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- Folie 1
- mRNA-Expressionsprofilierung und Normalisierung:
QPCR-Erfahrungen und Ergebnisse einer retrospektiven Studie an 106
primren Prostatakarzinom-Gewebepaaren Meye A 1, Schmidt U 1, Fssel
S 1, Koch R 2, Baretton G 3, Lohse A 1, Tomasetti S 1, Frhner 1 M,
Wirth MP 1 1 Klinik fr Urologie, 2 Institut fr Medizinische
Informatik und Biometrie, 3 Institut fr Pathologie, TU Dresden
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 2 / 20 Agenda Heterogenitt des PCa
berblick zu neuen molekularen Marker Design einer SOP-QPCR-Studie
erste Resultate zu 9 PCa-assoziierten Genen Arbeitshypothese:
Vorhersagbarkeit organbegrenzter PCa anhand von gemeinsam
berexprimierten mRNA-Markern Transferierbarkeit der Studien auf
Biopsien
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 3 / 20 Relatives berleben (5/10
Jahre) Nach Diagnosezeitraum PCa-Mortalitt in den USA (Land mit
hohem PSA-Screeninganteil) LZ in Abhngigkeit vom Stadium
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 4 / 20 Prognostizierte Verbesserung
des berlebens im Falle einer Frherkennung (SEER-Daten 1990-99)
KarzinomLokalisierte Tumoren bei Detektion (%) 5-JR (%) 5-JR, wenn
alle Flle bei Detektion lokalisierte Tumoren wren (%)
Kolon-Ca416490 Lungen-Ca191649 Brust-Ca658797 PCa6590100 Suche nach
neuen, besseren bzw. PSA-ergnzenden Markern zum PCa-Screening
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 5 / 20 Marker-basiertes
PCa-Progressionsmodell [Gonzalgo & Isaacs 2003] EZH2 (E)
>100 Genkandidaten fr das PCa postuliert (
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 7 / 20 Patienten & Gewebeproben
Gewebepaare von 106 RPEs (Tu >60%, Tf
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 8 / 20 QPCR-Logistik (Ablaufplan)
30-60 Gefrierschnitte (10m) in Lysepuffer Spin Tissue RNA Mini Kit
(Invitek, Berlin) 2X RT parallel (je 0,5 g; Superscript II,
Invitrogen) cDNA poolen & LC-PCR mit 1:5 Verdnnung (20l
Aliquots, bei 4C, nicht wegfrieren!) in 14/106 Fllen RNA-Mengen 30%
Abw. 3. Messung) Qualittskriterien: DNA-Standards (10E1-10E7), +/-
Kontr.
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 9 / 20 PCR-Bearbeitungsstrategie 11
Gewebepaare pro LC-Lauf gemeinsam extrahierte und umgeschriebene
Probenrunden Sammlung von kompletten Wiederholungs- lufen
(divergierende Doppelmessung) ohne Wiederholungen 336 PCRs/Gen
keine Normalverteilung der relativen Expressionswerte
Logarithmierung der Daten
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 10 / 20 Statistische Verfahren
receiver-operating characteristic (ROC) Kurven area under curve
(AUC) als Ma fr die Rate korrekter Diagnosen Analyse &
diagnostische Aussagekraft der Einzelvariablen (individuelle
Transkripte) diagnostische Regel nach Multivariatanalyse (via
AUC)
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 11 / 20 Resultat 1:
QPCR-Standardisierung Anstieg Standardkalibrierung 0.984 (GAPDH) -
1.149 (TBP) Korrelationskoeffizient >0,999 % ( 23 PCR-Lufe/Gen)
mediane Standardabweichungen 8-14 %
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 12 / 20 alle QPCR-Assays hoch
reproduzierbar
- Folie 13
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 13 / 20
p=0.038p=0.036p=0.00003p=0.531 GAPDH HPRT PBGD TBP Tf Tu Tf Tu Tf
Tu Tf Tu Verwendung von TBP fr relative Normierung der
Expressionsdaten (& RNA-Mengen) Resultat 2:
Referenzgen-Auswahl
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 14 / 20 Resultat 3A: relative
Expressionswerte Tu & Tf EZH2 mit geringstem & PSA mit
hchstem Niveau (zmol Gen/ zmol TBP) variable Genexpression (2-5
Log-Stufen/Gen) relativ geringe mRNA-Levels in allen
PCa-Zellinien
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 15 / 20 Resultat 3B: log relative
Expression Tu & Tf
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 16 / 20 Hchste berexpressionen fr:
DD3 (>40-fach im Median) & TrpM8 (>4-fach im Median)
Resultat 4: Tu:Tf Ratios
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 17 / 20 p=0.002 p=0.003 p=0.009
Resultat 5A: Subgruppenanalyse OC vs. NOC (vs. Tf) Verwendbarkeit
einzelner Marker zur Vorhersage organbegrenzter PCa???
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 18 / 20 Resultat 5B:
Subgruppenanalyse lGS vs. hGS (vs. Tf) p=0.102 p=0.099
- Folie 19
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 19 / 20 Resultat 5C:
Subgruppenanalyse lGS vs. hGS (vs. Tf) p=0.150 p=0.113
- Folie 20
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 20 / 20
- Folie 21
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 21 / 20 Diagnostische Regel eines
Logit-Modells zur PCa-Vorhersage Beispielrechnung fr Patient 1:
p=Wahrscheinlichkeit fr ein PCa leitet sich aus folgender
Transformation ab: p = exp(logit)/[1+exp(logit)] =
exp(2.298)/[1+exp(2.298)] = 0.909 = 99,9% Tf-Expression:
Prostein/TBP=2,01, EZH2/TBP=1,17, TRPM8/TBP=1,86,
DD3/PCA3/TBP=0,396 p fr Tu =6,9%, d.h. 93,1% (=100%-6,9%)
Wahrscheinlichkeit eines TF
- Folie 22
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 22 / 20 Einzelmarker (DD3) vs.
Kombination
- Folie 23
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 23 / 20 Weitere Schritte Gewebepaare
Erweiterung des Patientenkollektivs auf 150 Patienten (cDNA-Bank!)
Messung von weiteren PCa-assoziierten Markern, ggf. Integration in
das Modell Definition eines relevanten Panels (max. 5 Marker) Vgl.
der mRNA-Expressionsmuster mit CGH-Profilen zu definierender
Subgruppen (Kooperation Homburg) prospektive Reevaluierung
geeigneter Marker (Biopsiestudie)
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 24 / 20 Reevaluierung an
Biopsiematerial Simulation diagnostischer Stanzen am RPE-Prparat
Gefrierkonservierung der Biopsien Schnitte systematisch fr H&E
und RNA-Extraktion Verwendung der Biopsien fr QPCR bei primrer
Nachweisbarkeit von >50 Moleklen TBP absolut Markerpanel: PSA,
Trp-M8, Prostein, EZH2, DD3 cDNA-Menge aus 1/8 bis 1/16 Biopsieteil
ausreichend
- Folie 25
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 25 / 20 QPCR an Biopsien
- Folie 26
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 26 / 20 6-Markerbestimmung aus
Gesamtbiopsien
- Folie 27
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 27 / 20 Hypothetisches Modell fr
differentiell exprimierte PCa-Transkriptmarker
- Folie 28
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 28 / 20 Vision - additives
molekulares Staging Anwendungsgebiete PCa: Stanzbiopsie, LN-Gewebe
Serum-/Blut-, Urinprobe Disseminierte Tumorzellen, Mikrometastasen
Identifizierung von Patienten mit niedrigem Progressionsrisiko
(watchful waiting) Target-spezifische(re) Therapieoptionen (auf
Grundlage einer molekularen Charakterisierung des Individualtumors)
15-20mm, 0,8 mm Routinepathologie & & molekulare
Diagnostik
- Folie 29
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 29 / 20 Kenntnisstand
molekulargenetische PCa-Marker tumorbiologische Heterogenitt
basiert auch auf einer extremen genetischen Diversitt dieser
Ca-Entitt (kein PCa-Gen) hoffnungsvolle Marker (Prostata- oder/und
PCa-spezifisch) mit diagn. & progn. Potential identifiziert
(post-PSA-Zeit) einige gleichzeitig mgliche Therapietargets (z.B.
Immuntherapie) Testung molekular-basierter, modifizierbarer
Therapiestrategien extensive Evaluierung der klinischen
Test-Wertigkeiten notwendig klinische Anwendung additiver
molekularer Markermuster fr frhzeitige Diagnosemglichkeit
(Screening-Marker) individuellere Prognoseabschtzung &
Therapieentscheidung Abschtzung eines patientenspezifischen
Therapieansprechens
- Folie 30
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primren PCa-Gewebepaaren Folie 30 / 20 Marker 1: DD3 PCA3 (uPM3 TM
)-Transkript differential display code 3, 9p21-22 [Bussemaker et
al. 1999] Gen mit der bisher hchsten bekannten PCa-Spezifitt
(RT-PCR) identifiziert als 10-100-fach berexprimiert (Northern) in
53/56 PCa- Geweben (0/56 korrespondierenden Tf-Prostategeweben)
nichtkodierende mRNA der Prostata-Epithelzellen im Median 66-fache
E (QPCR, Detektierbarkeit bei 40 Mitarbeiter an Assay-Entwicklung
& Validierung bernahme durch 2 Diagnostikfirmen (Genprobe,
Bostwick Laboratories)
- Folie 31
- Meye et al, Klinik fr Urologie, TU Dresden MuMa-Studie an 106
primren PCa-Gewebepaaren Folie 31 / 20 Marker 5: EZH2 (E im HRPC)
polycomb group protein enhancer of zeste homolog 2
transkriptioneller Repressor (zellulre Identitt) spezifisch in HRPC
berexprimiert (mRNA & Protein) insbesondere in metastatische
PCa erhhte Expression PCa mit einer EZH2-E ~ direkt mit geringer LZ
(nicht mit GS oder Tumorstadium) unabhngige prognostische Relevanz
E-Detektion im Gewebe = negativer Prognoseprdiktor experimentelle
EZH2-Blockade (siRNA) in PCa-Zellinien: Viabilitts- & Wachstum
(aber keine Apoptose)