wildtyp-p53-Allels auf dem

1 Einleitung 13

zweiten homologen Chromosom. Somit stellt die TGFα/p53+/--Maus ein

wertvolles Tumorprogressionsmodell für das duktale Pankreaskarzinom dar,

welches die zelluläre Differenzierung und die typischen genetischen

Veränderungen der humanen Erkrankung reflektiert (Wagner et al., 2001).

1.3 Chromosomenaberrationen Mutationen spielen eine wesentliche Rolle bei der Initiation und Progression der

Tumorgenese (Frank et al., 2004). Dabei unterscheidet man formal drei

verschiedene Möglichkeiten der Veränderung des genetischen Materials, die

sowohl ohne erkennbare äussere Ursache als Spontanmutation als auch durch

exogene Einflüsse als induzierte Mutation entstehen können.

Bei den sogenannten Genommutationen handelt es sich um Veränderungen

der normalen Chromosomenzahl (=Aneuploidie), wobei man bei einem Zu-

gewinn von Chromosomen von Hyperploidie spricht, während der Verlust von

Chromosomen mit dem Begriff der Hypoploidie bezeichnet wird.

Im Gegensatz dazu stellen Genmutationen mikroskopisch unsichtbare

molekulare Veränderungen dar, die meist als Punktmutationen auftreten und

lediglich ein Basenpaar umfassen. Dabei unterscheidet man im Rahmen einer

Substitution von Basen den Austausch einer Purinbase gegen eine andere

Purinbase (Transition) vom Austausch gegen eine Pyrimidinbase

(Transversion). Auch kann es sowohl zum Verlust (Deletion) als auch zum

Einfügen (Insertion) oder zur Verdopplung (Duplikation) einzelner Basenpaare

kommen, was jeweils als sogenannte Frame-Shift-Mutation zur Veränderung

des Leserasters und somit zur Synthese eines veränderten Genprodukts führen

kann. Diese Punktmutationen können selbstverständlich auch Promotor-

regionen oder Stoppcodon-Abschnitte betreffen. Genmutationen, zu denen

zusätzlich auch Fehler im Prozess des Splicing gezählt werden, stellen die am

häufigsten zu beobachtende Mutationsform dar.

Chromosomale Aberrationen als dritte Form der Mutationen können in

numerische und strukturelle Chromosomenaberrationen unterteilt werden.

1 Einleitung 14

1.3.1 Numerische Chromosomenaberrationen Unter numerischen Aberrationen werden Veränderungen in der Chromosomen-

zahl zusammengefasst.

Als häufigster und wichtigster Mechanismus gilt dabei die Non-Disjunction, die

sowohl während der Meiose als auch während der Mitose stattfinden kann. So

trennen sich beispielsweise die homologen Chromosomen während der Meiose

nicht, sondern gelangen gemeinsam in eine Tochterzelle, wodurch im Falle

einer Befruchtung mit einer normalen Keimzelle eine Zygote mit Trisomie oder

Monosomie entsteht.

Daneben ist im Rahmen der numerischen Abberationen noch die Poly-

ploidisierung anzuführen, bei der nicht einzelne Chromosomen, sondern der

gesamte Chromosomensatz vervielfacht vorliegt, wobei der begriffliche

Übergang zur Genommutation hier fliessend ist.

1.3.2 Strukturelle Chromosomenaberrationen Strukturelle Chromosomenaberrationen werden durch Brüche an einem oder

mehreren Chromosomen verursacht. Dadurch kommt es zum Freiwerden

einzelner instabiler Chromosomenstücke, welche durch Reparatur-

mechanismen nur bedingt wieder zusammengefügt werden können. Man

differenziert balancierte Strukturveränderungen ohne Verlust oder Zugewinn

von genetischem Material von unbalancierten Aberrationen, die zum Verlust

oder Gewinn von Erbinformationen führen. Je nach Art der Strukturveränderung

können die im folgenden dargestellten Prozesse unterschieden werden.

1.3.2.1 Deletion

Der Verlust eines Chromosomensegments kann sowohl im Bereich des

Zentromers (zentrische Deletion) als auch zwischen zwei Bruchpunkten

(interstitielle Deletion) sowie endständig (terminale Deletion) erfolgen (siehe

1 Einleitung 15

Abbildung 1.1). Mikroskopisch nicht erfassbare Deletionen werden auch als

Mikrodeletionen bezeichnet.

Abbildung 1.1: Terminale Deletion (A) und Interstitelle Deletion (B) mit Ringbildung.

1.3.2.2 Translokation

Bei einer Translokation (siehe Abbildung 1.2) kommt es zur Übertragung und

Insertion eines Chromosomenfragments an eine andere Stelle. Findet dabei ein

wechselseitiger Austausch zweier Abschnitte statt, spricht man von einer

reziproken Translokation. Als Sonderfall gilt die sogenannte Robertsonsche

Translokation, bei der zwei akrozentrische Chromosomen im Bereich der

Zentromere miteinander verschmelzen (= zentrische Fusion).

1.3.2.3 Duplikation Liegt ein Chromosomenabschnitt im haploiden Chromosomensatz in zwei

Kopien vor, bezeichnet man dies als Duplikation (siehe Abbildung 1.3).

1 Einleitung 16

Abbildung 1.2: reziproke Translokation (A) und Robertson´sche Translokation (B).

Abbildung 1.3: Duplikation (A) und parazentrische Inversion (B). 1.3.2.4 Inversion Die Drehung eines Chromosomensegments um 180° zwischen zwei Bruch-

punkten wird unter dem Begriff der Inversion zusammengefasst. Je nachdem,

ob das Zentromer in die Inversionsregion mit eingeschlossen ist oder nicht,

unterscheidet man die perizentrische von der parazentrischen Inversion (siehe

Abbildung 1.3).

1.3.2.5 Sonstige strukturelle Chromosomenaberrationen Als weitere Strukturabnormitäten gelten die sogenannten Isochromosomen, die

durch eine Quer- statt Längsteilung des Zentromerapparates während der

1 Einleitung 17

Mitose entstehen und folglich aus zwei homologen Armen mit identischem

Genmaterial bestehen.

Desweiteren können die terminalen Enden eines Chromosomenbruchstücks zu

kreisförmigen DNA-Molekülen in Form von Ringchromosomen (siehe Abbildung

1.1) verschmelzen.

(adaptiert nach Seyffert et al., Fischer-Verlag (1998); Tariverdian et al.,

Springer-Verlag (2004))

1.4 Spectral Karyotyping (SKY)

Spectral Karyotyping (SKY) ist ein modernes molekular-zytogenetisches

Verfahren zur Chromosomenanalyse in Forschung und Klinik. Durch die

Kombination aus Fluoreszenz-Mikroskopie, Spektroskopie und hochauflösender

CCD (charge-coupled device) - Kameratechnik ist es möglich, sämtliche 24

Chromosomen des Menschen bzw. alle 21 Chromosomen der Maus simultan in

unterschiedlichen Farben darzustellen und dadurch chromosomale

Aberrationen und komplexe Markerchromosomen eindeutig zu erkennen

(Schröck et al., 1996; Liyanage et al., 1996). Insbesondere können häufig kleine

Veränderungen bis 1-2 Mb identifiziert werden, die der Untersuchung durch

herkömmliche Methoden entgehen (Fan et al., 2000).

Für die Analyse werden chromosomenspezifische DNA-Proben verwendet, die

durch fünf verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe (Spectrum Green, Cy3, Texas

Red, Cy5 und Cy5.5) sowie Kombinationen aus denselben eindeutig markiert

sind, so dass jedes Chromosom durch ein individuelles Fluoreszenzspektrum

charakterisiert ist und auf diese Weise identifiziert werden kann. Ein

kommerziell erhältliches Gemisch aus diesen markierten DNA-Proben (Sky

PaintTM Kit®, Applied Spectral Imaging, Isreal) wird nach Standardmethoden auf

Metaphasechromosomen in situ hybridisiert.

Nach erfolgreicher Hybridisierung folgt die Bildaufnahme der nun fluoreszenz-

markierten Chromosomen mit Hilfe des Spectra Cube®-Systems, das über eine

C-Mount-Verbindung an jedes beliebige Fluoreszenzmikroskop angeschlossen

1 Einleitung 18

werden kann. In einer einzigen Aufnahme wird das komplette Spektrum des

Lichts, das durch das Chromosomenpräparat emittiert wird, für jeden Bildpunkt

gleichzeitig erfasst. Dabei passiert das durch die Fluorochrome ausgesandte

Signal einen Triple-Pass-Filter und wird anschließend durch die Mikroskopoptik

und ein Sagnac-Interferometer auf eine digitale, thermoelektrisch gekühlte

CCD-Kamera geleitet. Das computergestützte Spektrometer entwickelt während

der Messung für jeden erfassten Pixel ein Interferogramm, aus dem durch

Fourier-Transformation (Malik et al., 1996) das genaue Spektrum berechnet

werden kann.

Nach einer kurzen Aufnahmezeit können die digitalisierten Bilder mit Hilfe der

Anwendersoftware SKY View® auf einem angeschlossenen Computer dar-

gestellt werden, wobei die Spektraldaten zunächst proportional zur Intensität

der ermittelten Fluoreszenz als Rot-Grün-Blau-(RGB)-Bild präsentiert werden.

Um die Zuordnung der Chromosomen während der Auswertung zu erleichtern,

wird parallel zum Spektralbild ein Bild der DAPI (4´-6´-Diamino-2-Phenylindol)-

Gegenfärbung aufgenommen, das durch die Software in der Bandendarstellung

verstärkt wird und somit nahezu Informationen einer G-Bänderung liefert.

Zusätzlich kann anschliessend mit Hilfe eines Algorithmus, der sämtlichen

Bildpunkten mit identischer Spektralfarbe eine eindeutig definierte Falschfarbe

zuordnet, eine Darstellung der Metaphase in 24 bzw. 21 Farben entwickelt

werden, die eine einfache Klassifizierung der Chromosomen erlaubt. Die

Chromosomen werden nun übersichtlich in einer Karyotyptafel angeordnet, und

eventuell vorhandene Abberationen können gesondert herausgestellt werden

(adaptiert nach Köhler u. Gräwe, Anwenderbericht SKY).

Insbesondere für die Tumorzytogenetik dient Spectral Karyotyping durch seine

schnelle und einfache Anwendung bei gleichzeitig hoher Genauigkeit als

wertvolles Hilfsmittel. So konnten seit Etablierung der Methode 1996 zahlreiche

Chromosomenabberationen in Tumorzelllinien, hämatologischen Malignomen

und soliden Tumoren bei Mensch und Maus durch SKY detektiert werden

(Schröck et al., 2000; Bayani et al., 2001).

Aktuelle Untersuchungen beim Menschen erfolgten unter anderem an Osteo-

sarkomen (Bayani et al., 2003) und Zelllinien aus dem Knochenmark von

1 Einleitung 19

Patienten mit Akuter Myeloischer Leukämie (Mrozek et al., 2003). Auch humane

Pankreaskarzinomzelllinien wurden bereits mit Hilfe von SKY analysiert

(Sirivatanauksorn et al., 2001; Ghadimi et al., 1999).

Eine grosse Erleichterung brachte das Spectral Karypotyping vor allem für die

Analyse von murinen Genomen, die durch die Ähnlichkeit der akrozentrischen

Chromosomen bezüglich Morphologie und Bandenmuster schwierig zu

charakterisieren sind. So wurden zum Beispiel murine Plasmozytom-Zelllinien

(Coleman et al., 1997) oder der Effekt einer Alteration des Brca1-Gens auf die

genetische Instabilität in Knock-Out-Mäusen (Shen et al., 1998) mit Hilfe von

SKY untersucht.

1.5 Fragestellung der Arbeit Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten verschiedene Tumorzelllinien aus

Pankreastumoren transgener TGFα/p53+/--Mäuse molekular-zytogenetisch

mittels Spektral Karyotyping (SKY) charakterisiert werden und den

entsprechenden Ergebnissen der vergleichenden genomischen Hybridisierung

(CGH) gegenübergestellt werden.

Interessent war dabei die Frage, ob die durch die CGH-Analyse beobachteten

über- und unterrepräsentierten chromosomalen Abschnitte ein entsprechendes

Korrelat in numerischen oder strukturellen Chromosomenveränderungen

zeigten. Auf diese Weise sollten bestimmte chromosomale Aberrationen

detektiert werden, die eventuell in den verschiedenen Zelllinien wiederholt

auftreten, um im Anschluss daran durch gezielte Untersuchungen mögliche

Kandidatengene aufspüren zu können, die mit der Tumorprogression in

TGFα/p53+/--Mäusen einhergehen.

Ziel war es letztendlich im Rahmen des gesamten Projekts, eine Kaskade an

sekundären genetischen Veränderungen aufzuzeigen, die für die Tumorgenese

der duktalen Pankreaskarzinome in TGFα/p53+/--Mäusen verantwortlich ist.

2 Material und Methoden 20

2 Material und Methoden

2.1 Chemikalien und Bioreagenzien Folgende Chemikalien und Lösungsmittel wurden für die Versuchsreihen

verwendet und bei den jeweils angeführten Firmen bezogen:

Ampuwa – steriles pyrogenfreies Fresenius, Bad Homburg Aqua ad injectabilia

BSA (Bovines Serum Albumin) Serva, Heidelberg

Citronensäuremonohydrat Merck, Darmstadt

DABCO (1,4 – Diazabicyclo-Octan) Sigma, Deisenhofen

DAPI (4´-6´-Diamidino-2-Phenylindol) Serva, Heidelberg

Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat Merck, Darmstadt

Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline 10x Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Ethanol 99,8 % (Rotipuran®) Roth, Karlsruhe

Fixogum Marabu, Hamm

Formaldehydlösung, mind. 37% z.A. Merck, Darmstadt

Formamid Fluka, Buchs

Glycerin (wasserfrei) Merck, Darmstadt

Magnesiumchlorid Merck, Darmstadt

Natriumchlorid Merck, Darmstadt

Natriumcitrat Merck, Darmstadt

Pepsin Riedel, de Haen

Salzsäure Merck, Darmstadt

TRIS (Trishydroxymethylaminomethan) Merck, Darmstadt

Tween® 20 Applichem, Darmstadt

Vectashield® Vector, Burlingame (USA)

Tabelle 2.1: Verwendete Chemikalien und Lösungsmittel mit jeweiliger Bezugsquelle.


2.2 Puffer und Lösungen Blockpuffer 3% BSA 4x SSC 0,1% Tween® 20 DABCO-Antifade-Solution 0,223 g DABCO 200 µl 1M Tris, pH 8,0 9 ml 100% Glycerol ad 10 ml H2O DAPI-Stammlösung (20%) 2 mg DAPI 10 ml Mc Ilvaine-Puffer pH 7,0 DAPI-Färbelösung (0,3 µl/ml) 150 µl DAPI-Stammlösung 100 ml Mc Ilvaine-Puffer pH 7,0 Denaturierungslösung 70% Formamid / 2x SSC, pH 7,0 Detektionspuffer 1% BSA 4x SSC 0,1% Tween® 20 Mc Ilvaine-Puffer, pH 7,0 0,1 M Citronensäuremonohydrat 0,2 M Di-Natriumhydrogen- phosphat-Dihydrat PBS (Phosphate Buffered Saline) 0,15 M NaCl 0,05 M NaHPO4 1x PBS / 50 mM MgCl2 50 ml 10x PBS 25 ml 1 M MgCl2 ad 500 ml dH2O 20x SSC (Standard Saline Citrate) 3 M NaCl 0,3 M NaCitrat HCl ad pH 7,0 Waschlösung I 50% Formamid / 2x SSC, pH 7,0 Waschlösung II 1x SSC, pH 7,0 Waschlösung III 4x SSC / 0,1% Tween® 20, pH 7,0


2.3 Antikörper und Reagenziensysteme Fluorescin Avidin FITC Vector, Burlingame (USA) SKY PaintTM Kit Applied Spectral Imaging Ltd., (Mouse SKY Reagent, Blocking Reagent, Migdal HaÉmek (Israel) Buffer One, Buffer Two, Anti-Fade DAPI Reagent) 2.4 Geräte und Materialien Fluoreszenzmikroskop Axiophot® Zeiss, Oberkochen

Spectra-Cube® System Applied Spectral Imaging Ltd., Migdal HaÉmek (Israel) Spectral Imaging® Software, Version 2.5 Applied Spectral Imaging Ltd., Migdal HaÉmek (Israel) SKY View® Software Program, Applied Spectral Imaging Ltd., Version 1.6.1 Migdal HaÉmek (Israel) Easy-FISH® Software Program, Version 1.1 2.5 Etablierung der Zelllinien

2.5.1 Herkunft der Tumoren

Die vorliegenden Zelllinien wurden an der Universität Ulm aus Tumormaterial

von transgenen Mäusen gewonnen. Es handelt sich dabei um Tiere, die den

Wachstumsfaktor TGFα unter der Kontrolle des Elastase-Promotors der Ratte

EL-TGFα-hGH überexprimieren (Sandgren et al.,1990) und dadurch nach einer

Latenzzeit von über einem Jahr duktale Pankreaskarzinome entwickeln

(Wagner et al.,1998). Diese genetisch alterierten Mäuse gelten als adäquate

Modellvorstellung für die Entstehung des menschlichen Pankreaskarzinoms

(Wagner et al., 2001). Um den Prozess der Tumorgenese zu beschleunigen,


wurden diese transgenen Tiere mit Knock-out-Mäusen gekreuzt, bei denen das

Tumorsupressorgen p53 ausgeschaltet wurde (Jacks et al.,1994). Die daraus

hervorgegangenen TGFα/p53+/--Mäuse entwickelten tatsächlich bereits nach

Ablauf von etwas mehr als einem halben Jahr maligne Veränderungen der

Bauchspeicheldrüse.

Für die Gewinnung der Zelllinien aus den Pankreastumoren dieser genetisch

veränderten Mäuse wurde nach den im folgenden dargestellten zwei

verschiedenen Prinzipien verfahren.

2.5.2 Isolation von Tumorzellen durch mechanische Zerkleinerung

Bei der ersten Variante zur Gewinnung von Karzinomzellen wurde das

Tumorstück sofort nach Entnahme in eine Petrischale mit Kulturmedium

(IMDM:RPMI 4:1 ohne FKS, Amphothericin B 1:100, 2 mM L-Glutamin, 0,06%

Gentamycin) gelegt und mit einem sterilen Skalpell zerkleinert. Dem Medium

wurde dabei Amphothericin B zugesetzt, um das Wachstum von Pilzen in der

Kultur zu verhindern. Da das Medium nach der mechanischen Zerkleinerung

bereits Tumorzellen enthielt, wurde es während 10 Minuten abzentrifugiert, das

Pellet mit FKS-haltigem Medium (IMDM:RPMI 4:1, 10% FKS, L-Glutamin/

Gentamycin) resuspendiert und in eine mit Kollagen beschichtete Flasche

gegeben.

Die verbliebenen zerkleinerten Tumorstücke wurden anschließend in ein

Blutkultur-Röhrchen mit FKS-freiem Medium gegeben und gründlich gevortext.

Nachdem sich die größeren Stücke abgesetzt hatten, wurde der trübe

Überstand in einem neuen Röhrchen zentrifugiert und das Pellet erneut in FKS-

haltigem Kulturmedium resuspendiert und in einer weiteren beschichteten

Flasche konserviert.

Die nach dem Prozess des Vortexen verbliebenen kleineren festen

Tumorstücke wurden ebenfalls in eine Flasche mit Medium inclusive FKS

überführt, während die größeren Tumorstücke zunächst in ein neues Röhrchen

mit 3 ml FKS-haltigem Medium gegeben wurden und mit Collagenase

(50 mg/ml) für mehrere Stunden bei 37oC im Schüttelwasserbad verdaut


wurden. Anschliessend wurde die Suspension abermals zentrifugiert, das Pellet

in frischem FKS-haltigem Medium resuspendiert und in einer vierten be-

schichteten Flasche konserviert.

Im Idealfall sind auf diese Weise nach Aufarbeitung eines Tumorstücks vier

Flaschen mit Tumorzellen entstanden. Dieses Verfahren wurde von Bettina

Schreiner am Institut für Humangenetik der Universität Ulm angewandt.

Nach diesem Protokoll wurden die Zelllinien MMUPaTu 3, MMUPaTu 4 sowie

MMUPaTu 9 entwickelt.

2.5.3 Isolation von Tumorzellen durch Feinnadelaspiration

Als zweite Variante zur Gewinnung von Tumorzellen wurden aus dem frischen

Tumormaterial Zellen durch Feinnadelaspiration entnommen und direkt in eine

Petrischale mit Medium gegeben (RPMI, 10% FKS, Pen/Strep).

Auf diese Weise entstanden die Zelllinien MMUPaTu 5, MMUPaTu 7 sowie

MMUPaTu 8, die Dr. Florian Greten aus der Abteilung Innere Medizin I der

Universität Ulm etabliert hat.

2.5.4 Weitere Etablierung und Klonierung der Tumorzelllinien

Nach Gewinnen des Zellmaterials wurde dem Medium während der ersten

Tage Amphothericin zugesetzt, um einem Wachstum von Pilzen in der Kultur

vorzubeugen. Durch mehrmaliges fraktioniertes Trypsinieren wurden die

anfangs beigemischten Fibroblasten von den Tumorzellen getrennt. Nach

mehreren Passagen konnten die Zelllinien jeweils mit Hilfe des Western Blot-

Verfahrens als reine epitheliale Linien identifiziert werden, indem sie positiv für

die epithelialen Zytokeratine 8 und 18, jedoch negativ für den mesenchymalen

Marker Vimentin getestet wurden.

Zur Klonierung der einzelnen Zelllinien wurden jeweils 100 µl der auf eine Zelle

pro 100 µl verdünnten Suspension in das Loch einer 96-Well-Platte pipettiert

und nur diejenigen Klone weiter passagiert, bei denen wirklich nur die

Anheftung einer einzigen Zelle beobachtet werden konnte. Auf diese Weise


konnte sichergestellt werden, dass genetisch und morphologisch einheitliche

Kulturen vorlagen, die jeweils nur von einer einzigen Ausgangszelle

abstammten.

2.5.5 Herstellung der Chromosomenpräparate Aus den verschiedenen Zellkulturen der Tumorzelllinien wurden nach allgemein

üblicher Vorgehensweise Metaphasepräparate hergestellt.

Dazu wurden der Kultur (jeweils ca. 3x106 Zellen in 10 ml Medium (RPMI:IMDM

1:4)) etwa 10 Minuten vor Abbruch das Spindelgift Colcemid zugegeben. Dabei

wurde darauf geachtet, dass sich möglichst viele Zellen in abgerundeter Form

auf dem Höhepunkt der Mitose befanden. Durch Zugabe von 3 ml 0,15%

Trypsin/EDTA konnten anhaftende Zellen vom Boden der Zellkulturflasche

abgelöst werden. Mit 5 ml zusätzlichem Medium wurde die Suspension

während 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet

vorsichtig resuspendiert.

Um die Zellen zum Platzen zu bringen, erfolgte im Anschluss die hypotone

Behandlung mit 0,4% KCl-Lösung für 15 Minuten bei 37°C. Nach einem

erneuten Zentrifugationsschritt und Resuspension des Pellets wurde unter

ständigem Schütteln tropfenweise 5 ml frisch angesetzte eiskalte Fixierlösung

zugegeben und das Gemisch für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Dieser Vorgang

wurde mehrmals wiederholt, bevor die Zellen zuletzt mit frischer Fixierlösung

überschichtet wurden, so dass eine trübe Suspension entstand.

Vor dem Auftropfen des Zellmaterials wurden die Objektträger über Nacht in

einer Küvette mit 2 M HNO3 gereinigt, mit demineralisiertem Wasser gespült

und in Aqua bidest bei 4°C aufbewahrt. Die fixierten Zellen wurden aus

20-30 cm Höhe zu jeweils 2-3 Tropfen auf die noch feuchten Objektträger

pipettiert, anschliessend während 2-3 Tagen luftgetrocknet und bis zur

Verwendung bei -20°C über Kieselgel gelagert.


2.5.6 Übersicht der Zelllinien Die nachfolgende Tabelle gibt einen Überblick über die Herkunft und Zuordnung

der einzelnen untersuchten Tumorzelllinien.

Zelllinie

Originaltumor Durch CGH-Analyse im

Originaltumor vermutete Aberrationen

MMUPaTu 3 Duktaler Pankreastumor der Maus 307, ♀, TGFα p53+/-

Sonstige

MMUPaTu 4 +Zellen aus MMUPaTu 31

Duktaler Pankreastumor der Maus 56, ♂, TGFα p53+/-

Rb1-Verlust

MMUPaTu 5 Duktaler Pankreastumor der Maus 304, ♂, TGFα p53+/-

Rb1-Verlust

MMUPaTu 7 = Tumorzelllinie TD22


c-Myc-Gewinn

MMUPaTu 8 = MMUPaTu 7B3


c-Myc-Gewinn

MMUPaTu 9 Duktaler Pankreastumor der

Maus 67, ♀, TGFα p53+/-

Rb1-Verlust

Tabelle 2.2: Übersicht über die untersuchten Zelllinien, deren Ursprungstumoren sowie die jeweils aufgrund der CGH-Analyse der Originaltumoren vermuteten sekundären genetischen Veränderungen. ♀: weiblich, ♂: männlich. 1 Die untersuchten Objektträger der Zelllinie MMUPaTu 4 stellten sich im nachhinein als kontaminiert mit einem Zellklon der Zelllinie MMUPaTu 3 heraus. 2 Die Tumorzelllinie MMUPaTu 7 wurde von Dr. Florian Greten aus der Abteilung Innere Medizin I der Universität Ulm etabliert und wurde aufgrund ihres typischen Aberrations- musters für zahlreiche weitergehende Untersuchungen herangezogen und im folgenden als Tumorzelllinie TD2 bezeichnet. 3 Die ursprünglich als MMUPaTu 8 erhaltenen Objektträger wurden im Verlauf der Unter- suchungen als höhere Passage der Tumorzelllinie MMUPaTu 7 (=TD2) identifiziert und deshalb auch als MMUPaTu 7B bezeichnet.

In-vitro Zelllinien bieten eine hervorragende Quelle an lebenden Zellen und

genetischem Material und unterliegen als grosser Vorteil nicht der begrenzten

Verfügbarkeit des primären Tumorgewebes, das zudem für manche funktionelle

Untersuchungen kein geeignetes Material darstellt.


2.6 Comparative Genomic Hybridization (CGH)

Die vergleichende genomische Hybridisierung (CGH, Comparative Genomic

Hybridization) ist eine molekular-zytogenetische Methode zur Detektion von

genetischen Imbalancen. Dabei wird die DNA der zu untersuchenden Zellen

sowie normaler Kontrollzellen isoliert, mit unterschiedlichen Fluorochromen

markiert und anschließend auf normale Metaphaseplatten hybridisiert.

Deletionen und Amplifikationen werden durch Unter- bzw. Überrepräsentation

einer der beiden Hybridisierungssonden auf den betreffenden Chromosomen-

regionen sichtbar (Kallionemi et al., 1992; Du Manoir et al., 1993). Die Analysen

der Zelllinien mittels CGH wurden von Bettina Schreiner am Institut für Human-

genetik der Universität Ulm durchgeführt.

2.6.1 Aufbereitung der Proben-DNA

Zur Herstellung der CGH-Sonde wurden zunächst jeweils 1 µg der Tumor-DNA

mit Biotin-16-dUTP sowie 1 µg der Referenz-DNA mit Digoxigenin-11-dUTP

mittels Nick-Translation (Rigby et al., 1977; Langer et al., 1981) markiert. Die

markierten DNA-Proben wurden anschließend zusammen mit 60-80 µg muriner

c0t1-DNA zur Absättigung hochrepetitiver Sequenzen sowie 20-30 µg

unspezifischer Heringssperma-DNA gefällt, in Formamid gereinigt, denaturiert

und 45-60 Minuten bei 37°C vorhybridisiert.

2.6.2 Vorbehandlung der Chromosomenpräparate und Hybridisierung

Die Chromosomenpräparate wurden nach Standardverfahren, ähnlich wie unter

2.7.1 und 2.7.2 beschrieben, vorbehandelt, denaturiert und anschließend mit

der zuvor hergestellten DNA-Mischung für 3 Tage in einer Metallkassette im

Wasserbad bei 37°C hybridisiert.


2.6.3 Waschen und Detektion

Nach der Hybridisierung wurden ungebundene und unspezifisch gebundene

DNA-Fragmente durch stringentes Waschen entfernt. Der Nachweis erfolgte

parallel für die Biotin-markierte Tumor-DNA mit Texas-Red-Avidin (10 µg/ml)

sowie für die Referenz-DNA mit Anti-Digoxigenin-FITC (1 µg/ml) in einer

feuchten Metallkassette für 45 Minuten bei 37°C. Schließlich wurden die

Metaphasen-Objekträger nach der Inkubation mit einer DAPI-Lösung

(0,33 µg/ml) gegengefärbt.

2.6.4 Visualisierung

Die Färberesultate der Zielchromosomen wurden mit einem Fluoreszenz-

Mikroskop (Axioplan®, Zeiss) unter Zuhilfenahme geeigneter Farbfilter

visualisiert und mittels des Bildanalyse-Systems ISIS® V. 3.05 (MetaSystems)

ausgewertet.

Da zur Qualitätskontrolle der Hybridisierung jeweils eine zur Tumor-DNA

gegengeschlechtliche Referenz-DNA verwendet wurde, konnte über

Veränderungen der Gonosomen X und Y in den Zelllinien mit dieser Methode

keine Aussage getroffen werden.

2.7 Spectral Karyotyping (SKY)

Wie bereits unter 1.5 beschrieben, handelt es sich bei Spectral Karyotyping

(SKY) um eine relativ neue zytogenetische Technik, mit Hilfe derer sämtliche

Chromosomen in verschiedenen Farben eindeutig dargestellt und

nachgewiesen werden können. Auf diese Weise können komplexe

Chromosomenaberrationen schnell und zuverlässig entdeckt werden und

Markerchromosomen identifiziert werden (Liyanage et al., 1996, Schröck et al.,

1996). Dazu werden Metaphasen mit einem direktmarkierten Set an Whole


Chromosome Probes hybridisiert, wobei jedes der 21 Mauschromosomen durch

eine andere Farbkombination nachgewiesen und dargestellt wird.

2.7.1 Vorbehandlung der Chromosomenpräparate

Zunächst wurden geeignete Objektträger jeder Zelllinie unter dem Phasen-

kontrastmikroskop ausgewählt und die jeweils besten Bereiche markiert.

Die Chromosomenpräparate wurden anschließend einer Pepsinbehandlung

unterzogen, um ein besseres Hybridisierungssignal zu erzielen und den

zytoplasmatischen Hintergrund zu reduzieren. Dazu wurden die Objektträger

für 3-5 Minuten bei 37°C mit einer Pepsinlösung (6 µl in 50 ml 0,01 M HCl)

inkubiert. Die Präparate wurden danach bei Raumtemperatur zweimal für

5 Minuten in 1x PBS sowie weitere 5 Minuten in 1x PBS / 50 mM MgCl2 (pH 7,0)

gewaschen.

Um die Morphologie der Chromosomen zu erhalten, erfolgte eine weitere

Fixierung in 1% Formaldehyd (1x PBS / 50 mM MgCl2) für 10 Minuten bei

Raumtemperatur. Nach weiterem zweimaligem Waschen für jeweils 5 Minuten

in 1x PBS wurden die Präparate in einer aufsteigenden Alkoholreihe

(70%, 80%, 90%, 100%, jeweils 3 Minuten) dehydriert und anschließend

luftgetrocknet. Während sämtlicher Waschschritte wurden die Objektträger

geschüttelt.

2.7.2 Denaturierung der Chromosomen Die auf einer Heizplatte vorgewärmten Chromosomenpräparate wurden bei

70°C in 40 ml 70% Formamid / 2x SSC (pH 7,0) für 1-2 Minuten denaturiert und

anschließend sofort in einer eiskalten aufsteigenden Alkoholreihe (70%, 80%,

90%, 100%, jeweils 3 Minuten) dehydriert. Einige Metaphasen benötigten eine

längere Denaturierungszeit von mehreren Minuten.

Nach Lufttrocknung wurden die Chromosomenmorphologie und der Grad der

Denaturierung unter dem Phasenkontrastmikroskop begutachtet.


2.7.3 Vorbereitung der Sondenprobe und Hybridisierung Die Sky PaintTM Mischung wurde kurz zentrifugiert und anschließend bei 80°C

für 7 Minuten denaturiert. Während zwei weiteren Stunden wurde die mit

Parafilm versiegelte Probe im Wasserbad bei 37°C vorbehandelt. Nach

erneutem Abzentrifugieren wurden jeweils 6 µl der denaturierten und vor-

hybridisierten Sonden auf einen Objektträger mit den denaturierten

Chromosomenpräparaten aufgetragen und luftblasenfrei mit einem 18 x 18 mm

Deckglas abgedeckt. Um ein Austrocknen der Präparate zu verhindern, wurden

die Deckgläser zusätzlich mit Fixogum-Klebstoff abgedichtet.

Die Hybridisierung erfolgte in einer feuchten Kammer für 36 Stunden bei 37°C.

2.7.4 Waschen und Detektion Nach Abschluss der Hybridisierung wurde die Fixogum-Versiegelung vorsichtig

abgelöst und die Deckgläser in einer auf 45°C vorgewärmten Lösung aus

2x SSC unter Schütteln abgewaschen. Die nachfolgenden Waschschritte zur

Entfernung ungebundener und unspezifisch gebundener DNA-Fragmente

erfolgten zunächst dreimal für 5 Minuten in 50% Formamid / 2x SSC und

anschließend zweimal für 5 Minuten in 1x SSC, jeweils unter Schüttel-

bewegungen bei 45°C im Wasserbad. Zuletzt wurden die Präparate für

2 Minuten bei Raumtemperatur in 4x SSC / 0,1% Tween® 20 getaucht.

Um unspezifische Bindungen der zum Nachweis verwendeten Antikörper zu

reduzieren, wurden die Chromosomenpräparate anschliessend mit 80 µl

Blockpuffer (3% BSA / 4x SSC / 0,1% Tween® 20) eingedeckt, mit einem

24 x 60 mm Deckglas versehen und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.

Nach Ablösen der Deckgläser und Abtropfen der restlichen Flüssigkeit erfolgte

der Nachweis der markierten Sonden mittels der vom Hersteller mitgelieferten

antikörperhaltigen Detektionslösungen (Buffer One, Buffer Two). Dazu wurden

in zwei aufeinanderfolgenden Arbeitsschritten jeweils 80 µl der entsprechenden

Pufferlösung auf die Objektträger aufgetragen, die Präparate mit einem 24 x 60

mm Deckglas abgedeckt und in einer feuchten Kammer bei 37°C für 45 Minuten


inkubiert. Im Anschluss an den jeweiligen Nachweisschritt konnten die

überschüssigen Antikörper durch dreimaliges Waschen unter Schütteln im

Wasserbad bei 45°C für 3 Minuten in 4x SSC / 0,1% Tween® 20 entfernt

werden. Um eine Abschwächung des Fluoreszenz-Signals zu vermeiden,

wurden die lichtempfindlichen Präparate dabei stets in mit Aluminiumfolie

bedeckten Küvetten transportiert.

Schliesslich wurden die Objektträger bei Raumtemperatur 2 Minuten in 2x SSC

getaucht, mit 150 µl DAPI-Lösung gegengefärbt und für 15 Minuten im Dunkeln

inkubiert. Nach erneutem Spülen in 2x SSC wurden die Chromosomen-

präparate luftgetrocknet, mit ca. 40 µl Vectashield®-Antifadinglösung eingedeckt

und bis zur Mikroskopie bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt.

2.7.5 Visualisierung und Auswertung der Ergebnisse Die Aufnahme der Metaphasen erfolgte mit Hilfe des Spectra Cube®-Systems

(Applied Spectral Imaging), einer Kombination aus Interferometer und hoch-

auflösender CCD–Kamera, verbunden mit einem Fluoreszenzmikroskop der

Marke Axiophot® (Zeiss), unter Zuhilfenahme der Spectral Imaging® Software,

Version 2.5.

Anschliessend wurden die Ergebnisse anhand definierter Kriterien mit Hilfe des

Software-Programms Sky View®, Version 1.6.1 (Applied Spectral Imaging,

Isreal) ausgewertet.

2.8 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist eine molekularzytogenetische

Technik, bei der chemisch markierte DNA-Sonden direkt auf Chromosomen-

präparate hybridisiert und durch Fluoreszenzsignale sichtbar gemacht werden.

Sie gestattet in Abhängigkeit von den gewählten DNA-Sonden zielgerichtete

Untersuchungen auf numerische oder strukturelle Chromosomenaberrationen

(Leitch et al., 1994; Swiger et al., 1996).


Im vorliegenden Fall wurden Sonden verwendet, die jeweils das gesamte

Chromosom anfärben (WCP = Whole Chromosome Painting), um Transloka-

tionen oder Markerchromosomen genauer zu spezifizieren, die durch SKY

aufgedeckt wurden oder teilweise nicht eindeutig zugeordnet werden konnten.

Dabei handelte es sich einerseits um WCP-Proben, die direkt mit dem

Fluorochrom Texas Red versehen waren (WCP 5, WCP X), andererseits um

Digoxigenin markierte WCP-Sonden, welche erst durch die anschliessende

Zugabe von mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC (Fluoresceinisothiocyanat)

gekoppeltem Anti-Digoxigenin sichtbar gemacht wurden (WCP 13).

2.8.1 Vorbehandlung und Denaturierung der Chromosomenpräparate Die Objektträger wurden nach üblicher Vorgehensweise, wie bereits unter 2.7.1

und 2.7.2 beschrieben, mit Pepsin vorbehandelt, mehreren Waschschritten

unterzogen, mit Formaldehyd fixiert und in einer aufsteigenden Alkoholreihe

dehydriert. Anschliessend erfolgte die Denaturierung der Chromosomen bei

70°C in 70% Formamid / 2x SSC (pH 7,0) für ca. 2 Minuten.

2.8.2 Vorbereitung der Sondenprobe und Hybridisierung Die direkt markierten chromosomenspezifischen DNA-Bibliotheken für das

Chromosom 5 sowie das X-Chromosom wurden entsprechend der Hersteller-

angabe 5 Minuten im Wasserbad bei 37°C vorbehandelt, kurz zentrifugiert und

bei 72°C für 5 Minuten im Heizblock denaturiert. Nach erneutem kurzem

Abzentrifugieren und Herunterkühlen auf Eis wurden jeweils 6 µl der Probe auf

die denaturierten Chromosomenpräparate aufgetragen und mit einem

18 x 18 mm Deckglas luftblasenfrei eingedeckt. Mittels Fixogum wurden die

Deckgläschen abgedichtet und die Präparate über Nacht in einer Metallkassette

bei 37°C hybridisiert.

Von der indirekt kodierten WCP-Sonde für das Chromosom 13 wurden jeweils

7 µl pro Objektträger verwendet. Die restliche Vorbehandlung geschah analog

zur oben beschriebenen Vorgehensweise mit einer Denaturierungszeit von


10 Minuten bei 72°C im Heizblock und einer Vorhybridisierung während 2

Stunden im Wasserbad bei 37°C.

2.8.3 Waschen und Detektion Am darauffolgenden Tag wurden die direkt kodierten Präparate zunächst

2 Minuten in 0,5x SSC bei 72°C und danach zweimal für 3 Minuten in 2x SSC

bei Raumtemperatur gewaschen. Wegen der Lichtempfindlichkeit der

Fluorochrome wurden wiederum aluminierte Küvetten verwendet. Die

Chromosomen wurden danach mit 150 µl einer DAPI-Lösung gegengefärbt und

für 15 Minuten im Dunkeln inkubiert. Nach kurzem Eintauchen in 2x SSC für

5 Minuten wurden die Objektträger schliesslich mit 40 µl DABCO-Antifade-

Lösung eingedeckt und bis zur Mikroskopie bei 4°C aufbewahrt.

Der Nachweis der Digoxigenin-markierten Sonde erfolgte nach stringentem

Waschen für 5 Minuten bei 72°C in 2x SSC sowie für 2 Minuten in 2x SSC bei

Raumtemperatur. Dazu wurden die Präparate zunächst für 30 Minuten mit

100 µl Blockpuffer (3% BSA / 4x SSC / 0,1% Tween® 20) inkubiert, um

unspezifische Bindungen der Antikörper zu verringern. Danach wurden 150 µl

Maus-Anti-Digoxigenin-FITC (Verdünnung 1:100 in Detektionspuffer (1% BSA,

4x SSC, 0,1% Tween® 20)) aufgetragen und die Objektträger für 30 Minuten in

einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert. Nicht gebundene überschüssige

Antikörper wurden im Anschluss durch dreimaliges Waschen für jeweils 5

Minuten in 4x SSC / 0,1% Tween® 20 in lichtundurchlässigen Küvetten bei

Raumtemperatur entfernt. Analog zu oben wurden die Präparate schliesslich

mit 150 µl DAPI für 15 Minuten inkubiert, kurz in 2x SSC gespült und mit 40 µl

DABCO-Antifade-Lösung eingedeckt.


2.8.4 Visualisierung und Auswertung der Ergebnisse Die Färberesultate der Zielchromosomen wurden mit einem Fluoreszenz-

Mikroskop (Axiophot®, Zeiss) unter Zuhilfenahme spezifischer Filter-

kombinationen für die verwendeten Fluorochrome DAPI, Texas Red und FITC

ausgewertet. Als Analyseprogramm am Computer diente die Software Easy-

FISH®, Version 1.1.

3 Ergebnisse 35

3 Ergebnisse 3.1 Etablierung der Zelllinien

Als Grundlage für die Entwicklung der Tumorzelllinien diente die Beobachtung,

dass in der CGH-Analyse der jeweiligen Ursprungstumoren verschiedene

wiederkehrende Aberrationsmuster aufgetreten waren. Daher sollte von jedem

Tumortyp mindestens eine Zelllinie etabliert werden, um die beobachteten

Veränderungen genauer zu charakterisieren. Die spezifischen Aberrationen

waren dabei Imbalancen des Chromosoms 11 mit einem Gewinn des

proximalen Abschnitts inklusive des Egfr-Genlokus sowie einem Verlust des

das Tumorsuppressorgen p53 beinhaltenden distalen Abschnitts. In

Kombination mit diesem typischen Muster konnte entweder der Verlust des

distalen Chromosoms 14 mit dem Genort des Tumorsuppressorgens Rb1

(MMUPaTu 4, 5, 9) oder ein Gewinn des Chromosoms 15 inclusive des c-Myc-

Onkogens (MMUPaTu 7, 8=7B) beobachtet werden. Andere Tumoren zeigten

dagegen eher uncharakteristische Aberrationsmuster (MMUPaTu 3). Eine

Übersicht über die untersuchten Zelllinien wurde bereits in Tabelle 2.1

dargestellt.

3.2 Molekular-zytogenetische Charakterisierung der Zelllinie MMUPaTu 7 = TD2 Die Zelllinie MMUPaTu 7 wurde aus Gewebe des undifferenzierten soliden

Adenokarzinoms der männlichen Maus Nr. 5 von Dr. Florian Greten aus der

Abteilung Innere Medizin I der Universität Ulm etabliert und im weiteren Verlauf

als Pankreaskarzinomzelllinie TD2 bezeichnet. Der Ursprungstumor war in der

CGH-Analyse neben der Veränderungen an Chromosom 11 durch einen

Gewinn des Chromosoms 15 inclusive des c-Myc-Lokus aufgefallen.

3 Ergebnisse 36

3.2.1 CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 7 = TD2 Bettina Schreiner aus der Abteilung Humangenetik der Universität Ulm

analysierte aus der Zelllinie TD2 bei Passage 25 extrahierte DNA mittels

vergleichender genomischer Hybridisierung. Als Amplifikationen wurden dabei

Gewinne an chromosomalem Material bezeichnet, deren Verhältnis Tumor-DNA

zu Referenz-DNA im CGH-Profil den Wert von 1,5 überschritt.

Abbildung 3.1 zeigt die detektierten Aberrationen mit einer Amplifikation des

proximalen Abschnitts von Chromosom 11 und einem Gewinn fast des

gesamten Chromosoms 17. Zusätzlich konnte ein deutlicher Ausschlag des

CGH-Profils am Beginn der unteren Hälfte des Chromosoms 15 festgestellt

werden, der allerdings den oberen Schwellenwert nicht ganz erreichte.

Abbildung 3.1: CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 7 = TD2. Als unterer und oberer Schwellenwert wurden 0,8 bzw. 1,25 festgelegt. Rot dargestellt sind Gewinne, grün Verluste an chromosomalem Material.

3 Ergebnisse 37

3.2.2 SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 7 = TD2 Aus Passage 20 der Zelllinie TD2 wurden insgesamt 16 Metaphasen durch

SKY charakterisiert. Die Anzahl der Chromosomen variierte dabei zwischen 42

und 80 mit einem durchschnittlichen Wert von 70 Chromosomen pro

Metaphase. 81% der untersuchten Metaphasen waren hypertriploid bis

hypotetraploid mit einer Chromosomenzahl zwischen 67 und 80. Abbildung 3.3

zeigt eine repräsentative Metaphase der SKY-Analyse der Zelllinie.

Überwiegend konnten numerische Aberrationen detektiert werden. Mit

Ausnahme der Gonosomen X und Y, die lediglich ein- bis zweimal vorhanden

waren, sowie des nur zwei- bis dreimal pro Metaphase nachgewiesenen

Chromosoms 11 waren sämtliche Chromosomen in drei- oder vierfacher Anzahl

repräsentiert. Das Chromosom 17 konnte sogar jeweils 4 bis 5 mal gezählt

werden.

Daneben traten zahlreiche kleine Markerchromosomen auf, deren Anzahl in

den einzelnen Metaphasen zwischen 2 und 9 variierte und deren Herkunft auch

durch SKY nicht eindeutig identifiziert werden konnte.

Als auffälligste Veränderung war in 94% der untersuchten Metaphasen ein

grosses Markerchromosom enthalten, das in der invertierten DAPI-Bänderung

im proximalen Anteil drei distinkte dunkle Banden aufwies. Dieser Abschnitt

konnte als Material von Chromosom 11 identifiziert werden, während der distale

Anteil des Markerchromosoms von Chromosom 5 stammte (siehe Abbildung

3.2).

Abbildung 3.2: Markerchromosom t(11;5) der Zelllinie TD2.

3 Ergebnisse 38

Abbildung 3.3: SKY-Analyse einer repräsentativen Metaphase der Zelllinie MMUPaTu 7 = TD2. (A) Invertiertes DAPI-Bild. (B) RGB-Bild nach Hybridisierung mit den SKY-Proben. (C) Pseudofarben-Bild nach pixelgenauer Klassifizierung der Spektraldaten. (D) Karyotyp der Metaphase mit 71 Chromosomen. Das Markerchromosom t(11;5) sowie die kleinen, nicht zuzuordnenden Markerchromosomen sind in der untersten Reihe dargestellt.

3 Ergebnisse 39

In einer einzelnen Metaphase konnte zusätzlich eine weitere strukturelle

Aberration in Form einer Translokation t(1;9) beobachtet werden.

3.2.3 Charakterisierung des Markerchromosoms 11 mittels FISH-Analyse Zur Bestätigung der Herkunft des distalen Abschnitts des durch SKY

detektierten grossen Markerchromosoms 11 wurden im Anschluss WCP-

Sonden für das Chromosom 5 auf einige Metaphasen der Zelllinie TD2

hybridisiert. Abbildung 3.4 zeigt neben den drei angefärbten regulären Kopien

des Chromosoms 5 das Markerchromosom, dessen distaler Anteil ebenfalls mit

dem für Chromosom 5 spezifischen Farbstoff Texas-Red koloriert ist.

Abbildung 3.4: FISH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 7 mit WCP 5. Das für das

Chromosom 5 spezifische Fluorochrom Texas-Red schlägt sich zusätzlich zu den drei regulären Chromosomen 5 auch auf dem distalen Anteil des grossen Markerchromosoms nieder.

3 Ergebnisse 40

3.3 Molekular-zytogenetische Charakterisierung der Zelllinie MMUPaTu 8 = 7B Die ursprünglich als MMUPaTu 8 bezeichneten zur Untersuchung bereit-

gestellten Präparate stellten sich im nachhinein als höhere Passagen der

bereits untersuchten Tumorzelllinie MMUPaTu 7 = TD2 heraus und wurden

daher im folgenden auch unter dem Namen MMUPaTu 7B geführt.

3.3.1 CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 8 = 7B Im Vergleich zu den früheren Passagen der Zelllinie zeigte sich in der CGH-

Analyse bei Passage 58 weiterhin die detektierte Amplifikation des proximalen

Chromosoms 11 sowie der deutliche Ausschlag des CGH-Profils nach rechts im

mittleren Bereich des Chromosoms 15. Der Gewinn des Chromosoms 17

erreichte allerdings nicht mehr den oberen Schwellenwert. Zusätzlich konnte

eine Amplifikation beinahe des gesamten Chromosoms 6 mit Betonung im

distalen Bereich festgestellt werden, die in früheren Passagen nicht aufgetreten

war (siehe Abbildung 3.5).

Abbildung 3.5: CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 8 = 7B. Dargestellt sind nur die aberrierten Chromosomen. 3.3.2 SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 8 = 7B Aus der Zelllinie MMUPaTu 8 = 7B wurden ebenfalls 16 Metaphasen mit SKY

analysiert. Es zeigte sich wiederum ein hypertriploider bis hypotetraploider

3 Ergebnisse 41

Chromosomensatz mit einer durchschnittlichen Anzahl von 76 Chromosomen,

die in den einzelnen Metaphasen zwischen 70 und 80 schwankte.

Wie in Tabelle 3.1 und Abbildung 3.7 dargestellt, waren beinahe alle

Chromosomen drei- bis viermal pro Metaphase vorhanden, die Chromosomen

10, 16 und 17, welche auch schon im jeweiligen CGH-Profil einen mehr oder

weniger ausgeprägten Gewinn zeigten, konnten meist sogar vier- bis fünfmal

gezählt werden.

Metaphase

Chromosom 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1 3 3 3 3 3 4 3 3 4 3 4 3 4 3 3 3

2 4 2 4 4 5 3 4 3 4 3 4 4 5 4 4 3

3 5 4 3 4 4 4 3 4 3 4 4 4 4 3 4 4

4 3 3 3 3 2 3 3 3 3 4 3 3 3 3 3 2

5 3 3 3 3 2 3 4 3 4 3 3 3 3 5 4 3

6 4 4 3 3 3 4 2 4 4 4 4 3 4 3 3 3

7 3 3 5 3 4 3 4 4 3 3 3 3 3 3 3 3

8 4 4 4 4 3 4 4 4 3 4 4 4 4 3 3 3

9 3 3 2 4 4 2 3 4 4 4 3 5 3 4 2 3

10 4 4 3 4 4 4 5 4 6 4 5 5 3 3 3 3

11 3 3 4 4 4 3 3 3 3 4 4 2 3 5 3 4

12 3 3 4 3 3 4 3 4 2 3 3 3 2 3 5 4

13 3 4 5 4 3 4 4 4 4 3 3 4 3 4 5 4

14 3 4 4 4 4 4 4 4 3 3 4 4 3 4 4 3

15 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 3 3 3 3 3 3

16 5 4 4 4 3 4 5 4 4 4 4 4 5 4 5 5

17 4 4 4 5 4 5 3 4 4 4 3 5 4 4 4 5

18 3 3 2 3 3 5 2 3 3 2 2 3 2 4 2 3

19 4 4 4 4 4 5 3 4 4 3 4 4 3 4 4 4

X 2 2 2 2 1 2 2 2 3 2 2 2 2 2 2 2

Y - 1 - - 1 1 1 1 - - 1 1 - - 2 2

M(11;5) + + + + + + + + + + + + + + +

t(15;6) + + + + + + + + +

t(6;15) + + + + + +

t(15;5) + 2

t(5;15) +

t(15;X) 2

Kl. Marker 2 4 4 3 5 2 5 3 5 1 2 6 4 5 6 3

Gesamtzahl 73 74 76 76 78 78 75 77 78 70 75 80 71 78 78 74

Tabelle 3.1: SKY-Analyse von 16 Metaphasen der Zelllinie MMUPaTu 8 = 7B. Numerisch überrepräsentierte Chromosomen sind rot, numerisch unterrepräsentierte grün unterlegt. Detektierte Translokationen sind blau dargestellt.

3 Ergebnisse 42

Die Geschlechtschromosomen X und Y waren dagegen auch in höheren

Passagen unterrepräsentiert mit durchschnittlich zwei X-Chromosomen je

Metaphase und sogar einem gänzlichen Verlust des auch sonst nur einfach

vorhandenen Y-Chromosoms in 44% der Fälle.

Neben den 1-6 kleinen Markerchromosomen, die durch SKY nicht zugeordnet

werden konnten, trat auch hier in 94% der untersuchten Metaphasen das schon

bekannte grosse Markerchromosom mit den drei Banden aus Material des

Chromosoms 11 im proximalen Bereich sowie Anteilen von Chromosom 5 distal

auf.

Zusätzlich konnte in 88% der Metaphasen eine in früheren Passagen noch nicht

aufgetretene strukturelle Aberration in Form einer Translokation von Material

des Chromosoms 15 auf Chromosom 6 detektiert werden. Interessanterweise

fand die Insertion in 5 der 14 beobachteten Fälle am distalen Ende des

Chromosoms 6 statt, während sie in 8 der 14 Fälle zentromernah im proximalen

Bereich erfolgte. Eine Metaphase wies sogar beide Möglichkeiten kombiniert

auf. Abbildung 3.6 stellt die beiden Varianten der Translokation einander

gegenüber, wobei auch die Grösse des inserierten Bereichs von Fall zu Fall

unterschiedlich war.

Abbildung 3.6: Translokationschromosom t(6;15) der Zelllinie MMUPaTu8 = 7B. Deutlich erkennbar ist die Integration von Material des Chromosoms 15 in Chromosom 6, wobei der Integrationsort variabel im distalen (links) oder proximalen (rechts) Abschnitt des Chromosoms auftritt. Als weitere, innerhalb der Zelllinie MMUPaTu 8 = 7B jedoch nur jeweils einmal

aufgetretene Aberrationen konnten eine Translokation von Material des

Chromosoms 15 auf das proximale Chromosom 5 (t(5;15)) sowie eine Inte-

gration von Material des Chromosoms 15 in das X-Chromosom (t(X;15)), die

sich zum Teil auch in anderen Zelllinien zeigte, detektiert werden.

3 Ergebnisse 43

Abbildung 3.7: SKY-Analyse einer Metaphase der Zelllinie MMUPaTu 8 = 7B. (A) Invertiertes DAPI-Bild. (B) RGB-Bild nach Hybridisierung mit den SKY-Proben. (C) Pseudofarben-Bild nach pixelgenauer Klassifizierung der Spektraldaten. (D) Karyotyp der Metaphase mit 73 Chromosomen. Zu beachten ist das Translokationschromosom t(6;15) sowie das Markerchromosom t(11;5).

3 Ergebnisse 44

3.3.3 Charakterisierung des Markerchromosoms 11 mittels FISH-Analyse Die Hybridisierung von WCP5-Proben auf einige Metaphasen der Zelllinie

MMUPaTu 8 = 7B ergab das zu erwartende Ergebnis mit einer Fluorochrom-

färbung des distalen Abschnitts des Markerchromosoms 11, wie bereits unter

3.2.3 dargestellt.

3.3.4 Weiterführende Untersuchungen der Zelllinie TD2 Im Anschluss an die Ergebnisse der SKY-Untersuchungen wurden von Bettina

Schreiner am Institut für Humangenetik der Universität Ulm weiterführende

Untersuchungen der Tumorzelllinie TD2 durchgeführt. Insbesondere hatten die

SKY-Analysen in den frühen Passagen kein Korrelat für den in der CGH

detektierten Gewinn von MMU 15 ergeben. Durch Echtzeit-PCR-Analysen

konnte allerdings sehr wohl eine Amplifikation des c-Myc-Lokus auf

Chromosom 15 nachgewiesen werden.

Daraufhin wurden FISH-Analysen mit c-Myc spezifischen BAC (bacterial

artificial chromosomes) - Proben durchgeführt, um die amplifizierten c-Myc-

Gene zu lokalisieren. Dabei zeigten sich in Präparaten der Zellkulturpassage 23

neben den Markierungen auf dem jeweiligen Chromosom 15 zahlreiche Signale

ausserhalb der Chromosomen. Diese extrachromosomalen Fragmente,

sogenannte „double minute“-Chromosomen (DM), waren jedoch zu klein, um

durch SKY identifiziert werden zu können (siehe Abbildung 3.8).

In höheren Passagen der Zelllinie wurde neben den DM-Signalen eine weitere

Möglichkeit der c-Myc-Amplifikation gefunden. Als grosse, homogen anfärbbare

Regionen, sogenannte Homogeneously Staining Regions (HSR), waren die

amplifizierten c-Myc-Gene in andere Chromosomen integriert (siehe Abbildung

3.8). So zeigte auch die FISH-Analyse mit WCP 15-Proben neben den

regulären Signalen Fluorochromniederschläge auf anderen Chromosomen

(siehe Abbildung 3.9). Aufgrund der in Kapitel 3.3.2 dargestellten SKY-Analysen

konnte das Chromosom 6 als Integrationsort der HSR eingegrenzt werden, was

durch eine anschliessende Hybridisierung der Metaphasen mit WCP 6 bestätigt

3 Ergebnisse 45

werden konnte. Auch hier zeigten sich die bereits durch SKY entdeckten

verschiedenen Integrationspositionen der c-Myc-Amplifikation von Chromosom

15 in Chromosom 6.

Abbildung 3.8: FISH-Analyse der Zelllinie TD2 mit c-Myc-spezifischen BAC-Proben. Frühe Passagen (links) zeigen extrachromosomale Signale als sogenannte „double minute“-Chromosomen (DM). In späteren Passagen (rechts) können zusätzlich homogen anfärbbare Regionen (HSR) beobachtet werden.

Abbildung 3.9: Hybridisierung von WCP 15 auf Metaphasen der Zelllinie TD2. Neben den regulären Signalen kommt das in andere Chromosomen in Form von HSR integrierte Material von Chromosom 15 zur Darstellung.

3 Ergebnisse 46

3.4 Molekular-zytogenetische Charakterisierung der Zelllinie MMUPaTu 9 Als Basis für die Zelllinie MMUPaTu 9 diente der Tumor Nr. 67 einer weiblichen

Maus, der in der CGH-Analyse als charakteristisches Aberrationsmuster einen

Verlust des distalen Chromosoms 14 inklusive des Rb1-Genlokus in

Kombination mit Amplifikation des proximalen Chromosoms 11 und Verlust des

distalen Anteils desselben Chromosoms aufwies.

3.4.1 CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 9 Die CGH-Analyse in Zellkulturpassage 49 zeigte die schon in der Zelllinie TD2

aufgetretenen Amplifikationen des proximalen Chromosoms 11 sowie des

mittleren Bereichs des Chromosoms 15. Desweiteren konnten minimale

Gewinne der jeweils terminalen Abschnitte von Chromosom 6 und 16 und ein

Verlust zentromernah bei Chromosom 10 verzeichnet werden, während die im

Ursprungstumor nachgewiesenen Imbalancen des distalen Chromosoms 11

sowie des Chromosoms 14 nicht mehr nachgewiesen werden konnten (siehe

Tabelle 3.2).

Gewinn Chromosom 6, 11, 15, 16

Verlust Chromosom 10

Tabelle 3.2: CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 9.

3.4.2 SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 9 Insgesamt wurden 18 Metaphasen der Tumorzelllinie MMUPaTu 9 mit SKY

charakterisiert. Auch hierbei standen wieder numerische Aberrationen im

Vordergrund. Der Chromosomensatz gestaltete sich überwiegend hypertriploid,

belegt durch eine durchschnittliche Chromosomenzahl von 65 mit einer

Schwankungsbreite zwischen 56 und 72 Chromosomen.

3 Ergebnisse 47

Während die meisten Chromosomen in der Regel dreifach vorhanden waren,

waren die Chromosomen 1, 4, 16 und X mit überwiegend zwei Kopien eher

unterrepräsentiert. Im Gegensatz dazu konnten die Chromosomen 6, 7, 8, 10,

14, 15 und 17 häufig vier- oder sogar fünffach gezählt werden. Abbildung 3.11

zeigt eine repräsentative Metaphase der Zelllinie MMUPaTu 9.

Die Anzahl der kleinen, schwer zuzuordnenden Marker war in dieser Zelllinie

eher gering. Häufig wurde dabei ein im Spektralbild grünes Markerchromosom

als Material von Chromosom 16 klassifiziert, was den Zugewinn dieses

Chromosoms in der CGH-Analyse belegen könnte.

In 72% der Metaphasen trat daneben ein auffälliges grosses Markerchromosom

mit mehreren distinkten Banden in der invertierten DAPI-Färbung auf, welches

als zu Chromosom 11 gehörend identifiziert werden konnte und in Abbildung

3.10 dargestellt ist. Ebenfalls abgebildet ist die Translokation von Material des

Chromosoms 11 auf den distalen Bereich des Chromosoms 9 (t(9;11)), die in

50% der untersuchten Metaphasen zu beobachten war. Weitere Auffälligkeiten

das Chromosom 11 betreffend waren die einmalige Translokation von

Abschnitten dieses Chromosoms an das terminale Ende von Chromosom 6

(t(6;11)) sowie die fusionsartige Aneinanderlagerung zweier Chromosomen 11

in vier Fällen.

Abbildung 3.10: Aberrationen des Chromosoms 11 in der Zelllinie MMUPaTu 9. Links ist das grosse Markerchromosom mit mehreren distinkten Banden in der invertierten DAPI-Färbung dargestellt. In der mittleren Abbildung ist die Translokation von Material des Chromosoms 11 auf das distale Chromosom 9 zu sehen. Rechts: Anlagerung von Abschnitten des Chromosoms 11 an Chromosom 6.

3 Ergebnisse 48

Abbildung 3.11: SKY-Analyse einer Metaphase der Zelllinie MMUPaTu 9. (A) Invertiertes DAPI-Bild. (B) RGB-Bild nach Hybridisierung mit den SKY-Proben. (C) Pseudofarben-Bild nach pixelgenauer Klassifizierung der Spektraldaten. (D) Karyotyp der Metaphase mit 66 Chromosomen. Numerisch auffallend ist eine Unterrepräsentation der Chromosomen 4, 16 und X, wohingegen die Chromosomen 6, 7, 8, 14, 15 und 17 vier- bis fünffach auftreten. Dargestellt ist auch das grosse Markerchromosom 11 sowie das Trans- lokationschromosom t(9;11).

3 Ergebnisse 49

Seltenere Ereignisse bei der Analyse der Zelllinie MMUPaTu 9 waren die

terminale Insertion von Material des Chromosoms 5 in Chromosom 9 (t(9;5),

28% der Metaphasen), die auch in anderen Zelllinien beobachtete Übertragung

von Anteilen des Chromosoms 15 auf das X-Chromosom (t(X;15), 11% der

Fälle), eine einmal aufgetretene Fusion der Chromosomen 2 und 3 sowie das

Vorhandensein eines vergrösserten Chromosoms 8 (17% der Metaphasen).

In weitergehenden Untersuchungen an der Universität Ulm konnten auch in

dieser Zelllinie in höheren Passagen extrachromosomale c-Myc-Amplifikationen

von Chromosom 15 in Form von „double minute“ Chromosomen (DM) nach-

gewiesen werden.

3.5 Molekular-zytogenetische Charakterisierung der Zelllinie MMUPaTu 3 Aus dem Pankreastumor der weiblichen Maus Nr. 307 wurde die Zelllinie

MMUPaTu 3 etabliert, wobei die CGH-Untersuchung des Ursprungstumors kein

spezifisches Aberrationsmuster ergeben hatte.

3.5.1 CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 3 In der CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 3 bei Passage 58 konnten

insgesamt vier auffällige Imbalancen detektiert werden. Neben einem Gewinn

des gesamten Chromosoms 17 stach vor allem eine Amplifikation am Übergang

des mittleren zum unteren Drittel des Chromosoms 8 heraus, die auch schon im

Ursprungstumor aufgefallen war. Verluste betrafen den mittleren Bereich des

Chromosoms 12 und einen zentromernahen Abschnitt des Chromosoms 5. Das

Chromosom 11 erwies sich in dieser Zelllinie als unauffällig, ebenso blieb der

Ausschlag des CGH-Profils für Chromosom 15 unterhalb des oberen

Schwellenwerts. Abbildung 3.12 gibt eine Übersicht über die erwähnten

Imbalancen.

3 Ergebnisse 50

Abbildung 3.12: CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 3.

3.5.2 SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 3 Die Charakterisierung von 16 Metaphasen der Zelllinie 3 durch SKY (siehe

Abbildung 3.14) brachte wiederum einen stark aneuploiden Chromosomensatz

hervor. Mit Ausnahme zweier Metaphasen mit einer Chromosomenzahl von 34

bzw. 121 konnten zwischen 49 und 67 Chromosomen pro Metaphase gezählt

werden. Die durchschnittliche Anzahl lag bei 63, so dass von einem triploiden

Karyotyp gesprochen werden kann. Dabei konnten allerdings zwischen den

einzelnen Chromosomen zum Teil erhebliche Unterschiede festgestellt werden.

Während die Chromosomen 1, 10 und 12 meist nur zweifach pro Metaphase

vorhanden waren, lagen die Chromosomen 2, 3 und 19 oft viermal in einer

Metaphase vor. Das Chromosom 17 konnte sogar häufig fünfmal gezählt

werden, was den deutlichen Ausschlag im CGH-Profil dieses Chromosoms

belegt.

Neben ein bis zwei kleinen Markerchromosomen, die durch SKY nicht

identifiziert werden konnten, zeigten sich mehrere sich wiederholende

strukturelle Aberrationen. In sämtlichen untersuchten Metaphasen trat ein

Fusionschromosom zwischen Chromosom 15 und einem Abschnitt des X-

Chromosoms auf, die sich am Zentromer aneinanderlagerten (t(X;15)). Dieser

Marker konnte in 63% der Fälle sogar in doppelter Ausführung beobachtet

werden. Daneben lag häufig eine Translokation eines Abschnitts von

Chromosom 12 (t(X;12), 81% der Metaphasen) oder Chromosom 13 (t(X;13),

69% der Metaphasen) auf den zentromerfernen Teil des X-Chromosoms vor.

Vor allem bei der Insertion von Material des Chromosoms 13 war das X-

Chromosom dabei stark verkürzt. Eine komplexere Aberration bot ein weiteres

3 Ergebnisse 51

Markerchromosom, bestehend aus dem zentromernahen Abschnitt von

Chromosom 13, gefolgt von Anteilen der Chromosomen 10 und 1 (t(13;10;1),

69% der untersuchten Metaphasen). Sämtliche Veränderungen konnten

mitunter zweifach pro Metaphase gezählt werden. Abbildung 3.13 stellt die

auffälligen Strukturaberrationen nebeneinander.

Abbildung 3.13: Häufige Aberrationen der Tumorzelllinie MMUPaTu 3. Abgebildet sind die Fusion von Teilen des X-Chromosoms an das Zentromer von Chromosom 15 (links), die Translokation von Material des Chromosoms 12 bzw. 13 auf das X-Chromosom (Mitte) sowie das Markerchromosom t(13;10;1) (rechts). Jeweils nur einmal vorkommende Ereignisse waren die Translokationen t(1;3)

(siehe Abbildung 3.14), t(X;2) sowie zweimal t(13;2). In einer der Metaphasen

trat zudem das schon aus der Zelllinie MMUPaTu 9 bekannte grosse

Markerchromosom 11 auf (siehe Abbildung 3.10 links). In 14 der 16 Meta-

phasen war jeweils eines der Chromosomen 8 auffällig vergrößert, was auch

gelegentlich schon in Zelllinie MMUPaTu 9 beobachtet worden war. Diese

Amplifikation konnte bereits in der CGH-Analyse detektiert werden.

3.5.3 Differenzierung des Translokationschromosoms t(X;13) durch FISH-Analyse Da die Anwendersoftware SKY View® mitunter Schwierigkeiten hatte, den

distalen Anteil des Translokationschromosoms t(X;13) als Chromosom 13 zu

klassifizieren und stattdessen das ebenfalls im Spektralbild rot dargestellte

Chromosom 7 als Möglichkeit anbot, wurden auf einige Metaphasen der

Zelllinie MMUPaTu 3 WCP13–Sonden hybridisiert. Das Ergebnis zeigte

zusätzlich zu den regulären Anfärbungen der Chromosomen 13 ein

Fluoreszenzsignal am distalen Ende eines anderen Chromosoms auf (ohne

Abbildung), so dass die Beteiligung von Chromosom 13 an der durch SKY

detektierten Translokation t(X;13) bestätigt werden konnte.

3 Ergebnisse 52

Abbildung 3.14: SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 3. (A) Invertiertes DAPI-Bild. (B) RGB-Bild nach Hybridisierung mit den SKY-Proben. (C) Pseudofarben-Bild nach pixelgenauer Klassifizierung der Spektraldaten. (D) Karyotyp der Metaphase mit 67 Chromosomen. Von den für die Zelllinie typischen Veränderungen sind numerische Verluste von Chromosom 1, 12 und zusätzlich hier 14 sowie Gewinne der Chromosomen 3, 17 und 19 zu sehen. Ebenfalls abgebildet ist das doppelt vorhandene Fusionschromosom t(X;15), die Translokation t(X;13), ein vergrössertes Chromosom 8 sowie die nur in dieser einzigen Metaphase aufgetretene Translokation t(1;3). Die Translokationen t(X;12) und t(13;10;1) konnten hier nicht beobachtet werden.

3 Ergebnisse 53

3.6 Molekular-zytogenetische Charakterisierung der Zelllinie MMUPaTu 4 Die Zelllinie MMUPaTu 4 wurde aus Gewebe des Pankreaskarzinoms der

männlichen Maus Nr. 56 gewonnen. Auch dieser Tumor wies in der

ursprünglichen CGH-Analyse einen Verlust des distalen Anteils von

Chromosom 14 samt des Rb1-Lokus sowie ein aberrantes Chromosom 11 mit

Verlust des terminalen Abschnitts auf.

3.6.1 CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 4 In der vergleichenden genomischen Hybridisierung (CGH) der Zelllinie

MMUPaTu 4 zeigten sich bei Zellkulturpassage 31 die folgenden Imbalancen

(siehe Abbildung 3.15): Gewinne des gesamten Chromosoms 15 und eines

Grossteils des Chromosoms 17 sowie Verluste in der proximalen Hälfte von

Chromosom 12 und der schon im Ursprungstumor festgestellte Verlust des

distalen Chromosoms 14. Das proximale CGH-Profil von Chromosom 11

erreichte nicht ganz den oberen Schwellenwert.

Abbildung 3.15: CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 4.

3.6.2 SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 4 Die Charakterisierung von 20 Metaphasen der Zelllinie MMUPaTu 4 mit SKY

legte schon bald den Verdacht nahe, dass die Präparate mit Zellen aus einer

anderen Linie kontaminiert waren. So konnten in der einen Hälfte der

Metaphasen zwischen 63 und 72 Chromosomen gezählt werden, während die

3 Ergebnisse 54

andere Fraktion deutlich über 100 Chromosomen enthielt. Nach genauerer

Untersuchung konnte der erste Klon der Linie MMUPaTu 3 zugeordnet werden

mit sämtlichen unter 3.5.2 beschriebenen Aberrationen: Überrepräsentierung

der Chromosomen 2, 3 und 19, das doppelt vorhandene Fusionschromosom

t(15;X) sowie die Translokation t(X;13) und das vergrösserte Chromosom 8. Die

Anlagerung von Teilen des Chromosoms 12 an das X-Chromosom t(X;12)

konnte eher selten beobachtet werden, wohingegen in 50% der Fälle zusätzlich

ein Translokationschromosom t(16;18) auffiel.

Der zweite, hochgradig aneuploide Klon muss der eigentlichen Zelllinie

MMUPaTu 4 zugerechnet werden. Dabei zeigte sich mit durchschnittlich 104

Chromosomen ein überwiegend pentaploider Karyotyp. Teilweise konnten

allerdings bis zu 127 Chromosomen pro Metaphase gezählt werden. Neben den

Chromosomen 12 und 14, wie schon durch die CGH-Analyse impliziert, waren

auch die Chromosomen 4 und 13 mit meist nur drei bis vier Kopien eher unter-

repräsentiert. Dagegen trat das Chromosom 15 in 70% der untersuchten

Metaphasen 7-8 mal auf, das Chromosom 17 in 90% sogar 8-9 mal, was die

starken Ausschläge im CGH-Profil nach rechts für diese Chromosomen belegt.

Interessanterweise konnten durchschnittlich nur jeweils drei X-Chromosomen

identifiziert werden, das Y-Chromosom ging in sämtlichen Metaphasen sogar

völlig verloren.

An strukturellen Aberrationen bot die Zelllinie MMUPaTu 4 folgende

Translokationen, die ansonsten in keiner der anderen Zelllinien beobachtet

werden konnten: t(1;12), t(7;8), t(14;11) und t(11;13). Diese Marker waren bis

auf letzteren in 100% der Metaphasen nachzuweisen und teilweise sogar

doppelt vorhanden. Interessanterweise trat in 50% der Fälle ein vergrössertes

Chromosom 11 sowie in 20% der Metaphasen ein vergrössertes Chromosom 8

auf, was auch schon aus den Zelllinien MMUPaTu 3 bzw. 9 bekannt war.

Abbildung 3.16 zeigt eine repräsentative Metaphase dieser Tumorzelllinie mit

den detektierten Imbalancen.

3 Ergebnisse 55

Abbildung 3.16: SKY-Analyse einer repräsentativen Metaphase der Zellinie MMUPaTu 4. (A) Invertiertes DAPI-Bild. (B) RGB-Bild nach Hybridisierung mit den SKY-Proben. (C) Pseudofarben-Bild nach pixelgenauer Klassifizierung der Spektraldaten. (D) Karyotyp der stark aneuploiden Metaphase mit 99 Chromosomen. Die Chromosomen 12, 13 und X treten typischerweise für diese Zelllinie eher dezimiert auf, das Y geht sogar völlig verloren. Dagegen sind die Chromosomen 15 und vor allem 17 hier mit 9 Kopien mehrfach amplifiziert. Die für die Zelllinie charakteristischen Translokationen t(1;12), t(7;8), t(11;13) und t(14;11) sind ebenfalls dargestellt. Zu beachten ist auch das schon aus anderen Zelllinien bekannte grosse Marker- chromosom 11.

3 Ergebnisse 56

Zahlreiche weitere Abberationen, die in Tabelle 3.3 zusammengefasst sind,

konnten jeweils nur ein einziges Mal in der Zelllinie MMUPaTu 4 gefunden

werden. Zudem präsentierten sich wieder ein bis vier kleine Marker-

chromosomen, die durch SKY nicht genau identifiziert werden konnten.

Selten detektierte Marker MMUPaTu 4

Translokationen t(7;6), t(7;18), t(8;1), t(8;6), t(8;7), t(15;8), t(17;2)

Sonstiges Ringchromosom 4, Fusion zweier Chromosomen 2, Fusion zweier Chromosomen 4

Tabelle 3.3: SKY-Ergebnisse MMUPaTu 4. Einmalig aufgetretene Aberrationen. 3.7 Molekular-zytogenetische Charakterisierung der Zelllinie MMUPaTu 5 Der Zelllinie MMUPaTu 5 lag der Tumor der männlichen Maus Nr. 304

zugrunde, der in der CGH-Analyse das typische Aberrationsmuster mit Verlust

des distalen Chromosoms 14 aufwies.

3.7.1 CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 5 Mittels CGH wurde bei Passage 25 aus der Zelllinie MMUPaTu 5 extrahierte

DNA analysiert. Dabei wurden Gewinne über weite Abschnitte der

Chromosomen 2 und 5 sowie am distalen Ende von Chromosom 19 festgestellt.

Ausschläge des CGH-Profils nach links im Sinne von Verlusten waren dagegen

bei den Chromosomen 4, 7, 10, 13 und 14 zu beobachten (siehe Tabelle 3.4).

Gewinn Chromosom 2, 5, 19

Verlust Chromosom 4, 7, 10, 13, 14

Tabelle 3.4: CGH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 5.

3 Ergebnisse 57

3.7.2 SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 5 Auch die Zelllinie MMUPaTu 5 brachte in der Charakterisierung durch SKY vor

allem numerische Aberrationen hervor, wobei die Ergebnisse der CGH-Analyse

zum Teil bestätigt werden konnten. So ergaben sich innerhalb der 18

untersuchten Metaphasen wie schon in der CGH Vervielfachungen von

Chromosom 2 und 19 mit jeweils 4 Kopien, zusätzlich war auch das

Chromosom 3 eher überrepräsentiert. Im Gegensatz dazu zeigten sich die

Chromosomen 4, 9, 12, 15 und 18 im Durchschnitt nur je zweimal pro

Metaphase, was die Ergebnisse der CGH-Analyse nur teilweise vermuten

liessen. Wie schon in Zelllinie MMUPaTu 4 konnte ein totaler Verlust des

Y-Chromosoms beobachtet werden. Insgesamt gestaltete sich der

Chromosomensatz meist triploid mit einer durchschnittlichen Chromosomenzahl

von 62, wobei die einzelnen Ergebnisse zwischen 50 und 65 schwankten (siehe

Abbildung 3.17).

Das schon in Zelllinie MMUPaTu 3 aufgetretene Fusionschromosom t(X;15)

(siehe Abbildung 3.13) wurde auch hier in sämtlichen Metaphasen detektiert, zu

83% sogar in doppelter Kopie. Zusätzlich zeigte sich in einem Fall eine andere

Version dieser Translokation, bei der der Anteil des X-Chromosoms nicht am

Zentromer, sondern an das distale Ende des Chromosoms 15 angelagert war.

In weiterführenden Untersuchungen an der Universität Ulm konnte gezeigt

werden, dass der Genlokus für c-Myc auf Chromosom 15 nicht am Bruchpunkt

dieser Aberration liegt.

Ebenso wie in Zelllinie MMUPaTu 3 konnten auch hier die Translokation t(X;13)

(89% der Metaphasen) und jeweils ein vergrössertes Chromosom 8 (72% der

Metaphasen) beobachtet werden. Als neu aufgetretene Modifikation wurde eine

Anlagerung von Material des Chromosoms 18 an Chromosom 16 entdeckt

(t(16;18), 78% der Fälle), die in Abbildung 3.18 vergrössert dargestellt ist.

3 Ergebnisse 58

Abbildung 3.17: SKY-Analyse der Zellinie MMUPaTu 5. (A) Invertiertes DAPI-Bild. (B) RGB-Bild. (C) Pseudofarben-Bild nach pixelgenauer Klassifizierung der Spektraldaten. (D) Karyotyp der Metaphase mit 65 Chromosomen. Numerisch zeigen sich Gewinne der Chromosomen 2, 3 und 19, dagegen Verluste der Chromosomen 4, 12 sowie des Y. Als typische Strukturanomalien dieser Zelllinie sind das doppelt vorhandene Fusionschromosom t(X;15) und die Translokationen t(X;13) sowie t(16;18) abgebildet. Das hier dargestellte grosse Marker-chromosom t(4;8) trat nur ein einziges Mal in dieser Metaphase auf.

3 Ergebnisse 59

Abbildung 3.18: Translokationschromosom t(16;18) der Zelllinie MMUPaTu 5.

Seltene Ereignisse waren ein komplexes grosses Markerchromosom t(4;8)

(siehe Abbildung 3.17), die Translokation t(5;2) sowie die Bildung eines

Ringchromosoms 4. Ein einziges Mal konnte auch das schon aus anderen

Zelllinien bekannte grosse Markerchromosom 11 gefunden werden.

Insgesamt fiel bei dieser Zelllinie eine grosse Übereinstimmung mit den aus

MMUPaTu 3 erhaltenen Ergebnissen auf. Möglicherweise könnte es sich um

einen durch Kontamination entstandenen Klon aus dieser Zelllinie handeln.

3.7.3 FISH-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 5 mit WCP X Die Hybridisierung von WCP-Proben für das X-Chromosom auf einige

Metaphasen der Zelllinie MMUPaTu 5 konnte die durch SKY detektierte

Beteiligung des X-Chromosoms an den oben aufgeführten Translokationen

bestätigen (ohne Abbildung).

3.8 Übersicht über häufig detektierte Aberrationen Tabelle 3.5 gibt eine zusammenfassende Darstellung der in den einzelnen

Zelllinien wichtigen numerischen und strukturellen Chromosomenaberrationen.

Fast durch alle Zelllinien zieht sich eine Überrepräsentation des Chromosoms

17. Auffällig ist auch der häufige Verlust von Chromosom 12 und der

Gonosomen, insbesondere des Y-Chromosoms. In struktureller Hinsicht häufen

sich Abberationen von Chromosom 11 sowie die Vergrösserung eines

Chromosoms 8. Bei einer Gegenüberstellung der vergrösserten Exemplare

dieses Chromosoms aus den verschiedenen Zelllinien zeigt sich allerdings

3 Ergebnisse 60

aufgrund des unterschiedlichen Bandenmusters, dass jeweils unterschiedliche

Amplifikationseinheiten vorliegen müssen (siehe Abbildung 3.19).

Numerische Aberrationen Strukturelle Aberrationen

Tumor-zelllinie

durchschnittl.

Chromosomen- zahl

Über-/ Unter- repräsentation Translokationen Sonstiges

MMUPaTu 7 = TD2 70 + Chr. 17

- Chr. 11, X, Y -- Marker M(11;5)

MMUPaTu 8 = 7B 76 + Chr. 10, 16, 17

- Chr. X, Verlust des Y t(6;15) Marker M(11;5)

MMUPaTu 9 65 + Chr. 6, 7, 8, 10, 14

15, 17 - Chr. 1, 4, 16, X

t(9;11)

t(6;11) (selten)

t(X;15) (selten)

Grosses Marker-

Chr.11

Vergrössertes Chr. 8 (selten)

MMUPaTu 3 63 + Chr. 2, 3, 17, 19 - Chr. 1, 10, 12

t(13;10;1)

t(X;12)

t(X;13)

Fusionschr. (X;15)

Vergrössertes

Chr. 8

Grosses Marker-Chr.11 (selten)

MMUPaTu 4 104 + Chr. 17, 19 - Chr. 4, 12, 13, 14, X,

Verlust des Y

t(1;12)

t(7;8)

t(11;13)

t(14;11)

Vergrössertes Chr. 8

Grosses Marker-

Chr.11 (selten)

MMUPaTu 5 62 + Chr. 2, 3, 19 - Chr. 4, 9, 12, 15, 18,

Verlust des Y

t(16;18)

t(X;13)

Fusionschr.(X;15)

Vergrössertes

Chr. 8

Tabelle 3.5: Zusammenfassende Darstellung der wichtigsten detektierten Aberrationen in den SKY-Analysen der untersuchten Tumorzelllinien. + = Überrepräsentation, - = Unterrepräsentation.

3 Ergebnisse 61

MMUPaTu 3 MMUPaTu 4 MMUPaTu 5 MMUPaTu 9 Abbildung 3.19: Gegenüberstellung des jeweils vergrösserten Chromosoms 8 aus den verschiedenen Zelllinien. Zuletzt soll noch eine Auflistung möglicher Kandidatengene den häufig

detektierten Aberrationen gegenübergestellt werden (siehe Tabelle 3.6).

Aberration Vergrösserung Chromosom 8

Marker M(11;5), grosses Marker-chromosom 11, t(9;11), t(6;11),

t(11;13), t(14;11)

t(14;11) Fusions-

chromosom (X;15)

t(16;18)

Mögliches

Kandidatengen

Jun-B Egfr Rb1 c-Myc Dpc4 = Smad4

Tabelle 3.6: Übersicht über entdeckte Chromosomenabberationen und mögliche damit zusammenhängende Kandidatengene.

4 Diskussion 62

4 Diskussion 4.1 Beteiligung von Signaltransduktionswegen, Zellproliferation und Apoptose am Prozess der Tumorgenese Die Entstehung von malignen Tumoren wird heute als ein mehrstufiger Prozess

akkumulierender Mutationen angesehen (Paul u. Regulier, 2001). Beteiligt sind

dabei verschiedene Onkogene, inaktivierte Tumorsuppressorgene und Mutator-

gene, die zu einem gestörten Gleichgewicht zwischen Zellvermehrung und

programmiertem Zelltod (Apoptose) führen.

Die Regulation dieser Prozesse gestaltet sich sehr komplex und wird über

zahlreiche Signaltransduktionswege gesteuert. Beispielsweise ist im vor-

liegenden Tumormodell der TGFα/p53+/--Mäuse die Ras-Erk-Signalkaskade

aktiv, die durch Bindung von TGFα an den Egf-Rezeptor induziert wird (Wagner

et al., 2001; Wagner et al., 2002). Zentrales Ziel dieses Regelkreises wie auch

vieler Onkogene und Tumorsuppressorgene ist die Beeinflussung des

Zellzyklus. Als kritisches Ereignis im Verlauf der Tumorgenese wird dabei das

Verlassen des Ruhestadiums G0 und der Übergang von der G1-Phase zur S-

Phase angesehen, in der die DNA repliziert wird. Zur Steuerung des Eintritts in

jede Phase sowie der weiteren Progression des Zellzyklus dienen komplexe

Interaktionen zwischen regulatorischen Elementen, den Cyclinen und Cyclin-

abhängigen Kinasen (CDKs) (Ivanchuk u. Rutka, 2004), deren Expression

durch mitogene Signale beeinflusst werden kann.

Auf der anderen Seite zeichnen sich maligne Zellen durch Apoptoseresistenz

aus. Der programmierte Zelltod kann extrinsisch über Todesrezeptoren sowie

intrinsich über die Mitochondrien und das Endoplasmatische Reticulum

vermittelt werden, wobei sämtliche Wege durch Mitglieder der Proteinfamilie

BCL-2 positiv und negativ reguliert werden (Daniel et al., 2003). So blockieren

beispielsweise extrinsische Apoptose-Inhibitoren wie FLIP die Aktivierung von

Effektorcaspasen, die im Zuge der Apoptose zelluläre Substrate spalten,

während intrinsische Regulatoren wie BAX die Freisetzung von Cytochrom C

aus den Mitochondrien ins Zytosol fördern, was zu einer Aktivierung von den

4 Diskussion 63

Zelltod fördernden Caspasen führt (Harada u. Grant, 2003). In dieses komplexe

Geflecht der Apoptoseregulation greifen ebenfalls zahlreiche Onkogene und

Tumorsuppressorgene ein.

Ergänzend zu erwähnen ist, dass in fortgeschrittenen Tumoren der

Mechanismus der Invasivität und Metastasierung eine entscheidende Rolle

spielt. Dadurch wird die maligne Zelle befähigt, die umgebende extrazelluläre

Matrix zu infiltrieren, sich aus der Adhäsion des Zellverbands zu lösen, an eine

andere Stelle zu wandern, dort weiter zu proliferieren und die Angiogenese zu

stimulieren, um die Versorgung des Tumors mit Sauerstoff zu gewährleisten

(Thompson u. Price, 2002).

4.2 Charakterisierung verschiedener Pankreaskarzinomzelllinien aus transgenen TGFα/p53+/--Mäusen durch Spectral Karyotyping (SKY) In der vorliegenden Arbeit wurden sechs verschiedene Zelllinien aus duktalen

Pankreaskarzinomen transgener TGFα/p53+/--Mäuse durch Spectral Karyo-

typing (SKY) analysiert. Hintergrund der Etablierung dieser Zelllinien war die

Beobachtung, dass in der Untersuchung der zugrundeliegenden Tumoren

mittels CGH und Real-Time-PCR ein charakteristisches Muster an sekundären

genetischen Veränderungen aufgefallen war (Schreiner et al., 2003). So zeigte

ein Grossteil der Karzinome eine Amplifikation des proximalen Abschnitts von

Chromosom 11 inklusive des Egfr-Lokus in Verbindung mit einem Verlust des

distalen Endes desselben Chromosoms, auf dem der Genort für das

Tumorsuppressorgen p53 lokalisiert ist. Zusätzlich zu diesen Alterationen

konnte alternativ entweder ein Gewinn des das Onkogen c-Myc tragenden

Chromosoms 15 oder ein Verlust von Chromosom 14 distal mit einer Deletion

des Rb1-Lokus beobachtet werden. Um diese Veränderungen genauer zu

charakterisieren, wurden jeweils aus Tumoren mit einem der typischen

wiederkehrenden Aberrationsmuster Zelllinien entwickelt, die durch

verschiedene molekular-zytogenetische Methoden weiter untersucht werden

sollten.

4 Diskussion 64

4.2.1 Polyploidisierung Insgesamt fiel bei der SKY-Analyse der sechs Zelllinien auf, dass jeweils eine

ausgeprägte Aneuploidie des Karyotyps vorlag mit meist triploidem bis

tetraploidem, mitunter wie in Zelllinie MMUPaTu 4 sogar noch stärker

polyploidisiertem Chromosomensatz mit bis zu 127 Chromosomen pro

Metaphase. Im Gegensatz dazu war allerdings jeweils nur eine geringe Anzahl

an strukturellen Aberrationen festzustellen. Ein solches Ergebnis konnte auch

bereits bei anderen murinen soliden Tumoren oder Tumorzelllinien beobachtet

werden. So zeigte etwa die aus Azoxymethan-induzierten Kolonkarzinomen

isolierte Maus-Tumorzelllinie AJ02-NM0 zwar einen pseudotetraploiden

Chromosomensatz, aber keine weiteren chromosomalen Instabilitäten (Guda et

al., 2004). Ähnliches konnten auch Wu et al. (2002) für Myc-induzierte murine

Lebertumoren feststellen. Im Gegensatz dazu wurden bei SKY-Analysen

humaner Pankreaskarzinom-Zelllinien multiple strukturelle Chromosomen-

veränderungen detektiert (Ghadimi et al., 1999). Eine Charakterisierung 20

verschiedener menschlicher Pankreas-Tumorzelllinien wie zum Beispiel CaPan-

2 oder PANC-1 brachte sogar die enorme Anzahl von insgesamt 344

chromosomalen Alterationen hervor, wovon mehr als 95% unbalancierte

Rearrangements waren (Sirivatanauksorn et al., 2001). Bei 14 dieser

untersuchten Zelllinien konnte die Arbeitsgruppe zusätzlich eine

Polyploidisierung des Chromosomensatzes nachweisen, so dass neben den

strukturellen Veränderungen auch der Mechanismus der numerischen

Aberration für humane Pankreaskarzinome propagiert werden kann (vgl. auch

Griffin et al., 1995).

Aus diesen Beobachtungen lässt sich schliessen, dass bei der Maus

numerische Chromosomenveränderungen bevorzugt werden, während in

menschlichen Karzinomzellen häufiger strukturelle Aberrationen auftreten, um

genetische Veränderungen zu erreichen. Ursächlich für die Aneuploidie ist eine

fehlerhafte Ausbildung der Mitosespindeln mit nachfolgender Fehlverteilung der

Chromosomen während der Zellteilung (Cahill et al., 1998). Hierbei besteht

auch ein Zusammenhang zwischen Verlust der p53-Aktivität, wie für das hier

4 Diskussion 65

vorliegende Mausmodell zutreffend, und dem Phänomen der Aneuploidie. So

arretieren Zellen mit mitotischen Defekten in Gegenwart von intaktem p53 in der

G1-Phase, während sie in Abwesenheit des Tumorsuppressorgens in die S-

Phase eintreten und schon nach wenigen Zellteilungen aneuploid werden

(Lanni und Jacks, 1998; Nigg, 2002). Daneben können bei telomerischer

Dysfunktion Fusionen und anschliessende Brüche von Chromosomen auftreten,

die normalerweise die p53-abhängige Apoptose induzieren. Fehlt p53, können

diese Zellen jedoch überleben und stark aberrante Karyotypen hervorbringen

(Artandi et al., 2000).

Duesberg und Li (2003) vertreten sogar die Hypothese, dass Aneuploidisierung

der entscheidende Faktor bei der Initiation und Progression der Tumorgenese

ist. Demnach führt Aneuploidie durch ein Ungleichgewicht von an der Mitose

und Aufrechterhaltung der Chromosomenstruktur beteiligten Proteinen und

Enzymen zu Fehlern in der Struktur und Verteilung der Chromosomen, was

eine Kette von weiteren Aberrationen nach sich zieht.

Zusätzlich zu numerischen Abweichungen konnten in den untersuchten

Tumorzelllinien auch mehrere strukturelle Aberrationen nachgewiesen werden,

die in den folgenden Abschnitten näher diskutiert werden.

4.2.2 Detektierte Aberrationen der Zelllinie MMUPaTu 7 = TD2 sowie MMUPaTu 8 = 7B Als Basis für die Zelllinie MMUPaTu 7 = TD2 diente ein duktales Pankreas-

karzinom mit den charakteristischen Alterationen des Chromosoms 11 in

Verbindung mit einem Gewinn des den c-Myc-Lokus tragenden Abschnitts auf

Chromosom 15, wie bereits unter 4.2 dargestellt. Die CGH-Analyse dieser

Zelllinie konnte dieses Muster bestätigen mit positiven Signalen im Bereich des

proximalen Chromosoms 11, im mittleren Abschnitt von Chromosom 15 sowie

zusätzlich über das gesamte Chromosom 17.

Im Spectral Karyotyping zeigten sich wie oben beschrieben fast ausschliesslich

numerische Abberationen mit einem hypertriploiden bis hypotetraploiden

Chromosomensatz. Abgesehen von einem leicht identifizierbaren Marker-

4 Diskussion 66

chromosom, das in 94% der Metaphasen auftrat und dessen proximaler

Abschnitt mit drei charakteristischen Banden Chromosom 11 und dessen

distaler Abschnitt Chromosom 5 zugeordnet werden konnte, konnten keine

weiteren Strukturabnormitäten festgestellt werden. Mehrere kleine

Markerchromosomen in variabler Anzahl waren auch durch SKY nicht eindeutig

identifizierbar, bedingt durch die untere Grenze der Auflösbarkeit für SKY

zwischen 1 und 2 Mb (Fan et al., 2000). Der Zugewinn des Chromosoms 17 in

der CGH-Analyse spiegelte sich in der im Vergleich zum Durchschnitt mit 4 bis

5 Kopien pro Metaphase erhöhten Anzahl dieses Chromosoms wieder.

Möglicherweise befindet sich hier ein noch unbekanntes Kandidatengen, das an

der Tumorentstehung in TGFα/p53+/--Mäusen beteiligt ist. Dagegen konnte

durch SKY zunächst kein Korrelat für den positiven Ausschlag des CGH-Profils

im mittleren Bereich des Chromosoms 15 detektiert werden.

Auch im Bereich des distalen Chromosoms 11, auf dem das Tumor-

suppressorgen p53 lokalisiert ist, konnten weder durch CGH noch durch SKY

Alterationen festgestellt werden. Nachdem allerdings durch LOH–Analysen

nachgewiesen wurde, dass in 95% aller Pankreastumoren von TGFα/p53+/--

Mäusen das verbleibende p53-Allel inaktiviert wird (Wagner et al., 2001), muss

davon ausgegangen werden, dass hier Punktmutationen oder Mikrodeletionen

vorliegen, die durch die Nachweisgrenze der Methoden CGH und SKY nicht

darstellbar sind. Das am häufigsten in humanen Tumoren inaktivierte Gen P53

auf Chromosom 17p13 (Olivier et al., 2002) war auch bereits bei Unter-

suchungen von humanen Pankreaskarzinom-Zelllinien durch CGH (Ghadimi et

al., 1999) und SKY (Sirivatanauksorn et al., 2001) sehr oft deletiert oder von

Mutationen betroffen. Aktiviert durch verschiedenste Formen von zellulärem

Stress wie Hypoxie oder DNA-Schädigung, schützt P53 normalerweise die Zelle

durch Arretierung des Zellzyklus über Interaktion mit cyclinabhängigen Kinasen

(CDKs) oder durch Induktion von Apoptose-induzierenden Proteinen wie zum

Beispiel BAX (Levine, 1997). Fällt diese protektive Funktion von P53 weg,

kommt es zur unkontrollierten Zellproliferation sowie zu erhöhter genetischer

Instabilität, die das Auftreten weiterer Mutationen von Onkogenen oder

Tumorsuppressorgenen begünstigt. Tatsächlich zeigten PCR-Analysen der

4 Diskussion 67

Zelllinie TD2 ebenfalls eine Deletion des Wildtypallels von p53 auf dem zweiten,

homologen Chromosom 11 (Schreiner et al., 2003).

Bei der Untersuchung von höheren Passagen der Zelllinie TD2 (MMUPaTu 8 =

7B) fiel in der CGH-Analyse zusätzlich zu den oben beschriebenen Gewinnen

der Chromosomen 11, 15 und 17 eine Amplifikation beinahe des gesamten

Chromosoms 6 auf mit Betonung im distalen Bereich. In der SKY-Analyse

zeigte sich wiederum ein hypertriploider bis hypotetraploider Chromosomensatz

mit Überrepräsentation der Chromosomen 10, 16 und 17, wohingegen eine

starke Dezimierung der Gonosomen, insbesondere des Y-Chromosoms zu

beobachten war. Ein solcher Verlust des Y-Chromosoms konnte beispielsweise

auch bei murinen Kolonkarzinomzelllinien festgestellt werden (Guda et al.,

2004), wobei die Bedeutung noch unklar ist. Neben dem auffälligen Marker-

chromosom t(11;5), das auch hier in 94% der untersuchten Metaphasen auftrat,

konnte in den späteren Passagen der Zelllinie TD2 in 88% der Fälle eine neue

Strukturaberration detektiert werden. Diese bestand in einer Translokation von

Material des Chromosoms 15 unterschiedlicher Grösse auf Chromosom 6 mit

variabler Insertionsstelle proximal (57%), distal (36%) oder kombiniert (7%).

Zudem zeigten sich vereinzelt zwei weitere Translokationen mit Beteiligung des

Chromosoms 15: t(5;15) sowie t(X;15).

4.2.2.1 Charakterisierung des Markerchromosoms t(11;5)

Bezüglich des Markerchromosoms t(11;5) lag in Verbindung mit dem Gewinn

des proximalen Chromosoms 11 in der CGH-Analyse sowie den Befunden des

der Zelllinie zugrundeliegenden Tumors der Verdacht nahe, der Genlokus des

Egf-Rezeptors könne in diese Strukturaberration involviert sein. Aufgrund der

Darstellung dreier distinkter Banden in der DAPI-Färbung konnte vermutet

werden, dass ein bestimmter Abschnitt des Chromosoms 11 in dieser

Aberration mehrfach amplifiziert vorliegt.

Bei EGF-R (Epidermal growth factor receptor) handelt es sich um ein

transmembranöses Glykoprotein mit Tyrosinkinaseaktivität, das zur Familie der

ERBB-Rezeptortyrosinkinasen zählt (Pazin u. Williams, 1992). Nach extra-

4 Diskussion 68

zellulärer Bindung spezifischer Liganden, zu denen neben EGF (Epidermal

growth factor) auch der im vorliegenden Mausmodell überexprimierte

Transforming growth factor alpha (TGFα) gehört, kommt es zur Dimerisierung

der Rezeptoren, die anschliessend durch Autophosphorylierung zyto-

plasmatischer Tyrosinreste aktiviert werden (Pazin u. Williams, 1992). Binden

nun intrazelluläre Signalmoleküle an diese Tyrosinreste, wird das Signal über

die RAS-Kaskade weitergeleitet und beeinflusst auf diesem Weg unter anderem

Zellproliferation, Überleben der Zelle, Gewebeinvasion und Angiogenese

(Olayioye et al., 2000). Wesentlich beteiligt an diesen Vorgängen sind die

Familien der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPKs) sowie der extra-

zellulär regulierten Kinasen (ERKs).

Eine Überexpression von EGF-R mit konsekutiver Aktivierung der nach-

folgenden Signaltransduktionskaskade konnten Korc et al. bereits 1992 für das

humane Pankreaskarzinom feststellen. Demnach stimulieren die Liganden des

EGFR, EGF und TGFα, auf autokrinem und parakrinem Weg das Wachstum

von Karzinomzellen, was zu einer gesteigerten Aggressivität des Tumors führt

(Yamanaka et al., 1993). Ein weiteres Indiz für die Beteiligung des EGFR-

Signalwegs an der Tumorgenese in Pankreaskarzinomen ist die Über-

expression der Rezeptortyrosinkinase ERBB2 (HER-2/NEU), die an der

Dimeren-Bildung während der Aktivierung des EGFR beteiligt ist, in pan-

kreatischen intraepithelialen Läsionen (Day et al., 1996). So ist es nicht

verwunderlich, dass in CGH-Analysen humaner Pankreaskarzinome und

daraus abgeleiteter Zelllinien oftmals ein Gewinn von Chromosom 7p12

beobachtet werden konnte, auf dem beim Menschen der Genort für den EGFR

lokalisiert ist (Ghadimi et al., 1999; Schleger et al., 2000). Im Gegensatz dazu

brachten allerdings SKY-Untersuchungen von zwanzig humanen Pankreas-

karzinomzelllinien keine rekurrenten Strukturaberrationen hervor, die das

Chromosom 7p einschliessen (Sirivatanauksorn et al., 2001).

Auch im hier vorliegenden Mausmodell konnte bereits demonstriert werden,

dass in den Pankreastumoren der TGFα/p53+/--Mäuse ähnlich wie in humanen

Karzinomen oder Neoplasie-Vorstufen durch eine erhöhte Expression von

TGFα eine Amplifikation von Egfr induziert wird, die zu einer Aktivierung der

4 Diskussion 69

Ras-Erk-Signalkaskade im Pankreas führt (Wagner et al., 2001; Wagner et al.,

2002). Diese Beobachtungen unterstreichen die zentrale Rolle des TGFα-Egfr-

Ras-Signaltransduktionsweges im Tumormodell der TGFα/p53+/--Mäuse.

Neben Egfr könnte auch das ebenfalls auf dem proximalen Chromosom 11

lokalisierte Gen für den Transkriptionsfaktor c-Rel in die Amplifikation des

Markerchromosoms t(11;5) involviert sein, zumal auch schon eine Aktivität

dieses Faktors in humanen Pankreaskarzinomen beschrieben wurde (Wang et

al., 1999). C-Rel steuert als Vertreter der NF-κB-Familie unter anderem die

Progression des Zellzyklus und trägt zur Inhibition der Apoptose bei (Hinz et al.,

1999; Chen et al., 2000).

Um diese Vermutungen genauer zu verifizieren, waren weitergehende

Untersuchungen erforderlich, die von Bettina Schreiner am Institut für

Humangenetik der Universität Ulm durchgeführt wurden. So ergaben Echtzeit-

PCR-Analysen der Zelllinie TD2 eine dreifache Kopienzahl der Gene Egfr, c-Rel

sowie Stk10 des proximalen Chromosoms 11. Durch gezielte FISH-Analysen

mit mehreren BAC-Proben des proximalen Chromosoms 11 konnte die Grösse

der in das Chromosom 5 integrierten Amplifikationseinheit mit 29 Mb

angegeben werden, wobei die Struktur aus mehreren sich wiederholenden,

invertierten Abschnitten bestand (Schreiner et al., 2003). Schliesslich ergaben

Northern Blot-Analysen eine 1,8-fach höhere Expression von Egfr in TD2-Zellen

als in Vergleichszellen, wohingegen in Transfektionsversuchen keine erhöhte

Aktivität von c-Rel in den Tumorzellen nachgewiesen werden konnte (Schreiner

et al., 2003). Damit gilt Egfr als ein zentrales Kandidatengen im Verlauf der

Tumor- genese der TGFα/p53+/--Mäuse.

Die Herkunft des distalen Anteils des Markerchromosoms t(11;5) konnte durch

Hybridisierung mit WCP 5 als Material von Chromosom 5 bestätigt werden.

4 Diskussion 70

4.2.2.2 Charakterisierung der Aberrationen von Chromosom 15 Die ausschliesslich in späteren Passagen der Zelllinie TD2 (MMUPaTu 8 = 7B)

gefundenen Translokationen mit Beteiligung des Chromosoms 15 t(6;15),

t(5;15) sowie t(X;15) könnten das bereits im zugrundeliegenden Tumor

überexprimierte Kandidatengen c-Myc beinhalten. Verwunderlich war nur,

warum in früheren Passagen der Zelllinie keine derartigen Aberrationen

aufgetreten waren, obwohl das CGH-Profil ebenfalls einen Gewinn des distalen

Chromosoms 15 anzeigte.

Das c-MYC–Onkogen ist schätzungsweise bei bis zu 70% aller menschlichen

Tumoren beteiligt, wobei die Aktivierung des Onkogens über verschiedene

Mechanismen wie Translokationen oder Amplifikationen erfolgen kann (Nilsson

u. Cleveland, 2003). So wird etwa klassischerweise durch die Translokation des

c-MYC-Onkogens in die Nähe regulativer Sequenzen der Gene für

Immunglobulinketten das Burkitt-Lymphom verursacht (Adams et al., 1985).

Auch CGH-Analysen humaner Pankreaskarzinome konnten Amplifikationen der

c-MYC-Region auf Chromosom 8q feststellen (Ghadimi et al., 1999; Schleger et

al., 2000), während Untersuchungen von Pankreastumorzelllinien durch SKY

jedoch keine derartigen Alterationen ergaben (Sirivatanauksorn et al., 2001).

Die vielfältigen Funktionen von c-MYC umfassen unter anderem die

Progression des Zellzyklus zur S-Phase in normalen Zellen (Heikkila et al.,

1987) sowie die Induktion der Angiogenese in Tumoren (Pelengaris et al.,

2002). Interessanterweise kann durch den Transkriptionsfaktor auch die

Apoptose von Zellen ausgelöst werden (Askew et al., 1991). Wie jedoch an

Mammakarzinomen transgener Mäuse gezeigt wurde (Amundadottir et al.,

1996), kann TGFα die c-Myc-induzierte Apoptose inhibieren und auf diesem

Weg einen kooperativen Effekt der beiden Moleküle hinsichtlich Zellproliferation

verursachen. Dieser synergistische pro-proliferative Mechanismus von TGFα

und c-Myc ist auch bei den hier vorliegenden Tumorzellen der TGFα/p53+/--

Mäuse, die ebenfalls TGFα überexprimieren, wahrscheinlich.

Um die Beteiligung von c-Myc an den detektierten Translokationen des

Chromosoms 15 zu untersuchen, führte Bettina Schreiner am Institut für

4 Diskussion 71

Humangenetik der Universität Ulm Echtzeit-PCR-Analysen durch, die eine 15-

16-fach erhöhte Kopienzahl für den c-Myc-Lokus ergaben. Allerdings waren

diese Amplifikationen auch schon in früheren Passagen der Zelllinie TD2

aufgefallen, die jedoch in der SKY-Untersuchung keine Alterationen des

Chromosoms 15 hervorbrachten. Erst durch FISH-Analysen mit c-Myc-

spezifischen BAC-Proben konnte eine Vielzahl kleiner extrachromosomaler

Signale sichtbar gemacht werden, die allerdings zu klein waren, um durch SKY

mit einem Detektionslimit zwischen 1 und 2 Mb (Fan et al., 2000) nachgewiesen

werden zu können. Sie stammten von sogenannten „double minute“

Chromosomen (DM) (Wahl, 1989) mit amplifizierten Sequenzen von jeweils

etwa 1,65 Mb. In höheren Passagen der Zelllinie zeigte sich zusätzlich zu den

DM-Chromosomen eine weitere Form der c-Myc-Amplifikation, sogenannte

HSRs (homogenously stained regions). Dabei handelt es sich um amplifizierte

Einheiten, die nicht wie die DM-Chromsomen episomal vorliegen, sondern in

verschiedene andere Chromosomen integriert sind. Aufgrund der in der SKY-

Analyse detektierten Translokationen konnte das Chromosom 6 als

hauptsächlicher Integrationsort der HSRs eingegrenzt werden, was durch

anschliessende FISH-Analyse mit WCP 6 bestätigt werden konnte. Allerdings

zeigte sich hierbei auch, dass sowohl die DMs als auch die HSRs in höheren

Passagen teilweise Material von Chromosom 6 enthielten. Möglicherweise kann

hieraus folgender Zyklus postuliert werden: Die Amplifikationen von c-Myc

liegen zunächst episomal in hoher Kopienzahl als DMs vor, bevor sie in Form

von HSRs in verschiedene Chromosomen, vor allem MMU 6, integrieren, um

anschliessend wieder unter Mitnahme von Abschnitten des Chromosoms 6 als

DMs freizuwerden. Ähnliche Amplifikationen von Myc-Proteinen in Form von

DMs konnten unter anderem bei Akuter Myeloischer Leukämie beobachtet

werden (Sait et al., 2002). Bei Mäusen zeigten sich DM-Chromosomen unter

anderem aus Material von Chromosom 19 bei hepatozellulären Karzinomen

(Zimonjic et al., 2001).

4 Diskussion 72

4.2.3 Detektierte Aberrationen der Zelllinien MMUPaTu 9, 3, 4 und 5 Auch die Zelllinien MMUPaTu 4, 5 und 9, deren zugrundeliegende Tumoren das

typische Aberrationsmuster von Chromosom 11 in Verbindung mit Verlust des

Rb1-Genlokus auf Chromosom 14 aufwiesen, sowie die Zelllinie MMUPaTu 3,

die keinem der alternativ auftretenden Alterationswege zuzuordnen war,

präsentierten sich in der SKY-Analyse als hochgradig aneuploid. Allerdings war

es nicht gelungen, Zelllinien mit Verlust des Rb1-Lokus erfolgreich zu

etablieren, da in den CGH-Profilen der Zelllinien MMUPaTu 4, 5 und 9 entweder

keine Veränderung im Bereich des distalen Chromosoms 14 festgestellt werden

konnte, oder aber zusätzlich ein Gewinn des c-Myc-Lokus auf Chromosom 15

auftrat, der bereits nach wenigen Zellkulturpassagen überwiegte. Insgesamt

zeigten diese Zelllinien mehr strukturelle Aberrationen als die Linie TD2, aber

im Vergleich zu Untersuchungen an humanen Tumoren (Sirivatanauksorn et al.,

2001) immer noch eine deutlich geringere Anzahl.

4.2.3.1 MMUPaTu 9 Die mit durchschnittlich 65 Chromosomen hypertriploide Zelllinie MMUPaTu 9

wies in der SKY-Analyse unter anderem numerische Überrepräsentationen der

Chromosomen 6 und 15 auf, welche auch im CGH-Profil eine deutliche

Tendenz Richtung Gewinn gezeigt hatten. Nachdem auch das Chromosom 11

in der vergleichenden genomischen Hybridisierung durch einen Zugewinn

aufgefallen war, konnten durch SKY mehrere Strukturaberrationen dieses

Chromosoms detektiert werden. So stellte sich in 72% der Metaphasen ein

grosses Markerchromosom mit mehreren distinkten Banden dar, das als

Material von Chromosom 11 identifiziert werden konnte. Zusätzlich waren die

beiden Translokationen t(9;11) (50% der Metaphasen) und t(6;11) (6%) sowie

eine Fusion am Zentromer jeweils zweier Chromosomen 11 (22%) aufgefallen.

Möglicherweise könnte es sich hierbei wiederum um Amplifikationen des Egfr-

Lokus handeln, der zentromernah auf MMU 11 lokalisiert ist, mit der

4 Diskussion 73

Konsequenz einer gesteigerten Zellproliferation und Gewebeinvasivität

(Olayioye et al., 2000), wie bereits in Kapitel 4.2.2.1 beschrieben.

Für die seltener detektierte Translokation t(9;5) kann Brca2 als Kandidatengen

auf Chromosom 5 angeführt werden, das bekanntermassen bei einer

Keimbahnmutation ein erhöhtes Risiko für Pankreaskarzinome mit sich bringt

(Hahn et al., 2003, vgl. auch Kapitel 1.1.5). Die exakten biochemischen

Funktionen der BRCA-Proteine sind noch unklar (Sherr, 2004), unter anderem

wurde eine Beteiligung an der Reperatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch

homologe Rekombination beschrieben (Jasin, 2002). Auch die korrespon-

dierende Region beim Menschen auf Chromosom 13q war in CGH-Analysen

von Pankreaskarzinomen häufig deletiert (Schleger et al., 2000). Allerdings ist

es schwierig, aus einer Translokation, wie sie hier vorliegt, den Verlust eines

Kandidatengens herzuleiten, es sei denn während der Übertragung des Gen-

materials gehen einige Abschnitte verloren.

Die in 11% der Metaphasen beobachtete Translokation von Material des

Chromosoms 15 auf das X-Chromosom, die in ähnlicher Form in sämtlichen

untersuchten Zelllinien ausser MMUPaTu 4 aufgetreten war, kann wiederum auf

eine Amplifikation des c-Myc-Onkogens auf Chromosom 15D3 hinweisen, wie

unter 4.2.2.2 ausführlich beschrieben. Da durch gezielte FISH-Analysen auch in

höheren Passagen von MMUPaTu 9 wie für die Zelllinie TD2 c-Myc-Kopien in

Form von „double minute“-Chromosomen detektiert werden konnten, könnte es

sich bei dieser Translokation eventuell um HSRs handeln, die in das X-

Chromosom intergriert sind.

Ein vergrössertes Chromosom 8, das sich in 17% der Metaphasen zeigte, steht

möglicherweise in Verbindung mit einer Amplifikation des dort lokalisierten

Transkriptionsfaktors Jun-B, die in Kapitel 4.2.3.2 näher beschrieben wird.

4 Diskussion 74

4.2.3.2 MMUPaTu 3 Wie bereits im Ursprungstumor, konnte auch in der CGH-Untersuchung der

daraus etablierten Zelllinie MMUPaTu 3 eine deutliche Amplifikation am

Übergang vom mittleren zum unteren Drittel des Chromosoms 8 gefunden

werden. Korrespondierend zu dieser Beobachtung fand sich in 88% der durch

SKY untersuchten Metaphasen jeweils ein vergrössertes Chromosom 8, was

auch in den Zelllinien MMUPaTu 4, 5 und 9 aufgefallen war. Allerdings

präsentierten sich im invertierten DAPI-Bild jeweils unterschiedliche Banden-

muster (siehe Abbildung 3.19), so dass von unterschiedlichen Amplifikations-

einheiten ausgegangen werden muss. Als Kandidatengen für diese Region

bietet sich der Transkriptionsfaktor Jun-B auf Chromosom 8C3 an, dessen

homologer Abschnitt beim Menschen auf Chromosom 19q gelegentlich auch in

Gewinne (Schleger et al., 2000) oder Inversionen (Sirivatanauksorn et al., 2001)

bei der zytogenetischen Untersuchung von Pankreaskarzinomzellllinien

involviert war. Über die Familie der JUN-Onkogene werden einerseits

proliferative Signale vermittelt, andererseits bewerkstelligen sie zelluläre

Transformation über die Wachstumsfaktoren-vermittelte Kaskade (Angel u.

Karin, 1991). Möglicherweise könnte also eine intrachromosomale Jun-

Amplifikation alternativ zur c-Myc-Amplifikation mitogene Stimuli im Modell der

TGFα/p53+/--Mäuse vermitteln. So demonstrierten auch Meggiato et al. (2003)

eine gesteigerte Expression von c-JUN in menschlichem Pankreaskarzinom-

gewebe mit einem hohen Prozentsatz an proliferierenden Tumorzellen.

Als weitere strukturelle Aberration zeigte sich in jeder Metaphase der Zelllinie

MMUPaTu 3 ein Fusionschromosom der Chromosomen X und 15, mitunter

sogar in doppelter Ausführung. Diese Veränderung, die auch in ähnlicher Form

in den Linien MMUPaTu 5 und 9 sowie TD2 aufgefallen war, deutet wiederum

auf eine Beteiligung des c-Myc-Onkogens hin.

Für die übrigen detektierten Translokationen t(X;12) (81% der Metaphasen),

t(X;13) (69%) sowie t(13;10;1) (69%) können keine relevanten Kandidatengene

benannt werden. Der Karyotyp der Zelllinie MMUPaTu 3 gestaltete sich triploid

4 Diskussion 75

mit numerischen Überrepräsentationen der Chromosomen 2, 3, 19 und vor

allem 17, korrespondierend zum Ergebnis der CGH-Analyse.

4.2.3.3 MMUPaTu 4 Die Zelllinie MMUPaTu 4 präsentierte die ausgeprägteste Aneuploidie der

untersuchten Reihen mit einem pentaploiden Chromosomensatz und Spitzen-

werten von bis zu 127 Chromosomen pro Metaphase. Die in der SKY-Analyse

mehrfach gegenüber dem Durchschnitt vorhandenen Chromosomen 15 und 17

und die eher unterrepräsentierten Chromosomen 12 und 14 spiegelten das

Ergebnis der CGH-Analyse wieder. Ein Verlust des Y-Chromosoms wie bei

Zelllinie TD2 (siehe 4.2.2) konnte auch hier festgestellt werden. Regelmässige

Strukturveränderungen umfassten die Translokationen t(1;12), t(7;8), t(14;11)

und t(11;13). Zudem konnte gelegentlich auch ein vergrössertes Chromosom

11 (50% der Metaphasen) sowie 8 (20% der Metaphasen) beobachtet werden,

wie bereits unter 4.2.3.1 und 4.2.3.2 beschrieben. Eine potentielle Beteiligung

der Kandidatengene Egfr und c-Jun an diesen Amplifikationen wäre wiederum

möglich.

Für die Translokation t(14;11) kann zusätzlich das auf Chromosom 14

lokalisierte Tumorsuppressorgen Rb1 in die Diskussion gebracht werden, das

über Interaktion mit Transkriptionsfaktoren wie E2F eine proliferations-

hemmende Wirkung während der G1-Phase des Zellzyklus ausübt (Sherr,

2004). Ausserdem verhindert hypophosphoryliertes RB1 durch Bindung an E2F

die Expression von Genen, die für die DNA-Replikation in der S-Phase

erforderlich sind (Nevins, 2001). Insofern kann ein Verlust des

Tumorsuppressorgens RB1 ungehinderte Zellteilung zur Folge haben.

Allerdings gelten Alterationen von RB1 trotz gelegentlicher Deletion der

korrespondierenden Region auf Chromosom 13q beim Menschen (Schleger et

al., 2000) nicht als charakteristisches Ereignis während der Karzinogenese von

duktalen Pankreastumoren (Bardeesy et al., 2002). Ausserdem ist der Verlust

eines Tumorsuppressorgens nur schwer mit einer Translokation, wie sie hier

vorliegt, zu erklären.

4 Diskussion 76

4.2.3.4 MMUPaTu 5 In der SKY-Analyse der Zelllinie MMUPaTu 5 stellte sich ein hypertriploider

Karyotyp mit durchschnittlich 62 Chromosomen dar, der in weiten Zügen mit

den Ergebnissen der Zelllinie MMUPaTu 3 übereinstimmte. So konnte auch hier

die bereits in Abschnitt 4.2.3.2 diskutierte Aberration eines Fusionschromosoms

t(X;15) mit möglicher Beteiligung des c-Myc-Lokus (100% der Metaphasen)

gefunden werden. Ebenso traten die bekannte Strukturveränderung t(X;13)

(89%) und jeweils ein vergrössertes Chromosom 8 (72%) auf. Zusätzlich zeigte

sich allerdings eine Translokation von Material des Chromosoms 18 auf

Chromosom 16 (72%), die bislang in keiner anderen Zelllinie aufgefallen war.

Vielleicht kann hier von einer klonalen Zusammensetzung innerhalb der Zelllinie

ausgegangen werden, ähnlich wie von Gorunova et al. (1998) für menschliche

Pankreastumoren beschrieben.

Bezüglich der Translokation t(16;18) kann eine eventuelle Beteiligung des

Tumorsuppressorgens DPC4/SMAD4 diskutiert werden. Beim Menschen auf

Chromosom 18q21 lokalisiert, liegt bei etwa 50% aller Pankreaskarzinome eine

homozygote Deletion von DPC4 vor, Loss of Heterozygosity wird für 90% aller

Tumoren angenommen (Hahn et al., 1996). So ist es nicht verwunderlich, dass

in CGH-Analysen (Schleger et al., 2000) und SKY-Untersuchungen

(Sirivatanauksorn et al., 2001) humaner Pankreaskarzinomzelllinien diese

Region sehr häufig von Verlusten betroffen war. Als Bestandteil der TGF-ß-

Signaltransduktionskaskade binden phosphorylierte SMAD-Komplexe an die

Promoter-Regionen bestimmter Gene (Sherr, 2004). Dies führt einerseits zur

Down-Regulation von Genen wie c-MYC, die für die Zellproliferation erforderlich

sind, andererseits zur Induktion von CDK-Inhibitoren, die die Zellzyklus-

progression eindämmen (Shi u. Massagué, 2003). Bei einem Verlust der

SMAD-Funktion kann sich die Zelle so unkontrolliert vermehren, was einen

weiteren Mechanismus der Tumorproliferation in den TGFα/p53+/--Mäusen

darstellen könnte. Wie bereits mehrfach erwähnt, stellt sich aber auch hier

wiederum das Problem, wie durch eine Translokation der Verlust eines Gens

erklärt werden kann.

4 Diskussion 77

4.2.4 Zusammenfassung häufig detektierter Abberationen Ausgangspunkt des Mausmodells war eine pankreasspezifische Über-

expression von TGFα in Verbindung mit einem heterozygoten Knock-Out des

Tumorsuppressorgens p53, mehrheitlich gefolgt von einem kompletten Verlust

des Wildtyp-Allels (Wagner et al., 2001). Durch diese Alterationen wurden

morphologische Veränderungen, Zellproliferation, Inhibition der Apoptose sowie

eine erhöhte genomische Instabilität induziert, die sekundäre genetische

Veränderungen nach sich zogen. Die SKY-Analyse verschiedener Zelllinien aus

den Pankreaskarzinomen der TGFα/p53+/--Mäuse brachte neben numerischen

Aberrationen vor allem wiederkehrende Strukturveränderungen der

Chromosomen 11, 15 und 8 hervor. Betrachtet man die beteiligten Kandidaten-

gene Egfr, c-Myc und Jun-B, werden durch die jeweilige Amplifikation der

Proteine verschiedene Möglichkeiten aufgezeigt, wie durch Eingriff in

Signaltransduktionskaskaden und Zellzykluskontrolle die unkontrollierte

Proliferation der Pankreaskarzinomzellen bewerkstelligt werden kann.

Interessant war die Beobachtung, dass innerhalb der Zelllinie TD2 zwei

verschiedene Wege der Amplifikation gleichzeitig realisiert waren (Schreiner et

al., 2003). Einerseits zeigte sich die intrachromosomale Vervielfachung der mit

29,5 Mb realtiv grossen Egfr-Region in niedriger Amplifikationsrate in Form des

Markerchromosoms t(11;5). Gleichzeitig konnten extrachromosomale c-Myc-

Amplifikationen einer Grösse von nur 1,65 Mb in vielfacher Kopie entdeckt

werden, die sich als „double minute“ Chromosomen präsentierten.

Als weitere wichtige genetische Alteration in den Zelllinien der TGFα/p53+/--

Mäuse muss die Hypermethylierung des Promoterbereichs des p16INK4a-Gens

angenommen werden, die in Methylierungs-Essays an der Universität Ulm für

die Linien TD2, MMUPaTu 3, 4 und 5 nachgewiesen werden konnte. P16INK4a

bremst als Inhibitor des Cyclin D1/CDK4/6-Komplexes den Übergang des Zell-

zyklus von der G1-Phase zur S-Phase (Serrano et al., 1993) und ist durch

Mutation, Deletion oder auch Hypermethylierung von regulatorischen

Sequenzen in bis zu 85% aller humanen Pankreastumoren inaktiviert (Schutte

et al., 1997). Auch LOH-Analysen von duktalen Karzinomen der TGFα/p53+/--

4 Diskussion 78

Mäuse zeigten zu einem Drittel biallelische Verluste des p16INK4a-Gens (Wagner

et al., 2001). Im Gegensatz zu menschlichen Tumorzelllinien wie CaPan-2 oder

Panc-1, die in der Charakterisierung durch SKY zu hohen Anteilen eine

Deletion im Bereich des P16INK4a-Abschnitts auf Chromosom 9p21 aufwiesen

(Sirivatanauksorn et al., 2001), konnten in der SKY-Analyse hier jedoch keine

rekurrenten Strukturaberrationen des homologen murinen Genlokus auf

Chromosom 4 gefunden werden. Die Inaktivierung von p16INK4a könnte

allerdings durch die numerische Unterrepräsentation von Chromosom 4 in den

Zelllinien MMUPaTu 4, 5 und 9 angedeutet werden und so einen zusätzlichen

pro-proliferativen Effekt in den Karzinomzellen bewirken.

Unklar bleibt die Rolle der Vervielfachung von Chromosom 17 in einem

Grossteil der Zelllinien, das möglicherweise ein noch unbekanntes Onkogen

beherbergt. Auch könnte sich auf dem häufig deletierten Chromosom 12 ein für

die Karzinogenese im TGFα/p53+/--Mausmodell relevantes Tumorsuppressor-

gen befinden. Der auch in murinen Kolonkarzinomzellen beobachtete Verlust

des Y-Chromosoms (Guda et al., 2004) bietet ebenfalls noch Raum für

Spekulationen. 4.2.5 Erfordernis weitergehender Untersuchungen der Zelllinien Um die durch die SKY-Analyse festgestellten Ergebnisse eingehender

charakterisieren und mögliche beteiligte Kandidatengene genauer identifizieren

zu können, sind weitergehende Untersuchungen an den Zelllinien erforderlich,

ähnlich wie bereits für die Zelllinie TD2 durchgeführt.

Durch gezielte FISH-Analyse mit BAC-Proben, die für den Genlokus des

verdächtigen Tumorsuppressorgens oder Onkogens spezifisch sind, kann eine

Beteiligung des Kandidatengens an den in der SKY-Analyse gefundenen

Aberrationen verifiziert werden. Zusätzlich kann durch Echtzeit-PCR die relative

Kopienzahl eines Kandidatengens im Vergleich zu normalen Zellen ermittelt

werden, womit unter anderem auch die Ausdehnung einer amplifizierten Region

bestimmt werden kann. Zur Untersuchung des Verlusts von Tumor-

suppressorgenen eignen sich ferner LOH-Analysen. Dazu wird DNA aus durch

4 Diskussion 79

Laser-Capture-Mikrodissektion gewonnenem Tumorgewebe isoliert. Auch der

immunhistochemische Nachweis von Proteinen, die durch Kandidatengene

kodiert werden, kann in vielen Fällen hilfreich sein.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sicherlich die Kombination mehrerer

molekularer und zytogenetischer Methoden die beste Aussage über genetische

Veränderungen im vorliegenden Modell der TGFα/p53+/--Mäuse erlaubt.

4.3 Vorteile und Limitierungen des Spectral Karyotyping Die Etablierung der Methode des Spektral Karyotyping (SKY) 1996 (Schröck et

al., 1996; Liyanage et al., 1996) war ein bedeutender Fortschritt im Bereich der

zytogenetischen Diagnostik. Durch die Kombination der Sensitivität und

Spezifität der Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) mit der Möglichkeit,

sämtliche Chromosomen simultan zu analysieren (Schröck et al., 1997), gelang

es, chromosomale Strukturveränderungen, insbesondere Translokationen,

Insertionen und komplexe Markerchromosomen zu identifizieren, die durch

herkömmliche Methoden nicht detektiert werden konnten (Bayani et al., 2000;

Bayani u. Squire, 2001). So wird die Technik bei Mensch und Maus zur

Charakterisierung zahlreicher Tumoren und Tumorzelllinien (siehe unter 1.4)

sowie im Bereich der pränatalen Diagnostik und Reproduktionstechnologie

eingesetzt. Einen aktuellen Überblick über die Anwendungsbereiche von SKY

bieten Liehr et al. (2004). Insbesondere für die Tumorzytogenetik ist die

Methode des Spectral Karyotyping sehr wertvoll, um wiederkehrende

chromosomale Aberrationen herauszufinden, die möglicherweise für den

Prozess der Tumorgenese entscheidende Onkogene oder Tumorsuppressor-

gene beherbergen (Bayani u. Squire, 2002). Durch die simultane (Tonon et al.,

2000) oder anschliessende Anwendung genspezifischer FISH-Proben können

die vermuteten Kandidatengene verifiziert werden und eine eventuelle

diagnostische oder prognostische Relevanz der Strukturveränderungen erörtert

werden. Eine grosse Erleichterung brachte SKY vor allem für die Identifikation

der morphologisch und im Hinblick auf das Bandenmuster sehr ähnlichen

4 Diskussion 80

akrozentrischen Mauschromosomen (Bayani u. Squire, 2001), zumal die Maus

einen sehr wertvollen onkologischen Modellorganismus für den Menschen

darstellt und bei der Maus entdeckte zytogenetische Alterationen auf die

entsprechenden humanen Regionen übertragen werden können (Bayani u.

Squire, 2002). Durch die zusätzliche Applikation der Technik auf

Rattenchromosomen (Buwe et al., 2003) bieten sich für die Zukunft in diesem

Bereich zahlreiche weitere Anwendungen.

Allerdings besitzt auch das moderne Verfahren des Spectral Karyotyping noch

seine Grenzen und Limitierungen. So liegt das Auflösungsvermögen für SKY

zwischen 1 und 2 Mb begrenzt (Fan et al., 2000), wodurch in den hier

durchgeführten Experimenten beispielsweise die oftmals aufgetretenen kleinen

Markerchromosomen nicht eindeutig identifiziert werden konnten oder die c-

Myc-Amplifikationen in Form von „double minute“ Chromosomen (DM) in den

Zelllinien TD2 und MMUPaTu 9 nicht sichtbar waren. Im Gegensatz dazu

konnten aber Sait et al. (2002) die chromosomale Herkunft von DMs bei Akuter

Myeloischer Leukämie sehr wohl durch SKY eindeutig nachweisen. Neuere

Bestrebungen zielen deshalb auf die bessere Sensitivität der verwendeten

SKY-Proben (Belaud-Rotureau et al., 2003). Als weitere Schwachstelle des

Spectral Karyotyping gilt die Schwierigkeit, kleine interchromosomale

Veränderungen zu detektieren, besonders in subtelomerischen Regionen (Fan

et al., 2000). Auch in den hier durchgeführten Analysen hatte SKY mitunter

Probleme, die Translokation von Material des Chromosoms 13 auf das

terminale Ende des X-Chromosoms in den Zelllinien MMUPaTu 3 und 5 zu

identifizieren und bot stattdessen das im RGB-Bild ähnliche Chromosom 7 als

Klassifikationsmöglichkeit an. Lee et al. (2001) untersuchten neun Fälle falscher

Ergebnisse durch SKY, die alle überwiegend auf demselben Mechanismus

beruhten. So führen strukturelle Veränderungen, die nicht-homologes

Chromosomenmaterial nebeneinanderstellen, zu einem Überlappen der

Fluoreszenz, was auch als „Flaring“ bezeichnet wird (Lu et al., 2000). Durch

diesen Effekt kann das Fluoreszenzsignal des benachbarten Chromatins

überdeckt oder gestört werden, was zu einer potentiellen Misinterpretation

durch das SKY-System führt. Weitere Ursachen für Klassifikationsfehler durch

4 Diskussion 81

SKY sind methodische Fehler während der Hybridisierung wie zum Beispiel

Überdenaturierung der Chromosomen oder Austrocknen der Metaphaseproben

(Lee et al., 2001) mit konsekutiver Abschwächung des Fluoreszenzsignals.

Insbesondere bei Mauschromosomen mit ihrem ausgeprägten Heterochromatin

im Bereich des Zentromers kann zudem die unvollständige Unterdrückung der

dort lokalisierten repetitiven DNA-Sequenzen zu einem intensiven und nicht

interpretierbaren Signal führen (Castleman et al., 2000).

5 Zusammenfassung 82

5 Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit sollten sechs verschiedene Tumorzelllinien, die an

der Universität Ulm aus duktalen Pankreaskarzinomen transgener TGFα/p53+/--

Mäuse etabliert worden waren, molekular-zytogenetisch durch Spectral

Karyotyping (SKY) charakterisiert werden. Ziel der Analyse war es dabei,

Hinweise auf sekundäre genetische Veränderungen zu erhalten, die für die

Tumorgenese in diesem Mausmodell verantwortlich sind.

Insgesamt wurden von jeder Tumorzelllinie zwischen 16 und 20 Metaphasen

durch SKY analysiert. Dabei konnten wie bereits in anderen onkologischen

Mausmodellen hauptsächlich numerische Aberrationen detektiert werden. So

zeigten die Zelllinien MMUPaTu 7 = TD2, 8 = 7B, 9, 3 und 5 jeweils einen

hypertriploiden bis hypotetraploiden Karyotyp mit einer gemittelten

Chromosomenzahl von 67. Die Zelllinie MMUPaTu 4 präsentierte sich sogar

noch stärker aneuploid mit durchschnittlich 104 Chromosomen pro Metaphase.

Während die Chromosomen 17 (83% der Zelllinien), weniger häufig auch MMU

2, 3, 10 (jeweils 33%) und 19 (50%), jeweils überrepräsentiert in den Meta-

phasen vorlagen, konnten häufig Verluste der Chromosomen 1 (33%), 4 (50%),

auf dem das p16INK4a-Gen lokalisiert liegt, sowie 12 (50%) beobachtet werden.

Regelmässig war auch eine verminderte Kopienzahl der Gonosomen, ins-

besondere des Y-Chromosoms in männlichen Karyotypen zu verzeichnen.

Durchschnittlich konnten nur 4,3 Strukturaberrationen pro Metaphase

aufgedeckt werden, wobei die Anzahl in den Zelllinien MMUPaTu 3, 4 und 5

gegenüber den Linien 9 und TD2 deutlich höher war. Fast immer stellten sich 1

bis maximal 9 kleine Markerchromosomen dar, die durch SKY nicht eindeutig

identifiziert werden konnten.

Auffälligste Aberration der Zelllinie TD2 (MMUPaTu 7 und 8=7B) war ein

grosses Markerchromosom (94% der Metaphasen), dessen proximaler Anteil

mit drei charakteristischen dunklen Banden aus Material von Chromosom 11

bestand, während der distale Abschnitt zu Chromosom 5 gehörte. Durch FISH-

Analyse mit spezifischen BAC-Proben für das Chromosom 11 konnte an der

Universität Ulm hierfür eine Amplifikation der Kandidatengene Egfr und c-Rel

5 Zusammenfassung 83

festgestellt werden. Eine Beteiligung dieser Genloci an den in anderen Zelllinien

festgestellten Strukturaberrationen des Chromosoms 11 kann ebenfalls

postuliert werden. So traten in Zelllinie MMUPaTu 9 die Translokationen t(9;11)

und t(6;11), in Linie MMUPaTu 4 die Translokationen t(11;13) und t(14;11)

sowie in den Zelllinien MMUPaTu 3, 4 und 9 jeweils häufig ein grosses

Markerchromosom 11 auf.

Auch strukturelle Veränderungen von Chromosom 15 konnten in den

untersuchten Metaphasen oft beobachtet werden. In Kombination mit FISH-

Analysen zeigten sich in Zelllinie TD2 und MMUPaTu 9 c-Myc-Amplifikationen

in Form von extrachromosomalen „double minutes“, die durch SKY nicht

dargestellt werden konnten, aber in höheren Passagen der Zelllinie TD2 auch in

SKY als homogeneously stained regions (HSR), integriert an variablen

Positionen des Chromosoms 6 (94% der Metaphasen), sichtbar wurden. Die

Analyse der Zelllinien MMUPaTu 3 und 5 brachte in jeder untersuchten

Metaphase ein Fusionschromosom, bestehend aus den Chromosomen 15 und

X, hervor, das meist sogar doppelt auftrat und selten auch in Zelllinie

MMUPaTu 9 beobachtet werden konnte. Möglicherweise liegt auch hier eine

Amplifikation für den c-Myc-Lokus vor.

In den analysierten Metaphasen der Linien MMUPaTu 3 und 5 (88 bzw. 78%)

sowie seltener MMUPaTu 4 und 9 trat jeweils ein vergrössertes Chromosom 8

auf, allerdings im Bandenmuster mit unterschiedlichen Amplifikationseinheiten.

Ein Gewinn des dort lokalisierten Transkriptionsfaktors Jun-B wäre möglich.

Weitere rekurrente Strukturabberationen umfassten in Zelllinie MMUPaTu 3 die

Translokationen t(X;13) (81%), t(X;12) (69%) und t(13;10;1) (69%) sowie in

Linie MMUPaTu 5 ebenfalls t(X;13) (89%) und daneben t(16;18) (78%). Die

SKY-Analyse von MMUPaTu 4 zeigte zudem in sämtlichen Metaphasen die

Mutationen t(1;12) und t(7;8).

Für eine genauere Charakterisierung der in die verschiedenen Struktur-

aberrationen involvierten Kandidatengene sind gezielte FISH-Analysen mit

lokusspezifischen BAC-Proben oder andere weiterführende molekular-

genetische Untersuchungen erforderlich.

6 Literaturverzeichnis 84

6 Literaturverzeichnis 1 Adams, J.M., Harris, A.W., Pinkert, C.A., Corcoran, L.M., Alexander, W.S., Cory, S., Palmiter, R.D., Brinster, R.L.: The C-Myc Oncogene Driven by Immunoglobulin Enhancers Induces Lymphoid Malignancy in Transgenic Mice. Nature 1985, 318, 533-538. 2 Almoguera, C., Shibata, D., Forrester, K., Martin, J., Arnheim, N., Perucho,

M.: Most Human Carcinomas of the Exocrine Pancreas Contain Mutant C-K-Ras Genes. Cell 1988, 53, 549-554.

3 Amundadottir, L.T., Nass, S.J., Berchem, G.J., Johnson, M.D., Dickson, R.B.: Cooperation of TGF alpha and c-Myc in mouse mammary tumorigenesis: coordinated stimulation of growth and suppression of apoptosis. Oncogene 1996, 13(4): 757-765.

4 Anderson, K.E., Sinha, R., Kulldorff, M.: Meat Intake and Cooking Techniques: Associations With Pancreatic Cancer. Mutat. Res. 2002, 32, 225-231.

5 Angel, P., Karin, M.: The Role of Jun, Fos and the AP-1 Complex in Cell Proliferation and Transformation. Biochem. Biophys. Acta 1991, 1072, 129-157.

6 Artandi, S.E., Chang, S., Lee, S.L., Alson, S., Gottlieb, G.J., Chin, L., De Pinho, R.A.: Telomere Dysfunction Promotes Non-Reciprocal Translocations and Epithelial Cancers in Mice. Nature 2000, 406, 573-574.

7 Askew, D.S., Ashmun, R.A., Simmons, B.C., Cleveland, J.L.: Constitutive C-Myc Expression in an IL-3-Dependent Myeloid Cell Line Suppresses Cell Cycle Arrest and Accelerates Apoptosis. Oncogene 1991, 6, 1915-1922.

8 Balmain, A., Harris, C.C.: Carcinogenesis in Mouse and Human Cells: Parallels and Paradoxes. Carcinogenesis 2000, 21, 371-377.

9 Bardeesy, N., DePinho, R.A.: Pancreatic Cancer Biology and Genetics. Nat. Rev. Cancer 2002, 2, 897-909.

10 Bardeesy, N., Sharpless, N.E., DePinho, R.A., Merlino,G.: The Genetics of Pancreatic Adenocarcinoma: a Roadmap for a Mouse Model. Semin. Cancer Biol. 2001, 11, 201-218.

11 Barton, C.M., Hall, P.A., Hughes, C.M., Gullick, W.J., Lemoine, N.R.: Transforming Growth Factor Alpha and Epidermal Growth Factor in Human Pancreatic Cancer. J. Pathol. 1991, 163, 111-116.


12 Bartsch, D.K., Sina-Frey, M., Lang, S., Wild, A., Gerdes, B., Barth, P., Kress, R., Grutzmann, R., Colombo-Benkmann, M., Ziegler, A., Hahn, S.A., Rothmund, M., Rieder, H.: . CDKN2A Germline Mutations in Familial Pancreatic Cancer. Am Surg. 2002, 236, 730-737.

13 Bayani, J., Squire, J.A.: Advances in the Detection of Chromosomal Aberrations Using Spectral Karyotyping. Clin Genet. 2001, 59, 65-73.

14 Bayani, J., Zielenska, M., Pandita, A., Al-Romaih, K., Karaskova, J.,Harrison, K., Bridge, J.A., Sorensen, P., Thorner, P., Squire, J.A.: Spectral Karyotyping Identifies Recurrent Complex Rearrangements of Chromosomes 8, 17 and 20 in Osteosarcomas. Genes Chromosomes Cancer 2003, 36, 7-16.

15 Bayani, J. et al.: SKY and FISH provide a refined identification of translocation breakpoints and complex chromosomal rearrangements. Elsevier Trends Journal Technical Tips Online 2000, http://www.biomednet.com/db/tto

16 Bayani, J.M., Squire, J.A.: Applications of SKY in Cancer Cytogenetics. Cancer Invest. 2002, 20, 373-386.

17 Belaud-Rotureau, M.A., Elghezal, H., Bernardin, C., Sanlaville, D., Radford-Weiss, I., Raoul, O., Vekemans, M., Romana, S.P.: Spectral Karyotyping (SKY) Principle, Advantages and Limitations. Ann. Biol. Clin. (Paris) 2003, 61, 139-146.

18 Bergman, W., Gruis, N.: Familial Melanoma and Pancreatic Cancer. N Engl J Med. 1996, 334, 471-472.

19 Biankin, A.V., Kench, J.G., Dijkman, F.P., Biankin, S.A., Henshall, S.M.: Molecular Pathogenesis of Precursor Lesions of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Pathology 2003, 35, 14-24.

20 Bockman, D.E., Merlino, G.: Cytological Changes in the Pancreas of Transgenic Mice Overexpressing Transforming Growth Factor Alpha. Gastroenterology 1992, 103, 1883.

21 Boyle, P., Maisonneuve, P., Bueno de Mesquita, B., Ghadirian, P., Howe, G.R., Zatonski, W., Bughurst, P., Moerman, C.J., Simard, A., Miller, A.B., Przewoniak, K., McMichael, A.J., Hsieh, C.C., Walker, A.M.: Cigarette Smoking and Pancreas Cancer: a Case Control Study of the Search Programme of the IARC. Int. J. Cancer 1996, 67, 63-71.

22 Brat, D.J., Lillemoe, K.D., Yeo, C.J., Warfield, P.B., Hruban, R.H.: Progression of Pancreatic Intraductal Neoplasias to Infiltrating Adenocarcinoma of the Pancreas. Am J Surg Pathol. 1998, 22, 163-169.


23 Brockie, E., Anand, A., Albores-Saavedra, J.: Progression of Atypical Ductal Hyperplasia/Carcinoma in Situ of the Pancreas to Invasive Adenocarcinoma. Annals of Diagnostic Pathology 1998, 2, 286-292.

24 Burris, H.A. 3rd, Moore, M.J., Andersen, J., Green, M.R., Rothenberg, M.L., Modiano, M.R., Cripps, M.C., Portenoy, R.K., Storniolo, A.M., Tarassoff, P., Nelson, R., Dorr, F.A., Stephens, C.D., Von Hoff, D.D.: Improvements in Survival and Clinical Benefit With Gemcitabine As First Line Therapy for Patients With Advanced Pancreatic Cancer: a Randomized Trial. J. Clin. Oncol. 1997, 15, 2403-2413.

25 Buwe, A., Steinlein, C., Köhler, M.R., Bar-Am, I., Katzin, N., Schmid, M.: Multicolor Spectral Karyotyping of Rat Chromosomes. Cytogenet. Genome Res. 2003, 103, 163-168.

26 Cahill, D.P., Lengauer, C., Yu, J., Riggins, G.J., Willson, J.K.V., Markowitz, S.D., Kinzler, K.W., Vogelstein, B.: Mutations of Mitotic Checkpoint Genes in Human Cancers. Nature 1998, 392, 300-303.

27 Caldas, C., Hahn, S.A., da Costa, L.T., Redston, M.S., Schutte, M., Seymour, A.B., Weinstein, C.L., Hruban, R.H., Yeo, C.J., Kern, S.E.: Frequent Somatic Mutations and Homozygous Deletions of the P16 (MTS1) Gene in Pancreatic Adenocarcinoma. Nat. Genet. 1994, 8, 27-34.

28 Caldas, C., Hahn, S.A., Hruban, R.H., Redston, M.S., Yeo, C.J., Kern, S.E.: Detection of K-Ras Mutations in the Stool of Patients With Pancreatic Adenocarcinoma and Pancreatic Ductal Hyperplasia. Cancer Res. 1994, 54, 3568-3573.

29 Capecchi, M.R.: Altering the Genome by Homologous Recombination. Science 1989, 244, 1288-1292.

30 Castleman, K.R., Ellis, R., Morrison, L., Piper, J., Saracoglu, K., Schulze, M.A., Speicher, M.R.: Classifictaion Accuracy in Multiple Color Fluorescence Imaging Microscopy. Cytometry 2000, 41, 139-147.

31 Cerny, W.L., Mangold, K.A., Scarpelli, D.G.: K-Ras Mutation Is an Early Event in Pancreatic Duct Carcinogenesis in the Syrian Golden Hamster. Cancer Res. 1992, 52, 4507-4513.

32 Chen, C., Edelstein, L.C., Gelinas, C.. The Rel/NF-KappaB Family Directly Activates Expression of the Apoptosis Inhibitor Bcl-x(L). Mol. Cell. Biol. 2000, 20, 2687-2695.

33 Coleman, A.E., Schröck, E., Weaver, Z., du Manoir, S., Yang, F., erguson-Smith, M.A., Ried, T., Janz, S.: Previously Hidden Chromosome Aberrations in T(12;15)-Positive BALB/c Plasmacytomas Uncovered by Multicolor Spectral Karyotyping. Cancer Res. 1997, 57, 4585-4592.


34 Cowgill, S.M., Muscarella, P.: The Genetics of Pancreatic Cancer. Am J Surg. 2003, 186, 279-286.

35 Cubilla, A.L., Fitzgerald, P.J.: Morphological Lesions Associated With Human Primary Invasive Nonendocrine Pancreas Cancer. Cancer Res. 1976, 36, 2690-2698.

36 Daniel, P.T., Schulze-Osthoff, K., Belka, C., Guner, D.: Guardians of Cell Death: the Bcl-2 Family Proteins. Essays Biochem. 2003, 39, 73-88.

37 Day, J.D., Digiuseppe, J.A., Yeo, C., Lai-Goldman, M., Anderson, S.M., Goodman, S.N., Kern, S.E., Hruban, R.H.: Immunohistochemical Evaluation of HER-2/Neu Expression in Pancreatic Adenocarcinoma and Pancreatic Intraepithelial Neoplasms. Hum. Pathol. 1996, 27, 119-124.

38 DiGiuseppe, J.A., Hruban, R.H., Offerhaus, G.J., Clement, M.J., van den Berg, F.M., Cameron, J.L., van Mansfeld, A.D.: Detection of K-Ras Muta-tions in Mucinous Pancreatic Duct Hyperplasia From a Patient With a Fa-mily History of Pancreatic Carcinoma. Am. J. Pathol. 1994, 144, 889-895.

39 Donehower, L.A.: The P53-Deficient Mouse: a Model for Basic and Applied Cancer Studies. Cancer Biology 1996, 7, 269-278.

40 Donehower, L.A., Harvey, M., Slagle, B.M., McArthur, M.J., Montgomery Jr., C.A., Butel, J.S., Bradley, A.: Mice Deficient for P53 Are Developmentally Normal but Susceptible to Spontaneous Tumors. Nature 1992, 356, 215-221.

41 du Manoir, S., Speicher, M.R., Joos, S., Schröck, E., Popp, S., Dohner, H., Kovacs, G., Robert-Nicoud, M., Lichter, P., Cremer, T.: Detection of Complete and Partial Chromosome Gains and Losses by Comparative Genomic in Situ Hybridization. Hum. Genet. 1993, 90, 590-610.

42 Duesberg, P., Li, R.: Multistep Carcinogenesis: a Chain Reaction of Aneuploidizations. Cell Cycle 2003, 2, 202-210.

43 Evans, S.C., Lozano, G.: The Li-Fraumeni Syndrome: An Inherited Suspectibility to Cancer. Mol. Med. Today 1997, 3, 390-395.

44 Fan, Y.S., Siu, V.M., Jung, J.H., Xu., J.: Sensitivity of Multiple Color Spectral Karyotyping in Detecting Small Interchromosomal Rearrangements. Gent Test 2000, 4, 9-14.

45 Flesken-Nikitin, A., Choi, K.C., Eng, J.P., Shmidt, E.N., Nikitin, A.Y.: Induction of Carcinogenesis by Concurrent Inactivation of P53 and Rb1 in the Mouse Ovarian Surface Epithelium. Cancer Res. 2003, 63, 3459-3463.

46 Frank, S.A., Nowak, M.A.: Problems of Somatic Mutation and Cancer. Bioessays 2004, 26, 291-299.


47 Frohman, M.A., Martin, G.R.: Cut, Paste, and Save: New Approaches to Altering Specific Genes in Mice. Cell 1989, 56, 145-147.

48 Gerdes, B., Ramaswamy, A., Ziegler, A., Lang, S.A., Kersting, M., Baumann, R., Wild, A., Moll, R., Rothmund, M., Bartsch, D.K.: P16INK4a Is a Prognostic Marker in Resected Ductal Pancreatic Cancer: an Analysis of P16INK4a, P53, MDM2 and Rb. Ann Surg. 2002, 235, 51-59.

49 Ghadimi, B.M., Schröck, E., Walker, R.L., Wangsa, D., Jauho, A., Meltzer, P.S., Ried, T.: Specific Chromosomal Aberrations and Amplification of the AIB1 Nuclear Receptor Coactivator Gene in Pancreatic Carcinomas. Am J Pathol. 1999, 154, 525-536.

50 Ghaneh, P., Greenhalf, W., Humphreys, M., Wilson, D., Zumstein, L., Lemoine, N.R., Neoptolemos, J.P.: Adenovirus-Mediated Transfer of P53 and P16(INK4a) Results in Pancreatic Cancer Regression in Vitro and in Vivo. Gene Ther . 2001, 8, 199-208.

51 Giardiello, F.M., Brensinger, J.D., Tersmette, A.C., Goodman, S.N., Petersen, G.M., Booker, S.V., Cruz-Correa, M., Offerhaus, J.A.: Very High Risk of Cancer in Familial Peutz-Jeghers Syndrome. Gastroenterology 2000, 119, 1447-1453.

52 Glimelius, B., Hoffmann, K., Sjoden, P.O., Jacobsson, G., Sellstrom, H., Enander, L.K., Lime, T., Svensson, C.: Chemotherapy Improves Survival and Quality of Life in Advanced Pancreatic and Biliary Cancer. Ann. Oncol. 1996, 7, 593-600.

53 Goldstein, A.M., Fraser, M.C., Struewing, J.P., Hussussian, C.J., Ranade, K., Zametkin, D.P., Fontaine, L.S., Organic, S.M., Dracopoli, N.C., Clark, W.H.Jr.: Increased Risk of Pancreatic Cancer in Melanoma-Prone Kindreds With P16INK4 Mutations. N Engl J Med. 1995, 333, 970-974.

54 Gorunova, L., Hoglund, M., Andren-Sandberg, A., Dawiskiba, S., Jin, Y., Mitelman, F., Johansson, B.: Cytogenetic Analysis of Pancreatic Carcinomas: Intratumor Heterogeneity and Nonrandom Pattern of Chromosome Aberrations. Genes Chromosomes Cancer 1998, 23, 81-99.

55 Greenblatt, M.S., Bennett, W., Hollstein, M., Harris, C.C.: Mutations in the P53 Tumor Suppressor Gene: Clues to Cancer Etiology and Molecular Pathogenesis. Cancer Res. 1994, 54, 4855-4878.

56 Griffin, C.A., Hruban, R.H., Morsberger, L.A., Ellingham, T., Long, P.P., Jaffee, E.M., Hauda, K.M., Bohlander, S.K., Yeo, C.J.: Consistent Chromosome Abnormalities in Adenocarcinoma of the Pancreas. Cancer Res. 1995, 55, 2394-2399.

57 Guda, K., Upender, M.B., Belinsky, G., Flynn, C., Nakanishi, M., Marino, N., Ried, T., Rosenberg, D.W.: Carcinogen-Induced Colon Tumors in Mice


Are Chromosomally Stable and Are Characterized by Low-Level Microsatellite Instability. Oncogene 2004, E-Pub ahead of print.

58 Guo, J., Kleeff, J., Li, J., Ding, J., Hammer, J., Zhao, Y., Grese, T., Korc, M., Buchler, M.W., Friess, H.: Expression and Functional Significance of CDC25B in Human Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Oncogene 2004, 23, 71-81.

59 Hahn, S.A., Greenhalf, B., Ellis, I., Sina-Frey, M., Rieder, H., Korte, B., Gerdes, B., Kress, R., Ziegler, A., Raeburn, J.A., Campra, D., Grutzmann, R., Rehder, H., Rothmund, M., Schmiegel, W., Neoptolemes, J.P., Bartsch, D.K.: BRCA2 Germline Mutations in Familial Pancreatic Carcinoma. J Natl Cancer Inst. 2003, 95, 214-221.

60 Hahn, S.A., Schutte, M., Hoque, A.T., Moskaluk, C.A., da Costa, L.T., Rozenblum, E., Weinstein, C.L., Fischer, A., Yeo, C.J., Hruban, R.H., Kern, S.E.: DPC4, a Candidate Tumor Suppressor Gene at Human Chromosome 18q21.1. Science 1996, 271, 350-353.

61 Hall, P.de L., Wilentz, R.E., de Klerk, W., Bornman, P.P.: Premalignant Conditions of the Pancreas. Pathology 2002, 34, 504-517.

62 Hamilton, D.L., Abremski, K.: Site-Specific Recombination by the Bacteriophage P1 Lox-Cre System. Cre-Mediated Synapsis of Two Lox Sites. J. Mol. Biol. 1984, 178, 481-486.

63 Harada, H., Grant, S.: Apoptosis Regulators. Clin. Exp. Hematol. 2003, 7, 117-138.

64 Heikkila, R., Schwab, G., Wickstrom, E., Loke, S.L., Pluznik, D.H., Watt, R., Neckers, L.M.: A C-Myc Antisense Oligodeoxynucleotide Inhibits Entry into S Phase but Not Progress From G0 to G1. Nature 1987, 328, 445-49.

65 Hinz, M., Krappmann, D., Eichten, A., Heder, A., Scheidereit, C., Strauss, M.: NF-KappaB Function in Growth Control: Regulation of Cyclin D1 Expression and G0/G1-to-S-Phase Transition. Mol. Cell Biol. 1999, 19, 2690-2698.

66 Hruban, R.H., Adsay, N.V., Albores-Saavedra, J., Compton, C., Garrett, E.S., Goodman, S.N., Kern, S.E., Klimstra, D.S., Klöppel, G., Longnecker, D.S., Lüttges, J.,Offerhaus,G.J.: Pancreatic Intraepithelial Neoplasia: a New Nomenclature and Classification System for Pancreatic Duct Lesions. Am J Surg Pathol. 2001, 25, 579-586.

67 Hruban, R.H., Canto, M.I., Yeo, C.J.: Prevention of Pancreatic Cancer and Strategies for Management of Familial Pancreatic Cancer. Dig Dis. 2001, 19, 76-84.

68 Huang, L., Goodrow, T.L., Zhang, S.Y., Klein-Szanto, A.J., Chang, H., Ruggeri, B.A.: Deletion and Mutation Analyses of the P16/MTS-1 Tumor


Suppressor Gene in Human Ductal Pancreatic Cancer Reveals a Higher Frequency of Abnormalities in Tumor-Derived Cell Lines Than in Primary Ductal Adenocarcinomas. Cancer Res. 1996, 56, 1137-1141.

69 Ivanchuck, S.M., Rutka, J.T.: The Cell Cycle: Accelerators, Brakes and Checkpoints. Neurosurgery 2004, 54, 692-700.

70 Jacks, T., Remington, L., Williams, B.O., Schmitt, E.M., Halachmi, S., Bronson, R.T., Weinberg, R.A.: Tumor Spectrum Analysis in P53-Mutant Mice. Curr. Biol. 1994, 4, 1-7.

71 Jaffee, E.M., Hruban, R.H., Canto, M., Kern, S.E.: Focus on Pancreas Cancer. Cancer Cell 2002, 2, 25-28.

72 Jasin, M. Homologous Repair of DNA Damage and Tumorigenesis: the BRCA Connection. Oncogene 2002, 21, 8981-8993.

73 Jenne, D.E., Reimann, H., Nezu, J., Friedel, W., Loff, S., Jeschke, R., Müller, O., Back, W., Zimmer, M.: Peutz-Jeghers Syndrome Is Caused by Mutations in a Novel Serine Threonine Kinase. Nature Genetics 1998, 18, 38-43.

74 Kallioniemi, A., Kallioniemi, O.P., Sudar, D., Rutovitz, D., Graqy, J.W., Waldman, F., Pinkel, D.: Comparative Genomic Hybridization for Molecular Cytogenetic Analysis of Solid Tumors. Science 1992, 258, 818-821.

75 Kalthoff, H., Schmiegel, W., Roeder, C., Kasche, D., Schmidt, A., Lauer, G., Thiele, H.G., Honold, G., Pantel, K., Riethmüller, G. et al.: P53 and K-RAS Alterations in Pancreatic Epithelial Cell Lesions. Oncogene 1993, 8, 289-298.

76 Kawesha, A., Ghaneh, P., Andren-Sandberg, A., Ograed, D., Skar, R., Dawiskiba, S., Evans, J.D., Campbell, F., Lemoine, N., Neoptolemos, J.P.: K-Ras Oncogene Subtype Mutations Are Associated With Survival but Not Expression of P53, P16(INK4A), P21(WAF-1), Cyclin D1, ErbB-2 and ErbB-3 in Resected Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Int. J. Cancer 2000, 89, 469-474.

77 Kelly, D.M., Benjamin, I.S.: Pancreatic Carcinoma. Ann. Oncol. 1995, 6, 19-28.

78 Kinzler, K.W., Vogelstein, B.: Lessons From Hereditary Colorectal Cancer. Cell 1996, 87, 159-170.

79 Kistner, A., Gossen, M., Zimmermann, F., Jerecic, J., Ullmer, C., Lubbert, H., Bujard, H.: Doxycycline-Mediated Quantitative and Tissue-Specific Control of Gene Expression in Transgenic Mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996, 93, 10933-10938.


80 Klöppel, G., Bommer, G., Ruckert, K., Seifert, G.: Intraductal Proliferation in the Pancreas and Its Relationship to Human and Experimental Carcino-genesis. Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histol. 1980, 387, 221-233.

81 Klöppel, G., Lüttges, J.: WHO-Classification 2000: Exocrine Pancreatic Tumors. Verh Dtsch Ges Pathol. 2001, 85, 219-228.

82 Korc, M., Chandrasekar, B., Yamanaka,Y., Friess, H., Büchler, M., Beger, H.G.: Overexpression of the Epidermal Growth Factor Receptor in Human Pancretic Cancer Is Associated With Concomitant Increases in the Levels of Epidermal Growth Factor and Transforming Growth Factor Alpha. J. Clin. Invest. 1992, 50, 1352-1360.

83 Kozuka, S., Sassa, R., Taki, T., Masamoto, K., Nagasawa, S., Saga, S., Hasegawa, K., Takeuchi, M.: Relation of Pancreatic Duct Hyperplasia to Carcinoma. Cancer 1979, 43, 1428.

84 Köhler, M.R., Gräwe, W.: Anwenderbericht Spectral Karyotyping. Hamamatsu Systeme.

85 Krebsbroschüre des Robert-Koch-Instituts. 2002. www.rki.de/gbe/krebs/broschuere2002/kapitel/c25.pdf

86 Lagna, G., Hata, A., Hemmati-Brivanlou, A., Massague, J.: Partnership Between DPC4 and SMAD Proteins in TGF-Beta Signalling Pathways. Nature 1996, 383, 832-836.

87 Lane, D.P.: P53, Guardian of the Genome. Nature 1992, 358, 15-16.

88 Langer, P.R., Waldrop, A.A., Ward, D.C.: Enzymatic Synthesis of Biotin-Labeled Polynucleotides: Novel Nucleic Acid Affinity Probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1981, 78, 6633-6637.

89 Lanni, J.S., Jacks, T.: Characterization of the P53-Dependent Postmitotic Checkpoint Following Spindle Disruption. Mol. Cell. Biol. 1998, 18, 1055-1064.

90 Lee, C., Gisselsson, D., Jin, C., Nordgren, A., Ferguson, D.O., Blennow, E., Fletcher, J.A., Morton, C.C.: Limitations of Chromosome Classification by Multicolor Karyotyping. Am. J. Hum. Genet. 2001, 68, 1043-1047.

91 Leitch, A.R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I.J.: In Situ-Hybridisierung. Spektrum 1994.

92 Levine, A.J.: P53, the Cellular Gatekeeper for Growth and Division. Cell 1997, 88, 323-331.

93 Liehr, T., Starke, H., Weise, A., Lehrer, H., Claussen, U.: Multicolor FISH Probe Sets and Their Applications. Histology And Histopathology 2004, 19, 229-237.


94 Liu, Q., Yan, Y.X., McClure, M., Nakagawa, H., Fujimura, F., Rustgi, A.K.: MTS-1 (CDKN2) Tumor Suppressor Gene Deletions Are a Frequent Event in Esophagus Cancer and Pancreatic Adenocarcinoma Cell Lines. Oncogene 1995, 10, 619-622.

95 Liyanage, M., Coleman, A., du Manoir, S., Veldman, T., McCormack, S., Dickson, R.B., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A., Janz, S., Wienberg J., Ferguson-Smith, M.A., Schröck, E., Ried, T.: Multicolour Spectral Karyotyping of Mouse Chromosomes. Nature Genetics 1996, 14, 312-315.

96 Lu, Y.J., Morris, J.S., Edwards, P.A., Shipley, J.: Evaluation of 24-Color Multifluor-Fluorescence in-Situ Hybridization (M-FISH) Karyotyping by Comparison With Reverse Chromosome Painting of the Human Breast Cancer Cell Line T-47D. Chromosome Res. 2000, 8, 127-132.

97 Lüttges, J., Klöppel, G.: Update on the Pathology and Genetics of Exocrine Pancreatic Tumors With Ductal Phenotype: Precursor Lesion and New Tumor Entities. Dig Dis. 2001, 19, 15-23.

98 Lynch, H.T., Brand, R.E., Lynch, J.F., Fusaro, R.M., Kern, S.E.: Hereditary Factors in Pancreatic Cancer. J Hepatobil Pancreat Surg. 2002, 9, 12-31.

99 Lynch, H.T., Fitzsimmons, M.L., Smyrk, T.C., Lanspa, S.J., Watson, P., McClellan, J., Lynch, J.F.: Familial Pancreatic Cancer: Clinopathologic Study of 18 Nuclear Families. Am. J. Gastroenterol. 1990, 85, 54-60.

100 Lynch, H.T., Frichot, B.C., Lynch, P., Lynch, J., Gurigis, H.A.: Family Studies of Malignant Melanoma and Associated Cancer. Surg Gynecol Obstet 1975, 141, 517-522.

101 Lynch, H.T., Smyrk, T.C., Watson, P., Lanspa, S.J., Lynch, J.F., Lynch, P.M., Cavalieri, R.J., Boland, C.R.: Genetics, Natural History, Tumor Spectrum and Pathology of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer: an Updated Review. Gastroenterology 1993, 104, 1535-1549.

102 Macville, M., Veldman, T., Padilla-Nash, H., Wangsa, D., O´Brien, P., Schröck, E., Ried, T.: Spectral Karyotyping, a 24-Colour FISH Technique for the Identification of Chromosomal Rearrangements. Histochem Cell Biol 1997, 108, 299-305.

103 Maire, F., Hammel, P., Ferris, B., Olschwang, S., O´Toole, D., Sauvanet, A., Palazzo, L., Ponsot, P., Laplane, B., Levy, P., Ruszniewski, P.: Intraductal Papillary and Mucinous Pancreatic Tumor: a New Extracolonic Tumor in FAP. Gut 2002, 51, 446-449.

104 Maitra, A., Adsay, N.V., Argani, P., Iacobuzio-Donahue, C., De Marzo, A., Cameron, J.L., Yeo, C.J., Hruban, R.H.: Multicomponent Analysis of the Pancreatic Adenocarcinoma Progression Model Using a Pancreatic Intraepithelial Neoplasia Tissue Microarray. Mod Pathol. 2003, 16, 902-12.


105 Malik, Z., Cabib, D., Buckwald, R.A., Talmi, A., Garini, Y., Lipson, S.G.: Fourier Transform Multipixel Spectroscopy for for Quantitative Cytology. J. Microscopy 1996, 182, 133-140.

106 Malumbres, M., Pellicer, A.: RAS Pathways to Cell Cycle Control and Cell Transformation. Front Biosci. 1998, 3, 887-912.

107 Meggiato, T., Calabrese, F., De Cesare, C.M., Baliello, E., Valente, M., Del Favero, G.: C-JUN and CPP32 (Caspase 3) in Human Pancreatic Cancer: Relation to Cell Proliferation and Death. Pancreas 2003, 26, 65-70.

108 Meszoely, I.M., Means, A.L., Scoggins, C.R., Leach, S.D.: Developmental Aspects of Early Pancreatic Cancer. Cancer J. 2001, 7, 242-250.

109 Mrozek, K., Tanner, S.M., Heinonen, K., Bloomfield, C.D.: Molecular Cytogenetic Characterization of the KG-1 and KG-1a Acute Myeloid Leukemia Cell Lines by Use of Spectral Karyotyping and Fluorescence in Situ Hybridization. Genes Chromosomes Cancer 2003, 38, 249-252.

110 Nagy, A.: Cre Recombinase: the Universal Reagent for Genome Tailoring. Genesis 2000, 26, 99-109.

111 Nevins, J. R. The Rb/E2F Pathway and Cancer. Hum. Mol. Genet. 2001, 10, 699-703.

112 Nigg, E. A. Centrosome Aberrations: Cause or Consequence of Cancer Progression. Nat. Rev. Cancer 2002, 2, 815-825.

113 Nilsson, J.A., Cleveland, J.L.: Myc Pathways Provoking Cell Suicide and Cancer. Oncogene 2003, 22, 9007-9021.

114 Ohlsson, B., Jansen, C., Ihse, I., Axelson, J.: Epidermal Growth Factor Induces Cell Proliferation in Mouse Pancreas and Salivary Glands. Pancreas 1997, 14, 94-98.

115 Olayioye, M.A., Neve, R.M., Lane, H.A., Hynes, N.E.: The ErbB Signaling Network: Receptor Heterodimerization in Development and Cancer. EMBO J. 2000, 19, 3159-3167.

116 Olivier, M., Eeles, R., Hollstein, M., Khan, M.A., Harris, C.C., Hainaut, P.: The IARC TP53 Database: New Online Mutation Analysis and Recommendations to Users. Hum. Mutat. 2002, 19, 607-614.

117 Ornitz, D.M., Palmiter, R.D., Hammer, R.E., Brinster, R.L., Swift, G.H., MacDonald, R.J.: Specific Expression of an Elastase-Human Growth Hormone Fusion Gene in Pancreatic Acinar Cells of Transgenic Mice. Nature 1985, 313, 600-603.


118 Ostrand-Rosenberg, S. Animal Models of Tumor Immunity, Immunotherapy and Cancer Vaccines. Current Opinion in Immunology 2004, 16, 143-150.

119 Paul, S., Regulier, E.: Molecular Basis of Oncogenesis. Ann. Biol. Clin. (Paris) 2001, 59, 393-402.

120 Pazin, M.J., Williams, L.T.: Triggering Signaling Cascades by Receptor Tyrosine Kinases. Trends Biochem. Sci. 1992, 17, 374-378.

121 Pelengaris, S., Khan, M., Evan, G.I.: Suppression of Myc-Induced Apoptosis in Beta Cells Exposes Multiple Oncogenic Properties of Myc and Triggers Carcinogenic Progression. Cell 2002, 109, 321-334.

122 Purdie, C.A., Harrison, D.J., Peter, A., Dobbie, L., White, S., Howie, S.E.M., Salter, D.M., Bird, C.C., Wyllie, A.H., Hooper, M.L., Clarke, A.R.: Tumor Incidence, Spectrum and Ploidy in Mice With a Large Deletion in the P53 Gene. Oncogene 1994, 9, 603-609.

123 Real, F.X., Vila, M.R., Skoudy, A., Ramaekers, F.C., Corominas, J.M.: Intermediate Filaments As Differentiation Markers of Exocrine Pancreas. Expression of Cytokeratins of Complex and Stratified Epithelia in Normal Pancreas and in Pancreas Cancer. Int. J. Cancer 1993, 54, 720-727.

124 Resor, L., Bowen, T.J., Wynshaw-Boris, A.: Unraveling Human Cancer in the Mouse: Recent Refinements to Modeling and Analysis. Human Mol. Genetics 2001, 10, 669-675.

125 Rieder, H., Sina-Frey, M., Ziegler, A., Hahn, S.A., Przypadlo, E., Kress, R., Gerdes, B., Colombo-Benkmann, M., Eberl, T., Grutzmann, R., Lorken, M., Schmidt, J., Bartsch,D.K.: German National Case Collection of Familial Pancreatic Cancer - Clinical-Genetic Analysis of the First 21 Families. Onkologie 2002, 25, 262-266.

126 Ries, L.A.G, Eisner, M.P., Kosary, C.L., Hankey, B.F., Miller, B.A., Clegg, L., Edwards, B.K.: SEER Cancer Statistic Review 1973-1999, National Cancer Institute, Bethesda, MD, USA. 2002.

127 Rigby, P.W., Dieckmann, M., Rhodes, C., Berg, P.: Labeling Deoxyribonucleic Acid to High Specific Activity in Vitro by Nick Translation With DNA Polymerase. I. J. Mol. Biol. 1977, 113, 237-251.

128 Riker, A., Libutti, S.K., Bartlett, D.L.: Advances in the Early Detection, Diagnosis and Staging of Pancreatic Cancer. Surgical Oncology 1998, 6, 157-169.

129 Rozenblum, E., Schutte, M., Goggins, M., Hahn, S.A., Panzer, S., Zahurak, M., Goodman, S.N., Sohn, T.A., Hruban, R.H., Yeo, C.J., Kern, S.E.: Tumor-Suppressive Pathways in Pancreatic Carcinoma. Cancer Res. 1997, 57, 1731-1734.


130 Sait, S.N., Qadir, M.U., Conroy, J.M., Matsui, S., Nowak, N.J., Baer, M.R.: Double Minute Chromosomes in Acute Myeloid Leukemia and Myelodysplastic Syndrome: Identification of New Amplification Regions by Fluorescence in Situ Hybridization and Spectral Karyotyping. Genes Chromosomes Cancer 2002, 34, 42-47.

131 Sandgren, E.P., Luetteke, N.C., Palmiter, R.D., Brinster, R.L., Lee, D.C.: Overexpression of TGF-Alpha in Transgenic Mice: Induction of Epithelial Hyperplasia, Pancreatic Metaplasia and Carcinoma of the Breast. Cell 1990, 85, 27-37.

132 Sauer, B. Inducible Gene Targeting in Mice Using the Cre/Lox System. Methods 1998, 14, 381-392.

133 Schleger, C., Arens, N., Zentgraf, H., Bleyl, U., Verbeke, C.: Identification of Frequent Chromosomal Aberrations in Ductal Adenocarcinoma of the Pancreas by Comparative Genomic Hybridization (CGH). J. Pathol. 2000, 191, 27-32.

134 Schlosser, W., Schönberg, M.H., Rhein, E.: Pankreaskarzinom Bei Chronischer Pankreatitis Mit Entzündlichem Pankreaskopftumor. Z. Gastroenterol. 1996, 34, 3-8.

135 Schmid, R.M., Klöppel, G., Adler, G., Wagner, M.: Acinar-Ductal-Carcinoma Sequence in Transforming Growth Factor Alpha Transgenic Mice. Ann. NY. Acad. Science 1999, 880, 219.

136 Schmoll, H.J., Buchele, T., Grothey, A., Demphe, W.: Where Do We Stand With 5-Fluoruracil? Semin. Oncol. 1999, 26, 589-605.

137 Schreiner, B., Baur, D.M., Fingerle, A.A., Zechner, U., Greten, F.R., Adler, G., Sipos, B., Klöppel, G., Hameister, H., Schmid, R.M.: Pattern of Secondary Genomic Changes in Pancreatic Tumors of Tgf-Alpha/Trp53+/- Transgenic Mice. Genes Chromosomes Cancer 2003, 38, 240-248.

138 Schreiner, B., Greten, F.R., Baur, D.M., Fingerle, A.A., Zechner, U., Böhm, C., Schmid, M., Hameister, H., Schmid, R.M.: Murine Pancreatic Tumor Cell Line TD2 Bears the Characteristic Pattern of Genetic Changes With Two Independently Amplified Gene Loci. Oncogene 2003, 22, 6802-6809.

139 Schröck, E., du Manoir, S., Veldman, T., Schoell, B., Wienberg, J., Ferguson-Smith, M.A., Ning, Y., Ledbetter, D.H., Bar-Am, I., Soenksen, D., Garini, Y., Ried, T.: Multicolor Spectral Karyotyping of Human Chromosomes. Science 1996, 273, 494-497.

140 Schröck, E., Padilla-Nash, H.: Multicolor Fluorescence in Situ Hybridization Reveal New Tumor-Specific Chromosomal Aberrations. Semin. Hematol. 2000, 37, 334-347.


141 Schröck, E., Veldman, T., Padilla-Nash, H., Ning, Y., Spurbeck, J., Jalal, S., Shaffer, L.G., Papenhausen, P., Kozma, C., Phelan, M.C., Kjeldsen, E., Schonberg, S.A., O´Brien, P., Biesecker, L., du Manoir, S., Ried, T.: Spectral Karyotyping Refines Cytogenetic Diagnostics of Constitutional Chromosomal Abnormalities. Hum. Genet. 1997, 101, 255-262.

142 Schutte, M., Hruban, R.H., Geradts, J., Maynard, R., Hilgers, W., Rabindran, S.K., Moskaluk, C.A., Hahn, S.A., Schwarte-Waldhoff, I., Schmiegel, W., Baylin, S.B., Kern, S.E., Herman, J.G.: Abrogation of the Rb/P16 Tumor-Suppressive Pathway in Virtually All Pancreatic Carcinomas. Cancer Res. 1997, 57, 3126-3130.

143 Seket, B., Savrin, J.C., Scoazec, J.Y., Partensky, C.: Pancreatic Acinar Cell Carcinoma in a Patient With Familial Adenomatous Polyposis. Gastroenterol Clin Biol. 2003, 27, 818-820.

144 Serrano, M., Hannon, G.J., Beach, D.: A New Regulatory Motif in Cell-Cycle Control Causing Specific Inhibition of Cyclin D/CDK4. Nature 1993, 366, 704-707.

145 Seyffert, W., Gassen, H.G., Hess, O., Jäckle, H., Fischbach, K.F.: Lehrbuch Der Genetik; Fischer-Verlag 1998. Kapitel 27, 28, 29.

146 Shen, S.X., Weaver, Z., Xu, X., Li, C., Weinstein, M., Chen, L., Guan, X.Y., Ried,T., Deng, C.X.: A Targeted Disruption of the Murine Brca1 Gene Causes Gamma-Irradiation Hypersensitivity and Genetic Instability. Oncogene 1998, 17, 3115-3124.

147 Sherr, C. J.: Principles of Tumor Suppression. Cell 2004, 116, 235-246.

148 Shi, Y., Massagué, J.: Mechanisms of TGF-Beta Signaling From Cell Membrane to the Nucleus. Cell 2003, 113, 685-700.

149 Simon, B., Printz, H.: Epidemiological Trends in Pancretic Neoplasias. Dig Dis. 2001, 19, 6-14.

150 Sirivatanauksorn, V., Sirivatanauksorn, Y., Gorman, P.A., Davidson, J.M., Sheer, D., Moore, P.S., Scarpa, A., Edwards, P.A.W., Lemoine, N.R.: Non-Random Chromosomal Rearrangements in Pancreatic Cancer Cell Lines Identified by Spectral Karyotyping. Int. J. Cancer 2001, 91, 350-358.

151 Su, G.H., Hruban, R.H., Bansal, R.K., Bova, G.S., Tang, D.J., Shekher, M.C., Westerman, A.M., Entius, M.M., Goggins, M., Yeo, C.J., Kern, S.E.: Germline and Somatic Mutations of the STK11/LBK1 Peutz-Jeghers Gene in Pancreatic and Biliary Cancers. Am. J. Pathol. 1999, 154, 1835-1840.

152 Swiger, R.R., Tucker, J.D.: Fluorescence in Situ Hybridization: A Brief Review. Environ. Mol. Mutagen 1996, 27, 245-254.


153 Tariverdian G., Buselmaier, W.: Humangenetik, 3.aktualisierte Auflage, Springer Verlag, 2004. S.56 ff., S.121, S.143 ff.

154 Tepel, J., Kruse, M.L., March, C., Fiedler, A., Kapischke, M., Ketterer, T., Sipos, B., Kalthoff, H., Kremer, B.: Terminally Modified Oligodeoxynucleotides Directed Against P53 in an Orthotopic Xenograft Model: a Novel Adjuvant Treatment Strategy for Pancreatic Ductal Carcinoma. Pancreas 2004, 28, 1-12.

155 Thompson, E.W., Price, J.T.: Mechanisms of Tumour Invasion and Metastasis: Emerging Targets for Therapy. Expert Opin. Ther. Targets. 2002, 6, 217-233.

156 Tonon, G., Roschke, A., Stover, K., Shou, Y., Kuehl, W.M., Kirsch, I.R.: Spectral Karyotyping Combined With Locus-Specific FISH Simultaneously Defines Genes and Chromosomes Involved in Chromosomal Translocations. Genes Chromosomes Cancer 2000, 27, 418-423.

157 Veldman, T., Vignon, C., Schröck, E., Rowley, J.D., Ried, T.: Hidden Chromosome Abnormalities in Haemotological Malignancies Detected by Multicolour Spectral Karyotyping. Nat. Genet. 1997, 15, 406-410.

158 Vogelstein, B., Fearon, E.R., Hamilton, S.R., Kern, S.E., Preisinger, A.C., Leppert, M., Nakamura, Y., White, R., Smits, A.M., Bos, J.L.: Genetic Alterations During Colorectal-Tumor Development. N Engl J Med. 1988, 319, 525-532.

159 Wagner, M., Greten,F.R., Weber, C.K., Koschnick, S., Mattfeldt, T., Deppert, W., Kern, H., Adler, G., Schmid, R.M.: A Murine Tumor Progression Model for Pancreatic Cancer Recapitulating the Genetic Alterations of the Human Disease. Genes Dev. 2001, 15, 286-293.

160 Wagner, M., Lührs, H., Klöppel, G., Adler, G., Schmid, R.M.: Malignant Transformation of Duct-Like Cells Originating From Acini in Transforming Growth Factor Alpha Transgenic Mice. Gastroentrology 1998, 115, 1254-1262.

161 Wagner, M., Weber, C.K., Bressau, F., Greten, F.R., Stagge, V., Ebert, M., Leach, S.D., Adler, G., Schmid, R.M.: Transgenic Overexpression of Amphiregulin Induces a Mitogenic Response Selectively in Pancreatic Duct Cells. Gastroenterology 2002, 122, 1898-1912.

162 Wahl, G. M.: The Importance of Circular DNA in Mammalian Gene Amplification. Cancer Res. 1989, 49, 1333-1340.

163 Wang, W., Abbruzzese, J.L., Evans, D.B., Larry, L., Cleary, K.R., Chiao, P.J.: The Nuclear Factor-Kappa B RelA Transcription Factor Is Constitutively Activated in Human Pancreatic Adenocarcinoma Cells. Clin. Cancer Res. 1999, 5, 119-127.


164 Warshaw, A.L., Castillo, C.F.: Pancreatic Carcinoma. N. Engl. J. Med. 1992, 326, 455-465.

165 Whitcomb, D.C., Gorry, M.C., Preston, R.A., Furey, W., Sossenheimner, M.J., Ulrich, C.D., Martin, S.P., Gates, L.K.Jr., Amann, S.T., Toskes, P.P., Liddle, R., McGrath, K., Uomo, G., Post, J.C., Ehrlich, G.D.: Hereditary Pancreatitis Is Caused by a Mutation in the Cationic Trypsinogen Gene. Nature Genetics 1996, 14, 141-145.

166 Wilentz, R.E., Iacobuzio-Donahue, C.A., Argani, P., McCarthy, D.M., Parsons, J.L., Yeo, C.J., Kern, S.E., Hruban, R.H.: Loss of Expression of Dpc4 in Pancreatic Intraepithelial Neoplasia: Evidence That DPC4 Inactivation Occurs Late in Neoplastic Progression. Cancer Res. 2000, 60, 2002-2006.

167 Wu, X., Pandolfi, P.P.: Mouse Models for Multistep Tumorigenesis. Trends Cell Biol. 2001, 11, S2-9.

168 Wu, Y., Renard, C.A., Apiou, F., Huerre, M., Tiollais, P., Dutrillaux, B., Buendia, M.A.: Recurrent Allelic Deletions at Mouse Chromosomes 4 and 14 in Myc-Induced Liver Tumors. Oncogene 2002, 21, 1518-1526.

169 Yamanaka, Y., Friess, H., Kobrin, M.S., Büchler, M., Beger, H.G., Korc, M.: Coexpression of Epidermal Growth Factor Receptor and Ligands in Human Pancreatic Cancer Is Associated With Enhanced Tumor Aggressiveness. Anticancer Res. 1993, 13, 565-569.

170 Yamano, M., Fujii, H., Takagaki, T., Kadowaki, N., Watanabe, H., Shirai, T.: Genetic Progression and Divergence in Pancreatic Carcinoma. Am J Pathol. 2000, 156, 2123-2133.

171 Zalatnai, A. Pancreatic Cancer - a Continuing Challenge in Oncology. Pathol. Oncol. Res. 2003, 9, 252-263.

172 Zimonjic, D.B., Zhang, H., Shan, Z., Factor, V., Trent, J., Thorgeirsson, S.S., Popescu, N.C.: DNA Amplification Associated With Double Minutes Originating From Chromosome 19 in Mouse Hepatocellular Carcinoma. Cytogenet. Cell Genet. 2001, 93, 114-116.

7 Publikationen 99

7 Publikationen Die Ergebnisse dieser Dissertation wurden für die folgende Publikation

verwendet:

Bettina Schreiner, Florian R. Greten, Dorothee M. Baur, Alexander A. Fingerle, Ulrich Zechner, Christian Böhm, Michael Schmid, Horst Hameister, Roland M. Schmid. Murine pancreatic tumor cell line TD2 bears

the characteristic pattern of genetic changes with two independently amplified

gene loci. Oncogene 2003; 22, 6802-6809.

8 Abkürzungsverzeichnis 100

8 Abkürzungsverzeichnis APC Adenomatous Polyposis Coli Protein BAC Bacterial Artificial Chromosome BAX BCL2-associated X Protein BCL-2 B-Cell CLL lymphoma 2 bp Basenpaare BRCA2 Breast Cancer 2 CCD Charge-coupled Device CDC25 Cell Division Cycle 25 CDK4 Cyclin-dependent Kinase 4 CDKN2A Cyclin-dependent Kinase Inhibitor 2A cDNA complementary DNA CGH Comparative Genomic Hybridization c-Rel Reticuloendotheliose Oncogene DM Double Minute DNA Desoxyribonucleic Acid DPC Deleted in Pancreatic Carcinoma dUTP Desoxyuridintriphosphat EGFR Epidermal Growth Factor Receptor ERB-B2 Avian Erythroblastic Leukaemia Viral Oncogene Homolog 2 FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung FITC Fluoresceinisothiocyanat FLIP FLICE-like Inhibitory Protein GTP Guanyl-Triphosphat hGH human Growth Hormone hMLH1 MutL Protein Homolog 1 hMSH2 MutS Protein Homolog 2 HSR Homogeneously Staining Region JUN B Transkriptionsfaktor JUN B K-RAS Kirsten Rat Sarcoma Oncogene 2 LOH Loss of Heterozygosity Mb Megabasenpaare mRNA messenger Ribonucleic Acid MYC Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog NF-κB Nuclear Factor kappa B p14ARF Alternative Reading Frame Product (= p19Arf bei der Maus) p16INK4a Cyclin-dependent Kinase 4 Inhibitor A p53 Tumorprotein p53 PanIN Pancreatic Intraepithelial Lesion PCR Polymerase Chain Reaction PRSS1 Protease Serine 1 (Trypsin 1) RB1 Retinoblastoma 1 SKY Spectral Karyotyping SMAD4 Mother Against Decapentaplegic Homolog 4 STK10/11 Serin/Threonin Kinase 10/11 TGFα/ß Transforming Growth Factor alpha/beta WCP Whole Chromosome Paint Bei der Bezeichnung von Genen und Proteinen ist zu beachten, dass für die humanen Varianten nur Grossbuchstaben verwendet werden, während bei den murinen Äquivalenten nur der jeweils erste Buchstabe grossgeschrieben wird.

Danksagung Mein aufrichtiger Dank gilt allen Personen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Insbesondere möchte ich danken:

Herrn Prof. Dr. M. Schmid für die Vergabe des Themas, die gute Betreuung sowie die schnelle und kritische Durchsicht der Arbeit. Herrn Prof. Dr. H. Hameister und Bettina Schreiner aus dem Institut für Humangenetik der Universität Ulm für die Bereitstellung des Arbeitsauftrages, die Überlassung des Zellmaterials, die Durchführung der CGH-Analysen und freundliche Vermittlung der Bilder sowie die gute Kooperation bei der Auswertung und Interpretation der Ergebnisse zum Erstellen der Dissertation.

Herrn Claus Steinlein für die stetige und unermüdliche Hilfsbereitschaft und Geduld bei sämtlichen labor- und computertechnischen Fragen und der Durchführung aller Experimente sowie für die hervorragende Zusammenarbeit.

Der Arbeitsgruppe Zytogenetik des Instituts für Humangenetik für das freundliche und angenehme Arbeitsklima und die Hilfe bei Fragen jeglicher Art, insbesondere Frau Dr. M. Guttenbach, Herrn Dr. I. Nanda, Herrn Dr. W. Feichtinger, Andrea Buwe und Noemi Reissmann sowie allen weiteren Mit-arbeitern der Abteilung Humangenetik am Biozentrum Würzburg.

Meinen ehemaligen Mitdoktorandinnen und –doktoranden aus der Human-genetik für die gegenseitige Unterstützung, Motivation und den Gedanken-austausch, insbesondere Sigrid Köhler und Christian Ziegler.

Meinen Freunden für alle Form der Unterstützung, Ablenkung und das Ertragen meiner Launen.

Der allergrösste Dank gilt meinen Eltern und meinem Bruder für die Ermöglichung meines Studiums und die jahrelange Unterstützung in jeglicher Hinsicht.

Lebenslauf persönliche Daten: Name: Christian Böhm Geburtsdatum: 03.11.1975 in Ulm/Donau Schulausbildung: 1982-1986 Rektor-Meinrad-Mayer-Grundschule Wullenstetten

1986-1995 Nikolaus-Kopernikus-Gymnasium Weißenhorn (neusprach-licher Ausbildungsweg), Allgemeine Hochschulreife 5/1995

Zivildienst: 1995-1996 Mobiler Sozialer Hilfsdienst, Diakonisches Werk Neu-Ulm Hochschulstudium:

SS1997–WS03/04 Studium der Humanmedizin an der Bayerischen Julius-Maximilian-Universität Würzburg

03/1999 Physikum 03/2000 1.Staatsexamen 09/2002 2.Staatsexamen 11/2003 3.Staatsexamen Praktische Tätigkeiten: 01/1997-04/1997 Orthopädische Klinik der Universität Ulm (Pflegepraktikum) 09/1999 Kreisspitalstiftung Weißenhorn (Famulatur Chirurgie) 08/2000 San Fernando General Hospital, Republic Of Trinidad &

Tobago (Famulatur Innere Medizin) 03/2001 Institut für Humangenetik, Universität Würzburg (Famulatur) 08/2001 Praxis Dres. Jerg, Senden (Famulatur Innere Medizin) 09/2001 Christiana Care Hospital, Delaware/USA (Famulatur

Medizinische Intensivstation) 10/2002-09/2003 Praktisches Jahr Neurolgische Universitätsklinik Würzburg

(Wahlfach), Spital Schwyz/Schweiz (Innere Medizin), Chirurgische Universitätsklinik Würzburg

Berufliche Tätigkeit: seit 6/2004 zunächst Arzt im Praktikum, danach Assistenzarzt an der Klinik für Neurologie (Leitung Prof. Erbguth) am Klinikum Nürnberg-Süd

Nürnberg, 12.09.2005

Zytogenetische Untersuchungen an Pankreaskarzinom ... · Aus dem Institut für Humangenetik der...

Documents

Transcript of Zytogenetische Untersuchungen an Pankreaskarzinom ... · Aus dem Institut für Humangenetik der...