Embryotransfer beim Pferd

Definition Embryotransfer

Gewinnung von Embryonen aus einem Spendertier und

Übertragung auf eine Leihmutter, die sowohl Trächtigkeit als auch

Aufzucht „übernimmt“

Anwendung des Embryotransfer beim Pferd - heute

• weltweite Nutzung für Forschungsprojekte zur Aufklärung von Embryonalentwicklung und Trächtigkeit bei der Stute

• in der Pferdezucht: begrenzter Einsatz- relativ gute Nutzung in USA (AQH)- zurückhaltende Nutzung in Europa (D: <10 registrierte Warmblutfohlen pro Jahr aus ET)

Anwendung des Embryotransfer beim Pferd

• vermehrte Produktion von Nachkommen von Spitzenklassestuten

• gleichzeitige Verwendung von Stuten in Zucht und Sport

• Erzeugung von Nachkommen aus Stuten, die nicht mehr in der Lage sind, ein Fohlen auszutragen

• Verkürzung des Generationsintervalls (=Einsatz nicht ausgewachsener Spenderstuten)

• Embryonenbanken von „bedrohten“ Pferderassen

Voraussetzungen für den Embryotransfer beim Pferd

• Registrierung von ET-Fohlen durch Zuchtverband?• Vorselektion von Spenderstuten mit

überdurchschnittlichem Zuchtwert• Verfügbarkeit einer ausreichenden Zahl von

Empfängerstuten

Voraussetzungen für den Embryotransfer beim Pferd II

• Zyklussynchronisation von Spender- und Empfängerstuten

• Verfügbarkeit hochklassiger Hengste mit sehr guter Fruchtbarkeit

• Abklärung der finanziellen Gegebenheiten

Selektion der Spenderstuten

• nur Stuten überdurchschnittlicher Qualität rechtfertigen die hohen Zusatzkosten

• bei Stuten mit Fruchtbarkeitsproblemen liegen die Embryonengewinnungsraten 50 bis 70% unter denen fertiler Spenderstuten

• Spenderstuten können gleichzeitig im Sport eingesetzt werden, allerdings müssen gynäkologische Kontrollen und Besamung während der Rosse uneingeschränkt möglich sein

• Alter 3 bis 10 Jahre (wiederholt im Zuchteinsatz)• Stuten mit nachgewiesener Fruchtbarkeit, guter

Milchleistung und überdurchschnittlichen „Mutterstuteneigenschaften“

• um negative Einflüsse auf die Fohlenentwicklung zu vermeiden, sollte die Empfängerstute mindestens die Größe der Spenderstute haben

• für gute Ergebnisse sollten 2 bis 3 Empfängerstuten pro Spenderstute bereitgestellt werden

• gelegentlich Verwendung ovariektomierter (=kastrierter) Stuten

Selektion der Empfängerstuten

Einfluß der Empfängerstute auf die Fetalentwicklung

(Allen et al. 2002)

• Transfer von Ponyembryonen auf a) Ponystuten: Geburtsgewicht: 24 kgb) Vollblutstuten: Geburtsgewicht: 37 kg

• Transfer von Vollblutembryonen aufa) Ponystuten: Geburtsgewicht: 32 kgb) Vollblutstuten: Geburtsgewicht: 55 kg

Einfluß der Empfängerstute auf die Fetalentwicklung - Schlußfolgerung

Werden Embryonen auf Empfängerstuten übertragen, die kleiner sind als die leibliche Mutter, kommen evtl. unterentwickelte Fohlen zur Welt

Einfluß auf die spätere Entwicklung?

Selektion des Hengstes

• Hengste von überdurchschnittlicher Qualität • Hengste mit nachgewiesen guter Fruchtbarkeit• unbegrenzte Verfügbarkeit des Samens

- Frischsamen/Natursprung: höchste Fruchtbarkeit

- gekühlter Samen: evtl. Transportprobleme

- Tiefgefriersamen: optimale Verfügbarkeit, aber verringerte Fruchtbarkeit

Vorbereitung von Spender und Empfänger

• Intensive Zuchttauglichkeitsuntersuchung (Uterustupfer, Endometriumsbiopsie)

• während der Rosse tägliche Ovulations- und Uteruskontrolle

• zusätzliche Kontrolle nach der Ovulation, um Gelbkörperentwicklung und Uterus zu beobachten

Management von Spender und Empfänger

• Rossesynchronisation:- Selektion einer synchronen Empfängerstute aus

einer großen Herde- Rosseinduktion mit Prostaglandinen

- mit Gestagenen und PGF- mit Gestagenen, Östrogenen und PGF

• Superovulation der Spenderstute - derzeit keine erfolgreiche Methode beim Pferd

• Ovulationssynchronisation: - Selektion einer synchronen Empfängerstute- Ovulationsinduktion während der Rosse

• beste Gewinnungsraten an Tag 7/8 post Ov.• Embryonengewinnung durch Uterusspülungen

via Zervix• ein Spülkatheter wird durch Zervix eingeführt

und mittels „Luftballon“ fixiert• Uterusspülungen mit PBS (phosphatgepufferte

Salzlösung, 1000 bis 1500ml, 37 °C, 3 bis 4 Spülungen)

• Flüssigkeitsgewinnung und anschließend Filtration (Porengröße des Filters 70- 75 µm)

Embryonengewinnung

Einfluß des Tages der Embryonengewinnung auf die Gewinnungsraten

(Squires 1993)

Tag nach Ovulation

Zahl der Spülungen

Zahl der Embryonen

Gewinnungsrate (%)

6 137 86 62

7 96 73 76

8 293 218 74

9 53 43 81

Embryonengröße an unterschiedlichen Tagen nach Ovulation

(Squires 1993)

Tag nach Ovulation Durchmesser

(mm)

Schwankungsbreite

(mm)

6 0,201 0,132-0,380

7 0,488 0,136-1,284

8 1,368 0,369-3,980

Embryonengewinnungsraten

• nach KB mit Frischsamen: 70-85%

• nach KB mit gekühltem Samen: 50-60%

• nach KB mit Tiefgefriersamen: 30-65%

sehr starke Abhängigkeit vom Hengst!

Embryonenübertragung

• innerhalb von 30 bis 60 min nach Gewinnung• sterile Lagerung bei 25 bis 30 °C• Übertragung auf Empfängerstute, die 1 bis 2

Tage nach der Spenderstute ovuliert hat• Transfer

- transzervikal (unblutig)- chirurgisch nach Flankenschnitt

(am stehenden Tier in Lokalanästhesie)

Trächtigkeitsraten nach Transfer*

• transzervikaler Transfer: 30-50%

• chirurgischer Transfer (fertiler Spender): 60-80%

• chirurgischer Transfer (subfertiler Spender): 30-60%

*Transfer innerhalb von 60min nach Embryonengewinnung

Trächtigkeitsraten nach Transfer

• Die Trächtigkeitsraten nach einem chirurgischen Transfer sind die höchsten

• Beim chirurgischen Transfer können die Empfängerstuten nicht beliebig oft verwendet werden, da es zu Verklebungen im Bereich der Operationswunden kommt

• Ein chirurgischer Transfer ist aus ethischen Gründen nur bedingt zu vertreten

Trächtigkeitsraten nach Transfer

• Beste Trächtigkeitsraten nach transferzervikalem = unblutigem Transfer werden erreicht, wenn synchrone, absolut geschlechtsgesunden Empfängerstuten zur Verfügung stehen

• In USA: Empfängerherden von >300 Stuten• In Europa ist die Verfügbarkeit an

Empfängerstuten meist sehr begrenzt, was zu schlechteren Transferergebnissen führt

Tiefgefrierkonservierung equiner Embryonen

• Trächtigkeitsraten sind derzeit zu niedrig für einen routinemäßigen Einsatz (<10%)

• Transfer früher Blastocysten führt zu etwas besseren Trächtigkeitsraten, jedoch sind Gewinnungsraten zu gering

• bei höherentwickelten Embryonalstadien scheint die equine Kapsel (azelluläre Schutzschicht) die Passage des Gefrierschutzmittels Glycerin in den Embryo zu behindern

ET-assoziierte Biotechnologien beim Pferd

• Embryonensplitting• IVF (In-vitro-Fertilization)• ICSI (IntraCytoplasmatic Sperm Injection)• GIFT (Gamete Intra Fallopian Transfer)• Klonen

derzeit nicht im routinemäßigen Einsatz

Embryonensplitting

• Produktion des kleinsten Klons

• erfolgreich in Forschungsprojekten verwendet

• relativ einfache Technik, jedoch sind die Trächtigkeitsraten nach Transfer gesplitteter Embryonen deutlich reduziert

In vitro Produktion von Pferdeembryonen

• Berichte von 2 lebenden Fohlen aus IVF waren vor ca. 10 Jahren ermutigend

• Technik beim Pferd bisher nicht wiederholbar• Maturation der Eizellen, Kultur der

Embryonen sowie Kapazitation der Spermien beim Pferd bisher in vitro kaum erfolgreich möglich

Intracytoplasmatic Sperm Injection (ICSI)

• Notwendigkeit der Eizellgewinnung durch Ovum Pickup am lebenden Tier ( 30%)

• vor der Eizellgewinnung Vorbehandlung der Stuten zwecks in vivo Maturation der Oozyten

• Spermien müssen nicht kapazitieren• sehr frühe Embryonalstadien werden blutig in

den Eileiter transferiert• aufwendige Ausrüstung erforderlich • erste Resultate vielversprechend

(>10 lebende Fohlen bisher)

Gamete intrafallopian transfer (GIFT)

• Spermien und Eizelle werden in den Eileiter der Empfängerstute übertragen

• Spermien müssen nicht in vitro kapazitieren• endoskopische Ausrüstung erforderlich• erfolgreiche Fohlengeburten nach GIFT

wurden bereits publiziert

Klonen

• Zellkern wird aus einer Körperzelle oder embryonaler Zelle entnommen und in eine reife Eizelle, deren eigener Kern entfernt worden ist, eingesetzt

• Geburten von einem Pferd und mehreren Maultieren in 2003 publiziert

• ca. 350 Versuche für 1 lebendes Fohlen• Wert für die Pferdezucht ist fraglich, da Genotyp

den Phänotyp nur zu ca. 30% bestimmt• Zuchtfortschritt durch Klonen nicht gegeben

Zusatzkosten von Fohlen, die durch ET entstanden sind im Vergleich zu KB

• Anschaffungs- und Einstellungskosten für Empfängerstuten

• Untersuchung und Synchronisation der Empfänger• Embryonenspülungen und -transfer• Einstellungskosten der Empfänger bis zum Absetzen

des Fohlens Zusatzkosten von ca. € 5000.- pro ET-Fohlen signifikant höhere Kosten für assoziierte Techniken