Genetisches Praktikum 2010 (20160)

Anwesenheitspflicht - maximal ein Fehltag

Klausur: 01.04.2010 (Gründonnerstag) im H15 09:00 - 10.15 Klausur zu Vorlesung u. Repetitorium 10:30 - 11:30 Klausur zum Praktikum Anmeldung bis Do. 25.03. über FlexNow – nur die, die planen zu kommen! (für Nachholklausur: Anmeldung im Sekretariat der Genetik) Um zu bestehen, müssen ! 50% der max. erreichbaren Punktzahl in jeder der beiden Klausuren erreicht werden. nur eine Nachholklausur in 2010! – danach erst ca. 1 Jahr später wieder neuer Versuch möglich!!!

Protokolle keine Abgabe von Protokollen; Auswertungen gemeinsam im Kurs; Protokollieren der Ergebnisse sowie gute Vor- und Nachbereitung sind essentiell, um Überblick zu behalten

Mitzubringen sind: Laborkittel Taschenrechner Millimeterpapier

Organisatorischer Ablauf: Morgens: Repetitorium H12, Beginn 9:00 (s.t.) (Theorie zu Versuchen, Bezug zur Vorlesung, Gelegenheit zum Fragen!) Anschließend: praktischer Teil (Mikroskopiersaal) Mittagspause variabel (siehe Zeitplan) Ende zwischen 16:00 und 18:00 Uhr

Skript: Versuche sind übergeordneten Themen zugeordnet (I - IV, s.S. 3) Skript-Aufbau: Unterpunkte 1-7 zu jedem Versuch Warnhinweise beachten Zeitplan: Verschachtelung der Versuche (s.S. 38)

Genetisches Praktikum 2010 (20160)

Zuordnung: Sitzplätze zu Gruppennamen:

H H H H H

36 – 39 Zweiergruppen

ausgehend von A1 die Plätze bitte lückenlos füllen!

Genetik Praktikum

Praktikumsversuche I. Allgemeines

A. Plasmid-Curing B. F-Plasmid-Nachweis C. Komplementations-Test mit rII-Mutanten des Phagen T4 D. PCR-Fingerprint mittels STR-Analyse

II. Methoden A. Titerbestimmung bei Bakterienkulturen B. !-Galaktosidase-Test

III. Mutagenese und DNA-Reparatur A. Isolierung und Identifizierung von Auxotrophie-Mutanten B. Nachweis der Transposon-Mutagenese des Plasmids pTS115 C. Ames-Test

IV. Projekt: Klonierung eines Genfragments A. PCR B. Gelelektrophorese C. Ligation D. Elektrotransformation E. Plasmid-Präparation

Modellorganismus Escherichia coli

•! Familie der Enterobacteriaceae (griech. „enteron“: Darm)

•! kommt im menschlichen und tierischen Darm vor

•! benannt seinem Entdecker Theodor Escherich (1919)

•! einer der am besten untersuchten Organismen der Welt

•! 4,6 Mb zirkuläres Chromosom; ca. 4000 Gene

•! Plasmide: kleine, zirkuläre, autonom replizierende, extrachromosomale DNA-Moleküle

•! Gram-negativ, stäbchenförmig, peritrich begeißelt

Versuch IIA

Versuch IIA

Titerbestimmung bei Bakterienkulturen (Wachstumskurve)

In der Molekularbiologie werden Bakterien z.B. verwendet:

- zur Vermehrung rekombinanter DNA-Moleküle

- zur Expression und Isolation von Proteinen

Am häufigsten verwendet: Escherichia coli - K12

- harmloser Stamm

- mikrobiologisch, biochemisch und genetisch sehr gut untersucht ("Haustierchen aller Molekularbiologen")

Kultivierung im Labor

- meist in Komplett- oder Vollmedium: z.B. LB (Luria Bertani) Medium

- Trypton (Pepton): enzymatisch verdaute Proteine (Aminosäurequelle)

- Hefeextrakt: Vitamine, Spurenelemente

- NaCl: Osmolarität

- Flüssigkultur oder feste Nährböden durch Zugabe von Agar

- Minimalmedium: def. Zusammensetzung; zur Identifikation von Auxotrophien (s.u.)

Versuch IIA

Bestimmung der Bakterienzahl Gesamtzellzahl:

- Bakterien sind sehr klein, für das blosse Auge nicht zu erkennen

- Auszählen in dünner Schicht unter dem Mikroskop (Thoma Zählkammer)

- Automatisiert durch elektrisches Zählgerät, basierend auf Leitfähigkeitsverlust einer Elektrolytlösung beim Durchtritt eines Bakteriums durch eine enge Öffnung (Coulter-Counter)

- Nachteil: lebende von toten Bakterien nicht ohne zusätzliche Färbung zu unterscheiden

Versuch IIA

Lebendzellzahl:

- jedes lebende Bakterium führt zur Bildung einer Kolonie bzw. jede Kolonie geht auf ein einzelnes Bakterium zurück

- cfu = colony forming unit

- Titer = cfu / ml Kultur

- Nachteil: Inkubationszeit von mindestens einem Tag

- Koch‘sches Plattengussverfahren

Bestimmung der Bakterienzahl

- Spatelplattenverfahren

Versuch IIA

Lebendzellzahl: Bestimmung der Bakterienzahl

je 0,9 ml Saline vorgelegt

Versuch IIA

Indirekte Methoden:

- lineare Proportionalität nur im Bereich OD ! 0,05 – 0,5 (Beschattungseffekte)

- schnelle Methode, aber relativ unempfindlich (noch keine Trübung bei 106 cfu/ml » geringe Zellzahlen schlecht messbar

- muss jeweils geeicht werden, da sehr von der Größe und Gestalt der Bakterien und dem jeweiligen Gerät abhängig (Eichkurve)

- Trübungsmessung bei einer bestimmten Wellenlänge (578 nm)

- Messung der Lichtabsorption und Lichtstreuung als "optische Dichte" (OD)

Bestimmung der Bakterienzahl

Versuch IIA

Wachstum durch Zweiteilung

20 " 21 " 22 " 23 "24 " 25 " 26 " ..... " 2n (n = Anzahl der Zellteilungen)

N = N0!2n (N = Bakterienzahl, N0 = Ausgangsbakterienzahl)

" lg(N/N0) = n ! lg2 " n = lg(N/N0) / lg2

Berechnung der Anzahl der Zellteilungen » Auflösen nach n (:

N = N0 2n " N / N0 = 2n

Teilungsrate " = n / t

Generationszeit g = 1 / " = t / n

n / t = lg(N/N0) / [lg2 ! (t – t0)]

Beispielrechnung (lg2 = 0,3010): in 10 h Vermehrung von 103 auf 109 Bakterien

» Teilungsrate = 2 h-1; » Generationszeit = 0,5 h

n / t = lg(109/103) / [lg2 ! 10 h] = 6 / [0,3010 ! 10 h] ! 2 h-1

Steilheit der Gerade entspricht der Teilungsrate

Exponentieller Anstieg (» Gerade bei halblogarithmischer Auftragung)

Versuch IIA

Wachstum in statischer Kultur Wachstum bestimmt durch: Temperaturoptimum, aerobe / anaerobe Bedingungen

Wuchstoffbedürfnis

lag-Phase: Anlaufphase, Anpassung an neue Bedingungen durch ansteigende RNA-, Ribosomen- und Enzymsynthese

log-Phase: exponentielles Wachstum konstante maximale Teilungsrate abhängig von Bakterienart und Wachstumsbedingungen

stationäre Phase: maximale Bakteriendichte, Ausbeute, Ertrag bestimmter Faktor aufgebraucht, Übergang allmählich, zunächst Wachstumsabnahme, schließlich kein Wachstum

Absterbephase: Autolyse

Versuch III.A

Isolierung und Identifizierung von Auxotrophie Mutanten

Ein durch eine Mutation hervorgerufener Phänotyp lässt Rückschlüsse auf die Funktion des mutierten Gens zu.

Mutation

- ungerichtete, zufällige Veränderung des Erbmaterials

spontan

- selten, ca. 10-8 pro Basenpaar, Zelle und Generation

induziert (Erhöhung der Effizienz in Mutagenese Screens)

- physikalisch: Strahlung

- chemisch: mutagene Substanzen (s. Ames Test)

- biologisch: durch Transposons

Versuch III.A

Auxotrophe Bakterien als Beispiele für Mutanten

Auxotrophie Wuchsstoffbedürftigkeit

auxotrophe Bakterien können auf Minimalmedium nicht wachsen, sondern benötigen bestimmte Wuchsstoffe (Aminosäuren, Vitamine, Purinbasen etc.)

Prototrophie alle Zellbestandteile können selbst hergestellt werden

prototrophe Bakterien können auf Minimalmedium (anorganische Salze; Kohlenstoffquelle) wachsen

Auxotrophie wird meist hervorgerufen durch Mutation in einem Gen, das für ein Enzym des Aufbaustoffwechsels kodiert, wobei Stoffwechselwege meist mehrere Schritte beinhalten.

Vorstufe A Vorstufe B Endprodukt Enzym 1 Enzym 2 Enzym 3

Gen 1 Gen 2 Gen 3

Vorstufe C

verschiedene Arginin auxotrophe Mutanten lassen sich unterschiedlich supplementieren

Wechselwirkung von Genen in Stoffwechselwegen

Vorstufe Ornithin Citrullin Arginin Enzym 1 Enzym 2 Enzym 3

arg1 arg2 arg3

Ein-Gen - Ein-Enzym Hypothese Ein-Gen - Ein-Polypeptid Hypothese

Versuch III.A

Warum ist auch diese Hypothese streng genommen nicht zutreffend?

Auxotrophe Bakterien als Beispiele für Mutanten

Versuch III.A

Replika Plattierung nach Lederberg:

Versuch IV.A

Klonierung eines Genfragments - Übersicht

Isolierung genomischer DNA

PCR zur Amplifikation der rDNA

Schnitt mit KpnI und SacI

SacI KpnI

SacI KpnI

Ligation

Transformation

Versuch IV.A

Klonierung eines Genfragments - Übersicht

Identifizierung positiver Klone:

Plasmidpräparation

Gelelektrophoretische Analyse

M 1 2

1 2

!-Komplementation

lacZ! auf Plasmid kodiert für !-Peptid der "-Galaktosidase (Aminosäuren 1-26)

lacZ# im Genom von E. coli $M15 kodiert für "-Galaktosidase der die Aminosäuren 11-41 fehlen

Monomer der "-Galaktosidase

LacZ# und LacZ! komplementieren sich zu aktiver tetramerer "-Galaktosidase

Versuch IV.A

Blau-Weiß-Screening

X-Gal

"-Gal

blaugrüner Farbstoff

Expressionsplasmid

Selektionsmarker: Antibiotikumsresistenz (z.B. AmpR: #-Lactamase)

Replikationsursprung (ori)

Promotor / Terminator

(Operator)

RBS / Start / Stop

Polylinker

- z.B. Produktion Humaninsulin seit 1982 Verfahren von Hoechst entwickelt, aber Verbot der Produktion in Deutschland, Zulassung seit 1987

Versuch IV.A

Polymerase Kettenreaktion (PCR) Kary Banks Mullis, Nobelpreis 1993

Versuch IV.A

... ATG GAG GAA TGT ACA GAA ATC GTG ....... CTC CTA GGA CCC AAA ATA TAA ...

... TAC CTC CTT ACA TGT CTT TAG CAC ....... GAG GAT CCT GGG TTT TAT ATT ...

GAT CCT GGG TTT TAT ATT AAGCTT

3‘ Primer HindIII

GAATTC ATG GAG GAA TGT ACA GAA

5‘ Primer EcoRI

Anhängen von Schnittstellen mittels 5' verlängerter Primer