01/2010 M. Obermeier

Mikrobiologische Diagnostik bei STD und HIV

Viren und Bakterienalte und neue Probleme in der Diagnostik

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Der Darm

Diarrhoe

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Erreger von Diarrhoen

� Viral:

� Rotaviren

� Noroviren

� Adenoviren

� Astroviren

� Coronaviren

� (CMV)

� Bakteriell/Parasitär:

� Campylobacter

� Lamblien

� Kryptosporidien

� Salmonellen

� Shigellen

� EHEC/ETEC

� (Clostridium difficile)

� Amöben (Reise)

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Nachweis von viralen Erregern

� Antigen:

� Noro-, Astro-, Rota- und Adenoviren

� PCR:

� Noro-, Adenoviren

� CMV aus Stuhl (pp65-Antigen und CMV-PCR aus Plasma bei dieser Fragestellung wenig empfindlich)

Abrechnung im EBM möglich

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Nachweis von bakteriellen/parasitären Erregern

� Kulturverfahren:

� Antibiogram (aber häufig keine Antibiotikatherapie erforderlich)

� Antigen-Verfahren:

� Giardia lamblia (Immunfluoreszenz, ELISA)

� Campylobacter jejunii

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Die Leber

Hepatitis C

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Hepatitis C Diagnostik

� Indirekter Virusnachweis� Anti-HCV-Suchtest (z.B. ELISA)� Anti-HCV-Bestätigungstest (Immuno-Blot)� (HCV-spezifische T-Zellen)

� Direkter Virusnachweis� Quantitative PCR (Real-Time PCR)� Qualitative PCR (einzeln obsolet)

� Genotypisierung mittels Sequenzierung� Genotypisierung mittels

Genotyp-spezifischer PCR� Genotypisierung mittels RFLP

(RestriktionsFragment-Längen-Polymorphismus)

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Vor- und Nachteile der Methoden zurGenotypisierung

Genotyp spezifischePCR/RFLP

� günstig

� schnell

� Gute Detektion von Mischinfektion

� Einschränkung auf häufigeGeno-und Subtypen

� Unterscheidung zwischenRelapse und Reinfektion nurmöglich bei Geno- bzw. Subtyp Veränderung

� Punktmutationen können zurFehlinterpretation führen

Genotyp mittelsSequenzierung

� Teuer� langsam� Mischinfektionen können nur

eingeschränkt detektiertwerden (Ultra-Deep-Sequencing?)

� Seltene Geno- bzw Subtypenwerden korrekt erkannt

� Unterscheidung zwischen Relapse und Reinfektion durch phylogenetische Analyse möglich

� EpidemiologischeUntersuchungen sind möglich

� Punktmutationen führen nichtzur Fehlinterpretation

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Auf Anti-HCV kann man lange warten

4341393735333129272523211917151311

97531

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Patient

� Screening nach anti-HCV nicht genug

� Nach der ersten positiven HCV-RNA

− 37% anti-HCV positiv 3 Monate später

− 86% anti-HCV positiv 6 Monate später

− 5% ohne SeroKonversion nach 1 Jahr

**

*

**

**

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Ohne Anti-HCV geht es auch nicht

Gruener et al. Infection control and hospital epidemiology march 2009, vol. 30, no. 3

Anti-HCV in der Probe ab Tag 130 positiv,Virus phylogenetisch der Indexpatientin zuzuordnen

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STD

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Lues

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Treponema pallidum

� Lues-Serologie

� Antikörper-Suchtest (z.B. ELISA)

� TPPA/TPHA: Treponema-pallidum Partikel-Agglutinations-Test

� VDRL

� FTA-ABS (Fluoreszenz-Treponema-Antikörper-Absorptions-Test)(IgM)

� Quantitative Lues-ELISA

� Bestätigungstest (Immuno-Blot)

� Lues-PCR

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Lues-Serologie I

negativ

negativ

negativ

positiv

FTA-ABS-IgM

keine Luesnegativnegativnegativ

unspezifische Reaktion, keine Lues

negativnegativpositiv

gesicherte Lues: Seronarbenach behandelter Lues oder langjährig bestehende (auch unbehandelte) Infektion

negativpositivpositiv

gesicherte Lues: Frische Infektion oder auch kurz nach Therapie

positivpositivpositiv

InterpretationVDRLFTA-Abs

TPPA

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Lues-Serologie II

negativ

negativ

positiv

FTA-ABS-IgM

Aktive Lues, geringer Zellzerfall

Schwach positiv (1:1

od. 1:2)positiv

positiv (>1:20000)

Alte Lues nicht aktiv nach Behandlung, VDRL wahrscheinlich unspezifisch

Schwach positiv (1:1

od. 1:2)positiv

positiv (1:1280)

Sehr frische Luesnegativnegativ/schwach positiv

positiv(1:1280)

InterpretationVDRLFTA-Abs

TPPA

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Neisseria gonorhoe

� Kultureller Nachweis� Langsam� Gegen Störfaktoren empfindlich� Antibiogramm möglich

� PCR Nachweis� Schnell� Weitgehend unempfindlich au Störfaktoren� Kombination mit Chlamydia trachomatis Nachweis

möglich� Empfindlichkeit bei asymptomatischen Infektionen

deutlich erhöht

� Antikörper Nachweis� Keine Entscheidung ob eine akute Infektion vorliegt

möglich

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Neisseria gonorrhoe – Einempfindlicher Erreger

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Chlamydia trachomatis

� Antigen-Nachweis (obsolet)

� Abstrich

� PCR-Nachweis

� Erststrahl-Urin (Morgenurin)

� Abstrich

� Bei positivem PCR-Nachweismolekulargenetische DifferenzierungLymphogranuloma venereum möglich(Serovare L1-L3)

� Antikörper-Nachweis

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Lunge

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Community-acquired Pneumonia (CAP)

ErregerHäufigkeit

Erreger ungeklärtCa 20-25%

Legionella spp.

S. aureus

C. pneumoniae, (Pseudomonaden)

Selten (<5%)

H. influenzae

M. pneumoniae

Enterobacteriaceae

RSV, Adenoviren Influenzaviren, Parainfluenzaviren

Gelegentlich (5-10%)

S. pneumoniaeSehr häufig (40-50%)

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Problemmaterial Sputum

� Echtes Sputum, kein Speichel

� Mikroskopie wichtig

� Genügend Granulozyten

� Nicht zu viele Plattenepithelien(Speichel Kontamination)

� Schnelle Verarbeitung erforderlich

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Procalcitonin

Christ-Crain & Müller, Swiss Med Wkly 2005;135:451-60

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Kinetik von Zytokinen, PCT und CRP nach Applikation von Endotoxin

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Procalcitonin

� <0.1 ng/ml

� Keine antibiotische Therapie

� 0.1 - 0.25 ng/ml

� Klinische Entscheidung

� 0.25 – 0.5 ng /ml

� Antibiotikatherapie (Penicillin V oder Aminopenicillin ggf. mit β-Lacatamase-Hemmer)

� >0.5 ng/ml

� Indikator für septischen Verlauf

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Diagnostische Probleme

� Chlamydophilia pneumoniae� Anzucht nur im Speziallabor möglich und

zeitaufwändig

� Serologie mit großem diagnostischen Fenster (2-3 Wochen nach Erkrankung bis zur IgM Bildung)

� IgM-Bildung bleibt bei erneuter Infektion aus

� Mycoplasma pneumoniae� Anzucht nur im Speziallabor möglich und

zeitaufwändig

� Serologie mit großem diagnostischen Fenster (12 Tage nach Erkrankung bis zur IgM Bildung)

� Kälteagglutinine mit hoher Unspezifität behaftet

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Virale CAP

� Antigen-Teste für RSV, Adeno- und Influenzaviren vorhanden

� PCR-Teste möglich, aber keine Kostenerstattung im EBM

� Keine spezifische Therapie für RSV und Adenoviren (Versuche mit Ribavirin bzw. Cidofovir bei schwer Immunsupprimierten)

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Mycobakterium tuberculosis

Robert Koch-Institut: SurvStat, http://www3.rki.de/SurvStat, Datenstand: 01.02.2010

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TBC Screening

� Tine Test seit2005 nicht mehrerhältlich

� Mendel-ManthouxTest mit 2 TU (tuberculin units) Tuberkulin RT23 des StatensInstitutKopenhagen

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γ-Interferon-Teste

� T-Spot.TB� Elispot-Verfahren

� Material: Heparin- oder Citrat-Blut

� Probe ohne speziellen Zusatz bis zu 8h stabil

� CD4+T-Zellzahl bis zu 40/µl möglich (sinkender NPV !!)

� Quantiferon Gold� Quantitatives Verfahren

� Spezielles Abnahmesystem

� Eingeschränkte Probenstabilität

� Mindest-CD4+T-Zellzahl 200/µl.

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Wie funktionierts?

� Die T-SPOT.TB Antigene(ESAT-6 & CFP 10) befindensich beide in der RD1 Region des M.tuberculosis.

� Die RD1 Region ist nicht in den BCG Stämmenvorhanden (diese Region ging bei der Entwicklung von M. bovis BCG aus M. boviszwischen 1908 und 1931 am Institut Pasteur verloren)

� Die RD1 Region ist ebenfallsnicht in den meisten UmweltMycobakterien vorhanden, einschliesslich M. avium.

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Was wird erkannt?

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Sensitivität und Spezifität TSpot TB

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Die Zukunft

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Keimdifferenzierung mittelsMALDI-TOF

� Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation

� Keimidentifizierunginnerhalb von 10 Minuten

� Reinkulturen notwendig(Kurzkultur meistensausreichend)

� Noch nicht aus primärenPatientenmaterial möglich

� Antibiotika-Resistenznoch nicht beurteilbar

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Funktionsprinzip MALDI-TOF

� Bakterien auf derTargetplattewerdenaufgebrochen und ionisiert

� Bruchstückebenötigenunterschiedlichlange bis sie auf dem Detektorauftreffen

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IBIS – Abbott PLEX-ID

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Abbott PLEX-ID

� Hohe Sensitivität� Schnelle Ergebnisse� Auch aus Patientenmaterial möglich (aber

bisher nicht für alle Erreger)� Hohe Anschaffungskosten� Bisher Antibiotikaresistenz nur im Sinne

MRSA Nachweis und VRE-Nachweis� Auch unbekannte Erreger werden erkannt

(Entdeckung von Influenza A/H1N1sw wurde mit dem Abbott PLEX-ID identifiziert)

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Vielen Dank für ihre Aufmerksamkeit