Zelluläre Signaltransduktion II
• TGF-ß, der Wachstumsfaktor, der das Wachstum hemmt?
Transforming growth factor ß (TGF-ß)
Growth factor Stimulation der Verankerungs-unabhängigen Zellproliferation von Tumorzellen in serum-
freiem Medium in Weichagar
Transforming Umwandlung epithelialer Zellen in Zellen mit mesenchymalen Eigenschaften.
Epithelial to Mesenchymal Transdifferentiation
Transforming growth factor ß (TGF-ß)
Growth factor Stimulation der Verankerungs-unabhängigen Zellproliferation von Tumorzellen in serum-
freiem Medium in Weichagar
Transforming Umwandlung epithelialer Zellen in Zellen mit mesenchymalen Eigenschaften.
Epithelial to Mesenchymal Transdifferentiation
Epithel: Schicht engverbundener, polarisierter Zellen
Mesenchym: Gewebe aus locker verbundenen, nicht polarisierten Zellen
Control TGF-ß
Transforming Growth Factor-ß-Induced Epithelial to Mesenchymal Transdifferentiation
Bhowmick et al., Mol Cell Biol 12, 27-36 (2001)
Transforming Growth Factor-ß-Induced Epithelial to Mesenchymal Transdifferentiation
Bhowmick et al., Mol Cell Biol 12, 27-36 (2001) Link to Cadherins
TGFß ein pleiotropes Cytokin
- 3 Isoformen werden von Säugetierzellen exprimiert (TGFß 1-3)
- Sequenz in verschiedenen Spezies hoch konserviert
- TGFß1: Endotheliale, hämapoetische und Bindegewebszellen
- TGFß2: Epitheliale und neuronale Zellen
- TGFß3: Mesenchymale Zellen
TGF-ß-Familie BMP-Familie
TGF-ß BMP2 (bone morphogenic Protein)
Activin BMP4
Nodal BMP7
TGF-ß und verwandte Proteine
SS
SS
ß1-LAP (80 kDa)
SS
TGF-ß1 (25 kDa)
LTBP (125-160 kDa)
Sekretion von TGF-ß1 als inaktiver Komplex
LAP = Latency-associated proteinLTBP = Latent TGF-ß-binding protein
SS
SS
ß1-LAP (80 kDa)
SS
TGF-ß1 (25 kDa)
LTBP (125-160 kDa)
Sekretion von TGF-ß1 als inaktiver Komplex
LAP = Latency-associated proteinLTBP = Latent TGF-ß-binding protein
Aktivierung von TGFß durch proteolytische Prozesse
TGFß ein pleiotropes Cytokin
- 3 Isoformen werden von Säugetierzellen exprimiert (TGFß 1-3)
- Sequenz in verschiedenen Spezies hoch konserviert
- TGFß1: Endotheliale, hämapoetische und Bindegewebszellen
- TGFß2: Epitheliale und neuronale Zellen
- TGFß3: Mesenchymale Zellen
Signale für die proteolytische Aktivierung:
- Stimulation von Integrinrezeptoren der extrazellulären Matrix
- Gefäßschädigungen und Aktivierung von Plasmin/Thrombospondin
TGFß Funktionen
- Inhibition der Zellproliferation
- Supression der Immunantwort
- Induktion von Zelldifferenzierung
- Stimulation der Synthese von extrazellulärer Matrix
- Stimulator der Angiogenese
Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren
3 Typen von TGF-Rezeptoren wurden in Säugetierzellen indentifiziert:
TGFß-R I: 55 kDa
TGFß-R II: 75 kDa
TGFß-R III: 200 – 400 kDa Proteoglycan ohne Signaltransduktionseigenschaften
TßR-II TßR-I
Ligandbindungs-domäne
Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren
TßR-II TßR-I
Ligandbindungs-domäne
Transmembran-domäne
Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren
TßR-II TßR-I
Ligandbindungs-domäne
Transmembran-domäne
Kinase-domäne
Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren
TßR-II TßR-I
Ligandbindungs-domäne
Transmembran-domäne
Kinase-domäne
Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren
Tß-R I und TßR-II sind Serin/Threonin Kinasen
P
TßR-II TßR-I
Ligandbindungs-domäne
Transmembran-domäne
Kinase-domäne
Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren
P
TßR-II TßR-I
Ligandbindungs-domäne
Transmembran-domäne
Kinase-domäne
Konstitutiv aktiveKinase
Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren
P
TßR-II TßR-I
Ligandbindungs-domäne
Transmembran-domäne
Kinase-domäne
Konstitutiv aktiveKinase
Durch Phosphorylierungaktivierte Kinase
Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren
P
TßR-II TßR-I
Ligandbindungs-domäne
Transmembran-domäne
Kinase-domäne
Konstitutiv aktiveKinase
Durch Phosphorylierungaktivierte Kinase
Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren
SGSGSG GS Domäne
PP
TßR-II TßR-I
TGF-ßLigandbindungs-domäne
Transmembran-domäne
Kinase-domäne
Konstitutiv aktiveKinase
Durch Phosphorylierungaktivierte Kinase
Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren
PP
PP
TßR-II TßR-I
TGF-ßLigandbindungs-domäne
Transmembran-domäne
Kinase-domäne
Konstitutiv aktiveKinase
Durch Phosphorylierungaktivierte Kinase
Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren
Phosphorylierung der GS Domäne
PP
PP
Signalkaskade
TßR-II TßR-I
TGF-ßLigandbindungs-domäne
Transmembran-domäne
Kinase-domäne
Konstitutiv aktiveKinase
Durch Phosphorylierungaktivierte Kinase
Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren
TßR-II
TGF-ß
TßR-I ActR-IIActR-IIB
Activin/Nodal
ActR-IB
Bestimmung der Ligandspezifität durch Kombination unter-schiedlicher Mitglieder der TßR-II- und TßR-I-Familien
TßR-II
TGF-ß
TßR-I ActR-IIActR-IIB
Activin/Nodal
ActR-IB
BMP2BMP4BMP7
GDF5BMP4 BMP7 AMH/MIS
ActR-IIActR-IIB
ActR-IIActR-IIB
BMPR-II BMPR-IABMPR-IB
BMPR-IABMPR-IB
ALK2 AMHR-II BMPR-IB
Bestimmung der Ligandspezifität durch Kombination unter-schiedlicher Mitglieder der TßR-II- und TßR-I-Familien
PP
PP
S igna lkaskadeS m ad-Prote ine
TßR -II TßR -I
TG F-ßL igandb indungs-dom äne
Transm em bran-dom äne
K inase-dom äne
K onstitu tiv aktiveK inase
D urch P hosphory lierungaktiv ierte K inase
Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren
Struktur der Smad-Proteine
Fusion aus
Sma: Analogon aus C. elegans
Mad: Analogon aus Drosophila
(Mad= „Mothers against decapentaplegig“)
Decapentaplegic = TGFß-Analog aus Drosophila
SXSNLSDNA-Bindung(ß-hairpin )R-Smads H2N- -COO-
Struktur der Smad-Proteine
SXSNLSDNA-Bindung(ß-hairpin )
MH1-Domäne MH2-DomäneLinker
R-Smads H2N- -COO-
Struktur der Smad-Proteine
SXSNLSDNA-Bindung(ß-hairpin )
MH1-Domäne MH2-DomäneLinker
R-Smads H2N- -COO-
Struktur der Smad-Proteine
Phosphorylierungsstelle
SXSNLSDNA-Bindung(ß-hairpin )
MH1-Domäne MH2-DomäneLinker
R-Smads
Co-Smad
H2N-
H2N-
-COO-
-COO-
Struktur der Smad-Proteine
Phosphorylierungsstelle
SXSNLSDNA-Bindung(ß-hairpin )
MH1-Domäne MH2-DomäneLinker
R-Smads
Co-Smad
I-Smads
H2N-
H2N-
H2N
-COO-
-COO-
-COO-
Struktur der Smad-Proteine
Phosphorylierungsstelle
Type
I re
cept
or
inte
ract
ion
Co-factorinteraction
Interaktionsdomänen der Smad-Proteine
Mitglieder der Smad-Familie
Mitglieder der Smad-Familie
Mitglieder der Smad-Familie
Mitglieder der Smad-Familie
SXSH2N- -COO-
SXS -COO-
-NH2
P P
ATP
ADP
TßR-I
Aktivierung der R-Smads durch TßR-I-abhängige Phosphorylierung der C-terminalen Domäne
PP
PP
TßR-II TßR-I
TGF-ß
Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade
R-SmadSXS -COO-
-N H2
PP
PP
TßR-II TßR-I
TGF-ß
Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade
R-SmadSXS -COO-
-N H2
SARA
SARA = Smad anchor for receptor activation
-CO
O-
SX
S
-NH
2
PP
PP
TßR-II TßR-I
TGF-ß
Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade
R-Smad
SA
RA
-CO
O-
SX
S
-NH
2
PP
PP
TßR-II TßR-I
TGF-ß
SXSH2N- -COO-PP
Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade
R-Smad
SA
RA
-CO
O-
SX
S
-NH
2
PP
PP
TßR-II TßR-I
TGF-ß
SXSH2N- -COO-PP
H2N- -COO-
SXSH2N- -COO-PP
SXSH2N- -COO-PP
Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade
-NH2
-COO-
Co-Smad
R-Smad
SA
RA
SMAD-4
-CO
O-
SX
S
-NH
2
PP
PP
TßR-II TßR-I
TGF-ß
SXSH2N- -COO-PP
H2N- -COO-
SXSH2N- -COO-PP
SXSH2N- -COO-PP
Translokation in den Zellkern
Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade
-NH2
-COO-
Co-Smad
R-Smad
SA
RA
H2
N
-CO
O-
PP
PP
TßR-II TßR-I
TGF-ß
SXSH2N- -COO-PP
H2N- -COO-
SXSH2N- -COO-PP
SXSH2N- -COO-PP
Translokation in den Zellkern
Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade
-NH2
-COO-
Co-Smad
R-SmadSXS -COO-
-N H2
SARA
SA
RA
X
X
X
I-Smad
-COO-SXS -C
OO-
PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H 2N-
C A G A C5' 3'
Transaktivierung?
Smad-abhängige Aktivierung der Transkription
S B Emad inding lement
-COO-SXS -C
OO-
PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H 2N-
C A G A C5' 3'
Transaktivierung?
Smad-abhängige Aktivierung der Transkription
Häufigkeit der Konsensussequenz 1/1024 bp (4 Basen, Pentanucleotid: 45 bp)
In praktisch jedem Promotor kommt diese Sequenz vor.
S B Emad inding lement
-COO-SXS -C
OO-
PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H 2N-
C A G A C5' 3'
Transaktivierung?
Smad-abhängige Aktivierung der Transkription
Häufigkeit der Konsensussequenz 1/1024 bp (4 Basen, Pentanucleotid: 45 bp)
In praktisch jedem Promotor kommt diese Sequenz vor.
Genspezifität kann nur durch Kombination mit anderen Faktoren erreicht werden
S B Emad inding lement
-COO-SXS -C
OO-
PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H 2N-
C A G A C5' 3'
Transaktivierung?
Smad-abhängige Aktivierung der Transkription
Affinität von Smads für Konsensussequenz ist relativ gering: (etwa 10-7 M, Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren zum Vergleich 3 nM )
S B Emad inding lement
-COO-SXS -C
OO-
PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H 2N-
C A G A C5' 3'
Transaktivierung?
Smad-abhängige Aktivierung der Transkription
Affinität von Smads für Konsensussequenz ist relativ gering: (etwa 10-7 M, Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren zum Vergleich 3 nM )
Ein SBE reicht für eine effektive Bindung der Smads an die DNAalleine nicht aus.
S B Emad inding lement
-COO-SXS -C
OO-
PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H 2N-
C A G A C5' 3'
Transaktivierung?
Smad-abhängige Aktivierung der Transkription
Affinität von Smads für Konsensussequenz ist relativ gering: (etwa 10-7 M, Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren zum Vergleich 3 nM )
Ein SBE reicht für eine effektive Bindung der Smads an die DNAalleine nicht aus.
S B Emad inding lement
Eine effektive DNA-Bindung kann nur durch multiple SBEs und/oder andereFaktoren erreicht werden
-COO
-SXS -COO
-
PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H 2N-
C A G A C5'
Smad-abhängige Aktivierung der Transkription
S B Emad inding lement
DNA-Bindungs-Kofaktoren
-COO
-SXS -COO
-
PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H 2N-
C A G A C5'
Smad-abhängige Aktivierung der Transkription
S B Emad inding lement
DNA-Bindungs-Kofaktoren
A T C A C A
A R Ectivin esponse lement
-COO
-SXS -COO
-
PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H 2N-
C A G A C5'
Transaktivierung
Smad-abhängige Aktivierung der Transkription
S B Emad inding lement
DNA-Bindungs-Kofaktoren
A T C A C A
FAST
A R Ectivin esponse lement
-COO
-SXS -COO
-
PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H 2N-
C A G A C5'
Transaktivierung
Smad-abhängige Aktivierung der Transkription
S B Emad inding lement
DNA-Bindungs-Kofaktoren
A T C A C A
FAST
FAST verstärkt die Bindung des Smad-Komplexes an die DNAhat aber selbst keine transaktivierende Wirkung.
A R Ectivin esponse lement
Smad-abhängige Aktivierung der TranskriptionD N A-B indungs-K ofaktoren
Bekannte DNA-Bindungspartner für Smads sind FAST für Smad2 und Smad3
OAZ für Smad1, Smad5 und Smad8
Smad-abhängige Aktivierung der TranskriptionD N A-B indungs-K ofaktoren
Bekannte DNA-Bindungspartner für Smads sind - FAST für Smad2 und Smad3
- OAZ für Smad1, Smad5 und Smad8
DNA-Bindungspartner erhöhen die Signalspezifität - da nur Gene aktiviert werden, die SRE und Erkennungssequenzen für die Kofaktoren haben
- da sie für eine bestimmte Gruppe von Smads und damit für eine Gruppe von Rezeptoren spezifisch sind
- da sie zellspezifisch exprimiert werden
Smad-abhängige Regulation der TranskriptionCoaktivatoren oder Repressoren
Smad-abhängige Regulation der TranskriptionCoaktivatoren oder Repressoren
-COO-SXS-COO
-PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H2N-
C A GA C5' 3'
S B Emad inding lement
Coaktivator
Smad-abhängige Regulation der TranskriptionCoaktivatoren oder Repressoren
-COO-SXS-COO
-PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H2N-
C A GA C5' 3'
S B Emad inding lement
Histon-Acetyl-Transferase
Coaktivator
Smad-abhängige Regulation der TranskriptionCoaktivatoren oder Repressoren
-COO-SXS-COO
-PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H2N-
C A GA C5' 3'
S B Emad inding lement
Histon-Acetyl-Transferase
Coaktivator
Histon
Histon-Ac
Smad-abhängige Regulation der TranskriptionCoaktivatoren oder Repressoren
-COO-SXS-COO
-PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H2N-
C A GA C5' 3'
S B Emad inding lement
Histon-Acetyl-Transferase
Coaktivator
Histon
Histon-Ac
Chromatinauflockerung
Smad-abhängige Regulation der TranskriptionCoaktivatoren oder Repressoren
-COO-SXS-COO
-PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H2N-
C A GA C5' 3'
S B Emad inding lement
Histon-Acetyl-Transferase
Coaktivator
Histon
Histon-Ac
Chromatinauflockerung
erhöhte Transkription
Smad-abhängige Regulation der TranskriptionCoaktivatoren oder Repressoren
-COO-SXS-COO
-PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H2N-
C A GA C5' 3'
S B Emad inding lement
Histon-Acetyl-Transferase
Coaktivator
Histon
Histon-Ac
Chromatinauflockerung
erhöhte Transkription
-COO-SXS-COO-PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H2N-
C A GA C5' 3'
S B Emad inding lement
Repressor
Smad-abhängige Regulation der TranskriptionCoaktivatoren oder Repressoren
-COO-SXS-COO
-PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H2N-
C A GA C5' 3'
S B Emad inding lement
Histon-Acetyl-Transferase
Coaktivator
Histon
Histon-Ac
Chromatinauflockerung
erhöhte Transkription
-COO-SXS-COO-PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H2N-
C A GA C5' 3'
S B Emad inding lement
Histon-Deacetylase
Repressor
Smad-abhängige Regulation der TranskriptionCoaktivatoren oder Repressoren
-COO-SXS-COO
-PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H2N-
C A GA C5' 3'
S B Emad inding lement
Histon-Acetyl-Transferase
Coaktivator
Histon
Histon-Ac
Chromatinauflockerung
erhöhte Transkription
-COO-SXS-COO-PP
SXS
-COO
-
PP
H2N-
H2N-
H2N-
C A GA C5' 3'
S B Emad inding lement
Histon-Deacetylase
Repressor
Histon-Ac
Histon
Chromatinkondensierung
erniedrigte Transkription
Aktivierung der TGFß-R/SMAD Signalkaskade führt bei epithelialen Zellen zu einem Zellzyklusarrest
Wodurch ?
Cyclin-abhängige Kinasen: Motoren und Schalter des Zellzyclus
CDKs: Motoren des Zellzyklus
Welche "Motorwirkung" haben CDKs im Zellzyklus ?
Durch die Phosphorylierung welcher Substratewerden Zellzyklusphasen eingeleitet ?
CDK Substrate: Initiation der S-Phase
Bedeutung von CDKs bei der Initiation der S-Phase
CDK Substrate: Initiation der S-Phase
NH2- -COOHA B
Retinoblastom-Protein (Rb)- Schlüsselsubstrat der S-Phase -
nucleäres Protein, 110 kDa
CDK Substrate: Initiation der S-Phase
NH2- -COOHA B
Retinoblastom-Protein (Rb)- Schlüsselsubstrat der S-Phase -
nucleäres Protein, 110 kDa
Bindung des Transkriptionsfaktors E2F
CDK Substrate: Initiation der S-Phase
NH2- -COOHA B
E2F: zentraler Transkriptionsfaktor bei der Induktion von S-Phase Genen
Retinoblastom-Protein (Rb)- Schlüsselsubstrat der S-Phase -
nucleäres Protein, 110 kDa
Bindung des Transkriptionsfaktors E2F
CDK Substrate: Initiation der S-Phase
NH2- -COOHA B
Bindung des Transkriptionsfaktors E2F
P P P P P P P P PP
Retinoblastom-Protein (Rb)- Schlüsselsubstrat der S-Phase -
nucleäres Protein, 110 kDa
E2F: zentraler Transkriptionsfaktor bei der Induktion von S-Phase Genen
CDK Substrate: Initiation der S-Phase
Rb
E2F
Rb
Repression E2F-kontrollierter Gene
CDK Substrate: Initiation der S-Phase
Rb
E2F
InduktionE2F-kontrollierter Gene
P P P
CDK 2
Cyclin E
Rb
E2F
Rb
Repression E2F-kontrollierter Gene
E2F: Initiator der S-Phase
E2F
E2F-kontrollierter Gene
DNA-Pol I
dNTP-Synth.
CDK 2
Cyclin E
Rb
P P P
Regulation der CDK-Aktivität: Inhibitoren
inaktiv
inaktivCDK
CyclinCyclin
aktiv
T160 PCDK
Cyclin
T160 PCDK
CKI
CDKinaktiv
Cyclin
CKI
P
Cyclinkonzentration
PhosphorylierungDephosphorylierung
CDK-Inhibitoren
CDK
CyclinT14
Y15
P
Pinaktiv
T160 P
ATP
Pi
ATP
Regulation der CDK-Aktivität: Inhibitoren
Beispiel: CKI p21
isosterische Hemmung durch Bindung im aktiven Zentrum
CDK 2
Cyclin E
CKI p21
G1 S-Phase
Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß
TGF-ß
Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß
TGF-ß
p15, p21
Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß
TGF-ß
p15, p21 p27
Cyclin/CdK
Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß
TGF-ß
p15, p21 p27
Cyclin/CdKRb/E2F
Rb-P
Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß
TGF-ß
p15, p21 p27
Cyclin/CdKRb/E2F E2F
Rb-P
Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß
S-Phase Gene
TGF-ß
p15, p21 p27
Cyclin/CdKRb/E2F E2F
Rb-P
myc
Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß
S-Phase Gene
Zielgene des Transkriptionsfaktors c-myc
(+) Cyclin D Vermehrte Bildung des CyclinD/Cdk4 Komplexes(+) Cyclin E Vermehrte Bildung des CyclinE/Cdk2 Komplexes
(+) cdc25a-Phosphatase Enthemmung des CyclinD/Cdk4 Komplexes(+) p27-Sequestrierungsfaktor Enthemmung des CyclinE/Cdk2 Komplexes
Myc C ell cycleprogression
G1
S
Beeinflussung des Zellzyklus durch Myc
Mögliche Angriffspunkte in der TGF-ß-Signalkette bei Tumorerkrankungen
• Aufhebung der TGF-ß-vermittelten Hemmung der Zellproliferation
z. B. Defekte in TßR oder Smad • Ausschaltung der proapoptotischen Signalkaskaden
z. B. Defekte in proapoptotischen Proteinen
In späteren Stadien TGF-ß Sekretion und dadurch :• Immunsuppression• Epitheliale zu mesenchymaler Transdifferenzierung erhöhte
Metastasierungsneigung• Vermehrte Neovaskularisation
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