Oxidativer- / Nitrosativer-Stress
Biochemische Grundlagen
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Dr. med. univ. Kurt Kraus
Laborarzt
MVZ Laborzentrum Ettlingen GmbH
Otto-Hahn-Straße 18 76275 Ettlingen
MVZ Laborzentrum Ettlingen GmbH
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Was ist oxidativer Stress? Was ist nitrosativer Stress?
Was sind die wichtigsten reaktiven Sauerstoffverbindungen(ROS)?
Wie und wodurch entstehen sie?
Wie schädigen sie Gefäße und Neuronen?
Was sind die wichtigsten Antioxidanzien?
Wie werden oxidativer Stress und antioxidative Kapazität gemessen?
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Inhalt
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Oxidativer Stress ist eine ständige überschießende Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen (ROS = reactive oxygen species). Es liegt ein ständiges Ungleichgewicht zwischen aggressiven ROS und schützenden Antioxidanzien vor.
Molekulare Grundlagen
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Die wichtigsten reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS)
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(Hyperoxid-Anion)
• Wasserstoffperoxid
• Stickoxid-Radikal
• Hydroxyl-Radikal
• Peroxynitrit-Anion
Huber J., Grundlagen der Altersprävention
← RNS
← RNS
5
Das Hydroxylradikal entsteht in 2 Reaktionsschritten: Reduktion von dreiwertigem Eisen (z. B. Speichereisen im Ferritin) zu zweiwertigem Eisen durch das Superoxid-Anion:
Rück-Oxidation des zweiwertigen Eisens unter gleich-zeitiger Spaltung von Wasserstoffperoxid*:
* OH‾ = Hydroxid-Anion, OH = Hydroxyl-Radikal Das Hydroxyl-Radikal ist eines der gefährlichsten Radikale!
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Entstehung des Hydroxylradikals
Fe 3+ + O2‾ O2 + Fe 2+
Fe 2+ + H2O2 Fe 3+ + OH‾ + OH
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Das Peroxynitrit-Anion entsteht durch die Verbindung des Stickoxid Radikals (NO) mit dem Superoxid-Anion (O2‾), vermutlich katalysiert durch die Superoxid-Dismutase (SOD):
ONOO‾ hemmt die Cytochrom C-Oxidase der Atmungskette – im Gegensatz zu NO – nicht reversibel, sondern irreversibel, außerdem die Akonitase des Zitronensäurezyklus.
Das Peroxynitrit-Anion ist äußerst gefährlich!
Entstehung des Peroxynitrit-Anions
NO + O2‾ SOD? ONOO‾
Das Superoxid-Anion
- entsteht unter der enzymatischen Aktivität von Oxidoreduktasen und Oxygenasen im Zytosol, in Peroxisomen und auf Zellmembranen
- entsteht vorwiegend in der
mitochondrialen Atmungskette,
und zwar an Enzymkomplex I
und vor allem an Enzymkomplex III.
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Entstehung des Superoxid-Anions
Kunsch and Medford
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Schematische Darstellung der mitochondrialen Atmungskette mit den Komplexen I und III
1-4 % des Sauerstoffs werden nicht zu Wasser reduziert (am Komplex IV), sondern zum Superoxid-Anion (vorwiegend am Komplex III).
Entstehung des Superoxid-Anions in der Atmungskette
Elektronenfähre
Staustufe
Überlauf
Elektronen
- Stau
O2 → O2‾
Hemmung der
Cytochrom-Oxidase
durch ONOO‾
↑
III
Horn, F. et al., Biochemie des Menschen
IV V
O2
Entkoppelung
der OXPHOS
Hemmung
↑
↑ ATP-Synthase
II
I
O2 O2 O2 O2 O2‾ O2‾ O2‾ O2‾ O2‾ O2 O2‾
Protonengradient
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Das Superoxid-Anion entsteht u. a. in der mito-chondrialen Atmungskette aus der Oxidation von NADH zu NAD+ und wird hauptsächlich durch die Superoxid-Dismutase (SOD) entgiftet:
Wasserstoffperoxid entsteht bei der Entgiftung des Superoxid-Anions durch die Superoxid-Dismutase (siehe oben), aber auch bei vielen anderen enzymatischen Reaktionen. Es wird entgiftet u. a. durch Glutathion-Peroxidase (GPX) bzw. Katalase:
2 H2O2 GPX/Katalase 2 H2O + O2
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Entgiftung des Superoxid-Anions
O2‾ + O2‾ + 2H+ SOD H2O2 + O2
1. Scherkräfte
2. Angiotensin II
3. biologisches Altern der Gefäße
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Hypertonie und altersbedingte
Atherosklerose der Gefäße
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Schwankungen des Blutdrucks mit phasenhaft steilem Blutdruckanstieg (psychischer Stress) lösen oszillierende Scherkräfte auf das Gefäßendothel aus, vor allem bei den Arteriolen.
Die oszillierenden Scherkräfte führen zur verstärkten Bildung von H2O2 und O2‾(im Verhältnis 100:1).
Genauer Mechanismus unbekannt (eine Hypothese: über Einwirkungen auf das Zytoskelett).
Entstehung von Peroxynitrit-Anionen ONOO-
Inaktivierung von NO-Radikalen, die im Endothel mit Hilfe des Enzyms eNOS (endotheliale Stickoxid-Synthase) gebildet wurden und unter physiologischen Bedingungen die Gefäßmuskulatur relaxieren
→ NO-Mangel = Vasokonstriktion
Entstehung von Hydroxylradikalen
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Folgen der Bildung von O2‾ und H2O2
NO + O2‾ SOD? ONOO‾
Fe 2+ + H2O2 Fe 3+ + OH‾ + OH
Oxidation von LDL (oxidiertes LDL)
Oxidation ungesättigter Fettsäurereste in den
Phospholipiden der Zellmembranen zu
Lipidhydroperoxiden
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Weitere Folgeschäden durch die ROS:
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Die ROS, das oxidierte LDL und die Lipidhydroperoxide aktivieren den Trankskriptionsfaktor NF-κ B (Nukleärer Faktor κ B) Synthese von Adhäsionsproteinen (ICAM-1;
VCAM-1 = vascular cell adhesion molecule-1, MCP-1 = monocyte chemoattractant protein-1) → Adhäsion von Leukozyten am Gefäßendothel
Synthese pro-inflammatorischer Zytokine
(u. a. TNF-alpha, Il-1, Il-6) Diese stimulieren ihrerseits NF-κ B → Circulus vitiosus
Folge: entzündliche Infiltration der Gefäßwände → Arteriosklerose
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verstärkt in der Gefäßwand die Aktivität der
NADPH-Oxidase
→ Superoxid-Anionen
induziert die Synthese der Adhäsionsproteine VCAM-1 und MCP-1
→ Arteriosklerose
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Angiotensin II
↑
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1) Mit fortschreitendem Alter stärkere Schädigung der mitochondrialen DNS durch oxidativen Stress im Vergleich zur chromosomalen DNS des Zellkerns, da in den Mitochondrien kein Schutz der DNS durch Histone.
Zunehmend Defekte bei der Synthese von Enzymen der Atmungskette
→ mitochondriale Atmung
→ ROS-Bildung
→ oxidativer Stress
→ Arteriosklerose
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Biologisches Altern der Gefäße
↑
↑
↑
↓
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2) Mit fortschreitendem Alter zunehmende Beein- trächtigung des Transports der SOD vom Zytosol in die Mitochondrien (Mangan-abhängige SOD2).
Ursache: Punktmutation im Signal-Polypeptid (mitochondrial targeting sequence), das den SOD-Transport in die Mitochondrien veranlasst.
→ Entgiftung von O2‾
→ ROS und oxidativer Stress
→ Arteriosklerose
↑
↓
↑
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3) Oxidativer Stress: Oxidation von intrazellulärem Glutathion Permeabilität der Mitochondrienmembran
Cytochrom C wandert aus den Mitochondrien
in das Zytosol
Komplexbildung des Cytochrom C mit Apaf-1 (Apoptosom)
→ Apoptose der Zelle
↑
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Zusammenfassung biologisches Altern der Gefäße
1) Schädigung der mitochondrialen DNS
2) Beeinträchtigung des Transports der SOD
3) Cytochrom C wandert aus den Mitochondrien in das Zytosol → Apoptose
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1. Entkoppelung der OXPHOS
mit Hemmung der ATP-Synthase
1. Amadori, AGE und RAGE
2. Polyol-Weg
Diabetes mellitus
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Hemmung der ATP-Synthase
Hyperglykämie
→ Glucosemetabolisierung durch Glykolyse und Zitratzyklus
→ Coenzyme NADH und FADH2
→ NADH und FADH2 = Elektronendonatoren → Überschuss an Elektronen gelangt in die mitochondriale Atmungskette.
→ beginnender Überlauf der Elektronen auf O2
→ Entkoppelung der OXPHOS → ATP
→ „Rückstau“ der Elektronen, die dadurch verstärkt mit O2 reagieren
→ O2‾
→ Arteriosklerose und Neuropathie
↑
↑
↑ ↑
↓ ↓
22 MVZ Laborzentrum Ettlingen GmbH 22 MVZ Laborzentrum Ettlingen GmbH
Schematische Darstellung der mitochondrialen Atmungskette mit den Komplexen I und III
1-4 % des Sauerstoffs werden nicht zu Wasser reduziert (am Komplex IV), sondern zum Superoxid-Anion (vorwiegend am Komplex III).
Entstehung des Superoxid-Anions in der Atmungskette
Elektronenfähre
Staustufe
Überlauf
Elektronen
- Stau
O2 → O2‾
Hemmung der
Cytochrom-Oxidase
durch ONOO‾
↑
III
Horn, F. et al., Biochemie des Menschen
IV V
O2
Entkoppelung
der OXPHOS
Hemmung
↑
↑ ATP-Synthase
II
I
O2 O2 O2 O2 O2‾ O2‾ O2‾ O2‾ O2‾ O2 O2‾
Protonengradient
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Bei Hyperglykämie zunächst Glykierung von Amino-gruppen der Proteine über die Bildung von Schiff’schen Basen und Amadori-Produkten (Zwischenprodukte)
→ von den Amadori-Produkten ausgehend weitere
chemische Reaktionen bis zur Bildung von AGEs.
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AGE-Synthese (advanced glycation end products)
Löffler, G., Basiswissen Biochemie
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Das Ausmaß der AGE-Synthese ist von der Glucose-Konzentration abhängig. → Bindung der AGEs an Zelloberflächenrezeptoren (RAGEs = Rezeptoren für AGEs) → Bildung von ROS → Aktivierung von NF-κ B → Synthese von Adhäsions- proteinen (ICAM-1, VCAM-1, MCP-1) und pro-in- flammatorischen Zytokinen (TNF-alpha, IL-1, IL-6) → Arteriosklerose und Neuropathie
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Polyol-Weg
Stoffwechselweg zum Verbrauch überschüssiger Glucose, die nicht für die Energiegewinnung durch Glykolyse, Zitratzyklus und mitochondrialer Atmungskette verwendet werden kann. Bei Gesunden von untergeordneter Bedeutung. Bei Diabetikern mit Hyperglykämie wird dagegen bis zu einem Drittel der Gesamt-Glucose über den Polyol-Weg verstoffwechselt.
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Polyol-Weg:
bei ständiger Hyperglykämie Verbrauch der NADPH- Reserven
NADPH steht für die Glutathion-Reduktase als Coenzym nicht mehr ausreichend zur Verfügung
Erschöpfung der Reserven an reduziertem Glutathion =
wichtigstes Antioxidans → oxidativer Stress → Arteriosklerose und Neuropathie
Glucose + NADPH + H+ Aldo-Reduktase Sorbitol + NADP+
↑
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Interferon gamma
stimuliert in Makrophagen die induzierbare Stickoxid-Synthase, welche über Arginin-Citrullin-Zyklus die Synthese des hochreaktiven Stickoxid-Radikals (NO-Radikals) katalysiert.
Physiologische Wirkung des NO-Radikals: Abtöten von Krankheitserregern
Entzündungen / Infektionen
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NO-Radikal kann mit Superoxid-Anion zum Peroxynitrit-Anion reagieren
NO-Radikal und Peroxynitrit-Anion hemmen Enzyme des Zitronensäure-Zyklus und der mitochondrialen Atmungskette und damit die Energiegewinnung betroffener Zellen (insbes. von Neuronen). Schädigung der Membran- und Proteinstrukturen von Zellen (u. a. die innere Mitochondrienmembran)
Folge: zelluläre Funktionsstörung (z.B. Erregungsleitungs-störungen) bis zum Zelltod; betroffen sind Neuronen und andere Zellen (z. B. Bindegewebszellen der Gelenkskapseln).
NO + O2‾ SOD? ONOO‾
nitrosativer
Stress
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NO● hemmt die Cytochrom C-Oxidase der Atmungskette reversibel, ONOO- dagegen irreversibel → Mitochondrienfunktion = Energiegewinnung herabgesetzt
Betrifft vor allem die Neuronen (hoher Energiebedarf).
Axonaler Transport von Zellstrukturproteinen ist eingeschränkt.
Darüber hinaus direkte stressbedingte Schäden an Membran- und Proteinstrukturen der Neuronen.
Neuropathie, z. B. bei chronischer Borreliose massive Freisetzung des Zytokins Interferon-γ durch Th1-Zellen → iNOS-Aktivität in Makrophagen → nitrosativer Stress
↓
↑ ↑ ↑ ↑
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Marker der Lipidperoxidation
- Malondialdehyd (MDA)
- oxidiertes LDL (oxLDL)
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Marker des oxidativen Stresses und der antioxidativen Kapazität
ROS oxidieren ungesättigte Fettsäurereste in den Phospho- lipiden der Zellmembranen. Es entstehen Lipidhydroperoxide = hochreaktive Zwischen-produkte; diese aktivieren den Transkriptionsfaktor NF-κ B (Adhäsionsproteine und pro-inflammatorische Zytokine)
Die Lipidhydroperoxide - werden teilweise durch die Glutathion-Peroxidase (GPX) entgiftet, - gehen teilweise weitere chemische Reaktionen ein
→ Malondialdehyd (MDA)
MDA ist ebenfalls reaktiv und wirkt mutagen, indem es Verbindungen mit Nukleinbasen eingeht und so Punkt- mutationen auslösen kann.
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Malondialdehyd (MDA)
↑
- entsteht durch die Oxidation von LDL (vermutlich katalysiert von Lipoxygenasen),
- aktiviert den Transkriptionsfaktor NF-κ B → Adhäsionsproteine und pro-inflammatorische Zytokine
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Oxidiertes LDL (oxLDL)
↑
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Marker der Nukleinsäureoxidation
8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin (OHDG) entsteht durch die Oxidation von Desoxyguanosin in der DNS des Zellkerns und insbesondere der Mitochondrien (in den Mitochondrien kein Schutz durch Histone)
→ zunehmend Defekte bei der Synthese von Enzymen der Atmungskette
→ mitochondriale Atmung
→ ROS-Bildung
→ oxidativer Stress
→ Arteriosklerose
↑
↑
↑
↓
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Marker des nitrosativen Stresses
- 3-Nitrotyrosin
- Arginin
- Citrullin/g Kreatinin
entsteht durch die Nitrierung von Tyrosin durch NO∙
bzw. durch ONOO-
Wenn Arginin bzw. Citrullin/g Kreatinin
dann nitrosativer Stress
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Arginin + O2 NO-Synthase NO + Citrullin
3-Nitrotyrosin
↓ ↑
LABORZENTRUM ETTLINGEN - KARLSRUHE
Marker der antioxidativen Kapazität
Totale Antioxidative Kapazität (AOC)
Glutathion
Glutathion-Peroxidase (GPX)
Ubichinon (Coenzym Q 10)
Superoxid-Dismutase (SOD)
Vitamin C und Vitamin E
Kofaktoren (Redoxfaktoren) Kupfer, Zink,
Mangan und Selen
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Totale antioxidative Kapazität (AOC)
„Globaltest“, mit dem das gesamte Reduktions-vermögen zur Entgiftung von ROS gemessen wird. Methode: Ein chromogenes Radikal wird mit Patientenserum versetzt. Die dann folgende Abnahme der Farbreaktion entspricht der antioxidativen Kapazität. Je größer der oxidative Stress, desto geringer die antioxidative Kapazität.
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Glutathion
ist das wichtigste Antioxidans. Reduziert Lipidhydro-peroxide mit Hilfe der Glutathionperoxidase (GPX).
Kofaktor der GPX ist Selen.
Selen ist für die Redox-Reaktionen das Elektronen-Reservoir.
Ubichinon (Coenzym Q 10)
ist einer der Elektronenüberträger innerhalb der mitochondrialen Atmungskette (zwischen Komplex I und Komplex III). Antioxidans und Radikalfänger wie Glutathion.
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Superoxid-Dismutase (SOD)
entgiftet das Superoxid-Anion (O2-∙)
Es gibt 3 Isoenzyme der SOD: SOD1: Vorkommen im Zytosol, enthält als Kofaktoren Kupfer und Zink
SOD2: Vorkommen in den Mitochondrien, enthält als Kofaktor Mangan
SOD3: Vorkommen auf extrazellulären Oberflächen Kupfer und Zink bzw. Mangan dienen als Elektronenreservoir für die Redoxreaktionen.
O2‾ + O2‾ + 2H+ SOD H2O2 + O2
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LABORZENTRUM ETTLINGEN - KARLSRUHE
Vitamin E (Tocopherol)
ist ein Antioxidans, das insbesondere ungesättigte Fettsäurereste in Zellmembranen vor der Lipidperoxi-dation schützt (Vermeidung von Lipidhydroperoxiden).
Das so oxidierte Vitamin E wird durch Vitamin C (Ascorbinsäure) regeneriert = reduziert.
Das so oxidierte Vitamin C wird durch Glutathion regeneriert = reduziert.
Vitamin E, Vitamin C und Glutathion wirken also synergistisch.
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Rationale Stufendiagnostik
Hierfür gelten folgende Grundsätze:
1) Je größer der oxidative Stress, desto geringer die antioxidative Kapazität.
2) Endprodukte des oxidativen Stresses, wie Malondialdehyd (MDA), oxidiertes LDL (oxLDL) oder 8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin (OHDG) sind generell aussagekräftiger als Enzyme, da sie kaum Schwankungen unterliegen.
3) Ist die Aktivität eines Enzyms zu niedrig, sollten seine Kofaktoren (Spurenelemente) kontrolliert werden. Darüber hinaus sind Substrate der Redox-Reaktionen, z. B. die beiden Vitamine C und E zu bestimmen.
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1. Stufe
2. Stufe
3. Stufe
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Untersuchung Material
Totale Antioxidative Kapazität (AOC) Serum
Totale Antioxidative Kapazität (AOC)
oxidiertes LDL (oxLDL)
8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin (OHDG)
Serum
Serum
Urin (gefroren)
Totale Antioxidative Kapazität (AOC)
8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin (OHDG)
Malondialdehyd (MDA)
Serum
Urin (gefroren)
Heparinplasma, gefroren oder
Serum, gefroren
Superoxid-Dismutase (SOD)
Glutathion-Peroxidase (GPX)
Glutathion
Glutathion-Reduktase
EDTA-Blut
EDTA-Blut
EDTA-Blut, gefroren
EDTA-Blut
Kofaktoren Kupfer, Zink und Mangan bei
erniedrigter SOD
Kofaktor Selen bei erniedrigter GPX
ggf. Vitamine C und E
ggf. Ubichinon (Coenzym Q10)
Kupfer im Serum,
Zink im Heparinblut,
Mangan im EDTA-Blut
EDTA-Blut
Serum
Serum
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Dr. med. univ. Kurt Kraus
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Wir danken
für Ihre Aufmerksamkeit
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Oxidativer- / Nitrosativer-Stress
Entstehung und Auswirkungen
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