Anwendung der diskontinuierlichen Polyacrylamidgel ...Anwendung der diskontinuierlichen...

Anwendung der diskontinuierlichen Polyacrylamidgel-Elektrophorese in der Taxonomie der Gattung

Nodulosphaeria Rbh. (Ascomycetes)

Von

.I URG B. BUCHER Birmensdorf/ZH

1. Einleitung und Problemstellung

Nach HEYWOOD (1971) steht die Systematik der Pflanzen gegenwärtig am Beginneiner neuen Periode. die vorwie gend durch bedeutende Entwicklnngen von Methodenund Ideen der Chemosystematik und der Numerischen Taxonomie gekennzeichnetist. Die wichtigsten Beiträge dieser Entwicklungen sind u. a. bei SWAIN (1963).HAWKES (1968), HEYWOOD (1968) und H.ARBORNE (1970) sowie SOKAL und SNEATH(1963) zusammengestellt.

In der Pilzsystematik läuft die Entwicklun g ähnlich (vgl. HALL 1969. TYRRELL1969). Bis anhin bildeten die morphologischen Merkmale, vorwiegend der reproduk-tiven Organe, die Grundlage für die systematische Einteilung der Pilze. Das Heran-ziehen von biochemischen Kriterien für die Klassifizierun g verma g aber auch bei denPilzen sowohl im Bereich höherer Taxa, zum Beispiel Lysin-Biosynthese (VOGEL1963), Tryptophan-Biosynthese (HOTTER und DEMoss 1967). Zellwandchemismus(BARTNICKI-GARCIA 1968) wie im Bereich von Gattungen und Arten, zum BeispielSerologie (SEELIDER 1968) neue zum Teil überraschende Gesichtspunkte zu ent-wickeln. Eine weitere Methode, die in der Taxonomie niederer Taxa Erfolg ver-spricht. ist die Gelelektrophorese löslicher Myzelproteine.

Die besondere Stellung der Proteine in der biochemischen Systematik lässt sich ausder Ein-Gen-Ein-Enzym-Hypothese (BEADLE und TA-rum 1941) folgern (zum BeispielSIBLEY 1962, LEONE 1964). Der Ver gleich der Enzymstruktur verschiedener Or ga-nismen kommt nach den in HALL (1969) zitierten WILSON und KAPLAN (1964) demVergleich des genetischen Materials gleich. Durch die genetische Festlegung derAminosäuresequenz werden Grösse, Form und amphoterische Eigenschaften einesProteinmoleküls bestimmt. Da nach SMITHIES (1959) diese Eigenschaften auch dieelektrophoretische Bewe glichkeit bestimmen. könnten die durch die Gelelektrophoresedargestellten Proteinspektren (Phero gramme) einen grossen taxonomischen Wert be-sitzen.

126 Vierteljahrsschrift der Naturforschenden Gesellschaft in Zürich 1974

Seit den ersten Untersuchungen von CHANG et al. (1962) an Neurospora spp. undCLARE (1963) an Pythium spp. versuchten mehrere Forscher (vgl. HALL 1969) pilz-liche Proteine, resp. Enzyme , mittels einer diskontinuierlichen Acrylamid- oder einerStärke gelelektrophorese zu trennen und die daraus resultierenden Pherogramme taxo-nomisch auszuwerten. Einer allgemeinen Anwendun g der Diskelektrophorese in derSystematik stehen allerdings noch mehrere Schwieri gkeiten im Wege. Probleme ent-stehen einerseits aus den Kulturansprüchen und der Entwicklung der Pilze undanderseits aus der Auswertun g und Interpretation der Pherogramme. Die bis jetztveröffentlichten Arbeiten, die ^ für oder gegen eine Anwendung der Diskelektro-phorese sprechen, lassen sich infolge der zum Teil stark abweichenden Methodiknicht vergleichen. HALL (1969) sieht deshalb in der Standardisierun g der Methodeein vordringliches Ziel. Da sich die meisten Untersuchungen auch auf Pilzgruppenschwieriger morphologisch taxonomischer Stellung beziehen , bedarf die Anwendungsolch neuer biochemischer Kriterien noch vermehrter Arbeiten an Gruppen mit be-kannter systematischer Einteilung.

Unsere Untersuchun gen sollen anhand der Ascomycetengattung NoclulosphaeriaRbh. (Pseudosphaeriales) die taxonomische Bedeutun g von Protein- und Enzym-pherogrammen prüfen. Die Gattung wurde in neuerer Zeit von HOLM (1957 und1961) bearbeitet und setzt sich grösstenteils aus morphologisch gut differenziertenArten zusammen. Die untersuchten Arten erwiesen sich in eigenen Laborversuchenals homothallisch und bildeten keinerlei reproduktive Organe in Schüttelkulturen, sodass am vegetativen Thallus keine erschwerenden Einwirkun gen auf den primärenStoffwechsel (vgl. HALL 1967, SH1PTON und MCDONALD 1970) zu erwarten sind.

2. Material und Methoden

2.1. Material

Die zur Untersuchung herangezogenen Pilzarten sind in Tabelle 1 zusammen gestellt. Die Pilzesammelten wir jeweils in den Monaten Mai bis August auf ihIen Wirtspflanzen in den Alpen derSchweiz (CH), Österreichs (A), Jugoslawiens (NU). Frankreichs (F) und Italiens (I). Zur Bestim-mung der 1NodulosphaeriaArten wurden die Schlüssel von HOLM (1957 und 1961) herangezogen.

Tabelle I. Liste der untersuchten .Nodulosphaeria-ArtenN.-ArtETH-Stanun-Nr. 1Virtsubstrat

A'. aquilana (D. S.Acc.) L. HOLst

M 8101 Hieraciunr sp.NI 8102 Hieraciunr sp.

N. centaureae (MÜLLER) L. HOLSI

Fundort

Bedoin (Vauctuse/F) 26. 5.70Col de Montets (Hte Savoie/F) 21. 7. 70

M 8103 Centaurea Scabiosa L. Wiesen (GR'CH) 27. 7. 701NI 8104 Ceutaurea Scabiosa L. St. Jakob i. R. (Kärnten/A) 13. 6. 71NI 8105 Ceutaurea Scabiosa L. Nlojstrana (Slowenien /YU) 18. 6. 71

Furkapass (UR CH) 21. 7. 70

Blatten (VS/CH) 17. 5. 70Klosters (GR/CH) 20. 7. 70'Petzen (Kärnten!A) 15. 6. 71Goggausee (Kärnten, A) 16. 6. 702Mojstrana (SlowenienjYU) 18. 6. 71Buchenegg (ZH/CH) 4. 7. 71La Rösa (GR/CH) 31. 7. 71S. Carlo (GR/CH) 4. B. 71Mojstrana (Slowenien YU) 18. 6. 71

Wiesen (GR/CH) 27. 7. 70'

Ste Marguerite (Vauci. F) 25. 5. 70:1

Jahrgan g 119 J. B. BUCHER. Elektrophorese in der Taxonomie von Nodulosp/raeria 127

N-.-\rtETH-Stamm-Nr. \Virtsubstrat

N. Cir.sii (KARST.) L. HOLM

Fundort

M 8106M 8108M 8109M 8110M 8111M 8112M 8113M 8114NI 8115

Carduus defforatus L.Cirsium arvense (L.) SCOP.Cirsium arvense (L.) SCOP.Cirsium arvense (L.) SCOP.Cirsium sp.Cirsium palustre (L.) SCoP.Cirsitarr sp.Cardutrs defforatus L.Carduus defloratus L.

Furkapass (UR/CH) 21. 7. 70Saualpe (Kärnten/A) 17. 6. 71Saualpe (Kärnten/A) 17. 6. 71Petzen (Kärnten/A) 15. 6. 71Petzen (Kärnten; A) 15. 6. 71Hochobir (Kärnten/A) 14. 6. 71Böschi (SZ/CH) 27. 6. 71'-Isola (GR/CH) 26. 7. 71La Rösa (GR/CH) 31.7. 71

N. derasa (BERK. et BR.) L. HOLM

NI 8116NI 8117NI 8118NI 8119

Seized() alpinus (L.) ScoP.Senecio Jacobaea L.Senecio rremorensis L.Senecio Doronicum L.

Unterchäseren (SG/CH) 18. 6. 70Frohburg (SO//CH) 26. 7. 70Petzen (Kärnten/A) 15. 6. 71Leg Grevasalvas (GR:CH) I. 8. 71

N. dolioloides AuERSw.

NI 8120 Achillea Mille%olimn L.

N. er_vthrospora (RiEss) L. HoLNI

M 8121 Clematis vitalba L.NI 8122 Adenostyles Alliariae (GOUAN) KERNERNI 8123 Senecio nemorensis L.M 8124 Arurrcus dioecus (WALTER) FERNALDM 8125 Buphthalmum salicifoliunt L.NI 8126 Stachvs silvatica L.NI 8127 Carduus defforatus L.M 8128 Cirsium arvense (L.) ScoP.NI 8140 Centaurea Scabiosa L.

N. Fruticuttr (Ros. ex. DESSt.) L. HOLM

NI 8129 Ononis repens L.

N. gallica L. HOLM

M 8130 Laserpitium gctllicum L.

N. Alarhieui (WEST.) L. HOLM

M 4821NI 8132M 8133NI 8134M 8135

Casranea sativa MILLERCirsium spinosissimunt (L.) ScoP.Centaurea Scabiosa L.Bupluhalrnum salicifolium L.Cirsium sp.

Tessin (CH) 19644Les Rangiers (BE/CH) 26. 7. 70Mojstrana (SlowenieniYU) IS. 6. 71Mojstrana (SlowenienjVU) 18. 6. 71Buchenegg (ZH /CH) 4. 7. 71

N. modesta (Desm.) MUNK ex L. HOLM

NI 8141M 8142NI 8143NI 8144M 8145NI 8146NI 8147NI 8148

Centcrurea Scabiosa L.Cirsium spinosissimunt (L.) ScoP.Plantago media L.Valeriana tripteris L.Aconitum Napellus L.Prenantkes purpurea L.Laserpitium siler L.Centaurea Scabiosa L.

Furkapass (UR {CH) 21. 7. 70Furkapass (UR/CH) 21. 7. 70Les Rangiers (BE CH) 26. 7. 70Alp Palfries (SG„ CH) 2. S. 70Alp Palfries (SG/CH) 2. S. 70Hauenstein (SO/CH) 9. 8. 70Mojstrana (Slowenien /YU) 18. 6. 71Mojstrana (Slowenien YU) IS. 6. 71

Fundort

Samnaun (GR/CH) 6. 8. 71Samnaun (GR/CH) 6. 8. 71Isola (GR/CH) 26. 7. 71Samnaun (GR/CH) 6. 8. 71Samnaun (GR/CH) 6. 8. 71Passo di Resia (l) 5. 8. 71Alpe Campo (GR/CH) 31. 7. 71Alpe Campo (GR/CH) 31. 7. 71Passo di Resia (I) 5. 8. 71


N-ArtETH-Stamm-Nr. Wirtsubstrat

NI 8149 Senecio rremorerrsis L.M 8150 Valeriana momenta L.M 8151 Aconitum Napellus L.N 18152 Aconitum l vcoctomun L.NI 8153 Aconitun Napellus L.NI 8154 Knautia arrensis (L.) COUITER em. DUBYM 8155 Aconitum: Napellus L.NI 8156 Senecio abrotanifofius L.M 8157 Laser pitium prutenicum L.

N. robusta (STRASSER) L. HOLM

Nl 8136NI 8137M 8138M 8139

Senecio nemorensis L.Senecio nemorensls L.Senecio rremorerrsis L.Senecio nemorensis L.

Stillberg (GR/CH) 30. 7. 701Petzen (Kärnten/A) 15. 6. 71Petzen (Kärnten/A) 15. 6. 71Isola (GR/CH) 26. 7.71

N. septemce/hrlata (Müt-LER) L. HOLM

NI 8158

Bupht/ra/rnum salicifoliumr L. Weesen (SG/CH) 14. 6. 70NI 8159

Buphtha/mum salicifo/ium L. Hochobir (Kärnten/A) 14. 6. 71M 8160

Bup/mha/mnrn salictfoliurn L. Mojstrana (Slowenien/YU) 18. 6. 71

r Leg. E. MÜLLER.Leg. M. DREYFUSS.

3 Leg . J. KRUG.'' Isolation F. CASAGRANDE (alle anderen Stämme sind eigene Isolationen).

Die verwendeten Reagenzien und Substanzen entsprachen mindestens dem Reinheitsgrad«puriss.». Das Myzel für die Proteinextrakte wurde in einer Malzextraktlösung (Wander, Bern/CH)kultiviert. Für die Proteinstandardisierung wurde Biuret-Reagens und Human-Protein-Standard vonder Firma Merz & Dade (Bern;CH) bezogen. Die Firma Serva (Heidelberg/D) lieferte die Sub-stanzen für die Polyacrylamidgele sowie die Substrate und Farbstoffe für die Enzym-, bzw.Proteinnachweise.

2.2. Methoden

2.2.l. Isolierung

Zur Isolation wurden die Pseudothecien für wenige Sekunden in einer 2% igen Formalinlösunggeschwenkt und in sterilem Wasser gequetscht. Teile der Fruchtschicht wurden zu mikroskopischenUntersuchun gen über die Artzugehörigkeit und Sporenmessungen herangezogen, der Rest in wenig,sterilem Wasser aufgeschwemmt, ausgeplattet und während 12 Stunden bei Zimmertemperatur inMalzagar (2%)-Petrischalen stehen gelassen. Unter dem Mikroskop ausgelesene, gekeimte Asco-sporen liessen sich als Einsporisolationen in Malzagar (2%)-Röhrchen kultivieren. Nach einemdreiwöchi gen Wachstum bei 21`C wurden die Kulturen bei 3'C gela gert und alle 7-8 Monateerneut überimpft. Das Alter der in den Untersuchungen verwendeten Reinkulturen betrug höch-stens zwei fahre.

2.2.2. Kulturmethoden

Das zur PIoteingewinnun g benötigte Pilzmyzel wurde submers in Schüttelkulturen (160 U/min.)bei 21'C und diffusem Licht gezogen. Pro 500-ml-Erlenmeyerkolben verwendeten wir 100 ml

Jahrgang 119 J. B. BUCKER. Elektrophorese in der Taxonomie von Nochrlosphaeria 129

2% iges Malzextraktwasser (pH 6,4 nach einer 20minütigen Autoklavierung) als Nährmedium. DasImpfmaterial bestand aus standardisierten Myzelstücken, die durch einen KorkbohIer (_) 5 mm)aus einer Petrischale gestanzt wurden. Da das Flächenwachstum einiger Arten auf Malzagar äusserstlangsam war, mussten die Petrischalen (17,5 ml 2% i ger Malzagar/Platte) vorgängig mit eineraus den Kulturröhrchen stammenden homogenisierten Myzelmasse beimpft und bei 21°C währendeiner Woche inkubiert werden.

Das Alter des zur Proteinextraktion verwendeten Myzels variierte von Art zu Art und wurdeso angesetzt, dass der Extraktionszeitpunkt in die Mitte der ersten linearen Wachstumsphasefiel (vgl. Abschnitt 3.1.4.).

2.2.3. Extraktion der löslichen Myzelproteine

Das für die Untersuchung benötigte Myzel wurde durch eine Vakuumfiltration nach zwei-maligem Waschen mit kaltem destilliertem Wasser gewonnen. Dem für die Extraktion vorgekühltenMyzel gaben wir eine äquivalente Men ge kalten Extraktionspuffer zu und homogenisierten es unterBeimischung von wenig, feinem Quarzsand bei 3°C während 15 Minuten in einem vorgekühltenMörser. Der von DURBIN (1966) verwendete 0,l-M-Trispuffer von pl-I 7,8 wurde leicht modifiziert:die Saccharosekonzentration wurde auf 15% gesenkt, dafür wurde wie bei RASstuSON undRUJiN (1971) 0,001 M EDTA und 2% Polyvinylpyrrolidon (:MG 24000) zugegeben. Die Homo-genate wurden in einer MSE-Kühlzentrifuge bei 0" C und S7 000 g während 15 Minuten gereinigt.Der Leberstand liess sich mit einer proportionalen Menge Sephadex G 50 coarse einengen und teilsvon Salzen und niedermolekularen Pro teinen befIeien (MIKEs 1965). Anschliessend wurde noch-mals zu den gleichen Bedingun gen zentrifugiert und das Sediment verworfen. Die gereinigtenExtrakte wurden mit Extraktionspuffer nach der Biuret-Methode (RACUSEN und JOHNSTONE 1961)auf 750 y Protein/0.l nil Extrakt standardisiert. Aus arbeitstechnischen Gründen mussten wir dieExtrakte einfrieren und lagern (-20°C). Wir un te rteilten die Extrakte in kleine Proben, so dass wirausgehend von einem Extrakt unabhängige Untersuchun gen durchführen konnten. Es wurden nureinmal eingefrorene Extrakte für die Analysen verwendet.

2.2.4. Elektrophorese

Die elektrophoIetische Auftrennung der löstichen Myzelproteine erfolgte über ein diskontinuier-liches System von Polyacrylamid-Gelen (ORNSTEIIv und DAVIS 1964); im wesentlichen nach der vonMAURER (1968) beschriebenen Standardmethode. Verwendet wurde Gelsystem la mit einem pH von8,9 und 7% Acrylamid im Trenngel für die Esteraseanalysen und 10% Acrylamid für die all-gemeinen ProteinunteIsuchungen. Die Gele setzten sich aus 0,15 ml Sammelgel und 0,95 ml Trenngelzusammen. ElektIophoriert wurde im Kühlschrank während ca. 100 Minuten in einem einfachenGerät aus Plexiglas für 12 zylindrische Gele (Innenmasse der Gelröhrchen: 4,7 > 75 min. DieRöhrchen wurden jeweils während 24 Stunden in Dichromschwefelsäure gereinigt und in Wasserund einer 0,5% i gen Tween 80-Lösung gespült). Strom lieferte zu konstanten Bedingungen einShandon-Vokam-Netzgerät. Die Stromstärke betrug 2.5 mA pro Gel. Zur Frontmarkierung dienteeine 0,001% ige Bromphenolblaulösung (zu ca. 0,5% im Kathodenpuffer).

2.2.5. Nachweis der löslichen Proteine und Enzyme nach derElektrophorese

?. 7 .5.I. Allgemeine Proteine

Die Proteinbänder der Gele wurden mit Coomassie Brillant Blue R250 (ST. GROTH et al. 1963)nachgewiesen. Die spezifische Proteinfärbung beruht auf elektrostatischen und van-der-Waals-Bindungen zwischen Farbstoff und Protein. Die Gele wurden in einer 0,25% i gen Coomassie-lösung (Methanol-Eisessig-Wasser = 5: 1 : 5) während 8 Minuten gefärbt und anschliessend in

130 Vierteljahrsschrift der Naturforschenden Gesellschaft in Zürich

1974

7% iger Essigsäure durch Auswaschen des ungebundenen Farbstoffs entfärbt (mod. nach MEYER undLAMBERTS 1965). Die Gele konnten in 7 0.0 iger Essigsäure in Pillengläschen aufbewahrt werden.

2.2.5.2. Esterasen

Die Methode für den Esterasenachweis beschrieb FERET (1971); sie stammt von BREWBAKER et al.(1968). Die Gele wurden in einem frisch zubereiteten. kalten Gemisch von 0,2 NI Phosphatpuffermit pH 7 enthaltend 0,1% Fast Blue RR und 2% einer 1%igen y.-Naphthylacetat-Lösung (Sub-strat in 70% Aceton gelöst) während 25 Minuten im Kühlschrank inkubiert. Die Esteraseaktivitätmanifestierte sich in der braun-schwarzen Farbe des reduzierten Diazoniumsalzes. Die Gele liessensich ebenfalls in 7% iger Essigsäure auf bewahren.

22.6. Auswertun g der Gele

2.2.6.1. Protein-Pherograrmne

Infolge der starken Untergrundfärbung, die die Beurteilung nahe beieinander liegender Bänder er-schwerte, konnten die Gele erst nach einer Entfärbezeit von 2-4 Wochen ausgewertet werden. DiePherogramme, das heisst die durch die Diskelektrophorese dargestellten Proteinspektren, wurdendensitometrisch mit einem Chromoscan NIKII (Joyce & Loebel) und ergänzend durch eine Leucht-pultbetrachtung erfasst. Mit dem Densitometer waren 70-80% aller von Auge sichtbaren Protein-bänder. nachweisbar. In den taxonomischen Untersuchungen wurden die Proteinphero gramme gra-phisch dar gestellt, wobei wir die Intensität der Bänder subjektiv in 4 Stufen (stark. mittel, schwachund sehr schwach; vgl. Abb. 17) berücksichtigten.

2.2.6.2. Esterase-Pherogranune

Im Gegensatz zu den Proteinpherogrammen liessen sich die Esterasepherogramme (Zymo-g ramme) nach Abtrennen des Sammelgels photographisch auswerten. Verwendet wurde ein Ilford-Pan-F-Film von 18 Din.

2.2.6.3. Taxonomische Beziehungen

Die taxonomischen Beziehungen oder relativen Verwandtschaften zwischen Pherogrammen ver-schiedener Stämme wurde mit Hilfe von Ähnlichkeitskoeffizienten (WHITNEY et al. 1968. SORENSONet al. 1971) ausgedrückt. Der Ähnlichkeitskoeflizient C, errechnete sich wie folgt:

C = a 6 c '

dabei bedeutet «a» die Anzahl gemeinsamer Bänder zweier Pherogramme. «b» Anzahl der Bänder,die nur im ersten Pherogramm und «c» Anzahl der Bänder, die nur im zweiten Pherogramm vor-kommen.

Die Beurteilung gemeinsamer Bänder war bei den Protein- und Esteraseuntersuchungen ver-schieden. Infol ge der relativ grossen Streuung der Re-Werte (relative Distanz eines Bandes zurFront der Markiersubstanz) von einzelnen Proteinbändern und der hohen Anzahl der nachgewiesenenProteine, musste neben dem ungefähren R,-Wert auch die Intensität zweieI Bänder überein-stimmen, um bei der Auswertung als gleichwertig anerkannt zu werden (vgl. Abschnitt 4.3.). Bei denEsterasephero grammen wurde die Intensität der Bänder nicht mehr berücksichtigt. Die Identitätzweier Bänder konnte da durch eine Koelektrophorese von Mischextrakten (JOHNSON et al. 1967,SHIPTON und FLEISCHMANN 1969, FERET 1971) überprüft werden (vgl. Abschnitt 4.7.); den R;-NVerten kam deshalb nur noch eine sekundäre Bedeutun g zu.

Jahrgang 119 J. B. BUCHER. Elektrophorese in der Taxonomie von Nodulosp/taeria 131

Die taxonomischen Beziehungen zwischen den verschiedenen Stämmen wurden jeweils in einerDreieckmatrix der Ähnlichkeitskoeffizienten zusammengefasst. Auf eine Klassenbildun g und Schraffur(vgl. SOKAL und SNEATH 1963) der Ähnlichkeitskoeffizienten-Matrix wurde verzichtet. die Gruppen-bildung der Stämme geht aus der Anordnung der Stämme in der Matrix und den ähnlichen Koeffi-zienten hervor.

3. Untersuchungen zur Methodik

Vorversuche nach einer für den Basidiomycet Coprinus Lagopus FR. aus gearbei-teten Methode der Proteinextraktion und der Elektrophorese (DEFAGO) führten bei

Nodulosphaeria-Arten zu unbefriedi genden Pheroarammen. Die Optimierung derMethodik zwang uns zu umfangreichen Untersuchun gen, die sich nicht nur auf die

rein technischen Belange beschränkten, sondern auch die biologischen Aspekte der

Kulturbedingun gen berücksichti gen mussten. Als Massstab für die Methoden diente

die Qualität der Phero gramme, das heisst eine optimale Bandenanzahl bezüglich

der Auswertung und Interpretation, sowie die Schärfe und die Verteilung der Bän-

der in der gesamten Ausdehnung des Gels.

Für die Untersuchun gen zur Methodik wurden die folgenden Stämme verwendet:

M 8104 (N. centaureac). M 8106 (N. Cirsü). M 8132 (N. Mathieui) nnd M 8159(AT. septeincelladata).

3.1. Allgemeine Proteine

Unter «all gemeinen Proteinen» verstehen wir die pufferlöslichen Proteine (vor-

wie gend Albumine und Globuline), die sich durch einen allgemeinen Proteinfarb-

stoff, wie Amidoschwarz oder Coomassie Blue , darstellen lassen.

3.1.1. Einfluss der Proteinextraktion

Der ursprünglich zur Extraktion verwendete 0.2 M Tris-HCI-Puffer mit pH 8.3

(DEFAGO) wurde zugunsten eines 0.1 M Tris-Puffers mit pH 7,8 nach DURBIN (1966)

verlassen. Um Störeffekten von phenolischen und anderer unerwünschten Substanzen

vorzubeugen. wurde diesem Puffer noch 2% Polyvinylpyrrolidon (MG 24000) zu-

gegeben (RAS\tusON und RUDIN 1971). Die Homogenisation im Mörser ergab eine in

qualitativer und quantitativer Hinsicht genü gende Konstanz der Proteinextraktion

(vgl. Abschnitt 3.1.6.). Eine mechanische Zellhomogenisation (Zellhomogenisator

Braun) nach MERKENSCHLAGER et al. (1957) genügte den Anforderungen nicht, da

die zähe, oft mit einem gallerti gen Schleim um gebene Mvzelmasse die der Zer-

kleinerun g dienenden Glaskugeln schluckte. Durch eine Zugabe von Sephadex G-50

nach der ersten Zentrifugation der Homogenate wurde die Qualität der Phero-

gramme in bezug auf die Bandtrennun g. Bandschärfe und Untergrundfärbung

(«noise») verbessert. Dieser Effekt dürfte auf eine Entsalzung und Konzentration

der Extrakte zurückzuführen sein (val. MIKES 1965).

12 VierteljahrsschriFt der Naturforschenden Gesellschaft in Zürich

1974

3.1.2. Einfluss der Proteinkonzentration der Extrakte

Der Nachweis der Proteine war in qualitativer und quantitativer Hinsicht von derProteinkonzentration des Extraktes abhängig. Die Proteinkonzentration wurde nachder Biuret-Methode (RACUSEN und JOHNSTONE 1961) bestimmt und mit Extrak-tionspuffer auf die gewünschte Men ge Protein verdünnt. Die ersten Proteinbänderliessen sich schon bei 50 y Proteinr auf 0.l ml Extrakt nachweisen. Mit zuneh-mender Proteinkonzentration stieg die Bandenanzahl. Bei sehr grossen Konzen-trationen wurde die Trennung naher Bänder durch eine zu starke Untergrund-färbun g erschwert, so dass die Entfärbezeit entsprechend verlängert werden musste.Optimale Resultate wurden mit 750 y Protein pro 0.1 nil Extraktlösung erzielt (Abb.1). Diese Menge , die auch STIPES (1970) benutzte, war bedeutend höher als dieder meisten bisherigen Untersuchun gen (zum Beispiel DURBIN 1966. GLYNN und REID1969).

3.1.3. Einfluss der Trenngellonzentration

Von den meisten Autoren wurde das von CHANG et al. (1962) verwendete7.50 0 ige Acrylamidgel zur elektrophoretischen Trennun g der löslichen Myzelproteinean gewandt. In unseren Versuchen zeigten sich jedoch bei verschiedenen Konzentra-tionen von Trenn gelen bedeutende Unterschiede in der Qualität der Pherogramme.Von den untersuchten Konzentrationen (7%. 10% und 15% Acrylamid) erwies sichdas 10%ige Gel am besten: Die Trennung der schnell wandernden und niedermole-kularen Proteine wurde ge genüber einem 7% ixen Trenngel erwartungsgemäss erhöht.ohne dabei den Nachweis der langsam wandernden und hochmolekularen Proteineauerschweren. Ein 15% iges Trenn gel verminderte die Bandanzahl wieder, da die Pro-teine in ihrer Beweglichkeit stark eingeschränkt waren und sich infolge des geringenAbstandes nicht mehr auswerten liessen (Abb. 2).

Bei der Gelzubereitun g und dem Nachweis der Proteine konnte das in MAURER(1968) beschriebene Vor gehen nicht immer befolgt werden. Einige Änderungen, diebedeutende Qualitätsverbesserungen der Phero gramme brachten, seien hier erwähnt.So wurde beim Überschichten der Sammel gellösun g vor der Polymerisation höch-stens 0.02 ml Wasser verwendet. Die Polymerisationszeiten von 20 Minuten für dasSammelgel und 30 Minuten für das Trenngel wurden um 5, respektiv 10 Minutenerhöht. Hin ge gen musste die 20minuti ge Färbezeit (0.25%ige Coomassielösung) auf8-10 Minuten verkürzt werden.

3.1.4. Einfluss der Wachstumszeit

Über den Einfluss der Wachstumszeit auf die Proteinspektren der Pilze liegen –im Gegensatz zu den höheren Pflanzen (v gl. BOULTER und THURMAN 1968) –unterschiedliche Ergebnisse vor. Nach CLARE (1963: Pythiurn spp.), CLARE et al. (1968:Fusarium spp., Phythoplrthora spp.. Saccharornyces spp., Schi_osaccharomvices spp.,Rhizoctonia spp.), DURBIN (1966: Septoria spp.) sowie GLYNN und REID (1969:Fusariurn spp.) lässt sich kein oder nur ein gerin ger Einfluss der Wachstumszeitauf die Proteinspektren feststellen. Diesen Untersuchungen stehen die Arbeiten von

Jahrgang 119 J. B. BUCHER. Elektrophorese in der Taxonomie von Nodulosphaeria

133

Abb. l. Einfluss der Proteinkonzentrationder Extrakte (y Protein%0.l ml Extrakt) aufdie Pherogramme (Densitometerkurven der

Pherogramme von N. Mathieui). e

0

7%

10%

15

e Abb. 2. Einfluss der Trenngelkonzentration (Den-sitometerkurven von N. R7athieui).

0

BENT (1967: Penicillium spp.). SEKHON und COLOTELO (1968: psychrophiler Basi-

diomycet) und MILTON et al. (1971: Verticillium spp.) entgegen.Zur Abklärung der Frage nach den wachstumsbedingten Veränderun gen des

Proteinspektrums wurden die Myzelproteine während 3 Wochen alle 3 Tage analy-

siert. Dabei konnten bei den in die Untersuchun g beigezogenen Nodulosphaeria-

e

3

6

9

12

15

18

21

TageIMy^elal^er)


Arten mehr oder weniger grosse Unterschiede von quantitativem und qualitativemCharakter der Proteinpherogramme festgestellt werden (Abb. 3). Während derlinearen Wachstumsphase (vgl. COCHRANE 1958) vereinheitlichten sich die Phero-gramme mehr und mehr (vgl. Abb. 3 und 4). Ein ähnliches Verhalten konnte in derstationären Phase des Wachstums beobachtet werden: die Proteinbandanzahl nahmjedoch mit zunehmendem Alter ab, und die Phero gramme wurden immer undeut-licher. Wahrscheinlich ist dies auf eine fortschreitende Autolyse in alten Kulturenzurückzuführen.

Abb. 3. Einfluss der Wachstumszeit (Densito-meterkurven von N. Cirsü).

Der Einfluss der Umweltsbedingun gen war auf das Wachstum der verschiedenenArten ziemlich unterschiedlich (Tab. 2). Es scheint uns deshalb für biochemischeUntersuchungen wichtig, wohl die Kulturbedin gungen, wegen des unterschiedlichenWachstumsrh ythmus aber nicht auch die Aberntezeit für alle untersuchten Artengleich festzusetzen. Wachstumsversuche erbrachten für Nodulosphaeriaarten ein ein-bis zweiphasisches Wachstum (Abb. 4, vgl. BRETZLOFF 1954). Um unter den ge-gebenen Bedingun gen bei den taxonomischen Untersuchun gen immer Kulturen des-selben physiologischen Alters vergleichen zu können, wurde der Extraktionszeit-punkt in die Mitte der ersten linearen Wachstumsphase gelegt.

M

8132

300

:r,Z

E

00

m 200 4E

3

M

8106

Jahrgang 119 J. B. BUGHER. Elektrophorese in der Taxonomie von Nodulosphaeria 135

Tabelle 2. Wachstum verschiedener Nodulosphaeria- Arten in (2%) Malzwasser in Schüttelkultur(mg Trockengewicht / 100 ml Nährlösun g . Mittelwerte aus 5 Wiederholungen)

MyzelalterNodulosphaeria-Art Myzelalter in Tagen bei Extraktion

6 9 12 15 18 21 in Tagen

N. aquilana (M 8102) 4 55 135 260 252 313 347 9N. centaureae (M 8103) 4 56 112 146 168 230 252 8N. Cirsii (M 8106) 2 7 48 89 140 195 180 12N. derasa (M 8117) 6 78 140 209 257 280 276 9N. dolioloides (NI 8120) 4 52 124 230 241 246 250 9N. e/rthrospora (M 8121) 5 88 222 274 312 344 368 8N. fraticutn (M 8129) 7 86 261 288 310 354 403 8N. gallica (M 8130) 5 68 210 221 318 315 336 7N. bfathieui (NI 8132) 6 56 146 248 254 264 370 9N. modesta (M 8145) 8 106 213 280 302 358 424 SN. robusta (M 8136) 3 44 108 294 304 268 274 10N. septemcellulata (NI 8158) 5 17 70 149 264 278 380 12

0 3 6 9 12 15 18 21

Myzelalter i n Tagen

Abb. 4. Wachstumskurven von N. Cirsii (M 8106) und .N.. Jarhieui (NI 8132) in Schüttelkulturen(2%-Malzwasser), => Extraktionszeitpunkt.


3.1.5. Proteinspektren von Einsporkulturen desselben Aus g angs-materials

Die Variabilität der Proteinspektren wurde anhand verschiedener Einsporkulturen

(alle aus demselben Fruchtkörper) mehrerer Nodulosphaeriaarten untersucht. DiePhero gramme der zur selben Art gehörenden Einsporkulturen glichen sich stark

(Abb. 5). Gewisse Unterschiede liessen sich in der Bandanzahl und Bandintensität

feststellen. Diese Unterschiede waren jedoch nicht gesichert, sie könnten sowohl von

der genetischen wie methodischen Variabilität herrühren (nach INGRAM 1957 führen

schon kleine Abweichun gen in der Aminosäuresequenz der Proteine zu bedeutenden

elektrophoretischen Beweglichkeitsunterschieden).

3

4

a

b

0

5

6

Abb. 6. Reproduzierbarkeit der Pherogramme vonN. Cirsii. a) I und II verschiedene Extrakte der-selben Einsporkultur; b) gleiches Extrakt, verschie-den lange Lagerung bei —20° C. 1. eine Woche;

2. ein halbes Jahr.

Abb. 5. Proteinspektren 6 verschiedener Einspor-kulturen desselben Fruchtkörpers (Densitometer-

kurven von N. Maihieui). e

3.1.6. Reproduzierbarkeit der Pherogramme

Die Qualität der Pherogramme hän gt, wie die vorangehenden Abschnitte zeigten.

weit gehend von der Standardisierun g der Methode ab. Unter exakt standardisierten.

stren g kontrollierten Bedin g un gen sind die Phero g ramme in einem hohen Masse re-

produzierbar. Wir konnten zum Beispiel keinen Einfluss auf die Phero g ramme ver-

schiedener Extrakte eines Stammes oder verschieden lan ger La gerung eines Extraktes

Jahrgang 119 J. B. SUCHER. Elektrophorese in der Taxonomie von .Noclu losphaeria 137

feststellen (Abb. 6). Kleine Unterschiede, vor allem quantitative Differenzen in derBandintensität, entstehen durch das Altern der Farblösungen oder beim Aus-werten kaum wahrnehmbarer Bänder (vgl. HALL 1969).

Bei der Auswertun g der Pherogramme kommt den R f-Werten eine grosse Be-deutung zu. Erfahrungsgemäss streuen bei Wiederholungen die R f-Werte gleicherProteine, ohne dass die subjektive Auswertung (das Erkennen eines typischen Mu-sters) erschwert wird. Bei einem umfangreichen Vergleich verschiedener Phero-gramme entstehen jedoch Interpretationsschwierigkeiten. Zur Abklärung der metho-dischen Streuung wurden, ausgehend von einem Extrakt, die Pherogramme vonvier elektrophoretischen Prozessen (Lauf. L) zu je 6 Gelen (Wiederholungen, W)miteinander ver glichen. Die R f-Werte dreier ausgewählter, gut erkennbaren Densito-meterpeaks (Abb. 7) wurden je mittels einer einfachen Varianzanalyse (LINDER 1964)untersucht.

Die Ergebnisse der Varianzanalysen sind in Tabelle 3 dargestellt. Den Streuungen(DQ-Werte), respektiv dem Verhältnis der Streuungen (F-Werte) ist zu entnehmen,dass die Streuungen der R f-Werte gleicher Proteine zwischen den vier Läufen be-deutend grösser ist, als zwischen den Wiederholungen innerhalb eines Laufes. Diesdarf bei einer Verlässlichkeit von P = 0.05 als gesichert gelten. Wir können des-

peak b

Abb. 7. Ausgewählte Densitometerpeaks (a, b.c) zur Ermittlung der methodisch bedingten

Streuung (N. Afarhieui).

Tabelle 3. Auswertun g der Varianzanalysen

Referenzpeak a b c

SQ L 0.000223 0,001034 0,000384SQw 0.000401 0.000361 0.000283

SQTotaI 0.000624 0.001394 0,000666

FG L 3 3 3FG 20 20 20

DQ L 0.000074 0.000345 0.000128DQw 0.00002_0 0.000018 0.000014

F L w i'i 3.702 19.116 9.046

S L 0,0086 0.0185 0.0113

Sw 0,0045 0.0042 0.0038

s Tabellen-F-Wert: F0 , o5 =3.098

1 38 Vierteljahrsschrift der Naturforschenden Gesellschaft in Zürich 1974

halb folgern, dass sich für sinnvolle Re-Mittelwerte die Wiederholungen auf ver-schiedene Elektrophoresen verteilen müssen.

Die beobachteten extremen Abweichungen der Re-Werte gleicher Proteinbänderbetrug 0,03 Re-Einheiten, was mit den von MCCowN et al. (1967), SORENSON et al.(1971) und FERET (1971) veröffentlichten Werten gut übereinstimmt. Diese Ab-weichun gen der Re-Werte in Pherogrammen gleicher Individuen werden von denmeisten Forschern als ein hohes Mass für die methodische Reproduzierbarkeit be-trachtet. Nach unseren Erfahrungen führt diese methodisch bedingte Streuung beitaxonomischen Untersuchungen von Pherogrammen mit mehr als 25 nachgewiesenenProteinbändern aber zu erheblichen Interpretationsschwierigkeiten. Um den angenom-menen Vertrauensgrenzen von =0,015 R 11-Einheiten zu genei gen, müssten nach einersehr groben Schätzung jeweils die Re-Werte von 5-7 Wiederholun gen Bemitteltwerden.

3.2. Enzymproteine

Dieselben Extrakte, die wir zur Abklärung der methodischen Fra gen bei denall gemeinen Proteinen verwendeten, untersuchten wir auch auf spezifische Enzym-aktivitäten. Die Methodik der Extraktion und der Elektrophorese wurde nicht ge-ändert. Der Nachweis der Enzymproteine beruht auf einem Aktivitätsnachweisdurch eine spezifische Reaktion der aufgetrennten Enzyme mit einem Substrat-Farbstoffgemisch. Die in den Enzympherogrammen (Zymogramme) auftretendenEnzymbänder stellen Isoenzyme (MARKERT und MOLLER 1959), das heisst verschie-dene Proteine gleicher enzymatischer Aktivität dar.

Im Gegensatz zu den Untersuchungen über die verschiedenen Einflüsse derMethodik auf die Proteinpherogramme wurde bei den Enzympherogrammen derEinfluss des Extraktionspuffers und die methodisch bedingte Streuung der Re-Wertevon Isoenzymbändern nicht mehr untersucht.

3.2.1. Untersuchte Enzyme

Enzympherogramme wurden schon oft zu genetischen und morphogenetischenArbeiten herangezogen (vgl. zum Beispiel HESS 1968, BARBER et al. 1969). Fürtaxonomische Studien schienen vor allem Esterase (zum Beispiel MEYER et al. 1964,HALL et al. 1968. 1969, NEALSON und GARBER 1969), Phosphatasen (NEALSON undGARBER 1969) sowie Oxidoreduktasen (CLARE et al. 1968) geeignet zu sein.

Abb. 8 zeigt die Phero gramme der von N. septerncellulata untersuchten Enzyme.Von taxonomischem Interesse waren nur die Esterasen und die Malatdehydro-genasen. da mehrere Isoenzyme beobachtet wurden und somit nicht nur auf denRe-Wert eines Bandes abgestellt werden musste. Infolge eines substratunabhängigenBandes bei den Malatdehydrogenasen (Abb. 9) beschränkten wir uns auf dieEsterasen. Das Vorkommen von sogenannten «Nothing-Dehydrogenasen» (ZIMMER-MANN und PEARSE 1959) ist bei allen Dehydrogenasen möglich. In unserem Fallwurde den Ursachen nicht weiter nach gegan gen. wir möchten jedoch auf die Lite-ratur, zum Beispiel SHAW und KREN (1965) und FALKENBERG et al. (1969), hin-weisen.

Jahrgan g 119 J. B. BUCHER. Elektrophorese in der Taxonomie von :1'odulosphaeria 139

1

3 4 5

2

Abb. 8. Untersuchte Enzyme: 1. Alkalische Phosphatasen (nachBREWER und SING 1970): 2. Esterasen (nach FERET 1971); 3. Glu-cose-6- Phosphat -Dehydrogenasen (nach BREWER und SING 1970);4. Malat-Dehydrogenasen (nach SCAND.ALIOS 1969): 5. Penoloxy-

dasen (nach VAN LOON 1971).

Abb. 9. SubstratunabhängigesIsoenzymband der MDH. 1.MDH-Nachweis mit Substrat;2. MDH-Nachweis ohne Sub-

strat.

3.2.2. Methodische und biolo g ische Einflüsse auf die Esterase-pherogramme

Die Bedeutun g methodischer und biolo gischer Einflüsse auf die Proteinspektrender untersuchten Nodulosphaeriaarten wurde schon in Abschnitt 3.1.1. hervorgehoben.Diese Resultate bestätigten sich auch in den in bezug auf Esterasen wiederholtenUntersuchungen (siehe Abb. 10-13). Besonderes Gewicht kommt nach unserer An-sicht wiederum der exakten Definition des Extraktionszeitpunktes zu. Die gewon-nenen Ergebnisse finden, im Ge gensatz zu den Befunden der Proteinpherogramme,in der Literatur eine allgemeine Unterstützung (zum Beispiel HALL 1967. CLARE et al.1968, STIPES 1970).

10 11

1 2

Abb. 10. Einfluss der Trenngelkonzentration(750 y Protein/0.1 ml Extrakt von N. Mathieui ).

Abb. 11. Einfluss der Proteinkonzentration(Trenngel 7% Acrylamid, N. Mathieui).

1. 5% Acrylamid; 2. 7% Acrylamid. 1.250 ;40.l ml Extrakt; 2. 750y/0,l ml Extrakt.

0,2

0,1

3 6

- 1 1


In den meisten Esterasepherogram men trat zwischen R11 0.0-0.3 ein breites, dif-fuses Band auf. Da dieses Band während der Inkubation in der Farblösung einerötliche Farbe zeigte und erst nachträglich die dunkle Farbe der Esterasebänderannahm, betrachteten wir dieses Band als Artefakt (vgl. FERET 1971).

TG9

Abb. 12. Änderungen im Exterase-Isoenzymmuster während dem Wachstum von N. Cirsü.

13

Abb. 13. Esterasepherogramme 6 verschie-dener Einsporkulturen desselben Frucht-

körpers (N. Mathieui).

3.3. Diskussion '̀der Resultate

Die von HALL (1969) geforderte allgemeine Standardisierung der Methode dürftesich kaum verwirklichen lassen. Es scheint vielmehr, dass jede Pilzgruppe eigene ,speziell auf sie abgestimmte biolo gische und technische Bedingungen erfordert. Be-schränkt man sich auf eine geschlossene systematische Gruppe, werden die Ein-

Jahrgang 119 J. B. BUCHER. Elekt rophorese in der Taxonomie von Nodulosphaeria 141

Füsse • der Proteinextraktion, Proteinmenge, elektrophoretischen Bedingun gen sowieder Kulturbedingungen auf die Pherogramme nach einer Optimierung der Methodejedoch unbedeutend. Wir stimmen mit anderen Autoren (zum Beispiel BENT 1967.GLYNN und REID 1969, MILTON et al. 1971) überein, dass die Pherogramme unterstren g kontrollierten Bedin gun gen reproduzierbar sind. Immerhin lässt das Vor-kommen einer methodisch bedingten Streuung der R t-Werte einige Zweifel an derAnwendun g der Diskelektrophorese in der Systematik aufkommen.

Die Auswertun g von Proteinpherogrammen (v gl. Abschnitt 4.) kann durch eineReduktion der nachgewiesenen Bänder erleichtert werden. Dies könnte durch einedifferenzierte Extraktion nach den verschiedenen Löslichkeitsklassen der Proteine(zum Beispiel Albumine. Globuline usw., vgl. VAUGHAN' und DENFORD 1968) oderdurch einen Nachweis gewisser Enzymproteine mittels einem bestimmten Substrat-Farbstoffgemisch erreicht werden. Wir wählten die zweite Möglichkeit, da sich dieProteine nicht exakt genu g nach ihrer Löslichkeit in Klassen definieren lassen (vgl.GRAHA M 1963. BARBER et al. 1967). In den anhand der pufferlöslichen Myzel-enzymen (Esterasen) wiederholten Untersuchungen konnte erneut die Notwendigkeiteiner exakten Standardisierung der Methode, insbesondere des Extraktionszeitpunk-tes, gezei gt werden.

4. Taxonomische Untersuchungen

4.1. Einleitung und systematische Stellung der Gattung Nodulosphaeria Rbh.

Pilze der Gattung Nodulosphaeria werden durch den Bau ihrer Fruchtkörper(Pseudothecien mit Ostiolum), ihren Befruchtungsvorgängen (im Innern der jungenFruchtkörper) und ihren Asci (zweischichtige Wand) zur Ordnung der Pseudosphae-riales der bitunicaten Ascomyceten gestellt. Nach den Entwicklungsvor gängen imInnern der reifenden Fruchtkörper (Auflösung des Psendoparenchyms. Ausbilduugvon Paraphysoiden vom Scheitel und Heranwachsen der Asci) gehört die Gattungzur Familie der Pleosporaceen (MOLLER und LOEFFLER, 1971).

Die Gattung Nodulosphaeria wurde von RABENHORST (1858) mit Nodulosphaeriahirta (= N. derasa [Berk. et Br.] L. Holm) begründet. CESATI und DE NOTARIS(1863) stellten wenig später die Gattung Leptosphaeria auf, in der sie die Typusart derGattung Nodulosphaeria einschlossen. In der Folge wurde Nodulosphaeria oft fälsch-licherweise als Synonym zu Leptosphaeria betrachtet. Dieser Irrtum wurde von meh-reren Autoren erkannt (V. HÖHNEL 1918. PETRAK 1923, MüLLER 1950). Die Bedeu-tun g der natürlichen Gruppe Nodulo.sphaeria als selbständi ge Gattun g wurde jedocherst wieder durch MUNK (1953) und vor allem HOLM (1957) hervorgehoben. Durchweitere morphologische Studien bereicherten HOLM (1961) und HOLM und MüLLER(1963) die Gattung um mehrere Arten auf ihren heuti gen Umfang.

Nodulo.sphaeria-Arten lassen sich anhand der gut ausgebildeten, aus meh rerenReihen von lang gestreckten Zellen bestehenden Fruchtkörperwand und den mehr-


zelli gen, spindelförmi g bis fädi gen Ascosporen, in denen eine Zelle in charakteri-stischer Weise knotenförmi g verdickt ist, gut erkennen (vgl. Abb. 14). Das deutlichaufgesetzte Ostiolum, die mit Periphysen versehene Mündun g und oft mit Borsten be-haarten Fruchtkörper bilden weitere Kriterien zur Abgrenzung gegen verwandte Gat-tungen der Familie der Pleosporaceen (vgl. HEJAROUDE 1969). Viele Arten besitzenan den Ascosporenenden auch typisch geformte schleimige Anhängsel, die oft über-sehen werden (unsichtbar in Milchsäurepräparaten), sich aber in Wasser mit etwasTusche gut indirekt darstellen lassen (HoLxt 1961).

Der Form der Anhän gsel kommt eine grosse taxonomische Bedeutun g zu (MOLLER1950). Sie darf jedoch nach HoLNI (1957) phylogenetisch nicht überwertet werden,da viele Paare. zum Beispiel N. derasa und N. robusta, trotz unterschiedlicherAppendices sich in mancher Hinsicht sehr nahe stehen. Die verschiedenen An-

Abb. 14. Ascosporen der untersuchten Nodulosphaeria-Arten: a) N. modesta, b) N. aquilana, c) N. cea-taureae, d) N. septemcellulara, e) N. dolioloides, f) N. derasa, g) N. robusta, h) N. Cirsii, i) N. fru-

ticum, k) N. erythrospora, l) N. Mathieui, m) N. gallica.

Jahrgang 119 J. B. BUCHER. Elektrophorese in der Taxonomie von Nodulosphaeria 143

hängsel dürften deshalb durch eine Serie von Allelen bestimmt werden (HOLM 1961).

Andere sich in der Morphologie sehr ähnliche Paare unterscheiden sich in der Wirts-

wahl, zum Beispiel N. modesta (polyphag) und N. aquilana (monophag auf J-Iieraciumspp.). Wiederum andere Paare, wie N. derasa und N. Cirsii, gleichen sich stark imBau ihrer Pseudothecien, unterscheiden sich aber in ihren Ascosporen und Wirts-

wahl (v gl. HOLm1 1957 und 1961).

Diesen interessanten morphologisch-taxonomischen und biologischen Beziehungen

versuchten wir durch die Auswahl unserer in die Untersuchung einbezogenen Arten

Rechnun g zu tragen. Im Sinne unserer Zielsetzung. dem Überprüfen der taxonomi-

schen Bedeutung der durch die Diskelektrophorese dargestellten löslichen Mvzel-

proteine, wurden nur Arten berücksichtigt von denen uns mehrere Stämme zu Ver-

fügun g standen. In der Natur selten vorkommende Arten mussten deshalb ausser

acht gelassen werden.

Die taxonomischen Untersuchungen wurden nach der in Abschnitt 2.2. beschrie-

benen standardisierten Methode durchgeführt. Die zu vergleichenden Proteinphero-

gramme stammten jeweils aus derselben (mindestens zweimal wiederholten) Elektro-

phorese. Bei den Esterasepherogrammen wurde die Identität verschiedener Iso-

enzymbänder mittels einer Koelektrophorese von Mischextrakten (vgl. Abschnitt

4.7.) überprüft.

4.2. Nodulosphaeria modesta (Denn.) Munk ex L. Hohn und Nodulosphaeria aquilana(Sacc.) L. Holm

N. modesta dürfte einer der häufigsten Pyrenomyceten der Alpen sein. Trotz dieserallgemeinen Verbreitung – oder gerade deswegen – gibt diese Art dem Taxonomen

grosse Probleme auf. Bis heute wurde N. modesta auf über 70. zu 14 verschiedenenFamilien gehörenden Angiospermen gefunden. Die Ascosporenform ([3–] 4-6 [-7]

Zellen. die 2. [3.] Zelle von oben knotenförmig verdickt) und die Sporengrösse

(25-33 [-45]:: 4.5 [-7] s) sind oft innerhalb einem Pseudothecium sehr variabel. Ge-

wisse Ascosporenformen und - grössen zeigen jedoch eine Affinität zu bestimmten

Wirtspflanzen. So konnten N. subtnodesta (4zellig, 2. Zelle verdickt: 22-29 µ lang)auf Tofieldia calyculata. N. aquilana ([5-] 6zelli g . 3. Zelle verdickt: [36–] 40-51 tylang) auf Hieraciunn spp. und N. Succisae (6[-7]-zellig. [2.] 3. Zelle verdickt: 3S-45 FLlang) auf Succisa pratensis von N. modesta getrennt werden (HOLM 1957 und 1961).Bevorzugt werden jedoch die kleineren 5 zelligen Sporen mit einer verdickten zweitenZelle gebildet: diese Sporen entsprechen auch dem T y pusmaterial (Sphaeria modestaDesin.). HOLM (1957) spricht deshalb von «N. modesta sensu stricto ». Aber auch ineinem solchermassen ein geschränkten Artkomplex von N. modesta sind die Varia-tionen der morphologischen Kriterien noch beträchtlich und wir stimmen mit HOLM

(1961) überein, dass zur taxonomischen Klärung dieses Problemkreises noch viele

Untersuchun gen an Herbarmaterial und Reinkulturen herangezogen werden müssen.

Unsere Kulturen stammten aus Kollektionen von den verschiedensten Wirts-

pflanzen und geographischen Regionen (Tab. l) mit relativ grosser Variation der

taxonomisch wichtigen morphologischen Kriterien wie Ascosporengrösse und Form

O

0 43


der hyalinen Sporenanhängsel (Abb. 15). In die Untersuchung der polyphagen ArtN. modesta (17 Stämme) wurde auch die monophage Art N. aquilana (2 Stämme, aufHieracium spp.) miteinbezogen.

Das Kulturverhalten der einzelnen Stämme auf Malza gar zeigte grosse Unter-schiede. Infolge der spontanen Sektorenbildun g und in Ermangelung an reproduk-tiven Organen liessen sich diese Differenzen nicht zu einer näheren Gruppierung derStämme auswerten. Sie wichen auch in der Wachstumsgeschwindigkeit in Schüttel-kulturen voneinander ab; immerhin überdeckten sich die Phasen des raschenlinearen Wachstums, so dass für die ganze modesta-Gruppe gleichaltriges Myzeluntersucht werden konnte.

Die Proteinpherogramme zeigten von Stamm zu Stamm grosse Unterschiede imMuster und liessen sich nicht in Gruppen unterteilen. Relative Verwandtschaftender Stämme konnten infolge der grossen Anzahl der zu vergleichenden Phero-gramme und unserer auf Re-Werten und Bandintensität beruhenden Auswertungnicht abgeklärt werden.

Die Esterasenpherogramme (Abb. 16, Auswertun g : Tab. 4) liessen eine Gruppierungder Stämme zu. Die Gruppenbildun g oder die relativen Verwandtschaften sind derMatrix der Ähnlichkeitskoeffizienten (Tab. 5) zu entnehmen.

Identische Esterasepherogramme zeigten je die Stämme M 8101 und M 8102(= N. aquilana!, beide von Hieracium spp., Ascosporenlänge 39,5 r resp. 40,5 re),M 8141 (von Centaurea Scabiosa, Ascosporenlänge 35 tt) und M 8142 (von Cirsiumspinosissimwn, Ascosporenlän ge 31,9 µ) sowie M 8150 (von Valeriana montana, Asco-

N 46O

O 4 4

5-

560 5 5

0

47

52 O ^ 01C 50

53

02

57 O 540 0 51

42C

49

3 ,0

4/0

Ase cs poren IS nee

Abb. 15. Ascosporenverhältnisse der modesta- Gruppe (Anhängsel-z und Ascosporenlänge).

0 N. modesta. ©o N. aquilana (vgl. Abb. 14a, b). Stämme M 81 ...

41 0

45

Jahrgang 119 J. B. BUCHER. Elektrophorese in der Taxonomie von Nochdosphaeria 145

49 50 51 52

53 54 55 56 57

Abb. 16. Esterasepheroaramme der modesm-Gruppe (Stämme NI 81... Itlr Wirtspflanzen val. Tab. 1).

Tabelle 4. Auswertung der Esterasepherogramme der modesta-Gruppe (Stämme NI 81 ..)

Esterase-Isoenzyme 01 02 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57

1

3456789

10111?13 -1415161718

sporenlänge 38.8 1.2) und die Stämme M 8145 (von .4conitum Napellus, Ascosporen-

länge 3.2,50 und M 8149 (von Senecio nemorensis, Ascosporenlänge 34.3 ii). WeitereGruppen oder Niue, deren Pherogramme sich zum Teil sehr ähnlich sind, lassen

sich in Abb. 16 und Tab. 4 erkennen. Diese Gruppierung nach den Pherogrammen

kann allerdings nicht mit Ascosporenmassen. Wirtszugehörigkeit oder Herkunft

Stämme

146 Vierteljahrsschrift der Naturforschenden Gese llschaft in Zürich 1974

Tabelle 5. Matrix der Esterase-Ähnlichkeitskoeffizienten (Cs 100) der modecsta- Gruppe(Stämme M S1 ..)

0 l02414250434753465452

45495148

5744

Stämme

5544

100424242443340362727

38383027303631

01

4242424433403627274438383027303631

02

1001005055364346365045455058504357

41

1005055364346365045455058504357

42

5055364346365045455058504357

50

63364536505650504036403338

43

405040406357574440443642

47

7045335044445045505036

53

42556056566042455043

46

605063635050675558

54

6763635045504227

52

71715650564538

55

1007163715633

45

7163715633

49

67566038

51

8S7058

48

7850

56

54

57 44

korreliert werden (v gl. Tab. I und 5, Abb. 15). Hingegen weisen einerseits dieaquilana-Stämme (M 8101 und M 8102) und anderseits die inode.sta-Stämme mit

extremen Sporenmassen (M 8143, M 8144 und M 8146) gegenüber den restlichenStämmen relativ niedri ge Ähnlichkeitskoeffizieten auf.

4.3. Nodulosphaeria centaureae (Müller) L. Holm und Nodulosphaeria septemcellulata(Müller) L. Holm

Die beiden monophagen Arten Nodulosphaeria centaureae: (auf Centaurea Sca-biosa) und V. septenicellulata (auf Bupltthalnntm salicifolium) wachsen in der Naturunter ähnlichen ökolo gischen Bedingungen und stehen sich morphologisch sehr nahe.

Beide haben lange spindelförmige Ascosporen mit 7 Zellen, wobei je die dritte Zelle

von oben knotenförmig verdickt ist. Hin gegen unterscheiden sich die Ascosporenin ihrer Länge (nach Hot.M 1957: N. centaureae 27-33 µ. N. septemcellulata 36-42 µ)

sowie durch die Form der schleimigen Anhängsel an den Sporenenden (bei N. cen-taureae gerade, bei septemcellulata rückwärts gebogen).

Das Kulturverhalten der Stämme jeder Art für sich war einheitlich. Beide Arten

wuchsen auf alalzagar nur langsam. Sie unterschieden sich einerseits im Substrat-mvzel (N. centaureae: hellbraun..\'. septemcellulata: schwarz) und anderseits in derVerfärbung des Substrates (N. centaureae: stark gelb,:V. septenicellulata: rötlich).Bei N. septemcellulata (M 8158) konnten nach einem halben Jahr bei 3 T C vereinzelt

fertile Pseudothecien gefunden werden. Meistens entwickelten sich aber wie bei N. ceu-taureae nur Primordien.


Die Protein- und Esterasepherogramme der Stämme jeder Art waren unter sich sehrähnlich und unterschieden sich deutlich von denen der anderen Art (Abb. 17 und 18).Tab. 6 zeigt, dass bei der Beurteilung der Proteinpherogramme die Farbintensitätder Bänder berücksichti gt werden muss um eine sinnvolle Unterscheidun g derStämme zu ermöglichen. Die Intensität der Proteinbänder eines Gels, resp. Phero-gramms wurde subjektiv in 4 Stufen eingeteilt (vgl. Abschnitt 2.2.6.1.). Diese Ab-stufung der Bänder erwies sich bei der Auswertun g der Proteinpherogramme alsnotwendig, erübrigte sich hin gegen bei den Esterasepherogrammen. Die relativenVerwandtschaften der Stämme kann den Matrizen der Ähnlichkeitskoeffizienten ent-nommen werden (Tab. 7 und 8).

o— e

Bandintensität

stark® mittel

schwachsehr schwach1

q f 8103 11810.. 118105 118158 1.18159 118160

Abb. 17. Proteinpherogramme von N. centaureae (NI 8103, NI 8104, NI 8105 alle von Centaur-eaScabiosa) und N. septenrcellulata (NI 8158, NI 8159, NI 8160 alle von Bupkthalmurn salicifoliwn).

Abb. 18. Esterasepherogramme von N. cen-taureae (M 8103, M 8104, M 8105) und N.septemcellulata (M 8158, M 8159, M 8160).

03- -.. 04- 05-- ...5S 59 - __ 60__..

Stämmegleicher R1(_0.015)

NI 8103 N4 8104 NI 8105 M 8158

NI 8103 29 27 27 74

NI 8104 24 29 29 22

NI 8105 22 25 31 27

N4 8158 13 12 15 28

N4 8159 14 14 17 21

NI 8160 1 3 14 18 21

NI 8159 NI 8160

24 25

22 24

25 27

25 28

148 vierteljahrsschrift der Naturforschenden Gesellschaft in Zürich 1974

Tabelle 6. Gemeinsame Bänder der Proteinpherogramme von N. centaureae (M 8103. M 8104,NI 8105) und N. septemcellulata (NI 8158. M 8159. NI 8160)

Tabelle 7. Matrix der auf den PIoteinpherogrammen basierenden Ähnlichkeitskoeffizienten (Cs 100)

von N. centaareae (NI 8103. NI 8104. NI 8105) und N. septetcellulata (M 8158. NI 8159, NI 8160)

NI 8103NI 8104 71NI 8105 58 72NI 8158 30 27 34NI 8159 32 32 40 60NI 8160 28 31 42 57 60

Stämme N4 8103 M 8104 N4 8105 M 8158 M 8159 M 8160

Tabelle 8. Matrix der auf den Esterasepherogrammen basierenden Ähnlichkeitskoeffizienten (C, < 100)

von N. centaureae (N4 8103, NI 8104, NI 8105) und N. septemcellulata (NI 8158. M 8159, NI 8160)

NI 8105NI 8103 78NI 8104 78 100NI 8159 33 45 45NI 8158 31 42 42 89NI 8160 31 42 42 89 100

Stämme NI 8105 NI 8103 NI 8104 NI8159 NI 8158 NI 8160

4.4. Nodulosphaeria derasa (Berk. et Br.) L. Holm und Nodulosphaeria robusta(Strasser) L. Holm

Ein zweites sich morphologisch und biolo gisch nahe stehendes Artenpaar bilden^r. derasa und N. robusta. In den Gemeinsamkeiten und Unterschieden der Sporenbesteht eine Analo gie zum Paar N. centaurea und N. septemcellulata. Die 4. (oder 5.)Zelle der 8- bis 10zelligen Ascosporen ist knotenförmig verdickt. Die Sporen von

Jahrgang 119 .1. B. BUCHER. Elektrophorese in der Taxonomic von Noclu1osplureria 149

N. derasa (nach HOLM 1957: [35-] 4ü-524--4.5 tt) sind etwas kleiner als diejenigenvon N. robusta (45-62 4-4,5 pc) und haben im Ge gensatz zu den gestreckten An-hän gseln von N. robusta rückwärts gebogene Fortsätze der Sporenende. Im Wirts-spektrum (fast ausschliesslich Senecio spp.) decken sich beide Arten mehr oderweniger.

Unsere Stämme wurden von Senecio spp. verschiedener Biotypen isoliert: die Kul-turen von N. robusta stammen so gar alle von Senecio IlelllOrellSiS (vgl. Tab. 1). Die

0 - i

1 - e

ri 8113 118119 flBll8 118118 118138 M8137 A8139 A8136

Abb. 19. Prote l npherocramme von N. 1erasa (NI 8116 von Senecio alpinus. M. 8117 von S. Jacobaca,M 8118 von S. nemorensis. M 8119 von S. Doronicum) und N. robusta (NI 8136. M 8137, NI 8138,

M 8139 alle von S. nemorensis).

16 17 18 19 36 37 38 39

Abb. 20. Esterasepherogramme von N. clerasa (NI 8116. NI 8117. M 8118. NI 81/9) und N. roba.sra( NI 8136, NI 8137, NI 8138. M 8139).


Isolationen waren jeweils in bezug auf die morphologischen Kriterien des Ausgangs-materials arttypisch. Alle robusta-Stämme bildeten auf Malzagar ein grünes Sub-stratmyzel und entwickelten in der Kälte (3'C) wenige halbreife Fruchtkörper. BeiN. derasa liessen sich zwei Gruppen erkennen. Die Stämme M 8116 und M 8118zei gten ein ähnliches Kulturverhalten wie die Isolationen von N. robusta. Die an-deren derasa-Stämme (M 8117 und M 8119) schieden auf Malzagar ein rotesExopigment aus und bildeten bei Zimmertemperatur Primordien. Beide Gruppenvon N. derasa entwickelten bei tiefer Temperatur nach etwa einem halben Jahr ver-einzelte Pseudothecien mit typischen Ascosporen.

Die Ähnlichkeiten der Proteinspektren der Stämme der beiden Arten warenziemlich hoch. Nach den Proteinpherogrammen (Abb. 19) können die Kulturen vonN. derasa nicht eindeutig von denjenigen von N. robusta getrennt werden. Dieskommt in den meistens nur sehr geringen Unterschieden der Ähnlichkeitskoeffi-zienten (Tab. 9) zum Ausdruck. Die relativ niedrigen Werte (Cs ( 100: 40-60), dersubjektiv doch so ähnlichen Proteinpherogramme, dürften auf die abweichenden In-tensitäten der gleichen Proteinbänder und somit auf unsere Auswertun g zurückzu-führen sein. Die Esterasepherogramme (Abb. 20) bestätigten teilweise die Ergeb-nisse der Untersuchun gen über die allgemeinen Proteine. Beide Arten stehen sichnach den Ähnlichkeitskoeffizienten ihrer Stämme (Tab. 10) wieder sehr nahe. Dierobusta-Stämme bilden jedoch eine geschlossene Gruppe und weisen eine mehroder weniger grosse relative Verwandtschaft zu den verschiedenen Stämmen vonN. derasa auf.

Tabelle 9. Matrix der auf den Proteinpherogrammen basierenden Ähnlichkeitskoeffizienten (Cs 100)von N.derasa (M 8116, NI 8117, M 8118, NI 8119) und N.rabusta (Nl8136, NI 8137, M 8138, M 8139)

M 8117M 8119 60NI 8116 56 44M 8118 60 47 63M 8138 47 40 45 49NI 8137 54 42 58 52 49NI 8139 55 52 44 68 53 74NI8136 47 44 38 58 59 69 64

Stämme M 8117 NI 8119 NI 8116 NI 8118 NI 8138 M 8137 NI 8139 NI 8136

Tabelle 10. Matrix der auf den Esterasepherogrammen basierenden Ähnlichkeitskoeffizienten (Cs x 100)von N.derasa (NI 8116, NI 8117, Ni 8118, M 8119) und ..robusta (M 8136, Nl8137, M 8138, M 8139)

NI 8116M 8117 58NI 8119 50 50NI 8118 45 73 67Nl 8136 45 64 75 88M 8137 45 64 75 88 100M 8138 45 64 75 88 100 100M 8139 45 64 75 88 100 100 100

Stämme NI8116 N18117 N18119 NI 8118 NI8136 NI 8137 NI 8138 NI8139

06 14._ __ 15 _ 08'

Jahrgang 119 J. B. BUGHER. Elektrophorese in der Taxonomie von Nodulosphaeria 151

4.5. Nodulosphaeria Cirsii (Karst.) L. Holm

N. Cirsü ist eine polyphage Art , die jedoch Compositenwirte, vor allem Carduusspp. und Cirsium spp., bevorzugt. Im Bau der Fruchtkörper steht die Art N. derasanahe (MÜLLER 1952, HOLM 1957). Unverkennbar sind jedoch die Ascosporen ([120–]140-170x4-5 pr). Die 16- bis 25zelli gen Sporen, deren B. oder 9. Zelle von obenknotenförmi g verdickt ist, sind aus geschleudert im oberen Teil meistens gekrümmt.

o_e

118106 11811, 118115 1..8106 118109 11 8110 M8111 11811

Abb. 21. Proteinpherogramme von N. Cirsii (NI 8106, NI 8114, NI 8115 von Carduus defloratus;NI 8108, Ni 8109, NI 8110, NI 8111, NI 8112, NI 8113 von Cirshun spp.).

11811 3

Abb. 22. Esterasepherogramme von N. Cirsii, Stämme M 81...

152 Vierteljahrsschrift der Natur forschenden Gesellschaft in Zürich 1974

Unsere Isolationen stammten ausschliesslich von Carduus spp. (M 8106, M 8114,M8115) und Cirsium spp. (M8108,M8109,M8110,M8111,M8112,M8113).Die Stämme liessen sich weder in der Morphologie der Ascosporen noch dem Kultur-

verhalten auseinanderhalten. Wie bei N. derasa und N. septemcellulata entwickeltensich nach etwa einem halbjährigen Aufenthalt bei 3`C in Malzagarröhrchen ver-

einzelt fertile Pseudothecien.

Die Auswertung der Protein- und Esterasepherogramme zeigte eine gute Ober-

einstimmung innerhalb der beiden Wirts gruppen; zwischen den Cardzuus- und denCirsiurn-Stämmen bestanden jedoch grössere Differenzen (Abb. 21 und 22, Tab. 11und 12). Bedenkt man, dass weder in der Ascosporenmorphologie noch dem Kultur-

verhalten der beiden Gruppen Unterschiede gefunden werden konnten, so über-

raschten diese stark wirtsgebundenen Pherogramme.

Tabelle 11. Matrix der auf den Proteinpherogrammen basierenden Ähnlichkeitskoeffizienten(Cs :>< 100) von N. Cirsii

M 8106NI 8114 72M 8115 66 84NI 8109 38 44 42NI 8108 36 41 36 91M 8110 32 37 35 64 83NI 8111 30 38 40 62 85 85NI 8112 32 40 39 68 83 78 70M 8113 31 36 38 81 78 71 68 76

Stämme NI 8106 NI 8114 NI 8115 NI 8109 NI 8108 NI 8110 NI 8111 NI S112 NI 8113

Tabelle 12. Matrix der auf den Esterasepherogrammen basierenden Ähnlichkeitskoeffizienten(Cs :,.100) von N. Cirsii

NI 8115NI 8106 60NI 8114 60 100NI 8108 27 40 40NI 8109 27 40 40 100NI 8110 27 40 40 100 100NI 8111 27 40 40 100 100 100NI 8112 27 40 40 100 100 100 100NI 8113 27 40 40 100 100 100 100 100

Stämme NI 8115 NI 8106 NI 8114 NI 8108 NI 8109 NI 8110 NI 8111 NI 8112 NI Sl13

4.6. Nodulosltitaeria crythrospora (Riess) ;3 . Holm

A. ervtltrospora findet sich auf den verschiedensten Wirten. Charakteristisch fürdie Art sind die 300-400 p. grossen, oft eingedrückten Fruchtkörper. Ebenso typisch

sind die Ascosporen, deren Form und Grösse innerhalb ein und demselben Pseudo-

thecium stark variieren kann. Nach HOLM (1957) beträgt die Grösse der Ascosporen

Jahrgan g 119 J. B. BUCHER. Elektrophorese in der Taxonomie von Voclulo.sphaeria 153

(75–) 100-130 (-145) / 3-3.5 l c. In der Regel weisen die Sporen etwa 20 Querwändeauf. Eine Zelle etwas über der Sporenmitte (meistens die B. oder 9.) ist knotenförmigverdickt. N. et_vthrospora dürfte ähnlich N. nrodesta einen ganzen Artkomplex dar-stellen, der jedoch zurzeit morphologisch noch nicht weiter unterteilt werden kann.

Unsere Kulturen lagen in bezu g auf die Ascosporengrösse des Ausgangsmaterials(Ausnahme: M 8121 von Clernatis ritalba) eher an der unteren Grenze der von HOLM(1957) angegebenen Masse. Bei den Stämmen M 8122 (von Adenostvles Alliariae),M 8123 (von Senecio nemorensis) und M 8140 (von Centaurea Scabio.sa) traten einige

7 8121 118122 118123 111812.. 118125 M8126 11812" 118128

Abb. 23. Proteinpherogramme von A. ervthrospora (M 8121 von Clemar's vitalba, NI 8122 von.4denostvles Allirrige, NCI 8123 von Se redo nemorensis, M 8124 von Aruncrs dioecus, M 8125 vonBuphthalnutm salicifoliunr, M 8126 von Stachvs silrcrtica. M 8127 von Carclrurs cleflorams. NCI 8128

Cirsitftrr arvense 1.

21 22. ._ 25 40 __. _25 ..__25_.. 26 .:27 _._. 28 _.

Abb. 24. Esterasepherogramme von N. eri-tluospora, Stämme M 81...

O f

154 Vierteljahrsschrift der Naturforschenden Gesellschaft in Zürich

1974

Zweifel an der Artzu gehöri gkeit auf. Die Ascosporengrösse betrug 80-110:K3 Fr undihre knotenförmig verdickte Zelle befand sich an der 6. oder 7. Stelle von oben.Ähnliche Sporen fand auch HOLM (1967), er konnte jedoch gestützt auf seinegrosse Erfahrung mit der Gattung Nodulosphaeria keine neue Art abtrennen. Ge-meinsam war allen untersuchten Stämmen die typische Form des zusammengedrück-ten Pseudotheciums von N. erythrospora.

Das Kulturverhalten der Stämme war ähnlich denen von N. rnodesta sehr unter-schiedlich. Auf Malzagar war mit Ausnahme von M 8140 das Wachstum gut und esbildeten sich oft Sektoren mit abweichenden Pigmenten. Dennoch liess sich in derFarbe des Substratmyzeles eine gewisse Parallele zu den morphologischen Beobach-tungen der Ascosporen feststellen: die Stämme M 8124, M 8125, M 8126, M 8127und M 8128 waren nur schwach, M 8122, M 8123 und M 8140 sehr dunkel pigmen-tiert: ivl 8121 la g zwischen diesen beiden Gruppen. Bei 3`C entwickelten sichspärlich Fruchtkörper, die jedoch nur bei M 8121 (von Clematis ritalba) in einigenwenigen Fällen reife Asci aufwiesen.

Die Protein- und Esterasepherogramme der Stämme waren uneinheitlich. Interes-santerweise konnten jedoch anhand der Pherogramme die gleichen Gruppen gebildetwerden, die sich schon aus den Betrachtun gen der Ascosporenmorphologie und desKulturverhaltens er gaben. Die Resultate sind in den Abb. 23 und 24 sowie denTab. 13 und 14 zusammengestellt.

Tabelle 13. Matrix der auf den Proteinpherogrammen basierenden Ahnlichkeitskoeffizienten(Cs x 100) von N. erythrospora

M 8121M 8122 36M 8123 29 57NI 8124 21 17 26NI 8125 32 18 17 52M 8126 20 21 20 5.) 61NI 8127 20 23 32 46 51 84M 8128 22 21 41 43 71 61

Stämme NI 8121 NI 8122 NI 8123 N4 8124 \I8125 NI 8126 Vt8127 NI 8128

Tabelle 14. Matrix der auf den Esterasepherogrammen basierenden A h nlichkeitskoeffizienten(Cs x 100) von N. erythrospora

NI 8140M 8122 42NI 8123 50 90NI 8121 IS 40 38NI 8124 25 33 42 36NI 8125 30 36 45 3S 63NI 8126 30 36 45 38 63 100N4 8127 30 36 45 38 63 100 100NI 8128 30 36 45 38 63 100 100 100

Stämme NI 8140 NI 8122 NI 8123 NI 8121 NI 8124 NI 8125 NI 8126 NI 8127 NI 8128

== =1.

Jahrgang 119 J. B. BUCHER. Elektrophorese in der Taxonomie von Nodulosphaeria l55

4.7. Nodulosphaeria Mathieui (West) L. Holm

N. .Mathieui steht im Bau der Fruchtkörperwand N. erythrospora sehr nahe(HoLM 1957) und besitzt wie diese ein grosses Wirtsspektrum. Die beiden Artenlassen sich gut durch ihre Ascosporen auseinanderhalten. Die Sporen von N. Ma-thieui haben eine kaum sichtbare Verdickun g der 4. Zelle und sind sehr fein (90–)100-120x2 µ.

Unsere Stämme bildeten als einzi ge der untersuchlen Nodulosphaeria-Arten beiZimmertemperatur auf den verschiedensten natürlichen Substraten (Stroh, Malz-,Gemüse- und Haferflockena gar) nach 3-4 Wochen fertile Pseudothecien. Die Fähi g

-keit zur Bildung der Hauptfruchtform nahm jedoch nach mehrmaligem Überimpfender Kulturen stark ab. Das Kulturverhalten des Stammes M 4821 (von Castaneasativa) zeichnete sich gegenüber den anderen Stämme (alle von Compositenarten)durch ein geringeres Wachstum aus. Dies dürfte auf die über 8jährige Kultivierungdes Stammes zurückzuführen sein.

Die Protein- und Esterasepherogramme der 5 Stämme zeigten eine grosse Ähn-lichkeit (Abb. 25 und 26). Die Esterasepherogramme scheinen abgesehen von ab-weichenden Bandintensitäten identisch zu sein. Die Auswertun g der Pherogrammenach R 1-Werten der Esterasebänder (Tab. 17) und das Überprüfen der Bänder mitähnlichen R 1-Werten durch eine Koelektrophorese von Mischextrakten (Abb. 27)ergaben jedoch einige Abweichun gen. Die relativen Verwandtschaften der Stämmesind den Tab. 15 und 16 zu entnehmen.

0

4821 8132. 8133 8134 8135`

Abb. 26. Esterasepherogramme vonN. Mathieui.

Abb. 25. Proteinpherogramme von N. Afarhieui(NI 4821 von Castanea saliva. M 8132 vonCirsium spinosissimum, NI 8133 von Centaur-eaScabiosa, NI 8134 von Buphthahnum salicifoliu,n.

NI 8135 von Cirsiuru sp.).R .14821 M8132 18133 11813. 118135


31

Tabelle 15. Matrix der auf den Proteinphero grammen basierenden Ahnlichkeitskoeffizienten(Cs 100) von N. Mathieui

NI 813/

M 8133 65NI 8134 71 71N4 8135 61 63 S3N4 4821 45 46 57 59

Stämme NI 8132 NI 8133 M 8134 NI 8135 NI 4821

Tabelle 16. Matrix der auf den Esterasephero grammen basierenden Ähnlichkeitskoeffizienten(Cs 100) von N. Mathieui

N4 8132M 8133 67NI 8134 67 100M 8135 83 83 83NI 4821 57 57 57 71

Stämme M 8132 N4 8133 NI 8134 M 8135 M 4821

7s

Abb. 27. Überprüfun g der Esterasepherogramme der Stämme4

N4 4821 und N4 8132 von N. Mathieui durch eine Koelektro-phorese. X = Pherogramm des Mischextraktes, -- nur schein-bar identische Isoenzymbänder. Nr. 1-7 Isoenzymbänder (val.

Tab. 17).

4 821 X 3132

Tabelle 17. Auswertun g. der Esterasephero g ramme von N. Mathieui (vg l. Abb. 26 u. 27)

Esteraseband Stämme

Nr. Rf N4 4821 N4 8132 NI 8133 M 8134 NI 8135

1 0.S4 -4,-7,

30.810.76 4-

4 0.66 + -l.-5 0,59 -4- 4-

67

0.570,55

--)- 4- -si--,


4.8. Diskussion der Resultate

4.8.I. Zur Interpretation der Pherogramme

Die Schwierigkeiten der Interpretation der Pherogramme sind en g an die Aus-

wertun g der Gele gebunden und stehen mit denjenigen der Methodik einer umfas-

senden Anwendun g der Diskelektrophorese in der Systematik entgegen (HALL 1969).

Eine Beurteilnn g der Pherogramme aufgrund der Re-Werte kann oft zu falschen

Interpretationen führen (SHIPTON und FLEISCHMANN 1969). Für uns war eine Aus-

wertung von Proteinpherogrammen in einem grösseren Rahmen unmöglich (vgl.

N. modesta). da die Vertrauensgrenzen von ±0,015 eines einzelnen R;-Wertes beiden in der Regel um 30 nach gewiesenen, grösstenteils nahe beieinander liegenden

Proteinbändern zu grosse Unsicherheiten brachten. Ein Überprüfen homolo ger Pro-

teinbänder durch eine Koelektrophorese von Mischextrakten (JOHNSON et al. 1967.

SHIPTON und FLEISCHMANN 1969) wurde durch die grosse Anzahl der Proteinbänder

verunmöglicht.

Zu einer Verbesserung der Aussa gekraft der Re-Werte könnte eventuell die Split-

geltechnik (LEBOY et al. 1964) beitragen. indem mit jedem Extrakt ein Protein-

standard mitelektrophoriert würde. Wir versuchten die Beurteilung homologer Protein-

bänder durch eine Wertun g der Intensität der Bänder einzuschränken. Homologe

Proteinbänder mussten nach unseren Massstäben in R,-Wert (_0,015) und Band-

intensität übereinstimmen. Eine differenziertere Beurteilung der relativen Verwandt-

schaften zwischen Phero grammen ergäbe sich durch die Verwendung der taxonomi-..

schen Distanzen nach Mahalanobis [D 1 =Y(x,i —x ik) 2] an Stelle unserer Ahn-i-i

lichkeitskoeffizienten C s (vgl. SOKAL und SNEATH 1963). Da die Proteine aber nur

beschränkt quantitativ nachgewiesen werden können – nach DE JONG (1955) variiert die

Aufnahmefähigkeit des Proteinfarbstoffes (Amidoschwarz) durch verschiedene Pro-

teine – und die Proteinbänder der Pherogramme einer relativ grossen methodischen

Streuun g der Re-Werte unterworfen sind, erachten wir die Pherogramme der all-

gemeinen Proteine als un geeignete allgemein gültige taxonomische Kriterien.

Die Auswertung der Esterasepherogramme wurde durch die Reduktion der Band-

anzahl bedeutend erleichtert. Die oft an gewandte subjektive Beurteilun g der Phero-

gramme (identisch oder starke Ähnlichkeit) darf. wie das Beispiel der Stämme von

V. Mathieui (Abschnitt 4.7.) zeigt, nicht ohne eine exakte Überprüfung homologerBänder durch eine Koelektrophorese von Mischextrakten (JOHNSON et al. 1967.

SHIPTON und FLEISCHMANN 1969, FERET 1971) und e ine Auswertun g der relativenVerwandtschaften mittels geeigneter taxonomischer Koeffizienten durchgeführt wer-

den. Auch die in dieser Weise hergeleiteten taxonomischen Beziehungen zwischen

Gruppen beliebi gen Ran ges lassen sich nur mit grossen Vorbehalten miteinander

vergleichen, da sich die gleiche Banddifferenz je nach Anzahl der gesamthaft nach-

gewiesenen Bänder sehr verschieden auswirkt.

158 Vierteljahrsschrift der NaturfoIschenden Gesellschaft in Zürich 1974

4.8.2. Zu den relativen Verwandtschaften der Stämme anhandder Proteinspektren

Viele Autoren (BENT 1967, CHANG et al. 1962, CLARE 1963. CLARE et al. 1968,DURBIN 1966. GILL und POWELL 1968. HALL et al. 1969. McCo as und WINSTEAD1963, MEYER et al. 1964. MILTON et al. 1971, NEALSON und GARBER 1967, STEWARDund BARBER 1964, STIPES 1970) fanden in den Protein- oder Enzympherogrammenihrer Or ganismen bedeutend mehr gemeinsame Bänder innerhalb einer Art als zwi-schen den Arten. Diesen Befunden stehen die Arbeiten von CODNER und CHESSON(1971), GLYNN und REID (1969), PEBERDY und TURNER (1967), SHIPTON undFLEISCHMANN (1969), SHIPTON und MCDONALD (1970) und SORENSON et al. (1971)gegenüber. Auch die Ergebnisse unserer Untersuchun gen ergaben einen negativenBefund für die Artspezifität von Protein- oder Enzympherogrammen in bezug auf diebestehende morphologische Taxonomie der Gattung Nodulosphaeria. Nach GLYNNund REID (1969) wurde der Variabilität der Pherogramme innerhalb einer Art beiden meisten Arbeiten zu wenig Aufmerksamkeit gewidmet. Oft wurden Folgerungenaus den Vergleichen von einem oder zwei Stämmen pro Art gezogen. Auch wirkämen für Nodulosphaeria spp. bei einer Beschränkun g der untersuchten Stämme zuartspezifischen Esterasepherogrammen (Abb. 28 und 29, vgl. aber Abb. 16, 20, 22und 24).

Trotz den geäusserten Bedenken gegen die Methodik und die Interpretation derPherogramme kann eine gewisse Korrelation der Ergebnisse zur bestehenden Taxo-

Abb. 28. Esterasepherogramme von 12 Nodulosphaeria spp.

a) N. modesto, b) N. aril/liana, c) N. dolioloides, d) N. centaureae, e) N. septenrcellulata, f) N. desa.sa,g) N. robu.sta, h) N. gallica. i) N. tlatlrieui. k) N. erptinospora, 1) N. Cirsü, m) N. fraticrun.

Abb. 29. Esterasepherogramme von je 2 Stämmen von 6 Nodulosphaeria spp. (d-1: s. Abb. 28).

Jahrgang 119 J. B. BUCHER. Elektrophorese in der Taxonomie von Aodulosphaeria

nomie der Gattun g Nodulosphaeria festgestellt werden. Das Vorkommen «artspezi-

fischer» , «rassenspezifischer» und « unspezifischer» Phero g ramme zwischen und inner-

halb der Arten deckt sich mit entsprechenden morphologischen und phylogenetischen

Betrachtungen. Einerseits haben wir in der Gattung morphologisch homogene, oft

stark wirts gebundene Arten. die Endstufen einer lan gen selbständi gen Entwicklung

darstellen dürften. Anderseits finden wir in ihren Formen morphologisch sehr variable

und polyphage Arten. Diese relativ wenig entwickelten Arten. eigentliche Artkom-

plexe, dürften die Stammformen zukünftiger Arten sein.

In die erste Gruppe der gefestigten von uns untersuchten Arten gehören V. con-

raureae, N. septenncellulata, N. derasa, N. robuster, N. 11=1athieui und N. Cirsii. DieStämme von N. cenraweae, N. septerncellulara und N. Mathieu! wiesen denn auch jeidentische oder zumindest Phero gramme hoher Ähnlichkeit auf. Die dem Paar

N. centaureae und N. septeincellulara zum Teil widersprechenden Resultate desmorphologisch analogen Paares N. derasa und N. robusta liessen sich durch einephylogenetisch spätere Trennun g der beiden letzteren Arten erklären. Da beide Arten

auch auf den gleichen Wirtspflanzen gefunden werden können und der Grad eher

Homothallie der Nodulosphaeria-Arten noch unbekannt ist, wären die verschieden-

artigen Pherogramme in der Gruppe derasa-robusra auch durch eine eventuelle

H y bridisierun g denkbar. Im Falle von N. Cirsil müssten wir rassen- oder Wirt-

spezifische Pherogramme. respektiv Änderungen des ProteinstotTwechsels ohne mor-

phologische Konsequenzen. annehmen. Wirtsgebundene Pherogramme hatten auch

die Stämme von N. centaureae und N. septerrrcellulara, bei allen anderen unter-suchten Arten und Stämmen konnte jedoch keine solche Korrelation beobachtet

werden. Literaturan gaben über mö g licherweise rassenspezifische Pherogramme diver-gieren : positive Befunde liegen bei Puccinia gramins var. tritici (M Acl o et al. 1967)

und Pvricularia or.v_ae (MATSLYANA und KozAKA 1971) vor. dagegen waren die

Ergebnisse bei Ph • tophthora fragariae (GILL und POW'ELL 1968) ne gativ. In der Gruppemit stark variablen morphologischen Formen überrascht die Vielfalt der Phero-

gramme der Art N. rnodesta nicht. Die Korrelation der Pherogramm-Gruppen beiN. er.vthrospora mit den Ascosporenmassen und dem Kulturverhalten der Stämme

müsste bei dieser polvphagen, heterogenen Art durch zusätzliche Untersuchungen

noch gefesti gt werden.

5. Diskussion und Folgerungen

Die zunehmende Bedeutung biochemischer Kriterien in der S y stematik ergab

sich nach BouLTER und THURMAN (1968) vorwiegend aus genetischen und morpho-

genetischen Arbeiten von Biochemikern. ohne dass der Wert oder die Brauchbarkeit

der vorgeschla genen Kriterien und Methoden von Taxonomen eingehend über-

prüft wurde. Es sollte vor allem gezeigt werden. dass diese biochemischen Kri-

i s ')


terien sogenannt « nute» taxonomische Merkmale sind. Das heisst die Kriterienmüssen neben einer genetischen Basis und einer gerin gen phänotypischen Varianzauch eine Ei gnung zur Gruppierung von Individuen, eine Korrelation zu bestehendentaxonomischen Merkmalen sowie eine für die meisten Taxonomen erfassbare Me-thodik aufweisen (BOULTER und THURMAN 1968, HEY\WOOD 1971).

Für die Proteinmoleküle an sich ist die genetische Grundlage, wie aus der Ein-leitun g gefolgert werden kann, sicher gegeben. Bei der Beurteilung der durch dieDiskelektrophorese dar gestellten Proteinspektren müssen nach verschiedenen Autoren(zum Beispiel BOULTER und THURMAN 1968. HALL 1969, SHIPTON Und FLEISCH-MANN 1969) auch die Grenzen der Methode beachtet werden. Da die elektrophore-tische Mobilität einerseits von der Ladun g und anderseits von der Molekül grösse derProteine abhän g i g ist, bedeutet eine gleiche Bewe glichkeit im Gel noch nicht eineIdentität der Moleküle in ihrer Aminosäuresequenz. Die Identität der Proteine oderEnzyme gleichen Re-Wertes scheint zwar um so wahrscheinlicher je näher sich dieIndividuen verwandt sind und je mehr Bänder übereinstimmen. Die Identität wirdhingegen um so fra glicher je weiter entfernt sich die Organismen stehen und jegeringer die Anzahl mo der übereinstimmenden Bänder ist. BOULTER und THURMAN(1968) fordern deshalb für taxonomische und systematische Arbeiten neben derElektrophorese noch andersartige Abklärun gen von Proteineigenschaften.

Wir betrachten die Verwendung von Phero grammen als all gemein gültige taxo-nomische Kriterien zurzeit noch nicht als gegeben, obwohl Anhaltspunkte zurGruppenbildung und einer teilweisen Korrelation zur bestehenden Taxonomie vor-lie gen. Unsere Bedenken richten sich dabei vorwie gend gegen die Methodik unddie Interpretation der Pherogramme. Ent ge gen der all gemeinen Auffassun g sind wirder Ansicht ; dass die Methode der Diskelektrophorese eine grössere technischeGeschicklichkeit und unter Berücksichti gung aller Gesichtspunkte äusserst lan g

-wierige Untersuchungen erfordert. Der Beweis für Pherogramme als sogenannt«gute» taxonomische Kriterien müsste nach einer Verbesserun g der Methodik in derZukunft erst noch erbracht werden.

Summary

On the basis of the taxonomically well known Ascomycetegenus ATodulosphaeria

RsH. the protein and enzyme (esterases) patterns obtained by acrylamide-gel disc

electrophoresis were studied with respect to their taxonomic value. Methodical and

biological conditions influenced the quality of the pherograms considerably, therefore

it seems hardly possible to realize a general standardization of the method. Diffi-

culties in evaluation and taxonomic interpretation of the pherograms were discussed.

Certain correlations to morphological and phylogenetical reflections on the genus

could be established, but no species specificity relating to the present taxonomy

of the group could be found. At the current sta ge of development the method

is estimated to be of little taxonomic value.

Jahrgang 119 J. B. BUCHER. Elektrophorese in der Taxonomie von Nodulosphaeriu 161

VerdankungeH

Diese Arbeit wurde im Rahmen einer Dissertation (ETH Diss. Nr. 4880) im Jahre 1972 abge-schlossen. Herrn Prof. Dr. E. Müller danke ich für die Überlassung des Themas und für die An-teilnahme an der Arbeit. Herrn Prof. Dr. H. Kern und Frl. Dr. G. Defago sowie allen anderenMitarbeitern des Institutes für spezielle Botanik der ETH danke ich für Hilfe und Unterstützung.Die densitometrischen Auswertungen der Gele wurden am Institut für Entomologie der ETHdurchgeführt; Herrn Prof. Dr. G. Benz und Herrn R. Waeger. dipl. Natw. ETH, sei dafür gedankt.

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