This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

924 NOTIZEN

Zur Kenntnis des Molekulargewichtes von Peptidsynthetasen aus Leber und H efe

J. D imigen, F. K link und D . R ichter

Institut für physiologische Chemie und Physikochemie der Universität Kiel

(Z. Naturforschg. 20 b , 924— 925 [1965] ; eingegangen am 23. Ju li 1965)

Die polysomale Peptidsynthese wird durch minde­stens zwei verschiedene Enzyme katalysiert. Aus E. c o l i 1, R eticulocyten2, Leber 3-5 und Hefe 6 wurden bisher je ein sehr labiler und ein wesentlich weniger empfindlicher Transferfaktor angereichert. Bei Reti­culocyten2 und L eber7 scheint der labile Faktor die Anlagerung von tRNS 11 an Ribosomen zu beeinflussen, so daß man dem stabileren Enzym die unmittelbar Pep- tid-knüpfende Wirkung zuschreiben darf. Keiner dieser Faktoren wurde bisher soweit gereinigt, daß eine Be­stimmung physikochemischer Konstanten möglich war. Gelfiltration an Dextrangelen erlaubt jedoch bei vielen globulären Proteinen eine recht genaue Abschätzung der Molekulargröße auch ohne Reindarstellung 8>9. Wir wendeten diese Methode auf stark angereicherte Präparationen des stabileren Faktors (F I) aus Leber und Hefe an.

Protein Reinheitsgrad Bezugsquelle Mol.-Gew.

j’-Globulin Behring(Rind) trocken, reinst (Marburg) 160 000

Serumalbumin, Behringdimer (Rind) trocken, reinst (Marburg) 134 000

Creatinphospho- Boehringerkinase p. a. (Mannheim) 81 000

Serumalbumin Behring(Rind) trocken, reinst (Marburg) 67 000

Eieralbumin 5-mal krist., Servareinst (Heidelberg) 45 000

Rennin Krist. Nutr. Bioch. Corp., Cleveland, Ohio

34 500

Tab. 1. Standardproteine mit Mol.-Gew. (L iteraturw erte), die zur Eichung der Sephadexsäulen verwendet wurden.

Die Aktivitätsbestimmung von F I wurde durch In­kubation mit Polysomen aus Leber, 14C-Aminoacyl- tRNS, den notwendigen Cofaktoren und Ionen sowie einem Überschuß von F II durchgeführt (Einzelheiten s. Abb. 2 ).

Methoden

Zur Abtrennung des Enzyms von dem labileren Faktor (F II) und zur weiteren Anreicherung verwen­deten wir neben den früher beschriebenen chromato­graphischen Verfahren mit TEAE-Zellulose5 mehrere Ammoniumsulfat-Fraktionierungsschritte und Gelfiltra­tion an Sephadex G 25 und G 200 7.

100

90 Adenosin

^<J 0

c- 7 0 h Renninr - .. . / \ Ser-Albumin Eieralbumm/ \ / ,

F I (Leber)

yy-GlobulinCPK

Ser-Albumin'(dimer)

Abb. 1. Mit Standardproteinen gewonnene Eichkurve zur Bestimmung von Mol.-Gew. durch Gelfiltration an Sephadex G 200. Das durchbrochene Kästchen gibt den Bereich, in dem die für FI aus Ratten- und Kalbsleber in verschiedenen

Experimenten ermittelten W erte liegen.

Ribosomen\

3,4 3,6 3,6 4,0 4,2 4.4 4,6 4fi 5,0 5,2 5.4 5,6 5.8 log Molekulargewicht — ►

Abb. 2. Trennung von FI aus Rattenleber, CPK, y-Globulinund Adenosin an Sephadex G 200. Transparenz ---------- ;Transferenzymaktivität o ------ O. Das Testsystem 11 enthieltin l ml : 8 uMol M g(CH3COO)2; 100 ,uMol KCl; 5 0 //M ol Tris (pn 7,6) ; 30 ,«Mol MEA; 2 ,wMol A T P; 0,33 ^M ol G TP; 4/^M ol P E P ; 25 [xg PK ; 5,0 Ext. Einh. (260 nm )/ lc m Rattenleber-Polysomen; 50 [xg 14C-Aminoacyl—tRNS = 3000 Ipm /m in; 0,2 ml F II aus Hefe; 0,3 ml der bezeich- neten Eluatfraktionen. Aufarbeitung der m arkierten P ro­teine durch TCE-Fällung, Waschung mit heißer TCE, Alko­hol-Äther, Ä ther; Aktivitätsmessung im Methandurchfluß-

zähler.

1 J. E. A l le n d e , R. M onro u . F . L ip m a n , P r o c . n a t . A c a d . S e i. U S A 51, 1211 [1964].

2 R. A r l in g h a u s, J. S h a e f fe r u . R. S ch w eet , P r o c . n a t . A c a d . S e i. U S A 51, 1291 [1964].

3 J. M . F e s s e n d e n u . K. M o l d a v e , J. biol. Chemistry 238, 1479 [1963].

4 S . S l a p ik o f f , J. M . F e s s e n d e n u . K. M o l d a v e , J. biol.Chemistry 238, 3670 [1963].

5 F. K lin k , A . M. N o u r u . K . F. A ep in u s, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 72, 654 [1963].

8 F. K lin k u . D. R ic h te r , in Vorbereitung.7 G. K ramer, F. K link u. H. G. P etersen , in Vorbereitung.8 P . A n d re w s , Biochem. J. 9 1 , 222 [1964].9 F. A u r ic c h io u . C. B . B ru n i, Biochem. Z. 3 4 0 , 321 [1964].

10 J. B ish op u . R. S c h w e e t , Biochim. biophysica Acta [Am­sterdam] 4 9 , 235 [1961].

NOTIZEN 9 2 5

Gelfitration: Sephadex G 200 wurde 72 Stdn. in Puf­fer (0,05-m. Tris, 0,1-m.KCl, 0,008-m. Mg(CH3COO)2 , PH 7,6) gequollen. Die Säule (Vol. 90 ml; 550 -14 mm) wurde nach dem Gießen 48 Stdn. mit Puffer durch­strömt, das äußere Volumen mit Ribosomen oder D ex­tranblau, das innere mit Adenosin bestimmt, die Ex­tinktion des Eluates im Durchflußphotometer bei 254 nm gemessen und die Lage der Gipfel durch zu­sätzliche Messung bei 280 bzw. 260 nm präzisiert. Zur Kalibrierung der Säulen wurden reine Proteine mit be­kanntem Mol.-Gew. verwendet (s. Tab. 1 ). Bei loga- rithmischer A uftragung8 der Mol.-Gew. gegen das Elutionsvolumen (Abb. 1) ergab sich eine über weite Bereiche lineare Abhängigkeit.

Ergebnisse

Abb. 2 zeigt eine Auftrennung eines Gemisches von F I, Creatinphosphokinase (C PK ), y-Globulin und Ade­nosin an Sephadex G 200. Die Transfer-Enzymaktivität

wurde in einem einheitlichen Gipfel eluiert. Die aktiven Fraktionen hatten in Abwesenheit von F II keine Wir­kung im Testsystem. Die Elutionsvolumina für F I-Prä- parate aus Ratten- und Kalbsleber ergaben Mol.-Gew. zwischen 89 000 und 95 000. Bei Anwesenheit von 0,005-m. MEA 11 im Elutionsmedium zeigte sich keine Verschiebung des Aktivitätsgipfels. Ein Einfluß der für die Transferreaktion unentbehrlichen Sulfhydrylsub- stanzen10 auf die Molekulargröße (etwa durch Des­aggregation) ist somit nicht feststellbar. Die deutlich geringeren Werte — etwa 80 000 — die an F I aus Hefe gemessen wurden, bedürfen der Sicherung durch weitere Experimente.

Frl. I. L a n g e sind wir für sorgfältige technische M itarbeit, der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t für die Unterstützung dieser Arbeit zu Dank verpflichtet.

11 Abkürzungen: ATP = Adenosintriphosphat. G TP = Gua- nosintriphosphat. PE P = Phosphoenolpyruvat. PK = Pyru­vatkinase. tRNS = Transfer-Ribonucleinsäure. TCE = Trichloressigsäure. MEA = 2-Mercaptoaethylamin.

Zur Abhängigkeit der photosynthetischen NADP-Reduktion

von Plastocyanin

A. T rebst und E . E lstner

Pflanzenphysiologisches Institut der Universität Göttingen, Abt. Biochemie der Pflanzen

(Z. Naturforschg. 20 b, 925— 926 [1965]; eingegangen am 3. A ugust 1965)

Hinweise für eine Funktion des von K a t o h und T a- k a m iy a isolierten Plastocyanins 1 in der Photosynthese ergaben sich aus einer Reihe von Ergebnissen. Die photosynthetischen Reaktionen isolierter Chloroplasten wurden durch Cu-Komplexbildner, insbesondere Salicyl- aldoxim 2, gehemmt, die Cytochrom c-Photooxydation in Digitonin-fragmentierten, Plastocyanin-freien Chloro­plasten ist Plastocyanin-abhängig 3, die Absorption bei 600 mju (Absorptionsmaximum des Plastocyanins) ändert sich bei Belichtung der Algen unter verschiede­nen Bedingungen4 und reduziertes Plastocyanin wird durch das Pigmentsystem 1 der Photosynthese oxy­diert 5. Diese Versuche stimmten darin überein, daß

1 S. K a t o h , Nature [London] 1 8 6 , 533 [1960] ; S. K a t o h u. A. T a k a m iy a , N ature [London] 1 8 9 , 665 [1961] ; S . K a t o h , I. S u g a , I. S h ir a t o r i u. A. T a k a m iy a , Arch. Biochem. Biophysics 9 4 , 136 [1961].

2 A. T r e b s t , Z. Naturforschg. 1 8 b, 817 [1963]; A. T r e b s t , H. E c k u . S. W a g n e r , in : „Photosynthetic Mechanism of Green Plants“ , National Academy of Sciences — National Research Council, Washington 1963.

3 S. K a t o h u. A. T a k a m iy a , in: „Photosynthetic Mechanisms of Green P lants“, National Academy of Sciences — National Research Council, W ashington 1963; S. K a t o h

u. A. T a k a m iy a , Plant Cell Physiol. 4, 335 [1963].4 J. d e K o u c h k o v s k y u . D. C. F o r k , Proc. nat. Acad. Sei.

USA 52, 232 [1964] ; D. C. F o r k u . W. U r b a c h , Proc.nat. Acad. Sei. USA 53,1307 [1965].

Plastocyanin als „electron carrier“ zwischen den beiden Lichtreaktionen der Photosynthese einzuordnen ist.

W ir m öchten h ie r ü b e r eine einfache M ethode b e ­rich ten , die P lasto cy an in -A b h än g ig k e it d e r N A D P -R e­d u k tio n zu zeigen. S ie b a u t au f den V ersuchen von N iem an u nd V e n n e s la n d 6, K a t o h 3 u nd K ok 5 m it De- te rg en z-frag m en tie rten C h lo ro p lasten au f. Solche C h lo ro p la sten h ab en die F äh ig k e it zur 0 2-E ntw icklung v e rlo ren , können a b e r — im G egensatz zu u n b e h an d e l­ten C h lo ro p lasten — redu zierte s Cytochrom c p h o to ­o xyd ieren . W h a tle y 7 zeig te, d aß d iese C ytochrom c- O x y d a tio n frag m e n tie rte r C h lo ro p lasten auch zu r R e ­d u k tio n von N A D P verw endet w erden k an n , w enn F e rred o x in u n d F erred o x in -N A D P -R ed u k tase zugesetzt w erden . N iemann u n d V e n n es lan d 6 fan d en , d aß Ä thanol- F ä llu n g solcher f rag m e n tie rte r C h lo ro p lasten zu P a r t i ­k e ln fü h rt , d ie Cytochrom c e rs t nach Z u g ab e e ines F a k ­to rs au s dem Ü b ers tan d p h o to o x id ierten , den K a to h u n d T a k a f i y a 3 als P la s to cy an in iden tifiz ie rten . D ie A rb e ite n von K ok 5 zeigen deutlich , d aß d as P ig m en t­system 1 d e r P h o to syn these nach D e terg enz-B ehand lung in ta k t geb lieben ist u n d daß es P la s to cy an in u n d C yto­chrom f bei B elich tung oxydiert. W ir zeig ten kürzlich 8,

5 B. K o k , in: „Photosynthetic Mechanisms of Green Plants“ , National Academy of Sciences — National Research Council, Washington 1963; B. K o k , H . J . R u r a in s k i u . E. A. H a r m o n , Plant Physiol. 39, 513 [1964] ; B. K o k u . H . J . R u r a in s k i , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 94, 588 [1965].

6 R. H. N ie m a n u . B. V e n n e s l a n d , Plant Physiol. 34, 255 [1959]; R. H. N ie m a n , H. N a k a m u r a u . B. V e n n e s l a n d , Plant Physiol. 34, 262 [1959].

7 F. R. W h a t l e y , in: „Photosynthetic Mechanisms of Green P lan ts“ , National Academy of Sciences — National Research Council, Washington 1963.

8 A. T r e b s t u. E. P is t o r iu s , in: „Beiträge zur Biochemie und Physiologie von Naturstoffen“ , Festschrift zum 65. Ge­burtstag v. K . M o t h e s , VEB Fischer Verlag, Jena 1965.