11

Seminar 1

Nachweis des Proteins NHE-7 in roten Blutzellen

Claudia Hahn

25.04.2012

22

Inhalt

Na+/K+-Transport

Leak-Transport

NHE Familie

Versuchsabläufe

Referenzen

3

K+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

K+

K+

K+

K+K+

K+

K+

K+

http://3imgsrv.fotofinder.com/archive/thumbnail/EE/EE375CF1C176A17E.jpg

4

K+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

K+

K+

K+

K+H+

K+

K+

K+

NHE Familie

Na+

H+

H+

H+

H+

http://3imgsrv.fotofinder.com/archive/thumbnail/EE/EE375CF1C176A17E.jpg

5

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

K+

K+

K+

H+K+

K+

K+

NHE Familie

Na+

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+

K+

H+

H+

Na+-K+-Transport

http://3imgsrv.fotofinder.com/archive/thumbnail/EE/EE375CF1C176A17E.jpg

6

K+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+Na+

K+

K+ K+

K+

K+

K+

K+

NHE Familie

Na+

Na+

Na+

Na+Na+

Na+

Na+

K+

Na+-K+-Transport

K+

K+

K+ K+

K+

Leak-Transport

Na+, K+

http://3imgsrv.fotofinder.com/archive/thumbnail/EE/EE375CF1C176A17E.jpg

77

Na+/K+-Transport

Natrium-Kalium-Pumpe

3 Natrium raus2 Kalium reinunter ATP Verbrauch (gegen Konzentrationsgefälle)

http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Scheme_sodium-potassium_pump-de.svg&filetimestamp=20100611205409

88

Leak-Transport

Definition:Unidirektionaler K+ und Na+ Einfluss und Ausfluss während alle bekannten Transportwege (Pumpen, Kanäle, Carrier) inhibiert sind

durch Ouabain + Bumetanide + EGTANa+/K+ Pumpe, der Na+/K+/2Cl- Kotransport und der Ca2+-aktivierte K+ Kanal sind inhibiert

Der "leak" Na+ Fluss ist komplizierter als der "leak" K+ Fluss Größere Anzahl von spezifischen Transportsystemen

Der "leak" K+ und Na+ Transport kann nicht über Elektrodiffusion erklärt werden

99

NHE

Transmembrane Antiporter (Na+/H+ Austauscher)

Regulieren den pH-Wert und die Ionenhomöostase

Wird durch verschiedene Signalwege reguliert

Hoch konserviert bei den Säugetieren

Neun Isoformen NHE1 bis NHE9

1010

Zwölf transmembrane Segmentantiporter

Im neutralen pH sind die NHEs inaktiv; Aktivierung erfolgt bei Ansäuerung

Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007

Struktur des Na+/H+ Austauschers

1111

NHE-Familie

NHE 1in nahezu allen Geweben, Zelltypen und Spezies

Konstanthaltung von pH und ZellvolumenReguliert die ProliferationAktivierung des Na+/H--Austauschs durch intrazelluläre Säurebelastung

NHE 2vor allem im Gastrointestinaltrakt (Magen und Darm)

ähnliche Aufgaben wie NHE1

1212

NHE 3Beim Menschen in Niere und Dünndarm, aber auch in vielen anderen Geweben zu finden

Volumenregulation

NHE 4beim Kaninchen im Magen exprimiert, mittelstark im Dünndarm und Kolon und schwach in Niere, Gehirn, Herz, Uterus, Skelettmuskel und Leber

Könnte an der Volumenregulation beteiligt sein

1313

NHE 5im Gehirn hoch exprimiert

NHE 6nur in den Mitochondrien, Herz, Gehirn, und Skelettmuskel

pH-, Volumen- und Elektrolytregulation

1414

NHE-7

kommt im Golgi-Netzwerk, Endosomen und Plasmamembran vorreguliert die Ionenhomöostase

Durch intrazelluläre Akkumulation von Ca-Ionen und die Bindung von Calmodulin (CaM) aktiviert (Bindung an IL2)

1515Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007

1616

Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007

1717

NHE-8

Am proximalen Tubulus der Niere entdecktim ER (endoplasmatisches Retikulum) und bis zum trans Golgi nachweisbar

Elektrolyttransport

NHE9

Im späten Endosom

1818

Versuchsablauf

Gewinnung von Blut

Isolierung der Membranproteine

Trennung der Proteine nach Größe mittels SDS-Page

Anfärben über Coomassie-blau

Western Blot

Detektion mit Antikörpern

1919

http://o.elobot.de/s/bot6/01307.jpg

2020

http://o.elobot.de/s/bot6/01307.jpg

2121http://www.imb-jena.de/~rake/Bioinformatics_WEB/gifs/sds_page1.gif

2222

Proteine roter Blutkörperchen nach der SDS-Gelektrophorese und Coomassie-Färbung

Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

2323

http://www.medizin.uni-greifswald.de/physiol/images/blot.jpg

2424http://www.leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/WesternBlotFinal.gif

2525

Western Blot zum Nachweis des NHE 7 mit Antikörpern

Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

2626

Ausblick

Weitere Nachweise mittels verschiedener Methoden:

MALDI-ToF

Kapillarelektrophorese

Flüssigchromatographie

Polymerase-Kettenreaktion

2727

Referenzen

Attaphitaya S, Park K and Melvin JE. Molecular cloning and functionalexpression of a rat Na+/H+ exchanger (NHE5) highly expressed in brain.J Biol Chem 274: 4383-4388, 1999.Baird NR, Orlowski J, Szabo EZ, Zaun HC, Schultheis PJ, Menon AGand Shull GE. Molecular cloning, genomic organization, and functionalexpression of Na+/H+ exchanger isoform 5 (NHE5) from human brain. JBiol Chem 274: 4377-4382, 1999.Bookstein C, DePaoli AM, Xie Y, Niu P, Musch MW, Rao MC andChang EB. Na+/H+ exchangers, NHE-1 and NHE-3, of rat intestine.Expression and localization. J Clin Invest 93: 106-113, 1994.Bookstein C, Musch MW, DePaoli A, Xie Y, Rabenau K, Villereal M,Rao MC and Chang EB. Characterization of the rat Na+/H+ exchangerisoform NHE4 and localization in rat hippocampus. Am J Physiol 271:C1629-38, 1996.Goyal S, Vanden Heuvel G and Aronson PS. Renal expression ofnovel Na+/H+ exchanger isoform NHE8. Am J Physiol 284: F467-F473,2003.

2828

Hoogerwerf WA, Tsao SC, Devuyst O, Levine SA, Yun CH, Yip JW,Cohen ME, Wilson PD, Lazenby AJ, Tse CM and Donowitz M. NHE2and NHE3 are human and rabbit intestinal brush-border proteins. Am JPhysiol 270: G29-41, 1996.Kapus A, Grinstein S, Wasan S, Kandasamy R and Orlowski J.Functional characterization of three isoforms of the Na+/H+ exchangerstably expressed in Chinese hamster ovary cells. ATP dependence,osmotic sensitivity, and role in cell proliferation. J Biol Chem 269: 23544-23552, 1994.Lang J, Untersuchungen zur Existenz von NHE-Isoformenin Plasmamembranen humaner Erythrozyten 2012Numata M and Orlowski J. Molecular cloning and characterization of anovel Na+,K+/H+ exchanger localized to the trans-Golgi network. J BiolChem 276: 17387-17394, 2001.Numata M, Petrecca K, Lake N and Orlowski J. Identification of amitochondrial Na+/H+ exchanger. J Biol Chem 273: 6951-6959, 1998.Pizzonia JH, Biemesderfer D, Abu AA, Wu MS, Exner M, Isenring P,Igarashi P and Aronson PS. Immunochemical characterization ofNa+/H+ exchanger isoform NHE4. Am J Physiol 275: F510-F517, 1998.Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007

2929

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit

3030

3131

http://www.zum.de/Faecher/Materialien/beck/bilder/cellm7.jpg