Die Messenger RNA (mRNA) erhält nach der Transkription sowohl eine 5‘-Kappe wie einen 3‘-Polyadenylat-Schwanz

5‘-Kappe

3‘-Poly(A)-SchwanzmRNA

(post-transkriptionale Modifizierung)

3‘ Polyadenylat-Schwanz

mRNA

5‘ 5‘ 5‘ 5‘

3‘

Spaltsignal

mRNA

n = 200 - 300 Nukleotide

der Polyadenylatschwanz wird erstzum Ende der Transkription von einemEnzym (PolyA-Polymerase) an dasgespaltende 3‘-Ende angehängt(Transkriptions-Termination)

Spaltung durchEndonuclease

Der polyA-Schwanz 1. erhöht Stabilität der mRNA2. wichtig beim Export dermRNA ins Zytoplasma

3‘ UTR

ORF

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Die Polyadenylierung der mRNA

DNA

RNA-Polymerase

polyA-PolymerasemRNA

Der Poly(A)-Schwanz erlaubt die einfache und schnelle biochemische Reinigung von poly(A)+ RNA

durch Affinitätschromatographie

Säule mit poly(U) gebunden an kleineSepharose-Kügelchen

reine poly(A)+ RNA>Northern, cDNA-Synthese, RT-PCR

Die Bildung der 5‘-Kappe an der mRNA erfolgt nur bei Eukaryonten

ungewöhnliches 5‘-5‘Triphosphat

7

2‘

5‘

5‘

3‘

der 5‘-Kappe wird noch während der Transkription von den entsprechenden Enzymen (“capping enzymes“)an das 5‘-Ende angehängt

die 5‘-Kappe erhöht die Stabilität der mRNA - Kontrolle der Gen-Expression

die 5‘-Kappe ist wichtig beim Export der mRNA in das Zytoplasma und bei der anschließenden Translation(Anlocken von Initiationsfaktorender Translation)

vom Gen kodiert später angehängt

RNA-Turnover

De-Adenylierung und Entfernung der 5‘-Kappe sind Signale zum Abbau der mRNA

5‘-Kappe

“decapping enzyme“

Die Cap-Struktur („Kopfgruppe“) eukaryontischer RNA-Moleküle

(A) wird bei der posttranslationalen Prozessierung abgespalten

(B) befindet sich am 5’ -Ende der mRNA und enthält einen methylierten

Guanylrest

(C) wird durch die RNA-Polymerase ll bei der Initiation der Transkription

synthetisiert

(D) blockiert bei der Translation die Peptidyltransferase-Reaktion

ist ein Produkt der Transesterifizierung beim Spleißvorgang

Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

……eine weitere post-transkriptionale Veränderung

das Spleißen der Prä-mRNA

Die Entdeckung des Spleiß-Phänomensbis 1977 hatte man die Vorstellung, daß die DNA-Sequenz eines Gens co-linear mit der Aminosäure-Sequenz ist

als man aber die reife mRNA von bestimmten Genen isolierte (polyU-Affinitätschromato-graphie) und mit der entsprechenden DNA-Matritze hybridisierte und die DNA::RNA-Hybride im Elektronenmikroskop sichtbar machte, gab es eine unerwartete Entdeckung

>>>> die gereinigte mRNA war viel kürzer als die DNA-Matritze

Intron

Exon

TACGGATCGTA ACAGTAGGCTATAAC

AUGCCUAGCAU-UGUCAUCCGAUAUUG

NNNNCTA

NNNNCTA

NNNN N

Die Struktur des Hühner-Ovalbumin-Gens

DNA-Matritze

Elektronenmikroskopie Zeichnung

E

mRNA

die Schleifen A-G sind die 7 Introne, die im primären Transkript noch vorhanden sind,später aber bei der Reifung der mRNA herausgeschnitten werden.

das Entfernen der Introne wird als Spleißen (“splicing“) bezeichnet

AUGStop

Exon Intron

8000 Nts

Intronsequenzen werden durchSpleißen entfernt

reife mRNA

Protein (Ovalbumin)

Translation

Prä-mRNA

Chromosom mit 1.5 x 108 Nucleotid-Basenpaaren - ca. 3000 Gene

0.5% des Chromosoms enthält Gene >>> 15 Gene

ein Gen mit 105 Nucleotid-Basenpaaren

Promoter

Transkription

Intron Exon

Spleißen

mRNA

Prä-mRNA

Transkription Bildung der 5‘-Kappe

Exon Intron

Spleißosome

IntronSpleißen

Polyadenylierung

prä-mRNA

mRNA

> das Spleißen ist ein äußerst komplizierter Vorgang - ca. 300 Komponenten beteiligt

> der Spleiß-Enyzm-Komplex wird Spliceosome genannt

> die meisten Gene höherer Eukaryonten haben Introne (bis zu 40 pro Gen)

> die Exone sind weniger als 1000 BP lang, in der Regel 100-200 Nukleotide (entspricht 30-50 Aminosäuren)

> die Größe der Introne schwankt von 50 - 20 000 Nukleotide

> die DNA, die den Intronen entspricht, ist daher viel mehr als die DNA, die für die Exone kodiert (Gen > 50.000 BP; mRNA > 5.000 BP)

die Entfernung des Introns aus der Prä-mRNA muß äußerst präzise ablaufen, damit die reife mRNA korrekt für das entsprechende Protein kodiert

die Präzision muß auf ein Nukleotid genau sein (molekulares Skalpell)

prä-mRNA

mRNAKorrekt gespleißt

mRNAfalsch gespleißt

fehlerhaftes Spleißen > frameshift Mutation>andere Aminosäuresequenz

korrektes Spleißen

Wie schneidet das Spliceosom derart korrekt die Introne aus der Prä-mRNA?man findet beim Vergleich der Exon/Intron-Übergänge bzw. Intron/Exon-ÜbergängeConsensus-Sequenzen

A G G U A A G U…………………..C A G GConsensus-Sequenz

5‘-Spleißstelle 3‘-Spleißstelle

• die Basensequenz eines Introns beginnt GU und endet mit AG

• Introne haben noch eine wichtige interne Stelle, die stets ca. 20 - 50 Nukleotide stromaufwärts von der 3‘ AG-Spleißstelle liegt und Verzweigungsstelle (“branch site“) genannt wird. In Hefe lautet die Verzweigungsstelle nahezu immer UACUAAC (TACTAAC-Box)

• Bereiche zwischen der 5‘ und 3‘ Spleißstelle und der Verzweigungsstelle sind relativ unwichtig für das Spleißen des Introns

• durch Mutationen in jeder dieser drei wichtigen Regionen kann es zur Hemmung des Spleißens bzw. zu einem veränderten Spleißen kommen

• falsches Spleißen verursacht auch Krankheiten, z. B. einige Formen von Thalassämien = erbliche Blutkrankheiten (Anämien) >>> defekte Hämoglobinsynthese

Allgemeine Regeln bei den Spleiß-Consensus-Bereichen

5‘-Spleißstelle 3‘-Spleißstelle“branch site“

GUAAGAG UACUAAC CAG G.................

(1) Normale Globin prä-mRNA

Exon 2 Exon 3Exon 1 Intron 2Intron 1

(2) Mutierte Globin prä-mRNA

Exon 2 Intron 2

Punktmutation

Exon 1

verlängertes Exon

Intron 1 Exon 3

Exon 2 Exon 3Exon 1mRNA

Protein

Protein

-Thalassämien

128

kein Häm

-----CCTATTGGTCTATTTTCCACCCTTAG GCTG-------

-----CCTATAG GTCTATTTTCCACCCTTAG GCTG---

Mutation

Exon 2

Exon 3

normale Spleißstelle

Stop Codon

Exon 2

neue Spleißstelle

Exon 3 (2)

(1)

StopExon 2Exon 1mRNA Exon 3

am Spleißvorgang sind viele Komponenten beteiligt

Spleiß-Enzyme

5‘-Kappe3‘

U1U2

U5 U6

U4

U-snRNA (Uridin-rich, small nuclear RNA)

U-snRNAs

Proteine+

U-snRNPs(Snurps)

Exon 2Intron

konserviertes Ain TACTAAC-Sequenz

biochemisch handelt es sich beim Spleißen um die Spaltung und Neubildung von Phosphodiester-Bindungen = Transesterifizierungs-Reaktionen (ohne Energie)

das Spleißen beginnt mit einem nukleophilen Angriff der 2‘-OH-Gruppe des kon-servierten Adenins innerhalbdes Introns auf die 3‘-5‘Phosphodiester-Bindung am 5‘ Exon/Intron-Übergang

Exon 2

es entsteht das Lasso-Intermediat (“lariat“)

Ex1 Ex2

5‘ 3‘Verzweigung

U1 und U2 die 5‘-Spleißstelle und die Verzweigungsstelle

U-snRNPs(Snurps)

die verschiedenen U-snRNPs reagieren nacheinander mit den verschiedenen Spleiß-stellen, bis sich ein funktions-fähiges Spliceosom ausgebildet hat

U4, U5 und U6 lagern sich zusammen

bei der Bindung von U4, U5 und U6 kommt es zum 5‘-Spleißen

U6 hält Exon 1 im Spliceosom (Lasso-Bildung “lariat“)

U2 und U4 verlassen das Spliceosom

U1 verläßt das Spliceosom

U5 und U6 verlassen das Spliceosom

5‘

3‘

U1

Wie können die Snurps am Spleißvorgang teilnehmen?

die snRNA-Moleküle haben an den Stellen, an denen keine Proteine gebunden sind, einzel-strängige RNA-Bereiche, die komplimentär zu den Consensus-Bereichen im Intron sind

U1

U2

Exon 1 Exon 2Intron

Verzweigungsstelle5‘-Spleißstelle 3‘-Spleißstelle

U2 bindet an die Verzweigungsstelle

U1 bindet an die 5‘-Spleißstelle

U5 bindet an die 3‘-Spleißstelle

GUCCAUUCA

hemmendes Oligonukleotid

U1

Hemmung des Spleißvorgangs durch Auto-Immunantikörper

Hemmung des in vitro Spleißens durch Auto-Immunantikörper (Patienten mit systemischem Lupus erythematodes)

Autoimmun-Krankheit: Antikörper gegen zelleigene Proteine; z. B. gegen die Sm-Proteine der U-snRNPs

Gelenke und die meisten Organsysteme stark beeinträchtigt

>>>> Schlüsselrolle der U-snRNPs beim Spleißen entdeckt mit Hilfe dieser AK

Der Mechanismus des Prä-mRNA-Spleißens

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Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

Restriktionsendonukleasen

(A) sind am Spleißen von mRNA-Vorläufermolekülen beteiligt

(B) integrieren reverse Transkripte der Retrovirus-RNA ins Genom der Wirtszelle

(C) spalten die 5’-Cap-Struktur vom Ende der mRNA

(D) entfernen die Poly(A)-Sequenz vom 3’ -Ende der mRNA

sind Enzyme, die in Bakterien Phagen-DNA spalten

Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

(E)

Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

9 kb = 9 000 BP/3 = 3 000 AS x 100 Da = 300 000 Da

Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

52Ein Gen enthält zwei Exons: Die Anzahl der Basen in der codierenden Sequenz beträgt 300 im Exon 1 und 600 im Exon 2. Die mittlere relative Molekülmasse der von diesen Exons codierten Aminosäuren ist 110/Aminosäure.

Welche relative Molekülmasse wird für das codierte Protein mit einem Fehler von plus/minus 1000 bestimmt?

(A) 3 000(B) 10 000(C) 33 000(D) 100 000(E) 330 000

Welche physiologische Bedeutung hat das Spleißen?

Warum gibt es Introne in der prä-mRNA, die beim Reifung zur mRNA entfernt und abgebaut werden?

warum Gene Introne haben ist in vielen Fällen noch unklar (Introne sind letztendlich Abfall!)

Welche physiologische Bedeutung hat das Spleißen?

Man kennt physiologisch-relevante Spleißvarianten:(1) alternatives Spleißen: erlaubt, aus einem einzigen Gen mehrere Genprodukte zu erhalten (Dogma 1 Gen > 1 Protein)(2) Trans-Spleißen: 5‘-Exon eines Gens wird an das 3‘-Exon eines anderen Gens gehängt >> dies ermöglicht der Zelle neue Genprodukte (Proteine) mit neuer Funktion zu schaffen

Alternatives Spleißen (z. B. 3‘-alternativ)

Beispiele für alternatives Spleißen findet man bei den Immunglobulinen, Myosine, Hormonen etc.

Exon 1 Exon 2 Alt.Exon

Exon 1 Exon 2

Exon 1 Exon 2Alt.Exon Intron

Alt.ExonIntron Intron

IntronAlt.Exon

5‘ 3‘

3‘

Der Lebenszyklus einer mRNA

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