Genome Engineering in der Ratte Stehen wir vor der Renaissance eines Modellorganismus?

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Boris Jerchow 41. Seminar über Versuchstiere und Tierversuche

08. Mai 2012, BfR, Berlin

Geschichte 1828

1877

1906 1909

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•  Laborratte stammt von Wanderratte ab •  Berichte über Rattenfänger aus dem

19. Jahrhundert •  Fänger studierten Verhalten •  1828 Hungerstudien •  1877-1885 genetische Studien durch

Crampe •  Anfang 20. Jahrhundert

Wiederentdeckung Mendelsche Gesetze (Fellfarbgenetik)

•  1906 Beginn der Zucht im Wistar Institute for Anatomy and Biology (www.wistar.org)

•  1909 erste Inzuchtratte Laborratte (Pemelet, wikipedia.org)

Wanderratte (Hans-Jörg Hellwig, wikipedia.org)

Die Ratte hat sich als ausgezeichnetes Tiermodell erwiesen

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•  Pharmakologie/Wirkstoffsuche •  Toxikologie •  Neurobiologie/Verhaltensforschung •  Herz-/Kreislaufforschung

Wistarat (US public domain)

Zucker Ratte (J. Servaes)

Sprague-Dawley Ratte (J.-E. Minh-Duy Poirrier)

Bild

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Timoféef-Ressovsky, Zimmer, Delbrück betrahlen Drosophila und weisen nach, dass Gene chemische Struktur besitzen

1940

Watson, Crick klären Doppelhelixstruktur der DNA auf 1953 Struktur von Genen; Mechanismen der Replikation,

Expression, Regulation (nur Prokarionten und Viren) 1960er

erste transgene Organismen 1970er erstes künstilches Plasmid 1971

Southern Blot 1975 Sanger Sequenzierung 1977

Knock-Out Technik 1980er Gordon/Ruddle und Costantini/Lacy: Transgene Mäuse 1981

Evans: murine ES-Zellen 1981 Mullis: PCR 1983

Smithies: Homologe Rekkombination 1985 Capecchi: Knock Out Maus 1989

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Publikationen Ratte, Maus 1950-1994 Die Ratte war in der Prä-Knockout-Ära das dominante Versuchstier

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Ratte Maus

1989

1990

2002

2012

Warum die Ratte? •  seit ¼ Jahrhundert kann das Genom

der Maus maßgeschneidert werden •  seitdem wurden tausende

gentechnisch veränderte Mauslinien erzeugt (z.B. EMMA: fast 3000, Jackson Lab: >6000 Linien)

•  unzählige Untersuchungen mit diesen Mauslinien, große Menge an Daten akkumuliert

•  Zucht und Haltung von Ratten deutlich teurer als bei der Maus

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1990 - 1994

1995 - 1999

2000 - 2004

2005 - 2009

2010 - 2012

Ratte Maus

Warum die Ratte?

•  seit Anfang des 20. Jahrhunderts Zucht von Inzuchtstämmen aufgrund von Eigenschaften, die von biomedizinschem Interesse sind

•  seit kurzem ist es möglich, auch das Genom der Ratte zielgerichtet zu verändern

•  schon rund 600 Stämme und Unterstämme in der Rat Genome Database www.rgd.mcw.edu

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Die Ratte ist nicht nur eine große Maus!

•  mehrere Millionen Jahre evolutionärer Abstand

•  Physiologie in vielen Fällen dem Menschen ähnlicher

•  bis zur Entwicklung der ko Maus war Ratte das dominante Versuchstier in der biomedizinischen Forschung

•  große Mengen von Daten müssten in der Maus neu erhoben werden (Tierschutz!)

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Bild

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Herz-Kreislauf-Erkrankungen

•  gutes Modell, vor allem Schlaganfall und Bluthochdruck •  verschiedene gezüchtete Linien ideal für entsprechende Studien •  operative Eingriffe •  Überwachung physiologischer Parameter •  Volumina

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Verhaltensstudien

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•  Ratte intelligenter als die Maus •  Ratte löst komplexere Aufgaben •  z.B. Radial Arm Maze zur

Untersuchung Einfluss pharmakologisch wirksamer Substanzen auf Erinnerung

Radial Arm Maze nach Olton, D.S., & Samuelson, R.J. (1976) Bild: wikipedia.org

und weitere Forschungsrichtungen

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z.B. Brustkrebs •  Hormonabhängigkeit vergleichbar mit dem Menschen •  prä-maligne Stadien sehr ähnlich denen beim Menschen z.B. Toxikologie und Wirkstoffforschung •  Abbau von Giftstoffen ähnlich wie beim Menschen •  Blutentnahmen in kurzen Abständen möglich •  Ratte war immer wichtiges Modell in der Industrie

GENTECHNISCHE VERÄNDERUNGEN IN DER RATTE

Eine neue Ära:

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ENU

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ohne Möglichkeit zur ziel-gerichteten Mutagenese:

ENU-Behandlung von Männchen

•  Punktmutationen •  sehr aufwändig, Mutationen

zu identifizieren •  mögliche Kosegregation •  Forward Genetics

wik

iped

ia.o

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Kyoto University Rat Mutant Archive (KURMA)

•  extensive ENU-Mutagenese •  Spermien von tausenden G1-Männchen

kryokonserviert •  optimiertes Screening-Verfahren über Mu Transposon

(einzelne Basenunterschiede als Zielsequenz) •  optimierte Rückgewinnung von Linien über ICSI •  viele interessante Linien identifiziert •  verschiedene Probleme bleiben

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ENU in der Maus 1979 ENU als genet.

Werkzeug 1981

1989 PKU Modell 1990

5000 Linien 2011 Ziel: 10000

Gene Traps über Transposons

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ITR SA Reporter SD pA ITR

Transposase

+

Funktionsweise Gene Trap

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ITR SA Reporter SD pA

ITR

Transposase

+

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 1 Exon 2 Exon 3

Restprotein-Reporter-Fusion

Über transgene Ratten

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x

Transposase

Transposase

Über Spermatogoniale Stammzellen (SSCs)

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Transposase

Selektion Analyse

Kryokonservierung Transplantation

Dazl -/-

Mit Gene Traps nicht alle Gene erreichbar

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Anz

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Stam

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unterschiedliche Gene mit Mutation

DIE KÖNIGSDISZIPLIN Zielgerichtete Mutagenese

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Ratten ES-Zellen

•  Standard-Methoden aus der Maus nicht übertragbar

•  Erfolg in der Maus abhängig vom Stamm •  Kultur mit Inhibitorcocktails führt bei nicht-

permissiven Mausstämmen zum Erfolg (3i, 2i)

•  Übertragung auf Ratte •  Zellen sehr instabil •  Durchführung wie bei Maus

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Evans 1981

Capecchi 1989

2i Medium 2008 echte rES-Zellen 2008

p53 KO 2010

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ES-Zellkultur x x x x x x

z.B. knock out von genomischen Sequezen

knock out ES-Zellen

Johannes Wilbertz, KI Stockholm ISTT Mediensammlung, www.transtechsociety.org

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Kombination einer Blastozyste mit KO ES-Zellen chimäre Ratte

wildtypisch

X

chimär

heterozygot

Keimbahn-transmission

schwierig!

Zink-Finger, TALENs und Homing Endonukleasen

•  ZFNs, TALENs: modular zusammengesetzt •  erzeugen Doppelstrangbrüche (DSB) •  Aktivierung zellulärer Reparaturmechanismen •  KO •  Homologe Rekombination •  Regulation von Genen

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Chimäres Protein: ZF-FokI

1996

ZFN-aktivierte hom Rek. in Zellkultur 2003 KO über ZFN in

Drosophila 2003

KO Ratten 2009 chimäres Protein: TAL-effektor-FokI

2010

Homologe Rek. in der Ratte

2011

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FokI

FokI

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ZFN-Mechanismus

DSB

Zelluläre Reparaturmechanismen

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DSB

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NHEJ

•  fehlerbehafteter Reparaturmech. •  Deletion von Nukleotiden

(selten Insertionen) •  Frame-Shift führt zum KO

homologe Rekombination

homologe Rekombination mit anderem Allel oder eingebrachter exogener DNA

Knock In

•  Cui et. al, Nature Biotech. 2011: Knock In von GFP in den Mdr1a Lokus

•  homologe Bereiche können kurz sein

•  Technisch einfach: Koinjektion von Nuklease und targeting Vektor in Pronukleus

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DSB

homologe Rekombination

homologe Rekombination mit anderem Allel oder eingebrachter exogener DNA

Koinjektion von mRNA und targeting Vektor

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TALENs als Alternative zu ZFNs

•  TAL Effektoren aus dem Pflanzenpathogen Xanthomonas spp. •  Repeats aus 34 Aminosäuren •  AS 12 und 13 binden an ein Nukleotid in DNA-Sequenz •  Code 2009 entschlüsselt •  In Verbindung mit FokI DSBs wie mit ZFNs

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Vor- und Nachteile

TALENs •  ein Repeat bindet ein

Nukleotid

ZFNs •  Repeats binden Triplets – nicht

alle Kombinationen möglich

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•  mehr Repeats benötigt •  scheinen „einfach so“ zu

funktionieren •  hohe Spezifizät auch mit

wildtypischer FokI •  relativ günstig, relativ leicht

selbst zu machen •  neue Technik

•  hoher Optimierungsbedarf (Wechelwirkungen der Repeats)

•  off-target Effekte, veränderte FokI erforderlich

•  relativ teuer, relativ schwierig selbst zu machen

•  15 Jahre Entwicklung und Erfahrung

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ZUSAMMENFASSUNG Zielgerichtete Mutagenese in der Ratte ist eine Option!

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Zusammenfassung I

•  Ratte hat seitens Physiologie, Intelligenz und Größe Vorteile gegenüber der Maus

•  bis zur Entwicklung der KO-Technik war die Ratte der häufiger verwendete Modellorganismus (große Datenmengen)

•  seit kurzem ist es möglich, zielgerichtete Mutatioen in der Ratte zu erzeugen

•  neue Frage: welche Spezies ist das besser geeignete Modell?

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Zusammenfassung II

•  ENU induzierte Mutationen nicht steuerbar, aufwändige Detektion, nur Punktmutationen, häufige Kosegregation

•  Gene Traps über transgene Ratten oder SSCs •  Sättigungseffekte •  Kultur, Selektion, Konservierung und Transplantation von SSCs

noch im Anfangsstadium •  ES-Zelltechnologie wie bei der Maus •  Zellen instabil, offensichtlich als Routinetechnik (noch) nicht

anwendbar

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Zusammenfassung III

•  chimäre Proteine aus ZF- oder TAL-Effektor-Repeats scheinen das größte Potential zu haben

•  homing Endonukleasen von Effiktivität her vergleichbar aber Sequenzspezifität schwieriger zu erzeugen

•  größere Zahl von KO-Rattenmodellen bereits erzeugt •  zusammen mit Targeting-Vektor KI möglich •  Endonukleasen: Technik der Zukunft?

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Ressourcen

•  Rat Genome Database, rgd, www.rgd.mcw.edu •  Knock Out Rat Consortium, KORC, www.knockoutrat.org •  Kyoto University Rat Mutant Archive, KURMA, www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/enu/ •  NIH Rat Genomics and Genetics, www.nih.gov/science/models/rat •  Sigma Advanced Genetic Engineering Labs, SAGE,

www.sageresearchmodels.com •  Cellectis, www.cellectis-bioresearch.com/tal-effector-nucleases

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