Post on 06-Apr-2015
Embryotransfer beim Pferd
Definition Embryotransfer
Gewinnung von Embryonen aus einem Spendertier und
Übertragung auf eine Leihmutter, die sowohl Trächtigkeit als auch
Aufzucht „übernimmt“
Anwendung des Embryotransfer beim Pferd - heute
• weltweite Nutzung für Forschungsprojekte zur Aufklärung von Embryonalentwicklung und Trächtigkeit bei der Stute
• in der Pferdezucht: begrenzter Einsatz- relativ gute Nutzung in USA (AQH)- zurückhaltende Nutzung in Europa (D: <10 registrierte Warmblutfohlen pro Jahr aus ET)
Anwendung des Embryotransfer beim Pferd
• vermehrte Produktion von Nachkommen von Spitzenklassestuten
• gleichzeitige Verwendung von Stuten in Zucht und Sport
• Erzeugung von Nachkommen aus Stuten, die nicht mehr in der Lage sind, ein Fohlen auszutragen
• Verkürzung des Generationsintervalls (=Einsatz nicht ausgewachsener Spenderstuten)
• Embryonenbanken von „bedrohten“ Pferderassen
Voraussetzungen für den Embryotransfer beim Pferd
• Registrierung von ET-Fohlen durch Zuchtverband?• Vorselektion von Spenderstuten mit
überdurchschnittlichem Zuchtwert• Verfügbarkeit einer ausreichenden Zahl von
Empfängerstuten
Voraussetzungen für den Embryotransfer beim Pferd II
• Zyklussynchronisation von Spender- und Empfängerstuten
• Verfügbarkeit hochklassiger Hengste mit sehr guter Fruchtbarkeit
• Abklärung der finanziellen Gegebenheiten
Selektion der Spenderstuten
• nur Stuten überdurchschnittlicher Qualität rechtfertigen die hohen Zusatzkosten
• bei Stuten mit Fruchtbarkeitsproblemen liegen die Embryonengewinnungsraten 50 bis 70% unter denen fertiler Spenderstuten
• Spenderstuten können gleichzeitig im Sport eingesetzt werden, allerdings müssen gynäkologische Kontrollen und Besamung während der Rosse uneingeschränkt möglich sein
• Alter 3 bis 10 Jahre (wiederholt im Zuchteinsatz)• Stuten mit nachgewiesener Fruchtbarkeit, guter
Milchleistung und überdurchschnittlichen „Mutterstuteneigenschaften“
• um negative Einflüsse auf die Fohlenentwicklung zu vermeiden, sollte die Empfängerstute mindestens die Größe der Spenderstute haben
• für gute Ergebnisse sollten 2 bis 3 Empfängerstuten pro Spenderstute bereitgestellt werden
• gelegentlich Verwendung ovariektomierter (=kastrierter) Stuten
Selektion der Empfängerstuten
Einfluß der Empfängerstute auf die Fetalentwicklung
(Allen et al. 2002)
• Transfer von Ponyembryonen auf a) Ponystuten: Geburtsgewicht: 24 kgb) Vollblutstuten: Geburtsgewicht: 37 kg
• Transfer von Vollblutembryonen aufa) Ponystuten: Geburtsgewicht: 32 kgb) Vollblutstuten: Geburtsgewicht: 55 kg
Einfluß der Empfängerstute auf die Fetalentwicklung - Schlußfolgerung
Werden Embryonen auf Empfängerstuten übertragen, die kleiner sind als die leibliche Mutter, kommen evtl. unterentwickelte Fohlen zur Welt
Einfluß auf die spätere Entwicklung?
Selektion des Hengstes
• Hengste von überdurchschnittlicher Qualität • Hengste mit nachgewiesen guter Fruchtbarkeit• unbegrenzte Verfügbarkeit des Samens
- Frischsamen/Natursprung: höchste Fruchtbarkeit
- gekühlter Samen: evtl. Transportprobleme
- Tiefgefriersamen: optimale Verfügbarkeit, aber verringerte Fruchtbarkeit
Vorbereitung von Spender und Empfänger
• Intensive Zuchttauglichkeitsuntersuchung (Uterustupfer, Endometriumsbiopsie)
• während der Rosse tägliche Ovulations- und Uteruskontrolle
• zusätzliche Kontrolle nach der Ovulation, um Gelbkörperentwicklung und Uterus zu beobachten
Management von Spender und Empfänger
• Rossesynchronisation:- Selektion einer synchronen Empfängerstute aus
einer großen Herde- Rosseinduktion mit Prostaglandinen
- mit Gestagenen und PGF- mit Gestagenen, Östrogenen und PGF
• Superovulation der Spenderstute - derzeit keine erfolgreiche Methode beim Pferd
• Ovulationssynchronisation: - Selektion einer synchronen Empfängerstute- Ovulationsinduktion während der Rosse
• beste Gewinnungsraten an Tag 7/8 post Ov.• Embryonengewinnung durch Uterusspülungen
via Zervix• ein Spülkatheter wird durch Zervix eingeführt
und mittels „Luftballon“ fixiert• Uterusspülungen mit PBS (phosphatgepufferte
Salzlösung, 1000 bis 1500ml, 37 °C, 3 bis 4 Spülungen)
• Flüssigkeitsgewinnung und anschließend Filtration (Porengröße des Filters 70- 75 µm)
Embryonengewinnung
Einfluß des Tages der Embryonengewinnung auf die Gewinnungsraten
(Squires 1993)
Tag nach Ovulation
Zahl der Spülungen
Zahl der Embryonen
Gewinnungsrate (%)
6 137 86 62
7 96 73 76
8 293 218 74
9 53 43 81
Embryonengröße an unterschiedlichen Tagen nach Ovulation
(Squires 1993)
Tag nach Ovulation Durchmesser
(mm)
Schwankungsbreite
(mm)
6 0,201 0,132-0,380
7 0,488 0,136-1,284
8 1,368 0,369-3,980
Embryonengewinnungsraten
• nach KB mit Frischsamen: 70-85%
• nach KB mit gekühltem Samen: 50-60%
• nach KB mit Tiefgefriersamen: 30-65%
sehr starke Abhängigkeit vom Hengst!
Embryonenübertragung
• innerhalb von 30 bis 60 min nach Gewinnung• sterile Lagerung bei 25 bis 30 °C• Übertragung auf Empfängerstute, die 1 bis 2
Tage nach der Spenderstute ovuliert hat• Transfer
- transzervikal (unblutig)- chirurgisch nach Flankenschnitt
(am stehenden Tier in Lokalanästhesie)
Trächtigkeitsraten nach Transfer*
• transzervikaler Transfer: 30-50%
• chirurgischer Transfer (fertiler Spender): 60-80%
• chirurgischer Transfer (subfertiler Spender): 30-60%
*Transfer innerhalb von 60min nach Embryonengewinnung
Trächtigkeitsraten nach Transfer
• Die Trächtigkeitsraten nach einem chirurgischen Transfer sind die höchsten
• Beim chirurgischen Transfer können die Empfängerstuten nicht beliebig oft verwendet werden, da es zu Verklebungen im Bereich der Operationswunden kommt
• Ein chirurgischer Transfer ist aus ethischen Gründen nur bedingt zu vertreten
Trächtigkeitsraten nach Transfer
• Beste Trächtigkeitsraten nach transferzervikalem = unblutigem Transfer werden erreicht, wenn synchrone, absolut geschlechtsgesunden Empfängerstuten zur Verfügung stehen
• In USA: Empfängerherden von >300 Stuten• In Europa ist die Verfügbarkeit an
Empfängerstuten meist sehr begrenzt, was zu schlechteren Transferergebnissen führt
Tiefgefrierkonservierung equiner Embryonen
• Trächtigkeitsraten sind derzeit zu niedrig für einen routinemäßigen Einsatz (<10%)
• Transfer früher Blastocysten führt zu etwas besseren Trächtigkeitsraten, jedoch sind Gewinnungsraten zu gering
• bei höherentwickelten Embryonalstadien scheint die equine Kapsel (azelluläre Schutzschicht) die Passage des Gefrierschutzmittels Glycerin in den Embryo zu behindern
ET-assoziierte Biotechnologien beim Pferd
• Embryonensplitting• IVF (In-vitro-Fertilization)• ICSI (IntraCytoplasmatic Sperm Injection)• GIFT (Gamete Intra Fallopian Transfer)• Klonen
derzeit nicht im routinemäßigen Einsatz
Embryonensplitting
• Produktion des kleinsten Klons
• erfolgreich in Forschungsprojekten verwendet
• relativ einfache Technik, jedoch sind die Trächtigkeitsraten nach Transfer gesplitteter Embryonen deutlich reduziert
In vitro Produktion von Pferdeembryonen
• Berichte von 2 lebenden Fohlen aus IVF waren vor ca. 10 Jahren ermutigend
• Technik beim Pferd bisher nicht wiederholbar• Maturation der Eizellen, Kultur der
Embryonen sowie Kapazitation der Spermien beim Pferd bisher in vitro kaum erfolgreich möglich
Intracytoplasmatic Sperm Injection (ICSI)
• Notwendigkeit der Eizellgewinnung durch Ovum Pickup am lebenden Tier ( 30%)
• vor der Eizellgewinnung Vorbehandlung der Stuten zwecks in vivo Maturation der Oozyten
• Spermien müssen nicht kapazitieren• sehr frühe Embryonalstadien werden blutig in
den Eileiter transferiert• aufwendige Ausrüstung erforderlich • erste Resultate vielversprechend
(>10 lebende Fohlen bisher)
Gamete intrafallopian transfer (GIFT)
• Spermien und Eizelle werden in den Eileiter der Empfängerstute übertragen
• Spermien müssen nicht in vitro kapazitieren• endoskopische Ausrüstung erforderlich• erfolgreiche Fohlengeburten nach GIFT
wurden bereits publiziert
Klonen
• Zellkern wird aus einer Körperzelle oder embryonaler Zelle entnommen und in eine reife Eizelle, deren eigener Kern entfernt worden ist, eingesetzt
• Geburten von einem Pferd und mehreren Maultieren in 2003 publiziert
• ca. 350 Versuche für 1 lebendes Fohlen• Wert für die Pferdezucht ist fraglich, da Genotyp
den Phänotyp nur zu ca. 30% bestimmt• Zuchtfortschritt durch Klonen nicht gegeben
Zusatzkosten von Fohlen, die durch ET entstanden sind im Vergleich zu KB
• Anschaffungs- und Einstellungskosten für Empfängerstuten
• Untersuchung und Synchronisation der Empfänger• Embryonenspülungen und -transfer• Einstellungskosten der Empfänger bis zum Absetzen
des Fohlens Zusatzkosten von ca. € 5000.- pro ET-Fohlen signifikant höhere Kosten für assoziierte Techniken