Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
: 12016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
MessenMessen-- und Regeln in der Biotechnologieund Regeln in der BiotechnologieBioProzessTechnikBioProzessTechnik (Basics)(Basics)
002_001002_001
Westfälische Hochschule- Standort Recklinghausen-
Sommersemester 2016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik : 12016
: 22016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
: 32016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Biologie Chemie
BiotechnologieDefinition: moderne BiotechnologieDefinition: moderne Biotechnologie
: 42016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Biologie Chemie
BiotechnologieBiotechnologieDefinition: moderne BiotechnologieDefinition: moderne Biotechnologie
: 52016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Biologie Chemie
• Biochemie
• Molekularbiologie (Gentechnik)
Biotechnologie
Interdisziplinarität
BiotechnologieDefinition: moderne BiotechnologieDefinition: moderne Biotechnologie
: 62016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Ing.wiss.
Biologie Chemie
• Biochemie
• Molekularbiologie
• Chemische Technik
• Reaktionstechnik• Bioverfahrenstechnik (Fermentation)
Biotechnologie
BiotechnologieBiotechnologieDefinition: moderne BiotechnologieDefinition: moderne Biotechnologie
: 72016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Biologie
Medizin
Chemie
Ing.wiss.
• Pharmazie
• Toxikologie
• Galenik
• Drug Targeting
• Medizintechnik
(Implantologie, Prothektik)
• Bioverfahrenstechnik
Biotechnologie
• Biochemie
• Molekularbiologie
BiotechnologieBiotechnologieDefinition: moderne BiotechnologieDefinition: moderne Biotechnologie
: 82016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Biologie
Medizin
Chemie
Ing.wiss.
Biotechnologie
• Weiße Biotechnologie:Ersetzen chemischer Prozesse durch biotechnologische Verfahren (Ascorbinsäuresynthese, ...)
• Graue Biotechnologie:"Umweltbiotechnologie": Stabilisierung von Enzymen in Waschprozessen, Klärung von Abwässern, ...
• Grüne BiotechnologiePflanzen- und Nahrungsmittelbereich, Futtermittel, Biofarming (Grüne und Rote BT), Ertragssteigerung, ...
• Rote BiotechnologiePharmazeutische Anwendung, Neue Therapeutika und Diagnostika (Rekombinante Proteine, Tissue Engineering, Drug Targeting, ...), Implantologie, ...
• Blaue BiotechnologieMeeresbiotechnologie, Nutzung mariner Stoffe (Klebetechniken, "Muscheln-Lotus-Effekt", ...)
BiotechnologieBiotechnologieDefinition: moderne BiotechnologieDefinition: moderne Biotechnologie
BioProzessTechnik
: 92016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Mathematik
Biotech. Math.
• Bioinformatik
High Throughput Systems / Genom-, Proteomentschlüss elung / ...
Biologie
Medizin
Chemie
Ing.wiss.
BiotechnologieBiotechnologieDefinition: moderne BiotechnologieDefinition: moderne Biotechnologie
: 102016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Biotechnologie ist die Lehre von der auf
Basis von quantifizierenden Methoden
reproduzierbar gemachten Durchführung
von Bioprozessen in industriellen
Produktionsverfahren technischen
Maßstabes.
EinfEinf üührung in die Biotechnologiehrung in die Biotechnologie
: 112016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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In einer modernen Definition erklärte die OECD
(Organization for Economic Cooperation and
Development) Biotechnologie als die Anwendung
von Naturwissenschaft und Technologie an
lebenden Organismen, deren Teilen sowie
Produkten und Modellen von ihnen.
In einer modernen Definition erklärte die OECD
(Organization for Economic Cooperation and
Development) Biotechnologie als die Anwendung
von Naturwissenschaft und Technologie an
lebenden Organismen, deren Teilen sowie
Produkten und Modellen von ihnen.
Biotechnologie Biotechnologie -- BegriffsbestimmungBegriffsbestimmung
: 122016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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einfachere, umweltfreundlichere und sauberere Produktionsverfahren zu etablieren,
die Abhängigkeit von fossilen Rohstoffen zu reduzier en,
die Investitionskosten zu verringern,
die Energie-und Entsorgungskosten zu reduzieren,
neue Produkte und Systemlösungen mit hohem Wertschöpfungspotenzial zu entwickeln,
die Wettbewerbsfähigkeit zahlreicher Industriezweige zu verbessern.
Beitrag der WeiBeitrag der Wei ßßen Biotechnologieen Biotechnologie
: 132016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Molekulare BiotechnologieEngineering von
Biosystemen
Zell-EngineeringStoffwechsel-Engineering
Protein-Engineering
BioprozesstechnikEngineering von
Produktionsverfahren
ProzessentwicklungReaktionstechnik
Aufarbeitungstechnik
BIOTECHNOLOGIE
integrierte Vernetzung
: 142016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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� Biotechnologische Prozesse– Substrate und deren Aufbereitung– Bioreaktoren
Aufbau, Design und BetriebKinetik
– Aufarbeitung
� Prozessbeispiele� Enzymtechnologie
– Produktion– Enzymatische Prozesse
EinfEinf üührung in die Biotechnologiehrung in die Biotechnologie
: 152016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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� Gärungen (Bier und Wein; Sauermilchprodukte und Käse; Wurstherstellung; Essig; fermentierte asiatische Produkte; Kaffee, Tee und Kakao)
� Enzyme (überlegen Sie welche)
Stärke und Milch
� Traditionelle Mikroorganismen in der Biotechnologie (überlegen Sie welche das sind und deren Klassifikation)
HefenSchimmelpilze (Pinsel- und Gießkannenschimmel)
Bakterien (Milchsäure, Buttersäure, Propionsäure, Aceton-Butanol, ...)
� Forscher (A. van Leeuwenhoek 1632-1723; L. Pasteur 1822-1895; E.
Buchner 1860-1917)
Renneberg, R. 2006. Biotechnologie für Einsteiger, Elsevier
Biotechnologie (traditionell)Biotechnologie (traditionell)
: 162016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Medizin
MarineOrganismen
Pflanzen
Industrielle Biotechno-logie
IBB
Grund- und Feinchemikalien, Wirkstoffe, Polymere, .. .
Biotechnologie heuteBiotechnologie heute
: 172016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Mikrotechnologien mithohem Durchsatz.Chemie/Biologie im Vordergrund (z.B. Enzym-entwicklung) Prozesse im Labor-
maßstab.Wechselwirkung von bio-chemischen Komponentenund Prozesstechnik (z.B. Enzym im Rührreaktor)
Prozess im Pilot oder Industriemaßstab.Prozesstechnik im Vordergrund (z.B. Dimensio-nierung des Enzymreaktors)
IBB
Industrielle Biotechnologie (IBB)Industrielle Biotechnologie (IBB)
: 182016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Abbildung: Schematische Darstellung der Arbeitsschritte in der Bioprozessentwicklung, vom Gen zum Produkt
„„ fromfrom genegene to to productproduct ““
: 192016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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� Stufen der Prozessentwicklung� Identifizierung eines neuen Produktkandidaten
� Entscheidung die Prozessentwicklung zu beginnen
� Parallele Entwicklung - Anlagentechnik und Maßstabsvergrösserungsowie physiologische Tests, klinische Studien, Toxizitätsüberprüfung, usw.
� In Phase III von klinischen Tests wird bereits Material aus der Produktionsanlage verwendet (Center for Biological Evaluation and Research, FDA).
� Vorteile einer effizienten Prozessentwicklung� In allen Einzelheiten reproduzierbare Herstellung eines biologischen
Produktes von invarianter Qualität und Charakteristik
� Reduktion der Anlagenkosten (durch z.B. Minimierung der Grösse des Bioreaktors) als wesentlichem Teil der gesamten Prozesskosten
� Reduktion der Zeitspanne zwischen Beginn der Prozessentwicklung und Markteinführung des Produktes.
BioProzessEntwicklungBioProzessEntwicklung
: 202016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Abbildung: Parallele Prozessentwicklung ist ein entscheidendes Kriterium für die Implementierung von biotechnologischen Verfahren in der Industrie. Dies gilt vor allem für neue Produkte mit medizinischer Anwendung, bei denen die Markteinführung mehrere Jahre benötigt. Die prinzipielle Brauchbarkeit des Verfahrens muss in den ersten 6 bis 12 Monaten bewiesen werden.
BioProzessEntwicklungBioProzessEntwicklung
: 212016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Grobes Ablaufschema eines biotechnologischen Prozesses.
Die völlig biospezifische Komponente ist die Bioreaktion(“Fermentation”).
Substrataufbereitung, Sterilisation, und Aufarbeitung erfordern teilweise spezielle Techniken, die für Biosysteme entwickelt und optimiert wurden.
Aufschluss von mikrobiellenZellen zur Enzymgewinnung ist ein Beispiel.
BioTechBioTech --ProzessProzess
: 222016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Abbildung: Optimierung eines industriellen Prozesses anhand identifizierter kostenbestimmender Faktoren
BioTechBioTech --ProzessProzess -- OptimierungOptimierung
: 232016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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� Reduktion der Substratkosten– Reinchemikalien für Massenprodukte zu teuer– ausgehend von erneuerbaren Rohstoffen– Kohlenhydrate (Zellulose, Stärke, Saccharose)– Proteine (aus Fisch, Sojabohnen)
� Eliminierung von Inhibitoren– Schwermetalle (Mn2+; Zitronensäure)– Azetat (Hefefermentation)
� Anforderungen für klinische Produkte– Viren– Proteine
Substrataufbereitung Substrataufbereitung -- UpstreamUpstream processingprocessing
: 242016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Viele “klassische” Produkte der Biotechnologie werden im Multihunderttonnen Maßstab jährlich hergestellt, haben aber einen Preis von unter 1 Euro pro Kilogramm.
Der Optimierung jedes einzelnen Prozess-schritteskommt daher Bedeutung zu.
Die Substratwahl ist davon eine wesentliche Komponente.
BioTechnologieBioTechnologie (Felder)(Felder)
: 252016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Stärke• Lineares und verzweigtes Homopolysaccharid, aufgebaut aus einer Hauptkette mit α1,4-glykosidisch verknüpften Glukoseeinheiten • Verzweigungen in α1,6-Positionen• Polymerisationsgrad und Verzweigungsgrad abhängig vom Rohstoff• Depolymerisation (Hydrolyse) für mikrobielle Verwertung nötig• Säurehydrolyse führt zu Nebenprodukten
•Lignocellulose•Saccharose
Prozessbeispiel (StProzessbeispiel (St äärke)rke)
: 262016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Der Abbau von Stärke ist das Beispiel für den Einsatz von Enzymen im großtechnischen Maßstab und wird unter anderem für das Upstream Processingeines natürlichen Rohstoffs verwendet.• Die Verflüssigung von Stärke findet mit extrem thermostabilen Enzymen (α−Amylasen) bei etwa 80°C statt. Die Hauptkette wird gespalten und kürzere, besser lösliche Einheiten enstehen.• DE entspricht der Anzahl an reduzierenden Enden, gewichtet an 100% Glukose.• Weitere Enzyme spalten mit unterschiedlichen Spezifitäten (α1,6; α1,4 - Maltose oder Glukose-spaltend; Glukoseisomerisierung; Dextrinsyn-these).
Prozessbeispiel (StProzessbeispiel (St äärke)rke)
: 272016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Abbildung : Einige Enzyme, die zur vollständigen Hydrolyse von Stärke (Amylopektin) benötigt werden. Die Quelle für diese und andere Amylasen sind Bakterien und Pilze.
Prozessbeispiel (StProzessbeispiel (St äärke)rke)
: 282016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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� Selektivität (Chemo, Regio, Stereo)
� günstiger pH (2 - 12) und T-Bereich (10 - 110 °C)
� keine oder wenig Nebenprodukte
� nicht toxisch und leicht abbaubar
� durch Immobilisierung wiederverwendbar
� Herstellung in unlimitierenden Mengen durch mikrobielleProduktion möglich
� Feinabstimmung der Eigenschaften möglich
� geringe(re) Stabilität und Bedarf an Kofaktoren (Metalle)
� manchmal teuer (vor allem wegen Aufarbeitung)
Beispiel : Isomerisierung der D-Glukose in D-Fruktose
VorVor -- und Nachteile des Enzymeinsatzesund Nachteile des Enzymeinsatzes
: 292016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
� Kostenreduktion� Erhöhung der Ausbeute und verbesserte
Rohstoffnutzung� Verminderung der Kosten für die Aufarbeitung (z.B.
Filtration in der Herstellung von Fruchtsäften)
� Qualitätsverbesserung� Veränderte technische Eigenschaften von Proteinen und
Fetten; verbesserter Geschmack von Käse
� Verminderte Umweltbelastung� Lösungsmittelbedarf in der Penicillinherstellung� Molkeverwertung (Laktoseabbau)
Wirtschaftliche Gesichtspunkte des EnzymeinsatzesWirtschaftliche Gesichtspunkte des Enzymeinsatzes
: 302016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Abbildung : Enzymatischer Prozess zur Herstellung von Fruktose-reichem Sirup (42 % D-Fruktose), welcher hauptsächlich zur Süßung von Getränken eingesetzt wird.
Im Gegensatz zur
Stärkeverzuckerung, die in
Rührtankreaktoren mit löslichen
Enzymen durchgeführt wird, erfolgt die Glukoseisomerisierung in
Reaktoren mit gebundenem
(immobilisiertem) Enzym
(Festbettreaktoren ).Die Bindung der Glukose-
Isomerase, als freies Enzym oder
innerhalb mikrobieller Zellen, erfolgt über adsorptive Kräfte an
Ionentauscher oder Silika mit oder
ohne Quervernetzung.
ImmobilisierteImmobilisierte EnzymeEnzyme
: 312016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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� Rührkesselreaktor (10 mL bis 100 m3 Arbeitsvolumen)� Reaktorgeometrie (H/D ≈ 1 - 3)� andere Designs: Säulenreaktoren ohne mechanisches
Rührwerk (H/D > 3)� Rührergeometrie (d/D ≈ 0.3 bis 0.5)
� Rührerbauweise und Leistungseintrag des Rühres (Pg ≈ d5) hängen stark voneinander ab.
� Turbulenz (Reynolds Zahl; Re = Nid2ρ/µ, laminar für Rei < 10; turbulent für Re > 104) hängt vom Leistungseintrag ab. Erhöhte Turbulenz verbessert das Mischverhalten im Bioreaktor.Rührerdrehzahl Ni [1/s]; Rührerdurchmesser d [m]; Fluiddichte ρ [kg/m3]; Fluidviskosität µ [kg/(m s)]
BioreaktorBioreaktor
: 322016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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ReaktorfahrweisenDas diskontinuierliche Verfahren (Batch-oderChargenverfahren), bei dem der Reaktionsraum zu Beginn mit dem gesamten Ausgangsmaterial und den Mikroorganismen gefüllt wird. Der Tank wird nach Beendigung der Reaktion geleert und das Produkt gereinigt.
Das kontinuierliche Verfahren , bei dem dem Reaktor ständig die Ausgangsstoffe zugeführt und ein Reaktionsgemisch entnommen werden. Ein Fließgleichgewicht zwischen Durchflussrate und Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen muss sich dabei einstellen.
Es gibt auch die semi-kontinuierliche Produktion , bei der in bestimmten Intervallen Fermentationsbrühe aus dem Reaktionsraum abgezogen und durch neues Medium ersetzt wird oder lediglich neues Medium zugegeben wird.
Bioreaktoren und ProzessBioreaktoren und Prozess --DesignDesign
: 332016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Schematischer Aufbau eines Rührkesselbioreaktors
• Tank aus rostfreiem Stahl• 1 oder mehrere Rührer montiert am Rührerschaft• Montage des Rührers erfolgt von unten oder oben (Dichtung und Sterilität !!)• Leistungseintrag direkt von der Anzahl der Rührer abhängig.• Sterile Belüftungsvorrichtung (Zu- und Abluft)• Temperaturkontrolle und Kühlungsvorrichtung (Leistungseintrag; mikrobielles Wachstum)• Sterile Inokulierung sowie Probenahme• Mess- und Regeltechnik
Der BioreaktorDer Bioreaktor
: 342016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
The power input (Pg) in an aerated stirred vessel influences:
• the oxygen transfer rate by affecting the transfer coefficient kLa, and
• the quality of mixing, avoiding dead zones (where mixing is poor) and local
concentration gradients.
It is dependent on:
• stirrer speed Ni (to the power of 3)
• stirrer diameter d (to the power of 5)
• the fluid density ρ, and
• the power number of the stirrer (which in turn depends on fluid turbu-lence
given by the Reynold’s number).
The value of kLa is influenced further by the (superficial; volumetric) gas flow rate
(Fg) and the medium viscosity (τ).
Der Bioreaktor Der Bioreaktor –– StoffStoff üübergang*bergang*
*Chemical, Engineering, DynamicsHeinzle, Prenosil
: 352016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Abbildung : Schematischer Darstellung einiger Rührertypen. Die Auswahl stellt immer einen Kompromiss zwischen Leistungseintrag (hoch), Aufbringen von Scherkräften (niedrig) sowie Kompatibilität mit viskosen Medien dar. Der Blattrührer(Rushton impeller) ist am breitesten einsetzbar. Biotechnologische Medien sind teilweise hoch viskos, einerseits auf Grund der gebildeten Biomasse oder wegen polymerer extrazellulärer Produkte.
RRüührerhrer
: 362016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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RRüührerhrer
Abbildung: Darstellung der Bauweise (a) und des Strömungsverhaltens (b) in Reaktoren mit axialem (links) und radialem (rechts) Rührer.
Abbildung: Strombrecher im Reaktor sorgen für erhöhte Turbulenz und damit verbesserte Mischung des Reaktorvolumens.
: 372016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Abbildung . Zusammenstellung weiterer gebräuchlicher Rührertypen, klassifiziert nach „axial“ und „radial“ sowie dem Einsatzbereich in Bezug auf die Zähigkeit der zu mischenden Flüssigkeit. η, Viskosität in Pa s.
Weitere Weitere RRüührertypenhrertypen
: 382016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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� Scherrate im gerührten Tank (“Integrated Shear Factor” ISF)� ISF = 2 π N d / (D - d) wobei N die Drehzahl des Rührers ist, d ist der Rührerdurchmesser
und D ist der Durchmesser des Reaktors
� Labordaten zeigen, dass z.B. tierische Zellen bei ISF Werten über 20 s-1
kaum mehr wachsen. � Hohe Scherraten können für die Grenzflächen Flüssig-Fest erwartet werden.
Es ist daher manchmal nötig, dass zwischen mittlerer Scherrate und maximaler Scherrate unterschieden wird.
� In Blasensäulen wird die Scherrate durch die Geschwindigkeit (ms-1) der Gasblasen determiniert. Weiter Schereffekte werden durch Koaleszenzerzeugt.
� Inaktivierung von Zellen und pilzlichen Mycelen (siehe Abb.) durch Scherkräfte fließt in das Design des Bioreaktors mit ein.
Abbildung : Das Wachstum von filamentösen Organis-men unterscheidet sich stark vom Wachstum von Bakterien oder Hefen. Sie zeigen apikale Verlängerung und Verzweigung der Hyphen, gefolgt von Pelletbildung. Prozessfaktoren beeinflussen dieses Wachstum und auch die Produktbildung.
ScherkrScherkr ääftefte
: 392016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Abbildung: Schematische Darstellungen eines Blasensäulereaktors (linkes Bild) und der Durchmischung in diesem Reaktor unter heterogenen Flussbedingungen (siehe nächste Seite).
BlasensäuleZylindrischer Aufbau, Verhältnis von Höhe zu Breite etwa 3 bis 6
Es gibt keine mechanische Durchmischung - die Mischung erfolgt über die mit den Gasblasen aufsteigende FlüssigkeitBegasung über Vorrichtung am Boden (Sinterplatte, Düse, o.ä.)Vorteile sind die relativ geringen Anlagenkosten, das Fehlen beweglicher Teile, und die geringe Schaumbildung
Weitere ReaktortypenWeitere Reaktortypen
: 402016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Weitere Reaktortypen (Weitere Reaktortypen ( AirliftAirlift ))
Abbildung: Typische Konfigurationen von Airliftreaktoren . Die Separation in Steig-und Fallrohr verbessert die Mischeigenschaften im Vergleich zur Blasensäule.
: 412016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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� Mischungseffizienz und Massentransport sind in allen drei Typen (STR, Blasensäule, Airlift) im Industriemaßstab ähnlich. Der maximale Massentransport ist im STR am höchsten, weil der Leistungseintrag über den Rührer am stärksten ist.
� Im Falle der BS und des AL bricht der Massentransport bei Viskositäten über 0.1 N s m-2 zusammen.
� Mechanischer Probleme können im STR im Zusammenhang mit dem Rührermotor auftreten.
� Daher gilt als Faustregel:� BS und AL sind für Bioreaktionen mit myzelbildenden Pilzen und in der Herstellung
von mikrobiellen Polysacchariden ungeeignet.� Flexibilität hinsichtlich Viskosität und Massentransport wird vor allem durch den STR
geliefert.� Bioreaktionen in viskose Medien werden nicht im Maßstab > 500 m3 betrieben.� Die BS ist der billigste Reaktor und wird für Reaktionen im Bereich niedriger
Viskositäten und in Volumina von 50 bis 500 m3 verwendet. Für Volumina von 200 bis 10 000 m3 wird der AL eingesetzt, vor allem weil die Möglichkeit lokaler Zugabe von Substrat besteht. Der STR ist in diesem Maßstab ungeeignet, da die Rührerleistung bis zu 1 MeW ansteigen kann.
Vergleiche Vergleiche -- ReaktortypenReaktortypen
: 422016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
� Dichtungen für den Rührerschaft(mit Sattdampf sterilisierbare Gleitringdichtungen)
� Filtration (adsorptive Tiefenfilter; Absolutfilter mit molekulare Ausschlussgröße; 0.1 µm)
� Sterile Zudosierung und Probennahme
� Sterilisation des Bioreaktors� Sattdampf statt trockener Hitze� Abtötungseffekt als Funktion der
Inkubationszeit und der Temperatur
Steriltechnik und SterilisationSteriltechnik und Sterilisation
: 432016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
� Aufheizen des flüssigen Mediums auf Sterilisationstemperatur (etwa 120°C)
� Direkte Injektion von Sattdampf ins Medium� Verdünnung (10-20%)� Qualität des Dampfes (Kontamination durch Metallionen oder
organische Substanzen)
� Indirekter Wärmetransfer über Kühlsystem des Reaktors
� Sterilisation erfolgt in drei Phasen, die in einem Temperatur-Zeit-Profil dargestellt werden: Aufheizen, Haltezeit (thd) bei 120 °C, Abkühlen.
� Die Sterilisationführt zur Reduktion der Anzahl der lebenden Zellen vor der Inaktivierung (N0).
� Unter der Annahme, dass die Zellen nur während thd inaktiviert werden, ergibt sich die Frage, wie lange thd sein soll.
Sterilisation mit SattdampfSterilisation mit Sattdampf
: 442016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Abbildung : Verschiedene konstruktionstechnische Lösungen, um Wärmetransfer in Bioreaktoren effektiv zu bewerkstelligen. Links: Ummantelung; Mitte: Kühlschlangen; Rechts: Kühlschlangen, die auch als Prellwände fungieren.
BeheizungBeheizung
: 452016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Abbildung : Zeit-Temperatur-Profil für eine typische Dampfsterilisation (a) und Abtötung der lebenden Zellen im Bioreaktor als Funktion der Zeit (b).
Die Inaktivierung der Zellen kann häufig als Reaktion 1.Ordnung beschrieben werden. Das heißt, die Abnahme von N über die Zeit erfolgt exponenziell.In der thd gilt:• ln (N1/N2) = kd thd
kd ist eine Inaktivierungskonstante (h-1), die Organismen spezifisch ist und von der Temperatur abhängt.•kd = A exp (-Ed/RT)wobei A ein Arrhenius Faktor, Ed die Aktivierungsenergie für den Zelltod, R die Gaskonstante und T die Temperatur in K ist.• thd = ln (N1/N2) / kd N1 ≥ 103; N2 ≤ 10-3
Sterilisation (Profile/Kinetik)Sterilisation (Profile/Kinetik)
: 462016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
� Vermeidung von Nebenreaktion (z.B. “Bräunung”) (Abb. 5.8)
� Kenntnis der Kinetik der Inaktivierung von hitzeresistenten Organismen bzw. Sporen (z.B. Bacillus sp.).
� In Suspensionen, wenn z.B. das Substrat unlöslich ist, hängt Wärmetransfer stark von der Partikelgröße ab.
� N ist direkt vom Maßstab abhängig. Sterilisation von größeren Reaktoren schwieriger (thd länger; Energiekosten bedeutend).
Sterilisation (Kinetik)Sterilisation (Kinetik)
: 472016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Abbildung : Charakterisierung des mikrobiellenWachstums anhand einer Darstellung des Zeitverlaufs (oben) sowie der spezifischen Wachstumsraten in den einzelnen Phasen (unten).
Wie lässt sich das mikrobielle Wachstum und damit verbunden, Substratverbrauch und Produktbildung formalkinetisch beschreiben?
Was sind typische Werte für die maximale Wachstumsrate von Hefen und Bakterien?
BioprozesskinetikBioprozesskinetik
: 482016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Biomasse YXS = g Zellen produziert / g Substrat verbraucht
Produkt YPS = g Produkt hergestellt / g Substrat verbraucht
Elektronenbilanzen dienen zur Berechnung der theoretischen Ausbeuten wie• Sauerstoffbedarf oder• maximale BiomasseausbeuteAusgegangen wird von den vorhandenen Elektronen (4 in C, 1 in H, −2 in O etc.) sowie dem Reduktionsgrad der beteiligten Reaktanden (Summe aller Elektronen / Anzahl der C Atome).Thermodynamisch maximale YXS Werte:n-Hexan (2,6); Glucose (0,8); Essigsäure (0,8); Oxalsäure (0,1)
ErtragskoeffizientenErtragskoeffizienten
: 492016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Voraussetzungen für experimentelle Studien zur Kine tik als physiologischer Eigenschaft von Mikroorganismen• Identifizierung relevanter Zustandsvariablen aus den Kulturparametern
• Vereinfachung
• Eliminierung von physikalischen Effekten (Massentransport)
Abbildung : Wechselwirkungen und mögliche Beeinflussungen zwischen dem biotechnologischen Produktionsystem(Zellpopulation) und der prozesstechnischen Umgebung (Medium, Bioreaktor). Eine typische Frage betrifft die Konzentration des limitierenden Substrates (C-Quelle, O2, etc.)
Physiologische Eigenschaften (MO)Physiologische Eigenschaften (MO)Physiologische Eigenschaften (MO)Physiologische Eigenschaften (MO)
: 502016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
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Abbildung : Darstellung von drei Rührtankbioreaktoren zur Erklärung der Begriffe „Transportlimitierung“ und „Pseudohomogenität“.
a) Fall einer homogenen Lösung ohne Grenzflächen (z.B. flüssig/fest oder gasförmig/flüssig); Stofftransport (rTR) erfolgt in der Regel durch molekulare Diffusion und ist
zumeist viel schneller als chemische Reaktionen (rRk). Zur Ermittlung kinetischer Gesetzmäßigkeiten muss gelten, dass rRk ≤ 0,1 rTR. Ein mögliches Beispiel wären
Transformationen mit löslichen Enzymen. b) Pseudohomogener Fall, in dem zwar reale Grenzflächen
vorliegen (OTR, Sauerstofftransport von der Gas- in die
Flüssigphase; Versorgung von suspendierten mikrobiellenFlocken mit Substrat), jedoch das Kriterium rRk ≤ 0,1 rTR
nach wie vor erfüllt wird.
c) Fall eines heterogenen Systems, wobei rRk ≥ 0,1 rTR.
Eliminierung von MassentransporteffektenEliminierung von Massentransporteffekten
: 512016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Mischen von RMischen von R üührkesselnhrkesseln
Abbildung: Eliminierung von Massentransporteffekten (2) - Misch zeitkonzept für Rührkesselrektoren.Experiment zur Charakterisierung des Mischverhaltens in einem Bioreaktor. Ein Marker (Salzlösung, Farbstoff, ...) wird in den Reaktor injiziert und die Misschung über Leitfähigkeit oder spektrophotometrische Detektion on-line mit einer Elektrode gemessen. Das Bild zeigt einen typischen Verlauf, aus dem die Zirkulationszeit (tc) und die Mischzeit (tm) ermittelt werden. tm wird durch die definierte Mischgüte (z.B. 90% wie im Bild) festgelegt. tcist eine Funktion des Macromixing und wird durch stärkeres Rühren erniedrigt. Beachten Sie: tm ≤ 0,1 tRk. Ein idealer Rührkessel ist vollständig (Mischgüte: 100%) und un endlich schnell vermischt.
: 522016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Biologisches Wachstum in einer autokatalytischen Reaktion
rX = dx/dt = µ x
mit x der Konzentration an Zellen (g/L), X der Masse an Zellen (g), rX der Wachstumsgeschwindigkeit (g/(L h)) sowie einem Proportionalitätsfaktor µ (1/h), der als spezifische Wachstumsrate bezeichnet wird.
µ = rX/x
Für die Situation von nur einem limitierenden Substrat formulierte Monod:
µ = µmax s/(Ks + s)
mit µmax der maximalen spezifische Wachstumsrate (1/h), s der Substratkonzen-tration (g/L) sowie Ks der Sättigungskonstante für s.
Den Ertragskoeffizienten YXS kann man formulieren als:
YXS = rX/rS (oder vereinfacht: = ∆x/∆s)
Typische Werte für µmax sind mit Glucose als C-Quelle (Saccharomyces: 0.47 1/h; E. coli: 2 1/h); für Ks von Glucose (Saccharomyces: 25 mg/L; E. coli: 4 mg/L; Aspergillus: 5 mg/L) und O2 (etwa 0,05 mg/L)
Grundbegriffe der Grundbegriffe der MonodMonod KinetikKinetik
: 532016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Abbildung : Vergleich von zwei Monod-Kinetiken mit unterschiedlichem Ks Wert (relativ niedrig: oben; relativ hoch: unten).
Bezüglich der Substratkonzentration s wird unter sättigenden Bedingungen (s ≈ 10 Ks) eine Reaktion nullter Ordnung erreicht.
rx = dx/dt = (µ maxx) s0 wobei: s0 = 1
Liegt s deutlich unter Ks, werden Bedingungen einer Reaktion erster Ordnung erreicht.
rx = dx/dt = (µ maxx/Ks) s1 wobei: s1 = s
Überlegungen zum Satzverfahren (Batch)• Reaktor wird befüllt und inokuliert. Danach ändern sich mit fortschreitendem Wachstum die Konzentrationen (Ci) aller Nährstoffe, der Zellen und der Produkte mit der Zeit.• Aus der Massenilanz: ∆(VCi)/∆t ≈ d(VCi)/dt = V ri
BatchBatch --VerfahrenVerfahren
: 542016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Überlegungen zum Satzverfahren (Batch) (2)
• Aus der Konzentrationsbilanz: ∆Ci/∆t ≈ dCi/dt = ri
• Unter Verwendung der Monod-Kinetik:
Biomasse : rX = dx/dt = µ x = µ max x s/(Ks + s)
Substrat : rs = ds/dt = q s x = − (µ/YXS) x = - x [µ max s/(Ks + s)]/YXS
• Oft gilt, da Ks einen kleinen Wert hat, dass s/(Ks + s) ≈ 1.
• Das heißt in weiterer Folge: rX = dx/dt ≈ µmax x.
• Nach Variablenseparation und Integration erhält man:
ln(x) - ln(x0) = ln (x/x0) = µmax (t - t0), oder
x = x0 e µmax (t - t0)
mit t der Zeit und dem Index 0 für t = 0.
• Wachstum (und Substratverbrauch) erfolgen exponenziell. Wenn s ≈ Ks stimmt die Näherung von s/(Ks + s) ≈ 1 nicht mehr. Es folgt ein Übergang von exponenziellerPhase in eine Verzögerungsphase.
• Minimale Verdopplungszeit td: 2 x0 = x0 e µmax (td - 0) woraus folgt: td = ln(2)/µmax
• Minimale Dauer des Batches tB = [ln(x0 + ∆x) - ln(x0)]/µmax
BatchBatch --VerfahrenVerfahren
: 552016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Überlegungen zum Satzverfahren (Batch) (3)
• Minimale Dauer des Batches tB = [ln(x0 + ∆x) - ln(x0)]/µmax
• Mit der Annahme, dass x0 sehr viel kleiner als x ist, und mit ∆x = s0YXS erhält man:
tB = [ln(s0YXS) - ln(x0)]/µmax
• Sauerstoff kann als limitierendes Substrat auftrete n
Sauerstoff ist in wässrigen Medien nur
schlecht löslich. Wie kann der
Mikroorganismus totzdem ausreichend
mit Sauerstoff versorgt werden, um das
Wachstum optimal zu unterstützen?
Begasung mit Luft oder reinem
Sauerstoff ist nötig.
YXO2 = rX / rO2
BatchBatch --VerfahrenVerfahren
: 562016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
� Sauerstofftransportrate OTR = kLa (O2* - O2) kL ist der Massentransportkoeffizient der Flüssigphase (ms-1); a ist die Gas-Flüssig
Austauschfläche pro Volumseinheit (m2 m-3); O2* ist die
Gleichgewichtskonzentration von Sauerstoff, und O2 ist die aktuelle Konzentration.
� OTR kann verbessert werden durch:
� Erhöhung von O2* (Reinsauerstoff statt Luft; Druckerhöhung)
� Erhöhung des kLa Wertes (Bioreaktortechnologie; 0.02 - 0.2 s-1)
� Größe und Verweilzeit der Gasblasen (Art der Begasungseinheit; Rührer
und Rührspitzengeschwindigkeit)
� Leistungseintrag (Art und Geometrie des Rührers; Rührerdrehzahl bzw.
Rührspitzengeschwindigkeit)
� Turbulenz (Rührer; Strombrecher)
� Begasungsrate
StoffStoff üübergangbergang
: 572016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Wechselwirkung zwischen biologischen und prozesstec hnischen Wechselwirkung zwischen biologischen und prozesstec hnischen Faktoren Faktoren
Einflussfaktoren• des Mediums
pH, T, mehr als 1 limitierendes Substrat, chemische Reaktionen, rheologische Eigen-schaften, Grenzflächen, Inhomogenitäten)
• der ZellenOperative Rahmenbe-dingungen für den Betrieb eines Bioreak-tors
ProzessfensterProzessfenster
: 582016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Abbildung: Messparameter in Bioreaktoren. Kontrolliert werden zumeist physikalische und chemische Parameter. Biologische Parameter wie die Biomassekonzentration lassen sich im Regelfall nur indirekt kontrollieren, wofür eine quantitative Korrelation zwischen physikalischen / chemischen Parametern und der biologischen Größe hergestellt werden muss. Es kann sich dabei um ein mathematisches Modell handeln (z.B. Monod Kinetik) oder empirische Korrelationen.
MessMess -- und Regeltechnik in Bioreaktorenund Regeltechnik in Bioreaktoren
: 592016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
� Sedimentation, Flockulierung, Flotation oder Zentrifugation von Zellen (Abb. A1)
� Filtration von Zellen oder Enzymen (Abb. A2)
� Mechanischer Zellaufschluss (Abb. A3)
� Weitere Reinigungsverfahren (bis zu 90% der Produktionskosten)� hochentwickelte Methoden auf Basis von biologischer
Affinität verfügbar� Kosten meist prohibitiv (klassische Chromatographie)
� Kontinuierliche Aufarbeitung im Prozessmaßstab
AufarbeitungAufarbeitung
: 602016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Abbildung : Darstellung von 3 technologisch genutzten Typen von Zentrifugen. Ein künstlich verstärktes Schwerefeld (≥ 5000 x g) ist bei vielen Zellen nötig, um brauchbare Absetzgeschwindigkeiten (im Vergleich zur Sedimentation) zu erzielen. Im Idealfall wird ein pastöses Produkt erzeugt. Wesentlich ist neben der Dichte der Zellen, deren Radius (bei Annahme von Kugelform).
Zentrifugenbauarten• Röhren (links)• Teller (mitte)• Mehrkammer (rechts)
ZentrifugenZentrifugen
: 612016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
� Flockulation� Bildung von Zellaggregaten durch Zusatz von
Flockulationsmitteln (geladene Polymere wie Polyethylenimin oder Acrylamid / Acrylat, mehrwertige Kationen, quarternäre Ammoniumverbindungen, ...)
� Neutralisation der negativ geladenen Gruppen an der Zelloberfläche von Mikroorganismen
� Gute Sedimentation der Flocken ist wichtig
� Flotation� Anhaftung der Zellen an Gasblasen� Zugabe von Oberflächen aktiven Substanzen
(“Schäumer”) wie kurzkettige Polyethylenglykole oder langkettige Alkohole
FlockulationFlockulation / / FlotationFlotation
: 622016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
� Abtrennung von festen Teilchen mit einem Filterhilfsmittel� Kuchen- oder Oberflächenfiltration� Sieb- oder Membranfiltration (Größenausschluss)� Tiefen- oder Bettfiltration (adsorptive Wechselwirkungen)
Oberflächenfiltration• Träger, der von Filtertuch bedeckt ist• Während der Filtration bildet sich der Filterkuchen allmählich, und der Flusswiderstand steigt damit stetig.• Bleibt der angelegte Druck konstant, sinkt die Durchflussrate.• Zellen stellen einen kompressiblen Filterkuchen dar, und es muss ein Kompromiss zwischen Durchlässigkeit (geringer Druck) und Kuchenentwässerung gefunden werden (hoher Druck).
FiltrationFiltration
: 632016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
� Chemische Methoden (Alkalibehandlung; Detergenzien wie SDS oder Cetyl (C16) Trimethylammoniumbromid; Enzyme wie Lysozym; Lyse durch Phagen oder Antibiotika wie Penicillin oder CephalosporinC)
� Osmotischer Schock (Einfrieren, Auftauen) und Trocknung (Gefrier-, Sprüh-, Lösungsmittel)
� Mechanische Verfahren� Scherkräfte in Lösung (Ultraschall, Rotor-Stator-Mischer -
mechanische Rührung; Hochdruckhomogenisator - Druck; 1000 - 2000 bar)
� Scherkräfte in Festsubstanz (Kugelmühle - Vermahlen; Mörser und Pistill - Vermahlen; X-Press - Druck)
� Für größeren Maßstab sind der Hochdruckhomogenisatorund die Kugelmühle gut geeignet.
� Kombinationen der Aufschlussmethoden sind möglich und sinnvoll.
ZellausschlussZellausschluss
: 642016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Eine technische Version des Hochdruckhomogenisators ist der Manton-Gaulin Homogenisator . Die Menge an freigesetztem intrazellulären Produkt ist proportional• dem angelegten Druck• der Anzahl der Passagen durch den Homogenisator• und ist temperaturabhängig.
Kugelmühlen unterscheiden sich in den Geometrien der Rührscheiben und vor allem in den verwendeten Mahlkugeln (meist aus Glas):• für Hefe (0,75 - 1,0 mm) • für Bacillus sp. (0,50 - 0,75 mm)• für Brevibact. sp. (0,25 - 0,50 mm)
ZellausschlussZellausschluss
: 652016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Abbildung: Die Prokaryonten (Eubakterien, Archebakterien) unterscheiden sich hinsichtlich des Aufbaus und der Stabilität ihrer Zellwände. a) Archaea; b) Gram-positive und c) Gram-negative Eubakterien.
Zellausschluss (Membranen)Zellausschluss (Membranen)
: 662016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Weitere Aufarbeitungsschritte für technische Enzyme beinhalten vor allem: • Fällung und Membranfiltration• Einfache chromatographische Verfahren• Extraktion und eventuell Trocknung
Kontinuierliche AufarbeitungKontinuierliche Aufarbeitung
: 672016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
CAPTUREprecipitationextractionionexchange, HIC
INTERMEDIATEvarious chromato-praphic proc.
POLISHINGAffinity methodsHigh-resolutionchromatography
Resolution increases
Capacity increases
Technische Enzyme und Proteine
Therapeutische Enzyme und Proteine
Allg. Schema fAllg. Schema f üür die Proteinaufreinigungr die Proteinaufreinigung
: 682016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
� Einsatzbereiche in der Technologie
� Hauptsächlich Hydrolasen(Enzymklasse 3)� Spaltung von Kohlenhydraten,
Proteinen, Fetten
� einfache und technisch wichtige Reaktionen
� keine Kofaktoren
� stabil
� “Other”: Analytik und Sensoren, Medizin, Biokatalyse und Feinchemikalien
� Keine “Reinproteine”
Technische EnzymeTechnische Enzyme
: 692016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
� Resolution von Aminosäureracematen (Gemisch der D,L-Form nach chemischer Synthese) durch Acylierung (der Aminogruppe) und anschließende selektive enzymatische Deacylierung mit dem Enzym L-Aminosäureacylase
� Anwendungen für Lebens- und Futtermittel bzw. für medizinische und kosmetische Zwecke.
Abbildung : Konzept der enzymatischen Resolution.
Industrielles Beispiel (1/4)Industrielles Beispiel (1/4)
: 702016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Abbildung : Prozesstechnische Realisierung der Resolution von racemischen Acylaminosäuren. Kernelement ist der immobilisierteEnzymreaktor, im Design eines Festbettes.
Industrielles Beispiel (2/4)Industrielles Beispiel (2/4)
: 712016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Abbildung : Darstellung verschiedener Methoden der Enzymimmobilisierung(Rückhaltung). Transport zum und vom Enzym kann durch Diffusion (Konzentrationsgradient) oder Konvektion (Druckdifferenz) erfolgen.
Industrielles Beispiel (3/4)Industrielles Beispiel (3/4)
: 722016BioProzessTechnik | Mess- und Regeltechnik
Frank Eiden Mess- und Regeltechnik
Abbildung : Reaktorkonfigurationen für enzymkatalysierte Prozesse. Die gezeichneten Membranen in Bild (b), (e) und (f) besitzen Poren, die für Proteine impermeabel sind (Ultrafiltrationsmembranen). Bilder (c) und (d) zeigen Festbett- und Wirbelschichtreaktoren.
Bioreaktoren und ProzessBioreaktoren und Prozess --DesignDesign
Industrielles Industrielles BeispielBeispiel(4/4)(4/4)
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