DIPLOMARBEIT
Titel der Diplomarbeit
Phytochemische Untersuchung von Eriosema laurentii
verfasst von
Tamara Scherzer
angestrebter akademischer Grad
Magistra der Pharmazie (Mag.pharm.)
Wien, 2014
Studienkennzahl lt. Studienblatt: A 449
Studienrichtung lt. Studienblatt: Diplomstudium Pharmazie
Betreuerin / Betreuer: ao. Univ.-Prof. Mag. Dr. Liselotte Krenn
Danksagung
Ich bedanke mich ganz herzlich bei Frau a.o. Univ.-Prof. Mag. Dr. Liselotte Krenn, für
die Bereitstellung dieses Diplomarbeitsthemas und für ihre hilfsbereite, freundliche
und lehrreiche Unterstützung während meiner gesamten Arbeit.
Bedanken möchte ich mich auch bei Frau Univ.-Prof. Dr. Verena Dirsch, Vorstand
des Departments für Pharmakognosie, für die zur Verfügungstellung eines
Arbeitsplatzes zur Durchführung meiner praktischen Tätigkeiten.
Bei der gesamten Arbeitsgruppe für Pharmakognosie möchte ich mich herzlichst für
die freundliche Aufnahme, die bedingungslose Hilfsbereitschaft und das angenehme
Arbeitsklima bedanken.
Mein Dank richtet sich auch an Herrn Dr. Martin Zehl und an Herrn Ass. Prof. Dr.
Hanspeter Kählig, die mir mit der Durchführung der MS – Analysen sowie der NMR –
Vermessungen dankbarerweise unter die Arme gegriffen haben.
Weiters möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, dass sie mir die Chance,
mittels ihrer finanziellen Unterstützung, boten, dieses Studium absolvieren zu können.
Sie hatten immer ein offenes Ohr für meine Probleme und waren mir in jeder
Lebenslage eine große Hilfe.
Bei all meinen Freunden möchte ich mich auf das Herzlichste für diese wirklich tolle
Studienzeit bedanken.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung und Zielsetzung 1
2 Material und Methoden 4
2.1 Material 4
2.2 Methoden 6 2.2.1 Säulenchromatographie (SC) 6 2.2.2 Dünnschichtchromatographie (DC) 7 2.2.3 Solid Phase Extraction (SPE) 8 2.2.4 High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) 10 2.2.5 Präparative Dünnschichtchromatographie 12 2.2.6 LC-MS 12 2.2.7 Nuclear Magnetic Resonance – Spektroskopie 13
3 Ergebnisse 14
3.1 Säulenchromatographie (SC-1) 14
3.2 Solid Phase Extraction (SPE) 16 3.2.1 SPE-1 16 3.2.2 SPE-2 22 3.2.3 SPE-3 24 3.2.4 SPE-4 29 3.2.5 SPE-5 32 3.2.6 Präparative Dünnschichtchromatographie der Fraktion SPE-5 E 35
3.3 Säulenchromatographie (SC-2) 40
3.4 Identifizierung weiterer Komponenten mittels DC 43
4 Diskussion der Ergebnisse 46
5 Zusammenfassung 48
6 Summary 49
7 Literaturverzeichnis 50
8 Abbildungsverzeichnis 52
9 Tabellenverzeichnis 53
10 Curriculum Vitae 54
11 Anhang 55
1. Einleitung und Zielsetzung
1
1 Einleitung und Zielsetzung
Die Gattung Eriosema gehört zu den Fabaceae/Leguminosae
(Schmetterlingsblütlern) und ist in tropischen Gegenden verbreitet. Es werden
ungefähr 140 verschiedene Species dieser Gattung unterschieden [1,2].
Der in dieser Arbeit behandelte Vertreter der Gattung, Eriosema laurentii De Wild,
kommt ebenfalls aus einem tropischen Gebiet. Das Ausgangsmaterial dieser Arbeit
wurde in Kamerun (Zentralafrika) gesammelt.
Abbildung 1: Eriosema laurentii (Foto, Sylvain B. Ateba)
Verschiedene Vertreter der Gattung Eriosema (E. tuberosum, E. kraussianum, E.
rufum, E. laurentii,..) finden in der afrikanischen, chinesischen und
südamerikanischen traditionellen Medizin Verwendung [1]. In der Regel werden
Dekokte der Wurzeln oder Infusa mit heißer Milch [1,3] gegen
1. Einleitung und Zielsetzung
2
Harnwegserkrankungen und Hodenentzündungen, zur Linderung von
Tollwutsymptomen und als Antidiarrhoikum (E. tuberosum) [1,4], bei Unfruchtbarkeit
der Frau (E. rufum) [1], zur Behandlung von Impotenz sowie Harnwegsbeschwerden
(E. kraussianum) [2,5] verwendet.
In ähnlicher Weise wird Eriosema laurentii in der traditionellen afrikanischen Medizin
sowohl als fruchtbarkeitssteigerndes und potenzförderndes pflanzliches Mittel als
auch gegen menopausale Beschwerden und als „Aphrodisiakum“ eingesetzt [6].
In einer Untersuchung der Inhaltsstoffe von Eriosema glomeratum wurden prenylierte
Dihydrocalcone isoliert, die eine hemmende Aktivität gegen Mikroorganismen wie
Bacillus megaterium, Escherichia coli, Chlorella fusca und Microbotryum violaceum
aufwiesen [8].
Abbildung 2: Herbarbeleg von Eriosema laurentii [7]
1. Einleitung und Zielsetzung
3
Auch das Dichlormethan-Extrakt von der Wurzel der Eriosema tuberosum zeigte eine
antimykotische Aktivität gegen Cladosporium cucumerinum und Candida albicans [1].
In Untersuchungen von Eriosema kraussianum konnte ein Zusammenhang zwischen
bestimmten Inhaltstoffen und dem positiven Effekt bei Impotenz und erekiler
Dysfunktion nachgewiesen werden. Für den vasodilatierenden Effekt scheinen
Pyranoisoflavonoide (Kraussianone) verantwortlich zu sein [2-3,5].
In neuen Untersuchungen zur Wirkung der Inhaltstoffe aus Eriosema laurentii stellte
man in in vitro Versuchen in einem rekombinanten Hefe-Assay agonistische
Wirkungen am Östrogenrezeptor α und am Arylhydrocarbonrezeptor fest [9].
Bei in vivo Versuchen an ovariektomierten Ratten konnte keine unerwünschte
Proliferation des Endometriums durch ein Extrakt aus Eriosema laurentii
nachgewiesen werden. Sowohl der Verlust an Oberschenkelknochenmasse als auch
die vaginale Atrophie wurden verhindert. Ebenso senkte der methanolische Extrakt
aus den oberirdischen Anteilen der Pflanze die Total-Cholesterin- und LDL-
Cholesterin-Werte und steigerte das HDL-Cholesterin [10].
Zu den Sekundärstoffen von Eriosema laurentii lagen bisher keine Untersuchungen
vor. Dies und die vielfältige traditionelle Anwendung wurden zum Anlass genommen,
in einem Projekt und mehreren Diplomarbeiten methanolische Extrakte aus Eriosema
laurentii De Wild zu untersuchen [6,11].
Die Zielsetzung dieser Arbeit war es, aus schon vorhandenen Fraktionen eines
methanolischen Extraktes einzelne Komponenten zu isolieren und ihre Struktur zu
identifizieren.
2. Material und Methoden
4
2 Material und Methoden
2.1 Material
Das methanolische Extrakt aus den oberirdischen Anteilen von Eriosema laurentii
wurde in vorangegangenen Arbeiten mittels verschiedener Trennverfahren
fraktioniert. Mehrere Fraktionen sollten in dieser Diplomarbeit weiter aufgetrennt
werden.
Abbildung 3: Auftrennungsschema des Extraktes
Die Ausgangsfraktionen AF 1 bis AF 3 boten sich zur weiteren Untersuchung an, da
aufgrund der vorhandenen Menge und ihrer Zusammensetzung die Isolierung von
Einzelkomponenten möglich erschien.
2. Material und Methoden
5
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (77+22+3,5)
Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (s. 2.2.2.2, S.8)
Ausgangsfraktion 1 und 2 wurden wegen ihrer ähnlichen Zusammensetzung
(Abbildung 4) vereinigt und mittels SC-1 weiter aufgetrennt.
Ausgangsfraktion Menge
AF 1 Cis 25-32 1,00g
AF 2 Cis 33-50 0,14g
AF 3 Cis 51-70 1,29g
AF1 AF2 AF3
Abbildung 4: DC verschiedener Fraktionen aus E. laurentii
2. Material und Methoden
6
2.2 Methoden
2.2.1 Säulenchromatographie (SC)
Für die Auftrennung der Fraktionen wurde die Säulenchromatographie eingesetzt,
wobei folgende Parameter verwendet wurden:
Tabelle 1: Bedingungen der SC-1
Stationäre Phase Sephadex® LH-20
Mobile Phase Elution mit MeOH-H2O (60:40)
Dimension Länge: 80cm; Ø 1,5cm
Durchflussrate 10ml/30min
Tabelle 2: Bedingungen der SC-2
Stationäre Phase Sephadex® LH-20
Mobile Phase Elution mit MeOH-H2O (50:50)
Dimension Länge:80cm; Ø 1,5cm
Durchflussrate 10ml/30min
Für das Säulenvolumen von ca. 380cm3 (80cm x 1,5cm x π) wurden ca. 190g
Sephadex® LH-20 3-4 Stunden in der mobilen Phase vorgequollen. Auf die gepackte
Säule wurde die Fraktion, gelöst in mobiler Phase, aufgetragen.
2. Material und Methoden
7
Die einzelnen Fraktionen wurden mit einem Fraktionssammler aufgefangen und jede
fünfte Fraktion mittels Dünnschichtchromatographie überprüft, um ähnliche
Fraktionen zu Sammelfraktionen vereinigen zu können.
2.2.2 Dünnschichtchromatographie (DC)
Mittels Dünnschichtchromatographie wurden die gesammelten Fraktionen überprüft
und vergleichende Untersuchungen mit Referenzsubstanzen durchgeführt.
2.2.2.1 Stationäre und mobile Phasen
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phasen: (1) Chloroform – Methanol – Wasser (77+22+3,5)
(2) Chloroform – Methanol – Wasser (80+10+1)
Konzentration der Auftragslösung: 0,1mg der jeweiligen Substanz wurden in 100µl
Methanol gelöst und 10µl bandförmig aufgetragen.
Abbildung 5: Säulenchromatographie an Sephadex® LH-20
2. Material und Methoden
8
2.2.2.2 Detektionsverfahren
Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (NP/PEG 400)
Die DC-Platte wird mit einer 1%igen methanolischen Lösung von Naturstoffreagens
A (Diphenylboryloxyethylamin) und anschließend mit einer 5%igen Lösung von PEG
400 in Ethanol besprüht. Die Auswertung der Platte erfolgt unter UV-Licht bei einer
Wellenlänge von 366nm [12].
Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagens (AASS)
Für dieses Sprühreagenz werden 0,5 ml Anisaldehyd mit 10 ml konzentrierter
Essigsäure mit 85 ml Methanol versetzt und anschließend 5 ml konzentrierte
Schwefelsäure hinzugegeben.
Die DC-Platte wird mit dem Sprühreagens besprüht und bei 100°C im
Trockenschrank für 10 min erhitzt. Die DC-Platte wird bei Tageslicht ausgewertet [12].
2.2.3 Solid Phase Extraction (SPE)
Die Fraktionen SC-1 A, B, D+E, G und I wurden mittels Festphasenextraktion weiter
aufgetrennt. Ziel war es, einzelne Substanzen aus dem Komponentengemisch zu
isolieren und zu identifizieren.
Stationäre Phasen: (1) Bond elut® (Varian, Inc.) MEGA BE-C18; 5g; 20ml
(2) Phenomenex® Strata C-18 E; 500mg; 6ml
Mobile Phasen: (1) Methanol – H2O 50%-100%
(2) Methanol – H2O 30%-100%
2. Material und Methoden
9
Tabelle 3: Konditionierung und Elution mit mobiler Phase (1)
Elutionsmittel Methanol % H2O %
Konditionierung 2 Bettvolumen 0 100
2 Bettvolumen 100 0
2 Bettvolumen 50 50
Gradientenelution 3 Bettvolumen 50 50
3 Bettvolumen 60 40
3 Bettvolumen 70 30
3 Bettvolumen 80 20
3 Bettvolumen 90 10
3 Bettvolumen 100 0
Tabelle 4: Konditionierung und Elution mit mobiler Phase (2)
Elutionsmittel Methanol % H2O %
Konditionierung 2 Bettvolumen 0 100
2 Bettvolumen 100 0
2 Bettvolumen 30 70
Gradientenelution 3 Bettvolumen 30 70
3 Bettvolumen 40 60
3 Bettvolumen 50 50
3 Bettvolumen 60 40
3 Bettvolumen 70 30
3 Bettvolumen 80 20
3 Bettvolumen 90 10
3 Bettvolumen 100 0
2. Material und Methoden
10
2.2.4 High Performance Liquid Chromatographie (HPLC)
Zur Überprüfung der Reinheit der Substanzen wurde die HPLC herangezogen.
System: SHIMADZU
Pumpe: LC-20AD
Detektor: SPD M20A diode array detector
Column oven: CTO-20AC
Auto injector: SIL-20AC HT
Säule: Hypersil® BDS-C18, 5μm, 4.0 x 250mm (Fa. Agilent)
Mobile Phase: A: 0,03M Essigsäure (pH 3)
B: CH3CN/0,03M Essigsäure (pH 3) (80+20)
Konzentration der Analysen-Lösung: 1mg/ml
Abbildung 7: SPE unter vermindertem Druck
Abbildung 6: Bond elut® (Varian, Inc.) MEGA BE-C18;
5g; 20ml
Abbildung 8: Bereitung der mobilen Phase A
2. Material und Methoden
11
Gradient 1: 0%B 5min
0% - 100%B 60min
100%B 5min
100% - 0%B 1min
Gradient 2: 5%B 5min
5% - 30%B 25min
30%B 5min
30%-50%B 15min
50%-100%B 5min
100%B 5min
100% - 5%B 1min
Gradient 3: 20%B 5min
20% - 40%B 10min
40%B 3min
40% - 60%B 7min
60% - 100%B 30min
100%B 5min
100% - 20%B 1min
Gradient 4: 5%B 5min
5% - 50%B 10min
50%B 5min
50% - 100%B 40min
100%B 5min
100% - 5%B 1min
Detektion: 254nm
Flussrate: 1,0ml/min
Injektionsvolumen: 10μl
Druck: 120bar
Temperatur: 25°C
2. Material und Methoden
12
2.2.5 Präparative Dünnschichtchromatographie
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatten (Merck) 20cmx20cm
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (80+10+1)
Die aufgetrennten Substanzen wurden vom Kieselgel mit 50ml 100%igem Methanol
unter 15 Minuten Behandlung im Ultraschallbad eluiert.
Die Lösung wurde durch Zentrifugation vom Kieselgel abgetrennt und der Überstand
unter vermindertem Druck zur Trockene gebracht.
2.2.6 LC-MS
Die Molekülmasse der isolierten Verbindungen wurde zur Aufklärung der Struktur
mittels Massenspektrometrie ermittelt.
Zur Bestimmung der molekularen Massen der einzelnen Substanzen wurden LC-MS-
Analysen auf einem Ultimate 3000 RSLC-Series System (Dionex, Germering,
Deutschland), das an ein 3D-Ionenfallen-Massenspektrometer mit einer orthogonalen
ESI-Quelle (HCT; Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland) gekoppelt ist,
durchgeführt.
Der Elutionsfluss wurde ca. 1:4 vor der ESI-Quelle gesplittet, die mit folgenden
Einstellungen durchgeführt wurde: Kapillarspannung -3,7 kV, Vernebelungsgas 26 psi
(N2), Trockengasfluss 9 l/min (N2), und Trockengastemperatur 340°C.
Mehrstufenmassenspektren im Positiv-Ionenmodus bis zu MS4 wurden in einem
Abbildung 9: Banden unter UV 366nm
Abbildung 10: Abkratzen der einzelnen Banden
2. Material und Methoden
13
automatischen data-dependent acquisition (DDA) Modus mit Helium als
Kollisionsgas, einem Isolationsfenster von 4 Th und einer Fragmentierungsamplitude
von 1,0 V gemessen.
2.2.7 Nuclear Magnetic Resonance – Spektroskopie
Die NMR - Untersuchungen wurden auf einem Bruker Avance DRX 600 NMR –
Spektrometer mit einem 5mm QNP Probenkopf (1H, 13C, 19F, 31P) mit z –
Gradientenspule und automatischer Matching- und Tuning – Einheit durchgeführt.
Messtemperatur: 298 K
Lösungsmittel: CDCl3
Messfrequenz: 600,13 MHz für 1H – NMR bzw. 150,92 MHZ für 13C – NMR
Es wurden 1D- (1H-NMR, 13C-NMR) und gradient enhanced 2D - Experimente
(COSY, TOCSY, NOESY, HSQC, HMBC) durchgeführt.
3. Ergebnisse
14
3 Ergebnisse
3.1 Säulenchromatographie (SC-1)
Anhand der dünnschichtchromatographischen Darstellung der Ausgangsfraktionen
AF1 bis AF3 (Abbildung 4, Seite 5) war erkennbar, dass AF-1 und AF-2 sehr
ähnliche Zusammensetzungen aufwiesen. Deshalb wurden die Fraktionen vereinigt
(1,1g) und mittels SC-1 (Bedingungen siehe Tab. 1, Seite 6) weiter aufgetrennt.
Ziel der Säulenchromatographie war es, die Komponenten mit Rf-Werten zwischen
0,2 und 0,3 zu isolieren.
Insgesamt wurden 240 Fraktionen gesammelt und jede fünfte Fraktion
dünnschichtchromatographisch überprüft. Die Sammelfraktionen wurden nochmals
mittels Dünnschichtchromatographie analysiert (Abbildung 11).
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (77+22+3,5)
Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (s. 2.2.2.2, S.8)
A B C D E CO F G H I J K L M N O CO
CO=AF1+AF2
Abbildung 11: DC der Sammelfraktionen der SC-1
3. Ergebnisse
15
Tabelle 5: Sammelfraktionen aus SC-1
Die rot gekennzeichneten Sammelfraktionen wurden wie im nächsten Kapitel beschrieben,
mittels SPE weiter aufgetrennt.
Die polaren Komponenten der Sammelfraktionen A,B,D+E mit Rf-Werten zwischen
0,2 und 0,3 (Abbildung 11, S.14) sollten mittels SPE rein dargestellt werden. Auch
die apolareren Komponenten der Sammelfraktionen G mit dem Rf-Wert von ca. 0,45
und I mit den Rf-Werten von ca. 0,4 und 0,8 sollten aufgrund ihrer Konzentration
und der ausreichenden Menge der Fraktionen (Tabelle 5) isoliert werden.
Sammelfraktion Fraktionen Menge in mg
A 1-11 111,5
B 12-16 120,0
C 17-22 131,3
D 23-24 30,3
E 25-28 57,0
F 29 10,9
G 30-36 52,1
H 37-39 18,5
I 40-53 66,2
J 54-66 36,3
K 67-89 33,1
L 90-102 16,2
M 103-124 14,6
N 125-213 28,6
O 214-240 6,6
3. Ergebnisse
16
3.2 Solid Phase Extraction (SPE)
Tabelle 6: Mittels SPE weiter fraktionierte Sammelfraktionen
3.2.1 SPE-1
Ziel der SPE-1 war es, die stark grün fluoreszierende Komponente aus
Sammelfraktion A mit dem Rf-Wert von 0,23 (Abbildung 11, S.14) rein darzustellen.
Die Sammelfraktion A (111,5mg) wurde in 1ml Methanol gelöst und auf die
konditionierte Kartusche (Stationäre Phase (1) siehe Seite 8) aufgetragen. Die Elution
erfolgte unter den in Tabelle 3 auf Seite 9 angegebenen Bedingungen.
Die einzelnen Fraktionen wurden mittels Dünnschichtchromatographie überprüft.
Fraktionen mit ähnlicher Zusammensetzung wurden zu Sammelfraktionen vereinigt
und nochmals dünnschichtchromatographisch dargestellt.
Sammelfraktion Menge in mg SPE
A 111,5 SPE1
B 120,0 SPE-2
D + E 87,3 SPE-3
G 52,1 SPE-4
I 66,2 SPE-5
3. Ergebnisse
17
Abbildung 12: DC der Sammelfraktionen der SPE-1
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (77+22+3,5)
Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (s. 2.2.2.2, S.8)
Tabelle 7: Sammelfraktionen der SPE-1
Sammelfraktionen Menge in mg
1 SPE-1 A 43,0
2 SPE-1 B 27,6
3 SPE-1 C 27,8
4 SPE-1 D 13,1
Die unter UV 366nm grün fluoreszierende Komponente bei Rf 0,23 war in Fraktion
SPE-1 C stark angereichert. Um die Reinheit der Substanz zu überprüfen, wurde
eine HPLC - Analyse durchgeführt.
1 2 3 4 CO
3. Ergebnisse
18
3.2.1.1 HPLC – Analyse der Sammelfraktion SPE-1 C
Durch die HPLC – Analyse (Abbildung 13) wurde festgestellt, dass die stark grün
fluoreszierende Bande (siehe Abbildung 12, S.17) in Sammelfraktion SPE-1 C einen
Hauptpeak bei einer Retentionszeit von 28,97 min in ausreichender Reinheit zeigte,
um weitere Analysen zur Strukturaufklärung durchführen zu können.
Abbildung 13: HPLC - Chromatogramm von SPE-1 C, Detektion bei 254nm, Gradient 1 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10)
3. Ergebnisse
19
3.2.1.2 Strukturaufklärung der Substanz TS1 (= 2"-O-α-Rhamnosyl-6-C-fucosyl-3'-methoxyluteolin)
In Sammelfraktion SPE-1 C lag Substanz TS 1 als überwiegende Komponente vor.
Um die Struktur klären zu können, wurden LC-MS-, 1H NMR-, 13C NMR-, HMBC-,
HSQC- und NOESY – Experimente durchgeführt.
Das MS-Spektrum des Positivionen-Modus (Anhang 1, S.55) zeigte den
Molekülionenpeak bei m/z 593,2, der im MS2 ein Fragment mit m/z 447,3 ergab.
Dieses Fragmentierungsmuster mit einer Differenz von 146 Da konnte einer
Abspaltung einer Desoxyhexose zugeordnet werden.
Das MS-Spektrum im Negativionen - Modus (Anhang 2, S.56) zeigte folglich den
Massenpeak bei m/z 591,1. Das Fragmentierungsmuster im MS3 scan
kennzeichnete einen Verlust einer Methylgruppe.
1H NMR-Spektrum: Die Protonen an C-3 und C-8 eines Flavons kamen als Singletts
bei δ = 6,647 ppm und δ = 6,557 ppm zur Resonanz. Daraus konnte eine
Substitution von C-6 des Flavons abgeleitet werden.
Ein weiteres Singulett bei δ = 3,96 ppm war einer Methoxygruppe zuzuordnen. Das
Vorliegen zweier Dubletts und eines Doppeldubletts bei δ = 7,481 ppm, δ = 6,935
ppm und δ = 7,513 ppm zeigte die zweifache Substitution von Ring B des Flavonoids
in Position 3‘ und 4‘.
Die Protonen zweier anomerer Protonen wurden bei δ = 4,927 ppm und δ = 5,189
ppm detektiert. Die Verschiebungen der Protonen an C6“ und C6‘‘‘ δ = 1,295 ppm
und δ = 0,720 ppm bewiesen das Vorliegen zweier Desoxyhexosen (Anhang 3-5,
S.57-59).
Im 13C NMR-Spektrum (Anhang 6, S.60) wurde das Vorliegen eines Flavons, das
an C-6, C-3‘ und C-4‘ Substituenten trägt, bestätigt. Aus dem Crosspeak eines
anomeren Protons mit C-6 im HMBC konnte die Verknüpfung der Zuckerkette über
C-6 gesichert werden. Aus dem Crosspeak der Protonen der Methylgruppe mit C-3‘
ergab sich das Vorliegen einer Methoxygruppe an C-3‘.
Aus den Verschiebungen und Kopplungen der Zuckerprotonen war 2‘‘-O-α-
Rhamnosyl-fucose als Zuckerkomponente zu identifizieren.
3. Ergebnisse
20
Substanz TS 1 wurde damit als 2"-O-α-Rhamnosyl-6-C-fucosyl-3'-methoxyluteolin
identifiziert. Diese Substanz war schon in Zea mays als 4“-OH-3‘-Methoxymaysin
nachgewiesen worden [13].
3. Ergebnisse
21
Substanz TS 1
1H (ppm) JH.H (Hz) 13C (ppm) 2 C - - 166.11 3 CH 6.647 s 104.35 4 C - - 184.12 4a C - - 105.47 5 C - - 160.69 6 C - - 110.00 7 C - - 164.68 8 CH 6.557 s 96.23 8a C - - 158.87 1‘ C - - 123.61 2‘ CH 7.481 d 2.2, breit 110.57 3‘ C - - 149.50 4‘ C - 152.16 5’ CH 6.935 d 8.4 116.79 6’ CH 7.513 dd 8.4 / d 2.2 121.77 OCH3 3.962 s 56.65
-Fucose 1’’ CH 4.927 d 9.8 73.63 2’’ CH 4.274 d 9.8 / d 9.1 75.79 3’’ CH 3.751 d 9.1 / d 2.7 77.69 4’’ CH 3.698 d 2.7 / d 0.7 73.99 5’’ CH 3.787 d 0.7 / q 6.5 76.21 6’’ CH3 1.295 d 6.5 17.19
-Rhamnose 1’’’ CH 5.189 d 1.6 (1H-13C 172.9 Hz) 102.31 2’’’ CH 3.861 d 1.6 / d 3.2 72.30 3’’’ CH 3.477 d 3.2 / d 9.5 72.07 4’’’ CH 3.105 d 9.5 / d 9.5 73.38 5’’’ CH 2.569 d 9.5 / q 6.2 69.85 6’’’ CH3 0.720 d 6.2 17.97
3. Ergebnisse
22
3.2.2 SPE-2
Sammelfraktion B (120mg) von SC-1 wurde mittels SPE-2 weiter aufgetrennt.
Die Fraktion wurde unter den Bedingungen wie in Tabelle 4 auf Seite 9 beschrieben,
an der stationären Phase (1) (S. 8) aufgetrennt.
Ziel der SPE-2 war es, die grün-blau fluoreszierenden Komponenten aus
Sammelfraktion B mit den Rf-Werten zwischen 0,12 und 0,3 (Abbildung 11, S.14)
zu fraktionieren.
Die einzelnen Fraktionen wurden mittels Dünnschichtchromatographie überprüft,
Fraktionen mit ähnlicher qualitativer Zusammensetzung zu Sammelfraktionen
vereinigt und zur Kontrolle nochmals dünnschichtchromatographisch analysiert
(Abbildung 14).
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (77+22+3,5)
Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (s. 2.2.2.2, S.8)
Abbildung 14: DC der Sammelfraktionen der SPE-2
1 2 3 4 5 6 CO 7 8 9 10 11 12 13 CO 14
3. Ergebnisse
23
Tabelle 8: Sammelfraktionen der SPE-2
Sammelfraktion Menge in mg
1 SPE-2 A 4,7
2 SPE-2 B 5,0
3 SPE-2 C 13,4
4 SPE-2 D 18,0
5 SPE-2 E 10,1
6 SPE-2 F 12,2
7 SPE-2 G 12,0
8 SPE-2 H 16,3
9 SPE-2 I 7,4
10 SPE-2 J 5,6
11 SPE-2 K 4,9
12 SPE-2 L 6,2
13 SPE-2 M 1,9
14 SPE-2 N 2,3
Mit dieser Methode konnte keine zufriedenstellende Auftrennung der Komponenten
erreicht werden (Abbildung 14, S.22). Die Zusammensetzung der einzelnen
Fraktionen war sehr komplex und die Ausbeuten zu gering, um weitere Trennschritte
zur Isolierung von Einzelkomponenten durchzuführen.
3. Ergebnisse
24
3.2.3 SPE-3
Aufgrund der übereinstimmenden Zusammensetzung wurden die beiden
Sammelfraktionen D und E (87,3mg) von SC-1 (Abbildung 11, S. 14) vereinigt und
mittels SPE-3 weiter fraktioniert.
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (77+22+3,5)
Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (s. 2.2.2.2, S.8)
Ziel dieser Auftrennung war es, die unter UV 254nm stark löschende Komponente
bei dem Rf-Wert von ca. 0,26 zu isolieren.
Auf eine konditionierte Kartusche (Stationäre Phase (1) siehe Seite 8) wurde die
Fraktion, die in 1ml MeOH gelöst worden war, aufgetragen.
Die Elution erfolgte entsprechend den Bedingungen der Tabelle 4 auf Seite 9.
Abbildung 15: DC der Sammelfraktionen aus D und E von SC-1
D D+E E D D+E E D D+E E
254 nm vor dem Besprühen
366 nm vor dem Besprühen
366 nm nach dem Besprühen
3. Ergebnisse
25
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (77+22+3,5)
Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (s. 2.2.2.2, S.8)
Abbildung 16: DC der Sammelfraktionen von SPE-3
1 2 CO 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CO 12
Vor dem Besprühen bei UV 254nm
Nach dem Besprühen bei UV 366nm
3. Ergebnisse
26
Tabelle 9: Sammelfraktionen von SPE-3
Die unter UV 254nm stark löschende Komponente war in SPE-3 B (Abbildung 16,
S. 25) weitgehend angereichert. Um die Reinheit der Substanz zu überprüfen, wurde
eine HPLC - Analyse durchgeführt
Sammelfraktion Menge in mg
1 SPE-3 A 2,0
2 SPE-3 B 9,3
3 SPE-3 C 5,8
4 SPE-3 D 6,6
5 SPE-3 E 4,4
6 SPE-3 F 14,3
7 SPE-3 G 6,6
8 SPE-3 H 8,6
9 SPE-3 I 5,4
10 SPE-3 J 2,3
11 SPE-3 K 1,8
12 SPE-3 L 4,8
3. Ergebnisse
27
3.2.3.1 HPLC – Analyse der Sammelfraktion SPE-3 B
Abbildung 17: HPLC - Chromatogramm von SPE-3 B, Detektion bei UV 254 nm, Gradient 1 (siehe S.11), Bedingungen (sieheS.10)
Durch die HPLC – Analyse ließ sich feststellen, dass die grün fluoreszierende Bande
in Sammelfraktion SPE-3 B (Abbildung 17) weitgehend in reiner Form vorlag. Bei
der massenspektrometrischen Vermessung (Anhang 11, S.63) zeigte sich aufgrund
des Fragmentierungsmustes, dass es sich bei der Substanz um Genistin mit einem
Massenpeak von 433,1 m/z im Positivionen-Modus handelt. Dies wurde anhand
einer Vergleichs-DC (Abbildung 18, S.28) bestätigt. Diese Komponente war bereits
in einer vorangegangenen Diplomarbeit [6] in Eriosema laurentii nachgewiesen
worden.
3. Ergebnisse
28
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (77+22+3,5)
Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (s. 2.2.2.2, S.8)
Vor dem Besprühen bei 254nm
Nach dem Besprühen bei 366nm
Abbildung 18: Vergleichs-DC von SPE-3 B mit Genistin
3. Ergebnisse
29
3.2.4 SPE-4
Sammelfraktion G (52,1mg) von SC-1 wurde in 1ml Methanol gelöst und auf eine
konditionierte Kartusche (Stationäre Phase (2) siehe Seite 8) aufgetragen.
Die Elution erfolgte entsprechend den Bedingungen der Tabelle 4 auf Seite 9.
Ziel der SPE-4 war es, die intensiv blau fluoreszierende Komponente in
Sammelfraktion G (Abbildung 11, S.14) bei dem Rf-Wert von 0,47 rein darzustellen.
Die einzelnen Fraktionen wurden mittels Dünnschichtchromatographie überprüft.
Fraktionen mit ähnlicher Zusammensetzung wurden zu Sammelfraktionen vereinigt
und nochmals dünnschichtchromatographisch kontrolliert (Abbildung 19).
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (77+22+3,5)
Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (s. 2.2.2.2, S.8)
Abbildung 19: DC der Sammelfraktionen von SPE-4
1 2 3 4 5 CO 6 7 8 9
3. Ergebnisse
30
Tabelle 10: Sammelfraktionen von SPE-4
Die unter UV 366nm blau fluoreszierende Komponente in SPE-4 B (Abbildung 19,
S.29) schien weitgehend von den Begleitstoffen isoliert worden zu sein. Um die
Reinheit der Substanz zu überprüfen, wurde eine HPLC - Analyse (Abbildung 20,
S.31) durchgeführt.
Sammelfraktion Menge in mg
1 SPE-4 A 1,2
2 SPE-4 B 0,3
3 SPE-4 C 9,7
4 SPE-4 D 20,2
5 SPE-4 E 11,2
6 SPE-4 F 2,3
7 SPE-4 G 3,1
8 SPE-4 H 0,9
9 SPE-4 I 1,8
3. Ergebnisse
31
3.2.4.1 HPLC – Analyse der Sammelfraktion SPE-4 B
In der dünnschichtchromatografischen Untersuchung erschien Fraktion SPE-4 B
(Abbildung 19, S.29) unter UV 366nm als stark hellblau fluoreszierende Bande
chromatographisch einheitlich. Jedoch zeigte die HPLC-Analyse (Abbildung 20)
zahlreiche Begleitstoffe. Eine Reindarstellung und eine Strukturaufklärung mittels
MS oder NMR waren aufgrund der geringen Substanzmenge nicht möglich.
Abbildung 20: HPLC - Chromatogramm von SPE-4 B, Detektion bei UV 254nm, Gradient 2
(siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10)
3. Ergebnisse
32
3.2.5 SPE-5
Sammelfraktion I (66,2mg) von SC-1 wurde in 1ml Methanol gelöst und auf eine
konditionierte Kartusche (Stationäre Phase (1) siehe Seite 8) aufgetragen.
Die Elution erfolgte entsprechend den Bedingungen der Tabelle 4 auf Seite 9.
Ziel der SPE-5 war es, die unter UV 366nm hellgrün fuoreszierende Komponente in
Sammelfraktion I (Abbildung 11, S.14) rein darzustellen.
Die einzelnen Fraktionen wurden mittels Dünnschichtchromatographie überprüft.
Fraktionen mit ähnlicher qualitativer Zusammensetzung wurden zu
Sammelfraktionen vereinigt und nochmals dünnschichtchromatographisch
analysiert.
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (77+22+3,5)
Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (s. 2.2.2.2, S.8)
Abbildung 21: DC der Sammelfraktionen von SPE-5
1 2 3 4 CO 5 6 7
3. Ergebnisse
33
Tabelle 11: Sammelfraktionen von SPE-5
Sammelfraktion Menge in mg
1 SPE-5 A 4,2
2 SPE-5 B 9,6
3 SPE-5 C 8,4
4 SPE-5 D 7,8
5 SPE-5 E 25,0
6 SPE-5 F 5,7
7 SPE-5 G 5,5
Die unter UV 366nm hellgrün fluoreszierende Komponente (Abbildung 21, S.32)
schien in Sammelfraktion 5 stark angereichert.
3. Ergebnisse
34
3.2.5.1 HPLC – Analyse der Sammelfraktion SPE-5 E
Um die Reinheit der Sammelfraktion SPE-5 E zu überprüfen, wurde eine HPLC
durchgeführt (Abbildung 22). Der Gradient 1 (siehe Seite 11) und die übrigen
Parameter zur Durchführung der HPLC sind im Kapitel 2.2.4 auf Seite10 bis 11
angegeben.
Aufgrund der HPLC – Analyse konnte man annehmen, dass die stark hellgrün
fluoreszierende Bande in Sammelfraktion SPE-5 E (siehe Abbildung 21, S.32) als
Hauptkomponente vorlag. Bei der massenspektrometischen Vermessung (Anhang
12 und 13, S.64-65) zeigte sich jedoch aufgrund des Fraktionierungsmusters, dass
es sich um mehrere sehr ähnliche Komponenten mit Massenpeaks von m/z 355 und
m/z 325 im Negativionen-Modus handelte. Den Unterschied von 30 m/z könnte eine
Methoxy - Gruppe ausmachen. Aufgrund dieses Resultats und der großen Ausbeute
(25mg) dieser Fraktion, erfolgte eine weitere Auftrennung mittels präparativer
Dünnschichtchromatographie.
Abbildung 22: HPLC - Chromatogramm von SPE-5 E, Detektion bei UV 254nm, Gradient 1 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10)
a
b
3. Ergebnisse
35
3.2.6 Präparative Dünnschichtchromatographie der Fraktion SPE-5 E
Ziel dieser Auftrennung war es, die Komponenten der Sammelfraktion SPE-5 E
voneinander zu trennen. In Abbildung 23 ist Sammelfraktion SPE-5 E nochmals
dünnschichtchromatographisch dargestellt. Es sind unter UV 366nm nach dem
Besprühen drei stark fluoreszierende Banden zu sehen, die als Substanz E1 mit Rf
0,59, Substanz E2 mit Rf 0,65 und Substanz E3 mit Rf 0,7 bezeichnet wurden. Weil
die Bande E1 ohne Besprühen unter UV 366 nm oder unter UV 254 nm nicht sichtbar
war, wurde als Marker mit annähernd gleichem Rf-Wert Formononetin, das auch
ohne Besprühen fluoresziert, aufgetragen.
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (80+10+1)
Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (s. 2.2.2.2 S.8)
1 = SPE-5 E 2 = Formononetin
Abbildung 23: Vorversuch zur präparativen Dünnschichtchromatographie von
Fraktion SPE-5 E
254 nm ohne
Besprühen
366 nm ohne
Besprühen
366 nm nach dem Besprühen
1 2 1 2 1 2
E3 E2 E1
3. Ergebnisse
36
In Kapitel 2.2.5 auf Seite 12 ist beschrieben, wie diese Auftrennung durchgeführt
wurde.
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte 20cmx20cm (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (80+10+1) Es wurden auf 5 Kieselgelplatten jeweils 200µl der gelösten Fraktion gleichmäßig
aufgetragen. Nach dem Entwickeln und Markieren der Banden wurden die
Fraktionen abgekratzt und wie in Kapitel 2.2.5 auf Seite 12 beschrieben mit
Methanol extrahiert.
Abbildung 24: Präparative DC von Fraktion SPE-5 E mit Formononetin (F)
F
3. Ergebnisse
37
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (80+10+1)
Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400 (s. 2.2.2.2, S.8)
Tabelle 12: Fraktionen aus SPE-5 E
Da die Fraktion E2 in sehr geringer Menge und chromatographisch nicht einheitlich
vorlag, wurde keine Strukturaufklärung mittels NMR durchgeführt.
Isolierte Fraktionen
Menge in mg
E2 2,0
TS 3 7,9
E1 3,9
Abbildung 25: DC der isolierten Komponenten aus SPE-5 E
E2 TS 3 SPE-5 E E1
3. Ergebnisse
38
3.2.6.1 HPLC- Analyse von E1 und TS 3
Um die Reinheit der Fraktionen E1 und TS 3 zu überprüfen, wurden HPLC –
Analysen durchgeführt.
In der dünnschichtchromatografischen Untersuchung erschien Substanz E1
(Abbildung 25, S.37) unter UV 366nm als hellblau fluoreszierende Bande
chromatographisch einheitlich. Jedoch zeigte die HPLC-Analyse (Abbildung 26)
einige Verunreinigungen. Eine Reindarstellung und eine Strukturaufklärung mittels
MS oder NMR waren aufgrund der geringen Substanzmenge nicht möglich.
Abbildung 26: HPLC-Chromatogramm von E1, Detektion bei UV 254nm,
Gradient 4 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10)
3. Ergebnisse
39
Aus dem HPLC - Chromatogramm ließ sich feststellen, dass die hellgrün
fluoreszierende Bande TS 3 (siehe Abbildung 25, S.37) eine Hauptkomponente
enthielt. Das Fragmentierungsmuster der MS – Analyse (Anhang 14 und 15, S.68-69)
zeigte jedoch, dass es sich um zwei sehr ähnliche Komponenten handelte, die
Molekülionenpeaks von 355 m/z und 325 m/z im Negativionen-Modus aufwiesen und
im Verhältnis 3:1 vorlagen. Es wurde vermutet, dass es sich hier um sehr ähnliche
Substanzen handelt, die sich jedoch durch eine Methoxygruppe unterscheiden.
Die genauen Strukturen dieses Gemisches konnten jedoch nicht mittels NMR ermittelt
werden.
Abbildung 27: HPLC-Chromatogramm von TS 3, Detektion bei UV 254nm,
Gradient 4 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10)
3. Ergebnisse
40
3.3 Säulenchromatographie (SC-2) Mittels SC-2 sollten 1,29g der Fraktion AF-3 (Abbildung 4, S.5) aufgetrennt werden.
Die Bedingungen für die SC-2 sind in der Tabelle 2 auf Seite 6 beschrieben.
Ziel der SC-2 war es, die komplexe Fraktion AF-3 weiter zu fraktionieren, um danach
einzelne Komponenten isolieren zu können.
Insgesamt wurden 335 Fraktionen gesammelt, jede fünfte Fraktion
dünnschichtchromatographisch überprüft und ähnliche Fraktionen vereinigt. Die
Sammelfraktionen wurden nochmals mittels Dünnschichtchromatographie
analysiert (Abbilidung 28).
Abbildung 28: DC der Sammelfraktionen aus SC-2 vor dem Besprühen unter
UV 254 nm
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (70+22+3,5)
Detektion: Naturstoffreagens A und Polyethylenglycol 400
Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagens (Kapitel 2.2.2.2, S.8)
A B C D E CO F G H I J K L M N O CO P Q R
3. Ergebnisse
41
Abbildung 29:DC der Sammelfraktionen aus SC-2 besprüht mit NP/PEG400
unter UV 366nm
A B C D E CO F G H I J K L M N O CO P Q R
Abbildung 30: DC der Sammelfraktionen aus SC-2 besprüht mit Anisaldehyd-
Schwefelsäure-Reagens im Tageslicht
A B C D E CO F G H I J K L M N O CO P Q R
3. Ergebnisse
42
Tabelle 13: Sammelfraktionen aus SC-2
Von den Fraktionen B bis F waren zu geringe Mengen vorhanden, sodass man keine
weiteren Auftrennungen zur Isolierung der einzelnen Substanzen durchführen konnte.
Unter UV 254nm (Abbildung 28, S.40) war in den Fraktionen G bis N eine starke
Löschung bei dem Rf-Wert von ca. 0,3 zu erkennen. Diese Substanz wurde als
Genistin (vgl. Startpunkte 1, 4, 6, 7, 11 im Vergleich mit 9 in Abbildung 33 und 34,
S.44) identifiziert, welches schon in einer vorangegangen Diplomarbeit [6]
aufgereinigt und identifiziert worden war. Aufgrund der starken Löschung dieser
Banden wurde darauf geschlossen, dass die anderen unter UV 254nm bzw. 366nm
sichtbaren Komponenten (Abbildung 29, S.41) in einer zu geringen Konzentration
vorlagen, um diese als Reinsubstanzen isolieren zu können.
Deshalb wurden einige dieser Fraktionen mit aus dieser Pflanze schon bekannten
Referenzsubstanzen verglichen (Kap. 3.4, S.43-45)
Sammelfraktion Fraktionen Menge in mg
A 1-27 30,0
B 28-33 6,3
C 34-37 3,5
D 38-42 9,3
E 43-47 15,5
F 48-51 19,3
G 52-58 50,2
H 59-72 115,5
I 73-92 74,7
J 93-117 43,5
K 118-162 148,3
L 163-230 92,3
M 231-268 44,8
N 269-293 113,2
O 294-298 48,0
P 299-310 41,1
Q 311-325 35,3
R 326-335 12,0
3. Ergebnisse
43
3.4 Identifizierung weiterer Komponenten mittels DC
Mittels DC wurden verschiedene Fraktionen mit authentischen Referenzsubstanzen
verglichen. Hierbei handelte es sich um die Isoflavone Formononetin, Biochanin A,
Genistein, 2-OH-Genistein und Daizein. Diese Substanzen wurden mit
Sammelfraktionen aufgetragen, die Banden mit ähnlichen Rf-Werten aufwiesen.
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (80+10+1)
Es war zu erkennen, dass es keine Übereinstimmungen hinsichtlich der Rf-Werte
der Banden sowie der Fluoreszenz gab.
1 SC-2 K 9 Formononetin
2 SPE-5 E 10 Daizein
3 Formononetin 11 SC-2 K
4 Biochanin A 12 2-OH-Genistein
5 SPE-5 E 13 SC-2 I
6 Genistein 14 SC-1 G
7 SC-2 K 15 2 OH- Genistein
8 SC-2 N 16 SPE-5 E
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Abbildung 31: DC-Vergleich von Sammelfraktionen mit Referenzsubstanzen
nach dem Besprühen mit NP/PEG400
UV 366nm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Abbildung 32: DC-Vergleich
Referenzsubstanzen vor dem Besprühen
UV 366nm
3. Ergebnisse
44
Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck)
Mobile Phase: Chloroform – Methanol – Wasser (77+22+3,5)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Abbildung 33: DC-Vergleich mit Referenzsubstanzen nach dem Besprühen
mit NP/PEG 400 unter UV 366nm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Abbildung 34: DC-Vergleich mit Referenzsubstanzen vor dem Besprühen bei
UV 254nm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Abbildung 35: DC-Vergleich mit Referenzsubstanzen nach dem Besprühen mit
AASS im Tageslicht
3. Ergebnisse
45
In dieser Vergleichs-DC wurden verschiedene Sammelfraktionen mit authentischen
Referenzsubstanzen sowie mit bereits identifizierten Substanzen aus einer
vorangegangenen Diplomarbeit [11] miteinander verglichen. Hierbei handelte es
sich um die Isoflavone Lupinalbin, Biochanin A, Genistin, und Daizein und KMU/A
(= Eriosemaon D), KMU/B (= 5,7-dihydroxy-2’-methoxy-6’’,6’’-dimethylpyrano (2’’,3’’
: 4’,5’) isoflavanon) und KMU/C (= 2-(2‘,4‘-dihydroxy-3‘-prenyl)-3,5,7-trihydroxy-6,8-
biprenyl-flavanon) [11]. Diese Substanzen wurden mit Sammelfraktionen
aufgetragen, die Banden mit ähnlichen Rf-Werten aufwiesen.
Es war zu erkennen, dass Genistin in allen Sammelfraktionen enthalten war.
Lupinalbin, Daizein sowie Biochanin A konnten nicht in den Sammelfraktionen
nachgewiesen werden. Auch mit den Substanzen KMU/A, KMU/B und KMU/C [11],
die nach dem Besprühen mit AASS bei Tageslicht grün, blau und rot erschienen,
konnte keine Übereinstimmung festgestellt werden (Abbildung 33-35, S.44).
1 SC-2 J 7 SC-2 M
2 Lupinalbin 8 KMU/A
3 Daizein 9 Genistin
4 SC-2 K 10 KMU/B
5 Biochanin A 11 SC-2 N
6 SC-2 L 12 KMU/C
5. Zusammenfassung
46
4 Diskussion der Ergebnisse
Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden Fraktionen eines methanolischen Extraktes
der oberirdischen Pflanzenteile von Eriosema laurentii durch unterschiedliche
Trennverfahren weiter aufgetrennt und bezüglich ihrer Inhaltsstoffe analysiert. Das
Ziel war es, Reinsubstanzen zu isolieren und zu identifizieren.
Es wurden 3 Ausgangsfraktionen in zwei Säulenchromatographien an Sephadex®
LH-20 fraktioniert. Die aus SC-1 entstandenen Sammelfraktionen A, B, D, E, G und I
(Abbildung 11, S.14) wurden mittels SPE-1 bis SPE-5 weiter aufgetrennt.
Die Sammelfraktion SPE-1 C zeigte nach dem Besprühen unter UV 366nm eine stark
grün fluoreszierende Bande bei einem Rf-Wert von 0,23 (Abbildung 12, S.17). Diese
Komponente konnte in einer ausreichenden Menge (27,8mg) und in weitgehend
reiner Form (Abbildung 13, S.18) isoliert werden. Weiterführende Untersuchungen zur
Strukturanalyse mittels LC-MS und NMR wurden durchgeführt.
Die Struktur von Substanz TS 1 konnte als 2"-O-α-Rhamnosyl-6-C-fucosyl-3'-
methoxyluteolin analysiert werden, welches schon in Zea mays als 4“-OH-3‘-
Methoxymaysin identifiziert worden war [13].
In der Sammelfraktion SPE-3 B konnte das bereits in einer vorangegangenen
Diplomarbeit [6] in Eriosema laurentii nachgewiesene Genistin als Reinsubstanz
isoliert und identifiziert werden.
Die Sammelfraktionen aus SPE-2 und SPE-4 ließen aufgrund ihrer komplexen
Zusammensetzung sowie ihrer geringen Ausbeute keine Isolierung von
Reinsubstanzen zu.
Die Sammelfraktion SPE-5 E zeigte auf der DC nach dem Besprühen unter UV 366nm
eine intensiv hellgrün fluoreszierende Komponente (Abbildung 21, S.32). Bei der
Untersuchung dieser Fraktion mittels LC-MS stellte sich heraus, dass es sich um ein
Gemisch mehrerer Komponenten handelte. Es wurde eine präparative
Dünnschichtchromatographie durchgeführt, um die einzelnen Komponenten zu
erhalten.
5. Zusammenfassung
47
Obwohl die dabei isolierte Substanz TS 3 im HPLC - Spektrum (Abbildung 27, S.39)
eine Hauptkomponente enthielt, konnte mittels NMR die Struktur nicht aufgeklärt
werden.
Aus der SC-2 wurden weitgehend Sammelfraktionen gewonnen, die eine sehr
komplexe Zusammensetzung aufwiesen. Es wurde festgestellt, dass im Großteil der
Fraktionen Genistin als Hauptkomponente enthalten war und zu geringe Mengen zur
Verfügung standen, um weitere Arbeiten an diesen Fraktionen durchzuführen (Kapitel
3.3, S.40-42).
5. Zusammenfassung
48
5 Zusammenfassung
Vertreter der Gattung Eriosema werden in der traditionellen chinesischen,
afrikanischen sowie in der südamerikanischen Medizin in Form von Dekokten der
Wurzel gegen Harnwegserkrankungen, Diarrhoe, bei Unfruchtbarkeit der Frau und
zur Behandlung von Impotenz verwendet.
Eriosema laurentii aus der Familie der Fabaceae ist in tropischen Gegenden Afrikas
heimisch und findet in ähnlicher Weise in der traditionellen afrikanischen Medizin
sowohl als fruchtbarkeitssteigerndes und potenzförderndes pflanzliches Mittel als
auch gegen menopausale Beschwerden Verwendung.
In in vitro Versuchen stellte man agonistische Wirkungen der Inhaltstoffe aus
Eriosema laurentii am Östrogenrezeptor α und am Arylhydrocarbonrezeptor fest.
Bei in vivo Versuchen an ovariektomierten Ratten konnte keine unerwünschte
Proliferation des Endometriums nachgewiesen werden. Sowohl der Verlust an
Oberschenkelknochenmasse als auch die vaginale Atrophie wurden durch ein Extrakt
aus Eriosema laurentii verhindert. Damit konnten im Tierversuch positive Effekte des
Extraktes gegenüber durch Östrogenmangel bedingten Gesundheitsproblemen
bestätigt werden.
Diese Diplomarbeit stellt einen Teil eines Forschungsprojektes dar, das sich mit der
Identifizierung und Reindarstellung der Wirkstoffe dieser Pflanze beschäftigt.
Drei Fraktionen wurden mittels Säulenchromatographie an Sephadex® LH-20 weiter
aufgetrennt. Mehrere Sammelfraktionen aus SC-1 wurden mittels SPE weiter
fraktioniert, auf ihre Inhaltsstoffe dünnschichtchromatographisch überprüft und
angereicherte Substanzen mittels LC-MS und NMR-Spektrometrie untersucht.
Es konnte Substanz TS 1 rein dargestellt und als 2"-O-α-Rhamnosyl-6-C-fucosyl-3'-
methoxyluteolin identifiziert werden.
6. Summary
49
6 Summary
Members of the genus Eriosema are used in traditional Chinese, African and South
American medicine in the form of decoctions of the roots against urinary disorders,
diarrhoea and to treat sterility in women and impotence.
Eriosema laurentii, a Fabaceae, is a common plant in the tropical areas of Africa and
is used in a similar way in traditional African medicine to increase fertility and virility
and to treat menopausal complaints.
In vitro analysis had shown agonistic effects of the extract and of compounds from
Eriosema laurentii at the estrogenreceptor α and the arylhydrocarbon receptor.
In in vivo tests in ovariectomized rats no maligne endometrial proliferation was
detected. The extract of Eriosema laurentii decreased the loss of femoral bone mass
and vaginal atrophy. Thus, in the animal studies positive effects of the extracts in
health problems occuring due to estrogen deficiency were confirmed.
This thesis represents a part of a research project which focussed on the identification
of active compounds of this plant.
Three fractions were further separated by column chromatography on Sephadex® LH
– 20. The resulting fractions of SC-1 were further separated by SPE, analysed by thin
layer chromatography and enriched fractions analysed by LC-MS and NMR
spectrometry.
Substance TS 1 was identified as 2"-O-α-Rhamnosyl-6-C-fucosyl-3'-methoxyluteolin.
Literaturverzeichnis
50
7 Literaturverzeichnis [1] Ma WG, Fuzzati N, Li QS, Yang CR, Stoeckli-Evans H, Hostettmann K (1995)
Polyphenols from Eriosema tuberosum. Phytochemistry 39, 1049-1061
[2] Drewes SE, Horn MM, Munro OQ, Dhlamini JTB, Meyer JJM, Rakuambo NC
(2002) Pyrano-isoflavones with erectile-dysfunction activity from Eriosema
kraussianum. Phytochemistry 59, 739-747
[3] Ojewole JAO, Drewes SE, Khan F (2006) Vasodilatory and hypoglycaemic
effects of two pyrano-isoflavone extractives from Eriosema kraussianum N. E.
Br. [Fabaceae] rootstock in experimental rat models. Phytochemistry 67, 610-
617
[4] Ma WG, Fukushi Y, Hostettmann K, Tahara S (1998) Isoflavonoid glycosides
from Eriosema tuberosum. Phytochemistry 49, 251-254
[5] Drewes SE, Horn MM, Khan F, Munro OQ, Dhlamini JTB, Rakuambo C, Meyer
JJM (2004) Minor pyrano-isoflavones from Eriosema kraussianum: activity-,
structure-, and chemical reaction studies. Phytochemistry 65, 1955-1961
[6] Pichler G. Chemische Untersuchung von Eriosema laurentii. Diplomarbeit,
Universität Wien, 2013
[7] http://collections.mnh.si.edu/search/botany/
[8] Awouafack MD, Kouam SF, Hussain H, Ngama D, Tane P, Schulz B, Green IR,
Krohn K (2008) Antimicrobial prenylated dihydrochalcones from Eriosema
glomerata. Planta Medica 74, 50-54
[9] Ateba SB, Njamen D, Medjakovic S, Zehl M, Kaehlig H, Jungbauer A, Krenn L
(2014 Publikation in Vorbereitung) Lupinalbin A as the most potent estrogene
receptor α and arylhydrocarbon receptor agonist in Eriosema laurentii De Wild
(Leguminosae).
Literaturverzeichnis
51
[10] Ateba SB, Njamen D, Medjakovic S, Hobiger S, Mbanya JC, Jungbauer A,
Krenn L (2013) Eriosema laurentii De Wild (Leguminosae) methanol extract
has estrogenic properties and prevents menopausal symptoms in
ovarieectomized wistar rats. Journal of Ethnopharmacology 150, 298-307
[11] Ukowitz K. Isolierung von Sekundärstoffen aus Eriosema laurentii.
Diplomarbeit, Universität Wien 2013
[12] Wagner H, Bladt S, Zgainski EM, Drogenanalyse,
Dünnschichtchromatographische Analyse von Arzneidrogen. Spinger-
Verlag Berlin, 1983.
[13] Snook ME, Widstrom NW, Wiseman BR, Byme PF, Harwood JS, Costello CE
(1995) New C-4”-hydroxy derivatives of maysin and 3’ methoxymaysin
isolated from corn silks (Zea mays). Journal of Agricultural and Food
Chemistry 43, 2740-2745
Tabellenverzeichnis
52
8 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Eriosema laurentii (Foto, Sylvain B. Ateba) .......................................... 1 Abbildung 2: Herbarbeleg von Eriosema laurentii [7] ................................................ 2 Abbildung 3: Auftrennungsschema des Extraktes..................................................... 4 Abbildung 4: DC verschiedener Fraktionen aus E. laurentii ...................................... 5 Abbildung 5: Säulenchromatographie an Sephadex® LH-20 .................................... 7 Abbildung 6: Bond elut® (Varian, Inc.) MEGA BE-C18; 5g; 20ml ........................... 10 Abbildung 7: SPE unter vermindertem Druck ......................................................... 10 Abbildung 8: Bereitung der mobilen Phase A ......................................................... 10 Abbildung 9: Banden unter UV 366nm ................................................................... 12 Abbildung 10: Abkratzen der einzelnen Banden ..................................................... 12 Abbildung 11: DC der Sammelfraktionen der SC-1 ................................................. 14 Abbildung 12: DC der Sammelfraktionen der SPE-1 .............................................. 17 Abbildung 13: HPLC - Chromatogramm von SPE-1 C, Detektion bei UV 254nm,
Gradient 1 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10) ......................................... 18 Abbildung 14: DC der Sammelfraktionen der SPE-2 .............................................. 22 Abbildung 15: DC der Sammelfraktionen aus D und E von SC-1 ............................ 24 Abbildung 16: DC der Sammelfraktionen von SPE-3 .............................................. 25 Abbildung 17: HPLC - Chromatogramm von SPE-3 B, Detektion bei UV 254 nm,
Gradient 1 (siehe S.11), Bedingungen (sieheS.10) .......................................... 27 Abbildung 18: Vergleichs-DC von SPE-3 B mit Genistin ......................................... 28 Abbildung 19: DC der Sammelfraktionen von SPE-4 .............................................. 29 Abbildung 20: HPLC - Chromatogramm von SPE-4 B, Detektion bei UV 254nm,
Gradient 2 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10) ......................................... 31 Abbildung 21: DC der Sammelfraktionen von SPE-5 .............................................. 32 Abbildung 22: HPLC - Chromatogramm von SPE-5 E, Detektion bei UV 254nm,
Gradient 1 (siehe S.11), Bedingungen (siehe S.10) ......................................... 34 Abbildung 23: Vorversuch zur präparativen Dünnschichtchromatographie von
Fraktion SPE-5 E ............................................................................................. 35 Abbildung 24: Präparative DC von Fraktion SPE-5 E mit Formononetin (F) ........... 36 Abbildung 25: DC der isolierten Komponenten aus SPE-5 E .................................. 37 Abbildung 26: HPLC-Chromatogramm von E1, Detektion bei UV 254nm, .............. 38 Abbildung 27: HPLC-Chromatogramm von TS 3, Detektion bei UV 254nm, ........... 39 Abbildung 28: DC der Sammelfraktionen aus SC-2 vor dem Besprühen unter UV
254 nm ............................................................................................................. 40 Abbildung 29:DC der Sammelfraktionen aus SC-2 besprüht mit NP/PEG400 ........ 41 Abbildung 30: DC der Sammelfraktionen aus SC-2 besprüht mit Anisaldehyd- ...... 41 Abbildung 31: DC-Vergleich von Sammelfraktionen mit Referenzsubstanzen nach
dem Besprühen mit NP/PEG400 ...................................................................... 43 Abbildung 32:DC-Vergleivch Referenzsubstanzen vor dem Besprühen ................. 43 Abbildung 33: DC-Vergleich mit Referenzsubstanzen nach dem Besprühen mit
NP/PEG 400 unter UV 366nm.......................................................................... 44 Abbildung 34: DC-Vergleich mit Referenzsubstanzen vor dem Besprühen mit unter
UV 254nm ........................................................................................................ 44 Abbildung 35: DC-Vergleich mit Referenzsubstanzen nach dem Besprühen mit
AASS im Tageslicht ......................................................................................... 44
Abbildungsverzeichnis
53
9 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Bedingungen der SC-1 ............................................................................ 6 Tabelle 2: Bedingungen der SC-2 ............................................................................ 6 Tabelle 3: Konditionierung und Elution mit mobiler Phase (1) .................................. 9 Tabelle 4: Konditionierung und Elution mit mobiler Phase (2) .................................. 9 Tabelle 5: Sammelfraktionen aus SC-1 ...................................................................15 Tabelle 6: Mittels SPE weiter fraktionierte Sammelfraktionen .................................16 Tabelle 7: Sammelfraktionen der SPE-1 .................................................................17 Tabelle 8: Sammelfraktionen der SPE-2 .................................................................23 Tabelle 9: Sammelfraktionen von SPE-3 ................................................................26 Tabelle 10: Sammelfraktionen von SPE-4 ..............................................................30 Tabelle 11: Sammelfraktionen von SPE-5 ..............................................................33 Tabelle 12: Fraktionen aus SPE-5 E .......................................................................37 Tabelle 13: Sammelfraktionen aus SC-2 .................................................................42
54
10 Curriculum Vitae Name: Tamara Scherzer
Geburtsdatum: 9.11.1986
Geburtsort: Waidhofen an der Thaya
Staatsangehörigkeit: Österreich
Eltern: Franz Scherzer
Gabriele Scherzer
Ausbildung
1993-1997 Volksschule, 3862 Eisgarn
1997-2001 Johann Böhm-Hauptschule für Knaben und
Mädchen, 3860 Heidenreichstein
2001-2003 Bundesbildungsanstalt für Kindergartenpädagogik,
2130 Mistelbach
2003-2007 Bundesaufbaugymnasium, 3580 Horn
Reifeprüfung absolviert am 18. Mai 2007
Oktober 2007 Beginn des Studiums der Pharmazie an der
Universität Wien
März bis Juni 2013 Praktische Arbeiten an der Diplomarbeit am
Department für Pharmakognosie der Universität
Wien
Praktika
August 2008 Apotheke zur Heiligen Margarethe, 3860
Heidenreichstein
Sommer 08/09/10/11 STAL Stadt-Apotheke-Litschau, 3874 Litschau
2011-2014 Apotheke Regenwald, 1220 Wien
Ab 2014 Sonnenapotheke, 1210 Wien
Anhang
55
11 Anhang
Anhang 1: MS-Spektrum von Substanz TS 1 im Positivionen-Modus
Anhang
56
Anhang 2: MS-Spektrum von Substanz TS 1 im Negativionen-Modus
591.1
3. -MS, 18.9-19.8min #1843-#1903
323.2
371.2 487.2
427.2
3. -MS2(591.1), 18.9-19.8min #1844-#1904
365.2
412.2
323.2
3. -MS3(591.1->427.4), 18.9-19.8min #1845-#1905
308.1
3. -MS4(591.1->427.4->323.4), 19.0-19.8min #1846-#1906
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
6x10
Intens.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
6x10
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
6x10
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5x10
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z
Anhang
57
Anhang 3: 1H NMR-Spektrum von Substanz TS 1 (1) Bereich von 0,5 ppm-7,5ppm
H-6‘‘‘
H-5‘
H-5‘‘‘
H-1‘‘
H-2‘‘
-OCH3
H-3
H-6‘‘
H-8
H-1‘‘‘
H-2‘ H-6‘
Zucker-H
Anhang
58
Anhang 4: 1H NMR-Spektrum von Substanz TS 1 (2) Bereich von 0,5 ppm bis 4,0 ppm
H-6‘‘‘
H-6‘‘
Zucker-H
-OCH3
H-5‘‘
Anhang
59
Anhang 5: 1H NMR-Spektrum von Substanz TS 1 (2) Bereich von 4,0 ppm bis 7,5 ppm
H-5‘
H-3
H-8
H-1‘‘‘
H-1‘‘
H-2‘‘
H-2‘ H-6‘
Anhang
60
Anhang 6: 13C-NMR-Spektrum der Substanz TS 1
C-6‘‘
C-8a
C-4‘
C-3‘
C-6‘
C-5‘
C-2‘
C-1‘
C-6
C-4a C-3 C-1‘‘‘
C-8
Zucker-C
C-5‘‘‘
-OCH3
C-6‘‘‘
C-5
C-2 C-7
C-4
Anhang
61
HBMC
Anhang 7: HBMC-Spektrum der Substanz TS 1
Anhang 8: HSQC-Spektrum der Substanz TS 1
Anhang
62
Anhang 9: COSY-Spektrum der Substanz TS 1
Anhang 10: NOESY-Spektrum der Substanz TS 1
Anhang
63
Anhang 11: MS-Spektrum von Genistin im Positivionen-Modus
Anhang
64
Anhang 12: MS-Spektrum von SPE-5 E a im Negativionen-Modus
Anhang
65
Anhang 13: MS-Spektrum von SPE-5 E b im Negativionen-Modus
Anhang
66
Anhang 14: MS-Spektrum von SPE-5 E a im Positivionen-Modus
Anhang
67
Anhang 15: MS-Spektrum von SPE-5 E b im Positivionen-Modus
Anhang
68
Anhang 16: MS-Spektrum von Substanz TS 3 im Negativionen-Modus
Anhang
69
Anhang 17: MS-Spektrum von Substanz TS 3 im Negativionen-Modus
Anhang
70
Anhang 18: MS-Spektrum von Substanz TS 3 im Positivionen-Modus
Anhang
71
Anhang 19: MS-Spektrum von Substanz TS 3 im Positivionen-Modus
Top Related