BIOCHEMIE

Elektrophorese, Immunodetektion

Regulation der bestehenden Enzymmenge

• Post-translational durch reversible, kovalente Modifikation (Phosphorylierung, Reduktion)• pH-Wert, (Co-)Substratkonzentration• Effektoren• Enzym-Inhibitorprotein-Interaktionen (14-3-3 Proteine)

Regulation von Enzymaktivitäten - Ebene 1 -

Enzyme können auf folgenden Ebenen reguliert werden

Enzymreinigung Chromatographie

Regulation von Enzymaktivitäten- Ebene 2 -

Regulation der Enzymproteinmenge Genexpression

• Transkription (Induktion/Repression)• Splicing, mRNA Stabilität• Translation• Proteolytischer Abbau

Enzymproteingehaltsbestimmung Elektrophorese, Blotting

ElektrophoresePrinzip

„Wanderung eines geladenen Teilchens im elektrischen Feld“

Proteine, DNA, RNA, organische Säuren, Kationen etc.

Aminosäuren sind amphotere/zwitterionische Verbindungen

Elektrophoretische Trennung von Proteinen

Proteine weisen positive und negative Ladungen auf ihrer Oberfläche auf.

Matrices bzw. GelePolyacrylamidgele

Stabilisierungder wanderndenProteinbandenin Gelen

Die Monomerkonzentrationen bestimmen die Porengrössender Polyacrylamidgele

Matrices bzw. GelePolyacrylamidgele

T [%] = (a + b) * 100 / VC [%] = b * 100 / (a + b)

a....Gewicht an Acrylamidb....Gewicht an MethylenbisacrylamidV....Volumen in mL

Zusammenhang zwischen Porengrösse und %T sowie %C

Fall AC konstant T erhöht

Porenweite sinktFall BT konstant C erhöht

PeakverteilungMinimum bei 4% C,

bei höheren und niedrigeren Konzentrationen nehmen die Porengrössen wieder zu

Geometrie der Gelelektrophorese

Rundgele vs.Flachgele

horizontal vs.vertikaleSysteme

Elektrophorese-Apparaturen

Elektrophoretische TrennprinzipienPolyacrylamid-Gelelektrophorese

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Isoelektrische FokussierungBildung des pH-Gradienten

Trägerampholyte sind Oligoamino-oligocarboxylsäuren

Sie weisen ver-schiedene Isoelek-trische Punkte auf

Elektrophoretische Mobilität vTrennung von Proteinen erfolgt aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilität

++

+

+-

--

- ---

+

+++

++--

--

+ -

Ano

de

Kat

hode

v = E . z / (6 r) E...elektr. Feld...Viskosität

• Nettooberflächenladung z pH-abhängig

• Molekülgrösse, -form r Stoke`scher Radius

diskontinuierliche PAGEKombination aus Isotachophorese

und Zonenelektrophorese

native PAGE

• keine Proteindenaturierung

• Proteintrennung auf Basis Oberflächenladung und Grösse d.h. Proteine verschiedener Molekülgrösse können in der nativen PAGE gleich schnell wandern

• kann auch zur Reinigung nativer Proteine eingesetzt werden

• optimierbar über Pufferzusam- mensetzung, pH-Wert und Porengrössen

SDS-PAGESodium dodecylsulphate

SDS ist ein anionisches Detergens, das in stöchiometrischem Verhältnis von 1.4 g SDS je an 1 g Protein bindet

Hierbei wird die native Konfiguration in eine ellipsoide K. aufgefaltet

SDS-PAGEVorteile

• die Oberflächenladungen der Proteine werden maskiert

• die Menge der „neuen“ negativen Ladungen korrelieren mit der Masse des Proteins (in Dalton)

• alle Proteine besitzen nach der Auffaltung diesselbe Konfiguration

• die Trennung erfolgt folglich nach Molekularmasse der Proteine

• Ausnahmen: Glykoproteine, Peptide < 15kDa

Auswertung des Molekulargewichts

Kalibration

Relative Mobilität gegen log Molekularmasse ergibt lineare Beziehung

Kalibration mit Polypeptidenbekannter Molekularmasse

SDS-PAGEBeispiel Gradientengel Coomassiefärbung

Porengrössenverteilung im Gel kontinuierlich ansteigend

gewährleistet hohe Trennleistung und Schärfe über weiten Molekularmassenbereich von Proteinen

Visualisierungunspezifische Färbungen

Allgemein erfolgt nach der PAGE eine Fixierung der Polypeptidbanden mit Alkoholen/Säuren oder durch Blotting

FärbungCoomassieblau-Färbung (> 1 ng pro Proteinbande) siehe auch

Bradford-Assay

Silber-Färbung (20-200x sensitiver)

# Verstärkung der Ag+-Bindung (Glutaraldehyd)# Ag+-Imprägnierung# Waschung# Entwicklung: Ag+-Reduktion zu Ag am Protein

Visualisierung der Polypeptidbandenunspezifische Färbungen

Visualisierungweitere Varianten

Enzymaktivitätsfärbungen

• nur bei nativer PAGE

• künstliche Substrate / Cofaktoren

• Bildung eines unlöslichen Produktes in der Enzymreaktion

Autoradiographie von markierten Proteinen

Western-BlottingPrinzip

Immobilisierung von Proteinbanden durch Transfer aus dem Gel auf proteinbindende Membranen

spezifische Polypeptiddetektion auf der Membran meist per Immunodetektion, die in PAGelen nicht möglich wäre (MG)

Transfer wird meist elektrophoretisch durchgeführt(Elektroblotting)

Typische Membranen bestehen aus Nitrocellulose, Nylon oder PVDF (Polyvinylidendifluorid)

Western BlottingDurchführung

Antigen-Antikörper-Reaktion

Antikörper -Aufbau -Konfigu- ration

Paratope

Antigen-Antikörper-ReaktionAntigen-Determinanten

Epitope

ImmunodetektionAblauf

Primärer Antikörper

SekundärerAntikörper

Nachweisreaktion

ImmunodetektionNachweisreaktion

Ausblick